專利名稱：蛋白激酶Nβ的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白激酶Nβ的應(yīng)用。
現(xiàn)代藥物開(kāi)發(fā)不再依賴于或多或少試探的方法，而典型地包含闡明構(gòu)成疾病或癥狀基礎(chǔ)的分子機(jī)制，鑒定候選靶分子和評(píng)估所述靶分子。一旦可獲得這樣證實(shí)的靶分子(在本文中也稱作靶)，可以檢驗(yàn)針對(duì)其的候選藥物。在很多情形中，這些候選藥物是可以由合成或天然化合物組成的化合物文庫(kù)的成員。組合文庫(kù)的使用也很常見(jiàn)。這些化合物文庫(kù)在本文中還稱為候選化合物文庫(kù)。盡管過(guò)去該方法已經(jīng)證明是成功的，它仍然耗時(shí)費(fèi)錢(qián)。當(dāng)前將不同技術(shù)用于靶鑒定和靶證實(shí)。
仍然有許多腫瘤和癌是人類健康的大威脅。為了產(chǎn)生更安全和更有效的具有更小副作用的藥物，必須了解經(jīng)適當(dāng)化合物處理后可特異性地或選擇性地影響它們的活性或存在的靶分子。因?yàn)榭梢允菨撛诨蚝蜻x藥物的化合物與靶之間的優(yōu)選地選擇性和特異性相互作用，靶在疾病或疾病癥狀如例如癌、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的功能可能被影響，因此疾病被治療或預(yù)防和疾病癥狀被改善。
因此構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題是提供適于用于腫瘤發(fā)生和癌的治療中治療方法的靶。構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的另一問(wèn)題是提供涉及腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的靶。
構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題在第一方面通過(guò)將蛋白激酶Nβ或其片段或衍生物用作PI3-激酶途徑的下游靶、優(yōu)選作為PI3-激酶途徑的下游藥靶來(lái)解決。
構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題在第二方面通過(guò)將蛋白激酶Nβ或其片段或衍生物用于制備治療和/或預(yù)防疾病的藥物和/或制備用于診斷疾病的診斷劑來(lái)解決，其中疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌和與PI3-激酶途徑有關(guān)的任何病理癥狀的組。
在按照本發(fā)明第一和第二方面的應(yīng)用的實(shí)施方案中，蛋白激酶Nβ具有按照SEQ ID NO.1或按照數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)PID g7019489或數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)gi 7019489的氨基酸序列，或其部分或衍生物。
構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題在第三方面通過(guò)將編碼蛋白激酶Nβ或其片段或衍生物的核酸用于治療和/或預(yù)防疾病和/或制備用于診斷疾病的診斷劑來(lái)解決，其中疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌和與PI3-激酶途徑有關(guān)的任何病理癥狀的組。
在按照本發(fā)明第三方面的應(yīng)用的實(shí)施方案中，蛋白激酶Nβ具有按照SEQ ID NO.1或按照數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)PID g7019489或數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)gi7019489的氨基酸序列，或其部分或衍生物。
在按照本發(fā)明第三方面的應(yīng)用的實(shí)施方案中，核酸是按照SEQ ID NO.2或按照數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)gi 7019488或NM_01335、優(yōu)選NM_01335.1的核酸。
在按照本發(fā)明任一方面的應(yīng)用的另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白激酶Nβ由按照SEQ ID NO.2或按照數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)gi 7019488或NM_01335、優(yōu)選NM_01335.1的核酸編碼。
在按照本發(fā)明第三方面的應(yīng)用的優(yōu)選實(shí)施方案中，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性核酸序列將與按照本發(fā)明第三方面的本發(fā)明的核酸雜交。
在按照本發(fā)明任一方面的應(yīng)用的另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸序列是在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與按照SEQ ID NO.2或按照數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)gi 7019488或NM_01335、優(yōu)選NM_01335.1的核酸序列或其部分雜交的核酸序列。
在按照本發(fā)明任一方面的應(yīng)用的優(yōu)選實(shí)施方案中，疾病的特征在于與所述疾病有關(guān)的細(xì)胞缺少PTEN活性，顯示增加的攻擊行為，或是晚期腫瘤細(xì)胞。
在按照本發(fā)明第三方面的應(yīng)用的更優(yōu)選的實(shí)施方案中，疾病是晚期腫瘤。
構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題在第四方面通過(guò)篩選治療和/或預(yù)防疾病和/或制備用于診斷疾病的診斷劑的試劑的方法來(lái)解決，其中疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌和與PI3-激酶途徑有關(guān)的任何病理癥狀的組，其包含以下步驟a)提供候選化合物，b)提供蛋白激酶Nβ的表達(dá)系統(tǒng)和/或檢測(cè)蛋白激酶Nβ活性的系統(tǒng)；c)將候選化合物與蛋白激酶Nβ的表達(dá)系統(tǒng)和/或檢測(cè)蛋白激酶Nβ活性的系統(tǒng)接觸；d)確定蛋白激酶Nβ的表達(dá)和/或活性是否在候選化合物的影響下改變。
在按照本發(fā)明第四方面的方法的實(shí)施方案中，候選化合物包含在化合物文庫(kù)中。
在按照本發(fā)明第四方面的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，候選化合物選自包含肽，蛋白質(zhì)，抗體，抗促成素(anticaline)，功能核酸，天然化合物和小分子的各類化合物的組。
在按照本發(fā)明第四方面的方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，功能核酸選自包含適體(aptamer)，適配酶(aptazyme)，核酶，spiegelmer，反義寡核苷酸和siRNA的組。
在按照本發(fā)明第四方面的方法的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，蛋白激酶Nβ或編碼蛋白激酶Nβ的核酸是與本發(fā)明其它任何方面有關(guān)描述的那些。
構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題在第五方面通過(guò)將蛋白激酶Nβ或其片段或衍生物和/或編碼蛋白激酶Nβ的核酸或其部分或衍生物用作開(kāi)發(fā)和/或制備治療和/或預(yù)防疾病的藥物和/或制備用于診斷疾病的診斷劑的靶分子來(lái)解決，其中疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌和與PI3-激酶途徑有關(guān)的任何病理癥狀的組。
在按照本發(fā)明第五方面的應(yīng)用的實(shí)施方案中，藥物和/或診斷劑包含試劑，其選自由包含抗體，肽，抗促成素，小分子，反義分子，適體，spiegelmer和RNAi分子的組。
在按照本發(fā)明第五方面的應(yīng)用的優(yōu)選實(shí)施方案中，試劑與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用。
在按照本發(fā)明第五方面的應(yīng)用的備選實(shí)施方案中，試劑與編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸，特別是與蛋白激酶Nβ的mRNA、基因組核酸或cDNA相互作用。
構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題在第六方面通過(guò)將與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的多肽用于開(kāi)發(fā)或制備治療和/或預(yù)防疾病的藥物和/或制備用于診斷疾病的診斷劑來(lái)解決，其中疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌和與PI3-激酶途徑有關(guān)的任何病理癥狀的組。
在按照本發(fā)明第六方面的應(yīng)用的實(shí)施方案中，多肽選自由以下各項(xiàng)組成的組針對(duì)蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的抗體和結(jié)合蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的多肽。
構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題在第七方面通過(guò)將與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的核酸用于開(kāi)發(fā)或制備治療和/或預(yù)防疾病的藥物和/或制備用于診斷疾病的診斷劑來(lái)解決，其中疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌和與PI3-激酶途徑有關(guān)的任何病理癥狀的組。
在按照本發(fā)明第七方面的應(yīng)用的實(shí)施方案中，核酸選自包含適體和spiegelmer的組。
構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題在第八方面通過(guò)將與編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸相互作用的核酸用于開(kāi)發(fā)或制備治療和/或預(yù)防疾病的藥物和/或制備用于診斷疾病的診斷劑來(lái)解決，其中疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌和與PI3-激酶途徑有關(guān)的任何病理癥狀的組。
在按照本發(fā)明第八方面的應(yīng)用的實(shí)施方案中，相互作用的核酸是反義寡核苷酸，核酶和/或siRNA。
在按照本發(fā)明第八方面的應(yīng)用的另一實(shí)施方案中，編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸是cDNA，mRNA或hnRNA。
在按照本發(fā)明第八方面的應(yīng)用的實(shí)施方案中，蛋白激酶Nβ和/或編碼蛋白激酶Nβ的核酸是與本發(fā)明任一方面相關(guān)描述的一種。
構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題在第九方面通過(guò)優(yōu)選用于預(yù)防和/或治療疾病的藥物組合物來(lái)解決，該藥物組合物包含至少一種試劑和至少一種藥用載體，所述試劑選自包含蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物，與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物或與編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸相互作用的小分子，蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的特異性抗體，與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的多肽，編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸，與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的核酸或與編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸相互作用的核酸的組，其中疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌和與PI3-激酶途徑有關(guān)的任何病理癥狀的組。
構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題在第十方面通過(guò)用于表征疾病或癥狀的試劑盒來(lái)解決，所述疾病或癥狀選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌和與PI3-激酶途徑有關(guān)的任何病理癥狀的組，所述試劑盒包含至少一種試劑和任選地至少一種其它化合物，所述試劑選自包含蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物，蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的特異性抗體，與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的多肽，與編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸相互作用的多肽，與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的核酸，與編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸相互作用的核酸的組。
本發(fā)明人已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)蛋白激酶Nβ，在本文也稱為PKNβ，是與癌和腫瘤有關(guān)的有價(jià)值的靶。更具體地，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)蛋白激酶Nβ是PI-3激酶/PTEN途徑的下游靶。更意外地本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)蛋白激酶Nβ與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移關(guān)聯(lián)。特別是后者作用似乎與抑制功能、更具體地PTEN腫瘤抑制功能的喪失強(qiáng)烈相關(guān)。如將在實(shí)施例中顯示，在作為PI-3激酶途徑抑制劑的PTEN無(wú)活性的癥狀中蛋白激酶Nβ將被上調(diào)。由于蛋白激酶Nβ的上調(diào)，發(fā)生該上調(diào)的細(xì)胞將顯示轉(zhuǎn)移行為和遷移行為的增加。這意味著蛋白激酶Nβ的抑制劑是控制細(xì)胞轉(zhuǎn)移和遷移行為的適當(dāng)方法，這是治療腫瘤和癌的適當(dāng)方法，該腫瘤和癌更具體地是轉(zhuǎn)移性的和其細(xì)胞顯示轉(zhuǎn)移和/或遷移行為的那些腫瘤和癌，在本文中通常稱為“本文所述疾病”或“本文所述癥狀”。本文所述疾病以及本文所述癥狀還包含腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。這特別適用于本文所述的那些疾病和本文所述的那些癥狀，其中與這些疾病或疾病癥狀有關(guān)的細(xì)胞是PTEN陰性，這意味著腫瘤抑制劑PTEN無(wú)活性或具有降低水平的活性。該疾病還包含其中通常涉及PI3-激酶途徑的那些疾病。除了轉(zhuǎn)移瘤以外，特別是糖尿病分別屬于這種類型的疾病和疾病癥狀。因此，細(xì)胞，特別是與本文所述疾病或疾病癥狀有關(guān)的和為PTEN陰性的那些，對(duì)于其作用模式是降低或消除各個(gè)有關(guān)細(xì)胞中蛋白激酶Nβ活性的藥物治療敏感。因此，使用所述藥物可以有利地治療患者，該患者腫瘤特征在于優(yōu)選過(guò)度激活的PI3-激酶途徑，包括但不限于通過(guò)擴(kuò)增或誘變編碼PI3-激酶途徑組分的基因(p110，Akt)或是PTEN陰性的或具有PTEN陰性的細(xì)胞，特別是如果這些細(xì)胞涉及本文所述疾病或本文所述疾病癥狀。該活性的降低可來(lái)源于轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平，即蛋白激酶Nβ的酶促活性的降低。不希望局促于任何理論，后一方面，即改變蛋白激酶Nβ的活性也是來(lái)自本發(fā)明人關(guān)于PKNβ特性的理解的結(jié)果，即PKNβ的酶促活性也可以上調(diào)和下調(diào)，更優(yōu)選下調(diào)。
另一組可以使用所述藥物有利地治療的患者是患有癌癥的那些，其喪失PTEN功能的發(fā)生率高，特別是在晚期腫瘤中(Cantley，L.C.和Neel，B.G.(1999).New insights into tumor suppressionPTEN suppresses tumorformation by restraining the phosphoinositide 3-kinase/AKT pathway.ProcNatl Acad Sci U S A 96，4240-4245；Ali，I.U.(2000).Gatekeeper forendometriumthe PTEN tumor suppressor gene.J Natl Cancer Inst 92，861-863)。PTEN的喪失與各種腫瘤細(xì)胞增加的攻擊和入侵行為相關(guān)。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，可以將也可以用作與本發(fā)明各個(gè)方面相關(guān)的分析工具或手段的、分別針對(duì)蛋白激酶Nβ或編碼其的核酸的那些診斷劑和治療劑用于任何腫瘤，條件是符合上述前提，即PTEN與增加的攻擊和入侵行為相關(guān)。
基于本文提供的公開(kāi)內(nèi)容，即蛋白激酶Nβ是下游藥靶和蛋白激酶Nβ是腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移和與其相關(guān)或由其導(dǎo)致的疾病的靶，可以設(shè)計(jì)，篩選或制備這種藥物。
由于蛋白激酶Nβ涉及以上概述的機(jī)制，它還可以用作診斷細(xì)胞或其體內(nèi)具有該類細(xì)胞的患者的狀態(tài)，其是否將分別進(jìn)行轉(zhuǎn)移和腫瘤發(fā)生的標(biāo)記。作為這種方法起作用和適用于該目的的實(shí)例是例如ICAM-1。ICAM-1用于胃癌進(jìn)行轉(zhuǎn)移的預(yù)后(Maruo Y，Gochi A，Kaihara A，ShimamuraH，YamadaT，TanakaN，OritaK.Int J Cancer.2002 Aug 1；100(4)486-490)，其中發(fā)現(xiàn)s-ICAM-1水平在肝轉(zhuǎn)移的患者中升高。在另一個(gè)實(shí)施例中，將骨橋蛋白用作乳腺癌的預(yù)后標(biāo)記(Rudland PS，Platt-Higgins A，El-TananiM，De Silva Rudland S，Barraclough R，Winstanley JH，Howitt R，WestCR.Cancer Res.2002 Jun 15；62(12)3417-3427)。在這個(gè)范圍內(nèi)蛋白激酶Nβ的存在或存在水平(蛋白質(zhì)或mRNA)或活性水平可以用作標(biāo)記，與蛋白激酶Nβ或多或少特異性相互作用的任何化合物因此將是適當(dāng)?shù)脑\斷劑。
下面將公開(kāi)在任何情形下與蛋白激酶Nβ特異性和/或選擇性相互作用的藥物和診斷劑的方法和設(shè)計(jì)原理。
根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)激酶Nβ證明是允許選擇性調(diào)節(jié)僅一些典型地涉及PI-3激酶途徑的方面，即轉(zhuǎn)移和遷移的適當(dāng)下游藥靶，和選擇性和特異性的診斷方法，即檢測(cè)典型地涉及PI3-激酶途徑的過(guò)程，更具體地轉(zhuǎn)移和遷移。
PI3-激酶途徑其特征在于經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)后的PI3-激酶活性和平行的信號(hào)途徑。細(xì)胞的生長(zhǎng)因子刺激導(dǎo)致細(xì)胞膜上它們相關(guān)受體的激活，其又與胞內(nèi)信號(hào)分子如PI3-激酶相關(guān)并將PI3-激酶激活。PI3-激酶(由調(diào)節(jié)p85和催化p110亞基組成)的激活通過(guò)磷酸化導(dǎo)致Akt的激活，由此支持細(xì)胞應(yīng)答如擴(kuò)增，存活或向下游遷移。PTEN因此是涉及磷脂酰肌醇(PI)3-激酶途徑的腫瘤抑制劑，過(guò)去已經(jīng)廣泛研究其在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化中的作用(關(guān)于綜述參見(jiàn)Stein，R.C.和Waterfield，M.D.(2000).PI3-kinase inhibitiona target for drug development？Mol Med Today 6，347-357；Vazquez，F(xiàn).和Sellers，W.R.(2000).The PTEN tumor suppressorproteinan antagonist of phosphoinositide 3-kinase signaling.BiochimBiophys Acta 1470，M21-35；Roymans，D.和Slegers，H.(2001).Phosphatidylinositol 3-kinases in tumor progression.Eur J Biochem 268，487-498)。腫瘤抑制劑PTEN通過(guò)逆轉(zhuǎn)PI3-激酶-催化反應(yīng)起PI3-激酶負(fù)調(diào)節(jié)物的作用和由此確保途徑的激活以瞬時(shí)和可控方式發(fā)生。PTEN的功能失活導(dǎo)致PI3-激酶信號(hào)的慢性超活化。通過(guò)加入小分子抑制劑LY294002可以阻斷PI3-激酶活性。以平行途徑作用的信號(hào)激酶MEK的活性和下游響應(yīng)可以例如被小分子抑制劑PD98059抑制。
PI3-激酶途徑通過(guò)PTEN功能喪失的慢性激活是腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的主要貢獻(xiàn)者，顯示該腫瘤抑制劑代表控制細(xì)胞增殖的重要關(guān)卡。PTEN剔除(knock out)細(xì)胞顯示與其中PT3-激酶途徑已經(jīng)通過(guò)PI3-激酶的激活形式被慢性誘導(dǎo)的細(xì)胞類似的特性(Di Cristofano，A.，Pesce，B.，Cordon-Cardo，C.和Pandolfi， P.P.(1998).PTEN is essential for embryonic development andtumour suppression.Nat Genet 19，348-355.Klippel，A.，Escobedo，M.A.，Wachowicz，M.S.，Apell，G，Brown，T.W.，Giedlin，M.A.，Kavanaugh，W.M.和Williams，L.T.(1998).Activation of phosphatidylinositol 3-kinase issufficient for cell cycle entry and promotes cellular changes characteristic ofoncogenic transformation.Mol Cell Biol 18，5699-5711.Kobayashi，M.，Nagata，S.，Iwasaki，T.，Yanagihara，K.，Saitoh，I.，Karouji，Y.，Ihara，S.和Fukui，Y.(1999).Dedifferentiation of adenocarcinomas by activation ofphosphatidylinositol 3-kinase.Proc Natl Acad Sci U S A 96，4874-4879).
PTEN涉及也稱為PTEN相關(guān)途徑的幾個(gè)途徑如PI3K/PTEN途徑，Akt途徑，EGF-相關(guān)自分泌回路(loop)和mTOR途徑。PI3-激酶途徑實(shí)際上是直接或間接涉及PI3-激酶的任何途徑。PI3-激酶在該途徑中可以用作抑制劑或激活劑，或者它可以被途徑的其它元件調(diào)節(jié)。
存在豐富的現(xiàn)有技術(shù)描述涉及PI3-激酶途徑的疾病和癥狀。這些癥狀和疾病中的任何一種可以因此通過(guò)本文教導(dǎo)設(shè)計(jì)、篩選或制備的本發(fā)明方法和藥物和診斷劑處理。為了不限制性地舉例說(shuō)明的原因，它是指下列各項(xiàng)子宮內(nèi)膜癌，結(jié)腸直腸癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，子宮內(nèi)膜癌，腺癌，子宮內(nèi)膜增生，考登綜合征，遺傳性非息肉病結(jié)腸直腸癌，Li-Fraumene’s綜合征，乳腺-卵巢癌，前列腺癌(Ali，I.U.，Journal of the National Cancer Institute，Vol.92，no.11，June 07，2000，第861-863頁(yè))，班-佐綜合征，LDD(Lhermitte-Duklos’綜合征)(Macleod，K.，上文)錯(cuò)構(gòu)瘤-巨頭病，包括Cow病(CD)和Bannayan-Ruvalcaba-Rily綜合征(BRR)，粘膜皮膚損傷(例如毛膜瘤(trichilemmonmas))，巨頭，智力低下，胃腸harmatomas，脂瘤，甲狀腺腺瘤，乳腺纖維囊性病，小腦發(fā)育不良性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤和乳腺和甲狀腺惡性腫瘤(Vazquez，F(xiàn).，Sellers，W.R.，上文)。
鑒于此，蛋白激酶Nβ是PI3-激酶途徑有價(jià)值的下游藥靶，其可以用副作用比針對(duì)蛋白激酶Nβ下游的靶的其它藥物小的藥物處理。因此本發(fā)明提供適合設(shè)計(jì)、篩選、開(kāi)發(fā)和制備藥物活性化合物的藥靶，這些化合物比本領(lǐng)域已知的那些如例如LY294002更有選擇性。通過(guò)對(duì)效應(yīng)分子該特定部分即蛋白激酶Nβ和途徑中涉及的任何另外的下游分子的控制，僅極有限量的其平行分支或信號(hào)級(jí)聯(lián)放大中另外的上游靶可能導(dǎo)致不期望的作用。因此，與細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、細(xì)胞調(diào)亡、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯有關(guān)的PI-3激酶/PTEN途徑的其它活性將不受影響。此外，不誘導(dǎo)胰島素信號(hào)，這意味著實(shí)際上避免了與LY294002的使用相關(guān)的觀察到的糖尿病響應(yīng)或其它副作用。LY294002(2-(4-嗎啉基)8-苯基色酮)是Lilly研究實(shí)驗(yàn)室(Indianapolis)開(kāi)發(fā)的作為PI-3K抑制劑的幾種色酮衍生物小分子抑制劑之一(Vlahos等，1994，JBC，269，5241-5248)。它靶向PI-3K分子它們的催化亞基，p110并且通過(guò)與ADP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合催化中心來(lái)發(fā)揮作用。然而，LY294002不能辨別不同的p110同工型(α，β，γ，δ)，這些同工型提示具有不同細(xì)胞功能。
蛋白激酶Nβ也是雷帕霉素處理的mTOR的另一下游。mTOR(雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶)，也稱為Raft或FRAP，作用于PI3-激酶的下游來(lái)調(diào)節(jié)諸如pp70S6激酶依賴性進(jìn)入細(xì)胞周期的過(guò)程。mTOR用作生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)可用性的傳感物以通過(guò)激活pp70S6激酶和起始因子4E來(lái)控制翻譯。mTOR的功能受細(xì)菌大環(huán)內(nèi)酯雷帕霉素抑制，雷帕霉素抑制T-細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)(Kuruvilla和Schreiber 1999，Chemistry & Biology 6，R129-R136)。
雷帕霉素及其衍生物是當(dāng)前用于臨床的適當(dāng)藥物的事實(shí)證明藥靶更有益和具有更小副作用，更具體地它是關(guān)于例如Yu等(Yu，K.等(2001)Endrocrine-RelatCanc 8，249)證明的特定分子機(jī)制。
蛋白激酶Nβ是蛋白激酶C家族的成員，該家族據(jù)說(shuō)是蛋白質(zhì)-絲氨酸/蘇氨酸激酶。典型地，這種類型的蛋白激酶包含一個(gè)調(diào)節(jié)和一個(gè)催化亞基，使用鈣離子和磷脂作為輔因子。二酰甘油用作這種類型的蛋白激酶家族的激活劑。蛋白激酶C家族的成員涉及與激素或神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)的幾個(gè)信號(hào)途徑。這些蛋白激酶通過(guò)磷酸化調(diào)節(jié)它們的靶蛋白的活性。本領(lǐng)域已知非生理性的持續(xù)激活蛋白激酶C導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表型，其可導(dǎo)致癌癥產(chǎn)生。
蛋白激酶Nβ作為mRNA的完整序列可在數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得，例如登記號(hào)為gi 7019488或NM_013355。使用遺傳密碼，從該mRNA中可推斷出具體的氨基酸序列。而且，蛋白激酶Nβ的氨基酸序列可在數(shù)據(jù)庫(kù)中以登記號(hào)gi 7019489或NP_037487.1獲得。屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是可以按照本發(fā)明使用其衍生物或截短形式(version)，只要可以實(shí)現(xiàn)期望效果。衍生化和截短的程度因此可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)分析測(cè)定。就核酸序列而言那些核酸序列也被術(shù)語(yǔ)編碼蛋白激酶Nβ的核酸序列包含，這些核酸序列可以與上述登記號(hào)指定的核酸或可以衍生于上述氨基酸序列的任何核酸序列雜交。該雜交為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。這種雜交的細(xì)節(jié)可以獲自Sambrook，J.Fritsch，E.F.和Maniats，T.(1989)Molecular CloningALaboratory Manual，2nded.Cold Spring HarborCold Spring HarborLaboratory。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，雜交是嚴(yán)謹(jǐn)條件下的雜交。另外，編碼蛋白激酶Nβ的核酸也是與任何上述核酸序列同源的核酸序列，其中同源程度優(yōu)選為75，80，85，90或95％。另外的與蛋白激酶Nβ有關(guān)的參考文獻(xiàn)尤其有Shibata H.等，J.Biochem.(Tokyo)2001 Jul；130(1)23-31；Dong，LQ，Proc Natl Akad Scie USA，2000，May 09；97(10)5089-5094；和Oishi，K.，Biochem Biophys Res Commun.1999，Aug.11；261(3)808-814。
尤其在M.musculus，R norvegicus，A.thaliana，C.elegans，D.melanogaster和S.cerevisiae中可以發(fā)現(xiàn)人蛋白激酶Nβ的同源物。對(duì)于上述各種物種，對(duì)比區(qū)域的百分同一性和長(zhǎng)度分別為67％和279個(gè)氨基酸，51％和866個(gè)氨基酸，38％和305個(gè)氨基酸，36％和861個(gè)氨基酸，63％和296個(gè)氨基酸和44％和362個(gè)氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)這些或其它同源物中的任何一種原則上適合于實(shí)施本發(fā)明，除非使用該同源物產(chǎn)生的藥物或診斷劑可以仍與人蛋白激酶Nβ或其它任何預(yù)定蛋白激酶Nβ相互作用。
人氨基酸序列還可以獲自ProtEST，登記號(hào)pirJC7083，其中各種蛋白激酶Nβ稱為JC7083蛋白激酶。人蛋白激酶Nβ的基因位于第9條人染色體上。蛋白激酶Nβ的cDNA來(lái)源通常是多種癌和各種胎兒或胚胎組織，更具體地，尤其是胃，腺癌，腦，乳腺，burkitt，淋巴瘤，子宮頸，軟骨肉瘤，結(jié)腸，胎兒眼，胎兒晶狀體，胎兒眼前段，胎兒視神經(jīng)，胎兒視網(wǎng)膜，胎兒視網(wǎng)膜中央窩(foveal)，胎斑肽脈絡(luò)膜，fibrotheoma，種系，nead頸，心臟，腎，大細(xì)胞癌，平滑肌肉瘤，轉(zhuǎn)移性軟骨肉瘤，卵巢，甲狀旁腺，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤，橫紋肌肉瘤，小細(xì)胞癌，鱗狀細(xì)胞癌，睪丸，和子宮。從該表中明顯的是在本文中也稱為藥劑(medicament)的藥物和診斷劑，包括腫瘤分類(staging)劑，即分別可以用于區(qū)分患者關(guān)于他可能遭受的疾病階段的狀態(tài)以及用于監(jiān)視施用于患者的治療功效的試劑，其按照本文提供的技術(shù)教導(dǎo)設(shè)計(jì)、篩選或制備，除了本文公開(kāi)的其它任何疾病和本文公開(kāi)的疾病癥狀以外，其可以用于治療、預(yù)防、診斷、預(yù)后和監(jiān)視這些疾病或涉及特定細(xì)胞、組織或器官的任何疾病。這些疾病和疾病癥狀也應(yīng)當(dāng)包含在術(shù)語(yǔ)“本文所述疾病”中。
鑒于本文公開(kāi)的意外發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶Nβ因而可以用作預(yù)防和/或治療本文所述的各種疾病和疾病癥狀的藥物，和用于為此目的制備藥物和用于制備診斷劑。
在將以上定義的蛋白激酶Nβ或其片段或衍生物本身用作藥物的情況下，將它優(yōu)選用作天然存在的蛋白激酶Nβ的競(jìng)爭(zhēng)劑和由此抑制其正常生物學(xué)功能。特別優(yōu)選用于該目的的蛋白激酶Nβ是催化缺陷型的。這種蛋白激酶Nβ可分別施用于生物和細(xì)胞，或可以通過(guò)基因治療的方式導(dǎo)入生物或各個(gè)細(xì)胞。
除了其本身是潛在藥物以外，蛋白激酶Nβ可以用作針對(duì)可以用作藥物或候選藥物或用作診斷劑的化學(xué)化合物的化合物。這些化學(xué)化合物屬于不同類別的化合物如抗體，肽，抗促成素，適體，spiegelmer，核酶，反義寡核苷酸和siRNA以及小分子。使用蛋白激酶Nβ其本身作為物理或化學(xué)實(shí)體或與蛋白激酶Nβ有關(guān)的信息，設(shè)計(jì)、選擇、篩選產(chǎn)生和/或制備化合物。在所述類別的化合物的設(shè)計(jì)、選擇、篩選、產(chǎn)生和/或制備方法中，蛋白激酶Nβ也將稱為靶，其用于該方法中而不是將各種化合物向需要其的患者的最終施用中。在提供各種類別的化合物的方法中，可以使用蛋白質(zhì)蛋白激酶Nβ，在本文中也稱為蛋白激酶Nβ或編碼蛋白激酶Nβ的核酸。本文所用的術(shù)語(yǔ)蛋白激酶Nβ包含蛋白激酶Nβ的任何片段或衍生物，其允許設(shè)計(jì)、選擇、篩選、產(chǎn)生和/或制備各類化合物中所述類別的化合物，其在應(yīng)用時(shí)又由于有活性而作為藥物或作為診斷劑。本文所用的編碼蛋白激酶Nβ的術(shù)語(yǔ)核酸應(yīng)當(dāng)包含任何核酸，其包含編碼如上定義的蛋白激酶Nβ的核酸或其部分。同樣考慮編碼蛋白激酶Nβ的核酸的一部分，只要它仍適合設(shè)計(jì)、選擇、篩選、產(chǎn)生和/或制備所述類別的化合物，其在應(yīng)用時(shí)又由于有活性而作為藥物或作為診斷劑。編碼蛋白激酶Nβ的核酸可以是基因組核酸，hnRNA，mRNA，cDNA或其中每個(gè)的一部分。
如以上概述，屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是除了本文所述的蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物或?yàn)榇说暮怂嵝蛄?，還可以使用其它工具或化合物以便產(chǎn)生或抑制產(chǎn)生于蛋白激酶Nβ或編碼蛋白激酶Nβ的核酸的作用。這些工具可以在篩選方法中確定或選擇。在該篩選方法中，第一步是提供一種或多種所謂的候選化合物。本文所用的候選化合物是在測(cè)試系統(tǒng)中檢測(cè)其適合性的化合物，該適合性是關(guān)于治療或減輕本文所述各種疾病和本文所述疾病癥狀或被用于這種疾病和疾病癥狀的診斷工具或試劑的適合性。如果候選化合物在測(cè)試系統(tǒng)中顯示各種作用，所述候選化合物是治療所述疾病和疾病癥狀的適當(dāng)工具或試劑，和原則上，以及所述疾病和疾病癥狀的適當(dāng)診斷劑。在第二步中將候選化合物與蛋白激酶Nβ表達(dá)系統(tǒng)或蛋白激酶Nβ的基因產(chǎn)物、優(yōu)選各種基因表達(dá)產(chǎn)物如hnRNA或mRNA，或蛋白激酶Nβ活性系統(tǒng)或蛋白激酶Nβ接觸。蛋白激酶Nβ活性系統(tǒng)在本文中也稱為檢測(cè)蛋白激酶Nβ活性的系統(tǒng)和/或優(yōu)選在該系統(tǒng)的含義中也是有活性的。
蛋白激酶Nβ表達(dá)系統(tǒng)基本上是顯示或展示蛋白激酶Nβ表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)，其中表達(dá)的程度或水平基本上可以改變。優(yōu)選地，蛋白激酶Nβ活性系統(tǒng)基本上是其中測(cè)量活性或活性狀態(tài)而不是蛋白激酶Nβ表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)。備選地，蛋白激酶活性系統(tǒng)是其活性可以測(cè)量的蛋白激酶Nβ或者提供或包含蛋白激酶Nβ的系統(tǒng)。在這些系統(tǒng)的任何一個(gè)中，檢驗(yàn)在候選化合物的影響下蛋白激酶Nβ或編碼蛋白激酶Nβ的核酸的活性是否不同于沒(méi)有候選化合物的情形。不管具體系統(tǒng)是否是表達(dá)系統(tǒng)或活性系統(tǒng)，屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是可以出現(xiàn)活性和表達(dá)分別增加或降低并且可以測(cè)量。典型地，表達(dá)系統(tǒng)和/或活性系統(tǒng)是體外反應(yīng)，如細(xì)胞提取物或細(xì)胞提取物的級(jí)分如核提取物。本文所用的蛋白激酶Nβ表達(dá)系統(tǒng)也可以是細(xì)胞，優(yōu)選與本文所述疾病和本文所述疾病病癥有關(guān)的組織或器官的細(xì)胞。
例如通過(guò)測(cè)量在候選化合物的影響下編碼蛋白激酶Nβ的核酸量、更具體地mRNA的增加或減少或表達(dá)的蛋白激酶Nβ的增加或減少，可以在每個(gè)表達(dá)水平上確定活性系統(tǒng)或表達(dá)系統(tǒng)中是否有增加或降低。測(cè)量所需技術(shù)，更具體地諸如對(duì)于mRNA或蛋白質(zhì)的這類變化的定量測(cè)量，是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員還公知的是例如通過(guò)使用適當(dāng)抗體測(cè)定蛋白激酶Nβ的量或含量的方法?？梢匀绫绢I(lǐng)域技術(shù)人員所知和例如Harlow，E.，和Lane，D.，″AntibodiesA Laboratory Manual，″Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，(1988)所述產(chǎn)生抗體。
在蛋白激酶Nβ表達(dá)系統(tǒng)的情形中，優(yōu)選可以在功能測(cè)定中測(cè)定蛋白激酶Nβ活性的增加或降低。
通常通過(guò)將候選化合物的水溶液加入各自反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行將候選化合物分別與表達(dá)系統(tǒng)和活性系統(tǒng)接觸，該反應(yīng)系統(tǒng)在本文中通常稱為測(cè)試系統(tǒng)。除了水溶液以外，可以使用候選化合物在有機(jī)溶劑中的混懸液或溶液。水溶液優(yōu)選為緩沖液。
優(yōu)選地，在每輪分別使用表達(dá)系統(tǒng)和活性系統(tǒng)中，僅使用單一候選化合物。然而，還屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是幾個(gè)該類測(cè)試在高通量系統(tǒng)中平行進(jìn)行。
按照本發(fā)明的方法的另一步驟在于測(cè)定在候選化合物的影響下，表達(dá)系統(tǒng)和活性系統(tǒng)的表達(dá)或活性是否分別相對(duì)于蛋白激酶Nβ或編碼其的核酸變化。典型地，這通過(guò)將加入候選化合物后的系統(tǒng)反應(yīng)與未加入候選化合物的系統(tǒng)反應(yīng)比較完成。優(yōu)選地，候選化合物是化合物文庫(kù)的成員?；旧先魏位衔镂膸?kù)適合于本發(fā)明目的，而與化合物類別無(wú)關(guān)。適當(dāng)?shù)幕衔镂膸?kù)尤其有由小分子組成的文庫(kù)，由肽、蛋白質(zhì)、抗體、抗促成素和功能核酸組成的文庫(kù)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知可以產(chǎn)生后者化合物并在本文中概述。
蛋白激酶Nβ蛋白質(zhì)的特異性抗體或編碼蛋白激酶Nβ的核酸的制備為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，并且例如在Harlow，E.，和Lane，D.，″AntibodiesALaboratory Manual，″Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，(1988)中描述。優(yōu)選地，單克隆抗體可以與本發(fā)明結(jié)合使用，其可以按照Cesar和Milstein的方案和基于其的進(jìn)一步發(fā)展來(lái)制備。本文所用抗體包括但不限于，完全抗體，抗體片段或衍生物如Fab片段，F(xiàn)c片段和單鏈抗體，只要它們適合于和能夠與蛋白激酶Nβ結(jié)合。除了單克隆抗體以外，還可以使用和/或產(chǎn)生多克隆抗體。多克隆抗體的產(chǎn)生也為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，例如在Harlow，E.，和Lane，D.，″AntibodiesA Laboratory Manual，″Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，(1988)中描述。優(yōu)選地，用于治療目的的抗體是以上定義的人源化的或人的抗體。
按照本發(fā)明可以使用的抗體可以具有一個(gè)或幾個(gè)標(biāo)記或標(biāo)簽。這些標(biāo)記或標(biāo)簽可以在其診斷應(yīng)用或其治療應(yīng)用中用于檢測(cè)抗體。優(yōu)選地，標(biāo)記和標(biāo)簽選自包含抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、生物素、金和熒光素的組，并例如在ELISA方法中使用。這些和另外的標(biāo)記以及方法在例如Harlow，E.，和Lane，D.，″AntibodiesA Laboratory Manual，″Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，(1988)中描述。
還屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是，標(biāo)簽或標(biāo)記顯示除了檢測(cè)以外的額外功能，如與其它分子相互作用。該相互作用可以例如是與其它化合物的特異相互作用。這些其它化合物可以是其中使用抗體的系統(tǒng)如人或動(dòng)物體固有的那些或通過(guò)使用各自抗體分析的樣品。適當(dāng)?shù)臉?biāo)記可以例如是生物素或熒光素，其特異相互作用的配偶體如抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素蛋白等存在于各種化合物或結(jié)構(gòu)上以與如此標(biāo)記或帶標(biāo)簽的抗體相互作用。
使用蛋白激酶Nβ蛋白質(zhì)或編碼蛋白激酶Nβ的核酸可以產(chǎn)生的另一類藥物以及診斷劑是與其結(jié)合的肽。這些肽可以通過(guò)使用按照現(xiàn)有技術(shù)的方法如噬菌體展示產(chǎn)生。基本上，產(chǎn)生諸如噬菌體形式的肽文庫(kù)，這種文庫(kù)與靶分子接觸，在本情形中靶分子是例如蛋白激酶Nβ。隨后從各自反應(yīng)中優(yōu)選作為與靶分子的復(fù)合體去除與靶分子結(jié)合的那些肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知結(jié)合特性至少在一定程度上依賴于具體實(shí)現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)定如鹽濃度等。在從未結(jié)合的文庫(kù)成員中分離以較高親和力或較大力與靶分子結(jié)合的那些肽以后，和任選地還在從靶分子和肽的復(fù)合體中去除靶分子以后，可以隨后表征各個(gè)肽。在表征前，任選地如例如通過(guò)增殖編碼肽的噬菌體來(lái)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增步驟。表征優(yōu)選包含將靶結(jié)合肽測(cè)序?；旧?，肽不受它們的長(zhǎng)度限制，然而在各種方法中優(yōu)選獲得優(yōu)選長(zhǎng)度約為8-20個(gè)氨基酸的肽。文庫(kù)的大小可以為約102至1018，優(yōu)選108至1015種不同的肽，然而不限于此。
一種具體形式的靶結(jié)合多肽是所謂的“抗促成素”，其尤其在德國(guó)專利申請(qǐng)DE 197 42 706中描述。
按照本發(fā)明，蛋白激酶Nβ蛋白質(zhì)以及編碼蛋白激酶Nβ的核酸可以在篩選方法中用作制備或開(kāi)發(fā)治療本文所述疾病和本文所述疾病癥狀的藥物的靶，以及制備和/或開(kāi)發(fā)用于診斷所述疾病和所述癥狀的工具，其中在篩選方法中使用小分子或小分子文庫(kù)。該篩選包含同時(shí)或順序?qū)蟹肿优c優(yōu)選來(lái)自上面指定文庫(kù)的那些的單個(gè)小分子或多種小分子接觸的步驟，和鑒定與靶分子結(jié)合的那些小分子或文庫(kù)成員，其如果連同其它小分子篩選，可以從未結(jié)合或未相互作用的小分子中分離。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到結(jié)合和未結(jié)合可強(qiáng)烈受具體的實(shí)驗(yàn)設(shè)定影響。在改變反應(yīng)參數(shù)的嚴(yán)謹(jǐn)度方面可以改變結(jié)合和未結(jié)合的程度，這允許微調(diào)該篩選方法。優(yōu)選地，在鑒定一種或幾種與靶分子特異相互作用的小分子以后，可以進(jìn)一步表征該小分子。這種進(jìn)一步表征可以例如在于鑒定小分子和確定其分子結(jié)構(gòu)和另外的物理、化學(xué)、生物和/或醫(yī)學(xué)特性。優(yōu)選地，天然化合物具有約100-1000Da的分子量。還優(yōu)選地，小分子是遵守本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的Lepinsky五項(xiàng)法則的那些。備選地，與優(yōu)選非合成的天然產(chǎn)物相反，還可以限定小分子以使它們是優(yōu)選產(chǎn)生于組合化學(xué)的合成小分子。然而，應(yīng)當(dāng)注意這些定義是僅幫助對(duì)本領(lǐng)域各個(gè)術(shù)語(yǔ)的一般理解。
還屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是將蛋白激酶Nβ和/或編碼蛋白激酶Nβ的核酸用作制備或選擇適體和spiegelmer的靶分子，其然后可以直接或間接用作藥物或診斷劑。
適體是單鏈或雙鏈的并且與靶分子特異性相互作用的D-核酸。適體的制備或選擇例如在歐洲專利EP 0 533 838中描述?；旧蠈?shí)現(xiàn)下列步驟。首先，提供核酸即潛在適體的混合物，其中每個(gè)核酸典型地包含幾個(gè)、優(yōu)選至少8個(gè)順序隨機(jī)化的核苷酸的片段。該混合物隨后與靶分子接觸，其中如基于與候選混合物相比，對(duì)靶增加的親和力或與其的更大力，核酸與靶分子結(jié)合。結(jié)合核酸隨后從混合物的剩余部分中分離。任選地，使用例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增如此獲得的核酸。這些步驟可以重復(fù)數(shù)次最終提供與靶特異性結(jié)合的核酸比率提高的混合物，然后從中任選地選擇最終結(jié)合核酸。這些特異性結(jié)合的核酸稱為適體。明顯的是在產(chǎn)生或鑒定適體的方法的任何階段，可以取單個(gè)核酸混合物樣品來(lái)使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定其序列。在本發(fā)明范圍內(nèi)的是可以例如通過(guò)引入產(chǎn)生適體的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的限定化學(xué)基團(tuán)來(lái)穩(wěn)定適體。該修飾可以例如在于在核苷酸糖部分的2’-位引入氨基。適體當(dāng)前用作治療劑。然而，還屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是如此選擇或產(chǎn)生的適體可以用于靶驗(yàn)證和/或作為先導(dǎo)物質(zhì)用于開(kāi)發(fā)藥物，優(yōu)選基于小分子的藥物。這實(shí)際上通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定完成，其中靶分子和適體之間的特異相互作用受候選藥物的抑制，候選藥物從靶和適體的復(fù)合體中替代適體，可以假定各個(gè)候選藥物允許特異性抑制靶和適體之間的相互作用，和如果相互作用是特異性的，所述候選藥物至少在原則上將適合于阻斷靶和因此在各種包含該靶的系統(tǒng)中降低其生物有效性或活性。如此獲得的小分子可以然后進(jìn)行進(jìn)一步的衍生化和修飾以優(yōu)化其物理、化學(xué)、生物和/或醫(yī)學(xué)特性如毒性、特異性、生物可降解性和生物利用度。
基于類似原理產(chǎn)生或制備spiegelmer，其可以按照使用蛋白激酶Nβ或編碼蛋白激酶Nβ的核酸的本發(fā)明使用或產(chǎn)生。Spiegelmer的制備在國(guó)際專利申請(qǐng)WO 98/08856中描述。Spiegelmer是L-核酸，這意味著它們由L-核苷酸組成，不同于如適體由D-核苷酸組成的適體。Spiegelmer其特征在于它們?cè)谏锵到y(tǒng)中具有極高穩(wěn)定性和與適體相比與它們針對(duì)的靶分子特異性相互作用的事實(shí)。為了產(chǎn)生spiegelmer，產(chǎn)生D-核酸異質(zhì)群體并將該群體與靶分子的旋光對(duì)映體接觸，在本情形中例如與天然存在的蛋白激酶Nβ的L-對(duì)映異構(gòu)體的D-對(duì)映異構(gòu)體接觸。隨后，分離不與靶分子的旋光對(duì)映體相互作用的那些D-核酸。然而，分離與靶分子的旋光對(duì)映體相互作用的那些D-核酸，任選地測(cè)定和/或測(cè)序和隨后基于獲自D-核酸的核酸序列信息合成相應(yīng)的L-核酸。序列和與靶分子的旋光對(duì)映體相互作用的上述D-核酸相同的這些L-核酸，將特異性地與天然存在的靶分子而不是與其旋光對(duì)映體相互作用。類似于產(chǎn)生適體的方法，還可以重復(fù)各個(gè)步驟數(shù)次和由此富集與靶分子的旋光對(duì)映體特異性相互作用的那些核酸。
基于本文公開(kāi)的作為靶分子的蛋白激酶Nβ或編碼蛋白激酶Nβ的核酸可以制備或產(chǎn)生的另一類化合物是核酶，反義寡核苷酸和siRNA。
所有上述核酸的共同特征是它們不與靶分子在翻譯產(chǎn)物水平上(在本情形中蛋白激酶Nβ)相互作用，而是與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(即編碼蛋白激酶Nβ的核酸如基因組核酸或其衍生的任何核酸如分別地相應(yīng)的hnRNA，cDNA和mRNA)相互作用。因此，上述類別的化合物的靶分子優(yōu)選為蛋白激酶Nβ的mRNA。
核酶是有催化活性的核酸，優(yōu)選由基本上包含兩部分的RNA組成。第一部分顯示催化活性而第二部分負(fù)責(zé)與靶核酸(在本情形中編碼蛋白激酶Nβ的核酸)的特異相互作用。當(dāng)靶核酸和核酶的第二部分之間典型地通過(guò)兩條雜交鏈上基本上互補(bǔ)的堿基序列雜交和沃森-克里克堿基配對(duì)相互作用時(shí)，催化活性部分可變得有活性，這意味著它在分子內(nèi)或分子間催化靶核酸，假定核酶的催化活性是磷酸二酯酶活性。隨后，可以進(jìn)一步降解靶核酸，由于缺乏新合成的蛋白激酶Nβ和在先存在的蛋白激酶Nβ的更新，最終導(dǎo)致靶核酸以及衍生于所述靶核酸的蛋白質(zhì)(在本情形中為蛋白激酶Nβ)的降解。核酶，它們的應(yīng)用和設(shè)計(jì)原理為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，例如在Doherty和Doudna(Ribozym structures and mechanism.Annu ref.Biophys.Biomolstruct.2001；30457-75)和Lewin & Hauswirth(RibozymeGene TherapyApplications for molecular medicine.200 17221-8)中描述。
反義寡核苷酸分別在制備藥物和作為診斷劑中的應(yīng)用是基于類似的作用方式?；旧?，基于堿基互補(bǔ)性反義寡核苷酸與靶RNA、優(yōu)選與mRNA雜交，由此激活RNase H。RNase H被磷酸二酯和硫代磷酸酯偶聯(lián)的DNA激活。然而，除了硫代磷酸酯偶聯(lián)的DNA以外，磷酸二酯偶聯(lián)的DNA被細(xì)胞核酸酶迅速降解。這些抗性的非天然存在的DNA衍生物與RNA雜交后不抑制RNase H。換句話說(shuō)，反義多核苷酸僅作為DNA RNA雜交復(fù)合體有效。這類反義寡核苷酸的實(shí)例尤其在美國(guó)專利US 5,849,902和US5,989,912中描述。換句話說(shuō)，基于靶分子(在本情形中為編碼蛋白激酶Nβ的核酸)的核酸序列，其來(lái)自從中原則上可以推斷各自核酸序列的靶蛋白質(zhì)，或通過(guò)知道如特別是mRNA的核酸序列，基于堿基互補(bǔ)的原理可以設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)姆戳x寡核苷酸。
特別優(yōu)選的是含有短序列的硫代磷酸酯DNA(3-9個(gè)堿基)的反義-寡核苷酸。激活細(xì)菌RNase H需要最少3個(gè)DNA堿基，哺乳動(dòng)物RNase H激活需要至少5個(gè)堿基。在這些嵌合寡核苷酸中，存在形成RNase H的底物的中央?yún)^(qū)域，側(cè)鄰由不形成RNase H的底物的修飾核苷酸組成的雜交“臂”。例如通過(guò)2’-O-甲基或2’-氟可以修飾嵌合寡核苷酸的雜交臂。備選方法在所述臂中使用膦酸甲酯或氨基磷酸酯鍵。用于實(shí)施本發(fā)明的反義寡核苷酸的另外實(shí)施方案是對(duì)甲氧基寡核苷酸，部分對(duì)甲氧基寡脫氧核糖核苷酸或?qū)籽趸押塑账帷?br> 對(duì)于本發(fā)明特別相關(guān)和有用的是在上述兩個(gè)US專利中更具體描述的那些反義寡核苷酸。這些寡核苷酸不含有天然存在的5′→3′-連接的核苷酸。然而寡核苷酸具有兩類核苷酸激活RNase H的2’-脫氧硫代磷酸酯和不激活RNase H的2’-修飾核苷酸。2’-修飾核苷酸之間的鍵可以是磷酸二酯，硫代磷酸酯或?qū)σ已趸姿岫?。通過(guò)連續(xù)的RNase H-激活區(qū)域完成RNase H的激活，該區(qū)域在3和5之間含有激活細(xì)菌RNase H的2’-脫氧硫代磷酸酯核苷酸和在5和10之間含有激活真核的、特別是哺乳動(dòng)物RNase H的2’-脫氧硫代磷酸酯核苷酸。防止降解的保護(hù)是通過(guò)使5’和3’末端堿基高度抗核酸酶和任選地通過(guò)放置3’末端保護(hù)基團(tuán)來(lái)完成。
更具體地，反義寡核苷酸包含5’末端和3’末端；11-59 5′→3′-連接的核苷酸獨(dú)立地選自由2’-修飾磷酸二酯核苷酸和2’-修飾的對(duì)烷氧基磷酸三酯核苷酸組成的組；和其中5’-末端核苷酸與3個(gè)和10個(gè)連續(xù)硫代磷酸酯連接的脫氧核糖核苷酸之間的RNase H激活區(qū)域連接，和其中所述寡核苷酸的3’-末端選自由反向脫氧核糖核苷酸、1-3個(gè)硫代磷酸酯2’-修飾核糖核苷酸的連續(xù)序列、生物素基團(tuán)和對(duì)烷氧基磷酸三酯核苷酸組成的組。
還可以使用反義寡核苷酸，其中不是5’末端核苷酸而是上述3’末端核苷酸與RNase H-激活區(qū)域連接。而且，5’末端選自特定組而不是所述寡核苷酸的3’末端。
適當(dāng)?shù)暮陀杏玫姆戳x寡核苷酸還有以下那些包含5’末端RNase H激活區(qū)域和在5個(gè)和10個(gè)連續(xù)脫氧硫代磷酸酯核苷酸之間；在11-59個(gè)連續(xù)5′→3′-連接的2’-甲氧基核糖核苷酸之間含有RNase H激活區(qū)域；和核酸外切酶封閉基存在于寡核苷酸的3’末端，其來(lái)源于由非-5′-3′-磷酸二酯-連接的核苷酸，1-3個(gè)連續(xù)的5′-3′-連接的修飾核苷酸和非核苷酸化學(xué)封閉基組成的組。
如下可以表征兩類特別優(yōu)選的反義寡核苷酸第一類反義寡核苷酸，在本文中也稱為第二代反義寡核苷酸，包含總共23個(gè)核苷酸，其包含5′→3′方向的7個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸的一段序列，9個(gè)2’-脫氧核糖核苷酸的一段序列，6個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸的一段序列和3’-末端2’-脫氧核糖核苷酸。從7個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸的第1個(gè)基團(tuán)開(kāi)始，首先4個(gè)是硫代磷酸酯連接，而隨后4個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸是磷酸二酯連接。此外，在最后一個(gè)即2’-O-甲基核糖核苷酸的最3’-末端和由9個(gè)2’-脫氧核糖核苷酸組成的序列的第一個(gè)核苷酸之間存在磷酸二酯鍵。所有2’-脫氧核糖核苷酸是硫代磷酸酯連接。硫代磷酸酯還存在最后一個(gè)即最3’-末端的2’-脫氧核苷酸和隨后由6個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸組成的序列的第一個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸之間。從6個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸的該基團(tuán)開(kāi)始，它們中的首先4個(gè)，再次以5′→3′方向，是磷酸二酯鍵連接的，而它們中的最后3個(gè)，對(duì)應(yīng)于位置20-22，是硫代磷酸酯連接的。最后一個(gè)，即末端3’-末端2’-脫氧核苷酸通過(guò)硫代磷酸酯鍵與最后一個(gè)即最3’-末端2’-O-甲基核糖核苷酸連接。
該第一類也可以通過(guò)參考下列示意性結(jié)構(gòu)描述RRRnnnnNNNNNNNNNnnnRRRN。因此，R表示硫代磷酸酯連接的2’-O-甲基核糖核苷酸(A，G，U，C)；n表示2’-O-甲基核糖核苷酸(A，G，U，C)；N表示硫代磷酸酯連接的脫氧核糖核苷酸(A，G，T，C)。
第二類特別優(yōu)選的反義寡核苷酸，在本文中也稱為第三代反義寡核苷酸或GeneBlocs，也包含具有下列堿基結(jié)構(gòu)(5′→3′方向)的總共17-23個(gè)核苷酸。
在5’-末端存在反向無(wú)堿基核苷酸，其是適合于賦予對(duì)外切核酸酶活性的抗性的結(jié)構(gòu)和例如在WO 99/54459中描述。該反向無(wú)堿基與磷酸二酯連接的5-7個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸的序列連接。在該5-7個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸的序列之后有7-9個(gè)2’-脫氧核糖核苷酸的序列，其全部都是硫代磷酸酯連接的。最后一個(gè)即最3’-末端的2’-O-甲基核糖核苷酸和包含2’-脫氧核苷酸的序列的第一個(gè)2’-脫氧核苷酸之間的連接是通過(guò)磷酸二酯鍵發(fā)生。與7-9個(gè)2’-脫氧核苷酸的序列鄰近，連接由5-7個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸組成的序列。最后一個(gè)2’-脫氧核苷酸與稍后提及的由5-7個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸組成的序列的第一個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸的連接是通過(guò)硫代磷酸酯鍵發(fā)生。5-7個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸的序列是磷酸二酯連接的。在第二個(gè)5-7個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸序列的3’-末端連接另一個(gè)反向無(wú)堿基。
該第二類還可以通過(guò)參考下列示意性結(jié)構(gòu)描述(GeneBlocs代表第三代反義寡核苷酸，也具有下列示意性結(jié)構(gòu))帽-(np)x(Ns)y(np)z-帽或帽-nnnnnnnNNNNNNNNNnnnnnnn-帽。因此，帽代表兩個(gè)末端處的反向脫氧無(wú)堿基或類似修飾；n代表2’-O-甲基核糖核苷酸(A，G，U，C)；N表示硫代磷酸酯連接的脫氧核糖核苷酸(A，G，T，C)；x表示5-7的整數(shù)；y表示7-9的整數(shù)；和z表示5-7的整數(shù)。
應(yīng)當(dāng)注意整數(shù)x，y和z可以彼此獨(dú)立地選擇，盡管優(yōu)選x和z在給定反義寡核苷酸中相同。因此，下列第三代反義寡核苷酸的堿基設(shè)計(jì)或結(jié)構(gòu)可以如下帽-(np)5(Ns)7(np)5-帽，帽-(np)6(Ns)7(np)5-帽，帽-(np)7(Ns)7(np)5-帽，帽-(np)5(Ns)8(np)5-帽，帽-(np)6(Ns)8(np)5-帽，帽-(np)7(Ns)8(np)5-帽，帽-(np)5(Ns)9(np)5-帽，帽-(np)6(Ns)9(np)5-帽，帽-(np)7(Ns)9(np)5-帽，帽-(np)5(Ns)7(np)6-帽，帽-(np)6(Ns)7(np)6-帽，帽-(np)7(Ns)7(np)6-帽，帽-(np)5(Ns)8(np)6-帽，帽-(np)6(Ns)8(np)6-帽，帽-(np)7(Ns)8(np)6-帽，帽-(np)5(Ns)9(np)6-帽，帽-(np)6(Ns)9(np)6-帽，帽-(np)7(Ns)9(np)6-帽，帽-(np)5(Ns)7(np)7-帽，帽-(np)6(Ns)7(np)7-帽，帽-(np)7(Ns)7(np)7帽，帽-(np)5(Ns)8(np)7-帽，帽-(np)6(Ns)8(np)7-帽，帽-(np)7(Ns)8(np)7-帽，帽-(np)5(Ns)9(np)7-帽，帽-(np)6(Ns)9(np)7-帽和帽-(np)7(Ns)9(np)7-帽。
基于本文提供的技術(shù)教導(dǎo)可以產(chǎn)生的和可以用作藥物和/或診斷劑的另一類化合物是針對(duì)編碼蛋白激酶Nβ的核酸、優(yōu)選mRNA的小干擾RNA(siRNA)。siRNA是典型長(zhǎng)度為約21至約23個(gè)核苷酸的雙鏈RNA。兩條RNA鏈之一的序列對(duì)應(yīng)于待降解的靶核酸如編碼蛋白激酶Nβ的核酸的序列。換句話說(shuō)，知道靶分子(在本情形中蛋白激酶Nβ)的核酸序列，優(yōu)選mRNA序列，可以設(shè)計(jì)雙鏈RNA，兩條鏈之一與所述例如蛋白激酶Nβ的mRNa互補(bǔ)，當(dāng)將所述siRNA應(yīng)用于含有編碼蛋白激酶Nβ的基因、基因組DNA、hnRNA或mRNA的系統(tǒng)時(shí)，各自的靶核酸將被降解和因此降低各個(gè)蛋白質(zhì)的水平。設(shè)計(jì)、構(gòu)建和使用所述siRNA分別作為藥物和診斷劑的基本原理尤其在國(guó)際專利申請(qǐng)WO 00/44895和WO 01/75164中描述。
基于上述設(shè)計(jì)原理，一旦已知編碼蛋白激酶Nβ的核酸序列，可以分別產(chǎn)生這些siRNA，反義寡核苷酸和核酶。這對(duì)于核酸的前體分子如hnRNA、cDNA等包括基因組核酸也是正確的。當(dāng)然，考慮到堿基對(duì)互補(bǔ)的基本原理，優(yōu)選基于沃森-克里克堿基配對(duì)，還知道各自的反義鏈可以允許設(shè)計(jì)基于這些核酸的化合物。因此，本發(fā)明的另一方面涉及針對(duì)蛋白激酶Nβ的或蛋白激酶Nβ特異性的特定siRNA，核酶和反義核苷酸。下面，這通過(guò)siRNA進(jìn)一步舉例說(shuō)明，然而這同樣適用于反義寡核苷酸和核酶，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公認(rèn)的。
該siRNA包含優(yōu)選15-25個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，其中這實(shí)際上意味著包含15，16，17，18，20，21，22，23，24或25個(gè)核苷酸的任何長(zhǎng)度。在另一實(shí)施方案中，siRNA甚至可以顯示更多的核苷酸。按照本領(lǐng)域公知的設(shè)計(jì)原理，可以產(chǎn)生各自的siRNA。因此，本文要求的siRNA包含優(yōu)選15-25個(gè)連續(xù)核苷酸的任何核苷酸長(zhǎng)度的一段序列，其至少部分與編碼PKN-β的有意義或反義鏈互補(bǔ)，第二條核糖核苷酸鏈，其分別與第一條鏈和因此編碼蛋白激酶N-β的反義鏈和有意義鏈至少部分互補(bǔ)。本領(lǐng)域已知的產(chǎn)生或制備siRNA的任何設(shè)計(jì)原理可以應(yīng)用于該類雙鏈結(jié)構(gòu)。本文公開(kāi)的siRNA空間(space)包含siRNA分子，其反義鏈以對(duì)應(yīng)于上述PKN-β編碼序列的第1個(gè)核苷酸的核苷酸開(kāi)始。另外的這種siRNA分子以對(duì)應(yīng)于上述PKN-β編碼序列的第2個(gè)核苷酸的核苷酸開(kāi)始，等等。重復(fù)這種類型的對(duì)PKN-β編碼序列的掃描以便提供所有可能的可以針對(duì)PKN-β的siRNA分子。如此產(chǎn)生的任何siRNA分子的長(zhǎng)度可以是適合于siRNA的任何長(zhǎng)度，更具體地上述任何長(zhǎng)度。優(yōu)選地，除了反義鏈或有意義鏈最5’末端的核苷酸以外，本文公開(kāi)的siRNA分子空間中的各種siRNA分子重疊。明顯的是如此獲得的反義序列必須通過(guò)堿基配對(duì)互補(bǔ)以便形成功能活性siRNA所需的至少部分雙鏈的結(jié)構(gòu)。
基于上述類別的化合物如抗體、肽、抗促成素、適體、spiegelmer、核酶、反義寡核苷酸以及siRNA的作用方式，因此還屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是使用分別靶向蛋白激酶N-β和編碼其的核酸的這些化合物中任何一種，以制備針對(duì)本文所述任何疾病和本文所述任何疾病癥狀的藥物或診斷劑。另外，這些試劑可以用于分別監(jiān)視所述疾病和疾病癥狀的進(jìn)展和施用的任何治療的成功。
按照本發(fā)明設(shè)計(jì)的各類化合物如抗體、肽、抗促成素、小分子、適體、spiegelmer、核酶、反義寡核苷酸和siRNA也可以包含在藥物組合物中。優(yōu)選該藥物組合物用于治療本文所述疾病或本文所述疾病癥狀。在一個(gè)實(shí)施方案中藥物組合物還可以包含一種或幾種上述類別的化合物和/或單一類別的一個(gè)或多個(gè)成員，和任選地另外的藥物活性化合物，和藥用載體。該載體可以是液體或固體，例如溶液，緩沖液，醇溶液等。適當(dāng)?shù)墓腆w載體尤其是淀粉等。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的是提供按照上述類別的化合物的不同化合物的各種制劑，以便實(shí)現(xiàn)特定給藥途徑如口服、腸胃外、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)等。
上述不同類別的化合物的各種化合物也可以單獨(dú)或組合附屬于或包含在試劑盒中。除了各種化合物以外該試劑盒另外包含一種或多種附加成分(element)或化合物，其中該成分選自包含緩沖液、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和各種化合物的使用說(shuō)明的組。優(yōu)選地，各種化合物以干燥或液體形式存在，優(yōu)選作為每次單一給藥的單位劑量存在。試劑盒可以特別用于治療、診斷或監(jiān)視疾病或?qū)Ρ疚乃黾膊『图膊“Y狀施加的治療的進(jìn)展。
現(xiàn)在通過(guò)下列附圖和實(shí)施例進(jìn)一步舉例說(shuō)明本發(fā)明，其不意欲限制保護(hù)范圍。從所述附圖和實(shí)施例中，可以理解實(shí)施方案和優(yōu)勢(shì)，其中

圖1顯示生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的PI3-激酶途徑激活的圖示；圖2顯示同位PC-3小鼠模型中在用雷帕霉素處理后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的測(cè)量；圖3顯示鑒定PKNβ為PI3-激酶途徑下游藥靶的實(shí)驗(yàn)方法；圖4顯示對(duì)PKNβ的初級(jí)GeneBloc篩選；圖5顯示用PKNβ特異的GB轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞在matrigel上的生長(zhǎng)；圖6顯示通過(guò)在HeLaB細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)siRNA的RNA干擾；圖7顯示在使用蛋白激酶Nβ反義和有意義序列作為探針雜交后人前列腺細(xì)胞和人前列腺癌細(xì)胞的照片；圖8顯示描述使用兩種不同siRNA構(gòu)建體的同位前列腺腫瘤模型中原發(fā)性腫瘤體積的圖表(圖8A)，描述使用兩種不同siRNA構(gòu)建體的同位前列腺腫瘤模型中淋巴結(jié)體積轉(zhuǎn)移的圖表(圖8B)，和在使用對(duì)照siRNA(圖8C1)和蛋白激酶Nβ特異性siRNA構(gòu)建體(圖8C2)的同位前列腺腫瘤模型中前列腺和淋巴結(jié)的照片；圖9顯示不同蛋白激酶Nβ衍生物和它們的活性的蛋白質(zhì)印跡分析，使用MPB作為標(biāo)準(zhǔn)磷酸化底物，在HeLa細(xì)胞中瞬時(shí)過(guò)量表達(dá)，抗-蛋白激酶Nβ抗體(抗-PK)用于檢測(cè)激酶衍生物的相對(duì)表達(dá)水平(圖9A)，另外的不同蛋白激酶Nβ衍生物的蛋白質(zhì)印跡分析，使用磷酸化形式的蛋白激酶Nβ的特異性抗體(圖9B)，和所用各種蛋白激酶Nβ衍生物的圖示(圖9C)；圖10顯示各種蛋白激酶Nβ衍生物的蛋白質(zhì)印跡(圖10A)，監(jiān)視其在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)水平，和蛋白激酶Nβ衍生物的磷酸化的凝膠分析(圖10B)；圖11顯示檢測(cè)蛋白激酶Nβ的蛋白質(zhì)底物磷酸化的免疫沉淀測(cè)定結(jié)果，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法(圖11A)或通過(guò)放射自顯影檢測(cè)摻入32P-標(biāo)記的磷酸鹽(圖11B)來(lái)檢測(cè)其磷酸化形式。為了確保在各個(gè)免疫沉淀物中存在可比較量的PKNβ，使用抗-PKNβ抗體重探測(cè)圖11A所示的濾液(“激酶”，圖11C)。
圖12顯示比較用LY294002處理不同時(shí)間的樣品中HeLa和PC-3細(xì)胞中內(nèi)源蛋白激酶Nβ的表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析。平行監(jiān)視磷酸化AKT的水平以證實(shí)PI3-激酶抑制劑的功效。
圖13顯示免疫-復(fù)合體中存在的各種重組PKNβ衍生物的相對(duì)蛋白質(zhì)量和激酶活性。在裂解指定時(shí)間之前已經(jīng)用PI3-激酶抑制劑LY294002處理表達(dá)各種重組蛋白質(zhì)的細(xì)胞。
圖14顯示一組照片，其中通過(guò)聚焦熒光顯微鏡研究PKNβ及其衍生物如PKNβ野生型(圖14A)、PKNβ衍生物TA(圖14B)、PKNβ衍生物KE(圖14C)和PKNβδN(圖14D)的細(xì)胞分布。HA-標(biāo)記的PKNβ重組衍生物在HeLa細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)48小時(shí)。在固定和透化處理以后，通過(guò)使用抗-HA抗體接著FITC-偶聯(lián)的抗小鼠抗體檢測(cè)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)。通過(guò)用羅丹明-鬼筆毒環(huán)肽標(biāo)記細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白來(lái)復(fù)染細(xì)胞。
圖1顯示生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的PI3-激酶途徑激活的圖示。生長(zhǎng)因子刺激細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞膜上它們相關(guān)受體的激活，其又與胞內(nèi)信號(hào)分子如PI3-激酶相關(guān)并將其激活。腫瘤抑制劑PTEN干擾PI3-激酶介導(dǎo)的下游應(yīng)答和確保途徑的激活以瞬時(shí)方式發(fā)生。LY294002是PI3-激酶的小分子抑制劑。PI3-K的一個(gè)已知下游基因是mTOR(雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶)，其可以通過(guò)臨床批準(zhǔn)的藥物雷帕霉素(Rapamune)抑制。PI3-K涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯、轉(zhuǎn)移和遷移的調(diào)節(jié)。X表示下游效應(yīng)物，其表示預(yù)計(jì)涉及促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移行為的潛在藥物靶。在途徑中作用于更下游的該類效應(yīng)物分子可能代表比更“上游”的靶如mTOR更好的藥靶，因?yàn)樗鼈兙哂休^小的多效作用。
結(jié)合下列實(shí)施例更詳細(xì)地討論圖2至圖5的主題。
圖6顯示通過(guò)在HeLaB細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)siRNA干擾。
(A)通過(guò)啟動(dòng)子(U6+2)驅(qū)動(dòng)表達(dá)靶特異序列(來(lái)源于目的基因的模板，含有21-鏈節(jié)的有意義和反向互補(bǔ)序列，連接12-鏈節(jié)的聚A序列)來(lái)產(chǎn)生siRNA分子。經(jīng)轉(zhuǎn)錄后RNA可能形成雙鏈siRNA分子。
(B)siRNA表達(dá)的靶基因的模板序列。將相應(yīng)的序列引入攜帶U6+2啟動(dòng)子盒的表達(dá)載體。
(C)siRNA表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的影響。通過(guò)在用于RNAi干擾實(shí)驗(yàn)的HeLaB細(xì)胞中轉(zhuǎn)染瞬時(shí)表達(dá)構(gòu)建體(見(jiàn)上文)。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收獲細(xì)胞，隨后接種(80000個(gè)細(xì)胞/孔)在“matrigel”凝膠上。通過(guò)在matrigel上測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)/增殖來(lái)分析RNA干擾對(duì)相應(yīng)基因的表達(dá)的影響。靶向PTEN的siRNA的表達(dá)對(duì)matrigel上HeLaB細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響(右圖)，而p110β和PKNβ特異的siRNA的表達(dá)嚴(yán)重干擾HeLaB在matrigel上的生長(zhǎng)行為(中圖和右圖)。
實(shí)施例1材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)人前列腺癌PC-3細(xì)胞獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物中心(ATCC)。細(xì)胞在F12K營(yíng)養(yǎng)混合物(Kaighn’s改進(jìn))中培養(yǎng)，該營(yíng)養(yǎng)混合物含有10％胎小牛血清(CS)，慶大霉素(50μg/ml)，和兩性霉素(50ng/ml)。按照制造商的使用說(shuō)明，通過(guò)使用各種陽(yáng)離子型脂質(zhì)如Oligofectamine，Lipofectamine(LifeTechnologies)，Argfectin50或Profectin50(Atugen/GOT Berlin，Germany)，或FuGene 6(Roche)，在96孔或10-cm板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染(30％-50％匯合)。通過(guò)將預(yù)形成的無(wú)血清培養(yǎng)基中的5x濃縮的GeneBloc和脂質(zhì)復(fù)合物加入完全培養(yǎng)基中的細(xì)胞來(lái)轉(zhuǎn)染GeneBlocs。對(duì)于平鋪在96孔中的細(xì)胞總轉(zhuǎn)染體積為100μl，對(duì)于10cm平板中的細(xì)胞為10ml。取決于細(xì)胞密度，最終脂質(zhì)濃度為0.8-1.2μg/ml；GeneBloc濃度在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中顯示。將培養(yǎng)的細(xì)胞胰蛋白酶消化，在通過(guò)培養(yǎng)基終止胰蛋白酶作用后收獲。加入洗滌步驟(PBS；離心5分鐘/1000rpm)，最后，考慮接種的細(xì)胞數(shù)和體積重懸浮沉淀。
通過(guò)Taqman分析測(cè)定RNA水平的相對(duì)量使用Invisorb RNA HTS 96試劑盒(InVitek GmbH，Berlin)分離和純化在96-孔中轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的RNA。使用300nM PKNβ5’引物，300nM PKNβ3’引物和100nM標(biāo)記的PKNβTaqman探針Fam-Tamra，通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR(Taqman)分析檢測(cè)PKNβmRNA表達(dá)的抑制。按照制造商的使用說(shuō)明在下列條件下在50μl中進(jìn)行反應(yīng)并在ABI PRISM 7700測(cè)序儀(Applied Biosystems)上分析48℃30分鐘，95℃10分鐘，接著95℃15秒和60℃1分鐘40個(gè)循環(huán)。
在matrigel基質(zhì)上的體外生長(zhǎng)當(dāng)接種在Matrigel上時(shí)用5μM LY294002或DMSO處理PC3細(xì)胞。如果在接種前轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用GeneBloc轉(zhuǎn)染細(xì)胞和在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)胰蛋白酶消化。在培養(yǎng)基中洗滌細(xì)胞，接種到用250l matrigel基底膜基質(zhì)(BectonDickinson)預(yù)包被的雙份24-孔(每孔100.000個(gè)細(xì)胞)中。在溫育24-72小時(shí)后用與Axiovert S100顯微鏡(Zeiss)連接的Axiocam照相機(jī)以5x放大率照相。
Affymetrix根據(jù)制造商的方案，使用總RNA試劑盒(AMBION)制備來(lái)自Matrigel上生長(zhǎng)的細(xì)胞的總RNA。在最后步驟中將沉淀的總RNA重懸浮在Invisorb裂解緩沖液中并使用Invisorb spin細(xì)胞-RNA試劑盒(INVITEK)純化。根據(jù)Affymetrix的方案制備生物素標(biāo)記的cRNA，將15μg cRNA雜交到Affymetrix GeneChip組HG-U95上。
數(shù)據(jù)分析使用Affymetrix GeneChip軟件Microarray Suite v4.0分析原始數(shù)據(jù)。作為一組對(duì)應(yīng)于一個(gè)轉(zhuǎn)錄物的16-20個(gè)探針對(duì)的平均的與錯(cuò)配寡核苷酸相比完全匹配寡核苷酸的雜交信號(hào)的差異，計(jì)算每個(gè)探針組的強(qiáng)度。探針組的平均差異與轉(zhuǎn)錄物的豐度成比例。在比較前將不同測(cè)定的總信號(hào)強(qiáng)度換算成相同值。通過(guò)成對(duì)比較來(lái)自實(shí)驗(yàn)和基線測(cè)定的相應(yīng)探針對(duì)的強(qiáng)度，使用Affymetrix軟件計(jì)算倍數(shù)變化。使用Affymetrix描述的抉擇矩陣，軟件還產(chǎn)生絕對(duì)調(diào)用(call)(在實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)錄物缺乏，臨界或存在)和差異調(diào)用(與另一個(gè)實(shí)驗(yàn)相比一個(gè)實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)錄物的豐度增加，臨界增加，無(wú)變化，臨界降低，降低)。結(jié)果輸出到Microsoft Excel(絕對(duì)調(diào)用，差異調(diào)用，倍數(shù)變化)中并過(guò)濾。丟棄具有缺少調(diào)用或無(wú)變化調(diào)用的所有探針組并通過(guò)倍數(shù)變化將表分類。
動(dòng)物研究按照食品與藥物管理局的非臨床實(shí)驗(yàn)室研究的良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范(GLP條例)和根據(jù)作為立法基礎(chǔ)的德國(guó)動(dòng)物保護(hù)法進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。
雄性shoeNMRI-nu/nu小鼠(Tierzucht Schnwalde GmbH)，在SPF條件下保養(yǎng)(層流氣流設(shè)備，Scantainer，Scanbur)，用作人前列腺癌細(xì)胞的受體。將2×106/0,03ml腫瘤細(xì)胞接種到年齡為6-8周和重28-30g的動(dòng)物的前列腺的左背側(cè)葉(iprost；同位的)或肝臟的左側(cè)葉的頂部(ihep；異位的)。為此，小鼠接受全身麻醉，使用Ketanest(Parke-Davis GmbH)和Rompun(Bayer Vital GmbH)80∶1的混合物，劑量分別為100mg/kg和5mg/kg。在腹部身體表面徹底消毒后，通過(guò)腹部皮膚和腹膜壁進(jìn)行切割，從包皮腺邊緣附近開(kāi)始和測(cè)量約1cm。借助一對(duì)鑷子和棉拭，顯現(xiàn)前列腺。同位細(xì)胞攻擊，接著借助放大鏡和通過(guò)使用攜帶30G 0,30×13的微型手術(shù)針(Becton Dickinson)的1ml注射器(Henke Sass Wolf GmbH)。施用是成功的，在接種位點(diǎn)觀察到顯著皰疹。關(guān)于腹膜壁和腹部皮膚的Michel鉗11×2mm(Heiland)，通過(guò)縫合材料(PGA Resorba，F(xiàn)ranz Hiltner GmbH)閉合傷口。傷口噴霧(Hansaplast Sprühpflaster，Beiersdorf AG)覆蓋損傷。在手術(shù)后階段期間將動(dòng)物保養(yǎng)在溫暖環(huán)境中直至完全醒來(lái)。按照每組由5-10只動(dòng)物組成的治療組的數(shù)量隨機(jī)化動(dòng)物。依次檢查它們，包括記錄發(fā)現(xiàn)。施用Ssniff NM-Z，10mm，可高壓滅菌(ssniff Spezialditen GmbH)，作為強(qiáng)化食物和通過(guò)HCl酸化飲用水，兩者都任意。
評(píng)估為了收到實(shí)際劑量水平，在治療日登記體重。同時(shí)，從體重發(fā)展可以獲得以認(rèn)識(shí)治療方式對(duì)整個(gè)生物體的影響。
在第0(基線)；14；28；和35天(犧牲)進(jìn)行血穿刺。從短期麻醉的動(dòng)物(二乙醚，Otto Fischar GmbH)的眼眶靜脈中吸血。為治療的相容性和副作用提供數(shù)據(jù)的評(píng)估參數(shù)如下白細(xì)胞數(shù)；血小板數(shù)；酶。另外的血載參數(shù)是膽紅素；肌酸酐；蛋白質(zhì)；脲；尿酸。
將所有犧牲的動(dòng)物完全解剖并照相記錄。通過(guò)一對(duì)測(cè)徑器二維測(cè)量腫瘤(前列腺)和轉(zhuǎn)移瘤(尾部，腰部，腎淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤)。按照V(mm3)＝ab2/2計(jì)算體積，b＜a。通常，實(shí)施治療方法的細(xì)胞數(shù)導(dǎo)致關(guān)于前列腺100％的腫瘤吸收。登記一些器官(肝臟；脾；腎)的重量以便發(fā)現(xiàn)另外的關(guān)于了解次級(jí)副作用的數(shù)據(jù)。
對(duì)于組織學(xué)分析，將腫瘤組織，即前列腺腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤的樣品固定在5％甲醛中并包埋石蠟。常規(guī)地，將切片HE染色，如果需要制備特異染色(Azan，PAS)。
為了檢測(cè)腫瘤和轉(zhuǎn)移細(xì)胞的人源，將充分的組織樣品冷凍在液氮中。當(dāng)使用PCR和用huHPRT特異擴(kuò)增子的Taqman分析時(shí)，我們可以在5mg組織中檢測(cè)到50個(gè)人細(xì)胞。
通過(guò)Mann和Whitney u-檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)證實(shí)治療結(jié)果。
實(shí)施例2對(duì)下游藥靶適合性概念的實(shí)驗(yàn)證據(jù)如在結(jié)合于此作為參考的本說(shuō)明書(shū)介紹部分中概述，與信號(hào)途徑下游連接的靶對(duì)于設(shè)計(jì)或開(kāi)發(fā)藥物和診斷劑都有價(jià)值。明顯的是，如果特定靶與其它不同途徑連接或者由于它在信號(hào)途徑中的位置與許多生物學(xué)現(xiàn)象連接如轉(zhuǎn)移和遷移、生長(zhǎng)翻譯細(xì)胞調(diào)亡、細(xì)胞周期、DNA修復(fù)等，如在PI-3激酶的情形中，處理該靶的任何化合物可能具有多種副作用，其可能對(duì)系統(tǒng)有害和從醫(yī)學(xué)觀點(diǎn)來(lái)看是不希望有的。因此，進(jìn)一步作用下游的靶應(yīng)當(dāng)是治療干預(yù)的第一選擇。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在PI3-激酶途徑的控制下涉及除了mTOR以外的另外可能的藥靶，其特異性用于控制轉(zhuǎn)移和遷移的現(xiàn)象和因此腫瘤發(fā)生。在制藥工業(yè)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)以Rapamune的商品名出售的雷帕霉素適合于抑制轉(zhuǎn)移和遷移。這證實(shí)了處理下游藥靶的策略的適合性。
如從圖2中可以知道，雷帕霉素適于減小淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤的體積和因此其效果比得上公知的PI3-激酶抑制劑LY294002。如在圖2A中描述，使用腫瘤獲得模型，在第1天開(kāi)始使用雷帕霉素的處理。使用的兩個(gè)濃度，即0.4mg/kg/劑量-2mg/kg/劑量導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度的巨大降低，表示為與磷酸鹽緩沖鹽水陰性對(duì)照相比測(cè)量的轉(zhuǎn)移瘤體積(mm3)。
對(duì)于組織學(xué)分析，將腫瘤組織，即前列腺腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤的樣品固定在5％甲醛中并包埋石蠟。常規(guī)地，將切片HE染色，如果需要制備特異染色(Azan，PAS)。
在從第28天開(kāi)始處理的Rapamune處理確立(established)腫瘤模型的情形中也基本上獲得相同結(jié)果。
測(cè)量在用雷帕霉素(Rapamune)處理以后在同位PC-3小鼠模型中的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。在圖2(A)中顯示(A)腫瘤獲得模型的結(jié)果。用0.03ml前列腺內(nèi)2×106PC3細(xì)胞注射裸shoeNMRI-nu/nu小鼠(每組8只)，每日腹膜內(nèi)使用Rapamune進(jìn)行處理，共28天，劑量為2mg/kg和0.4mg/kg。PBS用作對(duì)照。
為了處理確立的腫瘤(B)，允許細(xì)胞ipros生長(zhǎng)28天，在移植后第29天至第50天口服使用Rapamune進(jìn)行處理。如A中概述選擇劑量。分別在第29天和第51天犧牲動(dòng)物，測(cè)定總淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
實(shí)施例3鑒定PKNβ作為PI3-激酶途徑中的下游藥靶基本實(shí)驗(yàn)方法在圖3中顯示。用DMSO或PI3-K抑制劑LY294002處理在Matrigel上培養(yǎng)的PC3細(xì)胞，從每個(gè)樣品中分離總RNA。進(jìn)行差異Affymetrix基因表達(dá)作圖，使用實(shí)時(shí)RT-PCR Taqman測(cè)定證實(shí)表達(dá)。將p110用作無(wú)差異的標(biāo)準(zhǔn)。PC3細(xì)胞是PTEN-/-的，這意味著腫瘤抑制劑PTEN確實(shí)在這些細(xì)胞中缺乏，以致PI3-激酶途徑被永久激活，導(dǎo)致細(xì)胞增加的轉(zhuǎn)移活性或行為，其表現(xiàn)為它們?cè)趍atrigel測(cè)定中的生長(zhǎng)模式。具有侵入生長(zhǎng)潛力的細(xì)胞在基底膜如matrigel基質(zhì)上顯示增強(qiáng)生長(zhǎng)。(Petersen，O.W.，Ronnov-Jessen，L.，Howlett，A.R.和Bissell，M.J.(1992)Interaction withbasement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiationpattern of normal and malignant human breast epithelial cells.Proc Natl AcadSci U S A，89，9064-9068.(AuchSternberger et al.，2002 Antisense & Nucleicacid drug development 12131-143)。
與其相關(guān)應(yīng)當(dāng)注意PC3細(xì)胞在matrigel上生長(zhǎng)并將這當(dāng)作接近體內(nèi)環(huán)境的模型系統(tǒng)，從中分離的RNA假定比獲自生長(zhǎng)在非-matrigel環(huán)境如常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞的任何制劑更接近原位情形或結(jié)果。
實(shí)施例4篩選針對(duì)蛋白激酶Nβ的最優(yōu)反義寡核苷酸如所述用不同的GeneBloc濃度轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞，使用Taqman測(cè)定在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)測(cè)定mRNA水平，該測(cè)定使用300nM PKNβ特異的正向和反向引物和100nM探針和人-肌動(dòng)蛋白的40nM正向和反向引物和100nM探針。將mRNA水平對(duì)內(nèi)部肌動(dòng)蛋白水平標(biāo)準(zhǔn)化，顯示相對(duì)于GBC(用GeneBloc Control轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)的量。
其結(jié)果在圖4中顯示。從圖4中，作為特別有利的反義寡核苷酸，選擇GeneBlocs 70210和70211用于進(jìn)一步研究。
關(guān)于在各種實(shí)施例中本文使用的GeneBloc，應(yīng)當(dāng)注意它們都是本文指定的第三代反義寡核苷酸，這意味著，從表1中也是明顯的，大寫(xiě)字母代表脫氧核苷核苷酸，其通過(guò)硫代磷酸酯而不是磷酸二酯鍵連接。
表1所用各種GeneBlocs、它們的別名、相對(duì)于靶核酸的錯(cuò)配和它們的序列和結(jié)構(gòu)特性的綜述
各種GeneBlocs對(duì)應(yīng)于下列SEQ.ID.Nos70669SEQ.ID.No.370670SEQ.ID.No.424536SEQ.ID.No.524537SEQ.ID.No.624538SEQ.ID.No.770210SEQ.ID.No.870211SEQ.ID.No.970671SEQ.ID.No.1070676SEQ.ID.No.1170677SEQ.ID.No.12另外應(yīng)當(dāng)注意，考慮到以上反義寡核苷酸是GeneBlocs即第三代反義寡核苷酸的事實(shí)，以上的任何“t”實(shí)際上是“u”。
實(shí)施例5選擇性剔除蛋白激酶Nβ為了證明蛋白激酶Nβ是PI3-激酶途徑適合的下游藥靶，將獲自實(shí)施例4的兩個(gè)特別有利的GeneBlocs用于基于matrigel的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。將Matrigel生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)當(dāng)作顯示各個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移和遷移行為的替代模型。將更匯合的細(xì)胞生長(zhǎng)當(dāng)作它們的轉(zhuǎn)移和遷移行為增加的指示，這允許細(xì)胞擴(kuò)展到matrigel提供的三維結(jié)構(gòu)上。
如所述轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞并接種在matrigel上，監(jiān)視生長(zhǎng)。從接種在matrigel上的等份細(xì)胞中分離mRNA，并使用Taqman測(cè)定分析(作圖)。將PKNβ特異的mRNA對(duì)內(nèi)源p110αmRNA水平標(biāo)準(zhǔn)化。將PTEN特異的GeneBloc用作PTEN-/-PC-3細(xì)胞中的陰性對(duì)照，將p110α特異的GeneBloc用作胞外基質(zhì)中生長(zhǎng)的陽(yáng)性對(duì)照。通過(guò)分別比較PKNβ特異的GeneBloc 70210或70211和它們對(duì)應(yīng)的錯(cuò)配寡核苷酸70676和70677處理的細(xì)胞的生長(zhǎng)，顯示特異的生長(zhǎng)抑制。
各自的結(jié)果也在圖5中舉例說(shuō)明。從這可以知道基因塊70211和70210可能是制備治療本文所述疾病和疾病癥狀的藥物或診斷劑的適當(dāng)化合物。
實(shí)施例6通過(guò)在HeLaB細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)siRNA的RNA干擾本實(shí)驗(yàn)是成功設(shè)計(jì)允許特異性處理下游藥靶蛋白激酶Nβ的siRNA的實(shí)例。如圖6(A)所示，通過(guò)啟動(dòng)子(U6+2)驅(qū)動(dòng)表達(dá)靶特異序列(來(lái)源于目的基因的模板，含有21-鏈節(jié)的有意義和反向互補(bǔ)序列，連接12-鏈節(jié)的聚A序列)來(lái)產(chǎn)生siRNA分子。經(jīng)轉(zhuǎn)錄后RNA可能形成雙鏈siRNA分子。
在與針對(duì)PKNβ的mRNA序列設(shè)計(jì)的siRNA相同的載體構(gòu)建體中，將各種構(gòu)建體如p110β和PTEN分別用作陽(yáng)性和陰性對(duì)照。各自的設(shè)計(jì)在圖6中顯示。(B)是siRNA表達(dá)的靶基因的模板序列，將其導(dǎo)入攜帶U6+2啟動(dòng)子盒的表達(dá)載體。
通過(guò)轉(zhuǎn)染到用于RNAi干擾實(shí)驗(yàn)的HeLaB細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)構(gòu)建體。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收獲細(xì)胞，隨后接種(80000個(gè)細(xì)胞/孔)在“matrigel”上。通過(guò)測(cè)定在matrigel上轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)/增殖來(lái)分析RNA干擾對(duì)相應(yīng)基因的表達(dá)的影響。靶向PTEN的siRNA的表達(dá)對(duì)matrigel上HeLaB細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響(右圖)，而p110β和PKNβ特異的siRNA的表達(dá)嚴(yán)重干擾HeLaB在matrigel上的生長(zhǎng)行為(中圖和右圖)。
鑒于此，特定siRNA序列證明是治療本文公開(kāi)的疾病和疾病癥狀的有效方式。
實(shí)施例7在人前列腺腫瘤中檢測(cè)蛋白激酶Nβ為了提供進(jìn)一步的證據(jù)證明蛋白激酶Nβ是治療前列腺腫瘤的適合的靶，將各種人前列腺組織進(jìn)行原位雜交。
對(duì)于原位雜交從pCR4 Topo載體中序列NM 013355的核苷酸位置1672-2667制備有意義和反義鏈，因此將T7和T3聚合酶用于擴(kuò)增目的。人前列腺腫瘤細(xì)胞(PC-3)在小鼠中生長(zhǎng)。在解剖后，將組織冷凍在-20℃異戊烷溶液中，在-15℃切片并保存在-80℃。在雜交前將切片在多聚甲醛中固定。將人腫瘤標(biāo)本在多聚甲醛中固定并石蠟包埋。將腫瘤標(biāo)本用蛋白酶K處理并乙酰化。用35S-ATP和35S-UTP雙鏈標(biāo)記核酸探針，并與組織在58℃在含有50％甲酰胺的雜交緩沖液(0.4M NaCl，50％甲酰胺，1xDenhardt’s，10mM Tris，1mM EDTA，10％葡聚糖硫酸酯，10μg/ml每種tRNA和鮭精DNA，10mM DTT)中溫育。
原位雜交的結(jié)果在圖7中描述。使用前列腺腫瘤原位雜交的蛋白激酶Nβ反義探針，腺被強(qiáng)烈染色(圖7A)。與其相反，健康的前列腺組織染色較少并且僅提供背景信號(hào)，再次使用反義探針(圖7C)。與其相反，關(guān)于兩種組織有意義探針的使用不提供任何信號(hào)。
實(shí)施例8通過(guò)siRNa體內(nèi)減少原發(fā)性腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤本實(shí)施例涉及靶基因的體內(nèi)證實(shí)，使用同位前列腺腫瘤模型，其中通過(guò)使用針對(duì)蛋白激酶Nβ的siRNA可以顯示原發(fā)性腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤的減少都可以實(shí)現(xiàn)。結(jié)果在圖8A-8C中描述。
在圖8A的圖表中，使用下列兩個(gè)siRNA構(gòu)建體中任何一種可以顯著減小如實(shí)施例1中所述測(cè)定的同位前列腺腫瘤模型中的原發(fā)性腫瘤的體積5’actgagcaagaggctttggag或5’aaattccagtggttcattcca。
作為陰性對(duì)照使用針對(duì)p110-α亞基的siRNA，作為陽(yáng)性對(duì)照使用針對(duì)p110-β亞基的siRNA。陽(yáng)性對(duì)照因此作用于蛋白激酶NβPTEN的上游調(diào)節(jié)物。
另一組兩個(gè)獨(dú)立的siRNA分子被用于降解淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移瘤中編碼蛋白激酶Nβ的mRNA。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤是在下列淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)的繼發(fā)性腫瘤尾部，腰部，腎和縱隔淋巴結(jié)，其中尾淋巴結(jié)與前列腺最近，縱隔淋巴結(jié)與移植腫瘤最遠(yuǎn)。如在原發(fā)性腫瘤的情形中，siRNA構(gòu)建體明顯成功地減少了編碼蛋白激酶Nβ的mRNA和由此減小了腫瘤體積(圖8B)。陽(yáng)性和陰性對(duì)照如關(guān)于原發(fā)性腫瘤減小所討論的。在兩種情形(即原發(fā)性腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤)中，將人前列腺腫瘤細(xì)胞遺傳改造以從聚合酶III U6啟動(dòng)子表達(dá)各自的siRNA分子。
除了這些結(jié)果以外，如圖8C1和圖8C2所描述的清楚的表型分析顯示經(jīng)激活人前列腺腫瘤細(xì)胞中的siRNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄后，可以顯著減少淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤，在圖8C1中描述的腫脹的淋巴結(jié)在如圖8C2描述的siRNA處理的組織中不存在。
實(shí)施例9蛋白激酶Nβ的功能表征本實(shí)施例涉及蛋白激酶Nβ的功能表征，更具體地涉及衍生化，即截短或突變蛋白激酶Nβ的功能氨基酸殘基對(duì)其激酶活性和對(duì)其激酶活性受磷酸化調(diào)節(jié)的影響。
如也在圖9C中至少部分用示意圖描述，產(chǎn)生下列蛋白激酶Nβ的衍生物，氨基酸殘基是指本文公開(kāi)的野生型序列a)包含氨基酸535-889的激酶結(jié)構(gòu)域；b)包含氨基酸288-889的ΔN；c)在位置588處具有賴氨酸至精氨酸的突變的激酶結(jié)構(gòu)域；d)在位置588處具有賴氨酸至谷氨酸的突變的激酶結(jié)構(gòu)域；e)激酶結(jié)構(gòu)域的衍生物，其在磷酸化位點(diǎn)(AGC激活環(huán)共有序列)具有突變，氨基酸位置718的蘇氨酸殘基被改變?yōu)楸彼?TA718)或天冬氨酸或谷氨酸(TD718或TE718)；和f)全長(zhǎng)野生型PKNβ分子(889個(gè)氨基酸)。
將各自片段在HeLa細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。它們的相對(duì)表達(dá)通過(guò)Hela細(xì)胞提取物使用抗-PKNβ抗體的蛋白質(zhì)印跡分析測(cè)定。
在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)PKNβ的C-末端氨基酸(609-889)以后產(chǎn)生多克隆抗-PKNβ抗血清。按照標(biāo)準(zhǔn)方法從包函體中凝膠純化各種蛋白質(zhì)片段，回收并濃縮。
蛋白激酶Nβ在其C-末端的催化結(jié)構(gòu)域與AGC-類型的激酶分子具有同源性。該激酶家族其特征在于催化結(jié)構(gòu)域的激活環(huán)中保守的蘇氨酸殘基，為了酶促活性需要將其磷酸化。由于該蘇氨酸和激活環(huán)周?chē)被岬母弑Ｊ匦裕槍?duì)該位點(diǎn)的抗-磷酸抗體可從商業(yè)來(lái)源中獲得。在圖9中將這些各種抗體稱為抗-P*-PRK，在圖10中稱為抗-P*-AGC激酶。
MPB是髓鞘堿性蛋白，其是標(biāo)準(zhǔn)體外磷酸化底物。
獲得下列結(jié)果
*+有活性-無(wú)活性！沒(méi)有觀察到如可以從其它激酶可比較的突變中期望的“超活化”(Morgan和Debond，1994)。
結(jié)果在圖9中描述。
圖9A顯示不同蛋白激酶Nβ衍生物和它們的活性的凝膠分析，使用MPB作為標(biāo)準(zhǔn)磷酸化底物，在HeLa細(xì)胞中瞬時(shí)過(guò)量表達(dá)。如可以從圖9A中獲知，除了全長(zhǎng)蛋白激酶Nβ以外，僅其野生型形式的激酶結(jié)構(gòu)域在磷酸化MPB中有活性。
使用相同的蛋白激酶Nβ衍生物，可以觀察到除了包含在位置718處具有突變T/A的激酶結(jié)構(gòu)域的衍生物以外，無(wú)論它們另外的內(nèi)在活性，所有展示的其它衍生物也被磷酸化。
數(shù)據(jù)顯示功能激酶結(jié)構(gòu)域的存在和位置718處的磷酸化是PKNβ激酶活性的前提條件。然而，如從ΔN形式不能用作激酶可以得出結(jié)論，它們是不足夠的。數(shù)據(jù)還顯示PKNβ在氨基酸718處不自磷酸化，而是需要通過(guò)另外的激酶分子磷酸化，因?yàn)榧っ溉毕菪蚄R588突變體蛋白質(zhì)在位置718處保持磷酸化。
實(shí)施例10全長(zhǎng)PKNβ的表征為了分析全長(zhǎng)分子中蛋白激酶Nβ的功能氨基酸殘基的突變，如圖10和11所示進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)為了測(cè)量PKNβ的體外激酶活性，重組HA-或Myc-標(biāo)記的PKNβ衍生物在HeLa或COS-7細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。較小的激酶結(jié)構(gòu)域衍生物用作對(duì)照。平行用如實(shí)施例9所述抗-蛋白激酶Nβ抗體(圖10A)探測(cè)含有重組形式的蛋白激酶Nβ的細(xì)胞提取物，以證明可比較的表達(dá)水平，和用抗-磷酸AGC位點(diǎn)抗體(也稱為抗-P*-AGC-激酶)(圖10B)檢測(cè)以顯示蛋白激酶Nβ衍生物體內(nèi)不同磷酸化程度。
實(shí)施例11全長(zhǎng)蛋白激酶Nβ的活性的磷酸化要求和開(kāi)發(fā)非放射性體外激酶測(cè)定-蛋白激酶Nβ對(duì)HTS測(cè)定的適合性通過(guò)使用抗-標(biāo)記抗體從圖10所示細(xì)胞提取物中免疫沉淀PKNβ-衍生的分子。如所述(Klippel等，1996)洗滌免疫沉淀并分成兩半。一半與緩沖液中作為磷酸化底物的5μg MBP(UBI)，4mM MgCl2和γ-32P-ATP在室溫下溫育10分鐘。另外，如Klippel等，1998加入磷酸酶抑制劑和非特異性作用的激酶的抑制劑。在通過(guò)16％SDS-PAGE分離反應(yīng)產(chǎn)物以后通過(guò)放射自顯影檢測(cè)放射性磷酸鹽的摻入(圖11B)。
將免疫沉淀的第二半份與作為磷酸化底物的1μg GST-GSK3融合蛋白(Cell Signaling Technology)在200μM rATP的存在下溫育。隨后通過(guò)8-16％梯度SDS-PAGE和使用抗-磷酸GSK3α抗體(Cell SignalingTechnology)的蛋白質(zhì)印跡法分析反應(yīng)混合物(圖11A)。任何提取濾液和用抗-PKNβ抗血清重探測(cè)以證實(shí)各自免疫沉淀中可比較量的PKNβ蛋白質(zhì)的存在(圖11C)。
通過(guò)與活性蛋白平行分析激酶缺陷型變體(例如在ATP結(jié)合位點(diǎn)含有突變，參見(jiàn)以上)控制體外磷酸化反應(yīng)的特異性。
其它為全長(zhǎng)野生型蛋白激酶Nβ，在蛋白激酶Nβ的氨基酸718處TA突變變體的情形中缺乏信號(hào)顯示該氨基酸殘基確實(shí)是抗體檢測(cè)的磷酸化位置(圖10B)。激酶缺陷型變體(如圖10和圖9分別顯示的KE或KR突變)在該位點(diǎn)被磷酸化的事實(shí)顯示蘇氨酸718不是自磷酸化的底物。而細(xì)胞中的另一種激酶必須負(fù)責(zé)該位點(diǎn)的磷酸化，其中PDK1是可能的候選物。
此外，從該實(shí)驗(yàn)結(jié)合實(shí)施例9的實(shí)驗(yàn)，顯示位置718處的蛋白激酶Nβ的磷酸化是蛋白激酶Nβ活性的前提條件；所有在該位點(diǎn)檢測(cè)的突變抑制磷酸化和導(dǎo)致無(wú)活性的激酶分子。因此特別優(yōu)選的可以結(jié)合本文公開(kāi)的本發(fā)明任何方面使用的蛋白激酶Nβ是在位置718處磷酸化的蛋白激酶Nβ或其衍生物，包括如本文所述僅包含激酶結(jié)構(gòu)域的衍生物。數(shù)據(jù)進(jìn)一步顯示全長(zhǎng)PKNβ也不在氨基酸718處自磷酸化，而是需要通過(guò)另一激酶分子磷酸化，因?yàn)榧っ溉毕菪蚄E588突變蛋白質(zhì)在位置718處保持磷酸化。
如可以從圖11中看出，可以將測(cè)定蛋白激酶Nβ的活性修改為允許篩選蛋白激酶Nβ抑制劑至高通量系統(tǒng)中的形式。
第一步，確定非放射性篩選形式的適合性，其中將如已經(jīng)結(jié)合實(shí)施例10討論的各種蛋白激酶Nβ衍生物用于磷酸化適當(dāng)?shù)孜?。該底物可以例如是MBP或GSK3肽，其典型地固定在適當(dāng)載體如瓊脂糖或sepharose珠或在塑料表面上。在本情形中和如圖11A所描述，底物是與副肌球蛋白融合的GSK3-衍生的肽。第一行顯示所有使用不同蛋白激酶Nβ衍生物的各種測(cè)定實(shí)際上含有所述衍生物。僅全長(zhǎng)野生型蛋白激酶Nβ或如實(shí)施例9所定義的激酶結(jié)構(gòu)域適合于磷酸化底物。通過(guò)抗-磷酸GSK3α抗體(以上所述)檢測(cè)本情形中的磷酸化底物。
為了確認(rèn)在圖11A中描述的非放射性方法足夠敏感，用一半免疫沉淀物使用MBP作為磷酸化底物平行進(jìn)行放射性方法。激酶活性的效力可以從產(chǎn)生的磷酸化的底物的量獲得，如摻入[32P]后放射自顯影所示。如從圖11A和11B中可以看出，全長(zhǎng)野生型蛋白激酶Nβ以及激酶結(jié)構(gòu)域顯示活性，而使用全長(zhǎng)KE和全長(zhǎng)TA突變蛋白質(zhì)分別未檢測(cè)到(圖11A)或檢測(cè)到非特異性激酶的背景活性(圖11B)。
總之，全長(zhǎng)野生型蛋白激酶Nβ以及本文公開(kāi)的激酶結(jié)構(gòu)域的使用是設(shè)計(jì)HTS形式的篩選方法的適當(dāng)靶或工具。各種步驟將因此包含a)鑒于蛋白質(zhì)需要被磷酸化以顯示激酶活性而這不容易通過(guò)在細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)完成的事實(shí)，通過(guò)在非細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)如昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)中(關(guān)于Klippel等，1997中不同激酶的實(shí)例)表達(dá)產(chǎn)生純化的重組蛋白激酶Nβ蛋白質(zhì)；b)固定化GSK3-衍生的底物或類似底物，和將底物與純化的蛋白激酶Nβ在rATP，MgCl2和抑制劑的存在下在緩沖液中溫育；c)任選地在連續(xù)洗滌和進(jìn)一步任選地隨后在Delfia或Lance測(cè)定系統(tǒng)(Perkin Elmer)中顯影后，通過(guò)適當(dāng)檢測(cè)工具如抗體如抗-磷酸-GSK3抗體檢測(cè)底物磷酸化，其中磷酸化位點(diǎn)被Europium-標(biāo)記的抗體結(jié)合。結(jié)合的Europium的量然后通過(guò)時(shí)間分辨熒光分析來(lái)定量。
實(shí)施例12內(nèi)源性PKN-β的表達(dá)水平測(cè)定在本實(shí)施例中提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明PKN-β以PI3-激酶依賴型方式表達(dá)。圖3中顯示的PKN-βRNA的PI3-激酶-依賴型表達(dá)在此進(jìn)一步在蛋白質(zhì)水平上證實(shí)。
如本文實(shí)施例1所述培養(yǎng)PC-3細(xì)胞。所述PC-3細(xì)胞是PTEN-/-。HeLa細(xì)胞獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物中心(ATCC)并如Sternberger等(2002)所述培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染在10-m板中進(jìn)行(30％-50％的匯合)，按照制造商的使用說(shuō)明使用Fugene 6(Roche，Nutley，NJ)。將培養(yǎng)的細(xì)胞胰蛋白酶消化，在通過(guò)培養(yǎng)基終止胰蛋白酶作用以后收獲。
用10μM LY294002或DMSO處理兩種細(xì)胞類型，即PC-3細(xì)胞和HeLa細(xì)胞指定時(shí)間，其中將DMSO用作LY294002的溶劑和因此作為陰性對(duì)照。
通過(guò)SDS-PAGE分級(jí)獲得的提取物，隨后通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法分析。使用各種抗體檢測(cè)所示蛋白質(zhì)如用作加樣對(duì)照的p110、內(nèi)源性PKN-β和磷酸化Akt的水平。磷酸化Akt(P*-Akt)用作LY294002-介導(dǎo)的處理的功效的對(duì)照。
結(jié)果在圖12中描述。
在PC-3細(xì)胞中PI-3-激酶的抑制導(dǎo)致內(nèi)源性PKN-β表達(dá)在24小時(shí)后可見(jiàn)的降低，在48小時(shí)處理后蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步降低。在表達(dá)較高量的PKN-β蛋白質(zhì)的HeLa細(xì)胞中，該作用較不顯著，但是在用LY294002處理48小時(shí)后可以檢測(cè)到減少的量。
從這可以得出結(jié)論，PI3-激酶控制PKN-β的表達(dá)。
實(shí)施例13PKN-β活性需要PI3-激酶在HeLa細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)重組野生型PKN-β或PKN-β的衍生物(如圖10-11中描述)。所述衍生物是如本文實(shí)施例10所述的PKN-β衍生物TA和衍生物KE。在每種情形中如上所述通過(guò)myc-標(biāo)記修飾PKN-β，其允許使用抗-Myc抗體沉淀PKN-β及其衍生物。
為了評(píng)估PKN-β的活性，如上所述進(jìn)行使用免疫沉淀的體外激酶活性。一半沉淀進(jìn)行體外激酶反應(yīng)，第二半份通過(guò)使用抗-磷酸-PRK抗體的蛋白質(zhì)印跡法分析。提取濾液并使用抗-PKN-β抗血清重探測(cè)。從較早提取的細(xì)胞裂解液等分部分中分析磷酸-p70 S6激酶水平，以證實(shí)甚至僅在3小時(shí)處理后LY294002處理的功效。抗-磷酸p70抗體獲自Cell signaling。
如從圖13可以看出，LY294002處理導(dǎo)致PKN-β激酶活性的強(qiáng)烈抑制，該活性在此再次通過(guò)MBP的磷酸化來(lái)測(cè)量。在僅3小時(shí)的處理后，該效果是明顯的，在24小時(shí)PKN-β活性幾乎完全被抑制。在LY294002抑制PI3-激酶后也損害PKN-β在位置718處的磷酸化，然而該影響沒(méi)有對(duì)激酶活性的影響明顯。
PKN-β的TA衍生物用作如上所述的無(wú)活性對(duì)照，和作為抗-磷酸PRK抗體對(duì)位置718(P*-PK)處的磷酸-蘇氨酸的特異性的對(duì)照。
PKN-β衍生物KE用作如上所述的激酶缺陷型對(duì)照。它的磷酸化狀態(tài)似乎在某種程度上還受LY294002處理的影響。這顯示負(fù)責(zé)在位置718上磷酸化PKN-β的激酶以PI3-激酶依賴型方式完成。
更重要地，本實(shí)驗(yàn)顯示PKN-β不僅受PI3-激酶通過(guò)它的表達(dá)水平調(diào)節(jié)(參見(jiàn)圖3和12)，它還在它激活水平上受調(diào)節(jié)。這些發(fā)現(xiàn)顯示PKN-β代表用于干擾超活性的PI3-激酶途徑以治療干預(yù)的“完美的”下游靶，因?yàn)樗耆蕾囉谠诟鞣N水平上由它調(diào)節(jié)的PI3-激酶。這允許產(chǎn)生對(duì)蛋白質(zhì)PKN-β和編碼其的核酸顯示不同效果的化合物。甚至更重要的，這種PKN-β在翻譯而不是轉(zhuǎn)錄水平上、即在表達(dá)的蛋白質(zhì)水平上的活性調(diào)節(jié)，似乎比轉(zhuǎn)錄水平上的影響更顯著和更持久。
按照本發(fā)明另外的篩選方法是基于這種特別的理解和在體外激酶測(cè)定中優(yōu)選使用放射性或非放射性作為讀出。
實(shí)施例14PKN-β的定位信號(hào)在本實(shí)驗(yàn)中將各種PKN-β衍生物的定位與野生型PKN-β的定位比較。圖14顯示照片，其中通過(guò)聚焦熒光顯微鏡研究PKN-β及其衍生物如PKN-β野生型(圖14A)、PKN-β衍生物TA(圖14B)、PKN-β衍生物KE(圖14C)和PKN-βΔN(圖14D)的細(xì)胞分布。HA-標(biāo)記的PKN-β重組衍生物在HeLa細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)48小時(shí)。在固定和透化后，通過(guò)使用抗-HA抗體接著FITC-偶聯(lián)的抗-小鼠抗體來(lái)檢測(cè)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)。通過(guò)用羅丹明-鬼筆毒環(huán)肽標(biāo)記細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白來(lái)復(fù)染細(xì)胞。
結(jié)果在圖14A-14D中描述，其中在每對(duì)照片的左側(cè)涉及經(jīng)FITC-特異激發(fā)的細(xì)胞照片，右方照片顯示經(jīng)使用羅丹明-鬼筆毒環(huán)肽特異的波長(zhǎng)激發(fā)后的相同細(xì)胞。FITC-染色顯示用各種重組蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。羅丹明-鬼筆毒環(huán)肽染色顯示轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
如可以從圖14A中獲得，野生型PKN-β主要定位于細(xì)胞核。PKN-βTA的磷酸化位點(diǎn)突變體和KE突變體都是激酶缺陷型，與野生型PKN-β相比不再濃縮在核內(nèi)，而是擴(kuò)散在整個(gè)細(xì)胞中。最后，如圖14D中所描述，PKN-β衍生物ΔN，缺少分子N-末端的三個(gè)和也是激酶缺陷型(參見(jiàn)圖9)，基本上排除在核以外。
這些數(shù)據(jù)顯示PKN-β對(duì)核的適當(dāng)核定位取決于它作為活性激酶分子的能力和涉及它N-末端結(jié)構(gòu)域的存在。這暗示PI-3激酶可能也調(diào)節(jié)它的細(xì)胞定位。
在說(shuō)明書(shū)、序列表、權(quán)利要求和/或附圖中公開(kāi)的本發(fā)明特征可以單獨(dú)地或以任何組合作為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明各種形式的材料。
序列表<110>atugen AG<120>蛋白激酶Nβ的另外應(yīng)用<130>A 19015 PCT<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>889<212>PRT<213>人類<220>蛋白激酶Nβ(PKNβ)<221>MISC FEATURE<222>(1)..(889)<223>
<400>1Met Glu Glu Gly Ala Pro Arg Gln Pro Gly Pro Ser Gln Trp Pro Pro1 5 10 15Glu Asp Glu Lys Glu Val Ile Arg Arg Ala Ile Gln Lys Glu Leu Lys20 25 30Ile Lys Glu Gly Val Glu Asn Leu Arg Arg Val Ala Thr Asp Arg Arg35 40 45His Leu Gly His Val Gln Gln Leu Leu Arg Ser Ser Asn Arg Arg Leu50 55 60Glu Gln Leu His Gly Glu Leu Arg Glu Leu His Ala Arg Ile Leu Leu65 70 75 80Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Ala Glu Pro Val Ala Ser Gly Pro Arg85 90 95Pro Trp Ala Glu Gln Leu Arg Ala Arg His Leu Glu Ala Leu Arg Arg100 105 110Gln Leu His Val Glu Leu Lys Val Lys Gln Gly Ala Glu Asn Met Thr115 120 125His Thr Cys Ala Ser Gly Thr Pro Lys Glu Arg Lys Leu Leu Ala Ala130 135 140Ala Gln Gln Met Leu Arg Asp Ser Gln Leu Lys Val Ala Leu Leu Arg145 150 155 160
Met Lys Ile Ser Ser Leu Glu Ala Ser Gly Ser Pro Glu Pro Gly Pro165 170 175Glu Leu Leu Ala Glu Glu Leu Gln His Arg Leu His Val Glu Ala Ala180 185 190Val Ala Glu Gly Ala Lys Asn Val Val Lys Leu Leu Ser Ser Arg Arg195 200 205Thr Gln Asp Arg Lys Ala Leu Ala Glu Ala Gln Ala Gln Leu Gln Glu210 215 220Ser Ser Gln Lys Leu Asp Leu Leu Arg Leu Ala Leu Glu Gln Leu Leu225 230 235 240Glu Gln Leu Pro Pro Ala His Pro Leu Arg Ser Arg Val Thr Arg Glu245 250 255Leu Arg Ala Ala Val Pro Gly Tyr Pro Gln Pro Ser Gly Thr Pro Val260 265 270Lys Pro Thr Ala Leu Thr Gly Thr Leu Gln Val Arg Leu Leu Gly Cys275 280 285Glu Gln Leu Leu Thr Ala Val Pro Gly Arg Ser Pro Ala Ala Ala Leu290 295 300Ala Ser Ser Pro Ser Glu Gly Trp Leu Arg Thr Lys Ala Lys His Gln305 310 315 320Arg Gly Arg Gly Glu Leu Ala Ser Glu Val Leu Ala Val Leu Lys Val325 330 335Asp Asn Arg Val Val Gly Gln Thr Gly Trp Gly Gln Val Ala Glu Gln340 345 350Ser Trp Asp Gln Thr Phe Val Ile Pro Leu Glu Arg Ala Arg Glu Leu355 360 365Glu Ile Gly Val His Trp Arg Asp Trp Arg Gln Leu Cys Gly Val Ala370 375 380Phe Leu Arg Leu Glu Asp Phe Leu Asp Asn Ala Cys His Gln Leu Ser385 390 395 400Leu Ser Leu Val Pro Gln Gly Leu Leu Phe Ala Gln Val Thr Phe Cys405 410 415
Asp Pro Val Ile Glu Arg Arg Pro Arg Leu Gln Arg Gln Glu Arg Ile420 425 430Phe Ser Lys Arg Arg Gly Gln Asp Phe Leu Arg Arg Ser Gln Met Asn435 440 445Leu Gly Met Ala Ala Trp Gly Arg Leu Val Met Asn Leu Leu Pro Pro450 455 460Cys Ser Ser Pro Ser Thr Ile Ser Pro Pro Lys Gly Cys Pro Arg Thr465 470 475 480Pro Thr Thr Leu Arg Glu Ala Ser Asp Pro Ala Thr Pro Ser Asn Phe485 490 495Leu Pro Lys Lys Thr Pro Leu Gly Glu Glu Met Thr Pro Pro Pro Lys500 505 510Pro Pro Arg Leu Tyr Leu Pro Gln Glu Pro Thr Ser Glu Glu Thr Pro515 520 525Arg Thr Lys Arg Pro His Met Glu Pro Arg Thr Arg Arg Gly Pro Ser530 535 540Pro Pro Ala Ser Pro Thr Arg Lys Pro Pro Arg Leu Gln Asp Phe Arg545 550 555 560Cys Leu Ala Val Leu Gly Arg Gly His Phe Gly Lys Val Leu Leu Val565 570 575Gln Phe Lys Gly Thr Gly Lys Tyr Tyr Ala lle Lys Ala Leu Lys Lys580 585 590Gln Glu Val Leu Ser Arg Asp Glu Ile Glu Ser Leu Tyr Cys Glu Lys595 600 605Arg Ile Leu Glu Ala Val Gly Cys Thr Gly His Pro Phe Leu Leu Ser610 615 620Leu Leu Val Cys Phe Gln Thr Ser Ser His Ala Arg Phe Val Thr Glu625 630 635 640Phe Val Pro Gly Gly Asp Leu Met Met Gln Ile His Glu Asp Val Phe645 650 655Pro Glu Pro Gln Ala Arg Phe Tyr Val Ala Cys Val Val Leu Gly Leu660 665 670
Gln Phe Leu His Glu Lys Lys Ile Ile Tyr Arg Asp Leu Lys Leu Asp675 680 685Asn Leu Leu Leu Asp Ala Gln Gly Phe Leu Lys Ile Ala Asp Phe Gly690 695 700Leu Cys Lys Glu Gly Ile Gly Phe Gly Asp Arg Thr Ser Thr Phe Cys705 710 715 720Gly Thr Pro Glu Phe Leu Ala Pro Glu Val Leu Thr Gln Glu Ala Tyr725 730 735Thr Gln Ala Val Asp Trp Trp Ala Leu Gly Val Leu Leu Tyr Glu Met740 745 750Leu Val Gly Glu Cys Pro Phe Pro Gly Asp Thr Glu Glu Glu Val Phe755 760 765Asp Cys Ile Val Asn Met Asp Ala Pro Tyr Pro Gly Phe Leu Ser Val770 775 780Gln Gly Leu Glu Phe Ile Gln Lys Leu Leu Gln Lys Cys Pro Glu Lys785 790 795 800Arg Leu Gly Ala Gly Glu Gln Asp Ala Glu Glu Ile Lys Val Gln Pro805 810 815Phe Phe Arg Thr Thr Asn Trp Gln Ala Leu Leu Ala Arg Thr Ile Gln820 825 830Pro Pro Phe Val Pro Thr Leu Cys Gly Pro Ala Asp Leu Arg Tyr Phe835 840 845Glu Gly Glu Phe Thr Gly Leu Pro Pro Ala Leu Thr Pro Pro Ala Pro850 855 860His Ser Leu Leu Thr Ala Arg Gln Gln Ala Ala Phe Arg Asp Phe Asp865 870 875 880Phe Val Ser Glu Arg Phe Leu Glu Pro885<210>2<211>2670<212>DNA<213>人類<220>
<221>mRNA
<222>(1)..(2670)<223>PKNβ的mRNA/cDNA<400>2atggaggagg gggcgccgcg gcagcctggg ccgagccagt ggcccccaga ggatgagaag 60gaggtgatcc gccgggccat ccagaaagag ctgaagatca aggagggggt ggagaacctg120cggcgcgtgg ccacagaccg ccgccacttg ggccatgtgc agcagctgct gcggtcctcc180aaccgccgcc tggagcagct gcatggcgag ctgcgggagc tgcacgcccg aatcctgctg240cccggccctg ggcctggccc agctgagcct gtggcctcag gaccccggcc gtgggcagag300cagctcaggg ctcggcacct agaggctctc cggaggcagc tgcatgtgga gctgaaggtg360aaacaggggg ctgagaacat gacccacacg tgcgccagtg gcacccccaa ggagaggaag420ctccttgcag ctgcccagca gatgctgcgg gacagccagc tgaaggtggc cctgctgcgg480atgaagatca gcagcctgga ggccagtggg tccccggagc cagggcctga gctactggcg540gaggagctac agcatcgact gcacgttgag gcagcggtgg ctgagggcgc caagaacgtg600gtgaaactgc ttagtagccg gagaacacag gaccgcaagg cactggctga ggcccaggcc660cagctacagg agtcctctca gaaactggac ctcctgcgcc tggccttgga gcagctgctg720gagcaactgc ctcctgccca ccctttgcgc agcagagtga cccgagagtt gcgggctgcg780gtgcctggat acccccagcc ttcagggaca cctgtgaagc ccaccgccct aacagggaca840ctgcaggtcc gcctcctggg ctgtgaacag ttgctgacag ccgtgcctgg gcgctcccca900gcggccgcac tggccagcag cccctccgag ggctggcttc ggaccaaggc caagcaccag960cgtggccgag gcgagcttgc cagtgaggtg ctggctgtgc taaaggtgga caaccgtgtt 1020gtggggcaga cgggctgggg gcaggtggcc gaacagtcct gggaccagac ctttgtcatc 1080ccactggagc gagcccgtga gctggagatt ggggtacact ggcgggactg gcggcagcta 1140tgtggcgtgg ccttcctgag acttgaagac ttcctggaca atgcctgtca ccaactgtcc 1200ctcagcctgg taccgcaggg actgcttttt gcccaggtga ccttctgcga tcctgtcatt 1260gagaggcggc cccggctgca gaggcaggaa cgcatcttct ctaaacgcag aggccaggac 1320ttcctgaggc gttcgcagat gaacctcggc atggcggcct gggggcgcct cgtcatgaac 1380ctgctgcccc cctgcagctc cccgagcaca atcagccccc ctaaaggatg ccctcggacc 1440ccaacaacac tgcgagaggc ctctgaccct gccactccca gtaatttcct gcccaagaag 1500acccccttgg gtgaagagat gacaccccca cccaagcccc cacgcctcta cctcccccag 1560gagccaacat ccgaggagac tccgcgcacc aaacgtcccc atatggagcc taggactcga 1620cgtgggccat ctccaccagc ctcccccacc aggaaacccc ctcggcttca ggacttccgc 1680tgcttagctg tgctgggccg gggacacttt gggaaggtcc tcctggtcca gttcaagggg 1740acagggaaat actacgccat caaagcactg aagaagcagg aggtgctcag ccgggacgag 1800
atagagagcc tgtactgcga gaagcggatc ctggaggctg tgggctgcac agggcaccct 1860ttcctgctct ccctccttgt ctgcttccag acctccagcc atgcccgctt tgtgactgag 1920tttgtgcctg gtggtgacct catgatgcag atccacgagg atgtcttccc cgagccccag 1980gcccgcttct acgtggcttg tgttgtcctg gggctgcagt tcttacacga gaagaagatc 2040atttacaggg acctgaagtt ggataacctt ctgctggatg cccagggatt cctgaagatc 2100gcagactttg gactctgcaa ggaagggatc ggcttcgggg accggactag caccttctgt 2160ggcaccccgg agttcctggc tcccgaggtg ctgacccagg aggcatacac acaggccgtc 2220gactggtggg cgctgggtgt gctgctctac gagatgctgg tgggtgagtg cccgttccca 2280ggggacacag aggaagaggt gtttgactgc atcgtcaaca tggacgcccc ctaccccggc 2340tttctgtcgg tgcaagggct tgagttcatt cagaagctcc tccagaagtg cccggagaag 2400cgcctcgggg caggtgagca ggatgccgag gagatcaagg tccagccatt cttcaggacc 2460accaactggc aagccctgct cgcccgcacc atccagcccc ccttcgtgcc taccctgtgt 2520ggccctgcgg acctgcgcta ctttgagggc gagttcacag ggctgccgcc tgccctgacc 2580ccacctgcac cccacagcct cctcactgcc cgccaacagg ccgccttccg ggacttcgac 2640tttgtgtcag agcgattcct ggaaccctga2670<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>RNA<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(15)<223>通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接的DNA<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(21)<223>RNA<400>3ggagguccag tttctgagag g 21<210>4<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>RNA<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(15)<223>通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接的DNA<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(21)<223>RNA<400>4uguuucacct tcagcuccac a 21<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(7)<223>RNA<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(16)<223>通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接的DNA<220>
<221>misc_feature<222>(17)..(23)<223>RNA<400>5aggacaacac aagccacgua gaa23<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(7)<223>RNA<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(16)<223>通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接的DNA<220>
<221>misc_feature<222>(17)..(23)<223>RNA<400>6gcucugacac aaagtcgaag ucc23<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(7)<223>RNA<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(16)<223>通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接的DNA<220>
<221>misc_feature<222>(17)..(23)<223>RNA<400>7gcagucaaac acctctuccu cug23<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(6)<223>RNA<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(15)<223>通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接的DNA<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(21)<223>通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接的DNA<400>8caacacggtt gtccaccuuu a 21<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>RNA<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(15)<223>通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接的DNA<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(21)<223>RNA<400>9ucagugcttt gatggcguag u 21<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>RNA
<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(15)<223>
<220>通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接的DNA<221>misc_feature<222>(16)..(21)<223>RNA<400>10cuucucgcag tacaggcucu c 21<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>RNA<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(15)<223>通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接的DNA<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(21)<223>RNA<400>11caagacgctt gtgcacguuu a 21<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>RNA<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(15)<223>通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接的DNA
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(21)<223>RNA<400>12ucagagctta gttggcguug u 2權(quán)利要求
1.蛋白激酶Nβ或其片段或衍生物作為PI 3-激酶途徑的下游靶、優(yōu)選作為PI 3-激酶途徑的下游藥靶的應(yīng)用。
2.蛋白激酶Nβ或其片段或衍生物在制備治療和/或預(yù)防疾病的藥物和/或制備用于診斷疾病的診斷劑中的應(yīng)用，其中所述疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌和與PI 3-激酶途徑有關(guān)的任何病理癥狀的組。
3.按照權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其特征在于蛋白激酶Nβ具有按照SEQ ID NO.1或按照數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)PID g7019489或數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)gi7019489的氨基酸序列，或其部分或衍生物。
4.編碼蛋白激酶Nβ或其片段或衍生物的核酸在治療和/或預(yù)防疾病和/或制備用于診斷疾病的診斷劑中的應(yīng)用，其中所述疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌和與PI 3-激酶途徑有關(guān)的任何病理癥狀的組。
5.按照權(quán)利要求4的應(yīng)用，其特征在于蛋白激酶Nβ具有按照SEQ IDNO.1或按照數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)PID g7019489或數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)gi 7019489的氨基酸序列，或其部分或衍生物。
6.按照權(quán)利要求4或5的應(yīng)用，其特征在于所述核酸是按照SEQ IDNO.2或按照數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)gi 7019488或NM_01335、優(yōu)選NM_01335.1的核酸。
7.按照權(quán)利要求1，4或5任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中蛋白激酶Nβ由按照SEQ ID NO.2或按照數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)gi 7019488或NM_01335、優(yōu)選NM_01335.1的核酸編碼。
8.按照權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中要不是遺傳密碼的簡(jiǎn)并性所述核酸序列將與如權(quán)利要求4所述的核酸雜交。
9.按照前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述核酸序列是在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與按照SEQ ID NO.2或按照數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)gi 7019488或NM_01335、優(yōu)選NM_01335.1的核酸序列或其部分雜交的核酸序列。
10.按照權(quán)利要求2-9中任何一項(xiàng)的應(yīng)用，其特征在于所述疾病特征在于與所述疾病有關(guān)的細(xì)胞缺少PTEN活性，顯示增加的攻擊行為，或是晚期腫瘤細(xì)胞。
11.按照權(quán)利要求2-10中任何一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述疾病是晚期腫瘤。
12.一種篩選用于治療和/或預(yù)防疾病和/或制備用于診斷疾病的診斷劑的試劑的方法，其中所述疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌和與PI 3-激酶途徑有關(guān)的任何病理癥狀的組，其包含以下步驟a)提供候選化合物，b)提供蛋白激酶Nβ的表達(dá)系統(tǒng)和/或檢測(cè)蛋白激酶Nβ活性的系統(tǒng)；c)將候選化合物與蛋白激酶Nβ的表達(dá)系統(tǒng)和/或檢測(cè)蛋白激酶Nβ活性的系統(tǒng)接觸；d)確定蛋白激酶Nβ的表達(dá)和/或活性是否在候選化合物的影響下改變。
13.按照權(quán)利要求12的方法，其特征在于所述候選化合物包含在化合物文庫(kù)中。
14.按照權(quán)利要求12或13的方法，其特征在于候選化合物選自包含肽，蛋白質(zhì)，抗體，抗促成素，功能核酸，天然化合物和小分子的各類化合物的組。
15.按照權(quán)利要求14的方法，其特征在于所述功能核酸選自包含適體，適配酶，核酶，spiegelmer，反義寡核苷酸和siRNA的組。
16.蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物和/或編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸作為開(kāi)發(fā)和/或制備用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物和/或制備用于診斷疾病的診斷劑的靶分子的應(yīng)用，其中所述疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌和與PI 3-激酶途徑有關(guān)的任何病理癥狀的組。
17.按照權(quán)利要求16的應(yīng)用，其特征在于所述藥物和/或診斷劑包含選自一種試劑，所述試劑選自包含抗體，肽，抗促成素，小分子，反義分子，適體，spiegelmer和RNAi分子的組。
18.按照權(quán)利要求17的應(yīng)用，其特征在于所述試劑與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用。
19.按照權(quán)利要求17的應(yīng)用，其特征在于所述試劑與編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸、特別是與蛋白激酶Nβ的mRNA、基因組核酸或cDNA相互作用。
20.與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的多肽在開(kāi)發(fā)或制備治療和/或預(yù)防疾病的藥物和/或制備用于診斷疾病的診斷劑中的應(yīng)用，其中所述疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌和與PI 3-激酶途徑有關(guān)的任何病理癥狀的組。
21.按照權(quán)利要求20的應(yīng)用，其特征在于所述多肽選自包含針對(duì)蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的抗體和結(jié)合蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的多肽的組。
22.與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的核酸在開(kāi)發(fā)或制備治療和/或預(yù)防疾病的藥物和/或制備用于診斷疾病的診斷劑中的應(yīng)用，其中所述疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌和與PI 3-激酶途徑有關(guān)的任何病理癥狀的組。
23.按照權(quán)利要求22的應(yīng)用，其特征在于所述核酸選自包含適體和spiegelmer的組。
24.與編碼蛋白激酶Nβ的核酸或其部分或衍生物相互作用的核酸在開(kāi)發(fā)或制備治療和/或預(yù)防疾病的藥物和/或制備用于診斷疾病的診斷劑中的應(yīng)用，其中所述疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌和與PI 3-激酶途徑有關(guān)的任何病理癥狀的組。
25.按照權(quán)利要求24的應(yīng)用，其特征在于相互作用的核酸是反義寡核苷酸，核酶和/或siRNA。
26.按照權(quán)利要求24或25的應(yīng)用，其特征在于編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸是cDNA，mRNA或hnRNA。
27.按照權(quán)利要求16-26中任何一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述蛋白激酶Nβ和/或編碼蛋白激酶Nβ的核酸是權(quán)利要求1-11中任何一項(xiàng)描述的一種。
28.按照權(quán)利要求12-15中任何一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白激酶Nβ和/或編碼蛋白激酶Nβ的核酸是權(quán)利要求1-11中任何一項(xiàng)描述的一種。
29.優(yōu)選用于預(yù)防和/或治療疾病的藥物組合物，該藥物組合物包含至少一種試劑和至少一種藥用載體，所述試劑選自包含蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物，與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物或與編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸相互作用的小分子，蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的特異性抗體，與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的多肽，編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸，與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的核酸或與編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸相互作用的核酸的組，其中所述疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌和與PI3-激酶途徑有關(guān)的任何病理癥狀的組。
30.表征疾病或癥狀的試劑盒，所述疾病或癥狀選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌和與PI 3-激酶途徑有關(guān)的任何病理癥狀的組，所述試劑盒包含至少一種試劑和任選地至少一種其它化合物，所述試劑選自包含蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物，蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的特異性抗體，與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的多肽，與編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸相互作用的多肽，與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的核酸，與編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸相互作用的核酸的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白激酶Nβ或其片段或衍生物作為PI 3－激酶途徑的下游靶、優(yōu)選作為PI 3－激酶途徑的下游藥靶的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1674929SQ03819435
公開(kāi)日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2003年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月14日
發(fā)明者A·克利佩爾-吉澤, J·考夫曼 申請(qǐng)人:阿圖根股份公司