專利名稱：治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)生物體內(nèi)與胰島素有關(guān)的疾病例如糖尿病、肥胖癥等的治療或預(yù)防有效的藥物、食品、飲料或飼料。
背景技術(shù)：
胰島素是哺乳動(dòng)物正常的碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪代謝所必需的激素。I型糖尿病患者由于不能足夠產(chǎn)生支持生命的激素——胰島素，為了生存，需要由外部給予胰島素。II型糖尿病患者因胰島素產(chǎn)生量不足、胰島素抗性等原因而導(dǎo)致血糖量異常，為了將該血糖量控制到適當(dāng)?shù)牧浚枰o予胰島素、給予胰島素分泌促進(jìn)藥物。但是，II型糖尿病患者中，對(duì)于因高胰島素血癥或胰島素受體異常、胰島素受體的下游信號(hào)異常等而引起的胰島素抗性為主要病因的糖尿病患者來(lái)說(shuō)，即使給予胰島素或胰島素分泌促進(jìn)藥物，也未必見(jiàn)療效。
近年來(lái)，為了解決胰島素的副作用和上述問(wèn)題，進(jìn)行了與胰島素具有同樣生理機(jī)能的物質(zhì)(以下也可稱為類胰島素物質(zhì))的開(kāi)發(fā)，證實(shí)了合成的苯醌衍生物是類胰島素物質(zhì)(例如參照國(guó)際公開(kāi)第99/51225號(hào)公開(kāi)小冊(cè)子)、來(lái)自紫根的紫草素是類胰島素物質(zhì)(例如參照Kamei R.等七人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，2002年，Vol.292，642-651頁(yè))。這些類胰島素物質(zhì)顯示與胰島素同樣的生理活性，不僅對(duì)I型糖尿病患者，對(duì)II型糖尿病患者、進(jìn)一步對(duì)以胰島素抗性為主要病因的II型糖尿病患者，有望改善其癥狀。
八丈芹(アシタバ)是傘形科的大型多年生草本植物，已知具有各種促進(jìn)健康的效果。例如已知八丈芹所具有的生理活性有預(yù)防高血壓的效果、抗菌作用、抗腫瘤作用、抑制胃酸分泌作用、抗癌效果、增強(qiáng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子生成的效果、增強(qiáng)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子生成的作用(例如參照國(guó)際公開(kāi)第01/76614號(hào)公開(kāi)小冊(cè)子)，但是，對(duì)于抗糖尿病作用和抗肥胖作用等的類胰島素作用則至今不為人所知。
芹菜(セロリ)是屬于傘型科、已知具有各種生理作用的植物。芹菜的生理作用已知有抗凝血作用、抑癌作用等。但是對(duì)于抗糖尿病作用和抗肥胖作用等的類胰島素作用則至今不為人所知。
歐芹是屬于傘型科、已知具有各種生理作用的植物。歐芹的生理作用已知有改善貧血、預(yù)防食物中毒作用、止血作用、消除疲勞、發(fā)汗、利尿、保溫效果等。但是對(duì)于抗糖尿病作用和抗肥胖作用等類胰島素作用則至今不為人所知。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于開(kāi)發(fā)來(lái)自天然物、可安全簡(jiǎn)便地?cái)z取、適合作為食品材料、藥物原料、來(lái)自具有類胰島素作用的植物的處理物，并提供使用該處理物的藥物、食品、飲料或飼料。
以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行概述。本發(fā)明的第一發(fā)明涉及與胰島素水平或胰島素應(yīng)答異常有關(guān)的疾病的治療藥物或預(yù)防藥物，其特征在于含有來(lái)自傘形科植物的處理物作為有效成分。
本發(fā)明的第二發(fā)明涉及類胰島素作用劑，其特征在于含有來(lái)自傘形科植物的處理物作為有效成分。
本發(fā)明的第三發(fā)明涉及與胰島素水平或胰島素應(yīng)答異常有關(guān)的疾病的治療用或預(yù)防用的食品、飲料或飼料，其特征在于含有來(lái)自傘形科植物的處理物作為有效成分。
本發(fā)明的第四發(fā)明涉及細(xì)胞攝取葡萄糖的促進(jìn)劑，其特征在于含有來(lái)自傘形科植物的處理物作為有效成分。
本發(fā)明的第五發(fā)明涉及向脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑，其特征在于含有來(lái)自傘形科植物的處理物作為有效成分。
本發(fā)明的第一至五發(fā)明中，傘形科植物例如有八丈芹、芹菜或歐芹。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是表示由八丈芹根提取組分分化誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞中甘油三酯生物合成量的圖。
圖2是表示由八丈芹根提取組分分級(jí)的級(jí)分3、4分化誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞中甘油三酯生物合成量的圖。
圖3是表示八丈芹根提取組分促進(jìn)葡萄糖攝入的作用的圖。
圖4是表示由八丈芹葉提取組分分化誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞中甘油三酯生物合成量的圖。
圖5是表示由芹菜葉提取組分分化誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞中甘油三酯生物合成量的圖。
圖6是表示芹菜葉提取組分促進(jìn)葡萄糖攝入的作用的圖。
圖7是表示由歐芹提取組分分化誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞中甘油三酯生物合成量的圖。
圖8是表示歐芹提取組分促進(jìn)葡萄糖攝入的作用的圖。
圖9是表示由八丈芹根提取組分分化誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞中甘油三酯生物合成量的圖。
圖10是表示八丈芹根提取組分促進(jìn)葡萄糖攝入作用的圖。
圖11是表示八丈芹葉提取組分促進(jìn)葡萄糖攝入作用的圖。
圖12是表示八丈芹根提取物分級(jí)級(jí)分促進(jìn)葡萄糖攝入作用的圖。
圖13是表示松胞菌素B抑制八丈芹根乙醇提取組分促葡萄糖攝入的作用的圖。
圖14是表示八丈芹根乙醇提取組分和胰島素促進(jìn)葡萄糖攝入作用的協(xié)同效果的圖。
圖15是表示在由八丈芹根乙醇提取組分分化誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞中，通過(guò)胰島素的刺激來(lái)促進(jìn)葡萄糖攝入的作用的圖。
圖16是表示由八丈芹莖葉提取組分分化誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞中甘油三酯生物合成量的圖。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明中，傘形科植物是屬于被子植物類傘形科的植物，例如有八丈芹、水芹、鴨兒芹、獨(dú)活、胡蘿卜、芹菜、歐芹等。本發(fā)明中，可特別優(yōu)選使用八丈芹、芹菜、歐芹。本發(fā)明中，可以將它們單獨(dú)或?qū)煞N或以上混合使用。本發(fā)明中使用的傘形科植物并沒(méi)有特別限定，可以使用果實(shí)、種子、種皮、花、葉、莖、根、根莖和/或?qū)⒄曛参镏苯邮褂谩?br> 本發(fā)明中，作為有效成分使用的來(lái)自傘形科植物的處理物只要是具有類胰島素作用即可，并沒(méi)有特別限定，例如有提取物、粉碎物、榨汁液、破碎物、化學(xué)處理物、酶處理物，特別優(yōu)選提取物、粉碎物和榨汁液。只要是可作為本發(fā)明的有效成分使用即可，并沒(méi)有特別限定。各處理物可以單獨(dú)或?qū)煞N或以上混合使用。
本發(fā)明中，類胰島素作用是指顯示與胰島素同等的生理活性，對(duì)此并沒(méi)有特別限定，例如有促進(jìn)細(xì)胞攝入糖、氨基酸，合成糖原、蛋白質(zhì)和抑制其分解等的代謝調(diào)節(jié)作用。作為本發(fā)明的有效成分，只要至少顯示分化誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞作用或促進(jìn)細(xì)胞攝入葡萄糖的作用即可。所述類胰島素作用的有無(wú)，可按照后述實(shí)施例3或5的方法簡(jiǎn)便地測(cè)定。
本發(fā)明中，提取物是指用提取溶劑經(jīng)過(guò)提取操作工序而得到的物質(zhì)。提取可以按照公知的提取方法如下進(jìn)行。例如將原料粉碎或切細(xì)，然后用溶劑分批式或連續(xù)式進(jìn)行提取。對(duì)于獲得提取物的提取溶劑并沒(méi)有特別限定，可以是水，氯仿、乙醇、甲醇、異丙醇等醇類，丙酮、甲基乙基酮等酮類，乙酸甲酯、乙酸乙酯等親水性或親油性的溶劑，可以根據(jù)要求單獨(dú)或作為適當(dāng)?shù)幕旌弦菏褂?。提取溶劑的量可以適當(dāng)確定，通常相對(duì)于原料(固形分)，按照重量?jī)?yōu)選使用0.1-100倍量的提取溶劑。提取溫度也可以根據(jù)目的適當(dāng)確定，水提取的情況下，通常優(yōu)選4-130℃，更優(yōu)選25-100℃。另外，溶劑中含有乙醇時(shí)，優(yōu)選4-60℃范圍。提取時(shí)間也可以考慮提取效率來(lái)確定。通常優(yōu)選適當(dāng)選取原料、提取溶劑、設(shè)定提取溫度，使提取時(shí)間為數(shù)秒-數(shù)日，更優(yōu)選5分鐘-24小時(shí)的范圍。提取操作例如可以邊攪拌邊進(jìn)行，或靜置進(jìn)行，還可以根據(jù)需要重復(fù)多次進(jìn)行。通過(guò)上述操作，可得到來(lái)自傘形科植物的提取物(以下也可以稱為本發(fā)明的提取物)。根據(jù)需要，可對(duì)提取物進(jìn)行過(guò)濾、離心、濃縮、超濾、分子篩等處理，制備目標(biāo)類胰島素物質(zhì)的濃縮的提取物。提取物、濃縮提取物的類胰島素作用可按照后述實(shí)施例3或5的方法簡(jiǎn)便地測(cè)定。另外，按照公知的方法，將傘形科植物制成茶葉狀，用該物質(zhì)制備提取物(例如八丈芹茶)，如果該提取物也具有類胰島素作用，則也可作為本發(fā)明的提取物使用。另外含有兩種或以上這些提取物并使用。本發(fā)明中，可以含有兩種或以上由不同的方法得到的提取物并使用。
本發(fā)明中，用公知的方法分級(jí)來(lái)自傘形科植物的提取物而得到的組分、或通過(guò)多次重復(fù)分級(jí)操作而得到的級(jí)分也包括在本發(fā)明的提取物中。上述分級(jí)方法有提取、分級(jí)沉淀、柱層析、薄層色譜等。以類胰島素作用為指標(biāo)，通過(guò)對(duì)所得組分進(jìn)一步純化，可以分離出類胰島素物質(zhì)。
除來(lái)自傘形科植物的提取物之外的來(lái)自傘形科植物的處理物的制備方法例如有將植物干燥、粉碎，可得到粉末狀的來(lái)自傘形科植物的粉碎物。優(yōu)選通過(guò)冷凍干燥進(jìn)行干燥。另外也可以通過(guò)冷凍粉碎獲得粉碎物。
來(lái)自傘形科植物的榨汁液的制備方法只要是公知的植物榨汁方法即可，并沒(méi)有特別限定，例如可以使用螺旋式、齒輪式、轉(zhuǎn)刀式等壓榨機(jī)或果汁機(jī)來(lái)榨汁。作為前處理，可以切細(xì)或破碎，用上述果汁機(jī)用布等壓榨，獲得榨汁液。
破碎物是指將傘形科植物破碎的物質(zhì)，通常比粉碎物的組織片要大，例如可使用破碎機(jī)來(lái)制備?；瘜W(xué)處理物并沒(méi)有特別限定，例如指將傘形科植物進(jìn)行酸處理、堿處理、氧化處理、還原處理等而得到的物質(zhì)，例如可將傘形科植物浸泡于含有鹽酸、硫酸、硝酸、檸檬酸、乙酸等無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸，或者氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨等無(wú)機(jī)堿或有機(jī)堿的水溶液中來(lái)制備?；瘜W(xué)處理物包括來(lái)自經(jīng)過(guò)了上述化學(xué)處理的植物體的全部物質(zhì)。酶處理物是指例如經(jīng)果膠醇、纖維素酶、木聚糖酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、葡糖苷酶等處理的酶處理物，微生物處理的酶促反應(yīng)產(chǎn)物(例如發(fā)酵產(chǎn)物)，例如可通過(guò)使上述酶在適當(dāng)?shù)木彌_液中與傘形科植物作用來(lái)制備。酶處理物包括來(lái)自經(jīng)上述酶處理的植物體的全部物質(zhì)。并且，作為來(lái)自傘形科植物的處理物，還包括將傘形科植物的莖切斷，由其斷面得到的汁液。
本發(fā)明中，對(duì)于來(lái)自傘形科植物的處理物的形狀，只要具有類胰島素作用即可，并沒(méi)有特別限定，可以是粉末狀、固態(tài)狀、液狀的任意形狀。另外也可以將該物質(zhì)用公知的方法制粒，以得到的粒狀固態(tài)物質(zhì)作為本發(fā)明的來(lái)自傘形科植物的處理物使用。制粒方法并沒(méi)有特別限定，例如有轉(zhuǎn)動(dòng)制粒、攪拌制粒、流化床制粒、氣流制粒、擠壓制粒、壓制制粒、碎解制粒、噴射制粒或噴霧制粒等。將粉末狀的該來(lái)自傘形科植物的處理物溶解于液體例如水、醇等，制成液狀，這也可作為本發(fā)明的來(lái)自傘形科植物的處理物使用。
本發(fā)明中，例如可以將有效成分本身作為本說(shuō)明書中的與胰島素水平或胰島素應(yīng)答異常有關(guān)的疾病的治療用或預(yù)防用的食品、飲料或飼料等使用。使用有效成分本身的方式例如可將上述提取物或粉碎物等制成片劑的形式。片劑的制造可以按照公知的壓片方法進(jìn)行。
本發(fā)明中還提供高濃度或高純度含有來(lái)自傘形科植物的處理物的食品、飲料或飼料，這是指與以往的食品、飲料或飼料相比，本發(fā)明的食品、飲料或飼料中高濃度和/或高純度含有類胰島素物質(zhì)。如下所述，所述食品、飲料或飼料通過(guò)在以往的食品等中含有本發(fā)明的有效成分來(lái)制造。
本發(fā)明中，將來(lái)自傘形科植物的處理物稱為本發(fā)明的有效成分，也可以將含有本發(fā)明的有效成分的、與胰島素水平或胰島素應(yīng)答異常有關(guān)的疾病的治療藥物或預(yù)防藥物稱為本發(fā)明的治療藥物或預(yù)防藥物。
如后面所述，本發(fā)明的有效成分中未見(jiàn)毒性。另外也不用擔(dān)心產(chǎn)生副作用。因此，可安全且恰當(dāng)?shù)剡M(jìn)行疾病的治療或預(yù)防。因此含有該有效成分構(gòu)成的本發(fā)明的治療藥物、預(yù)防藥物、食品、飲料或飼料對(duì)于與胰島素水平或胰島素應(yīng)答異常有關(guān)的疾病的治療或預(yù)防有效。
本發(fā)明中，與胰島素水平或胰島素應(yīng)答異常有關(guān)的疾病是具有選自血液中胰島素水平變化、胰島素或胰島素受體的活性水平變化、胰島素受體的下游信號(hào)異常、以及它們的組合的因素為特征的疾病，例如有糖尿病、肥胖癥、動(dòng)脈硬化、可卡因戒斷癥狀、充血性心力衰竭、心血管痙攣、腦血管痙攣、嗜鉻細(xì)胞瘤、神經(jīng)節(jié)成神經(jīng)細(xì)胞瘤、慢性進(jìn)行性舞蹈病、高脂血癥、高胰島素血癥。糖尿病有I型糖尿病、II型糖尿病任意形式。II型糖尿病也包括即使給予胰島素或促胰島素分泌藥物也不見(jiàn)治療效果的以胰島素抗性為主要病因的疾病。
已知胰島素促進(jìn)誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，還已知成熟的脂肪細(xì)胞會(huì)攝入葡萄糖，在細(xì)胞內(nèi)蓄積甘油三酯(Rubin C.S.等、J.Biol.Chem.，Vol.253，No.20，7570-7578頁(yè)(1978年))。即，利用該方法，給予受試物質(zhì)以取代胰島素，通過(guò)測(cè)定向脂肪細(xì)胞的分化、細(xì)胞中甘油三酯的生物合成量，可以測(cè)定受試物質(zhì)的類胰島素作用.
已知胰島素具有促進(jìn)葡萄糖攝入的作用，已知在成熟的脂肪細(xì)胞中，通過(guò)胰島素的作用，會(huì)促進(jìn)葡萄糖向細(xì)胞內(nèi)的攝入(Rubin C.S.等、J.Biol.Chem.，Vol.253，No.20，7579-7583頁(yè)(1978年))。即，利用該方法，給予受試物質(zhì)以取代胰島素，通過(guò)測(cè)定成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的攝入量，可以測(cè)定受試物質(zhì)的類胰島素作用。
本發(fā)明的治療藥物或預(yù)防藥物例如有將本發(fā)明的上述有效成分與公知的藥用載體組合制成的制劑。
本發(fā)明的治療藥物或預(yù)防藥物的制造通常通過(guò)將上述有效成分與藥學(xué)上可接受的液狀或固體狀載體混合而進(jìn)行，可以根據(jù)需要加入溶劑、分散劑、乳化劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、賦型劑、粘合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑等，制成片劑、顆粒劑、散劑、粉末劑、膠囊劑等固體制劑，通常的溶液劑、混懸劑、乳劑等液體制劑。另外也可以制成在使用前添加適當(dāng)?shù)妮d體而形成液狀的干燥品、以及其他的外用制劑。
藥用載體可根據(jù)治療藥物或預(yù)防藥物的給藥形式和劑型選擇。制成含有固體組合物的口服制劑時(shí)，可以制成片劑、丸劑、膠囊劑、散劑、細(xì)粒劑、顆粒劑等，例如可利用淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無(wú)機(jī)鹽等。另外，制備口服制劑時(shí)，還可以混合粘合劑、崩解劑、表面活性劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、矯味劑、著色劑、芳香料等。例如制成片劑或丸劑時(shí)，可以根據(jù)需要用蔗糖、明膠、羥丙基纖維素等糖衣或者胃溶性或腸溶性物質(zhì)的薄膜包衣。制成含有液體組合物的口服制劑時(shí)，可以制成藥理學(xué)上可接受的乳劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑等，例如可以利用精制水、乙醇等作為載體。另外還可以根據(jù)需要添加潤(rùn)濕劑、助懸劑等的助劑、甜味劑、香味劑、防腐劑等。
另一方面，制成非口服制劑時(shí)，可以按照常規(guī)方法，將本發(fā)明的上述有效成分溶解或懸浮于作為稀釋劑的注射用蒸餾水、生理鹽水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等中，根據(jù)需要，通過(guò)加入殺菌劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、止痛劑等來(lái)制備。另外，也可以制備固體組合物，在使用前溶解于無(wú)菌水或無(wú)菌注射用溶劑中使用。
外用制劑包括經(jīng)皮給藥或經(jīng)粘膜(口腔、鼻腔)給藥用的固體、半固體狀或液狀制劑。也包括栓劑等。例如可制成乳劑、洗劑等的乳劑，外用酊劑、經(jīng)粘膜給藥的溶液劑等液體狀制劑，油性軟膏、親水性軟膏等軟膏劑，膜劑、經(jīng)皮貼片、糊劑等經(jīng)皮給藥或粘膜給藥用的貼劑等。
以上各種制劑可分別利用公知的藥用載體等，按照常規(guī)方法適當(dāng)?shù)刂苽洹Ｋ鲋苿┲械挠行С煞值暮恳紤]到給藥形式、給藥方法等，優(yōu)選只要是在后述的給藥量范圍內(nèi)可給予該有效成分的量，則并沒(méi)有特別限定。
本發(fā)明的治療藥物或預(yù)防藥物按照與制劑形式相適應(yīng)的適當(dāng)?shù)慕o藥途徑給藥。給藥方法并沒(méi)有特別限定，可以內(nèi)服、外用和注射。注射劑例如可以靜脈、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)等給藥；作為外用劑，例如栓劑，則可通過(guò)與栓劑相適應(yīng)的給藥方法給藥。
本發(fā)明的治療藥物或預(yù)防藥物的給藥量根據(jù)該制劑形式、給藥方法、使用目的和該治療藥物或預(yù)防藥物的給藥對(duì)象患者的年齡、體重、癥狀而適當(dāng)設(shè)定，并不是一成不變的。通常按照制劑中含有的上述有效成分計(jì)算給藥量，優(yōu)選人(例如成人)每天為0.1μg-1g/kg。當(dāng)然給藥量根據(jù)各種條件而變化，因此，有比上述給藥量少即足夠的情形，也有需要超出上述范圍的情形?？梢栽谛枰慕o藥量范圍內(nèi)，一天內(nèi)單次給藥，或分多次給藥。另外，本發(fā)明的治療藥物或預(yù)防藥物除了直接口服給藥之外，還可以添加到任意的飲料食品中進(jìn)行日常攝取。如實(shí)施例20所記載，本發(fā)明的有效成分和與本發(fā)明的有效成分具有同等作用的物質(zhì)例如胰島素聯(lián)合使用，有望得到它們的協(xié)同效果。
本發(fā)明還可提供含有上述有效成分的類胰島素作用劑。該類胰島素作用劑可以是上述有效成分本身，也可以是含有上述有效成分的組合物。該類胰島素作用劑例如可以將上述有效成分與可與該有效成分相同用途使用的其它成分(例如胰島素等)等混合，按照上述治療藥物或預(yù)防藥物的制備方法制成通常使用的藥劑的形式。該類胰島素作用劑中上述有效成分的含量要考慮該類胰島素作用劑的給予方法、使用目的等，只要是可得到表達(dá)本發(fā)明所需效果的量即可，并沒(méi)有特別限定。有效成分的含量例如是0.01-100重量％。該類胰島素作用劑的用量只要是可得到表達(dá)本發(fā)明所需的效果的量即可，并沒(méi)有特別限定。給予生物體使用時(shí)，特別優(yōu)選以可在上述治療藥物或預(yù)防藥物中的有效成分給藥量的范圍內(nèi)給予有效成分的量使用。類胰島素作用劑對(duì)于與胰島素水平或胰島素應(yīng)答異常有關(guān)的疾病有效。另外該類胰島素作用劑可用于制造這些疾病的治療或預(yù)防用食品、飲料或飼料。這些食品、飲料或飼料可以按照上述與胰島素水平或胰島素應(yīng)答異常有關(guān)的疾病的治療用或預(yù)防用的食品、飲料或飼料的標(biāo)準(zhǔn)使用。該類胰島素作用劑還對(duì)于與胰島素水平或胰島素應(yīng)答異常有關(guān)的疾病的藥物篩選有用。并且該類胰島素作用劑對(duì)于胰島素與細(xì)胞的作用機(jī)理的研究、該細(xì)胞的物理變化相關(guān)的機(jī)能研究有用。
通過(guò)將本發(fā)明的類胰島素作用劑給予人，有望降低血液中胰島素水平。即，可以使用本發(fā)明的類胰島素作用劑作為在治療或預(yù)防中需要降低胰島素水平的疾病的治療或預(yù)防藥物。對(duì)于該疾病并沒(méi)有特別限定，例如有高胰島素血癥、阿爾茨海默氏病等。另外，有報(bào)告指出經(jīng)由胰島素受體的刺激與壽命延長(zhǎng)效果有密切關(guān)系(Science，vol.299，572-574頁(yè)(2003年)；Nature，vol.424，277-284頁(yè)(2003年))，因此可以將本發(fā)明的類胰島素作用劑作為抗老化劑使用。
如后面所述，本發(fā)明的有效成分未見(jiàn)毒性。也不用擔(dān)心副作用。因此，可以安全且適當(dāng)?shù)乇磉_(dá)類胰島素作用。因此，含有該有效成分的本發(fā)明的藥物、食品、飲料或飼料對(duì)于與胰島素水平或胰島素應(yīng)答異常有關(guān)的疾病的治療或預(yù)防有效。
本發(fā)明還提供含有、添加和/或稀釋上述有效成分而成的與胰島素水平或胰島素應(yīng)答異常有關(guān)的疾病的治療用或預(yù)防用的食品、飲料或飼料。本發(fā)明的食品、飲料或飼料通過(guò)其類胰島素作用，對(duì)于與胰島素水平或胰島素應(yīng)答異常有關(guān)的疾病的癥狀改善、預(yù)防極為有效。并且，本發(fā)明的食品或飲料是具有降低血糖值的作用的降血糖用食品或飲料，對(duì)于需要注意血糖值或體內(nèi)脂肪的人是有效的功能性食品或飲料。
本說(shuō)明書中，“含有”是指食品、飲料或飼料中含有本發(fā)明所使用的有效成分的形式；“添加”是指向食品、飲料或飼料原料中加入本發(fā)明所使用的有效成分的形式；“稀釋”是指向本發(fā)明所使用的有效成分中加入食品、飲料或飼料的原料的形式。
本發(fā)明的食品、飲料或飼料的制造方法并沒(méi)有特別限定，例如混合、調(diào)制、加工等可按照通常的食品、飲料或飼料進(jìn)行，通過(guò)這些制造方法制造，所得食品、飲料或飼料只要含有具類胰島素作用的本發(fā)明的上述有效成分即可。
本發(fā)明的食品或飲料并沒(méi)有特別限定，例如有含有本發(fā)明的上述有效成分的谷物加工制品(例如小麥粉加工制品、淀粉類加工制品、預(yù)混加工制品、面類、通心粉類、面包類、豆餡包類、蕎麥面類、麥麩、米粉、粉絲、包裝糯米糕點(diǎn)等)、油脂加工制品(例如塑性油脂、炸油、色拉油、蛋黃醬、調(diào)味醬等)、大豆加工制品(例如豆腐類、豆醬、納豆等)、食用肉類加工制品(例如火腿、臘肉、壓制火腿、紅腸等)、水產(chǎn)制品(例如冷凍碎魚肉、魚糕、圓筒狀魚糕、魚糕片、炸胡蘿卜魚肉片、氽魚丸、筋、魚肉火腿、腸、鰹魚刨花、魚卵加工制品、水產(chǎn)罐頭、甜烹海味等)、乳制品(例如原料乳、奶油、酸乳酪、黃油、干酪、練乳、奶粉、冰激凌等)、蔬菜·果實(shí)加工制品(例如糊類、果醬類、成菜類、果實(shí)飲料、蔬菜飲料、混合飲料等)、糕點(diǎn)類(例如巧克力、餅干類、糕點(diǎn)面包類、蛋糕、糯米糕點(diǎn)(日本式)、糯米餅干類等)、酒精類(例如日本酒、中國(guó)酒、葡萄酒、威士忌、燒酒、伏特加、白蘭地、杜松子酒、朗姆酒、啤酒、清涼酒精飲料、果酒、利口酒等)、嗜好飲料(例如綠茶、紅茶、烏龍茶、咖啡、清涼飲料、乳酸飲料等)、調(diào)料(例如醬油、醬汁、醋、甜料酒等)、罐裝·瓶裝·袋裝食品(例如牛肉飯、蓋澆飯、紅豆飯、咖哩、其它各種加工食品等)、半干燥或濃縮食品(例如肝醬、其它調(diào)味醬、蕎面·面條汁、濃縮湯類等)、干燥食品(例如快餐面類、快餐咖哩、速溶咖啡、果汁粉、湯粉末、快餐醬湯、加工食品、加工飲料、加工湯等)、冷凍食品(例如雞素?zé)?、蒸雞蛋羹、烤鰻魚、漢堡牛排、燒麥、餃子、各種濃肉湯、果汁雞尾酒等)、固態(tài)食品、液體食品(例如湯等)、香辛料類等農(nóng)產(chǎn)·林產(chǎn)加工制品、畜產(chǎn)加工制品、水產(chǎn)加工制品等。
本發(fā)明的食品或飲料含有、添加和/或稀釋一種或多種上述有效成分，其含量只要是與表達(dá)類胰島素作用所必需的量相當(dāng)即可，對(duì)于其形狀并沒(méi)有特別限定，也包括可口服攝取的片狀、顆粒狀、膠囊狀等形狀。
本發(fā)明的飲料可以將本發(fā)明的有效成分與傘形科以外的植物例如蔬菜或果實(shí)等的榨汁液混合、或與傘形科植物同時(shí)榨汁，制成健康飲料。例如將八丈芹的榨汁液用水稀釋，與胡蘿卜、小松菜、蕪菁、青梗菜、西紅柿、柑桔、檸檬、葡萄柚、奇異果、菠菜、小蘿卜、白蘿卜、白菜、卷心菜、做沙拉的生菜、生菜、韭菜、秋葵、菜椒、黃瓜、菜豆、毛豆、豌豆、玉米、蒜、芝麻菜、枇杷、桔子、甘夏橘等的榨汁液，牛乳，豆乳等混合，制成具有類胰島素作用的健康飲料。
本發(fā)明的食品或飲料中的上述有效成分的含量并沒(méi)有特別限定，可從其感官和活性表達(dá)的角度考慮適當(dāng)選擇，例如每100重量％的食品優(yōu)選0.00001重量％或以上，更優(yōu)選0.0001-10重量％，進(jìn)一步優(yōu)選0.0006-6重量％；每100重量％的飲料優(yōu)選0.00001重量％或以上，更優(yōu)選0.0001-10重量％，進(jìn)一步優(yōu)選0.0006-6重量％。對(duì)于本發(fā)明的食品或飲料中含有的有效成分，例如人(例如成人)每天可以攝取0.001mg-10g/kg，優(yōu)選0.1mg-1g/kg。
如上所述，當(dāng)將有效成分以片劑的形式作為食品等提供時(shí)，有效成分的含量例如為0.01-100重量％。而直接將榨汁液作為飲料時(shí)，本發(fā)明的有效成分的含量例如為0.01-100重量％。
本發(fā)明還提供含有、添加和/或稀釋上述有效成分而得到的具有類胰島素作用的生物用飼料，并且作為一個(gè)實(shí)施方案，提供生物的飼養(yǎng)方法，其特征在于給予生物上述有效成分。作為本發(fā)明的飼料的另一個(gè)實(shí)施方案，還提供生物飼養(yǎng)劑，其特征在于該生物飼養(yǎng)劑中含有上述有效成分。
這些發(fā)明中，生物是指例如養(yǎng)殖動(dòng)物、動(dòng)物寵物等，養(yǎng)殖動(dòng)物例如有家畜、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、家禽、魚類、甲殼類或貝類。飼料例如有維持和/或改善身體狀況的飼料。生物飼養(yǎng)劑例如有浸漬劑、飼料添加劑、飲料添加劑。
根據(jù)這些發(fā)明，在適用該發(fā)明的以上例舉的生物中，通過(guò)本發(fā)明所使用的上述有效成分的類胰島素作用，有望表達(dá)出與本發(fā)明的上述治療藥物或預(yù)防藥物同樣的效果。即，上述飼料等具有治療或預(yù)防該生物的與胰島素水平或胰島素應(yīng)答異常有關(guān)的疾病的效果。
通常，對(duì)每1kg對(duì)象生物的體重、每天優(yōu)選給予0.01-2000mg本發(fā)明所使用的上述有效成分。關(guān)于給予，例如可通過(guò)將該有效成分添加并混合到供給對(duì)象生物的人工混合飼料的原料中，或與人工混合飼料的粉末原料混合后再添加并混合到其他原料中來(lái)進(jìn)行。對(duì)于上述有效成分在飼料中的含量并沒(méi)有特別限定，可根據(jù)目的適當(dāng)設(shè)定，優(yōu)選0.001-15重量％的比例。
本發(fā)明的飼料的制造方法并沒(méi)有特別限定，其混合可按照通常的飼料進(jìn)行，只要所制造的飼料中含有具有類胰島素作用的本發(fā)明的上述有效成分即可。
可適用本發(fā)明的生物并沒(méi)有特別限定，廣泛適用于養(yǎng)殖動(dòng)物中的馬、牛、豬、羊、山羊、駱駝、駝羊等家畜；小鼠、大鼠、豚鼠、兔等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；雞、鴨、火雞、鴕鳥(niǎo)等家禽；以及作為動(dòng)物寵物的狗、貓等。
通過(guò)攝取含有具有類胰島素作用的本發(fā)明中使用的上述有效成分的飼料，或?qū)?duì)象生物浸泡于含有具有類胰島素作用的本發(fā)明中使用的上述有效成分的液體中，可以良好地維持或改善家畜、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、家禽、動(dòng)物寵物等的身體狀況。這些例子也包括在本發(fā)明的飼養(yǎng)方法中。
本發(fā)明也可以提供含有上述有效成分的細(xì)胞攝入葡萄糖的促進(jìn)劑。該葡萄糖攝入促進(jìn)劑可以是上述有效成分本身，也可以是含有上述有效成分的組合物。該葡萄糖攝入促進(jìn)劑例如可以將上述有效成分與可與該有效成分同樣用途使用的其它成分(例如胰島素等)等混合，按照上述治療藥物或預(yù)防藥物的制造方法制成通常使用的試劑的形式。該葡萄糖攝入促進(jìn)劑中上述有效成分的含量要考慮到該葡萄糖攝入促進(jìn)劑的給予方法、使用目的等，只要是可表達(dá)本發(fā)明所希望的效果的量即可，并沒(méi)有特別限定。有效成分的含量例如是0.01-100重量％。另外，該葡萄糖攝入促進(jìn)劑的使用量只要是可表達(dá)本發(fā)明所希望的效果的量即可，對(duì)此并沒(méi)有特別限定。當(dāng)給予生物體使用時(shí)，特別優(yōu)選以可在上述治療藥物或預(yù)防藥物中的有效成分給藥量的范圍內(nèi)給予有效成分的量使用。該葡萄糖攝入促進(jìn)劑對(duì)于在治療或預(yù)防中需要促進(jìn)細(xì)胞攝入葡萄糖作用的疾病的治療或預(yù)防有效。關(guān)于該疾病，除了上述與胰島素水平或胰島素應(yīng)答異常有關(guān)的疾病之外，例如還有心臟疾病，特別是心肌梗塞、缺血后的心臟損傷等。另外，由于該葡萄糖攝入促進(jìn)劑促進(jìn)細(xì)胞攝入葡萄糖，因此，通過(guò)在肌細(xì)胞中發(fā)揮該作用，可以產(chǎn)生增強(qiáng)肌肉的作用、消除疲勞的作用。該葡萄糖攝入促進(jìn)劑可用于上述疾病的治療用或預(yù)防用食品、飲料或飼料的制造。這些食品、飲料或飼料可以作為上述的與胰島素水平或胰島素應(yīng)答異常有關(guān)的疾病的治療用或預(yù)防用的食品、飲料或飼料使用。該葡萄糖攝入促進(jìn)劑對(duì)于在上述治療或預(yù)防中需要細(xì)胞攝入葡萄糖促進(jìn)作用的疾病的藥物篩選有用。并且該葡萄糖攝入促進(jìn)劑對(duì)于細(xì)胞攝入葡萄糖的作用機(jī)理研究、該細(xì)胞的物理變化等的機(jī)能研究也有用。
本發(fā)明也可提供含有上述有效成分的向脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑。關(guān)于可由該分化誘導(dǎo)劑分化誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞的前脂肪細(xì)胞，只要是可分化為脂肪細(xì)胞的細(xì)胞即可，并沒(méi)有特別限定，例如除前脂肪細(xì)胞外，還有成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)類干細(xì)胞等。該分化誘導(dǎo)劑可以是上述有效成分本身，也可以是含有上述有效成分的組合物。該分化誘導(dǎo)劑例如可以將上述有效成分與可與該有效成分同樣用途使用的其它成分(例如胰島素等)等混合，按照上述治療藥物或預(yù)防藥物的制造方法制成通常使用的藥劑的形式。該分化誘導(dǎo)劑中上述有效成分的含量要考慮該分化誘導(dǎo)劑的給予方法、使用目的等，只要是可表達(dá)本發(fā)明所希望的效果的量即可，并沒(méi)有特別限定。有效成分的含量例如是0.01-100重量％。另外，該分化誘導(dǎo)劑的使用量只要是可表達(dá)本發(fā)明所希望的效果的量即可，對(duì)此并沒(méi)有特別限定。當(dāng)給予生物體使用時(shí)，特別優(yōu)選以可在上述治療藥物或預(yù)防藥物中的有效成分給藥量的范圍內(nèi)給予有效成分的量使用。該分化誘導(dǎo)劑對(duì)于在治療或預(yù)防中需要分化誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞作用的疾病的治療或預(yù)防有效。關(guān)于該疾病，除了上述與胰島素水平或胰島素應(yīng)答異常有關(guān)的疾病之外，例如還可以是痛風(fēng)、脂肪肝、膽囊結(jié)石、月經(jīng)不調(diào)、不孕癥等。該分化誘導(dǎo)劑可用于上述疾病的治療用或預(yù)防用食品、飲料或飼料的制造。這些食品、飲料或飼料可以作為上述與胰島素水平或胰島素應(yīng)答異常有關(guān)的疾病的治療用或預(yù)防用的食品、飲料或飼料使用。該分化誘導(dǎo)劑對(duì)于在上述治療或預(yù)防中需要分化誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞作用的疾病的藥物篩選有用。并且該分化誘導(dǎo)劑對(duì)于分化誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞作用的機(jī)理研究及其該物理變化等的機(jī)能研究也有用。
對(duì)于本發(fā)明中使用的上述有效成分，即使給予對(duì)于起作用表達(dá)來(lái)說(shuō)的有效量，也未見(jiàn)毒性。例如口服給予時(shí)，將八丈芹、芹菜或歐芹的乙醇提取物分別以1g/kg單次給予小鼠，也未見(jiàn)死亡例。上述有效成分在口服給予大鼠時(shí)，即使口服單次給予1g/kg，也未見(jiàn)死亡例。
實(shí)施例以下例舉實(shí)施例更具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些描述的任何限定。如無(wú)特別說(shuō)明，實(shí)施例中的％全部表示容量％。
實(shí)施例1八丈芹根提取組分的制備(1)將八丈芹(Angelica Keiskei)根部冷凍干燥，向10g細(xì)粉碎物中加入100mL氯仿，在室溫下提取30分鐘。抽濾后，對(duì)殘余物重復(fù)同樣的操作。將這些氯仿提取液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，然后將干燥固化物溶解于2.5mL二甲基亞砜中，制成八丈芹根的氯仿提取組分。
(2)向?qū)嵤├?-(1)的氯仿提取后殘余物中加入100mL乙醇，在室溫下提取30分鐘。抽濾后，對(duì)殘余物重復(fù)同樣的操作。合并乙醇提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，然后將干燥固化物溶解于2.5mL二甲基亞砜中，制備成八丈芹根的乙醇提取組分。
實(shí)施例2八丈芹根提取組分的分級(jí)向5.8kg八丈芹根部干燥粉末中加入24升乙酸乙酯，在室溫下提取3小時(shí)，吸濾后將乙酸乙酯提取液與殘余物分離。將得到的200mL乙酸乙酯提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，然后溶解于氯仿，用硅膠層析進(jìn)行分級(jí)。以下表示分級(jí)條件。硅膠使用BW-300SP(Fuji-Silysia化學(xué)公司制100mL)。以氯仿(500mL)、氯仿∶甲醇(容量比、以下也同樣)＝100∶1(300mL)、乙酸乙酯(200mL)的順序進(jìn)行洗脫。洗脫液依次分級(jí)為級(jí)分1(280mL)、級(jí)分2(200mL)、級(jí)分3(280mL)、級(jí)分4(240mL)，回收，分別減壓濃縮、干燥固化，然后溶解于2mL乙醇中，得到硅膠柱分級(jí)級(jí)分1-4。
實(shí)施例3八丈芹根提取組分對(duì)分化誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞(1)分化誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞是將前述Rubin C.S.等人的方法部分改進(jìn)而進(jìn)行的。在含有200μM抗壞血酸的含10％胎牛血清(ギブコ公司制)的Dulbecco氏改良eagle氏培養(yǎng)基(SIGMA-ALDRICH公司，D6046)(以下稱為A-D-MEM培養(yǎng)基)中以4×103個(gè)/mL懸浮前脂肪細(xì)胞株3T3-L1(ATCC CCL-92.1)，在12孔微量滴定板的孔內(nèi)各加入2mL，在5％二氧化碳存在下，在37℃培養(yǎng)7天。在第2、4天用相同的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換。第7天，更換為含有0.25μM地塞米松的A-D-MEM培養(yǎng)基，然后添加實(shí)施例1-(1)中制備的八丈芹根的氯仿提取組分或?qū)嵤├?-(2)中制備的八丈芹根的乙醇提取組分，使終濃度為0.1％。將添加4μL 5mg/mL胰島素(TAKARA BIO公司制)水溶液的組作為陽(yáng)性對(duì)照，將添加水的組作為陰性對(duì)照。添加各成分后，在45小時(shí)時(shí)，更換為A-D-MEM培養(yǎng)基，分別向各孔中加入4μL八丈芹根的氯仿提取組分或八丈芹根的乙醇提取組分、作為陽(yáng)性對(duì)照添加2μL 5mg/mL胰島素水溶液、作為陰性對(duì)照添加水，再培養(yǎng)7天。在第2、4天更換培養(yǎng)基，此時(shí)，分別向各孔中加入了4μL八丈芹根的氯仿提取組分或八丈芹根的乙醇提取組分、作為陽(yáng)性對(duì)照添加了2μL5mg/mL胰島素水溶液、作為陰性對(duì)照添加了水。
(2)甘油三酯生物合成量的測(cè)定測(cè)定細(xì)胞中甘油三酯的生物合成量作為分化誘導(dǎo)為成熟脂肪細(xì)胞的指標(biāo)或作為對(duì)類胰島素作用的評(píng)價(jià)。培養(yǎng)結(jié)束后，去掉培養(yǎng)基，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌細(xì)胞2次，加入1mL己烷∶異丙醇＝3∶2的溶劑，在室溫下放置30分鐘，然后回收上清。將該操作再次重復(fù)，將得到的2mL上清濃縮干燥固化。將沉淀溶解于100μL異丙醇中，然后用甘油三酯G-測(cè)定儀(和光純藥公司制、型號(hào)276-69801)測(cè)定10μL溶液中含有的甘油三酯的量。全部測(cè)定2次。
結(jié)果可見(jiàn)與添加水的組比較，八丈芹根的氯仿提取組分或八丈芹根的乙醇提取組分添加組與胰島素添加組同樣，誘導(dǎo)了甘油三酯的生物合成。即表明八丈芹根的氯仿提取組分或八丈芹根的乙醇提取組分有分化誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞的作用。這在圖1中表示。圖1的橫軸表示各樣品，縱軸表示甘油三酯的生物合成量(μg/mL)。
實(shí)施例4八丈芹根提取物分級(jí)級(jí)分的向脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用按照實(shí)施例3的方法測(cè)定由實(shí)施例2制備的八丈芹根提取組分的各級(jí)分的向脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo)活性。分別添加4μL 2.875mg/mL硅膠柱分級(jí)級(jí)分3或10.825mg/mL硅膠柱分級(jí)級(jí)分4作為樣品。以添加4μL 5mg/mL胰島素水溶液的組作為陽(yáng)性對(duì)照，以添加水的組作為陰性對(duì)照。之后與實(shí)施例3的方法同樣地進(jìn)行培養(yǎng)基和樣品的更換，添加樣品7天后測(cè)定細(xì)胞中的甘油三酯的量。
結(jié)果可見(jiàn)與添加水的組比較，硅膠柱分級(jí)級(jí)分3和硅膠柱分級(jí)級(jí)分4添加組與胰島素添加組同樣，誘導(dǎo)了甘油三酯的生物合成。即表明硅膠柱分級(jí)級(jí)分3和硅膠柱分級(jí)級(jí)分4添加組有分化誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞的作用。這在圖2中表示。圖2的橫軸表示各樣品，縱軸表示甘油三酯的生物合成量(μg/mL)。
實(shí)施例5八丈芹根提取組分對(duì)葡萄糖攝入的促進(jìn)作用(1)成熟脂肪細(xì)胞的制備分化誘導(dǎo)為成熟脂肪細(xì)胞是將前述Rubin C.S.等人的方法部分改進(jìn)而進(jìn)行的。在含有200μM抗壞血酸的含10％胎牛血清(ギブコ公司制)Dulbecco氏改良eagle氏培養(yǎng)基(SIGMA-ALDRICH公司制，D6046)中以4×103個(gè)/mL懸浮3T3-L1細(xì)胞(ATCC CCL-92.1)，在12孔微量滴定板的孔內(nèi)各加入2mL，在5％二氧化碳存在下，在37℃培養(yǎng)7天。第7天，更換為2mL含有200μM抗壞血酸、0.25μM地塞米松和10μg/mL胰島素(TAKARA BIO公司制)、0.5mM 3-異丁基1-甲基黃嘌呤(nacalai-tesque公司制、19624-44)的含10％胎牛血清(ギブコ公司制)的Dulbecco氏改良eagle氏培養(yǎng)基。45小時(shí)后，更換為2mL含有200μM抗壞血酸和5μg/mL胰島素的含10％胎牛血清(ギブコ公司制)Dulbecco氏改良eagle氏培養(yǎng)基，2天后、4天后更換同樣的培養(yǎng)基，培養(yǎng)7天，制備成熟脂肪細(xì)胞。
(2)測(cè)定對(duì)成熟脂肪細(xì)胞攝入葡萄糖的促進(jìn)作用測(cè)定當(dāng)樣品刺激成熟脂肪細(xì)胞時(shí)細(xì)胞內(nèi)2-脫氧葡萄糖的攝入量，以此作為對(duì)葡萄糖攝入促進(jìn)作用的評(píng)價(jià)或作為對(duì)類胰島素作用的評(píng)價(jià)。
培養(yǎng)結(jié)束后，去掉培養(yǎng)基，用含有0.1w/v％牛血清白蛋白(SIGMA-ALDRICH公司制，A8022)的Dulbecco氏改良eagle氏培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，然后分別向各孔中添加1mL含有八丈芹根的氯仿提取組分的二甲基亞砜溶液或八丈芹根的乙醇提取組分的二甲基亞砜溶液的相同培養(yǎng)基，使終濃度分別為0.025％、0.008％，在5％二氧化碳存在下，在37℃培養(yǎng)過(guò)夜。以未添加樣品的組作為陰性對(duì)照。培養(yǎng)過(guò)夜后，用赫佩斯緩沖鹽溶液(140mM NaCl、5mM KCl、2.5mMMgSO4、1mM CaCl2、20mM赫佩斯-Na(pH7.4))洗滌細(xì)胞2次，在各孔中分別添加0.9mL含有八丈芹根的氯仿提取組分的二甲基亞砜溶液或八丈芹根的乙醇提取組分的二甲基亞砜溶液的相同緩沖液，使?jié)舛确謩e為0.025％、0.008％，37℃培養(yǎng)75分鐘。此時(shí)，在經(jīng)過(guò)45分鐘時(shí)，在未添加樣品的孔中添加胰島素，使終濃度為1μg/mL，以該組作為陽(yáng)性對(duì)照。之后，加入100μL含有0.5μCi/mL 2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖(Perkin Elmer公司制、NET549A)、1mM 2-脫氧葡萄糖(nacalai-tesque公司制、10722-11)的赫佩斯鹽緩沖液，再在37℃培養(yǎng)10分鐘。培養(yǎng)結(jié)束后，去掉上清，用冷卻至4℃的磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞3次，然后加入0.5mL含有1％Nonidet P-40的磷酸鹽緩沖液，溶解細(xì)胞，使攝入到細(xì)胞中的2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖溶出。用25μL上清，以Aquasol-2(PerkinElmer公司制、6NE9529)作為閃爍液，通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)器LS 6500(Beckman Coulter公司制)測(cè)定放射活性。
結(jié)果可見(jiàn)，與陰性對(duì)照相比較，各濃度的八丈芹根的氯仿提取組分或八丈芹根的乙醇提取組分添加組與胰島素添加組同樣，促進(jìn)了2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的攝入。即表明八丈芹根的氯仿提取組分或八丈芹根的乙醇提取組分的組具有促進(jìn)葡萄糖攝入的活性。這在圖3表示。圖3中，橫軸表示各樣品，縱軸表示2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量(dpm)。
實(shí)施例6八丈芹葉提取組分的制備向各2g八丈芹葉干燥粉末中加入40mL蒸餾水、乙醇或乙酸乙酯，提取30分鐘，離心分離提取液和殘余物。接著對(duì)殘余物用30mL各溶劑重復(fù)2次提取操作。水提在60℃進(jìn)行，乙醇提取、乙酸乙酯提取在室溫下進(jìn)行。收集所得提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。最終，將水提取液溶解于10mL蒸餾水，得到八丈芹葉的水提取組分。將乙醇提取液溶解于8mL二甲基亞砜，得到八丈芹葉的乙醇提取組分。將乙酸乙酯提取液溶解于5mL二甲基亞砜，得到八丈芹葉的乙酸乙酯提取組分。
實(shí)施例7八丈芹葉提取組分的向脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用按照實(shí)施例3的方法測(cè)定由實(shí)施例6制備的八丈芹葉的水提取組分和八丈芹葉的乙醇提取組分的向脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用(類胰島素活性)。
即，向各孔中添加八丈芹葉的水提取組分水溶液，使終濃度分別為0.4％、0.2％、0.1％，或向各孔中添加八丈芹葉的乙醇提取組分的二甲基亞砜溶液，使終濃度為0.066％、0.022％，以這些組作為樣品。以添加4μL 5mg/mL胰島素(TAKARA BIO公司制)水溶液的組作為陽(yáng)性對(duì)照，以添加二甲基亞砜的組作為陰性對(duì)照。之后與實(shí)施例3的方法同樣地進(jìn)行培養(yǎng)基和樣品的更換，添加樣品7天后，測(cè)定細(xì)胞中的甘油三酯的量。
結(jié)果可見(jiàn)，各濃度的八丈芹葉的水提取組分和八丈芹葉的乙醇提取組分添加組誘導(dǎo)了甘油三酯的生物合成。即表明八丈芹葉的水提取組分和八丈芹葉的乙醇提取組分有分化誘導(dǎo)為成熟脂肪細(xì)胞的作用。這在圖4中表示。圖4的橫軸表示各樣品，縱軸表示甘油三酯的生物合成量(μg/mL)。
實(shí)施例8芹菜葉提取組分的制備向各2g芹菜葉干燥粉末中加入40mL蒸餾水、乙醇或乙酸乙酯，提取30分鐘，離心分離提取液和殘余物。接著對(duì)殘余物用30mL各溶劑重復(fù)2次提取操作。水提在60℃進(jìn)行，乙醇提取、乙酸乙酯提取在室溫下進(jìn)行。收集所得提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。最終，將水提取液溶解于10mL蒸餾水，得到芹菜葉的水提取組分。將乙醇提取液溶解于5mL二甲基亞砜，得到芹菜葉的乙醇提取組分。將乙酸乙酯提取液溶解于5mL二甲基亞砜，得到芹菜葉的乙酸乙酯提取組分。
實(shí)施例9芹菜葉提取組分的向脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用按照實(shí)施例3的方法測(cè)定由實(shí)施例8制備的芹菜葉的水提取組分、芹菜葉的乙醇提取組分和芹菜葉的乙酸乙酯提取組分的向脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用(類胰島素活性)。
即，向各孔中添加芹菜葉的水提取組分水溶液，使終濃度為0.1％；向各孔中添加芹菜葉的乙醇提取組分的二甲基亞砜溶液或芹菜葉的乙酸乙酯提取組分的二甲基亞砜溶液，使終濃度分別為0.2％、0.066％、0.022％，以這些組作為樣品。以添加4μL 5mg/mL胰島素(TAKARABIO公司制)水溶液的組作為陽(yáng)性對(duì)照，以添加二甲基亞砜的組作為陰性對(duì)照。之后與實(shí)施例3的方法同樣地進(jìn)行培養(yǎng)基和樣品的更換，添加樣品7天后，測(cè)定細(xì)胞中的甘油三酯的量。
結(jié)果可見(jiàn)，各濃度的芹菜葉的水提取組分、芹菜葉的乙醇提取組分和芹菜葉的乙酸乙酯提取組分添加組誘導(dǎo)了甘油三酯的生物合成。即表明芹菜葉的水提取組分、芹菜葉的乙醇提取組分和芹菜葉的乙酸乙酯提取組分有分化誘導(dǎo)為成熟脂肪細(xì)胞的作用。這在圖5中表示。圖5的橫軸表示各樣品，縱軸表示甘油三酯的生物合成量(μg/mL)。
實(shí)施例10芹菜葉提取組分對(duì)葡萄糖攝入的促進(jìn)作用按照實(shí)施例5記載的方法測(cè)定當(dāng)樣品刺激成熟脂肪細(xì)胞時(shí)細(xì)胞內(nèi)2-脫氧葡萄糖的攝入量，以此作為由實(shí)施例8制備的芹菜葉的乙醇提取組分對(duì)葡萄糖攝入的促進(jìn)作用的評(píng)價(jià)，或作為對(duì)類胰島素作用的評(píng)價(jià)。
即，向各孔中添加芹菜葉的乙醇提取組分的二甲基亞砜溶液或芹菜葉的乙酸乙酯提取組分的二甲基亞砜溶液，使終濃度分別為0.2％、0.066％，以這些組作為樣品。以未添加樣品的組作為陰性對(duì)照，以添加終濃度為1μg/mL的胰島素的組作為陽(yáng)性對(duì)照。之后同樣地測(cè)定攝入到細(xì)胞中的2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量。
結(jié)果可見(jiàn)，與陰性對(duì)照比較，備濃度的芹菜葉的乙醇提取組分和芹菜葉的乙酸乙酯提取組分添加組與胰島素添加組同樣，促進(jìn)了2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的攝入。即表明芹菜葉的乙醇提取組分和芹菜葉的乙酸乙酯提取組分具有促進(jìn)葡萄糖攝入的活性。這在圖6表示。圖6中，橫軸表示各樣品，縱軸表示2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量(dpm)。
實(shí)施例11歐芹提取組分的制備向各2g歐芹干燥粉末中加入40mL蒸餾水、乙醇或乙酸乙酯，提取30分鐘，離心分離提取液和殘余物。接著對(duì)殘余物用30mL各溶劑重復(fù)2次提取操作。水提在60℃進(jìn)行，乙醇提取、乙酸乙酯提取在室溫下進(jìn)行。收集所得提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。最終，將水提取液溶解于10mL蒸餾水，得到歐芹的水提取組分。將乙醇提取液溶解于5mL二甲基亞砜，得到歐芹的乙醇提取組分。將乙酸乙酯提取液溶解于5mL二甲基亞砜，得到歐芹的乙酸乙酯提取組分。
實(shí)施例12歐芹提取組分的向脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用按照實(shí)施例3的方法測(cè)定由實(shí)施例11制備的歐芹的水提取組分的向脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用(類胰島素活性)。
即，向各孔中添加歐芹的水提取組分水溶液，使終濃度分別為0.4％、0.2％、0.1％，以這些組作為樣品。以添加4μL 5mg/mL胰島素(TAKARA BIO公司制)水溶液的組作為陽(yáng)性對(duì)照，以添加二甲基亞砜的組作為陰性對(duì)照。之后與實(shí)施例3的方法同樣地進(jìn)行培養(yǎng)基和樣品的更換，添加樣品7天后，測(cè)定細(xì)胞中的甘油三酯的量。
結(jié)果可見(jiàn)，各濃度的歐芹的水提取組分添加組誘導(dǎo)了甘油三酯的生物合成。即表明歐芹的水提取組分有分化誘導(dǎo)為成熟脂肪細(xì)胞的作用。這在圖7中表示。圖7的橫軸表示各樣品，縱軸表示甘油三酯的生物合成量(μg/mL)。
實(shí)施例13歐芹提取組分對(duì)葡萄糖攝入的促進(jìn)作用按照實(shí)施例5的方法測(cè)定當(dāng)樣品刺激成熟脂肪細(xì)胞時(shí)細(xì)胞內(nèi)2-脫氧葡萄糖的攝入量，以此作為由實(shí)施例11制備的歐芹的乙醇提取組分和歐芹的乙酸乙酯提取組分促進(jìn)葡萄糖攝入的作用的評(píng)價(jià)，或作為對(duì)類胰島素作用的評(píng)價(jià)。
即，向各孔中添加歐芹的乙醇提取組分的二甲基亞砜溶液或歐芹的乙酸乙酯提取組分的二甲基亞砜溶液，使終濃度分別為0.2％、0.066％，以這些組作為樣品。以未添加樣品的組作為陰性對(duì)照，以添加終濃度為1μg/mL的胰島素的組作為陽(yáng)性對(duì)照。之后同樣地測(cè)定攝入到細(xì)胞中的2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量。
結(jié)果可見(jiàn)，與陰性對(duì)照比較，各濃度的歐芹的乙醇提取組分和歐芹的乙酸乙酯提取組分添加組與胰島素添加組同樣，促進(jìn)了2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的攝入。即表明歐芹的乙醇提取組分和歐芹的乙酸乙酯提取組分具有促進(jìn)葡萄糖攝入的活性。其在圖8表示。圖8中，橫軸表示各樣品，縱軸表示2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量(dpm)。
實(shí)施例14八丈芹根的乙醇提取組分和乙酸乙酯提取組分的制備向各2g八丈芹根干燥粉末中加入40mL乙醇或乙酸乙酯，在室溫下提取30分鐘，離心分離提取液和殘余物。接著對(duì)殘余物用30mL各溶劑重復(fù)2次提取操作。收集所得提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。最終，將乙醇提取液溶解于1mL二甲基亞砜，得到八丈芹根的乙醇提取組分。將乙酸乙酯提取液溶解于1mL二甲基亞砜，得到八丈芹根的乙酸乙酯提取組分。
實(shí)施例15八丈芹根的乙醇提取組分和乙酸乙酯提取組分的向脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用按照實(shí)施例3的方法測(cè)定由實(shí)施例14制備的八丈芹根的乙醇提取組分和八丈芹根的乙酸乙酯提取組分的向脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用(類胰島素活性)。
即，向各孔中添加八丈芹根的乙醇提取組分的二甲基亞砜溶液或八丈芹根的乙酸乙酯提取組分的二甲基亞砜溶液，使終濃度分別為0.05、0.025％，以這些組作為樣品。以添加4μL 5mg/mL胰島素(TAKARA BIO公司制)水溶液的組作為陽(yáng)性對(duì)照，以添加二甲基亞砜的組作為陰性對(duì)照。之后與實(shí)施例3的方法同樣地進(jìn)行培養(yǎng)基和樣品的更換，添加樣品7天后，測(cè)定細(xì)胞中的甘油三酯的量。
結(jié)果可見(jiàn)，各濃度的八丈芹根的乙醇提取組分或八丈芹根的乙酸乙酯提取組分添加組誘導(dǎo)了甘油三酯的生物合成。即表明八丈芹根的乙醇提取組分和八丈芹根的乙酸乙酯提取組分有分化誘導(dǎo)為成熟脂肪細(xì)胞的作用。這在圖9中表示。圖9的橫軸表示各樣品，縱軸表示甘油三酯的生物合成量(μg/mL)。
實(shí)施例16八丈芹根的乙醇提取組分和乙酸乙酯提取組分對(duì)葡萄糖攝入的促進(jìn)作用按照實(shí)施例5的方法測(cè)定當(dāng)樣品刺激成熟脂肪細(xì)胞時(shí)細(xì)胞內(nèi)2-脫氧葡萄糖的攝入量，以此作為由實(shí)施例14制備的八丈芹根的乙醇提取組分和八丈芹根的乙酸乙酯提取組分對(duì)葡萄糖攝入的促進(jìn)作用的評(píng)價(jià)，或作為對(duì)類胰島素作用的評(píng)價(jià)。
即，向各孔中添加八丈芹根的乙醇提取組分的二甲基亞砜溶液或八丈芹根的乙酸乙酯提取組分的二甲基亞砜溶液，使終濃度分別為0.1％、0.05％，以這些組作為樣品。以未添加樣品的組作為陰性對(duì)照，以添加終濃度為1μg/mL的胰島素的組作為陽(yáng)性對(duì)照。之后同樣地測(cè)定攝入到細(xì)胞中的2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量。
結(jié)果可見(jiàn)，與陰性對(duì)照比較，各濃度的八丈芹根的乙醇提取組分和八丈芹根的乙酸乙酯提取組分添加組與胰島素添加組同樣，促進(jìn)了2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的攝入。即表明八丈芹根的乙醇提取組分和八丈芹根的乙酸乙酯提取組分具有促進(jìn)葡萄糖攝入的活性。其在圖10表示。圖10中，橫軸表示各樣品，縱軸表示2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量(dpm)。
實(shí)施例17八丈芹葉提取組分對(duì)葡萄糖攝入的促進(jìn)作用按照實(shí)施例5的方法測(cè)定當(dāng)樣品刺激成熟脂肪細(xì)胞時(shí)細(xì)胞內(nèi)2-脫氧葡萄糖的攝入量，以此作為由實(shí)施例6制備的八丈芹葉的乙醇提取組分和八丈芹葉的乙酸乙酯提取組分對(duì)葡萄糖攝入的促進(jìn)作用的評(píng)價(jià)，或作為對(duì)類胰島素作用的評(píng)價(jià)。
即，向各孔中添加八丈芹葉的乙醇提取組分的二甲基亞砜溶液或八丈芹葉的乙酸乙酯提取組分的二甲基亞砜溶液，使終濃度分別為0.2％、0.1％，以這些組作為樣品。以未添加樣品的組作為陰性對(duì)照，以添加終濃度為1μg/mL的胰島素的組作為陽(yáng)性對(duì)照。之后同樣地測(cè)定攝入到細(xì)胞中的2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量。
結(jié)果可見(jiàn)，與陰性對(duì)照比較，各濃度的八丈芹葉的乙醇提取組分和八丈芹葉的乙酸乙酯提取組分添加組與胰島素添加組同樣，促進(jìn)了2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的攝入。即表明八丈芹葉的乙醇提取組分和八丈芹葉的乙酸乙酯提取組分具有促進(jìn)葡萄糖攝入的活性。其在圖11表示。圖11中，橫軸表示各樣品，縱軸表示2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量(dpm)。
實(shí)施例18八丈芹根提取物分級(jí)級(jí)分對(duì)葡萄糖攝入的促進(jìn)作用按照實(shí)施例5的方法測(cè)定當(dāng)樣品刺激成熟脂肪細(xì)胞時(shí)細(xì)胞內(nèi)2-脫氧葡萄糖的攝入量，以此作為由實(shí)施例2制備的八丈芹根提取組分的各級(jí)分對(duì)葡萄糖攝入的促進(jìn)作用的評(píng)價(jià)，或作為對(duì)類胰島素作用的評(píng)價(jià)。
即，使用終濃度為0.03mg/mL的硅膠柱分級(jí)級(jí)分1、終濃度為0.013mg/mL的硅膠柱分級(jí)級(jí)分2、終濃度為0.0077mg/mL的硅膠柱分級(jí)級(jí)分3或終濃度為0.0096mg/mL的硅膠柱分級(jí)級(jí)分4作為樣品。以未添加樣品的組作為陰性對(duì)照，以添加終濃度為1μg/mL的胰島素的組作為陽(yáng)性對(duì)照。之后同樣地測(cè)定攝入到細(xì)胞中的2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量。
結(jié)果可見(jiàn)，與陰性對(duì)照比較，八丈芹根提取組分的各級(jí)分添加組與胰島素添加組同樣，促進(jìn)了2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的攝入。即表明八丈芹根提取組分的硅膠柱分級(jí)級(jí)分1、2、3、4均具有促進(jìn)葡萄糖攝入的活性。其在圖12表示。圖12中，橫軸表示各樣品，縱軸表示2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量(dpm)。
實(shí)施例19松胞菌素B抑制八丈芹根乙醇提取組分對(duì)葡萄糖攝入的促進(jìn)作用對(duì)于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑——松胞菌素B是否抑制實(shí)施例16所示的八丈芹根乙醇提取組分對(duì)葡萄糖攝入的促進(jìn)作用進(jìn)行試驗(yàn)，按照實(shí)施例5的方法，對(duì)于當(dāng)樣品刺激成熟脂肪細(xì)胞時(shí)細(xì)胞內(nèi)2-脫氧葡萄糖的攝入時(shí)的松胞菌素B的影響進(jìn)行試驗(yàn)。
即，以添加了終濃度為0.1％的八丈芹根的乙醇提取組分的二甲基亞砜溶液的組作為樣品。以未添加樣品的組作為陰性對(duì)照，以添加終濃度為1μg/mL的胰島素的組作為陽(yáng)性對(duì)照。在各組中，在與設(shè)定胰島素添加組相同的時(shí)期設(shè)定終濃度40μM的松胞菌素B(nacalai-tesque公司制、10435-81)的添加組。之后同樣地測(cè)定攝入到細(xì)胞中的2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量。
結(jié)果可見(jiàn)，與陰性對(duì)照比較，八丈芹根的乙醇提取組分添加組與胰島素添加組同樣，促進(jìn)了2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的攝入，但各組因添加松胞菌素B而使2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的攝入幾乎完全受到抑制。即表明八丈芹根的乙醇提取組分促進(jìn)葡萄糖攝入的活性與胰島素同樣，是經(jīng)由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的。這在圖13表示。圖13中，橫軸表示各樣品，縱軸表示2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量(dpm)。
實(shí)施例20八丈芹根的乙醇提取組分和胰島素對(duì)葡萄糖攝入的協(xié)同促進(jìn)作用按照實(shí)施例5的方法的一部分，測(cè)定當(dāng)樣品刺激成熟脂肪細(xì)胞時(shí)細(xì)胞內(nèi)2-脫氧葡萄糖的攝入量，以此作為由實(shí)施例14制備的八丈芹根的乙醇提取組分和低濃度胰島素對(duì)葡萄糖攝入的協(xié)同促進(jìn)作用的評(píng)價(jià)。
成熟脂肪細(xì)胞的制備按照實(shí)施例5-(1)的方法進(jìn)行。
培養(yǎng)結(jié)束后，去掉培養(yǎng)基，用含有0.1％(w/v)牛血清白蛋白(SIGMA-ALDRICH公司制，A8022)的Dulbecco氏改良eagle氏培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，然后添加1mL終濃度0.02％的含有八丈芹根的乙醇提取組分的二甲基亞砜溶液的相同培養(yǎng)基，在5％二氧化碳存在下，在37℃培養(yǎng)過(guò)夜。以不含八丈芹根的乙醇提取組分的組作為陰性對(duì)照。培養(yǎng)過(guò)夜后，用赫佩斯緩沖鹽溶液(140mM NaCl、5mM KCl、2.5mM MgSO4、1mM CaCl2、20mM赫佩斯-Na(pH7.4))洗滌細(xì)胞2次，添加0.9mL含有八丈芹根的乙醇提取組分的相同緩沖液，使終濃度分別為0.02％，37℃培養(yǎng)45分鐘。接著，添加胰島素，使終濃度為0.001μg/mL，再培養(yǎng)30分鐘。此時(shí)，在未添加八丈芹根的乙醇提取組分的孔中添加胰島素，使終濃度為0.001μg/mL，以此作為對(duì)照。另外，以未添加樣品的組作為陰性對(duì)照。之后，與實(shí)施例5-(2)的方法同樣地測(cè)定攝入到細(xì)胞中的2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量。
結(jié)果可見(jiàn)，與陰性對(duì)照相比較，八丈芹根的乙醇提取組分添加組與胰島素添加組同樣，促進(jìn)了2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的攝入，但同時(shí)添加了胰島素的組比胰島素單獨(dú)添加組和八丈芹根的乙醇提取組分單獨(dú)添加組更促進(jìn)了2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的攝入。即表明通過(guò)在八丈芹根的乙醇提取組分中同時(shí)添加胰島素，具有協(xié)同增大促進(jìn)葡萄糖攝入活性的作用。這在圖14表示。圖14中，橫軸表示各樣品，縱軸表示2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量(dpm)。
實(shí)施例21在由八丈芹根提取組分分化誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞中，胰島素刺激對(duì)葡萄糖攝入的促進(jìn)在獲得實(shí)施例14制備的八丈芹根的乙醇提取組分所分化誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞后，驗(yàn)證胰島素的刺激是否會(huì)促進(jìn)該細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝入。
即，以添加了八丈芹根的乙醇提取組分的二甲基亞砜溶液的組為樣品，其終濃度為0.05％。以添加4μL 5mg/mL胰島素(TAKARA BIO公司制)水溶液的組作為陽(yáng)性對(duì)照。之后，與添加地塞米松相同的時(shí)期添加終濃度0.5mM的3-異丁基1-甲基黃嘌呤，除此之外，按照實(shí)施例3的方法，進(jìn)行培養(yǎng)基和樣品的更換，得到由八丈芹根的乙醇提取組分或胰島素分化誘導(dǎo)的成熟脂肪細(xì)胞。
接著，按照實(shí)施例5的方法，測(cè)定當(dāng)胰島素刺激所得成熟脂肪細(xì)胞時(shí)細(xì)胞內(nèi)2-脫氧葡萄糖的攝入量。
即，在各成熟脂肪細(xì)胞中，設(shè)定未添加胰島素組或終濃度為1μg/mL的胰島素添加組。之后同樣地測(cè)定攝入到細(xì)胞中的2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量。
結(jié)果可見(jiàn)，由八丈芹根的乙醇提取組分分化誘導(dǎo)的成熟脂肪細(xì)胞與由胰島素分化誘導(dǎo)的成熟脂肪細(xì)胞同樣，通過(guò)胰島素的刺激，促進(jìn)了2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的攝入。即表明在由八丈芹根的乙醇提取組分分化誘導(dǎo)的成熟脂肪細(xì)胞中，胰島素刺激可以促進(jìn)葡萄糖的攝入。這在圖15表示。圖15中，橫軸表示各樣品，縱軸表示2-脫氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量(dpm)。
實(shí)施例22八丈芹莖葉提取組分的制備向2g八丈芹莖葉的干燥粉末中加入40mL乙醇，在室溫下提取30分鐘，離心分離提取液和殘余物。接著對(duì)殘余物用30mL相同的溶劑重復(fù)2次提取操作。收集所得提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。最終，溶解于1mL二甲基亞砜中，得到八丈芹莖葉的乙醇提取組分。
實(shí)施例23八丈芹莖葉提取組分的向脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用按照實(shí)施例3的方法測(cè)定由實(shí)施例22制備的八丈芹莖葉的乙醇提取組分的向脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用(類胰島素活性)。
即，向各孔中添加八丈芹莖葉的乙醇提取組分的二甲基亞砜溶液，使終濃度為0.2、0.066、0.022％，以這些組作為樣品。以添加4μL5mg/mL胰島素(TAKARA BIO公司制)水溶液的組作為陽(yáng)性對(duì)照，以添加二甲基亞砜的組作為陰性對(duì)照。之后與實(shí)施例3的方法同樣地進(jìn)行培養(yǎng)基和樣品的更換，添加樣品7天后，測(cè)定細(xì)胞中的甘油三酯的生物合成量。
結(jié)果可見(jiàn)，各濃度的八丈芹莖葉的乙醇提取組分添加組誘導(dǎo)了甘油三酯的生物合成。即表明，八丈芹莖葉的乙醇提取組分有分化誘導(dǎo)為成熟脂肪細(xì)胞的作用。這在圖16中表示。圖16的橫軸表示各樣品，縱軸表示甘油三酯的生物合成量(μg/mL)。
實(shí)施例24八丈芹根部的乙醇提取組分的制備向200g八丈芹根部的干燥粉末中加入1升乙醇，在室溫下提取30分鐘，抽濾，然后分離為乙醇提取液和殘余物。接著對(duì)殘余物用1升相同的溶劑重復(fù)1次提取操作。收集所得提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。將所得濃縮物溶解于100mL橄欖油中，制成八丈芹根部的乙醇提取組分。
實(shí)施例25來(lái)自八丈芹黃色汁液的樣品的制備切割八丈芹莖部，由切割斷面收集黃色汁液。將所得汁液過(guò)濾，然后冷凍干燥，得到2g干燥粉末。向其中加入橄欖油，使其為10mL，制成來(lái)自八丈芹黃色汁液的樣品。
實(shí)施例26來(lái)自八丈芹的處理物對(duì)糖尿病改善的效果用II型糖尿病模型小鼠，對(duì)實(shí)施例24所得八丈芹根部的乙醇提取組分和實(shí)施例25所得來(lái)自八丈芹黃色汁液的樣品的病狀改善效果進(jìn)行研究。將雌性11周齡的KK-Ay小鼠(日本CLEA公司制)以5只為一組進(jìn)行試驗(yàn)。將懸浮、溶解于橄欖油中的各種樣品以5mL/kg每天一次連續(xù)強(qiáng)制口服給予。同樣地，將橄欖油以5mL/kg給予對(duì)照組。給予開(kāi)始前和給予第7天，由小鼠尾靜脈采血，通過(guò)簡(jiǎn)易血糖測(cè)定系統(tǒng)アキユチェクコンパクト(Roche Diagnostics公司制)測(cè)定血糖值。表明通過(guò)給予八丈芹根部的乙醇提取組分和來(lái)自八丈芹黃色汁液的樣品，血糖值顯著降低。另外。實(shí)驗(yàn)期間，體重和常規(guī)癥狀未見(jiàn)變化。
產(chǎn)業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供與胰島素水平或胰島素應(yīng)答異常有關(guān)的疾病的治療或預(yù)防用的藥物、食品、飲料或飼料，其特征在于含有來(lái)自傘形科植物的處理物作為有效成分。該藥物作為糖尿病或肥胖癥等與胰島素水平或胰島素應(yīng)答異常有關(guān)的疾病的治療藥物或預(yù)防藥物有效。另外，該食品或飲料通過(guò)作為日常飲料食品攝取，可改善與胰島素水平或胰島素應(yīng)答異常有關(guān)的疾病等癥狀等。因此，含有來(lái)自傘形科植物的處理物的功能性飲料食品通過(guò)其類胰島素作用，對(duì)維持生物體的內(nèi)穩(wěn)態(tài)有用。本發(fā)明還提供含有來(lái)自傘形科植物的處理物的類胰島素作用劑，該類胰島素作用劑對(duì)于胰島素的功能研究、與胰島素相關(guān)的疾病的藥物篩選有用。本發(fā)明也提供含有來(lái)自傘形科植物的處理物的細(xì)胞攝入葡萄糖促進(jìn)劑，該葡萄糖攝入促進(jìn)劑對(duì)于在治療或預(yù)防中需要促進(jìn)細(xì)胞攝入葡萄糖作用的疾病的治療或預(yù)防，該疾病的治療或預(yù)防用食品、飲料或飼料的制造，需要促進(jìn)葡萄糖攝入作用的疾病藥物的篩選有用。本發(fā)明也提供含有來(lái)自傘形科植物的處理物的向脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑，該分化誘導(dǎo)劑對(duì)于在治療或預(yù)防中需要分化誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞作用的疾病的治療或預(yù)防，該疾病的治療或預(yù)防用食品、飲料或飼料的制造，需要該分化誘導(dǎo)作用的疾病藥物的篩選有用。
權(quán)利要求
1.與胰島素水平或胰島素應(yīng)答異常有關(guān)的疾病的治療藥物或預(yù)防藥物，其特征在于含有來(lái)自傘形科植物的處理物作為有效成分。
2.權(quán)利要求1的治療藥物或預(yù)防藥物，其中傘形科植物是八丈芹、芹菜或歐芹。
3.類胰島素作用劑，其特征在于含有來(lái)自傘形科植物的處理物作為有效成分。
4.權(quán)利要求3的類胰島素作用劑，其中傘形科植物是八丈芹、芹菜或歐芹。
5.與胰島素水平或胰島素應(yīng)答異常有關(guān)的疾病的治療或預(yù)防用的食品、飲料或飼料，其特征在于含有來(lái)自傘形科植物的處理物作為有效成分。
6.權(quán)利要求5的食品、飲料或飼料，其中傘形科植物是八丈芹、芹菜或歐芹。
7.細(xì)胞攝入葡萄糖促進(jìn)劑，其特征在于含有來(lái)自傘形科植物的處理物作為有效成分。
8.權(quán)利要求7的葡萄糖攝入促進(jìn)劑，其中傘形科植物是八丈芹、芹菜或歐芹。
9.向脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑，其特征在于含有來(lái)自傘形科植物的處理物作為有效成分。
10.權(quán)利要求9的分化誘導(dǎo)劑，其中傘形科植物是八丈芹、芹菜或歐芹。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有來(lái)自傘形科植物的處理物作為有效成分的與胰島素水平或胰島素應(yīng)答異常有關(guān)的疾病的治療藥物或預(yù)防藥物、類胰島素作用劑、與胰島素水平或胰島素應(yīng)答異常有關(guān)的疾病的治療或預(yù)防用的食品、飲料或飼料、細(xì)胞攝入葡萄糖促進(jìn)劑、以及向脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑。
文檔編號(hào)A61K36/232GK1674926SQ0381950
公開(kāi)日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2003年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月9日
發(fā)明者榎龍嗣, 小川衣子, 大野木宏, 杉山勝美, 村木信子, 佐川裕章, 加藤郁之進(jìn) 申請(qǐng)人:寶生物工程株式會(huì)社