專利名稱：：用于基因治療的eNOS突變體的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及用于基因治療的內(nèi)皮型—氧化氮合酶(eNOS)多肽突變體及編碼這種多肽突變體的多核苷酸。特別地，本發(fā)明提供了eNOS多肽突變體，其在相應于哺乳動物eNOS的一個功能域的氨基酸序列中有一或多個突變。更特別地，本發(fā)明涉及這樣的eNOS多肽突變體，其在相應于鈣調蛋白結合位點中的一個在哺乳動物細胞中是磷酸化的氨基酸殘基的位置有至少一個突變，其中在所述磷酸化位點有一個單突變的eNOS多肽突變體中所述突變不是一個氨基酸被取代為Ala或Asp。本發(fā)明還提供了使用這種eNOS多肽突變體和多核苷酸的預防、診斷和治療方法。
背景技術：
：內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS，也稱為ecNOS或NOS3)及由eNOS酶活性產(chǎn)生的氧化氮(NO)在眾多生理學過程中起重要作用，所述生理學過程包括例如血管發(fā)生、血管舒張、免疫調節(jié)、血小板聚集的抑制及平滑肌的松弛。eNOS活性的調節(jié)包括多種第二信使分子的參與及其與多肽上不同的功能區(qū)域的相互作用(見例如Marletta，M.TrendsinBiochem.Sciences(2001)26519-521)。eNOS的不同功能域的功能和位置已被充分鑒定，包括例如從N末端至C末端為一個豆蔻?；灿形稽c、棕櫚?；奈稽c、加氧酶結構域、鈣調蛋白結合位點及還原酶結構域(見例如圖1，也見例如Stuehr，D.J.Annu.Rev.Pharmnacol.Toxicol.(1997)37339-359)所述)。來自不同物種的eNOS序列的對比示出在每個功能域內(nèi)的高度序列相同性。另外，已知許多功能域的共有序列。在應答各種生物學刺激(例如細胞刺激)中，野生型eNOS的鈣調蛋白結合位點和還原酶結構域內(nèi)的氨基酸殘基通過許多特異性激酶或磷酸酶在體外或體內(nèi)被磷酸化或去磷酸化。另外，這些位點的磷酸化水平有助于調節(jié)eNOS酶活性(見例如Fultonetal.Nature(1999)399597-601)。在人野生型eNOS(SEQIDNO1)中，位于人野生型eNOS(SEQIDNO1)的還原酶結構域中的氨基酸殘基Ser-1177的絲氨酸取代產(chǎn)生一種對磷酸化(繼而對eNOS活性的激活)有抗性的或者是組成型活性的eNOS多肽(見例如WO00/62605)。在其它物種的eNOS中產(chǎn)生相應氨基酸殘基的一個取代時可見相似的結果(見例如WO00/62605所述)。一種鈣調蛋白(CaM)和鈣(Ca++)的復合物可以有效結合eNOS鈣調蛋白結合位點，并刺激eNOS活性(例如NO產(chǎn)生)。另外，CaM-Ca++復合物與eNOS的結合可通過鈣調蛋白結合位點內(nèi)一個特殊氨基酸殘基的磷酸化水平而實現(xiàn)。例如，當Thr-495被磷酸化時，鈣調蛋白結合可被抑制和/或eNOS的鈣調蛋白激活的Ca++依賴性可被抑制。如果在Thr-495的磷酸化被阻止，例如通過特異性激酶抑制劑或通過將Thr-495改變?yōu)锳la而進行阻止，則可刺激eNOS活性(見例如Busse等所述)。內(nèi)皮NO合酶參與本文所述的許多活性，而且這些eNOS多肽的異常表達和/或活性和/或由這些酶產(chǎn)生的NO的異常數(shù)量與許多疾病病癥相關。因此，細胞中eNOS多肽水平及活性的調節(jié)明顯代表一種有用的治療靶。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于基因治療的分離的內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)多肽突變體、編碼這種多肽的多核苷酸及其變體。特別地，本發(fā)明提供了這樣的eNOS多肽突變體，其在相應于哺乳動物eNOS一個功能域的氨基酸序列中有一或多個突變，其中至少一個突變在相應于鈣調蛋白結合位點中的一個在哺乳動物細胞中是磷酸化的氨基酸殘基的位置，而且在所述磷酸化位點有一個單突變的eNOS多肽突變體中所述突變不是一個氨基酸被取代為Ala或Asp。一方面，本發(fā)明提供了一種分離的人eNOS多肽突變體，其在相應于人eNOS多肽的優(yōu)選由SEQIDNO1編碼的人eNOS的第495位的位置有一個突變，其中在鈣調蛋白結合位點的磷酸化位點有一個單突變的eNOS多肽突變體中所述突變不是一個氨基酸被取代為Ala或Asp。在一些方面，相應于第495位的突變是一個氨基酸被取代為Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Met、Ser、Cys、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg或者His，優(yōu)選被取代為Val、Leu或Ile，最優(yōu)選被取代為Val。在一些方面，在eNOS多肽突變體有一個以上突變的情況中，相應于第495位的突變優(yōu)選是一個氨基酸被取代為Ala或Val。另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的人eNOS多肽突變體，其在相應于哺乳動物eNOS的鈣調蛋白結合位點中的一個在哺乳動物細胞中是磷酸化的氨基酸殘基的位置有至少一個突變；及在相應于哺乳動物eNOS的還原酶結構域中的一個在哺乳動物細胞中是磷酸化的氨基酸殘基的位置進一步包含至少一個突變。在一些方面，鈣調蛋白結合結構域中的突變是在相應于人eNOS的第495位氨基酸殘基的位置，而且是一個氨基酸被取代為Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Met、Ser、Cys、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg或His，優(yōu)選被取代為Val、Leu或Ile，最優(yōu)選被取代為Val；還原酶結構域中的突變是在相應于人eNOS的第1177位氨基酸殘基的位置，而且優(yōu)選是一個氨基酸被取代為Asp。在一些方面中，在eNOS多肽突變體有一個以上突變的情況中，相應于第495位的突變優(yōu)選是一個氨基酸被取代為Ala或Val。優(yōu)選地，人eNOS是由SEQIDNO1編碼的人eNOS。另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的人eNOS多肽突變體，其在相應于哺乳動物eNOS的鈣調蛋白結合位點中的一個在哺乳動物細胞中是磷酸化的氨基酸殘基的位置有至少一個突變，而且在相應于在哺乳動物eNOS的豆蔻?；稽c的一個氨基酸殘基的位置進一步包含至少一個突變。在一些方面，鈣調蛋白結合結構域中的突變是在相應于人eNOS的第495位氨基酸殘基的位置，而且是一個氨基酸被取代為Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、TyrTrp、Met、Ser、Cys、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg或His，優(yōu)選被取代為Val、Leu或Ile，最優(yōu)選被取代為Val；豆蔻?；稽c的突變是在相應于人eNOS的第2位氨基酸殘基的位置，而且是一個氨基酸被取代為Ala。在這一方面，當eNOS多肽突變體有一個以上突變時，相應于第495位的突變是一個氨基酸更優(yōu)選地被取代為Ala或Val。優(yōu)選地，人eNOS是由SEQIDNO1編碼的人eNOS。另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的eNOS多肽突變體，其包含1)在相應于哺乳動物eNOS的鈣調蛋白結合位點中的一個在哺乳動物細胞中是磷酸化的氨基酸殘基的位置的至少一個突變；2)進一步包含在相應于哺乳動物eNOS的豆蔻?；稽c的一個氨基酸殘基的位置的至少一個突變；3)在相應于哺乳動物eNOS的一個還原酶結構域中的一個在哺乳動物細胞中是磷酸化的氨基酸殘基的位置進一步包含一個突變。在一些方面，鈣調蛋白結合結構域中的突變是在相應于人eNOS的第495氨基酸殘基的位置，而且是一個氨基酸被取代為Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Met、Ser、Cys、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg或His，優(yōu)選被取代為Val、Leu或Ile，最優(yōu)選被取代為Val；在豆蔻酰化位點的突變是在相應于人eNOS的第2位氨基酸殘基的位置，而且是一個氨基酸被取代為Ala；還原酶結構域中的突變是在相應于人eNOS的第1177位氨基酸的位置，而且優(yōu)選是一個氨基酸被取代為Asp。在這一方面，當eNOS多肽突變體有一個以上突變時，相應于第495位的突變優(yōu)選是一個氨基酸被取代為Ala或Val。優(yōu)選地，人eNOS是由SEQIDNO1編碼的人eNOS。另一方面，本發(fā)明的eNOS多肽突變體的磷酸化與參考eNOS多肽相比增加或降低。另一方面，本發(fā)明的eNOS多肽突變體與參考eNOS多肽相比在多肽的Ca++-鈣調蛋白介導的刺激中的Ca++依賴性降低。另一方面，本發(fā)明的eNOS多肽突變體與參考eNOS多肽相比活性增加。一方面，本發(fā)明的eNOS多肽突變體與參考eNOS多肽相比NO的產(chǎn)生增加。一方面，本發(fā)明的eNOS多肽突變體與參考eNOS多肽相比還原酶活性增加。一方面，所述參考eNOS多肽是或衍生自人eNOS、優(yōu)選由SEQIDNO1編碼的人eNOS的氨基酸序列。另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的eNOS多肽突變體，其具有與野生型或突變的eNOS多肽的氨基酸序列基本同源的氨基酸序列。一方面，本發(fā)明提供了一種分離的eNOS多肽突變體，其具有與野生型eNOS或本發(fā)明的突變的eNOS多肽的氨基酸序列有95-99％序列相同性的氨基酸序列。優(yōu)選地，起始eNOS多肽是人eNOS多肽，最優(yōu)選是或衍生自人野生型eNOS多肽，例如由SEQIDNO1編碼的人eNOS。另一方面，本發(fā)明提供了一種編碼本發(fā)明的eNOS多肽突變體的多核苷酸。一方面，本發(fā)明提供了一種具有編碼本發(fā)明eNOS多肽突變體的多核苷酸的重組載體，其中所述多核苷酸可操縱地與至少一個調節(jié)序列連接，由此所述編碼的多肽在細胞中表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種包含本發(fā)明的eNOS多肽突變體的藥物組合物。另一方面，本發(fā)明提供了一種包含編碼本發(fā)明的eNOS多肽突變體的多核苷酸的藥物組合物。另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的eNOS多肽突變體的一種結合配偶體(bindingpartner)。一方面，所述結合配偶體是一種多肽。在另一方面，所述結合配偶體是一種抗體或抗原特異性片段。另一方面，本發(fā)明提供了一種調節(jié)細胞中eNOS活性的方法，所述方法包括給予細胞編碼本發(fā)明的eNOS多肽突變體的一種多核苷酸。另一方面，本發(fā)明提供了一種調節(jié)細胞中eNOS活性的方法，所述方法包括給予細胞本發(fā)明的eNOS多肽突變體。另一方面，本發(fā)明提供了一種診斷與異常eNOS活性相關的病癥的方法，所述方法包括1)將患者的細胞與編碼本發(fā)明的eNOS多肽突變體的多核苷酸接觸，2)檢測指示病癥的eNOS活性的水平。另一方面，本發(fā)明提供了一種預防或治療與異常eNOS活性相關的病癥的方法，所述方法包括給予需要治療的患者有效量的本發(fā)明的eNOS多肽突變體。另一方面，本發(fā)明提供了一種治療或預防與異常eNOS活性相關的病癥，其中所述方法包括給予需要治療的患者有效量的編碼本發(fā)明的eNOS多肽突變體的多核苷酸，由此所述多肽突變體在患者體內(nèi)表達。另一方面，本發(fā)明的預防和治療方法進一步包括在給予eNOS多肽突變體或編碼eNOS多肽的多核苷酸之前、期間或之后給予需要治療的患者一或多種血管生成因子。附圖簡述當與附圖一起閱讀時，從以下的描述種可以更充分理解本發(fā)明的前述或其它方面、其各種特征以及發(fā)明本身。圖1是例證了哺乳動物NOS的各種功能域的圖。所述功能域包括但非限于例如(從N末端至C末端)豆蔻?；囊粋€共有位點、兩個棕櫚?；稽c、一個氧化酶結構域、一個鈣調蛋白結合位點(例如人eNOS的第494-517位氨基酸)，其包含用于磷酸化的一個共有序列(例如人eNOS的Thr-495)、及一個還原酶結構域。NOS多肽的功能域還包括例如一個自身抑制環(huán)和一個血紅素結合部位。圖2是例證了具有單突變或雙突變的eNOS多肽突變體與由SEQIDNO1編碼的野生型人eNOS(WT)相比，在HEK293細胞中對NO產(chǎn)生的刺激作用的柱狀圖。有單突變的eNOS突變體在相應于由SEQIDNO1編碼的人eNOS的Thr-495的位置有一個氨基酸被取代為Asp(T495D)、Ala(T495A)或Val(T495V)。具有雙突變的eNOS多肽突變體在相應于由SEQIDNO1編碼的人eNOS的Ser-1177的位置有被取代為Asp的第一個氨基酸取代，在相應于由SEQIDNO1編碼的人eNOS的Thr-495的位置有第二個氨基酸取代，被取代為Asp(T495D+S1177D)、Ala(T495A+S1177D)或Val(T495V+S1177D)。圖3是例證了具有一個單突變的eNOS突變體與由SEQIDNO1(野生型)編碼的野生型eNOS相比，在人動脈內(nèi)皮細胞(HAEC)中對NO產(chǎn)生的刺激作用的柱狀圖。具有單突變的eNOS多肽突變體在相應于由SEQIDNO1編碼的人eNOS的Thr-495的位置有一個氨基酸被取代為Asp(T495D)、Ala(T495A)或Val(T495V)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于基因治療的內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)多肽突變體、編碼這些多肽的多核苷酸及其變體。特別地，本發(fā)明提供了在相應于哺乳動物eNOS的功能域的氨基酸序列中有一或多個突變的eNOS多肽突變體，其中至少一個突變在相應于鈣調蛋白結合位點中的一個在哺乳動物細胞中是磷酸化的氨基酸殘基的位置；而且在鈣調蛋白結合位點的磷酸化位點有一個單突變的eNOS多肽突變體中所述突變不是一個氨基酸被取代為Ala或Asp。本發(fā)明人已經(jīng)揭示了在人eNOS的鈣調蛋白結合位點中Thr-495殘基的特定氨基酸取代單獨(其中不是取代為Ala或Asp)或與在Ser-1177的第二個突變組合，與野生型人eNOS相比可提高細胞中eNOS活性(例如NO產(chǎn)生)(見例如實施例2所述)；在基因治療中使用這種eNOS多肽突變體可改善與eNOS活性相關的病癥(如美國專利申請系列No.60/403,637所述，在此并入?yún)⒖?。因此，本發(fā)明的eNOS多肽和方法可用于調節(jié)細胞中eNOS活性水平，從而提供一種治療與eNOS活性相關的疾病和病癥的新治療方法。例如，這種新方法通過多重機制靶向重癥肢體缺血(CLI)潛在的病理學，所述多重機制包括例如1)血管發(fā)生的刺激；2)微血管功能紊亂的改善；3)現(xiàn)有血管的血管收縮(血管擴張)活性的恢復；及4)現(xiàn)有側支的重塑/成熟(動脈發(fā)生)。預期血流和氧輸送至皮膚和肌肉的改善能減輕靜息痛及治愈局部缺血潰瘍。另外，本發(fā)明的eNOS多肽突變體由于具有明顯較高的突變體eNOS酶比活性而比野生型eNOS更有效。另外，eNOS多肽的活性可以受鈣的嚴格調節(jié)及對oxLDL和年齡有抗性。因此，與生長因子相反，由于“給藥量過多”所引起的毒性在使用本發(fā)明的eNOS組合物的基因治療中是可以忽略的。在此引用的參考文獻以其全文并入?yún)⒖?。定義在此所用的技術和學術術語除非特別說明均具有本領域技術人員通常已知的含義。在此所引用的參考文獻是本領域技術人員所已知的各種方法學。闡述這些已知方法學的出版物及其它材料在此以其全文并入?yún)⒖?。闡述重組DNA技術的一般原理的標準參考書包括Sambrook，J.，etal.(1989)MolecularCloning，ALaboratoryManual，2dEd.，ColdSpringHarborLaboratoryPress，Planview，N.Y.；McPherson，M.J.，Ed.(1991)DirectedMutagenesisAPracticalApproach，IRLPress，Oxford；Jones，J.(1992)AminoAcidandPeptideSynthesis，OxrordSciencePublications，Oxford；Austen，B.M.andWestwood，O.M.R.(1991)ProteinTargetingandSecretion，IRLPress，Oxford?？梢岳帽绢I域技術人員已知的任何合適的材料和/或方法進行本發(fā)明；然而，優(yōu)選的材料和/或方法本文進行了描述。在下文描述和實施例中提及的材料、試劑等除非特別說明均可得自商業(yè)來源。如本文所用，術語“多肽”是指全長蛋白質或其片段，或肽。如本文所用，針對多肽或多核苷酸提及的術語“變體”是指一種多肽或多核苷酸，其與參考多肽或多核苷酸相比(例如與野生型多肽或多核苷酸相比)分別在一級、二級或三級結構中有變化。例如，所述氨基酸或核酸序列可含有與參考氨基酸或核酸序列不同的一個突變或修飾。在一些實施方案中，eNOS變體可以是一種不同的同種型或多態(tài)性。變體可以是使用本領域熟知的方法分離或產(chǎn)生的天然發(fā)生的、合成的、重組的或化學修飾的多肽或多核苷酸。如本文所用，針對多肽或多核苷酸提及的術語“突變”是指分別與參考多肽或多核苷酸相比(例如與野生型多肽或多核苷酸相比)，多肽或多核苷酸的一級、二級或三級結構存在一種天然發(fā)生的、合成的、重組的或化學的改變或者差異。具有這種突變的多肽和多核苷酸可以使用本領域熟知的方法分離或產(chǎn)生。如本文所用，術語“eNOS多肽突變體”(例如eNOS突變體、突變體eNOS、eNOS突變多肽、突變體eNOS多肽)是指一種eNOS多肽或其變體，其在相應于哺乳動物eNOS的一個功能域中一個位置的氨基酸殘基具有至少一個變化或突變。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述突變是在相應于人eNOS的第495位氨基酸殘基的位置有一個氨基酸取代，其中在鈣調蛋白結合位點的磷酸化位點有一個單突變的eNOS多肽突變體中所述氨基酸取代不是被取代為Ala或Asp。在其它優(yōu)選的實施方案中，當eNOS多肽突變體有一個以上的突變時，相應于第495位的突變優(yōu)選是一個氨基酸被取代為Ala或Val。在另一個優(yōu)選的實施方案中，eNOS多肽突變體與參考eNOS多肽相比活性增加或降低。如本文所用，術語eNOS多肽的“功能域”是多肽中的與eNOS活性相關的任何氨基酸殘基、位點或區(qū)域，包括但非限于例如蛋白質結合結構域(例如鈣調蛋白結合結構域、激酶結合結構域或配體結合結構域)、磷酸化位點、豆蔻?；稽c、還原酶結構域或激活位點。如本文所用，術語“eNOS活性”是指與細胞中所述酶相關的任何活性，包括但非限于例如NO產(chǎn)生、鈣調蛋白結合、刺激血管發(fā)生、改善微血管功能紊亂、恢復現(xiàn)有血管的血管收縮(血管舒張)活性、幫助現(xiàn)有側支的重塑/成熟(動脈發(fā)生)。eNOS活性也可以是與所述多肽相關的任何其它生物學或細胞活性，更特別地，可以是與eNOS的功能域相關的任何這種活性。eNOS活性也可以是與所述酶相關的活性的調節(jié)，包括但非限于例如在此描述的或本領域已知的任何eNOS活性的調節(jié)。如本文所用，針對eNOS活性所提及的術語“調節(jié)”是指這種活性的增加、降低、誘導或抑制。在一些實施方案中，eNOS活性的這種增加、降低、誘導或抑制是相對于一種參考分子例如eNOS野生型或突變體多肽而言的。如本文所用，術語“疾病”、“病癥(condition)”、“障礙(disorder)”是指在患者的細胞、組織或器官中一種不合需要的狀況，其中通過調節(jié)eNOS活性可以改善所述狀況。內(nèi)皮NOS參與許多生理學過程，包括但非限于血管發(fā)生、血管舒張、免疫調節(jié)、抑制血小板聚集及松弛平滑肌。因此，調節(jié)需要治療的患者的細胞、組織或器官中eNOS活性可以改善本文所述的疾病、病癥或障礙。如本文所用，術語“患者”是哺乳動物，優(yōu)選是人。eNOS多肽突變體本發(fā)明提供了用于基因治療的eNOS多肽突變體、編碼這種多肽的多核苷酸、及其變體。特別地，本發(fā)明提供了這樣的eNOS多肽突變體，其在相應于哺乳動物eNOS的一個功能域的氨基酸序列中有一或多個突變，在此至少一個突變是在相應于鈣調蛋白結合位點中的一個在哺乳動物細胞中是磷酸化的氨基酸殘基的位置；而且在所述磷酸化位點有一個單突變的eNOS多肽突變體中所述突變不是一個氨基酸被取代為Ala或Asp。在一些優(yōu)選的實施方案中，當eNOS多肽突變體有一個以上突變時，相應于第495位的突變優(yōu)選是一個氨基酸被取代為Ala或Val。哺乳動物eNOS多肽的功能域已經(jīng)充分鑒定，包括例如從N末端至C末端為一個豆蔻?；灿形稽c、棕櫚?；稽c、鈣調蛋白結合位點(例如人eNOS的第494-517位氨基酸)，其包含進行磷酸化的一個共有序列(例如人eNOS的Thr-495)、一個還原酶結構域和一個進行磷酸化的共有序列(例如人eNOS的Ser-1177)。這些位點的位置和特性已經(jīng)熟知(見例如Stuehr，D.J.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.(1997)37339-359)(圖1)。在一個實施方案中，本發(fā)明的eNOS多肽突變體在鈣調蛋白結合結構域、優(yōu)選在Thr-495以及在還原酶結構域、優(yōu)選在Ser-1177內(nèi)有一或多個突變，其中在鈣調蛋白結合位點的磷酸化位點有一個單突變的eNOS多肽突變體中所述Thr-495的突變不是氨基酸被取代為Ala或Asp。在一個實施方案中，本發(fā)明的eNOS多肽突變體在相應于人eNOS的Thr-495殘基的位置有第一個突變，其中在鈣調蛋白結合位點的磷酸化位點有一個單突變的eNOS多肽突變體中該突變不是一個氨基酸被取代為Ala或Asp。在另一個實施方案中，本發(fā)明的eNOS多肽突變體在相應于人eNOS的Thr-495殘基的位置有第一個突變；在相應于人eNOS的Ser-1177殘基的位置有第二個突變。在另一個實施方案中，本發(fā)明的eNOS多肽突變體在相應于人eNOS的Thr-495殘基的位置有第一個突變；在相應于人eNOS的Ser-1177殘基的位置有第二個突變；在相應于人eNOS的Gly-2殘基有第三個突變。本發(fā)明的突變可以是任何類型，包括例如一或多個氨基酸添加、取代、缺失、插入、修飾、翻轉、融合或截短，或者這些類型的組合，且可以是經(jīng)合成方法、化學方法、重組方法或通過已知方法產(chǎn)生的。在本發(fā)明的eNOS多肽突變體的優(yōu)選實施方案中，在相應于人eNOS的Thr-495的位置的突變是氨基酸被取代為Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Met、Ser、Cys、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg或His，優(yōu)選取代為Val、Leu或Ile，最優(yōu)選取代為Val；在相應于人eNOS的Ser-1177的位置的突變優(yōu)選是氨基酸被取代為Asp，優(yōu)選被取代為Ala；在相應于人eNOS的Gly-2的位置的突變是一個氨基酸被取代為Ala。在一些優(yōu)選的實施方案中，當eNOS多肽突變體有一個以上突變時，相應于第495位的突變是氨基酸優(yōu)選地被取代為Ala或Val。在一個實施方案中，本發(fā)明的eNOS多肽突變體除了在Thr-495位點有一個突變之外(用黑體表示)，在鈣調蛋白結合位點還有一或多個額外的突變氨基酸殘基，DPWKGSAAKGTGITRKKTFKEVANAVKISASLMGTVMAKRVKATI(SEQIDNO1，第478-522位氨基酸)。在其它物種中相對應的序列可略有不同，特別是在N末端磷酸化位點的殘基略有不同。這個基序中每個氨基酸均可以個別地改變?yōu)槿魏纹渌?9種天然氨基酸，或者改變?yōu)榉翘烊坏陌被?。在一些實施方案中，所述突變不是保守突變，例如Gly/Ala、Val/Ile/Leu、Asp/Glu、Lys/Arg、Asp/Gln、Thr/Ser或Phe/Trp/Tyr。在一個實施方案中，從一個eNOS多肽開始(起始多肽)，在相應于鈣調蛋白結合結構域的磷酸化位點的位置導入第一個突變，并將該多肽突變體與參考eNOS多肽(例如起始多肽或其它eNOS多肽，包括野生型eNOS多肽)對比分析eNOS活性。例如，可以選擇與起始eNOS多肽相比呈現(xiàn)較高量的eNOS活性(例如NO產(chǎn)生)的單突變體。在已經(jīng)產(chǎn)生所述第一個突變并鑒定之后，可重復該程序以產(chǎn)生有雙突變的eNOS多肽，并可以進一步重復以產(chǎn)生具有本文所述額外突變的eNOS多肽突變體。使用已知方法可以產(chǎn)生任何數(shù)目的突變。產(chǎn)生多肽突變體的方法(例如突變編碼多肽的核酸)是本領域的標準技術而且是熟知的。這些方法包括例如同源重組、定點誘變、盒式誘變及基于PCR的誘變(見例如Sambrooketal.，MolecularCloning，CSHPress(1989)；Kunkeletal.(1985)PNAS82，488-492和Leeetal.(2001)J.Biol.Chem.Dec21；276(51)47930-6)。這種突變的起始材料可以是例如來自例如任何人、小鼠、豚鼠、狗、牛、豬、兔、大鼠、綿羊、馬、非人靈長類動物或其它動物的eNOScDNA。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的eNOS多肽突變體與參考eNOS多肽相比呈現(xiàn)eNOS活性增加或降低(例如NO產(chǎn)生)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的eNOS多肽突變體可以呈現(xiàn)一或多種eNOS活性增加或降低，所述活性水平的增加或降低是針對參考eNOS多肽而言。本發(fā)明的突變多肽可以通過使用標準試驗分析本文所述任何eNOS活性而鑒定。例如，在應答各種體外或體內(nèi)刺激(例如細胞刺激)時，eNOS通過特異性激酶或磷酸酶在例如人eNOS的Thr-495和/或Ser-1177(或者在其它物種的相應殘基)磷酸化或去磷酸化。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的eNOS多肽突變體呈現(xiàn)NO產(chǎn)生增加、CaM對eNOS的CaM結合位點的結合和親和性增加，和/或呈現(xiàn)對CaM介導的eNOS激活的Ca++依賴性降低。本文描述的及本領域已知的任何這些及其它eNOS活性，包括由所述酶產(chǎn)生的NO間接介導的活性，均是可以通過本發(fā)明的eNOS組合物和方法調節(jié)的活性。eNOS在例如血管內(nèi)皮、心肌細胞、血小板、各種類型的免疫系統(tǒng)細胞(例如T細胞、中性粒細胞和單核細胞)中發(fā)現(xiàn)，并將L-Arg轉變?yōu)镹O，NO是參與和/或在許多生理應答中起調節(jié)功能的一種氣態(tài)信使分子。另外，eNOS結合與Ca++綴合的鈣調蛋白，激活eNOS酶活性。各種eNOS相關的活性包括由所述酶產(chǎn)生的NO直接或間接介導的活性。這種eNOS活性包括但非限于例如刺激血管發(fā)生(正常的或例如由于局部缺血所致削弱的)、刺激血管舒張、刺激側支血管發(fā)生、增強外周肢體血流、抑制肢體壞死(例如在重癥肢體缺血或CLI中)、增強傷口愈合、抑制平滑肌收縮、抑制或防止血小板吸附和聚集(這可以導致例如抑制血栓形成)、介導升高的HDL對心血管系統(tǒng)的保護作用、刺激內(nèi)皮細胞增殖和遷移、抑制白細胞激活和附著，趨化因子表達或平滑肌增殖、抑制心肌梗塞、調節(jié)免疫應答、及清除超氧化物陰離子。分析這些及其它eNOS活性的方法是本領域技術人員熟知的。例如，分析eNOS多肽磷酸化和/或磷酸化程度的標準方法包括一種體外方法，其中將蛋白質(例如在大腸桿菌中重組產(chǎn)生的或者部分或完全從天然原料中純化的蛋白質)與一種激酶如AMP激活的激酶(AMPK)或蛋白激酶C(PKC)或者與一種磷酸酶一起溫育。然后可以使用標準方法分析eNOS多肽或其胰蛋白酶消化產(chǎn)物，所述標準方法如凝膠電泳或與放射自顯影結合的柱層析或者用特異于給定磷酸肽的抗體免疫印跡。這些及其它分析參見例如WO00/28076、WO00/62605、WO00/62605、Michelletal.(2001)TheJournalofBiologicalChemistuy276，17，625-628及Flemingetal.(2001)CirculationResearch88，68e-75e等所述。體內(nèi)或體外測定直接或間接依賴于eNOS表達的各種活性的其它方法包括如下方法(1)在存在或無鈣調蛋白(CaM)的情況下測定L-[3H]-瓜氨酸的產(chǎn)生(見例如Balligandetal.(1995)J.Biol.Chem.270，14，582-586；Bredtetal.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87，682-685及Flemingetal.(2001)CirculationResearch88，68e-75e)。例如可以將重組eNOS與CaM共表達(見例如Rodriguez-Crespoetal.(1996)Arch.Biochem.Biophys.336，151-156))，并在存在不同量添加的EGTA的情況下進行分析(例如WO00/28076所述)；(2)測定與鈣調蛋白的結合能力(例如Flemingetal.(2001)CirculationResearch88，68e-75e所述)；(3)在完整的細胞中測定cGMP的時間依賴性和Nω-硝基-L-精氨酸-敏感性積聚(見例如Flemingetal.(1998)Circ.Res.82，686-695所述)；(4)測定還原酶活性，例如NADPH-依賴性還原酶，細胞色素C還原酶活性，或者2，6-二氯酚靛酚(DCIP)還原(見例如WO00/62605；WO00/62605；Martaseketal.(1999)MethodsEnzymol.301，70-78；Mastersetal.(1967)MethodsEnzymol.10，565-573所述)；(5)測定對平滑肌收縮的作用(見例如FurchgottandZawadzki(1980)Nature288373-376所述)；(6)測定對血小板功能的作用；(7)測定細胞中NO的釋放(作為亞硝酸鹽NO2-進行分析)，通過化學發(fā)光或通過血紅蛋白捕獲而確定(見例如WO00/62605、WO00/62605、Sessa(1995)J.Biol.Chem.270，17641-644、Kelmetal.(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.154，236-244所述)；(8)測定肢體壞死的抑制，通過在側支血管依賴性局部缺血肢體中毛細管密度增加或血管收縮反應而確定(見例如Muroharaetal.(1998)J.Clin.Invest.，101，2567-2568)；(9)測定傷口愈合、內(nèi)皮細胞遷移、增殖或分化的增強(見例如Leeetal.，(1999)AmJ.Physiol.277，H1600-1608)；或者(10)測定勃起功能障礙。也參見本文的實施例，其舉例說明了eNOS活性(例如NO產(chǎn)生)的分析。測試eNOS活性的動物模型是本領域標準使用并熟知的。例如為測試血管發(fā)生和血管再形成，見Murohara等(1998，同前)、Couffinhaletal.(1998)；AmJ.Pathol152，1667-1669、Couffinhaletal.，(1999)Circulation99，3188-3198及本發(fā)明實施例所述。這種模型包括例如經(jīng)手術形成的小鼠和大鼠后肢局部缺血模型，例如手術是在eNOS剔除小鼠中進行的。測定后肢血流和毛細管密度的方法也是熟知的(見例如Muroharaetal.(同前)、Couffinhaletal.(1998)；AmJ.Pathol152，1667-1669、Couffinhaletal.，(1999)Circulation99，3188-3198及本發(fā)明實施例所述)。本發(fā)明的eNOS多肽可以是一種重組多肽、天然多肽或者合成或半合成的多肽，或者其組合，優(yōu)選是一種重組多肽。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是分離的形式，而且可以是純化為例如同質性的。術語“分離的”當例如針對多肽或多核苷酸時，是指該材料是從其原始環(huán)境中分離的(例如如果其是天然發(fā)生的則是從天然環(huán)境分離的)，及是從其天然相關的至少一種其它成分中分離的。例如，在其天然活宿主中存在的天然發(fā)生的多肽不是分離的，但從天然系統(tǒng)中的一些或全部共存材料中分離出的則是分離的。這種多肽可以是一種組合物的一部分，如果這種組合物不是其天然環(huán)境的一部分，則所述多肽仍是分離的。本發(fā)明的eNOS多肽的片段或變體優(yōu)選基本保留至少一種eNOS活性。這種eNOS活性可以例如是任何本文所述的那些活性，包括具有與抗體反應的能力，即具有一種攜帶表位的肽，尤其包含一或多個本發(fā)明的突變的肽。本發(fā)明多肽片段的大小可以是任何與本發(fā)明目的例如用于基因治療相應的大小。所述片段的大小范圍可以從最小的特異性表位(例如大約6個氨基酸)至接近全長的基因產(chǎn)物(例如比全長多肽短一個氨基酸)。例如，本發(fā)明的多肽可以包含至少大約10、25、50、100、200、300、400、500、600、800、1000或1200個氨基酸。本發(fā)明的多肽片段可用于例如通過肽合成方法生產(chǎn)相應的全長多肽，例如作為生產(chǎn)全長多肽的中間體；用于誘導抗體或抗原結合片段的產(chǎn)生；作為“查詢序列”用于探查公共數(shù)據(jù)庫，等等。另外，包含本發(fā)明突變的多肽片段可用作eNOS拮抗劑。不希望受任何特定機制的限制，預期這種含有突變的肽片段，特別是與野生型eNOS相比與鈣調蛋白的親和性或結合增加的肽片段，可以在細胞中“吸收(sopup)”鈣調蛋白，由此抑制細胞中鈣調蛋白誘導的eNOS的激活。抑制程度可以為部分抑制至完全抑制。本發(fā)明多肽的變體(例如人eNOS多肽的變體，其在鈣調蛋白結合結構域中的Thr-495位點和/或其它位點已經(jīng)被改變)可以是例如(i)其中一或多個氨基酸殘基用一種保守或非保守的氨基酸殘基取代(優(yōu)選用保守的氨基酸殘基取代)，而且這種取代的氨基酸殘基可以是或不是由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基，或者(ii)其中一或多個氨基酸殘基包含一個取代基，或者(iii)其中所述多肽與另一種化合物融合，如與提高所述多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)融合，或者(iv)其中額外的氨基酸與多肽融合，所述額外的氨基酸如一種前導或分泌序列或者用于純化多肽的序列，通常用于產(chǎn)生一種遺傳工程化形式的能從細胞如轉化的細胞中分泌的蛋白質。所述額外的氨基酸可以來自異源來源或者可以是天然基因內(nèi)源的。屬于上述類型(i)的變體多肽包括例如突變蛋白、多肽突變體和衍生物。變體多肽的氨基酸序列由于例如一或多個添加、取代、缺失、插入、翻轉、融合及截短或者任何這些突變的組合而不同。例如，本領域技術人員熟知的保守氨基酸取代通常不引起蛋白質功能改變。屬于上述類型(ii)的變體多肽包括例如修飾的多肽。已知的多肽修飾包括但非限于糖基化、乙酰化、?；?、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素共價附著、血紅素部分的共價附著、核苷或核苷衍生物的共價附著、脂質或脂質衍生物的共價附著、磷脂酰肌醇的共價附著、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、去甲基化、共價交聯(lián)形成、胱氨酸形成、焦谷氨酸形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI錨形成、羥化、碘化、甲基化、豆蔻?；?、氧化、蛋白酶解、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硒?；?selenoylation)、硫化、轉移RNA介導的向蛋白質中添加氨基酸如精氨?；⒓氨樵诘鞍谆?。這些修飾是為本領域技術人員所熟知的，并且已經(jīng)在科學文獻中詳細描述。一些特別常見的修飾例如糖基化、脂質附著、硫化、谷氨酸殘基的γ-羧化，羥化及ADP-核糖基化在許多基礎教材中已經(jīng)描述，如Proteins--StructureandMolecularProperties，2nded.，T.E.Creighton，W.H.FreemanandCompany，NewYork(1993)。對這個主題可獲得許多詳細綜述，例如Wold，F(xiàn).，PosttranslationailCovalentModificationofProteins，B.C.Johnson，Ed.，AcademicPress，NewYork1-12(1983)、Seifteretal.(1990)Meth.Enzymol.182626-646及Rattanetal.(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.66348-62。屬于上述類型(iii)的變體多肽是本領域熟知的，包括例如PEG化或其它化學修飾。屬于上述類型(iv)的變體多肽包括例如通過裂解蛋白原(proprotein)部分可被激活以產(chǎn)生一種活性的成熟多肽的前蛋白(preprotein)或蛋白原。變體包括許多雜合體、嵌合體或融合多肽。這種變體的典型實例在本文另處論述。本領域技術人員已知許多其它類型的變體。例如，如本領域所熟知的，多肽不總是完全線性的。例如，多肽由于遍在蛋白化的結果可以分支，及通常由于翻譯后事件的結果可以是有或無分支的環(huán)形，所述翻譯后事件包括天然加工事件及通過非天然發(fā)生的人工操縱所致事件。環(huán)形的、分支的及分支的環(huán)形多肽可以通過非翻譯天然加工及通過合成方法合成。修飾和變化可以在多肽的任何部位發(fā)生，包括在肽主鏈、氨基酸側鏈和氨基或羧基末端。在一個給定多肽的幾個位點可以存在相同或不同程度的相同類型的修飾。另外，一個給定多肽可以含有一種類型以上的修飾。通過共價修飾而阻斷多肽中氨基或羧基基團或這兩個基團在天然發(fā)生的和合成的多肽中是常見的。例如，在大腸桿菌中在蛋白酶解之前產(chǎn)生的多肽的氨基末端殘基通常是N-甲酰甲硫氨酸。修飾可以依蛋白質產(chǎn)生方式而確定。例如，就重組多肽而言，修飾可以通過宿主細胞翻譯后修飾能力和多肽氨基酸序列中的修飾信號而確定。因此，當希望糖基化時，多肽可以在糖基化宿主通常在真核細胞中表達。昆蟲細胞通常攜帶與哺乳動物細胞相同的翻譯后糖基化，為此已經(jīng)揭示了昆蟲細胞表達系統(tǒng)以有效表達具有天然糖基化模式的哺乳動物蛋白質。針對其它修飾有相似的考慮。變體多肽可呈現(xiàn)一或多種eNOS活性增加或降低，其中eNOS活性的增加或降低是相對于參考eNOS多肽的活性水平而言。如所提及的，本發(fā)明的eNOS多肽突變體包括這樣的突變體，其中除了鈣調蛋白結合結構域中Thr-495殘基和/或其它位點之外有一或多個氨基酸被修飾，即所述額外突變位于eNOS多肽的其它功能域。例如，可以在一或多個催化結構域(例如氧化酶或還原酶結構域)或者調節(jié)區(qū)域(例如豆蔻?；稽c，自體抑制環(huán)，或位于分子C末端區(qū)域附近的Ser磷酸化位點，或者在本文另處描述的任何功能域)導入一或多個突變。額外的突變可以是本文所述的任何類型的突變。額外突變例如包括在人eNOS的第1177殘基位的Ser磷酸化位點用另一種氨基酸如Asp取代(見例如WO00/62605)，或者在人eNOS的豆蔻?；稽c的突變，如在第2殘基位的Ala用另一種氨基酸如Gly取代(見例如Sessaetal.，(1993).CirculationResearch72，921-924)。在豆蔻?；稽c突變的eNOS多肽可以位于細胞質而不是細胞膜中。這種突變對病原刺激(例如oxLDL)有抗性(與野生型eNOS相比)，其負調節(jié)eNOSNO產(chǎn)生。這個性質對eNOS多肽突變體(或編碼其的多核苷酸)在治療存在這種外部病原刺激的病癥如動脈硬化、周圍肢體局部缺血或CLI等中的應用有利。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的eNOS多肽在相應于Thr-495的位置包含一個氨基酸取代(例如取代為Ala、Val、Leu或Ile，優(yōu)選取代為Ala或Val)；和/或在相應于Ser-1177的位置包含一個氨基酸取代(例如優(yōu)選取代為Asp)；和/或在相應于Gly-2的位置包含一個氨基酸取代(例如取代為Ala)，其中雙突變體或三突變體與參考eNOS多肽(例如野生型eNOS或其它eNOS多肽突變體)相比呈現(xiàn)更高的eNOS活性。本發(fā)明的eNOS多肽突變體還包括與野生型eNOS或本發(fā)明的突變的eNOS多肽有不同程度的序列同源性(相同性)的多肽。在一個實施方案中，所述多肽與本發(fā)明的eNOS多肽基本同源，或者與其序列基本同源(序列相同性)。因此本發(fā)明的多肽及其片段可含有與野生型eNOS或本發(fā)明突變的eNOS多肽有至少大約65-70％的序列同源性(相同性)，優(yōu)選大約70-75％、75-80％或80-85％、85-90％序列同源性(相同性)，最優(yōu)選有大約90-95％或95-99％序列同源性(相同性)。本發(fā)明還包含這樣的多肽，其具有較低程度的序列相同性，但具有足夠相似性以呈現(xiàn)一或多種eNOS活性。根據(jù)本發(fā)明，術語“相同性百分比”當針對序列而言時，是指一個序列與一種請求保護的或描述的序列相比較，這種比較是在待比較的序列(“比較序列”)與所述或所請求保護的序列(“參照序列”)進行比對排列之后進行的。隨后相同性百分比通過下式確定相同性百分比＝100[1-(C/R)]其中C是在參照序列和比較序列之間進行比對的長度內(nèi)參照序列和比較序列之間的差異的數(shù)目，其中(i)在比較序列中沒有相應比對的堿基或氨基酸的參照序列中的每個堿基或氨基酸、(ii)參照序列中的間隔以及(iii)與比較序列中的比對的堿基或氨基酸不同的參照序列中的每一個比對的堿基或氨基酸組成一個差異；R是在與比較序列進行比對的長度內(nèi)的參照序列的堿基或氨基酸數(shù)目，參照序列中產(chǎn)生的任何間隔也被計為一個堿基或氨基酸。如果在比較序列和參照序列之間存在著這樣的比對，其按如上所述計算的相同性百分比與規(guī)定的最低相同性百分比大約相等或者大于規(guī)定的最低相同性百分比，則比較序列具有規(guī)定的與參照序列的最低相同性百分比，盡管也可能存在上述計算相同性百分比低于規(guī)定的相同性百分比的比對。在一個優(yōu)選的實施方案中，為比較目的而比對的參照序列的長度至少為參照序列長度的30％、優(yōu)選地至少40％、更優(yōu)選地至少50％、還更優(yōu)選地至少60％、還更優(yōu)選地至少70％、80％或90％(例如，當將第二個序列與具有91個氨基酸殘基的本文的氨基酸序列比對時，至少30個、優(yōu)選地至少35個、更優(yōu)選地至少45個、還更優(yōu)選地至少55個、還更優(yōu)選地至少65、70、80和90個氨基酸殘基被進行比對)。本文中對于相同性百分比或同源性百分比的描述同樣地適用于核苷酸或氨基酸序列。兩個序列之間的比較和相同性和相似性百分比的確定可以使用數(shù)學算法完成(ComputationalMolecularBiology，Lesk，A.M.，ed.，OxfordUniversityPress，NewYork，1988；BiocomputingInformaticsandGenomeProjects，Smith，D.W.，ed.，AcademicPress，NewYork，1993；ComputerAnalysisofSequenceData，Part1，Griffin，A.M.，andGriffin，H.G.，eds.，HumanaPress，NewJersey，l994；SequenceAnalysisinMolecularBiology，vonHeinje，G.，AcademicPress，1987；以及SequenceAnalysisPrimer，Gribskov，M.andDevereux，J.，eds.，MStocktonPress，NewYork，1991)。這種數(shù)學算法的一種優(yōu)選的非限制性例子如Karlinetal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-5877所述。這種算法被編入Altschuletal.(1997)NucleicAcidsRes.253389-3402所述的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)。當使用BLAST和GappedBLAST程序時，可以使用各自程序(例如NBLASST)的默認參數(shù)。在一個實施方案中，進行序列比較的參數(shù)可以設置成score＝100，wordlength-12，或者可以變化(例如W＝5orW＝20).在一個優(yōu)選的實施方案中，兩個氨基酸序列之間的相同性百分比用Needlemanetal.(1970)(J.Mol.Biol.48444-453)算法，該算法已經(jīng)編入GCG軟件包的GAP程序中，其使用BLOSUM62矩陣或PAM250矩陣，gapweight為16，14，12，10，8，6或4，lengthweight為1，2，3，4，5或6。在另一個優(yōu)選的實施方案中，兩個核苷酸序列之間的相同性百分比用GCG軟件包中的GAP程序(Devereuxetal.(1984)NucleicAcidsRes.12(1)387)確定，使用NWSgapdna.CMP矩陣，gapweight為40，50，60，70或80，lengthweight為1，2，3，4，5或6。用于序列比較的算法的另一個優(yōu)選的非限制性例子是MyersandMiller，CABIOS(1989)的算法，這種算法被編入ALIGN程序(版本2.0)，其是CGC序列比對軟件包的一部分。當使用ALIGN程序比較氨基酸序列，可以使用PAM120weightresiduetable，gaplengthpenalty為12，gappenalty為4。用于序列分析的其它算法是本領域已知的，并包括如Torellisetal.(1994)Comput.Appl.Biosci.103-5所述的ADVANCE和ADAM；以及Pearsonetal.(1988)PNAS852444-8所述的FASTA。根據(jù)本發(fā)明，術語“基本上同源的”當指蛋白質序列時，是指氨基酸序列至少約90-95％或97-99％或更高程度地相同。基本上同源的氨基酸序列可以由與編碼本發(fā)明的突變多肽的序列的核酸序列或其部分在高嚴格條件下雜交的核酸序列編碼。如本文所用，“高嚴格”條件是指，例如，在含有例如約5XSSC，0.5％SDS，100ug/ml變性鮭精DNA和50％甲酰胺的雜交溶液中，將印跡與一種長多核苷酸探針在42℃保溫過夜(例如至少12小時)。印跡可以在允許例如低于5％bp錯配的高嚴格條件下洗滌(例如在65℃在0.1×SSC和0.1％SDS中洗滌2次，每次30分鐘)，從而選擇具有例如95％或更高序列相同性的序列。高嚴格條件的其它非限制性實例包括在65℃在含有30mMNaCl和0.5％SDS的水性緩沖液中最后洗滌。高嚴格條件的另一個實例在50℃在7％SDS、0.5MNaPO4，pH7、1mMEDTA中雜交過夜，隨后在42℃用1％SDS溶液洗滌一或多次。而高嚴格洗滌可以允許低于5％錯配，降低的或低嚴格條件可允許最多20％核苷錯配。低嚴格雜交可以如上述完成，但使用較低的甲酰胺條件、較低溫度和/或較低的鹽濃度，以及較長的保溫時間。針對本發(fā)明的多肽(和多核苷酸)所應用的術語“片段”是指較大序列的一部分這樣的一個序列(即在較大的序列內(nèi)一個連續(xù)的或不間斷的殘基序列)。本發(fā)明的多肽可以源自哺乳動物的任何物種的細胞和組織，所述動物例如是小鼠、大鼠、豚鼠、兔、家畜如牛、綿羊或豬、寵物如狗、馬、非人靈長類動物、或其它動物、或人，但優(yōu)選源自人體細胞。已知許多物種的eNOS序列，例如人(Janssensetal.(1992)J.Biol.Chem.267，14，519-522)、牛(USP5,498,539的SEQIDNO2)、狗(genbankACCESSIONAF143503)和豚鼠(genbankACCESSIONAF146041)。在任何給定的哺乳動物中，可在許多組織中發(fā)現(xiàn)eNOS多肽。確定這種多肽的組織或細胞定位的方法是本領域的標準方法，包括例如免疫組織化學的標準方法。eNOS多肽見于例如血管內(nèi)皮、心肌細胞、血小板及各種免疫系統(tǒng)細胞如T細胞、中性粒細胞和單核細胞。編碼eNOS多肽突變體的多核苷酸本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明eNOS多肽突變體的多核苷酸及其片段。本發(fā)明還包括不間斷地編碼eNOS多肽突變體的多核苷酸。多核苷酸“不間斷地編碼”是指一種多核苷酸，其與被內(nèi)含子或其它非編碼序列中斷的ORF相比具有一個連續(xù)的開放讀框(ORF)。本發(fā)明的多核苷酸可以是一種重組多核苷酸、天然多核苷酸或者合成或半合成的多核苷酸，或者其組合。如本文所用，術語多核苷酸、寡核苷酸、寡聚物和核酸是可互換的術語。因此，“多核苷酸”可涵蓋全長多核苷酸的片段，如寡核苷酸。如本文所用，術語“基因”是指參與產(chǎn)生多肽鏈的一個DNA節(jié)段；其可包含在編碼區(qū)前和后的區(qū)域(前導序列和尾隨序列)，以及在各個編碼節(jié)段(外顯子)之間的插入序列(內(nèi)含子)。當然，cDNA沒有相應的內(nèi)含子。本發(fā)明包括編碼本發(fā)明多肽的分離的基因(例如基因組克隆)。本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA、PNA或DNA，例如cDNA、基因組DNA、及合成或半合成的DNA，或其組合。所述DNA可以是三鏈、雙鏈或單鏈DNA，如果是單鏈DNA則可以是編碼鏈或非編碼(反義))鏈。其可以包含發(fā)夾或其它二級結構。所述RNA包括寡聚物(包括具有有義或反義鏈的那些寡聚物)、mRNA、聚腺苷?；腞NA、總RNA、單鏈或雙鏈RNA，等等。本發(fā)明還包含DNA/RNA雙鏈體。本發(fā)明的多核苷酸及其片段的大小可以是任何與本發(fā)明目的相應的大小，例如當用作探針時有效達到希望的特異性的任何希望的大小。例如在融合多核苷酸或作為基因組序列一部分的多核苷酸的情況中，多核苷酸的大小范圍可以例如從最小的特異性探針(例如大約10-12個核苷酸)至超過全長cDNA；片段的長度可以大如例如比全長cDNA短一個核苷酸。例如，本發(fā)明的多核苷酸可包含至少大約8、10、12、14或15個連續(xù)的核苷酸，例如大約15個連續(xù)的核苷酸。如在本文另處所論述的，本發(fā)明的多核苷酸片段可用作例如雜交探針。多核苷酸的片段也可以用作盒式誘變的起始點。盒式誘變(見例如Leeetal.(2001)，如前述)允許在同一時間在序列中導入許多突變。然后可以表達各個克隆，并通過篩選方法選擇希望的表型并對產(chǎn)物測序。例如，全長eNOS突變體可以在大腸桿菌中表達，通過在鈣調蛋白親和柱上的吸附選擇突變體，洗脫然后進行Western印跡。然后使用標準測序方案確定結合的突變體的序列。相似地，可將突變的序列導入一個表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)在例如噬菌體展示上將該基序表達作一個表位。噬菌體可以與鈣調蛋白親和柱結合、被選擇并測序。也可以使用一種肽文庫方案，因為eNOS鈣調蛋白結合結構域的序列適應全合成。本發(fā)明涵蓋多核苷酸的許多類型的變體，這些變體包括例如如下變體(i)其中一或多個核苷酸被另一個核苷酸取代，或者其是另外突變的；或者(ii)其中一或多個核苷酸被修飾，例如包括一個取代基團；或者(iii)其中所述多核苷酸與另一種化合物融合，如與提高多核苷酸半衰期的化合物融合；或者(iv)其中額外的核苷酸與多核苷酸共價結合，這種序列編碼一個前導或分泌序列或者用于純化所述多肽的一個序列。所述額外的核苷酸可以來自異源來源，或者可以是天然基因內(nèi)源的。本發(fā)明的多核苷酸可以有一個編碼序列，其是野生型eNOS序列涵蓋的編碼序列的天然或非天然發(fā)生的等位基因變體。如本領域所已知的，等位基因變體是多核苷酸序列的一種變化的形式，其可具有一或多個核苷酸的取代、缺失或添加，一般基本上不改變所編碼的多肽的功能。位于編碼序列或調節(jié)序列中的其它變體序列可影響(例如增強或降低)本發(fā)明的eNOS多肽突變體的產(chǎn)生或其功能或活性。屬于上述類型(ii)的多核苷酸變體包括例如修飾，如可檢測標記(抗生物素蛋白、生物素、放射性元素、熒光標記和染料、能量轉移標記、發(fā)射能量的標記、結合配偶體等)的附著，或改善表達、攝取、編目(cataloging)、標記、雜交、檢測和/或穩(wěn)定性的基序的附著。根據(jù)希望的方法多核苷酸也可以附著于固體支持物，例如硝化纖維素、磁性或順磁性微球體(例如U.S.Pat.No.5,411,863、U.S.Pat.No.5,543,289所述；例如包含鐵磁性、超磁性、順磁性、超順磁性、氧化鐵和多糖微球體)、尼龍、瓊脂糖、重氮化纖維素、乳膠固體微球、聚丙烯酰胺，等等。見例如U.S.Pat.Nos.5,470,967、5,476,925、5,478,893所述。屬于上述類型(iii)的多核苷酸變體是本領域熟知的，包括例如各種長度的聚A+尾、5’帽結構，及核苷酸多肽突變體，例如肌苷、硫代核苷酸等。屬于上述類型(iv)的多核苷酸包括例如各種嵌合、雜合或融合多核苷酸。例如，本發(fā)明的多核苷酸可包含一個編碼序列和額外的非天然發(fā)生的或異源編碼序列(例如編碼前導、信號、分泌、定向、酶促、熒光、抗生素抗性及其它功能性或診斷性肽的序列)；或者包含一個編碼序列和非編碼序列，例如在5’或3’末端的未翻譯的序列，或者分散于編碼序列中，如內(nèi)含子。更特別地，本發(fā)明包括這樣的多核苷酸，其中eNOS多肽突變體的編碼序列在同一讀框與由所述多核苷酸編碼的另一個多肽序列(例如一個異源多肽序列)融合，產(chǎn)生一種融合的eNOS多肽突變體?？梢赃@種方式融合的多肽序列是例如有助于一種多肽從宿主細胞中表達和分泌的序列，是一個前導序列，其作為控制多肽從細胞和中轉運的一個分泌序列和/或促進多肽與細胞膜吸附的跨膜錨序列。具有前導序列的多肽是一種前蛋白，可以通過宿主細胞裂解前導序列以形成成熟形式的多肽。所述多核苷酸也可以編碼一種蛋白原，其是成熟蛋白質加上額外的N末端氨基酸殘基。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白質是蛋白原，而且通常是失活形式的蛋白質，一旦該原序列被裂解，則保留活性蛋白。本發(fā)明的多核苷酸也可以具有在框內(nèi)與一個標記序列融合的編碼序列，這使得可以鑒別和/或純化本發(fā)明的多肽。所述標記序列可例如是6-組氨酸標記(例如由pQE-9載體提供)，以便在細菌宿主中純化與該標記融合的成熟多肽；或者例如當使用哺乳動物宿主如COS-7細胞時，所述標記序列可以是血凝素(HA)標記。HA標記相應于衍生自流感血凝素蛋白的一個表位(見例如Wilson，I.，etal.，Cell，37767(1984)所述)。本領域技術人員顯而易見其它類型的多核苷酸變體。例如，根據(jù)希望的目的例如核酸酶如RNAseH抗性、改良的穩(wěn)定性，多核苷酸的核苷酸可以通過各種已知鍵例如酯、sulfamate，sulfamide，硫代磷酸酯，氨基磷酸酯、甲基膦酸酯，氨基甲酸酯等連接(見例如U.S.Pat.No.5,378,825)。可以摻入任何希望的核苷酸或核苷酸多肽突變體，例如6-巰基鳥嘌呤、8-氧-鳥嘌呤。本發(fā)明的多核苷酸還可具有衍生自生物體另一遺傳基因座的編碼序列，只要其與哺乳動物野生型eNOS多肽或來自另一種生物體的該多肽基本同源(例如直向同源)即可。本發(fā)明的多核苷酸可以根據(jù)任何希望的方法標記。例如本發(fā)明的多核苷酸可以使用放射性示蹤物如32P、35S、3H或14C標記。所述放射性標記可以根據(jù)任何方法進行，例如在3’或5’末端使用放射標記的核苷酸、多核苷酸激酶(用或沒有用磷酸酶去磷酸)或連接酶(根據(jù)進行標記的多核苷酸的末端)進行末端標記。也可以使用一種非放射性標記，將本發(fā)明的多核苷酸與具有如下性質的殘基組合，所述性質為免疫學性質(抗原、半抗原)、對某些試劑的特異性親和性(配體)、能使可檢測的酶反應進行完全的性質(酶或輔酶、酶底物或參與酶促反應的其它物質)、或者特征性物理性質如熒光或在希望的波長發(fā)射光線或吸收光線，等等。本發(fā)明的多核苷酸可包含一種序列，其與編碼野生型eNOS或本發(fā)明突變的eNOS多肽的核苷酸序列有至少大約65-100％(例如至少大約70-75％、80-85％、90-95％或97-99％)序列相同性，或者與其基本同源，或者在高嚴格雜交條件下與其雜交。術語“基本同源”當就多核苷酸序列而言時是指所述核苷酸序列與編碼野生型或本發(fā)明突變的eNOS多肽的多核苷酸具有至少大約90-95％或97-99％或更多相同性。eNOS多肽的表達及eNOS活性分析本發(fā)明還涉及含有載體和本發(fā)明多核苷酸的重組構建體。這種構建體包含一個載體如質粒或病毒載體，其中已經(jīng)以正向或反向插入了本發(fā)明的一個多核苷酸序列。本領域技術人員已知大量合適的載體，許多是可以商購的。例如如下載體細菌pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pBluescriptSK、pBSKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、pTRC99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；真核生物pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。然而，可使用任何其它質?；蜉d體，只要其在宿主中可復制及存活。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述載體是一種表達載體，其中已經(jīng)插入了本發(fā)明的一個多核苷酸序列，其與指導mRNA合成的一個合適的表達控制(調節(jié))序列(例如啟動子核/或增強子)可操縱地連接?？梢赃x擇已知控制原核細胞或真核細胞或其病毒的合適的表達控制序列，例如可調節(jié)的啟動子或調節(jié)序列，以在原核生物(例如細菌)、酵母、植物、哺乳動物細胞或其它細胞中表達。優(yōu)選的表達控制序列衍生自高表達的基因，例如衍生自編碼糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶或熱激蛋白等的操縱予。這種表達控制序列可以例如使用CAT(氯霉素轉移酶)載體或具有可選擇標記的其它載體選自任何希望的基因。用于這種選擇的兩種合適的載體是pKK232-8和pCM7。可以使用的細菌啟動子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、PR，、PL和trp。真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV激酶、早期和晚期SV40、腺病毒啟動子、來自逆轉錄病毒的LTR及小鼠金屬硫蛋白-I。合適載體和啟動子的選擇在本領域熟練技術員的水平范圍內(nèi)。通過高等真核細胞對編碼本發(fā)明多肽的DNA的轉錄可以通過在表達載體中插入一個增強子序列而提高。增強子是DNA的順式作用元件，通常為大約10-300bp，其作用于啟動子以提高其轉錄。代表性的實例包括在復制起點晚期側100-270堿基對處，巨細胞早期啟動子增強子，在復制起點晚期側的多形瘤增強子及腺病毒增強子。通常地，重組表達載體也包括復制起點。表達載體可含有翻譯起始的核糖體結合位點，轉錄終止序列、聚腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點，和/或5’側翼或未轉錄的序列。衍生自SV40剪接和聚腺苷酸化位點的DNA序列可用于提供需要的未轉錄的遺傳元件。載體也可包括擴增表達的合適序列。另外，表達載體優(yōu)選含有一或多個可選擇的標記基因以提供選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或者如在大腸桿菌中四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。本領域技術人員已知大量合適的表達載體，許多是可以商購的。合適的載體包括染色體、非染色體及合成的DNA序列，例如SV40的衍生物；細菌質粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質粒；衍生自質粒與噬菌體DNA，病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、TMV、禽痘病毒和假狂犬病病毒組合的載體。然而，可以使用任何其它載體，只要其在宿主中可復制及可存活即可。用于原核及真核宿主的合適的克隆和表達載體見例如如下文獻所述Sambrook，etal.，MolecularCloningALaboratoryManual，SecondEdition，ColdSpringHarbor，N.Y.，(1989)、Wuetal，MethodsinGeneBiotechnology(CRCPress，NewYork，NY，1997)，RecombinantGeneExpressionProtocols，inMethodsinMolecularBiology，Vol.62，(Tuan，ed.，HumanaPress，Totowa，NJ，1997)及CurrentProtocolsinMolecularBiology，(Ausabeletal，Eds.，)，JohnWiley&Sons，NY(1994-1999)。下文進一步描述了適于基因治療方法的載體和組織特異性調節(jié)序列。合適的DNA序列可通過許多方法插入載體中。一般通過本領域已知的標準方法將DNA序列插入合適的限制性內(nèi)切酶位點。這種及其它分子生物學技術的標準程序見于許多易于獲得的來源，例如Sambrook，etal.，MolecularCloningALaboratoryManual，SecondEdition，ColdSpringHarbor，N.Y.，(1989)。也見于Grahametal.(1988)Virology63，614-617所述的用于構建例如腺病毒基因輸送載體的拯救重組技術。如果需要，將一個異源結構序列以與翻譯起始和終止序列、優(yōu)選能指導翻譯的蛋白質分泌入壁膜間隙或胞外基質的前導序列、合適的狀態(tài)裝配在表達載體中。本發(fā)明還涉及用上述那些構建體轉化/轉染/轉導的宿主細胞，涉及所述細胞的子代，尤其在這種細胞產(chǎn)生一種穩(wěn)定的細胞系的情況中，該細胞系可用于分析eNOS活性例如以鑒別調節(jié)eNOS活性的制劑和/或用于生產(chǎn)本發(fā)明的多肽(例如制備生產(chǎn))?？梢蕴峒暗暮线m的宿主的代表性實例是細菌細胞，例如大腸桿菌，鏈霉菌，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)；真菌細胞，例如酵母；昆蟲細胞如果蠅S2和SpodopteraSf9(及其它昆蟲表達系統(tǒng))；動物細胞，包括哺乳動物細胞如CHO、COS(例如Gluzman，Cell，23175(1981)所述的猴腎成纖維細胞的COS-7細胞系)、C127、3T3、CHO、HeLa、BHK或Bowes黑素瘤細胞系；植物細胞。合適宿主的選擇確信在本領域技術人員的學術范圍內(nèi)。用于測試推定的調節(jié)因子的細胞系通常是哺乳動物細胞，監(jiān)測其NO水平以表示不同的eNOS活性。將一種構建體導入(或輸送至)宿主細胞可以通過例如磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂染、基因槍或電穿孔而實現(xiàn)(Davis，L，Dibner，M.，Battey，I.，BasicMethodsinMolecularBiology，(1986))。在轉化進合適的宿主菌株及在宿主菌株生長至合適的細胞密度之后，如果需要則選擇的啟動子可以通過合適的方式誘導(例如溫度改變或化學誘導)，并將細胞再培養(yǎng)一段時間。可將工程化的宿主細胞在經(jīng)修飾的適于激活啟動子(如果需要)、選擇轉化體或擴增本發(fā)明基因的標準營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件如溫度、pH等可以是先前選擇用于表達的宿主細胞使用的那些條件，而且是本領域熟練的技術人員熟知的。細胞可以典型地通過離心收獲、通過物理或化學方式破壞，并保留所得粗提物以進一步純化。或者，當一種異源多肽從宿主細胞中分泌進培養(yǎng)液中時，培養(yǎng)液的上清可用作蛋白質的來源。用于蛋白質表達的微生物細胞可以通過任何方法破壞，所述方法包括冷凍-解凍循環(huán)、超聲、機械破壞或使用細胞裂解劑。所述多肽可以通過標準方法從重組細胞培養(yǎng)物中回收和純化，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水性相互作用層析、親和性層析、羥磷灰石層析和凝集素層析等。如果需要，蛋白質再折疊步驟可用于完成成熟蛋白質的構型。最后的純化步驟可應用高效液相層析(HPLC)。除了上述從原核或真核宿主中重組生產(chǎn)多肽之外，本發(fā)明的多肽可以從天然來源中制備，或者可以通過化學合成方法制備(例如合成或半合成)，例如使用標準肽合成儀制備。也可以使用無細胞的翻譯系統(tǒng)以使用衍生自本發(fā)明的DNA構建體的RNA產(chǎn)生這種蛋白質。本發(fā)明的蛋白質也可以在轉基因動物或植物中表達，及從中分離和/或純化。生產(chǎn)和使用這種轉基因生物體的程序是本領域的標準程序。在本文另處描述了一些這種程序。當然，重組多核苷酸、包含這種多核苷酸的載體和轉移載體(例如用于基因治療的病毒轉移載體)也可以通過標準方法制備。例如，為制備腺病毒，例如包含本發(fā)明重組eNOS突變多核苷酸的腺病毒，可將感染的細胞離心并裂解，并將細胞裂解物進一步處理以從不需要的污染物如細胞成分中分離(例如純化、分離)病毒。純化腺病毒的標準程序是例如離心或膨脹床吸附層析以除去細胞碎片和/或濃縮病毒、大小排阻層析、離子交換(例如DEAE)層析、超速離心、超濾、等等。本發(fā)明還涉及一種非人轉基因動物，在其基因組內(nèi)包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的一或多個拷貝。本發(fā)明的轉基因動物在其基因組內(nèi)可含有編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的多個拷貝，或者編碼這種多肽的基因的一個拷貝，但其中所述基因與一個啟動子(例如可調節(jié)啟動子)連接，這將指導eNOS多肽突變體在所述轉基因動物的一些或全部細胞中表達(優(yōu)選過表達)。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的eNOS多肽突變體的表達優(yōu)先在血管組織中發(fā)生。可保證本發(fā)明的eNOS突變體優(yōu)先在希望的部位表達的調節(jié)序列，如組織特異性啟動子或增強子，是本領域熟知的。一些這種調節(jié)元件在本文另處加以論述。本發(fā)明涵蓋了許多非人轉基因生物體，包括例如果蠅、C.elegans、zebrafish和酵母。本發(fā)明的轉基因動物優(yōu)選是哺乳動物，例如牛、山羊、綿羊、兔、非人靈長類動物或大鼠，最優(yōu)選是小鼠。生產(chǎn)轉基因動物的方法是為本領域技術人員所熟知的，包括例如同源重組、誘變(例如ENU，Rathkolbetal.，Exp.Physiol.，85(6)635-644，2000)，及四環(huán)素調節(jié)的基因表達系統(tǒng)(見例如U.S.Pat.No.6,242,667；Wuetal，MethodsinGeneBiotechnology，CRC1997，pp.339-366；Jacenko，O.，StrategiesinGeneratingTransgenicAnimals，inRecombinantGeneExpressionProtocols，Vol.62ofMethodsinMolecularBiology，HumanaPress，1997，pp399-424)。轉基因生物體用于例如提供本發(fā)明的多核苷酸或多肽的來源，或者鑒別和/或鑒定調節(jié)這種多核苷酸或多肽表達和/或活性的制劑。轉基因動物也用作與例如本發(fā)明的突變的多核苷酸或多肽的表達相關的病癥的模型。本發(fā)明還涉及一種轉基因非人動物，其基因組包含編碼本文所述突變的eNOS的一或多個基因以代替另外的編碼述多肽的哺乳動物基因。剔除eNOS基因并將其用一個突變基因置換的方法是已知的(見例如Murohara1998(如前述)描述了一種小鼠，其中已經(jīng)剔除了eNOS基因)。優(yōu)選地，所述轉基因動物是小鼠或大鼠。除了上述方法之外，轉基因動物(或者剔除動物，其中插入一個轉基因以置換剔除的基因)可以根據(jù)已知方法制備，包括例如通過將重組基因原核注射入單細胞胚胎的原核中，將一種人工酵母染色體摻入胚胎干細胞中，基因定向方法，胚胎干細胞方法學，克隆方法，核轉移方法。也見例如U.S.PatentNos.4,736,866、4,873,191、4,873,316、5,082,779、5,304,489、5,174,986、5,175,384、5,175,385、5,221,778；Gordonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，777380-7384，1980；Palmiteretal.，Cell，41343-345，1985；Palmiteretal.，Ann.Rev.Genet.，20465-499，1986；Askewetal.，Mol.Cell.Bio.，134115-4124，1993；Gamesetal.Nature，373523-527，1995；ValanciusandSmithies，Mol.Cell.Bio.，111402-1408，1991；Staceyetal.，Mol.Cell.Bio.，141009-1016，1994；Hastyetal.，Nature，350243-246，1995；Rubinsteinetal.，Nucl.AcidRes.，212613-2617，1993；Cibellietal.，Science，2801256-1258，1998所述。重組酶切割系統(tǒng)的指導見例如U.S.Pat.Nos.5,626,159、5,527,695和5,434,066所述。也見Orban，P.C.，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，896861-6865(1992)；O′Gorman，S.，etal.，Science，2511351-1355(1991)；Sauer，B.，etal.，PolynucleotidesResearch，17(1)147-161(1989)；Gagneten，S.etal.(1997)Nucl.AcidsRes.253326-3331；XiaoandWeaver(1997)Nucl.AcidsRes.252985-2991；Agah，R.etal.(1997)J.Clin.Invest.100169-179；Barlow，C.etal.(1997)Nucl.AcidsRes.252543-2545；Araki，K.etal.(1997)Nucl.AcidsRes.25868-872；Mortensen，R.N.etal.(1992)Mol.Cell.Biol.122391-2395(G418escalation方法)；Lakhlani，P.P.etal.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA949950-9955(“hitandrun”)；WestphalandLeder(1997)Curr.Biol.7530-533(轉座子產(chǎn)生的“剔除”和“敲入(knock-in)”)；Templeton，N.S.etal.(1997)GeneTher.4700-709(用于有效基因靶向的方法，使得可以發(fā)生高頻率同源重組事件，例如無需選擇標記)；PCT國際公開WO93/22443(功能性破壞)所述。為產(chǎn)生轉基因動物，本發(fā)明的eNOS多核苷酸可以導入任何非人動物中以產(chǎn)生轉基因動物，所述非人動物包括非人哺乳動物，例如小鼠(例如Hoganetal.，ManipulatingtheMouseEmbryoALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NewYork，1986)、豬(例如Hammeretal.，Nature，315343-345，1985)、羊(例如Hammeretal.，Nature，315343-345，1985)、牛、大鼠或靈長類動物(例如Church，1987，TrendsinBiotech.513-19；Clarketal.，TrendsinBiotech.520-24，1987及DePamphilisetal.，BioTechniques，6662-680，1988所述)。轉基因動物可以通過U.S.Pat.No.5,994,618所述的方法產(chǎn)生(或增殖)，并用于本發(fā)明所述的任何用途。eNOS多肽結合配偶體本發(fā)明的eNOS多肽突變體或其變體，或者表達它們的細胞，也可以用于分析特異性結合配偶體，例如特異性結合本發(fā)明eNOS多肽突變體的蛋白質和核酸。這種結合配偶體包括例如激酶、磷酸酶和鈣調蛋白。另外，本發(fā)明的eNOS多肽突變體可用作免疫原以產(chǎn)生特異性抗體或抗原結合片段。可以使用本文所述或本領域已知的標準方法分析并分離eNOS多肽突變體的這種特異性結合配偶體。“特異性”抗體或抗原結合片段是指選擇性(優(yōu)先)結合本發(fā)明eNOS或其片段或變體，特別是結合本發(fā)明突變的序列的抗體或抗原結合片段?！疤禺愑凇倍嚯牡目贵w是指該抗體識別所述多肽內(nèi)的或多肽包含的一個限定的氨基酸序列。本發(fā)明的抗體可例如是多克隆或單克隆抗體。本發(fā)明還包括嵌合的、重組的、單鏈的及部分或完全人源化的抗體，以及Fab片段，或者Fab表達文庫的產(chǎn)物，及其片段。所述抗體可以是IgM、IgG、亞型、IgG2A、IgG1、等?？梢允褂帽绢I域已知的各種方法產(chǎn)生這種抗體和片段。針對相應于本發(fā)明一個序列的多肽產(chǎn)生的抗體可以例如通過如下方法獲得，直接將該多肽注射入動物中，或者將該多肽給予動物如山羊、兔、小鼠、雞等，優(yōu)選給予非人動物。如此獲得的抗體然后自身結合所述多肽。以這種方式，即使只編碼本發(fā)明多肽一個片段的序列也可以用于產(chǎn)生結合完整天然多肽的抗體。這種抗體然后可用于從表達該多肽的組織中分離該多肽?？贵w也可以通過給予裸DNA而產(chǎn)生。見例如USPNo.5,703,055、5,589,466和5,580,859所述。為制備單克隆抗體，可以使用通過連續(xù)細胞系培養(yǎng)產(chǎn)生抗體的任何技術。產(chǎn)生人單克隆抗體的所述技術例如包括雜交瘤技術(KohlerandMilstein，1975，Nature，256495-497)、三瘤技術、人B細胞雜交瘤技術(Kozboretal.，1983，ImmunologyToday472)及EBV-雜交瘤技術(Cole，etal.，1985，inMonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，AlanR.Liss，Inc.，pp.77-96)。生產(chǎn)單鏈抗體的技術(例如U.S.Patent4,946,778所述)可適于生產(chǎn)本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物的單鏈抗體。另外，轉基因動物可用于表達本發(fā)明的免疫原性多肽的部分或完全人源化的抗體。本發(fā)明還涉及其它特異性結合配偶體，包括例如適體(aptamers)和PNA。eNOS多肽突變體及編碼這種eNOS多肽的多核苷酸的診斷、預防和治療應用內(nèi)皮NO合酶參與許多功能和活性，例如本文所述的功能和活性；這些eNOS多肽的異常表達和/或活性，和/或由這些酶產(chǎn)生的NO的異常數(shù)量，與許多疾病相關。因此，本發(fā)明的eNOS多肽突變體和多核苷酸及其變體可用于調節(jié)細胞中eNOS活性，以改善這種病癥。在一些實施方案中，eNOS的表達和/或活性增加及隨之eNOS產(chǎn)生的NO量的增加與例如不利的血管發(fā)生相關，不利的血管發(fā)生例如導致不利的細胞增殖、腫瘤生長或各種致瘤性疾病。與NO產(chǎn)生增加相關的病癥是例如各種致瘤性疾病(包括癌發(fā)生、腫瘤發(fā)生及轉移癌增殖)、惡性腫瘤對放療或化療的抗性、膀胱癌轉移或否(cystadenocarcinoma)、血管肉瘤和增殖性視網(wǎng)膜病。在一些實施方案中，eNOS的表達和/或活性降低及伴隨的eNOS產(chǎn)生的NO量的降低與許多疾病相關，例如與過度血管收縮和/或不充分的血管舒張相關的病癥，所述病癥例如周圍肢體缺血、周圍動脈閉塞性疾病(PAOD)和重癥肢體缺血(CLI)、動脈硬化或血管血栓癥；心肌缺血，如由于冠狀動脈狹窄引起的血流受限所致；再狹窄，例如在球囊血管成形術后；高血壓，肺動脈高壓，阻塞性呼吸道疾病，移植動脈硬化，主動脈瘤，高膽固醇血癥，衰老，炎癥，吸煙的后果、充血性心力衰竭，妊娠毒血癥，糖尿病，血管發(fā)生缺陷疾病，Raynaud′s現(xiàn)象，Prinzmetal′s絞痛(冠狀動脈痙攣)，腦血管痙攣，溶血性尿毒癥，勃起功能障礙及傷口愈合不佳。與NO的異常低量相關的其它病癥包括心功能不全、心衰、缺血性心肌病、擴張性心肌病或移植后心肌病、心絞痛(包括不穩(wěn)定性心絞痛)、冠狀動脈痙攣、移植后冠心病、高膽固醇血癥、高血脂、高甘油三酯血癥(hypertriglyceridemia)、糖尿病(胰島素依賴型或非依賴型)的血管副作用、慢性腎功能不全(尿毒癥)的血管副作用、各種緣由的內(nèi)皮功能失調(動脈硬化、煙癮、X綜合征、肥胖、高血壓、血脂異常(dyslipidemia)、胰島素抗性)、系統(tǒng)或自身免疫性脈管炎、高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia)、buergerangeitis、血管栓塞疾病(thrombo-embolicdisease)、深或淺靜脈血栓、血管區(qū)內(nèi)動脈不足的動脈硬化(局部缺血，包括腦缺血或冠狀動脈缺血)、肺動脈高壓、血液透析或腹膜透析的副作用。NO的量不足還與不希望的子宮平滑肌收縮或子宮頸松弛相關；由此本發(fā)明突變的eNOS用于例如給予子宮而預防先兆流產(chǎn)，或者給予子宮頸而刺激或誘導分娩。與NO的量不足相關的其它病癥包括子癇前期(preeclampsia)、痛經(jīng)和尿失禁。給予本發(fā)明的eNOS多肽突變體還用于調節(jié)免疫應答。例如，本發(fā)明的eNOS多肽可以導入T細胞、血小板、中性粒細胞、單核細胞或NK細胞以調節(jié)其活性。通過這種措施可受益的病癥包括例如動脈硬化、炎癥疾病或自身免疫疾病。不希望限于任何特殊理論或機制，預期本發(fā)明的eNOS多肽突變體通過促進糖和脂肪酸的代謝以及改善肌細胞的營養(yǎng)和氧供給而有益于治療缺血性心臟病。本發(fā)明提供了在體外或體內(nèi)(例如在基于細胞的分析或在動物模型內(nèi))篩選物質的方法，以鑒別調節(jié)eNOS多肽的合成和/或活性的那些物質。這種方法可應用本發(fā)明突變的eNOS多肽或多核苷酸或其變體。抑制這種合成和/或活性的物質(拮抗劑)可例如導致患者細胞內(nèi)NO水平降低及因此引起生理學改變。增強這種合成和/或活性的物質(激動劑)可例如提高受影響的細胞內(nèi)NO的水平。例如，本發(fā)明涉及鑒別eNOS表達的調節(jié)劑的方法，包括測試推定的調節(jié)劑增加或降低本發(fā)明eNOS多肽突變體的例如作為鈣調蛋白和/或鈣離子濃度函數(shù)的磷酸化或活性的能力，或者調節(jié)本文所述的任何eNOS活性的能力。監(jiān)測這種活性的分析方法是本領域中的標準方法而且是為技術人員熟知的。抑制eNOS表達和/或活性的物質可用于治療、預防和/或改善與eNOS過表達或活性增加相關的病癥；增強這種活性的物質可用于治療、預防和/或改善與eNOS的表達低下或活性降低相關的病癥。eNOS多肽的抑制劑(例如eNOS活性或表達的抑制劑)可用于治療在本文另處描述的與eNOS的過表達或活性增加相關的任何病癥。本發(fā)明的eNOS多核苷酸或多肽突變體的刺激劑可用于例如治療在本文另處描述的與eNOS的表達低下或活性降低相關的任何病癥。在潛在的拮抗劑或激動劑的分析試驗中，可應用與eNOS相關的各種功能/或酶活性。典型的功能和活性在本文另處揭示?？稍隗w外、來自體內(nèi)(exvivo)或在體內(nèi)進行分析，并可以使用任何合適的細胞或組織進行。體內(nèi)分析可使用例如已經(jīng)描述的轉基因小鼠或者一種人源化小鼠進行，所述人源化小鼠中存在編碼所述突變的人eNOS的一種人類基因以代替編碼這種多肽突變體的小鼠基因。本文所述的任何分析當然可以適應于各種高通量方法學，可以產(chǎn)生、鑒別和鑒定推定的抑制劑或刺激劑。基于其調節(jié)eNOS表達或活性的能力而鑒別的物質也可以用于調節(jié)其它eNOS野生型或突變的多肽，和/或用于診斷或治療與一或多種eNOS活性相關的病癥。本發(fā)明的潛在的調節(jié)劑例如抑制劑或激活劑包括例如小的化合物(例如非有機或有機分子)、多肽、肽或肽多肽突變體、多核苷酸、特異性結合本發(fā)明多肽的抗體，等等。其它抑制劑或刺激劑可以進入細胞并直接結合與編碼本發(fā)明多肽的序列相鄰的DNA，從而降低其表達并因此降低胞內(nèi)NO的水平，或者提高其表達并因此提高胞內(nèi)NO的水平。本發(fā)明提供了一種診斷或確定包含NO水平變化的實際或潛在疾病或病癥的階段的方法(例如所述疾病或病癥是由eNOS的產(chǎn)生或活性介導的或與之相關)，所述方法通過確定懷疑具有這種疾病或病癥或者處于這種危險之中的動物體(例如需要治療的患者)內(nèi)本發(fā)明的eNOS多肽突變體的量(例如存在與否，或數(shù)量)或者其活性水平而進行。例如，本發(fā)明提供了一種診斷患病動物的疾病的方法，或者一種診斷處于患病危險中的動物對所述疾病的易感性的方法，其中所述疾病與例如特定的細胞、組織或器官中存在本發(fā)明的突變相關，這導致細胞、組織或器官中NO水平的不利地增加或降低，其中所述動物是哺乳動物，更優(yōu)選是人。這種診斷方法可應用在本文另處描述的任何分析試驗。例如，可以使用基于本發(fā)明的抗體或抗原特異性片段的方法檢測突變的多肽。免疫學分析包括例如ELISA、RIA和FACS分析。當為了診斷而分析樣品時，樣品可得自患者的任何合適的細胞、組織、器官或體液，包括但非限于血液、尿液、唾液、組織活檢和尸檢材料。本發(fā)明的eNOS多肽突變體的檢測也可用于研究目的，例如篩選已經(jīng)用攜帶這種突變體的質粒轉染的細胞以鑒別攜帶所述突變的那些細胞的研究中。根據(jù)本發(fā)明，抗體或抗原結合片段可存在于一個試劑盒中，該試劑盒包含例如一或多個抗體或抗原結合片段，一種希望的緩沖液，檢測組合物，用作對照的蛋白質(例如本發(fā)明的eNOS突變體)。包含多核苷酸的分析可用于確定樣品中本發(fā)明的突變的eNOS核酸的存在與否和/或對其定量。這種分析可用于例如診斷、預測、研究或法醫(yī)學目的。所述分析可例如是基于膜、基于溶液或基于芯片的分析?？梢允褂萌魏魏线m的分析形式，包括但非限于Southern印跡分析，Northern印跡分析，聚合酶鏈反應(PCR)(例如Saikietal.，Science，24153，1988；U.S.Pat.Nos.4,683,195、4,683,202和6,040,166；PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplications，Innisetal.，eds.，AcademicPress，NewYork，1990所述)，逆轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)，錨式PCR，cDNA末端快速擴增(RACE)(例如Schaefer，GeneCloningandAnalysisCurrentInnovations，Pages99-115，1997)，連接酶鏈反應(LCR)(EP320308)，限性(one-sided)PCR(Oharaetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，865673-5677，1989)，指示(indexing)方法(例如U.S.Pat.No.5,508,169)，原位雜交，示差展示(例如Liangetal.，Nucl.Acid.Res.，213269-3275，1993；U.S.Pat.Nos.5,262,311、5,599,672和5,965,409；WO97/18454；PrasharandWeissman，Proc.Natl.Acad.Sci.，93659-663及U.S.Pat.Nos.6,010,850和5,712,126；Welshetal.，NucleicAcidRes.，204965-4970，1992和U.S.Pat.No.5,487,985)及其它RNA指紋法技術，基于核酸序列的擴增(NASBA)及其它基于轉錄的擴增系統(tǒng)(例如U.S.Pat.Nos.5,409,818和5,554,527；WO88/10315)，多核苷酸陣列(例如U.S.Pat.Nos.5,143,854，、5,424,186、5,700,637、5,874,219和6,054,270；PCTWO92/10092；PCTWO90/15070)，Qbeta復制酶(PCT/US87/00880)，鏈置換擴增(SDA)，修復鏈反應(RCR)，核酸酶保護分析，基于扣除的方法(subtraction-basedmethos)或Rapid-ScanTM。其它有用的方法包括但非限于例如基于模板的擴增方法，競爭PCR(例如U.S.Pat.No.5,747,251)，基于氧化還原反應的分析(例如U.S.Pat.No.5,871,918)，基于Taqman的分析(例如Hollandetal.，Proc.Natl.Acad，Sci.，887276-7280，1991；U.S.Pat.Nos.5,210,015和5,994,063)，基于實時(real-time)熒光的監(jiān)測(例如U.S.Pat.5,928,907)，分子能量轉移標記(例如U.S.Pat.Nos.5,348,853、5,532,129、5,565,322、6,030,787和6,117,635；TyagiandKramer，NatureBiotech.，14303-309，1996)?？梢允褂眠m于基因或蛋白質表達的單細胞分析的任何方法，包括原位雜交、免疫細胞化學、MACS、FACS、流式細胞計量術，等等。為進行單細胞分析，表達產(chǎn)物可以使用抗體、PCR或其它類型的核酸擴增方法測定(例如Bradyetal.，MethodsMol.&Cell.Biol.2，17-25，1990；Eberwineetal.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.，89，3010-3014，1992；U.S.Pat.No.5,723,290)。這些及其它方法可常規(guī)進行，如引用的參考文獻所述進行。本發(fā)明還提供了診斷患病動物的疾病的方法，或者診斷處于患病危險中的動物對該疾病的易感性的方法，其中所述疾病與例如編碼eNOS多肽的多核苷酸的表達相關，所述方法包括確定來自該動物的細胞中所述多核苷酸的量，其中所述動物優(yōu)選是哺乳動物，最優(yōu)選是人?？梢允褂帽疚乃龅募氨绢I域已知的任何分析方法確定這種多核苷酸的存在與否和/或對其定量。編碼部分或全部本發(fā)明eNOS多肽突變體的多核苷酸序列可作為開發(fā)探針的參考，例如30-45個或更長的核苷酸可用于例如探查懷疑處于患病危險中的或患病動物的基因組；或者用于檢測這種突變的多核苷酸以進行研究，例如在篩選已經(jīng)用攜帶這種突變體的質粒轉染的細胞以鑒別包含所述突變的那些細胞的研究中。這種類型的雜交探針優(yōu)選有至少7或8個堿基，更優(yōu)選有大約10、11、12、13、14或15個堿基，最優(yōu)選有至少大約30個堿基，并呈現(xiàn)與編碼本發(fā)明的eNOS多肽突變體的部分或全部序列有大約65-100％的相同性。雜交探針特異于所選擇的多肽。術語“特異于”一種多核苷酸是指探針可用于鑒別樣品中一或多種靶基因或多核苷酸的存在情況。該探針是特異的是指其可用于在背景干擾(非特異性結合)之上檢測多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，多核苷酸可以存在于一個試劑盒中，其中所述試劑盒包含例如一或多種多核苷酸(如雜交探針)，一種希望的緩沖液(例如磷酸鹽緩沖液，Tris，等等)，檢測組合物，用作對照的RNA或cDNA(例如包含本發(fā)明的突變體)，文庫，等等。所述多核苷酸可以是用本領域已知的放射性或非放射性標記進行標記或是未標記的。本發(fā)明還涉及抗擊本文所述的eNOS介導的或與之相關的疾病或病癥的治療或預防方法，所述方法是例如給予影響eNOS的產(chǎn)生和/或活性的物質，或者給予一種如本發(fā)明的突變的eNOS多肽或多核苷酸的物質。這種治療可抑制或改善這種疾病或病癥。這種物質可通過標準程序給予需要治療的患者。合適的給予途徑是本領域技術人員熟知的，包括但非限于血管內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、動脈內(nèi)、和口服途徑。這種物質可使用標準方法配制為包含藥物可接受的賦形劑、載體等的藥物組合物。增強物質穿過細胞膜轉移(促進滲透)或者防止降解的配方和賦形劑是本領域技術人員所熟知的。例如，一種輸送載體(就體內(nèi)或來自體內(nèi)轉移而言，例如多核苷酸)可以通過任何標準方法輸送至靶細胞，所述方法包括例如脂質體介導的轉染，其中脂質體例如是含有膽固醇衍生物如SF-chol或DC-chol的陽離子脂質體；脂轉染胺轉染，等等。典型的方法例如USP5,656,565；Manninoetal.(1988)BioTechniques6，682-690及本文的參考文獻以及Gaoetal.(1991)BiochemBiophysResComm179，280-285所述。在一個實施方案中，給予患有與eNOS活性相關的病癥的患者的物質是局部給予表現(xiàn)疾病病癥的部位。這種局部給予可避免由NO在非疾病相關的細胞或組織中引起的不必要的作用(例如副作用)。例如，分子可直接給予心臟或骨骼肌，包括心肌細胞和骨骼肌細胞。本發(fā)明的多肽或多核苷酸可通過直接冠脈內(nèi)(或經(jīng)導管)注射而輸送至心肌組織，使用標準的基于經(jīng)皮導管方法在熒光鏡引導下，例如在足以使轉基因表達至達到高效治療的程度的量進行。所述注射可深入冠狀動脈(或導管)內(nèi)腔(例如在動脈內(nèi)腔內(nèi)大約1cm)，優(yōu)選在兩側冠狀動脈內(nèi)進行，因為側支血管的生長在各個患者體內(nèi)是高度變化的。通過冠狀動脈導管直接將材料注射入冠狀動脈的內(nèi)腔中，可以有效定向基因，及在注射期間最小程度地損失最接近主動脈的重組載體或多肽。當以這種方式輸送時，基因表達在肝細胞中不發(fā)生，而且在冠脈內(nèi)注射后的任何時間均不能發(fā)現(xiàn)病毒RNA。本發(fā)明可使用任何冠脈導管或者例如Stack灌注導管。另外，可以使用本領域技術人員已知的其它技術將本發(fā)明的突變的eNOS轉移至動脈壁。也見于Giordanoet.al.，(1994)ClinRes42，123A所述。為治療外周血管疾病，特征在于腿部血供不足的疾病，本發(fā)明的多核苷酸可以通過插入股動脈近端部分的導管輸送，從而實現(xiàn)轉移進接受股動脈血供的骨骼肌細胞中。見例如USP5,792,453所述。本發(fā)明的藥物也可以使用標準方法直接轉移進腦或脊髓，子宮或子宮頸(例如以乳液或形式)，或者任何希望的部位。在另一個實施方案中，治療分子(例如本發(fā)明突變的多肽或多核苷酸)是使用標準方法系統(tǒng)地給予的，但該標準方法經(jīng)改良以便其定向于感興趣的細胞、組織或器官。例如，多核苷酸可以置于組織特異性調節(jié)元件的控制下，如啟動子或增強子元件。例如通過將左心室肌球蛋白輕鏈-2(MLC[2V])或肌球蛋白重鏈的組織特異性轉錄控制序列與一種轉基因如本發(fā)明的eNOS基因在一個構建體如腺病毒構建體內(nèi)融合，則轉基因表達限于心室心肌細胞。由MLC[2V]和MHC啟動子及l(fā)acZ提供的基因表達的效力和特異性的程度已經(jīng)使用重組腺病毒系統(tǒng)確定。心臟特異性表達已經(jīng)由Lee等報道(J.Biol.Chem.26715875-15885(1992))。MLC[2V]啟動子由250bp組成，并易于適合例如腺病毒-5包裝限制。肌球蛋白重鏈啟動子，已知是強轉錄啟動子，提供了另一種合理的心臟特異性啟動子并由少于300bp組成。也可以使用骨骼肌特異性啟動子(見例如Hauseretal.(2000)Mol.Therapy216-26；Lietal.(1999)NatureBiotech.17241-245；及PatentWO99/02737所述)。也可利用平滑肌細胞啟動子如SM22α啟動子(Kempetal.，(1995)BiochemJ310(Pt3)1037-43)和SMα肌動蛋白啟動子(Shimizuetal.(1995)JBiolChem270(13)7631-43)。通過使用這種組織特異性啟動子及在體內(nèi)輸送轉基因，確信心肌細胞單獨(即在內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和心臟內(nèi)的成纖維細胞中不伴隨表達)即能提供本發(fā)明的eNOS多肽突變體的足夠的表達。限于心肌細胞或骨骼肌細胞的表達對基因轉移在治療臨床心肌缺血或外周缺血的用途中也有益處。通過限于心臟或骨骼肌表達，可避免血管發(fā)生在如視網(wǎng)膜的組織中的潛在有害作用。另外，在心臟的細胞中，肌細胞可能提供最長時間的轉基因表達，因為該細胞不進行快速更新，因此表達不會如內(nèi)皮細胞那樣由細胞分裂和死亡而導致降低。用于這種或其它目的的內(nèi)皮特異性啟動子是可以獲得的。內(nèi)皮特異性啟動子的實例包括Tie-2啟動子(Schlaegeretal.(1997)ProcNatlAcadSci1；94(7)3058-63)，內(nèi)皮縮血管肽啟動子(Leeetal.(1990)J.Biol.Chem.26510446-10450及eNOS啟動子(Zhangetal.(1995)JBiol.Chem270(25)15320-6和BuandQuertermous(1997)J.Biol.Chem.27232613-32622)。在本發(fā)明的一個實施方案中，將eNOS多肽突變體或其變體給予需要這種治療的患者，這種多肽可例如補償eNOS的降低或異常的表達或活性，包括例如患者的細胞、組織或器官中異常低水平的NO。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法涉及特別是在周圍血管疾病，心肌缺血或重癥肢體缺血(CLI)患者中一種刺激內(nèi)源性血管發(fā)生不足的缺血性疾病中側支血管發(fā)生的方法，所述方法包括給予本發(fā)明的eNOS多肽突變體。在一個優(yōu)選的實施方案中，對eNOS多肽突變體進行修飾以增強其進入細胞的能力。例如，在感興趣的多肽的N末端融合HIV-TAT多肽的一種融合多肽YGRKKRRQRRR(也稱為蛋白質轉導結構域，PTD)可以在大腸桿菌中產(chǎn)生，并純化變性形式的蛋白質?？梢詫⑦@種融合多肽(例如PTD-eNOS)導入患者中以進行治療。將變性的全長蛋白質轉導入細胞中的方法在本領域已經(jīng)有描述(見例如NatureMedicine(1998)Vol.4(12)1449所述)。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種治療特征在于細胞或組織具有異常eNOS低活性或低量的病癥，所述方法包括給予一種編碼本發(fā)明突變的eNOS多肽的多核苷酸，即一種基因治療方法，其中本發(fā)明的多核苷酸在一種基因輸送載體中被輸送。這種方法可用于治療在本文另處描述的任何病癥。例如，本發(fā)明涉及一種特別是在周圍血管疾病和/或心肌缺血患者中刺激內(nèi)源血管發(fā)生不足的缺血性疾病中側支血管發(fā)生的方法，所述方法包括給予編碼本發(fā)明突變的eNOS多肽的一種轉基因。所述基因輸送載體可以是病毒或非病毒來源的(通常見Jolly，CancerGeneTherapy151-64(1994)Kimura，HumanGeneTherapy5845-852(1994)；Connelly，HumanGeneTherapy1185-193(1995)和Kaplitt，NatureGenetics6148-153(1994)所述)。用于輸送構建體包括例如本發(fā)明的治療性編碼序列的基因治療載體可以局部或系統(tǒng)地給予。這些構建體可利用病毒或非病毒載體方案。這種編碼序列的表達可以使用內(nèi)源哺乳動物或異源啟動子誘導。編碼序列的表達可以是組成型或可調節(jié)的。本發(fā)明可應用重組逆轉錄病毒，構建這種重組逆轉錄病毒以攜帶或表達一種選擇的感興趣的核酸分子?？蓱玫哪孓D錄病毒載體包括EP0415731；WO90/07936；WO94/03622；WO93/25698；WO93/25234；U.S.PatentNo.5,219,740、WO93/11230、WO93/10218；VileandHart，CancerRes.533860-3864(1993)；VileandHart，CancerRes.53962-967(1993)；Rametal.，CancerRes.5383-88(1993)；Takamiyaetal.，J.Neurosci.Res.33493-503(1992)；Babaetal.，J.Neurosurg.79729-735(1993)；U.S.PatentNo.4,777,127；GBPatentNo.2,200,651；EP0345242及WO91/02805中描述的那些載體。適于與上述逆轉錄病毒載體構建體一起使用的包裝細胞系可易于制備(見例如PCT出版物WO95/30763和WO92/05266所述)，并用于產(chǎn)生生產(chǎn)細胞系(也稱為載體細胞系)以生產(chǎn)重組載體顆粒。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，包裝細胞系是從人體(如HT1080細胞)或水貂親代細胞系中產(chǎn)生的，從而允許在人血清中可不被失活的重組逆轉錄病毒的產(chǎn)生。本發(fā)明的方法也可以應用基于α病毒的載體，其作為基因輸送的載體。這種載體可以從各種α病毒中構建，包括例如Sindbis病毒載體、Semliki森林病毒(ATCCVR-67；ATCCVR-1247)、RossRiver病毒(ATCCVR-373；ATCCVR-1246)和委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(ATCCVR-923；ATCCVR-1250；ATCCVR-1249；ATCCVR-532)。這種載體系統(tǒng)的代表性實例包括如U.S.PatentNos.5,091,309、5,217,879和5,185,440；及PCT出版物Nos.WO92/10578、WO94/21792、WO95/27069、WO95/27044和WO95/07994所述那些載體系統(tǒng)。本發(fā)明的基因輸送載體也可使用細小病毒如腺伴隨病毒(AAV)載體。代表性實例包括由Srivastava在WO93/09239中、Samulskietal.，J.Vir.633822-3828(1989)、Mendelsonetal.，Virol.166154-165(1988)及Flotteetal.，P.N.A.S.9010613-10617(1993)中揭示的AAV載體。在一個優(yōu)選的實施方案中，使用腺病毒載體。本領域熟知許多修飾的腺病毒載體(例如Ad5或Ad2的修飾的載體)，特別是非復制性載體和/或不依賴輔助病毒的病毒。腺病毒載體的代表性實例包括由Berkner，Biotechniques6616-627(Biotechniques)；Rosenfeldetal.，Science252431-434(1991)；WO93/19191；Kollsetal.，P.N.A.S.215-219(1994)；Kass-Eisleretal.，P.N.A.S.9011498-11502(1993)；Guzmanetal.，Circulation882838-2848(1993)；Guzmanetal.，Cir.Res.731202-1207(1993)；Zabneretal.，Cell75207-216(1993)；Lietal.，Hum.GeneTher.4403-409(1993)；Cailaudetal.，Eur.J.Neurosci.51287-1291(1993)；Vincentetal.，Nat.Genet.5130-134(1993)；Jaffeetal.，Nat.Genet.1372-378(1992)及Levreroetal.，Gene101195-202(1992)所述的那些載體。本發(fā)明中可應用的腺病毒基因治療載體的實例還包括在WO94/12649、WO93/03769、WO93/19191、WO94/28938、WO95/11984和WO95/00655中所述的那些載體?？梢詰媒o予與如Curiel，Hum.GeneTher.3147-154(1992)所述滅活腺病毒連接的DNA。還可以應用其它基因輸送載體和方法，包括與滅活腺病毒單獨連接或不連接的聚陽離子濃縮DNA，例如Curiel，Hum.GeneTher.3147-154(1992)所述；配體連接的DNA，例如見Wu，J.Biol.Chem.26416985-16987(1989)所述；真核細胞輸送載體，例如見1994年5月9日提請的U.S.SerialNo.08/240,030，及U.S.SerialNo.08/404,796所述；光聚水凝膠材料的沉積；手持基因轉移粒子槍，如U.S.PatentNo.5,149,655所述；致電離輻射，如U.S.PatentNo.5,206,152及WO92/11033所述；核電荷中和或與細胞膜融合。另外的方法見Philip，Mol.CellBiol.142411-2418(1994)核Woffendin，Proc.Natl.Acad.Sci.911581-1585(1994)所述。也可以應用裸DNA。裸DNA導入方法的實例見WO90/11092和U.S.PatentNo.5,580,859所述。使用生物可降解的乳膠珠可改善攝取效力。DNA包被的乳膠珠在胞吞開始后被有效運至細胞中。所述方法可以通過對所述珠進行處理而加以改良以提高疏水性及從而促進內(nèi)體的破壞和DNA釋放入細胞質中?？勺鳛榛蜉斔洼d體的脂質體見U.S.PatentNo.5,422,120，PCTPatentPublicationNos.WO95/13796、WO94/23697和WO91/14445，及EPNo.0524968所述。適于使用的其它非病毒輸送包括機械輸送系統(tǒng)，如Woffendinetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91(24)11581-11585(1994)所述的方案。另外，這種編碼序列和表達產(chǎn)物可以通過光聚水凝膠材料的沉積而輸送?？捎糜谳斔途幋a序列的其它基因輸送的標準方法包括例如使用手持基因轉移粒子槍，如U.S.PatentNo.5,149,655所述；使用致電離輻射以激活轉移的基因，如U.S.PatentNo.5,206,152和PCTPatentPublicationNo.WO92/11033所述。將多核苷酸給予需要治療的患者的基因治療方法可以在體內(nèi)(為患者直接給予多核苷酸)或來自體內(nèi)(基于細胞的治療，包括將所述多核苷酸導入細胞，如取自進行治療的患者的細胞，或者不是取自進行治療的患者的細胞，然后將該轉染的細胞導入患者體內(nèi))進行。本發(fā)明的突變的eNOS多肽或多核苷酸可以單獨給予或者在給予eNOS之前、期間或之后與其它藥劑組合給予，所述其它藥劑例如血管發(fā)生因子，包括但非限于FGF、HGF、VEGF和bFGF，尤其是VEGF或bFGF。制備、給予及測試這種生長因子的方法是本領域中的標準方法。見例如Papapetropoulosetal.，(1997)JClinInvest100，3131-3139，Brocketal.，(1991)AmJPathol138，213-221和Kuetal.，(1993)AmJPhysiol.265，H586-592所述。可以使用標準程序將這種生長因子克隆入合適的表達載體中(單獨或克隆入表達本發(fā)明eNOS多核苷酸的載體中)。見例如Rivardetal.，(1999)AmJPathol154，355-363描述的一種通過使用VEGF進行肌內(nèi)基因治療而誘導血管發(fā)生的方法。在前述和如下的實施例中，所有溫度均設定為攝氏度，除非特別說明，所有部分和百分比均是就重量而言。如下實施例只是例證了本發(fā)明而無限制本發(fā)明之意。實施例實施例1eNOS多肽突變體及重組質粒和病毒載體產(chǎn)生編碼具有單氨基酸取代或雙氨基酸取代的eNOS多肽的質粒載體，以用于在細胞中進行體外和體內(nèi)的eNOS野生型和多肽突變體的質粒載體輸送以及表達。使用Kunkel定點誘變(Kunkel，T.A.PNAS1985；82488-492)直接在eNOS多核苷酸序列中產(chǎn)生突變體。通過測序證實突變。將野生型突變構建體的cDNA克隆入質粒載體pShuttle-CMV中，編碼eNOS多肽的多核苷酸置于CMV表達盒內(nèi)。因此在這些構建體中，多核苷酸可操縱地與一個CMV啟動子連接，由此該啟動子驅動所編碼的eNOS多肽突變體在細胞中的表達。在具有單氨基酸取代的eNOS多肽突變體中，相應于人eNOS的鈣調蛋白結合位點中第495位的Thr(見圖1)被取代為Ala、Asp或Val(分別稱為突變體T495A、T495D、T495V)。在具有雙氨基酸取代的eNOS多肽突變體中，相應于第1177位的Ser被取代為Asp，相應于第495位的Thr被取代為Ala、Asp或Val(分別稱為T495A+S1177D、T495D+S1177D、T495V+S1177D)。這些突變通過測序并測試HEK293細胞中NO的產(chǎn)生而證實(實施例2和圖2)。如Heetal(1998)PNAS95(5)，2509-2514所述產(chǎn)生編碼上述具有單突變或雙突變的eNOS多肽的腺病毒載體，以用于在細胞中進行體外和體內(nèi)的eNOS野生型和多肽突變體的病毒載體輸送。攜帶編碼eNOS多肽突變體的多核苷酸的pShuttle載體(如上述)，與含有缺失E1和E3的Ad5基因組的一個質粒共轉化進大腸桿菌BJ5183中。該腺病毒載體的主鏈衍生自腺病毒5。在這個載體主鏈中，腺病毒序列的E1區(qū)域在核苷酸454-3333之間缺失，部分E3缺失(核苷酸30004-30750)由645bp的外源DNA置換。在E1缺失位置可以插入一個多核苷酸，由此CMV啟動子(在-632至+7)和SV40聚腺苷酸化信號可操縱地與該多核苷酸連接以表達由該多核苷酸編碼的多肽。然后選擇編碼eNOS多肽突變體的所得重組腺病毒質粒，并通過限制性內(nèi)切酶分析而證實。相應的病毒通過用從該質粒切下的重組腺病毒基因組轉染293細胞而拯救，然后將該病毒在293細胞中擴增，通過標準CsCl梯度純化方法純化，并用于測試HAEC中NO的產(chǎn)生(實施例3和圖3)。另外，eNOS多肽突變體NOS1177D(由Sessaetal.，YaleUniversity提供)在相應于SEQIDNO1所示還原酶結構域中第1177位氨基酸殘基的位置有一個氨基酸取代，被取代為Asp。為測試這種eNOS多肽突變體在細胞中的活性，將編碼這個突變體的多核苷酸插入在腺病毒主鏈中缺失E1位置的部位(如實施例1上文所述)。所得的重組載體Ad5NOS1177D編碼eNOS多肽突變體NOS1177D。將該重組載體Ad5NOS1177D轉染進包裝細胞中，并將所得病毒進行噬斑純化，以及進行兩輪擴增。來自第二次擴增的病毒用于在3L生物反應器中接種大規(guī)模感染的HEK293細胞。然后將所得病毒通過兩次CsCl梯度分離而純化，并用10mMTrispH8.0，2mMMgCl2和4％蔗糖透析。將純化的重組病毒的等份也用于測試在HAEC中NO的產(chǎn)生(見實施例3，5和7)。Ad5EGFP是一種對照物，是編碼報道基因——綠色熒光蛋白(GFP)——的一種腺病毒載體，由CollateralTherapeutics制備，然后在HEK293細胞中擴增并通過FPLC純化。經(jīng)純化的病毒然后用PBSpH7.2和2％蔗糖透析。將純化的對照病毒的等份在-80℃貯存以在隨后的實驗中用作對照(見實施例5和7)。實施例2在HEK293細胞中eNOS多肽突變體的檢測及活性測定為測試和測定在HEK293細胞中eNOS多肽突變體的活性，將編碼eNOS多肽突變體的質粒載體(如實施例1所述)用于輸送及在HEK293細胞中表達該多肽突變體。首先將HEK293細胞鋪板于6孔平板中，每孔中有含有10％FBS(SeraCare)、2mM額外的L-谷胺酰胺和50μg/ml慶大霉素的2ml生長培養(yǎng)基(AlphaMEM(Gibco12561-056)。當細胞為大約75％鋪滿時，將它們用一種質粒穿梭載體轉染，所述載體編碼T495A、Thr495D或T495VeNOS多肽突變體(如實施例1所述)，或者編碼野生型人(WT)eNOS(SEQIDNO1)，或者編碼這兩者。轉染如下進行將8μg編碼WTeNOS或突變的eNOS的質粒穿梭載體、60μlLipofectamine2000(Invitrogen)和200lOptiMEM(Gibco)混和，在室溫保溫30分鐘后，將111μl該混合物加上420μlOptiMEM加入含有HEK293細胞的每個孔中。在37℃保溫2.5小時后，向每個孔中加入2ml生長培養(yǎng)基。兩天后(在37℃、5％CO2下保溫細胞)，使用化學發(fā)光方法測定細胞產(chǎn)生的NO量，之后將細胞裂解并如下述使用ELISA分析裂解物的eNOS蛋白含量。將NO產(chǎn)量根據(jù)eNOS蛋白質的量歸一化，以校正不同質粒之間轉染效力中的差異。NO產(chǎn)量的測定除去培養(yǎng)基，并將每個孔均用2mlNO分析緩沖液(5mMNaHEPES，140mMNaCl，5mMKCl，1mMMgCl2，10mM葡萄糖，10mMCaCl2，5mML-精氨酸，pH7.5)洗滌兩次。然后將該緩沖液用含有100U/ml超氧化物歧化酶和40ng/mlVEGF的1mlNO分析緩沖液置換。將孔用石蠟膜覆蓋，在37℃保溫30分鐘后，將細胞上的0.8ml緩沖液注射入SiemensNOA280化學發(fā)光檢測儀中，根據(jù)廠商指導測定NO產(chǎn)量。真正的NO氣用作標準。在完成NO測定后，除去細胞上剩余的緩沖液，并將細胞在0.6ml裂解緩沖液(0.5％NP-40，50mMTris-HClpH7.5，1μg/ml胃蛋白酶抑制劑A，1μg/ml亮抑蛋白酶肽，5μg/ml抑酶肽，24μg/mlPefablocSC(BoehringerMannheim))中裂解，并在-20℃貯存。eNOS蛋白質的測定將96孔ELISA平板(Costar3590)每孔用100μl的于50mM碳酸鈉緩沖液pH9.5中的5μg/ml包被抗體(兔多克隆抗eNOS)包被，并在4℃保溫過夜。從用與匙孔嘁血藍蛋白偶聯(lián)的相應于人eNOS的第599-614位殘基的肽免疫的兔中收集多克隆抗體(Babco)，使用蛋白質G瓊脂糖凝膠(Amersham)純化。將平板用在PBS+0.01％Tween20中的200μl/孔的0.5％I-Block(Tropix)封閉，在4℃保溫過夜。然后將平板用每孔350μl的PBS+0.5ml/LTween20洗滌3次。將含有eNOS的HEK293細胞裂解物加入該平板中，用裂解緩沖液稀釋5或10倍至終體積為60μl/孔，在室溫保溫1.5-2小時。然后將平板用每孔350μl的PBS+0.5ml/LTween20洗滌3次。如下加入檢測抗體，該檢測抗體是如參考文獻2所述用銪標記的一種單克隆抗eNOS抗體(TransductionLabsN30020)于Wallac分析緩沖液(Wallac/PerkinElmer1244-111)中的125ng/ml銪標記的抗體，100μl/孔。將平板在室溫保溫1.5小時。然后將平板用每孔350μl的PBS+0.5ml/LTween20洗滌3次。加入Wallac增強溶液(Wallac/PerkinElmer1244-105)，100μl/孔。將平板用平板密封器覆蓋并在4℃貯存過夜，然后在混和10分鐘后，將該平板在Wallac1420VICTOR2多標記計數(shù)器(PerkinElmerLifeSciences)中讀數(shù)，在615nm監(jiān)測時間分辨熒光(AberleS.etal.，NitricOxide1，226(1997)；MeurerJetal.，MethodsinEnzymology359，433-444(2002)。結果表明eNOS多肽突變體刺激HEK293細胞中NO的產(chǎn)生，而且單突變體T495A和T495V及雙突變體T495A+S1177D和T495A+S1177D與野生型eNOS相比刺激增加水平的NO的產(chǎn)生(圖2)。實施例3在HAE細胞中eNOS多肽突變體的檢測及活性的測定在含有10％FBS的4ml的EGM生長培養(yǎng)基(Cambrex)中以350,000個人主動脈內(nèi)皮細胞(HAEC)/孔鋪板6孔平板中。將細胞在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)。第二天向每個孔中加入編碼野生型或突變的eNOS(Thr495Ala，Thr495Asp，Thr495Val或Ser1177Asp)的腺病毒(2×109個總病毒顆粒/孔，大約2×107個感染性顆粒/孔)。在與該病毒保溫4小時后，除去培養(yǎng)基并用補加了0.1％明膠和30μM墨蝶呤(Sigma)的2mlEBM生長培養(yǎng)基(Cambrex)置換。20小時后，使用化學發(fā)光方法測定由細胞產(chǎn)生的NO，之后將細胞裂解并使用ELISA分析裂解物的eNOS蛋白質含量。將NO產(chǎn)量根據(jù)eNOS蛋白質的量歸一化，以校正由于用攜帶不同eNOS突變體的不同腺病毒構建體的轉染效力中的不同所致表達水平中的變化。結果表明eNOS多肽突變體刺激HEK293細胞中NO的產(chǎn)生，單突變體T495A和T495D與野生型eNOS相比刺激升高水平的NO的產(chǎn)生(圖3)。這項研究的結果與實施例2所述結果不同，在此項研究中是用VEGF刺激細胞以刺激NO釋放，而在實施例2所述研究中使用鈣離子載體。另外，腺病毒感染與用質粒DNA轉染相比每個細胞產(chǎn)生更多的eNOS(及更多的NO)。因此，這項研究中eNOS的過表達可能有助于用eNOS多肽突變體所觀測到的NO活性水平。人主動脈內(nèi)皮細胞含有內(nèi)源的野生型eNOS，但從過表達的突變體eNOS中產(chǎn)生的NO的量是內(nèi)源eNOS產(chǎn)生的NO量的大約20倍。在實施例2和3所述的數(shù)據(jù)中，將NO產(chǎn)量根據(jù)eNOS的量歸一化，因此eNOS多肽突變體具有相同范圍內(nèi)的活性。很可能的是使用腺病毒載體和質粒載體，由不同的eNOS多肽突變體產(chǎn)生的NO的檢測水平之間的不同是由于細胞中其它限制因素所致，如輔助因子的有效性所致。因此，在HAEC中進一步測試eNOS多肽突變體可進一步闡明在不同類型的細胞中eNOS的表達和活性。實施例4用于確定不同eNOS同種型的小鼠骨骼肌裂解物的Westerm印跡eNOS的不同同種型可以使用Western印跡分析檢測，并通過本領域已知的標準方法分離。在這個實施例中，使用小鼠骨骼肌裂解物檢測不同的小鼠eNOS同種型。SDS-PAGE針對每個樣品，將30μl肌組織勻漿加入含有100mM二硫蘇糖醇的10μl4x樣品緩沖液(InvitrogenCat.No.NP0007)中。在100℃加熱7-8分鐘后將每個樣品加樣于10％Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝膠(BMAPAGErCat.No.59102)中。如果需要，加入含有重組人eNOS的1μl的HEK細胞裂解物(于40μl的1x樣品緩沖液中)作為陽性對照。將預染色的蛋白質標記(10μl的InvitrogenLC5725)也加樣于該凝膠的一條泳道中。將凝膠電泳在由Berlexmediaprepdepartment提供的1xLaemmli電泳緩沖液中，在130V(恒定電壓)電泳1.5小時。在硝化纖維素上印跡在20V(恒定電壓)電壓下使用Novex/Invitrogen裝置(將該裝置預先在轉移緩沖液中浸泡)，在2小時內(nèi)將蛋白質移至硝化纖維素上。(轉移緩沖液＝由Berlexmediaprep提供的100ml10x轉移緩沖液+200ml甲醇+700mlH2O)。在印跡后，將硝化纖維素在4℃，在20mlTBS+5％脫脂乳粉中貯存過夜。(TBS＝0.02MTris-HCl，0.12MNaCl，pH7.5)。使用抗體對蛋白質的檢測(所有步驟均在室溫進行)將印跡在第一抗體(于TBS+0.1％Tween20+5％脫脂乳粉中1∶2000稀釋的抗eNOS或抗bNOS小鼠單克隆抗體BD/TransductionLabs)中保溫1小時15分鐘。然后將印跡如下洗滌在TBS+0.1％Tween20中洗滌一次10分鐘及兩次5分鐘。然后將印跡在第二抗體(過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG，ChemiconIntl.AP308P或Roche1814168，于TBS+0.1％Tween20+5％脫脂乳粉中稀釋1∶3000)中保溫1小時。在如上述洗滌之后，加上額外在TBS(無Tween)中洗滌5分鐘后，將印跡在ECL試劑(AmershamPharmaciaRPN2106)中保溫1分鐘。然后將印跡用SaranWrap覆蓋并曝光于AmershamPharmaciaHyperfilmECL(RPN1674A)1-5分鐘，顯色膠片。序列表<110>舍林股份公司<120>用于基因治療的eNOS突變體<130>53035AWOM1<150>US60/403,638<151>2002-08-16<160>8<170>PatentInversion3.2<210>1<211>1203<212>PRT<213>Homosapiens<400>1MetGlyAsnLeuLysSerValAlaGlnGluProGlyProProCysGly151015LeuGlyLeuGlyLeuGlyLeuGlyLeuCysGlyLysGlnGlyProAla202530ThrProAlaProGluProSerArgAlaProAlaSerLeuLeuProPro354045AlaProGluHisSerProProSerSerProLeuThrGlnProProGlu505560GlyProLysPheProArgValLysAsnTrpGluValGlySerIleThr65707580TyrAspThrLeuSerAlaGlnAlaGlnGlnAspGlyProCysThrPro859095ArgArgCysLeuGlySerLeuValPheProArgLysLeuGlnGlyArg100105110ProSerProGlyProProAlaProGluGlnLeuLeuSerGlnAlaArg115120125AspPheIleAsnGlnTyrTyrSerSerIleLysArgSerGlySerGln130135140AlaHisGluGlnArgLeuGlnGluValGluAlaGluValAlaAlaThr145150155160GlyThrTyrGlnLeuArgGluSerGluLeuValPheGlyAlaLysGln165170175AlaTrpArgAsnAlaProArgCysValGlyArgIleGlnTrpGlyLys180185190LeuGlnValPheAspAlaArgAspCysArgSerAlaGlnGluMetPhe195200205ThrTyrIleCysAsnHisIleLysTyrAlaThrAsnArgGlyAsnLeu210215220ArgSerAlaIleThrValPheProGlnArgCysProGlyArgGlyAsp225230235240PheArgIleTrpAsnSerGlnLeuValArgTyrAlaGlyTyrArgGln245250255GlnAspGlySerValArgGlyAspProAlaAsnValGluIleThrGlu260265270LeuCysIleGlnHisGlyTrpThrProGlyAsnGlyArgPheAspVal275280285LeuProLeuLeuLeuGlnAlaProAspGluProProGluLeuPheLeu290295300LeuProProGluLeuValLeuGluValProLeuGluHisProThrLeu305310315320GluTrpPheAlaAlaLeuGlyLeuArgTrpTyrAlaLeuProAlaVal325330335SerAsnMetLeuLeuGluIleGlyGlyLeuGluPheProAlaAlaPro340345350PheSerGlyTrpTyrMetSerThrGluIleGlyThrArgAsnLeuCys355360365AspProHisArgTyrAsnIleLeuGluAspValAlaValCysMetAsp370375380LeuAspThrArgThrThrSerSerLeuTrpLysAspLysAlaAlaVal385390395400GluIleAsnValAlaValLeuHisSerTyrGlnLeuAlaLysValThr405410415IleValAspHisHisAlaAlaThrAlaSerPheMetLysHisLeuGlu420425430AsnGluGlnLysAlaArgGlyGlyCysProAlaAspTrpAlaTrpIle435440445ValProProIleSerGlySerLeuThrProValPheHisGlnGluMet450455460ValAsnTyrPheLeuSerProAlaPheArgTyrGlnProAspProTrp465470475480LysGlySerAlaAlaLysGlyThrGlyIleThrArgLysLysThrPhe485490495LysGluValAlaAsnAlaValLysIleSerAlaSerLeuMetGlyThr500505510ValMetAlaLysArgValLysAlaThrIleLeuTyrGlySerGluThr515520525GlyArgAlaGlnSerTyrAlaGlnGlnLeuGlyArgLeuPheArgLys530535540AlaPheAspProArgValLeuCysMetAspGluTyrAspValValSer545550555560LeuGluHisGluThrLeuValLeuValValThrSerThrPheGlyAsn565570575GlyAspProProGluAsnGlyGluSerPheAlaAlaAlaLeuMetGlu580585590MetSerGlyProTyrAsnSerSerProArgProGluGlnHisLysSer595600605TyrLysIleArgPheAsnSerIleSerCysSerAspProLeuValSer610615620SerTrpArgArgLysArgLysGluSerSerAsnThrAspSerAlaGly625630635640AlaLeuGlyThrLeuArgPheCysValPheGlyLeuGlySerArgAla645650655TyrProHisPheCysAlaPheAlaArgAlaValAspThrArgLeuGlu660665670GluLeuGlyGlyGluArgLeuLeuGlnLeuGlyGlnGlyAspGluLeu675680685CysGlyGlnGluGluAlaPheArgGlyTrpAlaGlnAlaAlaPheGln690695700AlaAlaCysGluThrPheCysValGlyGluAspAlaLysAlaAlaAla705710715720ArgAspIlePheSerProLysArgSerTrpLysArgGlnArgTyrArg725730735LeuSerAlaGlnAlaGluGlyLeuGlnLeuLeuProGlyLeuIleHis740745750ValHisArgArgLysMetPheGlnAlaThrIleArgSerValGluAsn755760765LeuGlnSerSerLysSerThrArgAlaThrIleLeuValArgLeuAsp770775780ThrGlyGlyGlnGluGlyLeuGlnTyrGlnProGlyAspHisIleGly785790795800ValCysProProAsnArgProGlyLeuValGluAlaLeuLeuSerArg805810815ValGluAspProProAlaProThrGluProValAlaValGluGlnLeu820825830GluLysGlySerProGlyGlyProProProGlyTrpValArgAspPro835840845ArgLeuProProCysThrLeuArgGlnAlaLeuThrPhePheLeuAsp850855860IleThrSerProProSerProGlnLeuLeuArgLeuLeuSerThrLeu865870875880AlaGluGluProArgGluGlnGlnGluLeuGluAlaLeuSerGlnAsp885890895ProArgArgTyrGluGluTrpLysTrpPheArgCysProThrLeuLeu900905910GluValLeuGluGlnPheProSerValAlaLeuProAlaProLeuLeu915920925LeuThrGlnLeuProLeuLeuGlnProArgTyrTyrSerValSerSer930935940AlaProSerThrHisProGlyGluIleHisLeuThrValAlaValLeu945950955960AlaTyrArgThrGlnAspGlyLeuGlyProLeuHisTyrGlyValCys965970975SerThrTrpLeuSerGlnLeuLysProGlyAspProValProCysPhe980985990IleArgGlyAlaProSerPheArgLeuProProAspProSerLeuPro99510001005CysIleLeuValGlyProGlyThrGlyIleAlaProPheArgGly101010151020PheTrpGlnGluArgLeuHisAspIleGluSerLysGlyLeuGln102510301035ProThrProMetThrLeuValPheGlyCysArgCysSerGlnLeu104010451050AspHisLeuTyrArgAspGluValGlnAsnAlaGlnGlnArgGly105510601065ValPheGlyArgValLeuThrAlaPheSerArgGluProAspAsn107010751080ProLysThrTyrValGlnAspIleLeuArgThrGluLeuAlaAla108510901095GluValHisArgValLeuCysLeuGluArgGlyHisMetPheVal110011051110CysGlyAspValThrMetAlaThrAsnValLeuGlnThrValGln111511201125ArgIleLeuAlaThrGluGlyAspMetGluLeuAspGluAlaGly113011351140AspValIleGlyValLeuArgAspGlnGlnArgTyrHisGluAsp114511501155IlePheGlyLeuThrLeuArgThrGlnGluValThrSerArgIle116011651170ArgThrGlnSerPheSerLeuGlnGluArgGlnLeuArgGlyAla117511801185ValProTrpAlaPheAspProProGlySerAspThrAsnSerPro119011951200<210>2<211>37<212>PRT<213>Homosapiens<400>2AlaAlaLysGlyThrGlyIleThrArgLysLysThrPheLysGluVal151015AlaAsnAlaValLysIleSerAlaSerLeuMetGlyThrValMetAla202530LysArgValLysAla35<210>3<211>37<212>PRT<213>Bostaurus<400>3AlaThrLysGlyAlaGlyIleThrArgLysLysThrPheLysGluVal151015AlaAsnAlaValLysIleSerAlaSerLeuMetGlyThrLeuMetAla202530LysArgValLysAla35<210>4<211>38<212>PRT<213>Homosapiens<400>4GlyThrAsnGlyThrProThrLysArgArgAlaIleGlyPheLysLys151015LeuAlaGluAlaValLysPheSerAlaLysLeuMetGlyGlnAlaMet202530AlaLysArgValLysAla35<210>5<211>38<212>PRT<213>Rattusrattus<400>5GlyThrAsnGlyThrProThrLysArgArgAlaIleGlyPheLysLys151015LeuAlaGluAlaValLysPheSerAlaLysLeuMetGlyGlnAlaMet202530AlaLysArgValLysAla35<210>6<211>37<212>PRT<213>Rattusrattus<400>6AspGluLysLeuArgProArgArgArgGluIleArgPheThrValLeu151015ValLysAlaValPhePheAlaSerValLeuMetArgLysValMetAla202530SerArgValArgAla35<210>7<211>37<212>PRT<213>Musmusculus<400>7AsnGluLysLeuArgProArgArgArgGluIleArgPheArgValLeu151015ValLysValValPhePheAlaSerMetLeuMetArgLysValMetAla202530SerArgValArgAla35<210>8<211>37<212>PRT<213>Homosapiens<400>8AspGluLysArgArgProLysArgArgGluIleProLeuLysValLeu151015ValLysAlaValLeuPheAlaCysMetLeuMetArgLysThrMetAla202530SerArgValArgVal3權利要求1.一種分離的eNOS多肽突變體，其在相應于哺乳動物eNOS的一個功能域的氨基酸序列中有一或多個突變，其中至少一個所述突變i)在相應于鈣調蛋白結合結構域中的一個在哺乳動物細胞中是磷酸化的氨基酸殘基的位置發(fā)生；及ii)不是一個被取代為Ala或Asp的氨基酸取代，其中所述eNOS多肽突變體有一個突變且所述一個突變是在所述位置。2.權利要求1的eNOS多肽突變體，其中所述氨基酸殘基是人eNOS的第495位氨基酸殘基。3.權利要求2的eNOS多肽突變體，其中所述人eNOS的氨基酸序列是SEQIDNO1。4.權利要求3的eNOS多肽突變體，其中在相應于第495位氨基酸殘基位置的所述突變是一個氨基酸被取代為Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Met、Ser、Cys、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg或His。5.權利要求4的eNOS多肽突變體，其中在相應于第495位氨基酸殘基的位置的所述突變是一個氨基酸被取代為Val、Leu或Ile。6.權利要求5的eNOS多肽突變體，其中在相應于第495位氨基酸殘基的位置的所述突變是一個氨基酸被取代為Val。7.權利要求3的eNOS多肽突變體，其中所述多肽突變體在除了所述鈣調蛋白結合結構域之外的一或多個功能域中還進一步包含至少一個突變。8.權利要求7的eNOS多肽突變體，其中在相應于第495位氨基酸殘基的位置的所述突變是一個氨基酸被取代為Ala、Val、Leu或Ile。9.權利要求8的eNOS多肽突變體，其中在相應于第495位氨基酸殘基的位置的所述突變是一個氨基酸被取代為Ala或Val。10.權利要求9的eNOS多肽突變體，其中在相應于第495位氨基酸殘基的位置的所述突變是一個氨基酸被取代為Val。11.權利要求8的eNOS多肽突變體，其中所述多肽突變體在相應于所述人eNOS的豆蔻?；稽c的氨基酸序列中進一步包含至少一個突變。12.權利要求11的eNOS多肽突變體，其中所述多肽突變體在相應于所述人eNOS的第2位氨基酸殘基的位置包含一個突變。13.權利要求12的eNOS多肽突變體，其中在相應于第2位氨基酸殘基的位置的所述突變是一個氨基酸被取代為Ala。14.權利要求8的eNOS多肽突變體，其中所述多肽突變體在相應于所述人eNOS的還原酶位點的氨基酸序列中進一步包含至少一個突變。15.權利要求14的eNOS多肽突變體，其中所述多肽突變體在相應于所述人eNOS的第1177位氨基酸殘基的位置包含一個突變。16.權利要求15的eNOS多肽突變體，其中在相應于所述人eNOS的第1177位氨基酸殘基的位置的所述突變是一個氨基酸被取代為Asp。17.權利要求16的eNOS多肽突變體，其中所述多肽突變體進一步在相應于所述人eNOS的第2位氨基酸殘基的位置包含一個突變，所述突變是一個氨基酸被取代為Ala。18.權利要求1的eNOS多肽突變體，其中所述多肽突變體的磷酸化與一參考eNOS多肽相比增加或降低。19.權利要求1的eNOS多肽突變體，其中所述多肽與參考eNOS多肽相比對鈣調蛋白的結合親和性提高。20.權利要求1的eNOS多肽突變體，其中所述多肽與參考eNOS多肽相比在Ca++-鈣調蛋白介導的刺激中對Ca++依賴性降低。21.權利要求1的eNOS多肽突變體，其中所述多肽突變體與參考eNOS多肽相比eNOS活性增加。22.權利要求21的eNOS多肽突變體，其中所述活性是NO的產(chǎn)生。23.權利要求21的eNOS多肽突變體，其中所述活性是還原酶活性。24.權利要求18、19、20、21、22或23的eNOS多肽突變體，其中所述參考多肽的氨基酸序列是人eNOS的氨基酸序列或衍生自人eNOS的氨基酸序列。25.權利要求24的eNOS多肽突變體，其中所述參考多肽的氨基酸序列是SEQIDNO1或衍生自SEQIDNO1。26.一種分離的eNOS多肽突變體，其中所述多肽突變體的氨基酸序列與權利要求1的eNOS多肽突變體的氨基酸序列基本同源。27.一種分離的eNOS多肽突變體，其中所述多肽突變體的氨基酸序列與權利要求26的所述多肽突變體的氨基酸序列有95-99％序列相同性。29.一種編碼權利要求1的多肽突變體的分離的多核苷酸。30.一種重組載體，其包含可操縱地與至少一個調節(jié)序列連接的權利要求29的多核苷酸。31.一種包含權利要求1的多肽突變體的藥物組合物。32.一種包含權利要求29的多核苷酸的藥物組合物。33.權利要求1的多肽突變體的一種結合配偶體。34.權利要求33的結合配偶體，其中所述結合配偶體是一種多肽。35.權利要求34的結合配偶體，其中所述結合配偶體是一種抗體或抗原特異性抗體片段。36.一種調節(jié)細胞中eNOS活性的方法，所述方法包括給予所述細胞權利要求1的多肽突變體。37.一種調節(jié)細胞中eNOS活性的方法，所述方法包括給予所述細胞權利要求29的多核苷酸，由此所述多肽突變體在所述細胞中表達。38.一種診斷與異常eNOS活性相關的病癥的方法，所述方法包括i)將患者的細胞與權利要求29的所述多核苷酸接觸；及ii)檢測作為所述病癥指示的eNOS活性水平。39.一種預防或治療與異常eNOS活性相關的病癥的方法，所述方法包括給予需要治療的患者有效量的權利要求1的所述多肽突變體。40.一種預防或治療與異常eNOS活性相關的病癥的方法，所述方法包括給予需要治療的患者有效量的編碼權利要求1的所述多肽突變體的多核苷酸，由此所述多肽突變體在所述患者中表達。41.權利要求39的方法，其中所述方法進一步包括在所述給予患者所述多肽突變體之前、期間或之后，進一步給予一或多種血管生成因子。42.權利要求40的方法，其中所述方法進一步包括在所述給予患者所述多核苷酸之前、期間或之后，進一步給予一或多種血管生成因子。全文摘要本發(fā)明提供了用于基因治療的內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)多肽突變體，及編碼這種多肽突變體的多核苷酸。特別地，本發(fā)明提供了這樣的eNOS多肽，其在相應于哺乳動物eNOS的一個功能域的一個氨基酸序列中有一或多個突變。更特別地，本發(fā)明提供了這樣的eNOS多肽，其在鈣調蛋白結合位點中的一個在哺乳動物細胞中是磷酸化的氨基酸殘基的位置有至少一個突變，其中在所述磷酸化位點有一個單突變的eNOS多肽突變體中所述突變不是一個氨基酸被取代為Ala或Asp；本發(fā)明還提供了編碼這種多肽突變體的多核苷酸。本發(fā)明還提供了使用這種eNOS多肽突變體和多核苷酸的預防、診斷和治療方法。文檔編號A61K38/00GK1691958SQ03819455公開日2005年11月2日申請日期2003年8月15日優(yōu)先權日2002年8月16日發(fā)明者埃里克·布拉斯科,卡塔林·考澤,約翰·帕金森申請人:舍林股份公司