專(zhuān)利名稱(chēng)：含有淀粉樣β1－6抗原陣列的疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、病毒學(xué)、免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了包含有序重復(fù)抗原或抗原決定簇陣列的組合物，特別是Aβ1-6肽-VLP組合物。更具體地，本發(fā)明提供了包含病毒樣顆粒和與其結(jié)合的至少一個(gè)Aβ1-6肽的組合物。本發(fā)明也提供了用于產(chǎn)生此綴合物或有序重復(fù)陣列的方法。本發(fā)明組合物可用于阿爾茨海默氏病的治療性疫苗的生產(chǎn)和用作預(yù)防或治愈阿爾茨海默氏病及有效地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，特別是抗體免疫應(yīng)答的藥物。而且，本發(fā)明組合物特別可用于有效地誘導(dǎo)自身特異性免疫應(yīng)答。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默氏病(AD)是(65歲和更年長(zhǎng))老年人中癡呆的最常見(jiàn)原因，并且對(duì)于公眾健康是一個(gè)嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。例如，在美國(guó)，報(bào)道有4百萬(wàn)人患有這種疾病。預(yù)期該疾病的發(fā)病率將隨著人口老齡化而增加。
阿爾茨海默氏病的主要病理學(xué)征兆是與年齡有關(guān)的行為改變、β淀粉狀蛋白沉積為不溶斑塊(稱(chēng)為神經(jīng)炎斑塊或AD斑塊)、神經(jīng)元內(nèi)由τ蛋白質(zhì)組成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)和整個(gè)前腦的神經(jīng)元損失。除了在(65歲或更年長(zhǎng))老年發(fā)生的晚發(fā)性AD外，還有35和60歲之間發(fā)生的早發(fā)性AD，家族性AD(FAD)。AD病理學(xué)異常在FAD中比在晚發(fā)或散發(fā)性AD中更普遍、嚴(yán)重和早發(fā)生。APP基因、早老素(presenilin)1和早老素2基因中的突變與FAD相關(guān)。
如所述，阿爾茨海默氏病(AD)中的一個(gè)關(guān)鍵性事件是淀粉樣蛋白沉積為不溶性纖維塊(淀粉樣病變，amyloidogenesis)，產(chǎn)生了細(xì)胞外神經(jīng)炎斑塊和腦血管壁周?chē)某练e物(綜述參見(jiàn)Selkoe，D.J.(1999)Nature.399，A23-31)。盡管神經(jīng)炎斑塊和嗜剛果紅血管病含有其它蛋白質(zhì)諸如糖胺聚糖和載脂蛋白，但是這些沉積物的主要組分是淀粉樣β肽(Aβ)。Aβ從稱(chēng)為淀粉樣前體蛋白質(zhì)(APP)的大得多糖蛋白蛋白酶解切下，APP包括具有單疏水跨膜區(qū)和695-770個(gè)氨基酸的多種同種型。Aβ形成了長(zhǎng)度不超過(guò)43個(gè)氨基酸的一組肽，其顯示了相當(dāng)大的氨基和羧基末端異質(zhì)性(截短)及修飾(Roher，A.E.，Palmer，K.C.，Chau，V.，& Ball，M.J.(1988)J.CellBiol.107，2703-2716.Roher，A.E.，Palmer，K.C.，Yurewicz，E.C.，Ball，M.J.，& Greenberg，B.D.(1993)J.Neurochem.61，1916-1926)。主要的同種型是Aβ1-40和1-42。它具有形成β片層的高度傾向，而后者可聚集為原纖維，這最終導(dǎo)致淀粉樣蛋白質(zhì)。
Aβ肽在阿爾茨海默氏病神經(jīng)病理學(xué)中具有重要作用。Aβ肽的區(qū)域特異性細(xì)胞外積累伴隨著小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生(microgliosis)、細(xì)胞骨架改變、營(yíng)養(yǎng)不良性神經(jīng)炎和突觸損失。這些病理學(xué)改變被認(rèn)為與定義該疾病的認(rèn)知下降有關(guān)。
在EP 526’511中描述了在沒(méi)有任何佐劑且淀粉樣β蛋白質(zhì)或Aβ1-28與載體沒(méi)有任何連接的情況下，以多達(dá)10-2mg/劑量的量施用淀粉樣β蛋白質(zhì)，或者具體地是Aβ1-28，用于治療阿爾茨海默氏病。
其他人也已經(jīng)通過(guò)Aβ肽聯(lián)合佐劑進(jìn)行給藥的方式誘導(dǎo)了抗Aβ1-42的細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答。在阿爾茨海默氏病的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，動(dòng)物超量表達(dá)含有突變APP(717)V-F的人類(lèi)淀粉樣前體蛋白質(zhì)(PDAPP-小鼠；Johnson-Wood，K.等，Proc.Natl.Acad.USA 941550-1555，Games，D.等，Nature 373523-527(1995a))，引起了Aβ1-42超量產(chǎn)生并出現(xiàn)了斑塊、營(yíng)養(yǎng)不良性神經(jīng)炎、突觸前末端損失、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生。在最近研究中，據(jù)Schenk，D.等(Nature 400173-77(1999)和WO99/27944)的報(bào)道，在最初4次免疫中向6周齡PDAPP小鼠給藥混合有人類(lèi)中不能使用的強(qiáng)佐劑(CFA/IFA)的聚集Aβ1-42，接著在隨后免疫中，給藥PBS中聚集的Aβ1-42，基本上防止了斑塊形成和有關(guān)的營(yíng)養(yǎng)不良性神經(jīng)炎。相同作者還報(bào)道了利用相同策略免疫年長(zhǎng)小鼠(11月齡)也顯著地降低了阿爾茨海默氏病(AD)樣神經(jīng)病學(xué)的程度和進(jìn)展。在WO 99/27944的實(shí)施例III(抗確立的AD的治療效力的篩選)中報(bào)道了從利用上述策略免疫的小鼠獲得的脾細(xì)胞的增殖，表明通過(guò)接種方法誘導(dǎo)了Aβ1-42特異性T細(xì)胞。WO 9927944中報(bào)道了Aβ片段與山羊抗小鼠IgG的偶聯(lián)，以及在佐劑CFA/IFA存在的情況下用所述偶聯(lián)片段進(jìn)行的免疫。WO 99/27944中也公開(kāi)了包含與多肽諸如白喉毒素連接的Aβ片段的組合物在促進(jìn)抗Aβ免疫應(yīng)答中的用途。然而，沒(méi)有提供免疫數(shù)據(jù)。
已經(jīng)證明識(shí)別Aβ N末端(1-16)內(nèi)表位的單克隆抗體(抗體6C6)保護(hù)PC12細(xì)胞免受纖維性β淀粉樣蛋白的神經(jīng)毒性損害，并且體外使β淀粉樣蛋白解聚(Solomon B.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997))。也已證明抗Aβ1-28形成的單克隆抗體可以體外抑制β淀粉樣蛋白聚集(Solomon B.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996))。Frenkel等(J.Neuroimmunol.8885-90(1998))后來(lái)鑒定了兩個(gè)抗聚集抗體10D5和6C6的表位，即表位“EFRH”，也即Aβ3-6。相反，對(duì)Aβ1-7特異的抗體不能防止β淀粉樣蛋白聚集(Frenkel D.等，J.Neuroimmunol.95136-142(1999))。
Aβ1-42具有形成原纖維的性質(zhì)，并且實(shí)際上WO 99/27944中所述的疫苗組合物利用的是經(jīng)處理能形成聚集體的Aβ1-42。已經(jīng)證明這些原纖維對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物是毒性的(Yankner等.，Science 245417-420(1989))，并且當(dāng)將其注射到動(dòng)物大腦中時(shí)也觀察到了毒性作用(Sigurdson等，Neurobiol.Aging 17893-901(1996)；Sigurdson等，Neurobiol.Aging 18591-608(1997))。Walsh等，(Nature 416535-539(2002))報(bào)道了在細(xì)胞內(nèi)小泡中形成Aβ天然寡聚體。這些寡聚體在大鼠體內(nèi)抑制了長(zhǎng)期的強(qiáng)化作用(potentiation)，并且當(dāng)以在人類(lèi)大腦和腦脊髓液中發(fā)現(xiàn)的濃度存在時(shí)破壞了突觸可塑性。
在另一個(gè)研究中，Bard，F(xiàn).等.(Nature Medicine 6916-19(2000))報(bào)道了盡管相對(duì)適度的血清水平，但是抗Aβ1-42抗體的外周給藥能降低淀粉樣蛋白負(fù)擔(dān)。該研究利用了抗Aβ1-42多克隆抗體，或抗來(lái)源于Aβ不同區(qū)域的合成片段的單克隆抗體。因此，抗Aβ肽抗體的誘導(dǎo)具有作為阿爾茨海默氏病潛在治療法的希望。
WO99/27949中描述了與β淀粉樣斑塊有關(guān)的抗原(諸如β淀粉樣肽和Aβ1-40)的粘膜給藥。據(jù)說(shuō)粘膜給藥可以抑制與阿爾茨海默氏病有關(guān)的一些細(xì)胞因子應(yīng)答，并且增強(qiáng)與炎性應(yīng)答抑制有關(guān)的另一些細(xì)胞因子應(yīng)答，其中該炎性應(yīng)答與該疾病有關(guān)。據(jù)認(rèn)為通過(guò)“激發(fā)以抗炎性細(xì)胞因子模式為特征的T細(xì)胞”可以抑制炎性應(yīng)答。如WO9927949中所述適宜的抗原包括對(duì)AD特異并被人類(lèi)或動(dòng)物宿主的免疫T細(xì)胞識(shí)別的抗原。
WO 01/18169中描述了單克隆抗體所識(shí)別的Aβ表位與絲狀噬菌體外殼蛋白的融合。用在外殼蛋白VIII上顯示15mer表位VHEPHEFRHVALNPV(SEQ ID NO89)的絲狀噬菌體免疫小鼠，產(chǎn)生了識(shí)別Aβ1-16和Aβ1-40的抗體。利用Aβ肽在抑制性ELISA中證明了這點(diǎn)，并且發(fā)現(xiàn)用Aβ1-40抑制血清與Aβ1-16的結(jié)合具有1μM的IC50。然而，Solomon(WO 01/18169)沒(méi)有提示由帶有表位VHEPHEFRHVALNPV(SEQ ID NO89)的絲狀噬菌體引起的抗血清能結(jié)合AD淀粉樣斑塊或神經(jīng)炎斑塊。
利用不同于待激發(fā)的免疫應(yīng)答所要針對(duì)的抗原的序列進(jìn)行免疫有大量的缺點(diǎn)。首先，可以誘導(dǎo)針對(duì)抗原或抗原決定簇以外的序列部分的抗體。其次，在外源側(cè)翼序列元件背景中的抗原構(gòu)象可能不同于全長(zhǎng)抗原背景中的抗原構(gòu)象。因此，盡管可以激發(fā)與抗原交叉反應(yīng)的抗體，但是它們對(duì)抗原的結(jié)合可能是次最佳的。這樣激發(fā)的抗體的精確特異性也可能不對(duì)應(yīng)于抗抗原本身引起的抗體的特異性，因?yàn)楸砦恢写嬖诓煌谌L(zhǎng)Aβ上殘基的另外側(cè)鏈。最后，15mer氨基酸序列可以含有T細(xì)胞表位。WO 01/18169中也公開(kāi)了絲狀噬菌體外殼蛋白質(zhì)III上表位YYEFRH(SEQ ID NO90)的展示，其中每個(gè)噬菌體上通常只存在3-5個(gè)拷貝。當(dāng)使用感染性噬菌體作為用于免疫的載體時(shí)出現(xiàn)了幾個(gè)問(wèn)題。首先，對(duì)于大的免疫運(yùn)動(dòng)，大規(guī)模和足夠量生產(chǎn)感染劑是有問(wèn)題的。其次，疫苗中含有抗生素抗性基因的噬菌體DNA的存在也是有問(wèn)題的，并且是安全性問(wèn)題。最后，在使用非感染性噬菌體作為疫苗的情況下，大量噬菌體輻射的可行性和效力尚未解決。
WO 01/62284已經(jīng)描述了Aβ類(lèi)似物，其中修飾Aβ以包括T輔助細(xì)胞表位。用Aβ類(lèi)似物免疫具有人類(lèi)APP轉(zhuǎn)基因的TgRND8+小鼠比在沒(méi)有佐劑情況下用Aβ1-42免疫產(chǎn)生了高4到7.5倍的抗體效價(jià)。
最近的研究證明通過(guò)免疫接種誘導(dǎo)大腦淀粉樣蛋白沉積物減少有改進(jìn)認(rèn)知功能的潛力(Schenk，D.，等Nature 400173-177(1999)；Janus，C.等，Nature 408979-982(2000)；Morgan，D.等，Nature 408982-985(2000))。
用佐劑QS21中聚集的Aβ1-42免疫的患者的尸體解剖表明，存在T淋巴細(xì)胞腦膜腦炎和巨噬細(xì)胞對(duì)腦白質(zhì)的浸潤(rùn)(Nicoll，J.A.等，Nature Med.9448-452(2003))。
最近，出版物已經(jīng)報(bào)道了在用聚集的Aβ1-42和QS-21佐劑組成的疫苗AN1792免疫的患者中的18例腦膜腦炎(Orgogozo J.-M.等，Neurology6146-54(2003))。據(jù)報(bào)道T細(xì)胞活化是對(duì)該疾病負(fù)責(zé)的潛在機(jī)制，但在疾病和血清抗Aβ1-42效價(jià)之間沒(méi)有明顯的關(guān)系。
公認(rèn)單獨(dú)給藥純化的蛋白質(zhì)通常不足以激發(fā)強(qiáng)免疫應(yīng)答；分離的抗原一般必需與稱(chēng)為佐劑的輔助物質(zhì)一起施用。在這些佐劑中，施用的抗原可以免于被快速降解，并且佐劑可以造成抗原的低水平延長(zhǎng)釋放。在本發(fā)明中，Aβ肽通過(guò)結(jié)合VLP而具有免疫原性，并且不需要佐劑。
因此，改進(jìn)接種效率的一種方法是增加所施用抗原的重復(fù)程度。不同于分離的蛋白質(zhì)，在有和無(wú)T細(xì)胞輔助及不存在任何佐劑的情況下，病毒都可以誘導(dǎo)快速和有效的免疫應(yīng)答(Bachmann & Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol15235-270(1991))。盡管病毒常常由少數(shù)蛋白質(zhì)組成，但是它們能觸發(fā)比它們的分離成分強(qiáng)得多的免疫應(yīng)答。對(duì)于B細(xì)胞應(yīng)答，已知病毒免疫原性的一個(gè)至關(guān)重要的因素是表面表位的重復(fù)性和有序性。許多病毒顯示了準(zhǔn)晶體表面，該表面展示出一個(gè)有規(guī)則的表位陣列，這些表位可以有效地與B細(xì)胞上的表位特異性免疫球蛋白交聯(lián)(Bachmann &Zinkernagel，Immunol.Today 17553-558(1996))。與B細(xì)胞上表面免疫球蛋白的這種交聯(lián)是直接誘導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)程和IgM抗體產(chǎn)生的強(qiáng)活化信號(hào)。而且，這種觸發(fā)的B細(xì)胞能活化T輔助細(xì)胞，接著在B細(xì)胞中誘導(dǎo)從IgM到IgG抗體產(chǎn)生的轉(zhuǎn)換和長(zhǎng)壽記憶B細(xì)胞的產(chǎn)生——任何接種的目的(Bachmann & Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol15235-270(1997))。病毒結(jié)構(gòu)甚至可以與自身免疫病中抗-抗體的產(chǎn)生相聯(lián)系，作為針對(duì)病原體的天然應(yīng)答的一部分(參見(jiàn)，F(xiàn)ehr，T.等，J Exp.Med.1851785-1792(1997))。因此，通過(guò)高度有組織的病毒表面呈遞的抗體能誘導(dǎo)強(qiáng)抗-抗體應(yīng)答。
然而，如所述的，免疫系統(tǒng)通常不能產(chǎn)生抗來(lái)源于自身的結(jié)構(gòu)的抗體。對(duì)于低濃度存在的可溶抗原而言，這是由Th細(xì)胞水平上的耐受性所致。在這些條件下，將自身抗原與可以遞送T輔助的載體偶聯(lián)可以打破耐受性。對(duì)于高濃度存在的可溶蛋白質(zhì)或低濃度的膜蛋白質(zhì)，B和Th細(xì)胞可以是耐受性的。然而，B細(xì)胞的耐受性可能是可逆的(無(wú)反應(yīng)性)，并且可以通過(guò)施用偶聯(lián)外源載體的高度有組織形式的抗原來(lái)破壞(Bachmann&Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol15235-270(1997))。如2002年1月18日提交的，正在審查的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/050,902中所表明的，用包含與VLP結(jié)合的Aβ肽(Aβ1-15，Aβ1-27和Aβ33-42，其是小鼠的自身抗原)的組合物可以誘導(dǎo)強(qiáng)免疫應(yīng)答。具體地，結(jié)合RNA噬菌體Qβ VLP的上述人類(lèi)Aβ肽在人類(lèi)APP轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)了高Aβ特異性效價(jià)(實(shí)施例中所述)，這證明用結(jié)合VLP的Aβ肽免疫可以克服對(duì)自身抗原Aβ的耐受性。
因此，為了治療阿爾茨海默氏病，需要高免疫原性的安全組合物和疫苗，特別是，利用無(wú)可以激發(fā)副反應(yīng)的T細(xì)胞表位和佐劑但仍能誘導(dǎo)結(jié)合淀粉樣斑塊的高抗體效價(jià)的免疫原。
發(fā)明概述我們發(fā)現(xiàn)Aβ1-6肽與具有固有重復(fù)組織結(jié)構(gòu)的核心顆粒，特別是病毒樣顆粒(VLP)或VLP亞單位結(jié)合形成的高度有序和重復(fù)的綴合物，是用于誘導(dǎo)Aβ1-6特異性抗體的有效免疫原。因此，本發(fā)明提供了用于阿爾茨海默氏病治療的預(yù)防和治療手段，該手段基于有序和重復(fù)的Aβ1-6-核心顆粒陣列，特別是基于VLP-Aβ1-6肽綴合物或陣列。這種預(yù)防和治療劑能誘導(dǎo)高效價(jià)抗Aβ1-6肽抗體，該抗體與可溶Aβ交叉反應(yīng)，并且能結(jié)合人類(lèi)APP轉(zhuǎn)基因小鼠模型中的人類(lèi)淀粉樣斑塊以及結(jié)合AD淀粉樣斑塊。而且，此激發(fā)的抗體不與大腦切片上的APP結(jié)合。
此外，本發(fā)明提供了用于AD治療的新的組合物、疫苗和方法。包含Aβ1-6肽的此組合物和疫苗無(wú)T細(xì)胞表位，并且能誘導(dǎo)結(jié)合AD斑塊和可溶Aβ的抗體。通過(guò)使Aβ1-6肽結(jié)合核心顆粒，優(yōu)選地結(jié)合VLP，甚至更優(yōu)選地結(jié)合RNA噬菌體的VLP，Aβ1-6肽以高度重復(fù)和有序的方式被呈遞給患者的免疫系統(tǒng)。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗原或抗原決定簇是人類(lèi)淀粉樣β肽Aβ1-6(DAEFRH；SEQ ID NO75)，其是Aβ(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID NO91)的片段，其中人類(lèi)淀粉樣β肽Aβ1-6與核心顆?；騐LP結(jié)合。SEQ ID NO92中提供了淀粉樣β蛋白質(zhì)。SEQ ID NO93中提供了淀粉樣β前體蛋白。
因此，本發(fā)明提供了組合物，該組合物包含(a)具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的核心顆粒；和(b)至少一個(gè)具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇是Aβ1-6肽，并且其中所述第二附著位點(diǎn)選自(i)非天然存在于所述抗原或抗原決定簇中的附著位點(diǎn)；和(ii)所述抗原或抗原決定簇中天然存在的附著位點(diǎn)，其中所述第二附著位點(diǎn)能與所述第一附著位點(diǎn)締合(association)；并且其中所述抗原或抗原決定簇和所述核心顆粒通過(guò)所述締合相互作用以形成有序和重復(fù)的抗原陣列。適于本發(fā)明中使用的核心顆粒的優(yōu)選實(shí)施方式是病毒、病毒樣顆粒、噬菌體、RNA噬菌體的病毒樣顆粒，細(xì)菌菌毛或鞭毛或具有能形成本發(fā)明的有序和重復(fù)抗原陣列的固有重復(fù)結(jié)構(gòu)的任何其它核心顆粒。
本發(fā)明的Aβ片段是可溶的，并且一般地不形成團(tuán)聚體。而且，它們與核心顆?；騐LP結(jié)合，并且優(yōu)選地共價(jià)結(jié)合。因此，本發(fā)明組合物不具有誘導(dǎo)有毒作用，諸如作為淀粉樣沉積物的種子的危險(xiǎn)。
用包含結(jié)合核心顆?；騐LP的Aβ1-6肽的組合物可以獲得與可溶Aβ和AD淀粉樣斑塊交叉反應(yīng)的高效價(jià)抗體，這是本發(fā)明的意外發(fā)現(xiàn)。特別地，已經(jīng)證明VLP可以介導(dǎo)抗自身抗原的抗體誘導(dǎo)，由此破壞自身耐受性(WO 02/056905，這里整體將該文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容并入為參考文獻(xiàn))。而且，該表位的小尺寸也排除了T細(xì)胞表位的存在，因此提供了不誘導(dǎo)Aβ特異性T細(xì)胞應(yīng)答的新組合物。此外，所激發(fā)的抗體不結(jié)合大腦切片上的APP。因此，本發(fā)明提供了用于AD預(yù)防和治療的安全疫苗組合物。
更具體地，本發(fā)明提供了包含有序重復(fù)抗原或抗原決定簇陣列，特別是Aβ1-6肽-VLP綴合物的組合物。更具體地，本發(fā)明提供了包含病毒樣顆粒和與其結(jié)合的至少一個(gè)Aβ1-6肽的組合物。本發(fā)明也提供了用于產(chǎn)生此綴合物或有序重復(fù)陣列的方法。本發(fā)明組合物可以用于生產(chǎn)治療阿爾茨海默氏病的疫苗，和用做藥物以預(yù)防或治愈阿爾茨海默氏病和有效地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，特別是抗體應(yīng)答。而且，在本上下文中，本發(fā)明組合物尤其可用于有效地誘導(dǎo)自身特異性免疫應(yīng)答。
在本發(fā)明中，Aβ1-6肽典型地以定向方式結(jié)合核心顆粒或VLP，從而產(chǎn)生有序和重復(fù)的Aβ1-6肽抗原陣列。而且，核心顆?；騐LP的高度重復(fù)有組織結(jié)構(gòu)可以介導(dǎo)Aβ肽以高度有序的重復(fù)方式進(jìn)行展示，產(chǎn)生高度有組織的重復(fù)抗原陣列。而且，因?yàn)楹诵念w粒和VLP對(duì)用核心顆粒-Aβ1-6肽陣列或VLP-Aβ1-6肽陣列免疫的宿主是外源的，所以Aβ1-6肽與核心顆粒或VLP的結(jié)合也提供了T輔助細(xì)胞表位。這些陣列尤其在它們高度有組織的結(jié)構(gòu)、維度和陣列表面抗原的重復(fù)性方面不同于現(xiàn)有技術(shù)的綴合物。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，化學(xué)合成Aβ1-6肽，而從適于核心顆?；騐LP折疊和裝配的表達(dá)宿主中表達(dá)和純化核心顆粒或VLP。然后，通過(guò)Aβ1-6肽與核心顆粒或VLP的結(jié)合，裝配Aβ1-6肽陣列。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了組合物，該組合物包含(a)病毒樣顆粒，和(b)至少一個(gè)抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇是Aβ1-6肽，并且其中所述至少一個(gè)抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒結(jié)合。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，該藥物組合物包含(a)本發(fā)明組合物，和(b)可接受的藥物學(xué)載體。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含如下組合物的疫苗組合物，其中所述組合物包含(a)病毒樣顆粒；和(b)至少一個(gè)抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇是Aβ1-6肽；并且其中所述至少一個(gè)抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒結(jié)合。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了免疫方法，該方法包括向動(dòng)物施用本發(fā)明組合物、本發(fā)明藥物組合物或本發(fā)明疫苗。
在再一方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明組合物的方法，該方法包括(a)提供病毒樣顆粒；和(b)提供至少一個(gè)抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇是Aβ1-6肽；(c)混合所述病毒樣顆粒和所述至少一個(gè)抗原或抗原決定簇，使得所述至少一個(gè)抗原或抗原決定簇與所述病毒樣顆粒結(jié)合。
相似地，本發(fā)明提供了制備權(quán)利要求1的組合物的方法，該方法包括(a)提供具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的核心顆粒；(b)提供至少一個(gè)具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇是Aβ1-6肽；并且其中所述第二附著位點(diǎn)選自(i)非天然存在于所述抗原或抗原決定簇中的附著位點(diǎn)；和(ii)所述抗原或抗原決定簇中天然存在的附著位點(diǎn)；并且其中所述第二附著位點(diǎn)能締合所述第一附著位點(diǎn)；和(c)混合所述核心顆粒和所述至少一個(gè)抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇和所述核心顆粒通過(guò)所述締合相互作用以形成有序和重復(fù)的抗原陣列。
在另一方面，本發(fā)明提供了權(quán)利要求1的組合物用于制備治療阿爾茨海默氏病藥物的用途。
在另一方面，本發(fā)明提供了權(quán)利要求1的組合物用于制備預(yù)防或治療阿爾茨海默氏病的藥物的用途。而且，在另一方面，本發(fā)明提供了權(quán)利要求1的組合物單獨(dú)或聯(lián)合其它藥劑或者以明確缺少特殊物質(zhì)諸如佐劑的形式用于制備治療或預(yù)防阿爾茨海默氏病和/或刺激哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)的組合物、藥物組合物、疫苗、藥劑或藥物的用途。
因此，特別地，本發(fā)明提供了適于預(yù)防和/或減輕阿爾茨海默氏病或其相關(guān)病癥的疫苗組合物。本發(fā)明還提供了用于預(yù)防和/或減輕人類(lèi)的阿爾茨海默氏病或其相關(guān)病癥的免疫或接種方法?？梢灶A(yù)防地或治療地施用本發(fā)明組合物。
在
具體實(shí)施例方式
中，本發(fā)明提供了預(yù)防和/或減弱由“自身”基因產(chǎn)物，即這里所用的“自身抗原”引起或加重的阿爾茨海默氏病或其相關(guān)病癥的方法。在相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了在動(dòng)物或個(gè)體中誘導(dǎo)免疫學(xué)應(yīng)答的方法，該方法導(dǎo)致可以預(yù)防和/或減弱由“自身”基因產(chǎn)物引起或加重的阿爾茨海默氏病或其相關(guān)病癥的抗體產(chǎn)生。
如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的，當(dāng)向動(dòng)物或人類(lèi)給藥本發(fā)明組合物時(shí)，它們可以是含有鹽、緩沖液、佐劑或期望用于改進(jìn)組合物效力的其它物質(zhì)的組合物。大量的文獻(xiàn)包括Remington′s Pharmaceutical Sciences(Osol，A，編輯，Mack Publishing Co.(1990))中提供了適于在藥物組合物制備中使用的物質(zhì)的例子。
如果受體個(gè)體可以耐受本發(fā)明組合物的施用，那么稱(chēng)本發(fā)明組合物是“藥理學(xué)可接受的”。而且，將以“治療有效量”(即，產(chǎn)生期望的生理學(xué)作用的量)施用本發(fā)明組合物。
可以用本領(lǐng)域已知的各種方法給藥本發(fā)明組合物，但是正常地，通過(guò)注射、輸注、吸入、口服或其它適合的物理方法給藥。做為可替代方案，可以肌內(nèi)地、靜脈內(nèi)地、或皮下地給藥該組合物。用于給藥的組合物成分包括無(wú)菌水性(例如，生理鹽水)或非水性溶液和懸浮液。非水溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油諸如橄欖油和可注射的有機(jī)酯諸如油酸乙酯。載體或封閉敷料可以用于增加皮膚滲透性和增強(qiáng)抗原吸收。
基于本領(lǐng)域已知的現(xiàn)有技術(shù)、下面的附圖、本發(fā)明說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求，本發(fā)明的其它實(shí)施方式對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)。


圖1描述了還原條件下電泳的SDS-PAGE凝膠，表明Aβ1-6肽(NH2-DAEFRHGGC-CONH2)(SEQ ID NO77)與Qβ外殼蛋白的VLP偶聯(lián)的結(jié)果。
圖2表示在用偶聯(lián)Qβ外殼蛋白的VLP的Aβ1-6肽免疫的小鼠血清中，對(duì)Aβ1-6特異性抗體的ELISA分析。
圖3表示在用偶聯(lián)Qβ外殼蛋白的VLP的Aβ1-6肽免疫的小鼠血清中，對(duì)Aβ1-40特異性抗體的ELISA分析。
圖4A-B表示用偶聯(lián)Qβ外殼蛋白的VLP的Aβ1-6肽免疫的小鼠的血清染色的APP23小鼠大腦切片(A)和AD患者entorhinalcortex切片(B)。
圖5A-E表示用偶聯(lián)Qβ外殼蛋白VLP的Aβ1-6肽免疫的小鼠的血清或者用對(duì)人或小鼠APP之C末端特異的多克隆兔抗血清染色的APP23小鼠大腦切片。
圖6表示用ELISA試驗(yàn)測(cè)得的、用偶聯(lián)Qβ VLP的人類(lèi)Aβ1-6肽免疫恒河猴的結(jié)果。
圖7表示通過(guò)組織學(xué)在人類(lèi)AD和轉(zhuǎn)基因小鼠斑塊上測(cè)定到的、斑塊與血清的結(jié)合結(jié)果，其中所述血清來(lái)源于用偶聯(lián)Qβ VLP的人類(lèi)Aβ1-6肽免疫的猴子。
圖8描述了對(duì)鼠Aβ1-6與AP205 VLP偶聯(lián)的SDS-PAGE分析。
圖9表示ELISA中測(cè)定到的、用偶聯(lián)AP205的鼠Aβ1-6免疫小鼠的結(jié)果。
圖10表示在用QβhAβ1-6免疫的9.5至19個(gè)月齡的“Swedish/London”轉(zhuǎn)基因小鼠的血清中，抗Aβ40和抗Aβ42效價(jià)的ELISA分析。
圖11表示用QβhAβ1-6或PBS免疫的“Swedish/London”轉(zhuǎn)基因小鼠的大腦切片的免疫組織化學(xué)染色。
圖12表示在用QβhAβ1-6、Qβ或PBS免疫的9.5至19個(gè)月齡“Swedish/London”轉(zhuǎn)基因小鼠中對(duì)斑塊沉積物的定量。
圖13表示在用QβhAβ1-6或PBS免疫的13.5至19個(gè)月齡“Swedish/London”轉(zhuǎn)基因小鼠中對(duì)斑塊沉積物的定量。
圖14表示在用Qβh Aβ1-6免疫的“Swedish”轉(zhuǎn)基因小鼠血清中，針對(duì)抗Aβ40和抗Aβ42效價(jià)的ELISA分析。
圖15表示用Qβh Aβ1-6或PBS免疫的“Swedish”轉(zhuǎn)基因小鼠的大腦切片的免疫組織化學(xué)染色。
圖16表示在用Qβh Aβ1-6或PBS免疫的“Swedish”轉(zhuǎn)基因小鼠中對(duì)斑塊沉積物的定量。
發(fā)明詳述除非另外定義，這里所用的所有科技術(shù)語(yǔ)具有和本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的意思相同的意思。盡管在本發(fā)明實(shí)踐或試驗(yàn)中可以使用與這里所述相似或等同的任何方法和材料，但是，此后描述的是優(yōu)選的方法和材料。
1定義Aβ1-6肽這里所用的Aβ1-6肽指具有與人類(lèi)Aβ1-6序列相應(yīng)的序列或與人類(lèi)Aβ1-6序列同源的序列的肽。與人類(lèi)Aβ1-6序列同源的序列包括，但不限于其它物種的Aβ1-6序列，因此包括但不限于靈長(zhǎng)類(lèi)、兔子、豚鼠、光滑爪蟾(xenopus Laevis)、青蛙、小鼠和大鼠Aβ1-6序列。盡管來(lái)源于爪蟾或青蛙的Aβ1-6序列在兩個(gè)位置不同于人類(lèi)Aβ1-6，但是它們具有保守性突變(Ala-Ser，Phe-Tyr)，因此根據(jù)該定義認(rèn)為它們與Aβ1-6同源。然而，根據(jù)本發(fā)明，通常修飾Aβ1-6肽使得第二附著位點(diǎn)附著于其上。優(yōu)選地，用包含第二附著位點(diǎn)的接頭或氨基酸接頭修飾第二附著位點(diǎn)，以便結(jié)合核心顆?；騐LP。當(dāng)這里提到Aβ1-6肽時(shí)，應(yīng)該包括上述修飾的Aβ1-6肽，即具有附著于其上的第二附著位點(diǎn)的Aβ1-6肽。然而，通常地，本申請(qǐng)文件中明確地指出這種修飾。而且，隨著本說(shuō)明書(shū)的進(jìn)行，作為本發(fā)明抗原或抗原決定簇的Aβ1-6肽的其它優(yōu)選實(shí)施方式將變得顯而易見(jiàn)。
佐劑這里所用術(shù)語(yǔ)“佐劑”指免疫應(yīng)答的非特異性刺激物或允許在宿主中產(chǎn)生貯庫(kù)(depot)的物質(zhì)，當(dāng)其與本發(fā)明疫苗或藥物組合物聯(lián)合時(shí)可以提供更強(qiáng)的免疫應(yīng)答?？梢允褂酶鞣N佐劑。例子包括完全和不完全弗氏佐劑，氫氧化鋁和修飾的胞壁酰二肽。其它佐劑是礦物凝膠諸如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)諸如溶血卵磷脂、pluronie polyol、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔槭血藍(lán)蛋白、二硝基苯酚和潛在有用的人類(lèi)佐劑諸如BCG(卡介菌)和短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。這些佐劑也是本領(lǐng)域已知的?？梢耘c本發(fā)明組合物一起給藥的其它佐劑包括但不限于單磷酰脂質(zhì)免疫調(diào)節(jié)劑，AdjuVax 100a，QS-21，QS-18，CRL1005，鋁鹽(Alum)，MF-59，OM-174，OM-197，OM-294和病毒體佐劑技術(shù)。佐劑也可以包含這些物質(zhì)的混合物。
來(lái)源于南美洲樹(shù)Quillaja Saponaria Molina樹(shù)皮的具有佐劑活性的免疫學(xué)活性皂苷級(jí)分是本領(lǐng)域已知的。例如QS21，也稱(chēng)為QA21，是來(lái)源于Quillaja Saponaria Molina樹(shù)的Hplc純化級(jí)分，并且在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,057,540中公開(kāi)了它的生產(chǎn)方法(做為QA21)。Scott等，Int.Archs.AllergyAppl.Immun.，1985，77，409也公開(kāi)了Quillaja皂苷作為一種佐劑。單磷酰脂質(zhì)A和其衍生物是本領(lǐng)域已知的。優(yōu)選的衍生物是3-脫氧-酰化單磷酰脂質(zhì)A，見(jiàn)英國(guó)專(zhuān)利號(hào)2220211。WO00/00462中描述了其它優(yōu)選的佐劑，這里將這篇文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容并入為參考文獻(xiàn)。
然而，本發(fā)明有利的特征是本發(fā)明組合物高度的免疫原性。如這里已概述的或者隨著本說(shuō)明書(shū)的進(jìn)行將變得顯而易見(jiàn)的，本發(fā)明在備選的或優(yōu)選的實(shí)施方案中提供了無(wú)佐劑的疫苗和藥物組合物，從而產(chǎn)生了用于治療AD的疫苗和藥物組合物，該疫苗和藥物組合物無(wú)佐劑并且因此具有優(yōu)良的安全性質(zhì)，因?yàn)樽魟┛赡芤鸶弊饔?。在涉及用于治療AD的疫苗和藥物組合物時(shí)，這里所用的術(shù)語(yǔ)“無(wú)”指所使用的疫苗和藥物組合物沒(méi)有佐劑。
氨基酸接頭如這里所使用的，本說(shuō)明書(shū)中 “氨基酸接頭”，或也稱(chēng)為“接頭”在于連接第二附著位點(diǎn)與抗原或抗原決定簇，或者更優(yōu)選地，其已經(jīng)包含或含有第二附著位點(diǎn)，典型地，但不是必需地，所述第二附著位點(diǎn)為一個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選地為半胱氨酸殘基。然而，即使由氨基酸殘基組成的氨基酸接頭是本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，但是這里使用的術(shù)語(yǔ)“氨基酸接頭”并沒(méi)有意指這種氨基酸接頭專(zhuān)門(mén)地由氨基酸殘基組成。氨基酸接頭的氨基酸殘基優(yōu)選地由本領(lǐng)域已知的天然氨基酸或非天然氨基酸，全L或全D或其混合物組成。然而，包含具有巰基或半胱氨酸殘基的分子的氨基酸接頭也包括在本發(fā)明中。這種分子優(yōu)選地包含C1-C6烷基-、環(huán)烷基(C5，C6)、芳基或雜芳基組成部分。然而，除了氨基酸接頭外，優(yōu)選地包含C1-C6烷基-、環(huán)烷基-(C5，C6)、芳基或雜芳基組成部分并且無(wú)任何氨基酸的接頭也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)?？乖蚩乖瓫Q定簇或可選地第二附著位點(diǎn)和氨基酸接頭之間的連接優(yōu)選地通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵，更優(yōu)選地通過(guò)至少一個(gè)肽鍵進(jìn)行。
動(dòng)物這里使用的術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”意在包括例如人類(lèi)、綿羊、麋鹿、鹿、黑尾鹿、貂、哺乳動(dòng)物、猴子、馬、牛、豬、山羊、狗、貓、大鼠、小鼠、鳥(niǎo)、雞、爬行動(dòng)物、魚(yú)、昆蟲(chóng)和蛛形綱動(dòng)物。
抗體這里所用術(shù)語(yǔ)“抗體”指能結(jié)合表位或抗原決定簇的分子。該術(shù)語(yǔ)意在包括整個(gè)抗體和其抗原結(jié)合片段，包括單鏈抗體。最優(yōu)選地，抗體是人抗原結(jié)合抗體片段，并且包括，但不限于Fab，F(xiàn)ab′和F(ab′)2，F(xiàn)d，單鏈Fvs(scFv)，單鏈抗體，二硫鍵連接的Fvs(sdFV)及含有VL或VH結(jié)構(gòu)域的片段?？贵w可以來(lái)源于任何動(dòng)物來(lái)源，包括鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳動(dòng)物。優(yōu)選地，抗體是人、鼠、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞抗體。這里所用術(shù)語(yǔ)“人”抗體包括具有人類(lèi)免疫球蛋白氨基酸序列的抗體，并包括從人類(lèi)免疫球蛋白文庫(kù)分離的抗體或者從具有一種或多種人類(lèi)免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因并且不表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白的動(dòng)物分離的抗體，例如，參見(jiàn)Kucherlapati等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,939,598。
抗原這里所用術(shù)語(yǔ)“抗原”指能被抗體結(jié)合或者在被MHC分子呈遞后能被T細(xì)胞受體(TCR)結(jié)合的分子。這里所用術(shù)語(yǔ)“抗原”也包括T-細(xì)胞表位?？乖€能被免疫系統(tǒng)識(shí)別和/或能誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而激活B-和/或T-淋巴細(xì)胞。然而，這可能要求，至少在一些情況下，抗原含有或連接有Th細(xì)胞表位，并且在佐劑中給出。抗原可以有一個(gè)或多個(gè)表位(B-和T-表位)。上述特異性反應(yīng)意思是指抗原典型地以高度選擇性方式優(yōu)先地與其相應(yīng)抗體或TCR反應(yīng)，而不與可能由其它抗原激發(fā)的大量其它抗體或TCR反應(yīng)。這里所用抗原也可以是幾種單獨(dú)抗原的混合物。
抗原決定簇這里所用術(shù)語(yǔ)“抗原決定簇”意指B或T淋巴細(xì)胞特異地識(shí)別的抗原部分。B-淋巴細(xì)胞應(yīng)答抗原決定簇產(chǎn)生抗體，而T淋巴細(xì)胞通過(guò)增殖和建立對(duì)細(xì)胞和/或體液免疫的介導(dǎo)起決定作用的效應(yīng)子功能來(lái)應(yīng)答抗原決定簇。
締合(association)這里所用術(shù)語(yǔ)“締合”當(dāng)用于第一和第二附著位點(diǎn)時(shí)，指第一和第二附著位點(diǎn)的結(jié)合，優(yōu)選地通過(guò)至少一個(gè)非肽鍵結(jié)合。締合的性質(zhì)可以是共價(jià)的、離子的、疏水的、極性的或它們的任何組合，優(yōu)選地締合的性質(zhì)是共價(jià)的。
第一附著位點(diǎn)這里所用短語(yǔ)“第一附著位點(diǎn)”指非天然或天然來(lái)源的元件，位于抗原或抗原決定簇上的第二附著位點(diǎn)可以與其締合。第一附著位點(diǎn)可以是蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物，次生代謝物或化合物(生物素、熒光素、視黃醇、地高辛配基、金屬離子、苯甲基磺酰氟化合物)，或它們的聯(lián)合或者它們的化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)。通常地和優(yōu)選地，第一附著位點(diǎn)位于核心顆粒諸如，優(yōu)選地病毒樣顆粒的表面。多個(gè)第一附著位點(diǎn)通常以重復(fù)構(gòu)型存在于核心或病毒樣顆粒的表面。
第二附著位點(diǎn)這里所用短語(yǔ)“第二附著位點(diǎn)”指與抗原或抗原決定簇連接的元件，位于核心顆?；虿《緲宇w粒表面上的第一附著位點(diǎn)可以與其締合?？乖蚩乖瓫Q定簇的第二附著位點(diǎn)可以是蛋白質(zhì)、多肽、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次生代謝物或化合物(生物素、熒光素、視黃醇、地高辛配基、金屬離子、苯甲基磺酰氟化合物)，或它們的聯(lián)合或者它們的化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)。至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)存在于抗原或抗原決定簇上。因此，術(shù)語(yǔ)“具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的抗原或抗原決定簇”指包含至少該抗原或抗原決定簇和該第二附著位點(diǎn)的抗原或抗原性構(gòu)建體。然而，特別是對(duì)于非天然來(lái)源，即，不天然出現(xiàn)在抗原或抗原決定簇中的第二附著位點(diǎn)，這些抗原或抗原性構(gòu)建體包含“氨基酸接頭”。
結(jié)合這里所用術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”指可以是共價(jià)的(例如通過(guò)化學(xué)偶聯(lián))或非共價(jià)的(例如離子相互作用、疏水相互作用、氫鍵等)結(jié)合或附著。共價(jià)鍵可以是例如酯、醚、磷酸酯、酰胺、肽、二酰亞胺、碳-硫鍵、碳-磷鍵等等。術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”更廣義，并且包括術(shù)語(yǔ)諸如“偶聯(lián)”、“融合”和“附著”。
外殼蛋白這里所用術(shù)語(yǔ)“外殼蛋白”指能摻入噬菌體或RNA噬菌體的衣殼裝配物中的噬菌體或RNA噬菌體蛋白質(zhì)。然而，當(dāng)指RNA噬菌體外殼蛋白基因的具體基因產(chǎn)物時(shí)，使用術(shù)語(yǔ)“CP”。例如，RNA噬菌體Qβ外殼蛋白基因的具體基因產(chǎn)物稱(chēng)為“Qβ CP”，而噬菌體Qβ的“外殼蛋白”包括“Qβ CP”及A1蛋白質(zhì)。噬菌體Qβ的衣殼主要由Qβ CP組成，具有少量的A1蛋白質(zhì)。同樣地，VLP Qβ外殼蛋白主要包含Qβ CP，具有少量的A1蛋白質(zhì)。
核心顆粒這里所用術(shù)語(yǔ)“核心顆?！敝妇哂泄逃兄貜?fù)組織的剛性結(jié)構(gòu)。這里所用核心顆?？梢允呛铣蛇^(guò)程的產(chǎn)物或者是生物學(xué)過(guò)程的產(chǎn)物。
偶聯(lián)的這里所用術(shù)語(yǔ)“偶聯(lián)的”指通過(guò)共價(jià)鍵或通過(guò)強(qiáng)的非共價(jià)相互作用的附著，通常和優(yōu)選地指通過(guò)共價(jià)鍵的附著。本發(fā)明中可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員通常用于生物活性材料偶聯(lián)的任何方法。
有效量這里所用術(shù)語(yǔ)“有效量”指實(shí)現(xiàn)期望的生物學(xué)作用所必需的量或足以實(shí)現(xiàn)期望的生物學(xué)作用的量。組合物的有效量將是達(dá)到選定結(jié)果的量，并且該量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)地確定。例如，治療免疫系統(tǒng)缺陷的有效量可以是引起免疫系統(tǒng)活化所必需的量，一旦暴露于抗原，這種量將引起抗原特異性免疫應(yīng)答形成。該術(shù)語(yǔ)也與“足夠量”同義。
表位這里所用術(shù)語(yǔ)“表位”指在動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選人中，具有抗原或免疫原活性的多肽的連續(xù)或不連續(xù)部分。在MHC分子背景中表位可以被T細(xì)胞通過(guò)其T細(xì)胞受體識(shí)別，或者表位可以被抗體識(shí)別。這里所用術(shù)語(yǔ)“免疫原性表位”定義為通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行測(cè)定，可以在動(dòng)物中激發(fā)抗體應(yīng)答或誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的多肽部分(參見(jiàn)，例如，Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813998-4002(1983))。如這里所用術(shù)語(yǔ)“抗原性表位”定義為通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行測(cè)定，抗原蛋白質(zhì)中可以與抗體免疫特異性結(jié)合的部分。免疫特異性結(jié)合排除了非特異性結(jié)合，但是不一定排除與其它抗原的交叉反應(yīng)性?？乖员砦徊槐匾欢ㄊ敲庖咴缘?。抗原性表位也可以是T細(xì)胞表位，在這種情況下，它們可以在MHC背景下，免疫特異性地結(jié)合T細(xì)胞受體。
表位可以在表位獨(dú)特的空間構(gòu)象中包含3個(gè)氨基酸。一般地，表位由至少約5個(gè)這種氨基酸組成，更一般地，由至少約8-10個(gè)這種氨基酸組成。如果表位是有機(jī)分子，那么它可以如硝基苯基一樣小。
融合這里所用術(shù)語(yǔ)“融合”指不同來(lái)源的氨基酸序列通過(guò)它們的編碼核苷酸序列的讀框內(nèi)組合而在一個(gè)多肽鏈中組合。術(shù)語(yǔ)“融合”明確地包含內(nèi)部融合，即，不同來(lái)源的序列除了融合在多肽鏈一個(gè)末端外，還可以插入到多肽鏈中。
免疫應(yīng)答這里所用術(shù)語(yǔ)“免疫應(yīng)答”指引起B(yǎng)和/或T-淋巴細(xì)胞和/或抗原呈遞細(xì)胞激活或增殖的體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。然而，在一些情況下，免疫應(yīng)答可能具有低的強(qiáng)度，并且只有當(dāng)使用至少一種本發(fā)明物質(zhì)時(shí)才可檢測(cè)?！懊庖咴浴敝赣糜诖碳せ钌矬w免疫系統(tǒng)的試劑，由此免疫系統(tǒng)的一種或多種功能將被增強(qiáng)并且定向于此免疫原性劑?！懊庖咴远嚯摹笔窃谧魟┐嬖诨虿淮嬖诘那闆r下，單獨(dú)地或是以連接載體的形式激發(fā)細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答的多肽。優(yōu)選地，可以活化抗原呈遞細(xì)胞。
“增強(qiáng)”免疫應(yīng)答的物質(zhì)是這樣的一種物質(zhì)，即當(dāng)與沒(méi)有添加該物質(zhì)時(shí)測(cè)定的相同免疫應(yīng)答比較，添加該物質(zhì)時(shí)觀察到免疫應(yīng)答被增強(qiáng)或強(qiáng)化或發(fā)生偏離。例如，可以在免疫期間利用或不利用該物質(zhì)并獲取樣品，然后可以在樣品中利用51Cr釋放試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞毒性T細(xì)胞的裂解活性。與沒(méi)有該物質(zhì)時(shí)的CTL裂解活性比較，該物質(zhì)增強(qiáng)CTL裂解活性時(shí)的量稱(chēng)為足以增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的量。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，免疫應(yīng)答增強(qiáng)至少2倍，更優(yōu)選地增強(qiáng)至少約3倍或更多。也可以改變所分泌的細(xì)胞因子的量和類(lèi)型。做為可以替代的方案，可以改變誘導(dǎo)的抗體或其亞型的量。
免疫這里所用術(shù)語(yǔ)“免疫“或相關(guān)術(shù)語(yǔ)指賦予產(chǎn)生抗靶抗原或表位的實(shí)質(zhì)性免疫應(yīng)答(包括抗體和/或細(xì)胞免疫諸如效應(yīng)CTL)的能力。這些術(shù)語(yǔ)不要求產(chǎn)生完全的免疫，而是要求產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上比基線大的免疫應(yīng)答。例如，如果本發(fā)明方法應(yīng)用后，出現(xiàn)了對(duì)靶抗原的細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答，那么就認(rèn)為哺乳動(dòng)物被免疫了。
天然來(lái)源這里所用術(shù)語(yǔ)“天然來(lái)源”意指物質(zhì)的整體或其部分不是合成的，而是自然界中存在或產(chǎn)生的。
非天然的這里所用術(shù)語(yǔ)“非天然的”一般意指不是來(lái)源于自然界的，更具體地，該術(shù)語(yǔ)意指來(lái)源于人工的。
非天然來(lái)源這里所用術(shù)語(yǔ)“非天然來(lái)源”一般意指合成的或者不是來(lái)源于自然界的；更具體地，該術(shù)語(yǔ)意指來(lái)源于人工的。
有序和重復(fù)的抗原或抗原決定簇陣列這里所用術(shù)語(yǔ)“有序重復(fù)的抗原或抗原決定簇陣列”一般地指抗原或抗原決定簇的重復(fù)模式，其特征在于抗原或抗原決定簇相對(duì)于核心顆?；虿《緲宇w粒為一種典型地且優(yōu)選地一致的空間排列。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，重復(fù)模式可以是幾何學(xué)模式。適宜的有序重復(fù)抗原或抗原決定簇陣列的典型和優(yōu)選例子是具有嚴(yán)格重復(fù)的抗原或抗原決定簇次晶晶序的陣列，優(yōu)選地具有0.5到30納米晶面間距(spacing)，優(yōu)選地5到15納米晶面間距。
菌毛這里所用術(shù)語(yǔ)“菌毛”指細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)，其由組織成有序重復(fù)模式的蛋白質(zhì)單體(例如菌毛蛋白單體)組成。而且，菌毛是參與諸如細(xì)菌細(xì)胞附著宿主細(xì)胞表面受體、細(xì)胞間遺傳交換和細(xì)胞-細(xì)胞識(shí)別等過(guò)程的結(jié)構(gòu)。菌毛的例子包括類(lèi)型1菌毛、P菌毛、F1C菌毛、S菌毛和987P菌毛。下面列出了菌毛的其它例子。
菌毛樣結(jié)構(gòu)這里所用短語(yǔ)“菌毛樣結(jié)構(gòu)”指與菌毛具有相似特征并由蛋白質(zhì)單體組成的結(jié)構(gòu)?！熬珮咏Y(jié)構(gòu)”的一個(gè)例子是表達(dá)修飾的菌毛蛋白的細(xì)菌細(xì)胞形成的結(jié)構(gòu)，該修飾的菌毛蛋白不形成與天然菌毛相同的有序重復(fù)陣列。
多肽這里所用術(shù)語(yǔ)“多肽”指由通過(guò)酰胺鍵(也稱(chēng)為肽鍵)線性連接的單體(氨基酸)組成的分子。它指氨基酸的分子鏈，并且不指產(chǎn)物的特定長(zhǎng)度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽和蛋白質(zhì)都包括在多肽定義中。該術(shù)語(yǔ)也意指多肽的表達(dá)后修飾，例如糖基化、乙?；?、磷酸化等。重組或衍生多肽不一定從指定核酸序列翻譯而成。其也可以通過(guò)任何方法，包括化學(xué)合成來(lái)產(chǎn)生。
殘基這里所用術(shù)語(yǔ)“殘基”意指多肽主鏈或側(cè)鏈中具體的氨基酸。
自身抗原這里所用術(shù)語(yǔ)“自身抗原”指宿主DNA編碼的蛋白質(zhì)，并且通過(guò)宿主DNA編碼的蛋白質(zhì)或RNA產(chǎn)生的產(chǎn)物也定義為自身的。此外，由2種或幾種自身分子聯(lián)合產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，或者是作為自身分子一部分的蛋白質(zhì)，及與上述兩種自身分子具有高度同源性(＞95％，優(yōu)選地＞97％，更優(yōu)選地＞99％)的蛋白質(zhì)也可以認(rèn)為是自身的。
治療這里所用術(shù)語(yǔ)“治療”或“治療的”指預(yù)防和/或治療。例如，當(dāng)在感染性疾病方面使用該術(shù)語(yǔ)時(shí)，該術(shù)語(yǔ)指預(yù)防性治療(該預(yù)防性治療增加個(gè)體對(duì)病原體感染的抗性，或者換而言之，減少個(gè)體被病原體感染或個(gè)體顯示出由感染引起的病征的可能性)，以及個(gè)體感染后的治療(以戰(zhàn)勝感染，例如減少或消除感染或者防止其變得更嚴(yán)重)。
疫苗這里所用術(shù)語(yǔ)“疫苗”指含有本發(fā)明組合物并具有能向動(dòng)物給藥的形式的制劑。通常地，疫苗包含常規(guī)鹽水或緩沖水性溶液介質(zhì)，而本發(fā)明組合物懸浮或溶解于其中。以這種形式，可以方便地使用本發(fā)明組合物以預(yù)防、改善或治療病癥。一旦將該疫苗引入到宿主中，該疫苗就能激發(fā)免疫應(yīng)答，包括但不限于抗體和/或細(xì)胞因子的產(chǎn)生和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞的活化和/或其它細(xì)胞應(yīng)答。
可選地，本發(fā)明的疫苗還包含佐劑，該佐劑可以相對(duì)于本發(fā)明化合物以次要或主要比例存在。
病毒樣顆粒(VLP)這里所用術(shù)語(yǔ)“病毒樣顆?！敝割?lèi)似病毒顆粒的結(jié)構(gòu)。而且，本發(fā)明病毒樣顆粒由于缺少所有或部分病毒基因組，特別是病毒基因組中的復(fù)制和感染元件，所以它是非復(fù)制和非感染性的。本發(fā)明病毒樣顆?？梢院胁煌谄浠蚪M的核酸。本發(fā)明病毒樣顆粒的典型和優(yōu)選的實(shí)施方式是病毒衣殼，諸如病毒，噬菌體或RNA噬菌體的病毒衣殼。這里可交換地使用的術(shù)語(yǔ)“病毒衣殼”和“衣殼”指由病毒蛋白質(zhì)亞單位組成的大分子裝配物。典型并優(yōu)選地，病毒蛋白質(zhì)亞單位裝配成病毒衣殼或衣殼，所述衣殼的結(jié)構(gòu)具有固有的重復(fù)組織，其中所述結(jié)構(gòu)通常是球形或管狀。例如，RNA噬菌體或HBcAg的衣殼具有二十面對(duì)稱(chēng)的球形。這里所用術(shù)語(yǔ)“衣殼樣結(jié)構(gòu)”指由病毒蛋白質(zhì)亞單位組成的大分子裝配物，其形態(tài)類(lèi)似上述意義的衣殼，但是偏離典型的對(duì)稱(chēng)裝配，而是維持了足夠程度的有序和重復(fù)性。
噬菌體的病毒樣顆粒這里所用術(shù)語(yǔ)“噬菌體的病毒樣顆粒”指類(lèi)似噬菌體結(jié)構(gòu)的病毒樣顆粒，其是非復(fù)制和非感染性的，并且缺少至少一種或多種編碼噬菌體復(fù)制機(jī)器的基因，并且典型地也缺少一種或多種編碼負(fù)責(zé)病毒附著或進(jìn)入到宿主中的蛋白質(zhì)的基因。然而，該定義也應(yīng)該包括這樣的噬菌體病毒樣顆粒，其中前述一種或多種基因仍舊存在但是已失活，因此也導(dǎo)致非復(fù)制和非感染性的噬菌體病毒樣顆粒。
RNA噬菌體外殼蛋白的VLP從RNA噬菌體外殼蛋白的180個(gè)亞單位自裝配形成的、可選地含有宿主RNA的衣殼結(jié)構(gòu)稱(chēng)為“RNA噬菌體外殼蛋白的VLP”。一個(gè)具體例子是Qβ外殼蛋白的VLP。在這種特定情況下，Qβ外殼蛋白的VLP可以僅由Qβ CP亞單位裝配(Qβ CP亞單位通過(guò)Qβ CP基因表達(dá)產(chǎn)生，該基因含有例如TAA終止密碼子，從而通過(guò)阻抑作用排除了更長(zhǎng)A1蛋白質(zhì)的任何表達(dá)，參見(jiàn)Kozlovska，T.M.，等，Intervirology 399-15(1996))，或者還可以在衣殼裝配物中含有A1蛋白質(zhì)亞單位。
病毒顆粒這里所用術(shù)語(yǔ)“病毒顆粒”指病毒的形態(tài)學(xué)形式。在一些病毒類(lèi)型中，它包括蛋白質(zhì)衣殼環(huán)繞的基因組；其它病毒還具有另外的結(jié)構(gòu)(例如，包膜，尾等)。
一個(gè)/一種除非另有說(shuō)明，當(dāng)在本公開(kāi)中使用術(shù)語(yǔ)“一個(gè)/一種”時(shí)，它們意指“至少一個(gè)/一種”或者“一個(gè)/種或多個(gè)/種”。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員所清楚的，本發(fā)明一些實(shí)施方式涉及到使用重組核酸技術(shù)諸如克隆、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、DNA和RNA的純化、原核生物和真核生物細(xì)胞中重組蛋白質(zhì)的表達(dá)等。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且在出版的實(shí)驗(yàn)室方法手冊(cè)中可以方便地找到(例如，Sambrook，J.等，編輯，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel，F(xiàn).等，編輯，Current Protocols in Molecular Biology，John H.Wiley&Sons，Inc.(1997))。在文獻(xiàn)中也充分描述了與組織培養(yǎng)細(xì)胞系有關(guān)的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)(Celis，J.，編輯，Cell Biology，Academic Press，第二版，(1998))和抗體技術(shù)(Harlow，E.和Lane，D.，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988)；Deutscher，M.P.，″Guide to Protein Purification，″Meth.Enzymol.128，Academic Press SanDiego(1990)；Scopes，R.K.，Protein Purification Principles and Practice，第三版，Springer-Verlag，New York(1994))，這里將這些文獻(xiàn)并入為參考文獻(xiàn)。
2.增強(qiáng)免疫應(yīng)答的組合物和方法本公開(kāi)的發(fā)明提供了用于在動(dòng)物中誘導(dǎo)抗Aβ1-6肽免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)能結(jié)合Aβ淀粉樣斑塊和可溶Aβ的抗體的組合物和方法。本發(fā)明組合物包含，或者可替代地其組成為(a)具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的核心顆粒；和(b)至少一個(gè)具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇是Aβ1-6肽，并且其中所述第二附著位點(diǎn)選自(i)非天然存在于所述抗原或抗原決定簇中的附著位點(diǎn)；和(ii)所述抗原或抗原決定簇中天然存在的附著位點(diǎn)，其中所述第二附著位點(diǎn)能與所述第一附著位點(diǎn)締合；并且其中所述抗原或抗原決定簇和所述核心顆粒通過(guò)所述締合相互作用以形成有序和重復(fù)的抗原陣列。更具體地，本發(fā)明組合物包含或者可替代地其組成為病毒樣顆粒和至少一個(gè)抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇是Aβ1-6肽，并且其中所述至少一個(gè)抗原或抗原決定簇與病毒樣顆粒結(jié)合以形成有序和重復(fù)的抗原-VLP陣列。而且，本發(fā)明能使實(shí)施者方便地構(gòu)建這種組合物，特別是用于阿爾茨海默氏病治療和/或預(yù)防。本申請(qǐng)范圍中的病毒樣顆粒指類(lèi)似于病毒顆粒但是沒(méi)有致病性的結(jié)構(gòu)。一般地，病毒樣顆粒缺少病毒基因組，因此是非感染性的。而且，通過(guò)異源表達(dá)可以大量產(chǎn)生病毒樣顆粒，并且可以容易地進(jìn)行純化。
在一個(gè)實(shí)施方式中，核心顆粒包含或者選自病毒、細(xì)菌菌毛、從菌毛蛋白形成的結(jié)構(gòu)、噬菌體、病毒樣顆粒、RNA噬菌體病毒樣顆粒、病毒衣殼顆粒或其重組形式。本領(lǐng)域已知的具有有序和重復(fù)外殼和/或核心蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的任何病毒都可以選作本發(fā)明的核心顆粒；適宜病毒的例子包括新培斯病毒和其它甲病毒，彈狀病毒(例如，水泡性口膜炎病毒)，細(xì)小核糖核酸病毒(例如人鼻病毒，Aichi病毒)，披膜病毒(例如，風(fēng)疹病毒)，正粘病毒(例如，Thogoto病毒，Batken病毒，家禽瘟疫病毒)，多瘤病毒(例如，多瘤病毒BK，多瘤病毒JC，禽多瘤病毒BFDV)，細(xì)小病毒，輪狀病毒，諾沃克病毒，口蹄疫病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒，乙型肝炎病毒，煙草花葉病毒，F(xiàn)lockHouse Virus，和人乳頭瘤病毒，并且優(yōu)選RNA噬菌體，噬菌體Qβ，噬菌體R17，噬菌體M11，噬菌體MX1，噬菌體NL95，噬菌體fr，噬菌體GA，噬菌體SP，噬菌體MS2，噬菌體f2，噬菌體PP7(例如，參見(jiàn)Bachmann，M.F.和Zinkernagel，R.M.，Immunol.Today 17553-558(1996)中的表1)。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明利用病毒基因工程，在有序和重復(fù)的病毒包膜蛋白和第一附著位點(diǎn)之間產(chǎn)生融合，所述第一附著位點(diǎn)包含或者可替代地或優(yōu)選地其是選定的異源蛋白質(zhì)、肽、抗原決定簇或反應(yīng)性氨基酸殘基。本發(fā)明組合物的構(gòu)建還可能使用本領(lǐng)域已知的其它基因操作；例如，可能期望通過(guò)基因突變限制重組病毒的復(fù)制能力。而且，由于化學(xué)或物理失活作用，或者如所述，由于缺少能復(fù)制的基因組，本發(fā)明所用病毒不能復(fù)制。選定用于和第一附著位點(diǎn)融合的病毒蛋白質(zhì)應(yīng)該具有有組織的重復(fù)結(jié)構(gòu)。這種有組織的重復(fù)結(jié)構(gòu)包括病毒表面上的準(zhǔn)晶體組織，具有5-30nm，優(yōu)選地5-15nm晶面間距。這種類(lèi)型融合蛋白質(zhì)的產(chǎn)生將在病毒表面上導(dǎo)致許多有序重復(fù)的第一附著位點(diǎn)，并且反映天然病毒蛋白質(zhì)的正常組織。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，第一附著位點(diǎn)可以是任何適宜的蛋白質(zhì)、多肽、糖、多核苷酸、肽(氨基酸)、天然或合成聚合物、次級(jí)代謝物或它們的聯(lián)合，或者它們的一部分，它們可以用來(lái)特異性附著抗原或抗原決定簇，從而形成有序和重復(fù)抗原陣列。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式中，核心顆粒是重組甲病毒，并且更具體地，是重組新培斯病毒。甲病毒是正鏈RNA病毒，它們?cè)诟腥炯?xì)胞的胞質(zhì)中完整地復(fù)制它們的基因組RNA，并且沒(méi)有DNA中間體(Strauss，J.和Strauss，E.，Microbiol.Rev.58491-562(1994))。甲病毒科的幾個(gè)成員，新培斯病毒(Xiong，C.等，Science 2431188-1191(1989)；Schlesinger，S.，Trends Biotechnol.1118-22(1993))，塞姆利基森林病毒(Semliki forestvirus，SFV)(Liljestrm，P.& Garoff，H.，Bio/Technology 91356-1361(1991))和其它病毒(Davis，N.L.等，Virology 171189-204(1989))已經(jīng)接受了相當(dāng)多的關(guān)注，其被用做各種不同蛋白質(zhì)的病毒基表達(dá)載體(Lundstrom，K.，Curr.Opin.Biotechnol.8578-582(1997)；Liljestrm，P.，Curr.Opin.Biotechnol.5495-500(1994))和用做疫苗研制的候選者。最近，已經(jīng)授予了涉及甲病毒在異源蛋白質(zhì)表達(dá)和疫苗研制中的用途的大量專(zhuān)利(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,766,602；5,792,462；5,739,026；5,789,245和5,814,482)。如這里并入為參考文獻(xiàn)的前述文獻(xiàn)所述，通過(guò)重組DNA技術(shù)領(lǐng)域一般已知的方法，可以構(gòu)建本發(fā)明的甲病毒核心顆粒。
可以使用各種不同的重組宿主細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生用于抗原或抗原決定簇附著的基于病毒的核心顆粒。例如，已知甲病毒具有廣泛的宿主范圍；新培斯病毒感染培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物和兩棲動(dòng)物細(xì)胞及一些昆蟲(chóng)細(xì)胞(Clark，H.，J.Natl.Cancer Inst.51645(1973)；Leake，C.，J.Gen.Virol.35335(1977)；Stollar，V.in THE TOGAVIRUSES，R.W.Schlesinger，編輯，Academic Press，(1980)，583-621頁(yè))。因此，在本發(fā)明實(shí)踐中可以使用多種重組宿主細(xì)胞。BHK，COS，Vero，HeLa和CHO細(xì)胞特別適于異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，因?yàn)樗鼈冇袧撃芤耘c人類(lèi)細(xì)胞相似的方式糖基化異源蛋白質(zhì)(Watson，E.等，Glycobiology 4227，(1994))，并且可以經(jīng)選擇(Zang，M.等，Bio/Technology 13389(1995))或者基因工程改造(Renner W.等，Biotech.Bioeng.4476(1995)；Lee K.等.Biotech.Bioeng.50336(1996))在無(wú)血清培養(yǎng)基中及懸浮液中生長(zhǎng)。
通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(參見(jiàn)，例如Sambrook，J.等，編輯，MOLECULARCLONING，A LABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，9章；Ausubel，F(xiàn).等，編輯，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John H.Wiley &Sons，Inc.(1997)，16章)中所述方法，包括諸如電穿孔、DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染、顯微注射、陽(yáng)離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、scrape loading、生物彈道引入和感染，可以實(shí)現(xiàn)將多核苷酸載體引入到宿主細(xì)胞中。在Felgner，P.等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,580,859中討論了將外源DNA序列引入到宿主細(xì)胞中的方法。
包裝的RNA序列也可以用于感染宿主細(xì)胞。可以通過(guò)將這些包裝的RNA序列添加到培養(yǎng)基中，以便將其引入宿主細(xì)胞中。例如，在大量文獻(xiàn)，包括“新培斯病毒表達(dá)系統(tǒng)”，C版本(Invitrogen目錄號(hào).K750-1)中描述了非感染性甲病毒顆粒的制備。
當(dāng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞用作產(chǎn)生基于病毒的核心顆粒的重組宿主細(xì)胞時(shí)，一般地，將在組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)這些細(xì)胞。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)，例如Celis，J.，編輯，CELL BIOLOGY，Academic Press，第二版，(1998)；Sambrook，J.等，編輯，MOLECULAR CLONING，ALABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel，F(xiàn).等，編輯，CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John H.Wiley&Sons，Inc.(1997)；Freshney，R.，CULTURE OF ANIMAL CELLS，Alan R.Liss，Inc.(1983))。
適于用做本發(fā)明核心顆粒的其它RNA病毒例子包括，但不限于下面的病毒呼腸病毒科成員，包括正呼腸病毒屬(哺乳動(dòng)物和禽逆轉(zhuǎn)錄病毒的多種血清型)，環(huán)狀病毒屬(藍(lán)舌病病毒，Eugenangee病毒，Kemerovo病毒，非洲馬瘟病毒和科羅拉多蜱傳熱病毒)，輪狀病毒屬(人類(lèi)輪狀病毒，內(nèi)布拉斯加小牛腹瀉病毒，鼠輪狀病毒，猿猴輪狀病毒，牛或綿羊輪狀病毒，禽輪狀病毒)；小RNA病毒科，包括腸道病毒屬(脊髓灰質(zhì)炎病毒，柯薩奇病毒A和B，埃可病毒(ECHO)，甲、丙、丁、戊和已型肝炎病毒，猿猴腸道病毒，鼠科腦脊髓炎(ME)病毒，Poliovirus muris，牛腸道病毒，豬腸道病毒)，心病毒屬(腦心肌炎病毒(EMC)，Mengovirus)，鼻病毒屬(人類(lèi)鼻病毒，包含至少113種亞型；其它鼻病毒)，Apthovirus屬(口蹄疫病毒(FMDV)；Calciviridae科，包括豬水皰疹病毒，San Miguel海獅病毒，貓小RNA病毒和諾沃克病毒；披膜病毒科，包括甲病毒屬(東方馬腦炎病毒，Semlikforest病毒，新培斯病毒，屈曲病毒，，O′N(xiāo)yong-Nyong病毒，羅斯河病毒，委內(nèi)端拉馬腦炎病毒，西部馬腦炎病毒)，黃病毒屬(蚊傳播的黃熱病毒，登革病毒，日本腦炎病毒，St.Louis腦炎病毒，Murray河谷腦炎病毒，西尼羅病毒，Kunjin病毒，中歐蜱傳病毒，遠(yuǎn)東蜱傳病毒，Kyasanur森林病毒，羊跳躍病III病毒，Powassan病毒，Omsk出血熱病毒)，風(fēng)疹病毒屬(風(fēng)疹病毒)，瘟病毒屬(粘膜病病毒，豬霍亂病毒，Border disease病毒)；布尼亞病毒科，包括布尼亞病毒屬(Bunyamwera病毒和相關(guān)病毒，加利福尼亞腦炎病毒組)，白蛉病毒屬(白蛉熱Sicillian病毒，山谷熱病毒)，納伊羅病毒屬(克里米亞-剛果出血熱病毒，內(nèi)羅畢綿羊病病毒)，和烏庫(kù)病毒屬(Uukuniemi和相關(guān)病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒屬(甲型流感病毒，許多人類(lèi)亞型)，豬流感病毒，禽和馬流感病毒，乙型流感病毒(許多人類(lèi)亞型)，和丙型流感病毒(可能單獨(dú)的屬)；副粘病毒科，包括副粘病毒屬(1型副流感病毒，仙臺(tái)病毒，血細(xì)胞吸附病毒，副流感病毒2到5型，新城疫病毒，腮腺炎病毒)，麻疹病毒屬(麻疹病毒，亞急性硬化全腦炎病毒，犬瘟病毒，牛瘟病毒)，肺病毒屬(呼吸道合胞病毒(RSV)，牛呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒)；森林病毒，新培斯病毒，屈曲病毒，O′N(xiāo)yong-Nyong病毒，羅斯河病毒，委內(nèi)端拉馬腦炎病毒，西部馬腦炎病毒)，黃病毒屬(蚊傳播的黃熱病毒，登革病毒，日本腦炎病毒，St.Louis腦炎病毒，Murray河谷腦炎病毒，西尼羅病毒，Kunjin病毒，中歐蜱傳病毒，遠(yuǎn)東蜱傳病毒，Kyasanur森林病毒，羊跳躍病III病毒，Powassan病毒，Omsk出血熱病毒)，風(fēng)疹病毒屬(風(fēng)疹病毒)，瘟病毒屬(粘膜病病毒，豬霍亂病毒，Boder disease病毒)；布尼亞病毒科，包括布尼亞病毒屬(Bunyamwera和相關(guān)病毒，加利福尼亞腦炎病毒組)，白蛉病毒屬(白蛉熱Sicillian病毒，山谷熱病毒)，納伊羅病毒屬(克里米亞-剛果出血熱病毒，內(nèi)羅畢綿羊病病毒)，和烏庫(kù)病毒屬(Uukuniemi和相關(guān)病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒屬(甲型流感病毒，許多人類(lèi)亞型)；豬流感病毒，禽和馬流感病毒；乙型流感病毒(許多人類(lèi)亞型)，和丙型流感病毒(可能單獨(dú)的屬)；副粘病毒科，包括副粘病毒屬(副流感病毒1型，仙臺(tái)病毒，血細(xì)胞吸附病毒，副流感病毒2到5型，新城疫病毒，腮腺炎病毒)，麻疹病毒屬(麻疹病毒，亞急性硬化全腦炎病毒，犬瘟病毒，牛瘟病毒)，肺病毒屬(呼吸道合胞病毒(RSV)，牛呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒)；彈狀病毒科，包括水泡性病毒(VSV)屬，Chandipura病毒，F(xiàn)landers-Hart Park病毒)，狂犬病毒屬(狂犬病病毒)，魚(yú)類(lèi)彈狀病毒和線狀病毒(馬爾堡病毒和埃博拉病毒)；沙粒病毒科，包括淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCM)，Tacaribe病毒復(fù)合物和拉沙病毒；冠狀病毒科，包括傳染性支氣管炎病毒(IBV)，小鼠肝炎病毒，人類(lèi)腸冠狀病毒和貓傳染性腹膜炎(貓冠狀病毒)。
可以用做核心顆粒的示例性DNA病毒包括，但不限于痘病毒科，包括正痘病毒屬(大天花，類(lèi)天花，猴痘痘苗，牛痘，Buffalopox，野兔痘，Ectromelia)，野兔痘病毒屬(粘液瘤，纖維瘤)，禽痘病毒屬(禽痘病毒，其它禽類(lèi)痘病毒)，山羊痘病毒屬(綿羊痘，山羊痘)，豬痘病毒屬(豬痘)，副痘病毒屬(傳染性小膿皰皮炎病毒，假牛痘，牛丘疹性口炎病毒)；虹彩病毒科(非洲豬熱病毒，蛙病毒2和3，魚(yú)淋巴囊腫病毒)；皰疹病毒科，包括α-皰疹病毒(單純皰疹1和2型，水痘-帶狀皰疹病毒，馬流產(chǎn)病毒，馬皰疹病毒2和3，假狂犬病毒，傳染性牛角膜結(jié)膜炎病毒，傳染性牛鼻氣管炎病毒，貓鼻氣管炎病毒，傳染性喉氣管炎病毒)；β-皰疹病毒(人巨細(xì)胞病毒和豬、猴和嚙齒動(dòng)物的巨細(xì)胞病毒)；γ-皰疹病毒(EB病毒(EBV)，馬立克氏病病毒，松鼠猴皰疹病毒，Herpesvirus ateles，Herpesvirussylvilagus，豚鼠皰疹病毒，Lucke腫瘤病毒)；腺病毒科，包括Mastadenovirus屬(人類(lèi)亞組A，B，C，D和E及未分組的；猿猴腺病毒(至少23種血清型)，犬傳染性肝炎，和牛、豬、綿羊、青蛙和許多其它物種的腺病毒，禽腺病毒屬(禽類(lèi)腺病毒)；和不可培養(yǎng)的腺病毒；乳多空病毒科，包括乳頭瘤病毒屬(人乳頭瘤病毒，牛乳頭瘤病毒，兔乳頭瘤病毒和其它物種的各種致病性乳頭瘤病毒)，多瘤病毒屬(多瘤病毒，猿猴空泡病毒(SV-40)，野兔空泡病毒(RKV)，K病毒，BK病毒，JC病毒，和其它靈長(zhǎng)類(lèi)多瘤病毒諸如嗜淋巴細(xì)胞乳頭瘤病毒)；細(xì)小病毒科，包括腺相關(guān)病毒屬，細(xì)小病毒屬(貓泛白細(xì)胞減少病毒，牛細(xì)小病毒，犬細(xì)小病毒，阿留申貂病病毒等)。最后，DNA病毒可以包括諸如慢性傳染性神經(jīng)病病毒(CHINA病毒)之類(lèi)的病毒。
在其它實(shí)施方式中，細(xì)菌菌毛蛋白、細(xì)菌菌毛蛋白的亞部分，或者含有細(xì)菌菌毛蛋白或其亞部分的融合蛋白質(zhì)被用于制備本發(fā)明組合物或疫苗組合物。菌毛蛋白的例子包括由大腸桿菌(Escherichia coli)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)、施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)產(chǎn)生的菌毛蛋白。適于本發(fā)明使用的菌毛蛋白氨基酸序列包含GenBank報(bào)道AJ000636，AJ132364，AF229646，AF051814，AF051815和X00981中所述氨基酸序列，這里將這些文獻(xiàn)所有公開(kāi)的內(nèi)容并入為參考文獻(xiàn)。
在將細(xì)菌菌毛蛋白輸出到細(xì)菌外周質(zhì)以前，通常加工該蛋白質(zhì)以移除N末端前導(dǎo)序列。而且，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的，用于制備本發(fā)明組合物或疫苗組合物的細(xì)菌菌毛蛋白通常將沒(méi)有天然存在的前導(dǎo)序列。
適于本發(fā)明使用的菌毛蛋白的一個(gè)具體例子是大腸桿菌(E.coli)P菌毛蛋白(GenBank報(bào)道AF237482(SEQ ID NO1))。適于本發(fā)明使用的類(lèi)型1大腸桿菌菌毛蛋白的一個(gè)例子是具有GenBank報(bào)道P04128(SEQ IDNO2)中所述氨基酸序列的菌毛蛋白，其由具有GenBank報(bào)道M27603(SEQ ID NO3)中所述核苷酸序列的核酸編碼。這里將這些GenBank報(bào)道所有公開(kāi)的內(nèi)容并入為參考文獻(xiàn)。而且，一般地，上述蛋白質(zhì)的成熟形式將被用于制備本發(fā)明的組合物或疫苗組合物。
適于本發(fā)明實(shí)踐中使用的細(xì)菌菌毛蛋白或菌毛蛋白亞部分一般將能締合以形成有序和重復(fù)的抗原陣列。
體外制備菌毛和菌毛樣結(jié)構(gòu)的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，Bullitt等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9312890-12895 (1996)描述了大腸桿菌(E.coli)P菌毛亞單位的體外重建。而且，Eshdat等，J.Bacteriol.148308-314 (1981)描述了適于解離大腸桿菌類(lèi)型1菌毛和重建菌毛的方法。簡(jiǎn)而言之，這些方法如下在飽和鹽酸胍中37℃溫育以解離菌毛。然后，通過(guò)層析純化菌毛蛋白，隨后通過(guò)用5mM三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸(pH 8.0)透析形成菌毛蛋白二聚體。Eshdat等也發(fā)現(xiàn)一旦用含有5mM MgCl2的5mM三(羥甲基)氨基甲烷(pH 8.0)透析后菌毛蛋白二聚體將重新裝配形成菌毛。
而且，利用，例如常規(guī)的基因工程和蛋白質(zhì)修飾方法，可以修飾菌毛蛋白以含有第一附著位點(diǎn)，其中抗原或抗原決定簇通過(guò)第二附著位點(diǎn)連接此第一附著位點(diǎn)。可替代地，抗原或抗原決定簇可以通過(guò)第二附著位點(diǎn)直接連接這些蛋白質(zhì)中天然存在的氨基酸殘基。然后，這些修飾的菌毛蛋白可以用在本發(fā)明疫苗組合物中。
可以用這里所述用于HBcAg的相似方法修飾用于制備本發(fā)明組合物或疫苗組合物的細(xì)菌菌毛蛋白。例如，可以缺失或用其它氨基酸殘基置換半胱氨酸和賴氨酸殘基，并且可以向這些蛋白質(zhì)添加第一附著位點(diǎn)。而且，可以以修飾形式表達(dá)菌毛蛋白或者可以在表達(dá)后化學(xué)修飾菌毛蛋白。相似地，可以從細(xì)菌收集完整的菌毛，然后化學(xué)修飾之。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，從細(xì)菌(例如大腸桿菌)收集菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)，并且用于形成本發(fā)明的組合物或疫苗組合物。適于制備組合物或疫苗組合物的菌毛的一個(gè)例子是大腸桿菌類(lèi)型1菌毛，其是從具有SEQ IDNO2中所示氨基酸序列的菌毛蛋白單體形成的。
本領(lǐng)域已知多種方法可用于收集細(xì)菌菌毛。例如，Bullitt和Makowski(Biophys.J.74623-632(1998))描述了用于從大腸桿菌收集P菌毛的菌毛純化方法。根據(jù)該方法，從含有P菌毛質(zhì)粒的超菌毛化大腸桿菌剪切菌毛，并且通過(guò)溶解和MgCl2(1.0M)沉淀循環(huán)純化。
一旦收獲后，菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)就可以用各種方法修飾。例如，可以向菌毛添加第一附著位點(diǎn)，其中抗原或抗原決定簇可以通過(guò)第二附著位點(diǎn)附著第一附著位點(diǎn)。換而言之，可以收集和修飾細(xì)菌菌毛蛋白或菌毛樣結(jié)構(gòu)以產(chǎn)生有序和重復(fù)的抗原陣列。
抗原或抗原決定簇可以與菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)中存在的天然半胱氨酸殘基或賴氨酸殘基連接。在這種情況下，天然氨基酸殘基的高度有序和重復(fù)性將引導(dǎo)抗原或抗原決定簇與菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)偶聯(lián)。例如，可以利用異雙官能交聯(lián)劑使菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)與抗原或抗原決定簇的第二附著位點(diǎn)連接。
當(dāng)使用生物體天然合成的結(jié)構(gòu)(例如，菌毛蛋白)制備本發(fā)明組合物和疫苗組合物時(shí)，基因工程改造這些生物體以使它們產(chǎn)生具有期望特征的結(jié)構(gòu)常常是有利的。例如，當(dāng)使用大腸桿菌類(lèi)型1菌毛時(shí)，可以修飾這些菌毛的來(lái)源大腸桿菌使之產(chǎn)生具有特定特征的結(jié)構(gòu)?？赡艿木鞍仔揎椀睦影ㄒ粋€(gè)或多個(gè)賴氨酸殘基的插入，一個(gè)或多個(gè)天然存在的賴氨酸殘基的缺失或置換，和一個(gè)或多個(gè)天然存在的半胱氨酸殘基(例如，SEQ IDNO2中位置44和84的半胱氨酸殘基)的缺失或置換。
而且，可以對(duì)菌毛蛋白基因進(jìn)行其它修飾，以產(chǎn)生含有第一附著位點(diǎn)(例如，F(xiàn)OS或JUN結(jié)構(gòu)域)而不是賴氨酸殘基的表達(dá)產(chǎn)物。當(dāng)然，適宜的第一附著位點(diǎn)一般將限于那些不會(huì)阻止菌毛蛋白形成適于用在本發(fā)明疫苗組合物中的菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)的第一附著位點(diǎn)。
可以體內(nèi)(例如，通過(guò)同源重組)修飾細(xì)菌細(xì)胞中天然存在的菌毛蛋白基因，或者可以將具有特定特征的菌毛蛋白基因插入到這些細(xì)胞中。例如，菌毛蛋白基因可以作為可復(fù)制克隆載體或插入到細(xì)菌染色體中的載體的一個(gè)成分被引入到細(xì)菌細(xì)胞中。插入的菌毛蛋白基因也可以連接表達(dá)調(diào)節(jié)控制序列(例如lac操縱基因)。
在大多數(shù)情況下，本發(fā)明組合物或疫苗組合物中使用的菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)將由單一類(lèi)型的菌毛蛋白亞單位組成。一般地將使用由相同亞單位組成的菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)，因?yàn)轭A(yù)期它們將形成可以呈遞高度有序和重復(fù)抗原陣列的結(jié)構(gòu)。
然而，本發(fā)明組合物也包括這樣的組合物和疫苗，該組合物和疫苗包含由異質(zhì)菌毛蛋白亞單位形成的菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)?？梢詮募?xì)菌細(xì)胞中天然存在的基因表達(dá)能形成這些菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)的菌毛亞單位，或者可以將形成這些菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)的菌毛蛋白亞單位引入到細(xì)胞中。當(dāng)在形成菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞中表達(dá)天然存在的菌毛蛋白基因和引入的基因時(shí)，結(jié)果一般是從這些菌毛蛋白混合物形成的結(jié)構(gòu)。而且，當(dāng)在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)兩種或多種菌毛蛋白基因時(shí)，每種菌毛蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量典型地將是決定菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)中不同菌毛蛋白亞單位比率的因素。
當(dāng)期望菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)具有特定的混合菌毛蛋白亞單位組成時(shí)，可以通過(guò)異源誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)節(jié)至少一種菌毛蛋白基因的表達(dá)。這種啟動(dòng)子及其它遺傳元件可以用于調(diào)節(jié)細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生的不同菌毛蛋白亞單位的相對(duì)量，并由此調(diào)節(jié)菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)的組成。
此外，抗原或抗原決定簇可以通過(guò)非肽鍵的鍵連接細(xì)菌菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)，可以基因工程改造產(chǎn)生本發(fā)明組合物中使用的菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)的細(xì)菌細(xì)胞以產(chǎn)生融合抗原或抗原決定簇的菌毛蛋白。形成菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)的這種融合蛋白質(zhì)適于本發(fā)明疫苗組合物中使用。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，核心顆粒是病毒樣顆粒，其中病毒樣顆粒是重組病毒樣顆粒。利用重組DNA技術(shù)和公眾容易得到的病毒編碼序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以制備VLP。例如，利用商購(gòu)桿狀病毒載體，同時(shí)對(duì)序列進(jìn)行適當(dāng)修飾以允許編碼序列和調(diào)節(jié)序列功能性連接，可以基因工程改造病毒包膜或核心蛋白的編碼序列使之在桿狀病毒表達(dá)載體中于病毒啟動(dòng)子調(diào)節(jié)控制下表達(dá)。也可以基因工程改造病毒包膜或核心蛋白的編碼序列使之在例如細(xì)菌表達(dá)載體中表達(dá)。
VLP的例子包括但不限于乙型肝炎病毒衣殼蛋白(Ulrich，等，VirusRes.50141-182(1998))，麻疹病毒(Warnes，等，Gene 160173-178(1995))，新培斯病毒，輪狀病毒(US 5,071,651和US 5,374,426)，口蹄疫病毒(Twomey，等，Vaccine 131603-1610，(1995))，諾沃克病毒(Jiang，X.，等，Science 2501580-1583(1990)Matsui，S.M.，等，J.Clin.Invest.871456-1461(1991))，逆轉(zhuǎn)錄病毒GAG蛋白質(zhì)(WO 96/30523)，逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty蛋白質(zhì)p1，乙型肝炎病毒表面蛋白質(zhì)(WO 92/11291)，人類(lèi)乳頭瘤病毒(WO98/15631)，RNA噬菌體，Ty，fr-噬菌體，GA-噬菌體，AP205-噬菌體和Qβ-噬菌體。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)，本發(fā)明VLP不限于任何特定的形式。可以化學(xué)地或通過(guò)生物學(xué)方法合成該顆粒，該顆?？梢允翘烊换蚍翘烊坏摹＠?，這種類(lèi)型的實(shí)施方式包括病毒樣顆?；蚱渲亟M形式。
在一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，VLP可以包含重組多肽或其片段，或者可替代地基本上由，或者可替代地由重組多肽或其片段組成，所述重組多肽可以選自輪狀病毒重組多肽，諾沃克病毒重組多肽，甲病毒重組多肽，口蹄疫病毒重組多肽，麻疹病毒重組多肽，新培斯病毒重組多肽，多瘤病毒重組多肽，逆轉(zhuǎn)錄病毒重組多肽，乙型肝炎病毒重組多肽(例如，HBcAg)，煙草花葉病毒重組多肽，獸棚病毒(Flock House Virus)重組多肽，人乳頭瘤病毒重組多肽，噬菌體重組多肽，RNA噬菌體重組多肽，Ty重組多肽，fr噬菌體重組多肽，GA噬菌體重組多肽和Qβ噬菌體重組多肽。病毒樣顆粒還可以包含這些多肽的一個(gè)或多個(gè)片段及這些多肽的變體，或者可替代地基本上由或可替代地由這些多肽的一個(gè)或多個(gè)片段及這些多肽的變體組成。多肽變體與它們的野生型對(duì)應(yīng)物在氨基酸水平上可以共有例如至少80％，85％，90％，95％，97％或99％的同一性。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，病毒樣顆粒包含重組RNA噬菌體蛋白質(zhì)或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由重組RNA噬菌體蛋白質(zhì)或其片段組成。優(yōu)選地，RNA噬菌體選自a)噬菌體Qβ；b)噬菌體R17；c)噬菌體fr；d)噬菌體GA；e)噬菌體SP；f)噬菌體MS2；g)噬菌體M11；h)噬菌體MX1；i)噬菌體NL95；k)噬菌體f2；l)噬菌體PP7和m)噬菌體AP205。
在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，病毒樣顆粒包含RNA噬菌體Qβ或RNA噬菌體fr或RNA噬菌體AP205的重組蛋白質(zhì)或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌體Qβ或RNA噬菌體fr或RNA噬菌體AP205的重組蛋白質(zhì)或其片段組成。
在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，重組蛋白質(zhì)包含RNA噬菌體外殼蛋白，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌體外殼蛋白組成。
因此，形成衣殼或VLP的RNA噬菌體外殼蛋白，或與自裝配為衣殼或VLP相容的噬菌體外殼蛋白片段是本發(fā)明的其它優(yōu)選實(shí)施方式。例如，可以在大腸桿菌(E.coli)中重組表達(dá)噬菌體Qβ外殼蛋白。而且，一旦進(jìn)行這種表達(dá)后，這些蛋白質(zhì)將自發(fā)地形成衣殼。此外，這些衣殼將形成具有固有重復(fù)組織的結(jié)構(gòu)。
可以用于制備本發(fā)明組合物的噬菌體外殼蛋白的具體優(yōu)選例子包括RNA噬菌體的外殼蛋白諸如噬菌體Qβ的外殼蛋白(SEQ ID NO4PIR數(shù)據(jù)庫(kù)，記錄號(hào)VCBPQβ，稱(chēng)為Qβ CP和SEQ ID NO5記錄號(hào)AAA16663，稱(chēng)為Qβ A1蛋白質(zhì))，噬菌體R17的外殼蛋白(SEQ ID NO6PIR記錄號(hào)VCBPR7)，噬菌體fr外殼蛋白(SEQ ID NO7；PIR記錄號(hào)VCBPFR)，噬菌體GA外殼蛋白(SEQ ID NO8；GenBank記錄號(hào)NP-040754)，噬菌體SP外殼蛋白(SEQ ID NO9；GenBank記錄號(hào)CAA30374，稱(chēng)為SP CP和SEQ ID NO10；記錄號(hào)NP 695026，稱(chēng)為SPA1蛋白質(zhì))，噬菌體MS2外殼蛋白(SEQ ID NO11；PIR記錄號(hào)VCBPM2)，噬菌體M11外殼蛋白(SEQ ID NO12；GenBank記錄號(hào)AAC06250)，噬菌體MX1外殼蛋白(SEQ ID NO13；GenBank記錄號(hào)AAC14699)，噬菌體NL95外殼蛋白(SEQ ID NO14；GenBank記錄號(hào)AAC14704)，噬菌體f2外殼蛋白(SEQ ID NO15；GenBank記錄號(hào)P03611)，噬菌體PP7外殼蛋白(SEQ ID NO16)，和噬菌體AP205外殼蛋白(SEQ ID NO28)。而且，在Qβ外殼蛋白的衣殼裝配物中可以摻入噬菌體Qβ的A1蛋白質(zhì)(SEQ IDNO5)或從其C末端缺失多達(dá)100，150或180個(gè)氨基酸的C末端截短形式。一般地，將限制衣殼裝配中Qβ A1蛋白質(zhì)相對(duì)于Qβ CP的百分比以確保衣殼形成。
此外，已發(fā)現(xiàn)當(dāng)在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)Qβ外殼蛋白時(shí)，其自裝配為衣殼(Kozlovska TM.等，GENE 137133-137(1993))。所獲得的衣殼或病毒樣顆粒顯示了具有25nm直徑和T＝3準(zhǔn)對(duì)稱(chēng)的二十面噬菌體樣衣殼結(jié)構(gòu)。而且，噬菌體Qβ的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析。衣殼含有180個(gè)拷貝的外殼蛋白，它們通過(guò)二硫鍵以共價(jià)五聚體和六聚體形式連接(Golmohammadi，R.等，Structure 4543-5554(1996))，使Qβ外殼蛋白形成的衣殼具有顯著穩(wěn)定性。然而，從重組Qβ外殼蛋白制備的衣殼或VLP可以含有不通過(guò)或不完全通過(guò)二硫鍵連接衣殼中其它亞單位的亞單位。然而，VLP中，通常約80％以上亞單位通過(guò)二硫鍵互相連接。因此，一旦將重組Qβ衣殼加樣到非還原性SDS-PAGE上，就可以觀察到對(duì)應(yīng)于單體Qβ外殼蛋白的條帶及對(duì)應(yīng)于Qβ外殼蛋白六聚體或五聚體的條帶。在非還原性SDS-PAGE中，不完全二硫鍵連接的亞單位可以表現(xiàn)為二聚體、三聚體或甚至四聚體條帶。Qβ衣殼蛋白對(duì)有機(jī)溶劑和變性劑還顯示了異常的抗性。意外地，我們觀察到DMSO和乙腈濃度高達(dá)30％和胍鹽濃度高達(dá)1M不影響衣殼穩(wěn)定性。Qβ外殼蛋白形成的衣殼的高度穩(wěn)定性特別有利于它們?cè)诒景l(fā)明的哺乳動(dòng)物和人類(lèi)免疫和接種中的使用。
如我們通過(guò)Stoll，E.等.J.Biol.Chem.252990-993(1977)中所述的N末端Edaman測(cè)序所觀察到的，一旦在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)后，通常Qβ外殼蛋白的N末端甲硫氨酸將被移除。由沒(méi)有移除N末端甲硫氨酸的Qβ外殼蛋白組成的VLP，或者含有存在或不存在N末端甲硫氨酸的Qβ外殼蛋白的混合物的VLP也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
WO 02/056905中公開(kāi)了本發(fā)明的其它優(yōu)選的RNA噬菌體(特別是Qβ)的病毒樣顆粒，這里將該公開(kāi)內(nèi)容整體并入為參考文獻(xiàn)。
也已經(jīng)證明了其它RNA噬菌體外殼蛋白一旦在細(xì)菌宿主中表達(dá)就可以自裝配(Kastelein，RA.等，Gene 23245-254(1983)，Kozlovskaya，TM.等，Dokl.Akad.Nauk SSSR 287452-455(1986)，Adhin，MR.等，Virology170238-242(1989)，Ni，CZ.，等，Protein Sci.52485-2493(1996)，Priano，C.等，J.Mol.Biol.249283-297(1995))。Qβ噬菌體衣殼除了包含外殼蛋白外，還包含通常所說(shuō)的通讀蛋白質(zhì)A1和成熟蛋白質(zhì)A2。A1通過(guò)在UGA終止密碼子處的抑制而產(chǎn)生，并且其具有329個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。本發(fā)明中所用的噬菌體Qβ重組外殼蛋白的衣殼無(wú)A2裂解蛋白，并且含有來(lái)源于宿主的RNA。RNA噬菌體外殼蛋白是RNA結(jié)合蛋白，其與復(fù)制酶基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的莖環(huán)相互作用，在病毒生命周期中充當(dāng)翻譯阻遏物。相互作用的序列和結(jié)構(gòu)元件是已知的(Witherell，GW.&Uhlenbeck，OC.Biochemistry 2871-76(1989)；Lim F.等，J.Biol.Chem.27131839-31845(1996))。一般地，已知莖環(huán)和RNA參與病毒裝配(Golmohammadi，R.等，Structure 4543-5554(1 996))。
在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，病毒樣顆粒包含RNA噬菌體重組蛋白質(zhì)或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌體重組蛋白質(zhì)或其片段組成，其中重組蛋白質(zhì)包含RNA噬菌體突變外殼蛋白，優(yōu)選地上述RNA噬菌體的突變外殼蛋白，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌體突變外殼蛋白，優(yōu)選地上述RNA噬菌體的突變外殼蛋白組成。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)置換的方法移除至少一個(gè)，或者可替代地至少兩個(gè)賴氨酸殘基，或者通過(guò)置換的方法添加至少一個(gè)賴氨酸殘基，修飾了RNA噬菌體突變外殼蛋白；做為可替代的方案，通過(guò)至少一個(gè)賴氨酸殘基，或者可替代地至少兩個(gè)賴氨酸殘基的缺失，或者通過(guò)插入的方法添加至少一個(gè)賴氨酸殘基，修飾了RNA噬菌體突變外殼蛋白。至少一個(gè)賴氨酸殘基的缺失、置換或添加允許改變偶聯(lián)的程度，即， 每個(gè)RNA噬菌體VLP的每個(gè)亞單位上偶聯(lián)的Aβ1-6肽量，特別地以便滿足和適應(yīng)疫苗的要求。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，病毒樣顆粒包含RNA噬菌體Qβ重組蛋白質(zhì)或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌體Qβ重組蛋白質(zhì)或其片段組成，其中重組蛋白質(zhì)包含具有SEQ ID NO4氨基酸序列的外殼蛋白，或者具有SEQ ID NO4和SEQ ID NO5或SEQ ID NO5突變體的氨基酸序列的外殼蛋白混合物，或者可替代地基本由或可替代地由具有SEQ ID NO4氨基酸序列的外殼蛋白，或者具有SEQ ID NO4和SEQID NO5或SEQ ID NO5突變體的氨基酸序列的外殼蛋白混合物組成，并且其中優(yōu)選地切割了N末端甲硫氨酸。
在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，病毒樣顆粒包含Qβ重組蛋白質(zhì)或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由Qβ重組蛋白質(zhì)或其片段組成，其中重組蛋白質(zhì)包含突變Qβ外殼蛋白，或者可替代地基本由或可替代地由突變Qβ外殼蛋白組成。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)置換的方法移除至少一個(gè)賴氨酸殘基，或者通過(guò)置換的方法添加至少一個(gè)賴氨酸殘基，修飾了這些突變外殼蛋白質(zhì)?？商娲兀ㄟ^(guò)至少一個(gè)賴氨酸殘基的缺失，或者通過(guò)插入的方法添加至少一個(gè)賴氨酸殘基，修飾了這些突變外殼蛋白。
4個(gè)賴氨酸殘基暴露于Qβ外殼蛋白衣殼的表面上。用精氨酸置換了暴露的賴氨酸殘基的Qβ突變體也可以用于本發(fā)明。因此，下面的Qβ外殼蛋白突變體和突變Qβ VLP可以用在本發(fā)明實(shí)踐中“Qβ-240”(Lys13-Arg；SEQ ID NO17)，“Qβ-243”(Asn 10-Lys；SEQ ID NO18)，“Qβ-250”(Lys2-Arg，Lys13-Arg；SEQ ID NO19)，“Qβ-251”(SEQ ID NO20)和“Qβ-259”(Lys 2-Arg，Lys16-Arg；SEQ ID NO21)。因此，在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，病毒樣顆粒包含突變Qβ外殼蛋白的重組蛋白質(zhì)，或者基本由或可替代地由突變Qβ外殼蛋白的重組蛋白質(zhì)組成，該突變Qβ外殼蛋白的重組蛋白質(zhì)包含具有選自下面的氨基酸序列的蛋白質(zhì)a)SEQ ID NO17氨基酸序列；b)SEQ ID NO18氨基酸序列；c)SEQ ID NO19氨基酸序列；d)SEQ ID NO20氨基酸序列；和e)SEQ ID NO21氨基酸序列。在WO 02/056905中描述了上述Qβ外殼蛋白、突變Qβ外殼蛋白VLP和衣殼的構(gòu)建、表達(dá)和純化。在此，特別提及上述申請(qǐng)的實(shí)施例18。
在本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，病毒樣顆粒包含Qβ重組蛋白質(zhì)或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由Qβ重組蛋白質(zhì)或其片段組成，其中該重組蛋白質(zhì)包含任何一個(gè)前述Qβ突變體和相應(yīng)A1蛋白質(zhì)的混合物，或者可替代地基本由或可替代地由任何一個(gè)前述Qβ突變體和相應(yīng)A1蛋白質(zhì)的混合物組成。
在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，病毒樣顆粒包含RNA噬菌體AP205的重組蛋白質(zhì)或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌體AP205重組蛋白質(zhì)或其片段組成。
AP205基因組由成熟蛋白質(zhì)、外殼蛋白、復(fù)制酶和相關(guān)噬菌體中不存在的2個(gè)開(kāi)放讀框組成；所述兩個(gè)開(kāi)放讀框是在成熟蛋白基因的翻譯中起作用的一個(gè)開(kāi)放讀框和裂解基因(Klovins，J.，等，J.Gen.Virol.831523-33(2002))。可以從質(zhì)粒pAP283-58(SEQ ID NO27)表達(dá)AP205外殼蛋白，所述質(zhì)粒是pQb10(Kozlovska，T.M..等，Gene 137133-37(1993))的衍生物，并且其含有AP205核糖體結(jié)合位點(diǎn)。AP205外殼蛋白也可以克隆到pQb185中，位于載體中存在的核糖體結(jié)合位點(diǎn)下游。如2002年7月17日提交，名稱(chēng)為“分子抗原陣列”(Atty.Docket No.1700.0310000)的同時(shí)待審美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)中所述，兩種方法都導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)和衣殼形成，特此將這篇專(zhuān)利申請(qǐng)的整體并入為參考文獻(xiàn)。載體pQb10和pQb185是來(lái)源于pGEM載體的載體，并且通過(guò)trp啟動(dòng)子控制這些載體中克隆基因的表達(dá)(Kozlovska，T.M.等，Gene 137133-37(1993))。質(zhì)粒pAP283-58(SEQID NO27)包含下面序列的推定的AP205核糖體結(jié)合位點(diǎn)，該核糖體結(jié)合位點(diǎn)位于XbaI位點(diǎn)下游及AP205外殼蛋白ATG起始密碼子緊上游tctagaATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAAGTGAGGAAAATCACatg(SEQ ID NO57)。載體pQb185包含位于XbaI位點(diǎn)下游和起始密碼子上游的SD序列(tctagaTTAACCCAACGCGTAGGAGTCAGGCCatg(SEQ ID NO58)，下劃線的是SD序列)。
在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，病毒樣顆粒包含RNA噬菌體AP205的重組外殼蛋白或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌體AP205的重組外殼蛋白或其片段組成。
因此，本發(fā)明的該優(yōu)選實(shí)施方式包含形成衣殼的AP205外殼蛋白。這種蛋白質(zhì)可以從天然來(lái)源制備或重組表達(dá)。如電子顯微鏡術(shù)(EM)和免疫擴(kuò)散所證明的，細(xì)菌中產(chǎn)生的AP205外殼蛋白自發(fā)形成衣殼。當(dāng)在EM下觀察時(shí)，AP205外殼蛋白(SEQ ID NO28)形成的衣殼的結(jié)構(gòu)特征和AP205 RNA噬菌體外殼蛋白形成的衣殼的結(jié)構(gòu)特征幾乎不能區(qū)分。AP205VLP是高度免疫原性的，并且可以連接抗原和/或抗原決定簇以產(chǎn)生疫苗構(gòu)建體，該疫苗構(gòu)建體展示了以重復(fù)方式定向的抗原和/或抗原決定簇。激發(fā)的抗所展示抗原的高效價(jià)表明，結(jié)合的抗原和/或抗原決定簇易于接近以和抗體分子發(fā)生相互作用，并且具有免疫原性。
在本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，病毒樣顆粒包含RNA噬菌體AP205的重組突變外殼蛋白或其片段，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌體AP205的重組突變外殼蛋白或其片段組成。
AP205 VLP的能裝配的突變體形式，包括在氨基酸位置5具有脯氨酸到蘇氨酸置換的AP205外殼蛋白(SEQ ID NO29)也可以用在本發(fā)明實(shí)施中，并且產(chǎn)生了本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方式。這些VLP、來(lái)源于天然來(lái)源的VLP或AP205病毒顆?？梢越Y(jié)合抗原以產(chǎn)生本發(fā)明的有序重復(fù)抗原陣列。
可以從質(zhì)粒pAP281-32(SEQ ID No.30)表達(dá)AP205 P5-T突變外殼蛋白，該質(zhì)粒直接來(lái)源于pQb185，并含有代替Qβ外殼蛋白基因的突變AP205外殼蛋白基因。將用于AP205外殼蛋白表達(dá)的載體轉(zhuǎn)染到大腸桿菌(E.coli)中用于AP205外殼蛋白的表達(dá)。
實(shí)施例1中描述了自裝配為VLP的外殼蛋白和突變外殼蛋白的表達(dá)方法。適合的大腸桿菌(E.coli)株系包括但不限于大腸桿菌K802，JM 109，RR1。通過(guò)用SDS-PAGE檢測(cè)外殼蛋白和突變外殼蛋白的表達(dá)，并且通過(guò)可選地首先用凝膠過(guò)濾純化衣殼并隨后在免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(Ouchterlony試驗(yàn))中或電子顯微鏡下(Kozlovska，T.M..等，Gene 137133-37(1993)檢測(cè)衣殼的形成和裝配，可以鑒定適宜的載體及株系和它們的聯(lián)合。
從載體pAP283-58和pAP281-32表達(dá)的AP205外殼蛋白可以由于大腸桿菌(E.coli)胞質(zhì)中的加工而無(wú)最初的甲硫氨酸氨基酸。切割的、未切割形式的AP205VLP或其混合物是本發(fā)明另外優(yōu)選的實(shí)施方式。
在本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，病毒樣顆粒包含RNA噬菌體AP205的重組外殼蛋白或其片段和RNA噬菌體AP205重組突變外殼蛋白或其片段的混合物，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌體AP205重組外殼蛋白或其片段和RNA噬菌體AP205重組突變外殼蛋白或其片段的混合物組成。
在本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，病毒樣顆粒包含RNA噬菌體AP205重組外殼蛋白或重組突變外殼蛋白的片段，或者可替代地基本由或可替代地由RNA噬菌體AP205重組外殼蛋白或重組突變外殼蛋白的片段組成。
能裝配為VLP或衣殼的重組AP205外殼蛋白片段也可以用在本發(fā)明實(shí)踐中?？梢酝ㄟ^(guò)在外殼蛋白或突變外殼蛋白內(nèi)部或末端缺失，產(chǎn)生這些片段。在外殼蛋白和突變外殼蛋白序列中的插入，或者抗原序列與外殼蛋白或突變外殼蛋白序列的融合，只要與裝配為VLP相容，均是本發(fā)明的實(shí)施方式，它們將導(dǎo)致嵌合AP205外殼蛋白或顆粒。通過(guò)電子顯微鏡術(shù)可以檢測(cè)插入、缺失及與外殼蛋白序列融合的結(jié)果，以及其是否與裝配為VLP相容。
通過(guò)利用沉淀的分級(jí)步驟和利用凝膠過(guò)濾(利用例如SepharoseCL-4B，Sepharose CL-2B，Sepharose CL-6B柱子或它們的聯(lián)合)的純化步驟，可以分離純化形式的由上述AP205外殼蛋白、外殼蛋白片段和嵌合外殼蛋白形成的顆粒。分離病毒樣顆粒的其它方法是本領(lǐng)域已知的，并且可以用于分離噬菌體AP205病毒樣顆粒(VLP)。例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,918,166中描述了超離心用于分離酵母逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty VLP的用途，這里將這篇文獻(xiàn)整體并入為參考文獻(xiàn)。
已經(jīng)測(cè)定了幾種RNA噬菌體的晶體結(jié)構(gòu)(Golmohammadi，R.等，Structure 4543-554(1996))。利用這些信息，可以鑒定表面暴露的殘基，由此可以修飾RNA噬菌體外殼蛋白，以便可以通過(guò)插入或置換的方法插入一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)性氨基酸殘基。結(jié)果，這些修飾形式的噬菌體外殼蛋白也可以用于本發(fā)明。因此，形成衣殼或衣殼樣結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)(例如，噬菌體Qβ，噬菌體R17，噬菌體fr，噬菌體GA，噬菌體SP，噬菌體AP205和噬菌體MS2的外殼蛋白)的變體也可以用于制備本發(fā)明組合物。
盡管上述變體蛋白質(zhì)的序列不同于它們的野生型對(duì)應(yīng)物，但是這些變體蛋白質(zhì)一般地將保留形成衣殼或衣殼樣結(jié)構(gòu)的能力。因此，本發(fā)明還包括組合物或疫苗組合物，該組合物或疫苗組合物還包含形成衣殼或衣殼樣結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的變體；本發(fā)明還包括用于制備這種組合物或疫苗組合物的方法、用于制備這種組合物的單個(gè)蛋白質(zhì)亞單位，和編碼這些蛋白質(zhì)亞單位的核酸分子。因此，本發(fā)明范圍內(nèi)包括可以形成衣殼或衣殼樣結(jié)構(gòu)并且保留了締合和形成衣殼或衣殼樣結(jié)構(gòu)的能力的野生型蛋白質(zhì)的變體形式。
由此，本發(fā)明還包括包含如下蛋白質(zhì)的組合物或疫苗組合物，該蛋白質(zhì)包含與野生型蛋白質(zhì)至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同的氨基酸序列，或者可替代地基本由或可替代地由與野生型蛋白質(zhì)至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同的氨基酸序列組成，該蛋白質(zhì)形成有序陣列并具有固有的重復(fù)結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明范圍中還包括核酸分子，該核酸分子編碼用于制備本發(fā)明組合物的蛋白質(zhì)。
在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明還包括包含如下蛋白質(zhì)的組合物，該蛋白質(zhì)包含與SEQ ID Nos4-21中所示任一氨酸序列具有至少80％，85％，90％，95％，97％，或99％相同性的氨基酸序列，或者可替代地基本由或可替代地由與SEQ ID Nos4-21中所示任一氨酸序列具有至少80％，85％，90％，95％，97％，或99％相同性的氨基酸序列組成。
適于本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)也包括可以形成衣殼或衣殼樣結(jié)構(gòu)或VLP的蛋白質(zhì)C末端截短突變體。這種截短突變體的具體例子包括具有SEQ IDNos4-21之任一中所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中已經(jīng)從C末端移除了1，2，5，7，9，10，12，14，15或17個(gè)氨基酸。通常地，這些C末端截短突變體將保留形成衣殼或衣殼樣結(jié)構(gòu)的能力。
適于本發(fā)明中使用的其它蛋白質(zhì)也包括可以形成衣殼或衣殼樣結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)N末端截短突變體。這種截短突變體的具體例子包括具有SEQ IDNos4-21任何一個(gè)中所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中已經(jīng)從N末端移除了1，2，5，7，9，10，12，14，15或17個(gè)氨基酸。通常地，這些N末端截短突變體將保留形成衣殼或衣殼樣結(jié)構(gòu)的能力。
適于本發(fā)明中使用的其它蛋白質(zhì)包括可以形成衣殼或衣殼樣結(jié)構(gòu)的N和C末端截短突變體。適合的截短突變體包括具有SEQ ID Nos4-21任何一個(gè)中所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中已經(jīng)從N末端移除了1，2，5，7，9，10，12，14，15或17個(gè)氨基酸，并且已經(jīng)從C末端移除了1，2，5，7，9，10，12，14，15或17個(gè)氨基酸。通常地，這些N末端和C末端截短突變體將保留形成衣殼或衣殼樣結(jié)構(gòu)的能力。
本發(fā)明還包括包含如下蛋白質(zhì)的組合物，該蛋白質(zhì)包含與上述截短突變體具有至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同性的氨基酸序列，或者可替代地基本由或可替代地由與上述截短突變體具有至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同性的氨基酸序列組成。
因此，本發(fā)明包括從可以形成衣殼或VLP的蛋白質(zhì)制備的組合物和疫苗組合物，從單個(gè)蛋白質(zhì)亞單位和VLP或衣殼制備這些組合物的方法，制備這些單個(gè)的蛋白質(zhì)亞單位的方法，編碼這些亞單位的核酸分子，和利用本發(fā)明組合物接種個(gè)體和/或在個(gè)體中激發(fā)免疫應(yīng)答的方法。
如前所述，本發(fā)明包括病毒樣顆粒或其重組形式。在一個(gè)另外優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明組合物中所使用的顆粒由乙型肝炎病毒核心蛋白質(zhì)(HBcAg)或HBcAg片段組成。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明組合物中所使用的顆粒由經(jīng)修飾除去了或減少了自由半胱氨酸殘基數(shù)量的乙型肝炎病毒核心蛋白質(zhì)(HBcAg)或HBcAg蛋白質(zhì)片段組成。Zhou等.(J.Virol.665393-5398(1992))證明了經(jīng)修飾移除了天然存在的半胱氨酸殘基的HBcAg可以保留締合并形成衣殼的能力。因此，適于本發(fā)明組合物中使用的VLP包括含有修飾的HBcAg或其片段的VLP，其中已經(jīng)缺失或用另一種氨基酸殘基(例如，絲氨酸殘基)置換了一個(gè)或多個(gè)天然存在的半胱氨酸殘基。
HBcAg是通過(guò)乙型肝炎核心抗原前體蛋白質(zhì)加工產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。已經(jīng)鑒定了多種HBcAg同種型，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員容易獲得它們的氨基酸序列。在大多數(shù)情況下，將利用加工形式的HBcAg(即，其中已經(jīng)移除了乙型肝炎核心抗原前體蛋白質(zhì)的N末端前導(dǎo)序列的HBcAg)制備本發(fā)明的組合物或疫苗組合物。
而且，當(dāng)在不會(huì)發(fā)生加工的條件下產(chǎn)生HBcAg時(shí)，一般地以“加工的”形式表達(dá)HBcAg。例如，當(dāng)將指導(dǎo)蛋白質(zhì)胞質(zhì)表達(dá)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)用于產(chǎn)生本發(fā)明HBcAg時(shí)，一般地將以乙型肝炎核心抗原前體蛋白質(zhì)的N末端前導(dǎo)序列不存在的方式表達(dá)這些蛋白質(zhì)。
例如，WO 00/32227中，特別是實(shí)施例17到19和21到24中，及WO 01/85208中，特別是實(shí)施例17到19，21到24，31和41中以及WO02/056905中公開(kāi)了可以用于本發(fā)明的乙型肝炎病毒樣顆粒的制備。對(duì)于后面的申請(qǐng)，特別地參考實(shí)施例23，24，31和51。這里明確地將所有這3篇文獻(xiàn)并入為參考文獻(xiàn)。
本發(fā)明也包括經(jīng)修飾缺失或置換了一個(gè)或多個(gè)額外的半胱氨酸殘基的HBcAg變體。自由半胱氨酸殘基可以參與多種化學(xué)側(cè)鏈反應(yīng)，這是本領(lǐng)域已知的。這些側(cè)鏈反應(yīng)包括二硫化物交換，與化學(xué)物質(zhì)或代謝物(注射的或在和其它物質(zhì)的聯(lián)合治療中形成的)反應(yīng)，或者直接氧化和與核苷酸在暴露于UV光后反應(yīng)。特別是考慮到HBcAg具有結(jié)合核酸的強(qiáng)烈傾向這一事實(shí)，由此可能產(chǎn)生毒性加成物。這些毒性加成物將以多種形成分布，每種毒性加成物可能單獨(dú)地以低濃度存在，但是當(dāng)每種毒性加成物集合在一起時(shí)就達(dá)到毒性水平。
鑒于上述，疫苗組合物中應(yīng)用移除了天然半胱氨酸殘基的修飾HBcAg的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，當(dāng)與抗原或抗原決定簇結(jié)合后，將在數(shù)量上減少或完全地消除有毒物可以結(jié)合的位點(diǎn)。
已經(jīng)鑒定了適于本發(fā)明實(shí)踐中使用的大量天然HBcAg變體。例如，Yuan等，(J.Virol.7310122-10128(1999))描述了其中用亮氨酸殘基或苯丙氨酸殘基置換了位于與SEQ ID NO22中位置97對(duì)應(yīng)的位置的異亮氨酸殘基的變體。在GenBank報(bào)道AAF121240，AF121239，X85297，X02496，X85305，X85303，AF151735，X85259，X85286，X85260，X85317，X85298，AF043593，M20706，X85295，X80925，X85284，X85275，X72702，X85291，X65258，X85302，M32138，X85293，X85315，U95551，X85256，X85316，X85296，AB033559，X59795，X85299，X85307，X65257，X85311，X85301(SEQ ID NO23)，X85314，X85287，X85272，X85319，AB010289，X85285，AB010289，AF121242，M90520(SEQ ID NO24)，P03153，AF110999，和M95589中公開(kāi)了大量HBcAg變體及幾種乙型肝炎核心抗原前體變體的氨基酸序列，這里將每個(gè)GenBank報(bào)道公開(kāi)的內(nèi)容并入為參考文獻(xiàn)。WO01/85208中SEQ ID NOs89-138中進(jìn)一步公開(kāi)了上述乙型肝炎核心抗原前體變體的序列。這些HBcAg變體在氨基酸序列的多個(gè)位置存在差異，包括對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO25中12，13，21，22，24，29，32，33，35，38，40，42，44，45，49，51，57，58，59，64，66，67，69，74，77，80，81，87，92，93，97，98，100，103，105，106，109，113，116，121，126，130，133，135，141，147，149，157，176，178，182和183位置氨基酸殘基的氨基酸殘基。WO 00/198333，WO 00/177158和WO 00/214478中描述了適于本發(fā)明組合物中使用并且可以根據(jù)本申請(qǐng)公開(kāi)內(nèi)容進(jìn)行進(jìn)一步修飾的其它HBcAg變體。
如上所述，本發(fā)明組合物或疫苗組合物中將使用通常加工的HBcAg(即，缺少前導(dǎo)序列的HBcAg)。本發(fā)明包括利用上述變體HBcAg的疫苗組合物及使用這些組合物的方法。
利用已知的計(jì)算機(jī)程序諸如Bestfit程序可以常規(guī)地確定是否多肽的氨基酸序列有與一種上述野生型氨基酸序列或其亞部分至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同的氨基酸序列。當(dāng)使用Bestfit或任何其它序列比對(duì)程序以檢測(cè)是否特定序列與參照氨基酸序列具有例如95％相同性時(shí)，設(shè)定參數(shù)，以便計(jì)算和全長(zhǎng)參照氨基酸序列相比的同一性百分?jǐn)?shù)，并且允許達(dá)到參照序列中氨基酸殘基總數(shù)5％的同源性空位。
上述HBcAg變體和前體的氨基酸序列相互相對(duì)地相似。因此，提到位于對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO25中特定位置的位置的HBcAg變體氨基酸殘基時(shí)，指在SEQ ID NO25所示氨基酸序列中在該位置存在此氨基酸殘基。在感染哺乳動(dòng)物的乙型肝炎病毒中這些HBcAg變體之間大部分存在足夠高的同源性，這樣本領(lǐng)域技術(shù)人員幾乎毫無(wú)困難即可檢閱SEQ ID NO25中所示氨基酸序列和特定HBcAg變體的氨基酸序列，并鑒定出“相應(yīng)的”氨基酸殘基。而且，SEQ ID NO24中所示HBcAg氨基酸序列(顯示來(lái)源于感染旱獺的病毒的HBcAg氨基酸序列)與具有SEQ ID NO25中所示氨基酸序列的HBcAg有足夠的同源性，因此顯而易見(jiàn)在SEQ ID NO25中，在SEQ ID NO25的氨基酸殘基155和156之間存在3個(gè)氨基酸殘基插入。
本發(fā)明也包括包含感染鳥(niǎo)類(lèi)的乙型肝炎病毒HBcAg變體的疫苗組合物，及包含這些HBcAg變體的片段的疫苗組合物。對(duì)于這些HBcAg變體，在將它們包含在本發(fā)明疫苗組合物中之前，可以缺失或用另外氨基酸殘基置換這些多肽中天然存在的1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基。
如上所述，自由半胱氨酸殘基的去除可以減少可能導(dǎo)致有毒成分與HBcAg結(jié)合的位點(diǎn)的數(shù)量，并且也消除可能導(dǎo)致相同或鄰近HBcAg分子的賴氨酸和半胱氨酸殘基發(fā)生交聯(lián)的位點(diǎn)。因此，在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式中，已缺失或用另外的氨基酸殘基置換了乙型肝炎病毒衣殼蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基。
在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明組合物或疫苗組合物將包含其中移除了C末端區(qū)域(即，SEQ ID NO25的氨基酸殘基145-185或150-185)的HBcAg。因此，適于本發(fā)明實(shí)踐中使用的其它修飾的HBcAg包括C末端截短突變體。適宜的截短突變體包括其中已經(jīng)從C末端移除了1，5，10，15，20，25，30，34，35個(gè)氨基酸的HBcAg。
適于本發(fā)明實(shí)踐中使用的HBcAg也包括N末端截短突變體。適宜的截短突變體包括其中已從N末端移除了1，2，5，7，9，10，12，14，15或17個(gè)氨基酸的修飾的HBcAg。
適于本發(fā)明實(shí)踐中使用的其它HBcAg包括N和C末端截短突變體。適宜的截短突變體包括已從N末端移除了1，2，5，7，9，10，12，14，15和17個(gè)氨基酸及從C末端移除了1，5，10，15，20，25，30，34，35個(gè)氨基酸的HBcAg。
本發(fā)明還包括包含HBcAg多肽的組合物或疫苗組合物，該HBcAg多肽包含與上述截短突變體具有至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同性的氨基酸序列，或者可替代地基本由或可替代地由與上述截短突變體具有至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同性的氨基酸序列組成。
在本發(fā)明一些實(shí)施方式中，將賴氨酸殘基引入HBcAg多肽中以介導(dǎo)Aβ1-6肽與HBcAg的VLP的結(jié)合。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，利用包含SEQID NO25氨基酸1-144或1-149，1-185，或者可替代地由SEQ ID NO25氨基酸1-144或1-149，1-185組成的HBcAg制備本發(fā)明組合物，其中所述HBcAg被修飾，以致對(duì)應(yīng)于位置79和80的氨基酸由具有Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(SEQ ID NO33)氨基酸序列的肽置換，產(chǎn)生了具有SEQ ID NO26中所示序列的HBcAg多肽。這些組合物對(duì)于抗原決定簇偶聯(lián)HBcAg VLP的實(shí)施方式特別有用。在另外優(yōu)選的實(shí)施方式，將SEQ IDNO25位置48和107的半胱氨酸殘基突變?yōu)榻z氨酸。本發(fā)明還包括包含如下相應(yīng)多肽的組合物，該多肽具有任何一個(gè)上述乙型肝炎核心抗原前體變體中所示的氨基酸序列并具有上述氨基酸改變。進(jìn)一步包括在本發(fā)明范圍中的是能締合形成衣殼或VLP并且具有上述氨基酸改變的其它HBcAg變體。因此，本發(fā)明還包括包含HBcAg多肽或這些蛋白質(zhì)的適當(dāng)時(shí)被加工以移除N末端前導(dǎo)序列并用上述改變進(jìn)行修飾的形式的組合物或疫苗組合物，其中所述HBcAg多肽包含與任何一種野生型氨基酸序列具有至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同性的氨基酸序列，或者可替代地由與任何一種野生型氨基酸序列具有至少80％，85％，90％，95％，97％或99％相同性的氨基酸序列組成。
本發(fā)明組合物或疫苗組合物可以包含不同HBcAg的混合物。因此，這些疫苗組合物可以由氨基酸序列不同的HBcAg組成。例如，可以制備包含“野生型”HBcAg和修飾的HBcAg的疫苗組合物，在修飾的HBcAg中已改變(例如，缺失、插入或置換)了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。而且，本發(fā)明優(yōu)選的疫苗組合物是呈現(xiàn)高度有序和重復(fù)抗原陣列的疫苗組合物，其中抗原是Aβ1-6肽。
在本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，至少一個(gè)Aβ1-6肽通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵與所述病毒樣顆粒或核心顆粒結(jié)合。優(yōu)選地，至少一個(gè)Aβ1-6肽通過(guò)至少一個(gè)非肽鍵的共價(jià)鍵與所述病毒樣顆?；蚝诵念w粒結(jié)合，從而產(chǎn)生Aβ1-6肽陣列或Aβ1-6肽-VLP綴合物。該Aβ1-6肽陣列或綴合物通常并優(yōu)選地具有重復(fù)和有序的結(jié)構(gòu)，因?yàn)橹辽僖粋€(gè)Aβ1-6肽以定向方式與VLP或核心顆粒結(jié)合。至少一個(gè)Aβ1-6肽與VLP或核心顆粒以定向有控制的確定方式結(jié)合和附著，確保了重復(fù)和有序的Aβ1-6肽-VLP陣列或綴合物的形成，這在下文所述中將顯而易見(jiàn)。而且，VLP或和核心顆粒的典型固有高度重復(fù)和有組織的結(jié)構(gòu)也有利于促進(jìn)Aβ1-6肽以高度有序和重復(fù)方式展示，形成高度有組織和重復(fù)的Aβ1-6肽-VLP陣列或綴合物。
因此，優(yōu)選的本發(fā)明綴合物或陣列在它們高度有組織的結(jié)構(gòu)、維度方面，和陣列表面上抗原的重復(fù)性方面不同于現(xiàn)有綴合物。而且，本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式允許在表達(dá)宿主中表達(dá)顆粒，從而保證了VLP正確的折疊和裝配，然后，抗原，即Aβ1-6肽進(jìn)一步偶聯(lián)該VLP。
本發(fā)明公開(kāi)了Aβ1-6肽結(jié)合VLP的方法。如所述，在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過(guò)化學(xué)交聯(lián)方法，通常和優(yōu)選地通過(guò)利用異雙官能交聯(lián)劑，使Aβ1-6肽結(jié)合VLP。幾種異雙官能交聯(lián)劑是本領(lǐng)域已知的。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，異雙官能交聯(lián)劑含有可以與優(yōu)選的第一附著位點(diǎn)(即VLP或至少一個(gè)VLP亞單位的賴氨酸殘基的側(cè)鏈氨基)反應(yīng)的官能團(tuán)，和可以與優(yōu)選的第二附著位點(diǎn)(即與Aβ1-6肽融合的和可選地通過(guò)還原反應(yīng)獲得的半胱氨酸殘基)反應(yīng)的另一個(gè)官能團(tuán)。該方法的第一步，通常稱(chēng)為衍生，是VLP和交聯(lián)劑反應(yīng)。該反應(yīng)的產(chǎn)物是活化的VLP，也稱(chēng)為活化的載體。在第二步中，利用通常的方法諸如凝膠過(guò)濾或透析移除未反應(yīng)的交聯(lián)劑。在第三步中，Aβ1-6肽與活化的VLP反應(yīng)，并且該步驟通常稱(chēng)為偶聯(lián)步驟?？蛇x地可以在第四步中，例如通過(guò)透析，移除未反應(yīng)的Aβ1-6肽。幾種異雙官能交聯(lián)劑是本領(lǐng)域已知的。這些交聯(lián)劑包括優(yōu)選的交聯(lián)劑SMPH(Pierce)，磺基-MBS，磺基-EMCS，磺基-GMBS，磺基-SIAB，磺基-SMPB，磺基-SMCC，SVSB，SIA和可從例如Pierce Chemical Company(Rockford，IL，USA)獲得的其它交聯(lián)劑(這些交聯(lián)劑具有對(duì)氨基有活性的一個(gè)官能團(tuán)和對(duì)半胱氨酸殘基有活性的一個(gè)官能團(tuán))。所有上述交聯(lián)劑引起了硫醚鍵的形成。適于本發(fā)明實(shí)踐的另一類(lèi)交聯(lián)劑的特征在于一旦偶聯(lián)，就在Aβ1-6肽和VLP之間引入二硫鍵。屬于該類(lèi)的優(yōu)選交聯(lián)劑包括例如SPDP和磺基-LC-SPDP(Pierce)?？梢酝ㄟ^(guò)改變?cè)囼?yàn)條件諸如每種反應(yīng)組分的濃度，一種試劑相對(duì)于另一種試劑的過(guò)量、pH、溫度和離子強(qiáng)度來(lái)影響交聯(lián)劑對(duì)VLP的衍生程度。可以通過(guò)改變上述試驗(yàn)條件調(diào)整偶聯(lián)程度，即每個(gè)VLP亞單位的Aβ1-6肽數(shù)量，以滿足疫苗要求。
Aβ1-6肽結(jié)合VLP的一個(gè)特別有利的方法是VLP表面上的賴氨酸殘基和Aβ1-6肽上的半胱氨酸殘基的連接。在一些實(shí)施方式中，可能需要將含有半胱氨酸殘基的氨基酸接頭(半胱氨酸殘基作為第二附著位點(diǎn)或作為接頭的一部分)融合到Aβ1-6上以便偶聯(lián)VLP。
一般地，柔性氨基酸接頭是有利的。氨基酸接頭的例子選自(a)CGG；(b)N-末端γ1接頭；(c)N-末端γ3接頭；(d)Ig鉸鏈區(qū)；(e)N-末端甘氨酸接頭；(f)(G)kC(G)n，n＝0-12且k＝0-5(SEQ ID NO34)；(g)N-末端甘氨酸-絲氨酸接頭；(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2(SEQ ID NO35)；(i)GGC；(k)GGC-NH2；(l)C-末端γ1接頭；(m)C-末端γ 3接頭；(n)C-末端甘氨酸接頭；(o)(G)nC(G)k，n＝0-12且k＝0-5(SEQ IDNO36)；(p)C-末端甘氨酸-絲氨酸接頭；(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2，且o＝0-8(SEQ ID NO37)。
氨基酸接頭的其它例子是免疫球蛋白鉸鏈區(qū)，甘氨酸絲氨酸接頭(GGGGS)n(SEQ ID NO38)，和甘氨酸接頭(G)n，所有這些接頭還都包含做為第二附著位點(diǎn)的半胱氨酸殘基和可選地甘氨酸殘基。所述氨基酸接頭的典型優(yōu)選例子是N-末端γ1CGDKTHTSPP(SEQ ID NO39)；C-末端γ1DKTHTSPPCG(SEQ ID NO40)；N-末端γ3CGGPKPSTPPGSSGGAP(SEQ ID NO41)；C-末端γ3PKPSTPPGSSGGAPGGCG(SEQ ID NO42)；N-末端甘氨酸接頭GCGGGG(SEQ ID NO43)和C-末端甘氨酸接頭GGGGCG(SEQ IDNO44)。
當(dāng)疏水性Aβ肽結(jié)合VLP時(shí)，特別適于本發(fā)明實(shí)踐中的其它氨基酸接頭是N末端接頭CGKKGG(SEQ ID NO46)或CGDEGG(SEQ ID NO31)，或C末端接頭GGKKGC(SEQ ID NO45)和GGEDGC(SEQ ID NO32)。對(duì)于C末端接頭，可選地在C末端酰胺化末端半胱氨酸。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，優(yōu)選在肽C末端以GGCG(SEQ ID NO47)、GGC或GGC-NH2(″NH2″代表酰胺化)接頭作為氨基酸接頭，或在N末端以CGG作為氨基酸接頭。一般地，將甘氨酸殘基插入到大的氨基酸和將要用做第二附著位點(diǎn)的半胱氨酸之間，以避免在偶聯(lián)反應(yīng)中較大氨基酸可能的空間位阻。在本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方式中，氨基酸接頭GGC-NH2與Aβ1-6的C末端融合。
Aβ1-6肽上存在的半胱氨酸殘基必須是還原狀態(tài)以便與活化的VLP上的異雙官能交聯(lián)劑反應(yīng)，也就是說(shuō)必須有可用的自由半胱氨酸或具有自由巰基的半胱氨酸殘基。在起結(jié)合位點(diǎn)作用的半胱氨酸殘基是氧化形式，例如如果它形成二硫鍵時(shí)，需要用例如DTT，TCEP或β-巰基乙醇還原該二硫鍵。WO 02/056905中描述了低濃度還原試劑與偶聯(lián)相容，而如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的，高濃度將抑制偶聯(lián)反應(yīng)，在這種情況下，在偶聯(lián)前，必須例如通過(guò)透析、凝膠過(guò)濾或反相HPLC移除還原劑或降低它的濃度。
根據(jù)上述優(yōu)選的方法，通過(guò)利用異雙官能交聯(lián)劑使Aβ1-6肽與VLP結(jié)合，將允許Aβ1-6肽以定向方式偶聯(lián)VLP。Aβ1-6肽偶聯(lián)VLP的其它方法包括利用碳二亞胺EDC和NHS使Aβ1-6肽交聯(lián)VLP的方法。在另一些方法中，利用同雙官能交聯(lián)劑諸如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3(Pierce Chemical Company，Rockford，IL，USA)或者具有對(duì)VLP的氨基或羧基有反應(yīng)性的官能團(tuán)的其它已知同雙官能交聯(lián)劑，使Aβ1-6肽附著VLP。
VLP結(jié)合Aβ1-6肽的其它方法包括生物素酰化VLP并且將Aβ1-6肽作為鏈霉抗生物素蛋白-融合蛋白表達(dá)的方法，或者例如WO 00/23955中所述，生物素?；疉β1-6肽和VLP的方法。在這種情況下，Aβ1-6肽可以首先結(jié)合鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白，通過(guò)調(diào)整Aβ1-6肽與鏈霉抗生物素蛋白的比率，使自由結(jié)合位點(diǎn)仍舊可獲得用于與下一步添加的VLP結(jié)合。做為可替代的方案，可以在“一個(gè)容器”反應(yīng)中混合所有成分。其它配體-受體對(duì)也可以用做結(jié)合試劑用于結(jié)合Aβ1-6肽和VIP，條件是可得到該受體和配體的可溶形式，并且它們能與VLP或Aβ1-6肽交聯(lián)。做為可替代的方案，配體或受體可以與Aβ1-6肽融合，并由此介導(dǎo)與化學(xué)結(jié)合或融合了受體或配體的VLP結(jié)合。通過(guò)插入或置換也可以實(shí)現(xiàn)融合。
如所述，在本發(fā)明有利的實(shí)施方式中，VLP是RNA噬菌體VLP，并且在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，VLP是RNA噬菌體Qβ外殼蛋白的VLP。
如果空間上允許，優(yōu)選地通過(guò)RNA噬菌體VLP上暴露的賴氨酸殘基，一個(gè)或幾個(gè)抗原分子，即Aβ1-6肽可以與RNA噬菌體外殼蛋白的衣殼或VLP的一個(gè)亞單位結(jié)合。因此，RNA噬菌體外殼蛋白，特別是Qβ外殼蛋白的VLP的特定特征是每個(gè)亞單位可以偶聯(lián)幾個(gè)抗原。這樣可以產(chǎn)生密集的抗原陣列。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，至少一個(gè)Aβ1-6肽與病毒樣顆粒通過(guò)病毒樣顆粒的至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和抗原或抗原決定簇的至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)之間的相互作用或締合而實(shí)現(xiàn)結(jié)合或附著。
Qβ外殼蛋白的VLP或衣殼在它們的表面展示了確定數(shù)量的賴氨酸殘基，具有確定的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，該拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)具有指向衣殼內(nèi)部并且與RNA相互作用的3個(gè)賴氨酸殘基，和暴露于衣殼外部的另外4個(gè)賴氨酸殘基。這些確定的特性有利于抗原附著到顆粒外部，而不是附著到賴氨酸殘基與RNA相互作用的顆粒內(nèi)部。其它RNA噬菌體外殼蛋白的VLP在它們表面也具有確定數(shù)量的賴氨酸殘基，且這些賴氨酸殘基具有確定的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。
在本發(fā)明其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，第一附著位點(diǎn)是賴氨酸殘基和/或第二附著位點(diǎn)包含巰基或半胱氨酸殘基。在本發(fā)明非常優(yōu)選的實(shí)施方式中，第一附著位點(diǎn)是賴氨酸殘基，并且第二附著位點(diǎn)是半胱氨酸殘基。
在本發(fā)明非常優(yōu)選的實(shí)施方式中，Aβ1-6肽通過(guò)半胱氨酸殘基結(jié)合RNA噬菌體外殼蛋白的VLP(特別是Qβ外殼蛋白的VLP)的賴氨酸殘基。
來(lái)源于RNA噬菌體的VLP的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它們?cè)诩?xì)菌中高的表達(dá)產(chǎn)率，該高的表達(dá)產(chǎn)率使得可以以可擔(dān)負(fù)得起的花費(fèi)生產(chǎn)大量物質(zhì)。
如所述，本發(fā)明綴合物或陣列在它們高度有組織的結(jié)構(gòu)、維度方面，和陣列表面上抗原的重復(fù)性方面不同于現(xiàn)有綴合物。而且將VLP用作載體使得可以形成具有可變抗原密度的穩(wěn)固抗原陣列或綴合物。具體地，RNA噬菌體VLP的應(yīng)用，特別是RNA噬菌體Qβ外殼蛋白VLP的應(yīng)用允許獲得非常高的表位密度。特別地，通過(guò)偶聯(lián)人類(lèi)Aβ1-6肽和Qβ外殼蛋白VLP可以達(dá)到每個(gè)亞單位1.5個(gè)以上表位的密度。利用本申請(qǐng)的教導(dǎo)可以實(shí)現(xiàn)具有高表位密度的RNA噬菌體外殼蛋白VLP組合物的制備。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，當(dāng)Aβ1-6肽偶聯(lián)Qβ外殼蛋白VLP時(shí)，優(yōu)選每個(gè)亞單位具有0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2.0，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9或更高的平均Aβ1-6肽數(shù)量。
這里所定義的第二附著位點(diǎn)可以天然或非天然存在于抗原或抗原決定簇上。在抗原或抗原決定簇上不存在適宜的天然第二附著位點(diǎn)的情況下，必須進(jìn)行抗原改造使其具有非天然第二附著位點(diǎn)。
如上所述，4個(gè)賴氨酸殘基暴露在Qβ外殼蛋白VLP表面上。通常地，這些殘基通過(guò)與交聯(lián)劑分子反應(yīng)而衍生化。在不是所有暴露的賴氨酸殘基都偶聯(lián)抗原的情況下，衍生作用步驟后，留下了與交聯(lián)劑反應(yīng)的賴氨酸殘基，其中交聯(lián)劑分子附著ε氨基。這引起了對(duì)VLP溶解度和穩(wěn)定性可能有害的一個(gè)或幾個(gè)正電荷的消失。如在以下公開(kāi)的Qβ外殼蛋白突變體中，通過(guò)用精氨酸置換一些賴氨酸殘基，可以阻止正電荷過(guò)量的消失，因?yàn)榫彼釟埢慌c交聯(lián)劑反應(yīng)。而且，用精氨酸置換賴氨酸殘基可以產(chǎn)生更確定的抗原陣列，因?yàn)檩^少的位點(diǎn)可用于和抗原反應(yīng)。
因此，在本申請(qǐng)中下面公開(kāi)的Qβ外殼蛋白突變體和突變Qβ VLP中，用精氨酸置換了暴露的賴氨酸殘基Qβ-240(Lys13-Arg；SEQ ID NO17)，Qβ-250(Lys 2-Arg，Lys13-Arg；SEQ ID NO19)和Qβ-259(Lys 2-Arg，Lys16-Arg；SEQ ID NO21)?？寺?gòu)建體，表達(dá)蛋白質(zhì)，純化VLP并且用于偶聯(lián)肽和蛋白質(zhì)抗原。也構(gòu)建了Qβ-251(SEQ ID NO20)，并且在本申請(qǐng)中可以找到如何表達(dá)、純化和偶聯(lián)Qβ-251外殼蛋白VLP的指導(dǎo)。
在另一實(shí)施方式中，我們公開(kāi)了具有一個(gè)額外賴氨酸殘基的Qβ突變體外殼蛋白，其適用于獲得甚至更高密度的抗原陣列?？寺≡撏蛔凅wQβ外殼蛋白，Qβ-243(Asn 10-Lys；SEQ ID NO18)，表達(dá)蛋白質(zhì)，并且分離和純化了衣殼或VLP，表明額外賴氨酸殘基的引入與亞單位自裝配為衣殼或VLP相容。因此，利用Qβ外殼蛋白突變體的VLP可以制備Aβ1-6肽陣列或綴合物。使抗原附著VLP，特別是附著RNA噬菌體外殼蛋白的VLP的一個(gè)特別有利方法是RNA噬菌體外殼蛋白VLP表面上存在的賴氨酸殘基與添加在抗原(即，Aβ1-6肽)上的半胱氨酸殘基連接。為了半胱氨酸殘基有效地做為第二附著位點(diǎn)，必須有用于偶聯(lián)的巰基。因此，半胱氨酸殘基必須是還原狀態(tài)，即，必須有可用的具有自由巰基的半胱氨酸殘基或自由半胱氨酸。在起第二附著位點(diǎn)作用的半胱氨酸殘基是氧化形式，例如如果它形成二硫鍵時(shí)，需要用例如DTT，TCEP或β-巰基乙醇還原該二硫鍵。必須針對(duì)每種抗原調(diào)整還原劑濃度和還原劑相對(duì)抗原的摩爾過(guò)量。如果需要，檢測(cè)從10μM或更低濃度開(kāi)始直到10-20mM或更高濃度的還原劑滴定范圍，并評(píng)價(jià)抗原與載體的偶聯(lián)。盡管如WO 02/056905中所述低濃度還原劑與偶聯(lián)反應(yīng)相容，但是高濃度將抑制偶聯(lián)反應(yīng)，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的，在這種情況下，必須例如通過(guò)透析、凝膠過(guò)濾或反相HPLC移除還原劑或降低它的濃度。有利地，透析或平衡緩沖液的pH低于7，優(yōu)選地6。必須檢測(cè)低pH緩沖液與抗原活性或穩(wěn)定性的相容性。
通過(guò)交聯(lián)劑和其它反應(yīng)條件的選擇可以調(diào)節(jié)RNA噬菌體外殼蛋白VLP上的表位密度。例如，交聯(lián)劑磺基-GMBS和SMPH通常允許達(dá)到高表位密度。高濃度反應(yīng)劑正面影響衍生作用，并且反應(yīng)條件的操縱可以用于控制偶聯(lián)RNA噬菌體外殼蛋白VLP，特別是Qβ外殼蛋白VLP的抗原數(shù)量。
在設(shè)計(jì)非天然第二附著位點(diǎn)之前，必須選擇它應(yīng)該融合、插入或一般地進(jìn)行基因工程改造的位置。例如，可以根據(jù)抗原晶體結(jié)構(gòu)選擇第二附著位點(diǎn)的位置。這種抗原晶體結(jié)構(gòu)可以提供關(guān)于分子C或N末端可用性(例如，從它們與溶劑的可接近性來(lái)確定)的信息，或者關(guān)于適于用做第二附著位點(diǎn)的殘基，諸如半胱氨酸殘基暴露于溶劑的信息。如Fab片段情況下，暴露的二硫鍵也可以是第二附著位點(diǎn)的來(lái)源，因?yàn)橐话愕赝ㄟ^(guò)用例如2-巰基乙胺、TCEP、β-巰基乙醇或DTT溫和還原，它們可以轉(zhuǎn)化為單個(gè)的半胱氨酸殘基。選擇不影響抗原免疫原性的溫和還原條件。一般地，在用自身抗原免疫旨在抑制該自身抗原和它的天然配體相互作用的情況下，第二附著位點(diǎn)的添加方式將允許抗與天然配體相互作用的位點(diǎn)的抗體產(chǎn)生。因此，將要選擇第二附著位點(diǎn)的位置以避免來(lái)源于第二附著位點(diǎn)或含有它的任何氨基酸接頭的空間位阻。在其它實(shí)施方式中，期望定向于不同于自身抗原與其天然配體的相互作用位點(diǎn)的位點(diǎn)的抗體應(yīng)答。在這種實(shí)施方式中，可以選擇第二附著位點(diǎn)以使它能夠阻止抗自身抗原與其天然配體的相互作用位點(diǎn)的抗體產(chǎn)生。
選定第二附著位點(diǎn)位置的其它標(biāo)準(zhǔn)包括抗原的寡聚化狀態(tài)，寡聚化位點(diǎn)，輔因子的存在，和是否可以獲得抗原結(jié)構(gòu)和序列中如下位點(diǎn)的公開(kāi)試驗(yàn)證據(jù)，其中在所述位點(diǎn)的抗原修飾與自身抗原的功能相容，或者與識(shí)別自身抗原的抗體的產(chǎn)生相容。
在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，Aβ1-6肽包含能與核心顆粒和VLP或VLP亞單位上第一附著位點(diǎn)締合的單一第二附著位點(diǎn)或單一活性附著位點(diǎn)。這確保了至少一個(gè)，但是通常是一個(gè)以上，優(yōu)選地10，20，40，80，120，150，180，210，240，270，300，360，400，450個(gè)以上抗原與核心顆粒或VLP進(jìn)行確定的一致結(jié)合和締合。因此，在抗原上提供單一第二附著位點(diǎn)或單一活性附著位點(diǎn)將確?？梢詫?dǎo)致非常高度有序和重復(fù)陣列的單一和一致類(lèi)型的結(jié)合或締合。例如，如果通過(guò)賴氨酸(做為第一附著位點(diǎn))和半胱氨酸(做為第二附著位點(diǎn))相互作用實(shí)現(xiàn)結(jié)合或締合，根據(jù)本發(fā)明該優(yōu)選實(shí)施方式，不管該半胱氨酸殘基是天然的或是非天然存在于抗原上的，都將確保每個(gè)抗原僅僅一個(gè)半胱氨酸殘基能結(jié)合或締合VLP或核心顆粒的第一附著位點(diǎn)。
在一些實(shí)施方式中，抗原上第二附著位點(diǎn)的改造需要融合氨基酸接頭，該氨基酸接頭含有適于做為根據(jù)本發(fā)明的第二附著位點(diǎn)的氨基酸。因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，氨基酸接頭通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵結(jié)合抗原或抗原決定簇。優(yōu)選地，氨基酸接頭包含第二附著位點(diǎn)，或者可替代地基本由第二附著位點(diǎn)組成。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，氨基酸接頭包含巰基或半胱氨酸殘基。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，氨基酸接頭是半胱氨酸。上面已經(jīng)提到了本發(fā)明氨基酸接頭的一些選擇標(biāo)準(zhǔn)及氨基酸接頭的其它優(yōu)選實(shí)施方式。
在本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，至少一個(gè)抗原或抗原決定簇，即Aβ1-6肽與病毒樣顆粒融合。如上所述，VLP典型地由至少一種裝配為VLP的亞單位組成。因此，在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗原或抗原決定簇，優(yōu)選地至少一個(gè)Aβ1-6肽與病毒樣顆粒的至少一種亞單位或能摻入VLP的蛋白質(zhì)融合，產(chǎn)生嵌合VLP-亞單位-Aβ1-6肽蛋白質(zhì)融合物。
通過(guò)插入到VLP亞單位序列中，或者通過(guò)融合到VLP亞單位或能摻入VLP的蛋白質(zhì)的N或C末端可以實(shí)現(xiàn)Aβ1-6肽的融合。此后，當(dāng)提到肽與VLP亞單位的融合蛋白時(shí)，包括與亞單位序列任一末端的融合或亞單位序列中肽的內(nèi)部插入。
通過(guò)將Aβ1-6肽序列插入到VLP亞單位變體中也可以實(shí)現(xiàn)融合，該VLP亞單位變體中已經(jīng)缺失了部分亞單位序列，也稱(chēng)為截短突變體。截短突變體可以具有VLP亞單位序列的部分N或C末端或內(nèi)部缺失。例如，具有氨基酸殘基79到81缺失的具體VLP HBcAg是具有內(nèi)部缺失的截短突變體。Aβ1-6肽與截短突變體VLP亞單位N或C末端的融合也產(chǎn)生了本發(fā)明的實(shí)施方式。同樣，通過(guò)置換也可以在VLP亞單位序列中實(shí)現(xiàn)表位的融合，其中例如對(duì)于具體的VLP HBcAg，用外源表位置換氨基酸79-81。因此，通過(guò)將Aβ1-6肽序列插入到VLP亞單位序列中，通過(guò)用Aβ1-6肽置換VLP亞單位的部分序列，或者通過(guò)缺失、置換或插入的聯(lián)合可以實(shí)現(xiàn)此后所稱(chēng)的融合。
嵌合的Aβ1-6肽-VLP亞單位一般能自裝配為VLP。這里也將展示出與其亞單位融合的表位的VLP稱(chēng)作嵌合VLP。如所述，病毒樣顆粒包含至少一種VLP亞單位，或者可替代地由至少一種VLP亞單位組成。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，病毒樣顆粒包含嵌合VLP亞單位和非嵌合VLP亞單位的混合物，或者可替代地由嵌合VLP亞單位和非嵌合VLP亞單位的混合物組成，從而產(chǎn)生了所謂的鑲嵌顆粒，其中該非嵌合VLP亞單位為沒(méi)有與抗原融合的VLP亞單位。這對(duì)于確保VLP形成和裝配可能是有利的。在這些實(shí)施方式中，嵌合VLP亞單位的比例可以是1，2，5，10，20，30，40，50，60，70，80，90，95％或更高。
可以向肽或表位序列任一末端添加側(cè)翼氨基酸殘基，其中該肽或表位序列將融合到VLP亞單位序列任一末端，或者插入到VLP亞單位序列內(nèi)部。甘氨酸和絲氨酸殘基是在側(cè)翼序列中使用的特別有利的氨基酸，其中向待要融合的肽添加該側(cè)翼序列。甘氨酸殘基賦予了額外的柔性，其可以減小外源序列融合到VLP亞單位序列中引起的潛在去穩(wěn)定作用。
在本發(fā)明具體實(shí)施方式
中，VLP是乙型肝炎核心抗原VLP。已經(jīng)描述了在HBcAg N末端(Neyrinck，S.等，Nature Med.51157-1163(1999))或在所謂的主要免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)(MIR)中插入Aβ1-6肽的融合蛋白(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001))，WO 01/98333)，并且它們是本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式。也已經(jīng)描述了MIR中有缺失的天然HBcAg變體(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)，明確地將這篇文獻(xiàn)整體并入為參考文獻(xiàn))，與N或C末端的融合，及與野生型HBcAg比較在對(duì)應(yīng)于缺失位點(diǎn)的MIR位置的插入是本發(fā)明另外的實(shí)施方式。也已經(jīng)描述了與C末端的融合(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001))。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易發(fā)現(xiàn)關(guān)于如何利用經(jīng)典分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建融合蛋白的指導(dǎo)(Sambrook，J等，編輯，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第二版，Cold Spring Habor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989)，Ho等，Gene 7751(1989))。已經(jīng)描述了編碼HBcAg和HBcAg融合蛋白并且可用于HBcAg和HBcAg融合蛋白表達(dá)的載體和質(zhì)粒(Pumpens，P.& Grens，E.Intervirology 4498-114(2001)，Neyrinck，S.等，Nature Med.51157-1163(1999))，這些載體和質(zhì)?？梢杂糜诒景l(fā)明實(shí)踐中。我們也通過(guò)實(shí)施例的方式(實(shí)施例6)描述了在HBcAg MIR中插入表位，產(chǎn)生嵌合的自裝配HBcAg。對(duì)自裝配效率和待要插入到HBcAg MIR中的表位的展示進(jìn)行優(yōu)化的一個(gè)重要因素是插入位點(diǎn)的選擇，及一旦插入，將要從HBcAg的MIR序列中缺失的氨基酸數(shù)目(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)；EP 0 421 635；U.S.專(zhuān)利號(hào).6,231,864)，或者換而言之，HBcAg中哪些氨基酸將用新表位置換。例如，已經(jīng)描述了用外源表位置換HBcAg氨基酸76-80，79-81，79-80，75-85或80-81(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)；EP0421635；US 6’231’864)。HBcAg含有長(zhǎng)精氨酸尾部(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology4498-114(2001))，其不是衣殼裝配所必需的，并且能結(jié)合核酸(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001))。包含或缺少該精氨酸尾部的HBcAg都是本發(fā)明的實(shí)施方式。
在本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，VLP是RNA噬菌體VLP。一旦在細(xì)菌中，特別是在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)RNA噬菌體主要外殼蛋白，其就自發(fā)裝配為VLP?？梢杂糜谥苽浔景l(fā)明組合物的噬菌體外殼蛋白的具體例子包括RNA噬菌體諸如噬菌體Qβ(SEQ ID NO4；PIR數(shù)據(jù)庫(kù)，記錄號(hào)VCBPQβ，稱(chēng)為Qβ CP和SEQ ID NO5；記錄號(hào)AAA16663，稱(chēng)為QβA1蛋白質(zhì))和噬菌體fr(SEQ ID NO7；PIR記錄號(hào)VCBPFR)的外殼蛋白。
在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，至少一個(gè)Aβ1-6肽與Qβ外殼蛋白融合。已經(jīng)描述了將表位融合到截短形式的Qβ A1蛋白質(zhì)C端，或者插入到A1蛋白質(zhì)中的融合蛋白構(gòu)建體(Kozlovska，T.M.，等，Intervirology，399-15(1996))。A1蛋白質(zhì)通過(guò)在UGA終止密碼子處的抑制產(chǎn)生，并且其有329個(gè)氨基酸或328個(gè)(如果考慮N末端甲硫氨酸的切割)氨基酸的長(zhǎng)度。通常在大腸桿菌(E.coli)中發(fā)生丙氨酸(Qβ CP基因編碼的第二個(gè)氨基酸)之前的N末端甲硫氨酸的切割，并且這與Qβ外殼蛋白N末端的情況相同。UGA琥珀密碼子3’的A1基因部分編碼195個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的CP延伸物。(在此CP延伸物的位置72和73之間插入至少一個(gè)Aβ1-6肽產(chǎn)生了本發(fā)明另一實(shí)施方式(Kozlovska，T.M.，等.，Intervirology 399-15(1996))。在C末端截短的Qβ A1蛋白質(zhì)C末端融合Aβ1-6肽產(chǎn)生了本發(fā)明另外的優(yōu)選實(shí)施方式。例如，Kozlovska等，(Intervirology，399-15(1996))描述了Qβ A1蛋白質(zhì)融合物，其中在位置19截短的Qβ CP延伸物的C末端融合表位。
如Kozlovska等(Intervirology，399-15(1996))所述，展示融合表位的顆粒的裝配通常需要A1蛋白質(zhì)-Aβ1-6肽融合物和野生型CP同時(shí)存在以形成鑲嵌顆粒。然而，包含僅由融合了至少一個(gè)Aβ1-6肽的VLP亞單位組成的病毒樣顆粒，特別是RNA噬菌體Qβ外殼蛋白的VLP的實(shí)施方式也包括在本發(fā)明范圍中。
可以通過(guò)多種方法實(shí)現(xiàn)鑲嵌顆粒的產(chǎn)生。Kozlovska等，Intervirology，399-15(1996)描述了3種方法，這3種方法都可以用在本發(fā)明實(shí)踐中。在第一種方法中，在含有編碼克隆的UGA抑制型tRNA的質(zhì)粒(pISM3001質(zhì)粒(Smiley B.K.，等.，Gene 13433-40(1993)))的大腸桿菌(E.coli)株系中，表達(dá)編碼Qβ A1蛋白質(zhì)融合物的質(zhì)粒以介導(dǎo)融合表位在VLP上的有效展示，其中所述Qβ A1蛋白質(zhì)融合物在CP和CP延伸之間具有UGA終止密碼子，而所述克隆的UGA抑制型tRNA將導(dǎo)致UGA密碼子翻譯為T(mén)rp。在另一個(gè)方法中，將CP基因終止密碼子修飾為UAA，并且共轉(zhuǎn)化表達(dá)A1蛋白質(zhì)-Aβ1-6肽融合物的第二質(zhì)粒。此第二質(zhì)粒編碼不同的抗生素抗性，并且復(fù)制起點(diǎn)與第一質(zhì)粒相容(Kozlovska，T.M.，等，Intervirology399-15(1996))。在第三種方法中，以雙順?lè)醋臃绞骄幋aCP和A1蛋白質(zhì)-Aβ1-6肽融合物，其可操作地連接啟動(dòng)子諸如Trp啟動(dòng)子，參見(jiàn)Kozlovska等，Intervirology，399-15(1996)的圖1中所述。
在另一實(shí)施方式中，Aβ1-6肽插入到fr CP的氨基酸2和3(切割后的CP，即切除了N末端甲硫氨酸的CP的編號(hào))之間，由此產(chǎn)生了Aβ1-6肽-fr CP融合蛋白。已經(jīng)描述了可用于本發(fā)明實(shí)踐中自裝配為VLP的fr CP融合蛋白質(zhì)的構(gòu)建和表達(dá)用載體和表達(dá)系統(tǒng)(Pushko P.等.，Prot.Eng.6883-891(1993))。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，Aβ1-6肽序列插入到fr CP缺失突變體中位于氨基酸2后，在所述突變體中已經(jīng)缺失了fr CP的殘基3和4(Pushko P.等，Prot.Eng.6883-891(1993))。
也已描述了在RNA噬菌體MS-2外殼蛋白N末端突出的β發(fā)夾中融合表位和之后融合表位在RNA噬菌體MS-2自裝配的VLP上的呈遞(WO92/13081)，并且通過(guò)插入或置換將Aβ1-6肽融合到MS-2 RNA噬菌體的外殼蛋白中也落入本發(fā)明的范圍中。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式中，Aβ1-6肽融合到乳頭瘤病毒衣殼蛋白上。在一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，Aβ1-6肽融合到牛乳頭瘤病毒1型(BPV-1)的主要衣殼蛋白L1上。已經(jīng)描述了桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)中用于BPV-1融合蛋白構(gòu)建和表達(dá)的載體和表達(dá)系統(tǒng)(Chackerian，B.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962373-2378(1999)，WO 00/23955)。用Aβ1-6肽置換BPV-1L1氨基酸130-136產(chǎn)生了BPV-1 L1-Aβ1-6肽融合蛋白，其是本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式。已經(jīng)描述了在桿狀病毒載體中的克隆和在桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞中的表達(dá)，并且它們可以用在本發(fā)明實(shí)踐中(Chackerian，B.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962373-2378(1999)，WO 00/23955)?？梢杂枚喾N方法諸如，凝膠過(guò)濾或蔗糖梯度超離心進(jìn)行展示融合Aβ1-6肽的裝配顆粒的純化(Chackerian，B.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962373-2378(1999)，WO00/23955)。
在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，Aβ1-6肽與能摻入到Ty VLP中的Ty蛋白質(zhì)融合。在一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，Aβ1-6肽與TYA基因編碼的p1或衣殼蛋白(Roth，J.F.，Yeast 16785-795(2000))融合。已經(jīng)從釀酒酵母(Saccharomyces Serevisiae)分離了酵母逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty1，2，3和4，而且已經(jīng)從粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces Pombae)分離了逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tf1(Boeke，J.D.和Sandmeyer，S.B.，“Yeast Transposable elements，”《The molecular and Cellular Biology of the Yeast SaccharomycesGenome dynamics，Protein Synthesis，and Energetics》，193頁(yè)，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1991))。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty1和2與copia類(lèi)植物和動(dòng)物元件有關(guān)，而Ty3屬于gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子家族，其與植物和動(dòng)物逆轉(zhuǎn)錄病毒有關(guān)。在Ty1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中，p1蛋白質(zhì)也稱(chēng)為Gag或衣殼蛋白，具有440個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。在VLP成熟期間，在位置408切割p1產(chǎn)生p2蛋白質(zhì)，其是VLP的必需成分。
已經(jīng)描述了p1融合蛋白和用于酵母中所述融合蛋白表達(dá)的載體(Adams，S.E.，等，Nature 32968-70(1987))。因此，例如通過(guò)將編碼Aβ1-6肽的序列插入到pMA5620質(zhì)粒的BamHI位點(diǎn)中，Aβ1-6肽可以與p1融合(Adams，S.E.，等，Nature 32968-70(1987))。編碼外源表位的序列克隆到pMA5620載體中導(dǎo)致融合蛋白表達(dá)，該融合蛋白包含以C末端融合在外源表位N末端的Ty1-15 p1的氨基酸1-381。同樣，用Aβ1-6肽進(jìn)行N末端融合，或者內(nèi)部插入到p1序列中，或者置換部分p1序列也落入本發(fā)明范圍中。特別地，Aβ1-6肽插入到Ty蛋白質(zhì)p1氨基酸30-31，67-68，113-114和132-133之間的Ty序列中(EP0677111)產(chǎn)生了本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式。
適于Aβ1-6肽融合的其它VLP是例如逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒(WO9630523)，HIV2 Gag(Kang，Y.C.，等，Biol.Chem.380353-364(1999))，豇豆花葉病毒(Taylor，K.M.等.，Bio1.Chem.380387-392(1999))，細(xì)小病毒VP2 VLP(Rueda，P.等，Virology 26389-99(1999))，HBsAg(US4,722,840，EP0020416B1)。
適于本發(fā)明實(shí)踐的嵌合VLP例子還有在Intervirology 391(1996)中描述的嵌合VLP。本發(fā)明中可以考慮使用的其它VLP例子是HPV-1，HPV-6，HPV-1 1，HPV-16，HPV-18，HPV-33，HPV-45，CRPV，COPV，HIV GAG，煙草花葉病毒。已經(jīng)制備了SV-40，多瘤病毒，腺病毒，單純皰疹病毒，輪狀病毒和諾沃克病毒的病毒樣顆粒，并且包含Aβ1-6肽的這些VLP的嵌合VLP也在本發(fā)明范圍中。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，用氨基酸接頭修飾適于產(chǎn)生本發(fā)明疫苗的Aβ1-6肽以便與VLP結(jié)合。這些Aβ1-6肽包括但不限于在C末端融合到接頭GGC上的Aβ1-6肽。適于融合到Aβ1-6片段N末端的氨基酸接頭包括但不限于序列CGG和CGHGNKS。適于融合到Aβ1-6的C末端的接頭包括但不限于序列GGC。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，當(dāng)接頭融合到Aβ或Aβ片段C末端時(shí)，酰胺化C末端半胱氨酸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，Aβ1-6與氨基酸接頭融合，并且具有序列NH2-DAEFRHGGC-CONH2，其中酰胺化C末端半胱氨酸(這用C末端的“-CONH2”標(biāo)明)，并且肽N末端是游離的(進(jìn)一步用“NH2-”標(biāo)明)。優(yōu)選地，該氨基酸接頭是短的，以避免誘導(dǎo)抗所述接頭氨基酸的免疫應(yīng)答，但是其應(yīng)該允許誘導(dǎo)與可溶Aβ和AD斑塊交叉反應(yīng)的抗體，并且可以有利于抗體和Aβ1-6肽相互作用。氨基酸接頭的其它適宜特性是柔性，優(yōu)選地缺少大氨基酸，大氨基酸可能干擾偶聯(lián)和/或引起抗接頭本身的免疫應(yīng)答。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，含有做為第二附著位點(diǎn)的半胱氨酸殘基的氨基酸接頭融合到Aβ1-6肽的C末端。
本發(fā)明實(shí)踐中適宜的其它Aβ片段包括來(lái)源于其它動(dòng)物物種、經(jīng)上述修飾的對(duì)應(yīng)于前述片段的Aβ片段，其中該Aβ片段激發(fā)與人淀粉樣斑塊和可溶性人Aβ交叉反應(yīng)的抗體。這種片段的例子是來(lái)源于靈長(zhǎng)類(lèi)(DAEFRH；SEQ ID NO84)，野兔(DAEFRH；SEQ ID NO85)，豚鼠(DAEFRH；SEQID NO88)，小鼠(DAEFGH；SEQ ID NO76)，大鼠(DAEFGH；SEQ IDNO87)和xaenopus laevis(DSEYRH；SEQ ID NO86)的Aβ1-6。
已經(jīng)報(bào)道了基于超表達(dá)人類(lèi)APP突變形式的轉(zhuǎn)基因小鼠的大量AD動(dòng)物模型(Games，D.等，Nature 373523-527(1995a)；Sturchler-Pierrat等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9413287-13292(1997)；Hsiao，K.，等，Science27499-102(1996)；Chen，G.等，Nature 408975-979(2000)；Janus，C.等.，Nature 408979-982(2000)；Morgan，D.等，Nature 408982-985(2000))。這些小鼠模型在轉(zhuǎn)基因超表達(dá)水平、轉(zhuǎn)基因上存在的AD突變和指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因超表達(dá)的啟動(dòng)子方面互相不同。這些動(dòng)物模型不能顯示AD所有的病理癥兆，特別是與年齡相關(guān)的行為改變、β淀粉狀蛋白沉積為不溶斑塊、神經(jīng)元內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)和整個(gè)前腦的神經(jīng)元損失(Chapman，P.F.Nature 408915-916(2000))。然而，記憶缺陷和鑒定它們的方法可以在這些模型中進(jìn)行確定，并且它們可以在動(dòng)物模型中用于檢測(cè)本發(fā)明組合物的作用(Chen，G.等，Nature 408975-979(2000)；Janus，C.等，Nature 408979-982(2000)；Morgan，D.等，Nature 408982-985(2000))。而且，可以在還出現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生的那些模型中研究與年齡相關(guān)的Aβ沉積為淀粉樣斑塊。
相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，對(duì)這里所述方法和應(yīng)用的其它適應(yīng)性更改和修改是顯而易見(jiàn)的，并且能夠進(jìn)行這樣的更改和修改而不背離本發(fā)明的范圍或其任何實(shí)施方式?，F(xiàn)在已經(jīng)詳細(xì)地描述了本發(fā)明，通過(guò)參考下面的實(shí)施例將更清楚地理解本發(fā)明，這里所包括的實(shí)施例僅僅是示例的目的，不意在限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1優(yōu)選的RNA噬菌體VLP或核心顆粒的克隆、構(gòu)建、表達(dá)和純化A.突變Qβ外殼蛋白的構(gòu)建和表達(dá)，及突變Qβ外殼蛋白VLP或衣殼的純化突變外殼蛋白的質(zhì)粒構(gòu)建和克隆pQβ-240的構(gòu)建質(zhì)粒pQβ10(Kozlovska，TM，等，Gene 137133-137)用做pQβ-240構(gòu)建的起始質(zhì)粒。通過(guò)反向PCR產(chǎn)生突變Lys13→Arg。以倒轉(zhuǎn)尾對(duì)尾方向設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)引物5′-GGTAACATCGGTCGAGATGGAAAACAAACTCTGGTCC-3′(SEQ ID NO48)和5′-GGACCAGAGTTTGTTTTCCATCTCGACCGATGTTACC-3′(SEQ ID NO49)。
第一次PCR的產(chǎn)物用做第二次PCR反應(yīng)的模板，其中使用上游引物5′-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3′(SEQ ID NO50)，和下游引物
5′-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3′(SEQ ID NO51)。用XbaI和Mβh1103I消化第二次PCR的產(chǎn)物，并且克隆到用相同限制酶切割的pQβ10表達(dá)載體中。利用PCR試劑盒試劑，根據(jù)生產(chǎn)者的方案進(jìn)行這些PCR反應(yīng)(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
利用定向標(biāo)記摻入方法進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)期望的突變。包含pQβ-240的大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞支持14kD蛋白質(zhì)的有效合成，該蛋白質(zhì)與從Qβ噬菌體顆粒分離的對(duì)照Qβ外殼蛋白在SDS-PAGE上共遷移。
所得到氨基酸序列(SEQ ID NO17)AKLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAYpQβ-243的構(gòu)建質(zhì)粒pQβ10用做pQβ-243構(gòu)建的起始質(zhì)粒。通過(guò)反向PCR產(chǎn)生突變Asn10→Lys。以反轉(zhuǎn)尾對(duì)尾方向設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)引物5′-GGCAAAATTAGAGACTGTTACTTTAGGTAAGATCGG-3′(SEQ ID NO52)和5′-CCGATCTTACCTAAAGTAACAGTCTCTAATTTTGCC-3′(SEQ ID NO53)。
第一次PCR產(chǎn)物用做第二次PCR反應(yīng)的模板，其中使用上游引物5′-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3′(SEQ ID NO50)，和下游引物5′-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3′(SEQ ID NO51)。用XbaI和Mph1103I消化第二次PCR產(chǎn)物，并且克隆到用相同限制酶切割的pQβ10表達(dá)載體中。利用PCR試劑盒試劑，根據(jù)生產(chǎn)者的方案進(jìn)行這些PCR反應(yīng)(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
利用定向標(biāo)記摻入方法測(cè)序，證實(shí)期望的突變。包含pQβ-243的大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞支持14kD蛋白質(zhì)的有效合成，該蛋白質(zhì)與從Qβ噬菌體顆粒分離的對(duì)照Qβ外殼蛋白在SDS-PAGE上共遷移。
所得到氨基酸序列(SEQ ID NO18)AKLETVTLGKIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAYpQβ-250的構(gòu)建質(zhì)粒pQβ-240用做pQβ-250構(gòu)建的起始質(zhì)粒。通過(guò)定點(diǎn)誘變產(chǎn)生突變Lys2→Arg。上游引物5′-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3′(SEQ ID NO54)和下游引物5′-GATTTAGGTGACACTATAG-3′(SEQ ID NO55)用于突變PCR片段的合成，在pQβ-185表達(dá)載體中在唯一限制位點(diǎn)NcoI和HindIII引入該突變PCR片段。利用PCR試劑盒試劑，根據(jù)生產(chǎn)者的程序進(jìn)行這些PCR反應(yīng)(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
利用定向標(biāo)記摻入方法測(cè)序，證實(shí)期望的突變。包含pQβ-250的大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞支持14kD蛋白質(zhì)的有效合成，該蛋白質(zhì)與從Qβ噬菌體顆粒分離的對(duì)照Qβ外殼蛋白在PAGE上共遷移。
所得到的氨基酸序列(SEQ ID NO19)ARLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAYpQβ-251的構(gòu)建質(zhì)粒pQβ10用做pQβ-251構(gòu)建的起始質(zhì)粒。通過(guò)反向PCR產(chǎn)生突變Lys16→Arg。以反轉(zhuǎn)尾對(duì)尾方向設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)引物5′-GATGGACGTCAAACTCTGGTCCTCAATCCGCGTGGGG-3′(SEQ ID NO56)和5′-CCCCACGCGGATTGAGGACCAGAGTTTGACGTCCATC-3′(SEQ ID NO57)。
第一次PCR產(chǎn)物用做第二次PCR反應(yīng)的模板，其中使用上游引物5′-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3′(SEQ ID NO50)，和下游引物5′-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3′(SEQ ID NO51)。用XbaI和Mph1103I消化第二次PCR產(chǎn)物，并且克隆到用相同限制酶切割的pQβ10表達(dá)載體中。利用PCR試劑盒試劑，根據(jù)生產(chǎn)者的程序進(jìn)行這些PCR反應(yīng)(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
利用定向標(biāo)記摻入方法測(cè)序，證實(shí)期望的突變。包含pQβ-251的大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞支持14kD蛋白質(zhì)的有效合成，該蛋白質(zhì)與從Qβ噬菌體顆粒分離的對(duì)照Qβ外殼蛋白在SDS-PAGE上共遷移。SEQ ID NO20中示出了該構(gòu)建體編碼所得的氨基酸序列。
pQβ-259的構(gòu)建質(zhì)粒pQβ-251用做pQβ-259構(gòu)建的起始質(zhì)粒。通過(guò)定點(diǎn)誘變產(chǎn)生突變Lys2→Arg。使用上游引物5′-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3′(SEQ ID NO54)和下游引物5′-GATTTAGGTGACACTATAG-3′(SEQ ID NO55)用于突變PCR片段的合成，在pQβ-185表達(dá)載體中在唯一限制位點(diǎn)NcoI和HindIII引入該突變PCR片段。利用PCR試劑盒試劑，根據(jù)生產(chǎn)者的程序進(jìn)行這些PCR反應(yīng)(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
利用定向標(biāo)記摻入方法測(cè)序，證實(shí)期望的突變。包含pQβ-259的大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞支持14kD蛋白質(zhì)的有效合成，該蛋白質(zhì)與從Qβ噬菌體顆粒分離的對(duì)照Qβ外殼蛋白在SDS-PAGE上共遷移。
所得到的氨基酸序列(SEQ ID NO21)AKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY用于Qβ和Qβ突變體表達(dá)和純化的一般方法表達(dá)用Qβ外殼蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)JM109。使用以Qβ外殼蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的克隆接種含有20μg/ml氨芐青霉素的5ml LB液體培養(yǎng)基。在37℃溫育該接種培養(yǎng)物16到24小時(shí)，不要振蕩。隨后在含有20μg/ml氨芐青霉素的100-300ml新鮮LB培養(yǎng)基中以1100稀釋制備的接種物，并且不要振蕩，在37℃過(guò)夜溫育。在燒瓶中，在含有1％酪蛋白氨基酸和0.2％葡萄糖的M9培養(yǎng)基中，以1∶50稀釋由此得到的第二次接種物，并且在振蕩條件下，在37℃過(guò)夜溫育。
純化用于純化方法的溶液和緩沖液1.裂解緩沖液LB50mM Tris-HClpH8.0，5mM EDTA，0.1％tritonX100和5微克/ml濃度新制備的PMSF。沒(méi)有溶菌酶和DNAse。
2.SAS水中飽和的硫酸銨。
3.緩沖液NET。
20mM Tris-HCl，pH 7.8和5mM EDTA和150mM NaCl。
4.PEGNET中40％(w/v)聚乙二醇6000。
破碎和裂解以2ml/g細(xì)胞，在LB中重懸浮冷凍的細(xì)胞。用22kH超聲處理混合物5次，15秒，各次間有1分鐘間隔以在冰上冷卻溶液。然后利用Janecki K60轉(zhuǎn)子，以14000rpm離心裂解液1小時(shí)。除非有另外說(shuō)明，利用相同轉(zhuǎn)子進(jìn)行所有下述離心步驟。在4℃ 貯藏上清液，用LB沖洗細(xì)胞殘?jiān)?次。離心后，合并裂解液的上清液和洗滌級(jí)分。
分級(jí)分離在對(duì)上述合并的裂解液攪拌的條件下，逐滴地添加飽和的硫酸銨溶液。將SAS體積調(diào)整到1/5總體積，以獲得20％的飽和度。放置溶液過(guò)夜，并且第二天以14000rpm離心該溶液20分鐘。用少量20％硫酸銨洗沉淀，并且再次離心。合并所獲得的上清液，逐滴地添加SAS以獲得40％飽和度。放置溶液過(guò)夜，并且第二天以14000rpm離心該溶液20分鐘。在NET緩沖液中溶解所獲得的沉淀。
層析在Sepharose CL-4B柱子上加樣NET緩沖液中重溶解的衣殼或VLP蛋白質(zhì)。層析期間洗脫了3個(gè)峰。第一個(gè)峰主要含有膜和膜片段，沒(méi)有收集該峰。衣殼包含在第二個(gè)峰中，而第三個(gè)峰含有其它大腸桿菌(E.coli)蛋白質(zhì)。
合并峰級(jí)分，并且調(diào)整NaCl濃度到0.65M的終濃度。在攪拌條件下逐滴地添加體積相應(yīng)于二分之一合并的峰級(jí)分的PEG溶液。不要攪拌，放置溶液過(guò)夜。通過(guò)以14000rpm離心20分鐘沉降衣殼蛋白。然后，在最小體積NET中溶解它，并且將它再一次加樣到Sepharose CL-4B柱子上。合并峰級(jí)分，并且用60％(w/v)飽和度的硫酸銨沉淀。在NET緩沖液中離心和重溶解后，在Sepharose CL-6B柱子上加樣衣殼蛋白以再次層析。
透析和干燥合并上述獲得的峰級(jí)分，利用大量無(wú)菌水進(jìn)行透析，并且冷干貯藏。
Qβ-240的表達(dá)和純化在LB中重懸浮細(xì)胞(用質(zhì)粒pQβ-240轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(E.coli)JM109)，超聲處理5次，15秒(水冰夾套)，并且以13000rpm離心1小時(shí)。在進(jìn)一步處理前，在4℃貯藏上清液，而用9ml LB洗殘?jiān)?次，最后用9ml LB中的0.7M尿素洗殘?jiān)?。合并所有上清液，并且加樣到SepharoseCL-4B柱子上。用硫酸銨沉淀合并的峰級(jí)分，并且離心。然后，在Sepharose2B柱子上進(jìn)一步純化重溶解的蛋白質(zhì)，并且最后在Sepharose 6B柱子上純化重溶解的蛋白質(zhì)。如上所述，最后用大量水透析衣殼峰，并且凍干。通過(guò)電子顯微鏡術(shù)證實(shí)衣殼蛋白裝配為衣殼。
Qβ-243的表達(dá)和純化在LB中重懸浮細(xì)胞(大腸桿菌RR1)和如一般方法所述處理該細(xì)胞。通過(guò)在Sepharose CL-4B柱子上和最后在Sepharose CL-2B柱子上的兩步連續(xù)凝膠過(guò)濾純化蛋白質(zhì)。如上所述，合并峰級(jí)分并凍干。通過(guò)電子顯微鏡術(shù)證實(shí)衣殼蛋白裝配為衣殼。
Qβ-250的表達(dá)和純化在LB中重懸浮細(xì)胞(用pQβ-250轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM 109)和如上所述處理該細(xì)胞。通過(guò)在Sepharose CL-4B柱子上和最后在Sepharose CL-2B柱子上凝膠過(guò)濾純化蛋白質(zhì)，并如上所述凍干該蛋白質(zhì)。通過(guò)電子顯微鏡術(shù)證實(shí)衣殼蛋白裝配為衣殼。
Qβ-259的表達(dá)和純化在LB中重懸浮細(xì)胞(用pQβ-259轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM 109)并超聲處理。用10ml LB洗殘?jiān)?次，并且用10ml LB中的0.7M尿素再次洗殘?jiān)Ｍㄟ^(guò)在Sepharose CL-4B柱子上的2個(gè)凝膠過(guò)濾層析步驟純化該蛋白質(zhì)。如上所述，透析和凍干該蛋白質(zhì)。通過(guò)電子顯微鏡術(shù)證實(shí)衣殼蛋白裝配為衣殼。
B.重組AP205 VLP的克隆，表達(dá)和純化AP205外殼蛋白基因的克隆通過(guò)利用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)和在用于測(cè)序的商購(gòu)質(zhì)粒pCR 4-TOPO中克隆，從產(chǎn)生自噬菌體AP205 RNA的兩個(gè)cDNA片段裝配AP205外殼蛋白(CP)的cDNA(SEQ ID NO28)。逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)是相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。質(zhì)粒p205-246中含有的第一片段包含CP序列上游269個(gè)核苷酸和編碼CP最開(kāi)始24個(gè)N末端氨基酸的74個(gè)核苷酸。質(zhì)粒p205-262中含有的第二片段包含編碼CP氨基酸12-131的364個(gè)核苷酸和CP序列下游另外162個(gè)核苷酸。p205-246和p205-262都來(lái)源于J.Klovins的惠贈(zèng)。
通過(guò)兩步PCR設(shè)計(jì)質(zhì)粒283.-58以在一個(gè)全長(zhǎng)CP序列中融合來(lái)源于質(zhì)粒p205-246和p205-262的兩個(gè)CP片段。
使用含有用于克隆到質(zhì)粒pQb185中的NcoI位點(diǎn)的上游引物p1.44，或含有用于克隆到質(zhì)粒pQb10中的XbaI位點(diǎn)的上游引物p1.45，和含有HindIII限制位點(diǎn)的下游引物p1.46(下劃線是限制酶的識(shí)別序列)p1.44 5’-AACC ATG GCA AAT AAG CCA ATG CAA CCG-3’(SEQID NO79)p1.45 5’-AATCTAGAATTTTCTGCGCACCCATCCCGG-3’(SEQ ID NO80)p1.46 5’-AAAAGC TTA AGC AGT AGT ATC AGA CGA TAC G-3’(SEQ ID NO81)。
兩個(gè)另外引物，在p205-262中所含片段的5’末端退火的引物p1.47，和在質(zhì)粒p205-246中所含片段的3’末端退火的引物p1.48用于擴(kuò)增第一次PCR中的片段。引物p1.47和p1.48相互互補(bǔ)。
p1.475’-GAGTGATCCAACTCGTTTATCAACTACATTT-TCAGCAAGTCTG-3’(SEQ ID NO82)p1.485’-CAGACTTGCTGAAAATGTAGTTGATAAACGA-GTTGGATCACTC-3’(SEQ ID NO83)。
在開(kāi)始的兩個(gè)PCR反應(yīng)中，產(chǎn)生兩個(gè)片段。用引物p1.45和p1.48和模板p205-246產(chǎn)生第一片段。用引物p1.47和p1.46和模板p205-262產(chǎn)生第二片段。這兩個(gè)片段都用做第二次PCR反應(yīng)的模板，其中用引物聯(lián)合p1.45和p1.46或p1.44和p1.46進(jìn)行拼接重疊延伸。用XbaI或NcoI和HindIII消化兩個(gè)第二步PCR反應(yīng)的產(chǎn)物，并且用相同限制位點(diǎn)分別克隆到源于pGEM的表達(dá)載體pQb10或pQb185中，位于大腸桿菌色氨酸操縱子啟動(dòng)子控制下。
獲得了兩個(gè)質(zhì)粒，pAP283-58(SEQ ID NO27)--其在pQb10中含有編碼野生型AP205 CP(SEQ ID NO28)的基因，和pAP281-32(SEQ IDNO30)一一其在pQb185中具有突變Pro5→Thr(SEQ ID NO29)。通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)外殼蛋白序列。PAP283-58含有位于CP的ATG密碼子上游及XbaI位點(diǎn)下游的49個(gè)核苷酸，并且含有該外殼蛋白mRNA推定的原始核糖體結(jié)合位點(diǎn)。
重組AP205 VLP的表達(dá)和純化A.重組AP205VLP的表達(dá)用質(zhì)粒pAP283-58轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。用單菌落接種具有20μg/ml氨芐青霉素的5ml LB液體培養(yǎng)基，并且不要振蕩，在37℃溫育16-24小時(shí)。
在含有20μg/ml氨芐青霉素的100-300ml LB培養(yǎng)基中以1∶100稀釋制備的接種物，并且不要振蕩，在37℃溫育過(guò)夜。在含有用于緩沖的0.2％葡萄糖和磷酸鹽的2TY培養(yǎng)基中以1∶50稀釋所得到的第二次接種物，并且在37℃，在振蕩器上溫育過(guò)夜。通過(guò)離心收集細(xì)胞，并且在-80℃冷凍。B.重組AP205 VLP的純化溶液和緩沖液裂解緩沖液50mM Tris-HCl pH 8.0，5mMEDTA，0.1％tritonX100和5微克/mlPMSF。
SAS水中飽和的硫酸銨。
緩沖液NET20mM Tris-HCl，pH 7.8和5mM EDTA和150mM NaCl。
PEGNET中40％(w/v)聚乙二醇6000。
裂解以2ml/g細(xì)胞，在裂解緩沖液中重懸浮冷凍的細(xì)胞。用22kH超聲處理混合物5次，15秒，各次間有1分鐘間隔以在冰上冷卻溶液。然后利用F34-6-38(Ependorf)轉(zhuǎn)子，以12000rpm離心裂解液20分鐘。除非有另外說(shuō)明，利用相同轉(zhuǎn)子進(jìn)行所有下述離心步驟。在4℃貯藏上清液，用裂解緩沖液洗細(xì)胞殘?jiān)?次。離心后，合并裂解液的上清液和洗滌級(jí)分。
硫酸銨沉淀可以進(jìn)一步用于純化AP205 VLP。在第一步中，選擇AP205VLP不沉淀的硫酸銨濃度。棄去所得到的沉淀。在下一步中，選擇定量沉淀AP205 VLP的硫酸銨濃度，通過(guò)離心(14000rpm，20分鐘)，從該沉淀步驟的沉淀物分離AP205 VLP。在NET緩沖液中溶解所得到的沉淀。層析將來(lái)源于合并的上清液的衣殼蛋白加樣到Sepharose 4B柱子上(2.8×70cm)，并且以4ml/小時(shí)/級(jí)分，用NET緩沖液洗脫。收集級(jí)分28-40，并且用60％飽和度的硫酸銨沉淀。在沉淀前，通過(guò)SDS-PAGE和Western印跡(用對(duì)AP205特異的抗血清進(jìn)行)分析級(jí)分。在NET緩沖液中重溶解通過(guò)離心分離的沉淀，并且將其加樣到Sepharose 2B柱子上(2.3×65cm)，以3ml/小時(shí)/級(jí)分洗脫。通過(guò)SDS-PAGE分析級(jí)分，之后收集級(jí)分44-50，合并，并且用60％飽和度的硫酸銨沉淀。在NET緩沖液中重溶解通過(guò)離心分離的沉淀，并且在Sepharose 6B柱子上(2.5×47cm)純化，以3ml/小時(shí)/級(jí)分洗脫。通過(guò)SDS-PAGE分析該級(jí)分。收集級(jí)分23-27，調(diào)整鹽濃度到0.5M，并且用PEG6000(其中從水中40％母液添加PEG6000，并且添加到13.3％的終濃度)沉淀。在NET緩沖液中重溶解通過(guò)離心分離的沉淀，并且如上所述加樣到相同Sepharose 2B柱子上，以相同方式洗脫。收集級(jí)分43-53，并且用60％飽和度的硫酸銨沉淀。在水中重溶解通過(guò)離心分離的沉淀，并且利用大量水透析所獲得的蛋白質(zhì)溶液。每克細(xì)胞可以分離約10mg純化的蛋白質(zhì)。
利用電子顯微鏡術(shù)對(duì)病毒樣顆粒檢查，表明它們與噬菌體顆粒相同。
實(shí)施例2含有賴氨酸殘基的肽插入到HBcAg(1-149)的c/el表位中HBcAg的c/el表位(殘基72到88)位于乙型肝炎病毒衣殼(HBcAg)表面的頂部區(qū)域。用肽Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(SEQ ID NO33)遺傳地置換該區(qū)域的一部分(脯氨酸79和丙氨酸80)，產(chǎn)生了HBcAg-Lys構(gòu)建體(SEQID NO26)。所引入的賴氨酸殘基在其側(cè)鏈含有反應(yīng)性的氨基，該反應(yīng)性氨基可以用于HBcAg顆粒與含有自由半胱氨酸基團(tuán)的任何抗原的分子間化學(xué)交聯(lián)。
通過(guò)PCRs產(chǎn)生具有SEQ ID NO78中所示氨基酸序列的HBcAg-LysDNA通過(guò)PCR分別地?cái)U(kuò)增編碼HBcAg片段的兩個(gè)片段(氨基酸殘基1到78和81到149)。用于這些PCRs的引物也引入了編碼Gly-Gly-Lys-Gly-Gly肽(SEQ ID NO33)的DNA序列。利用引物EcoRIHBcAg(s)和Lys-HBcAg(as)，從pEco63擴(kuò)增HBcAg(1到78)片段。利用引物L(fēng)ys-HBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)，從pEco63擴(kuò)增HBcAg(81到149)片段。引物L(fēng)ys-HBcAg(as)和Lys-HBcAg(s)在兩個(gè)PCR產(chǎn)物末端引入互補(bǔ)DNA序列，從而允許在隨后PCR裝配中兩個(gè)PCR產(chǎn)物的融合。利用引物EcoRIHBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)，通過(guò)PCR擴(kuò)增裝配的片段。
對(duì)于PCRs，在具有2單位Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的50ml反應(yīng)混合物中使用每種寡聚物各100pmol及50ng模板DNAs。對(duì)于兩個(gè)反應(yīng)，實(shí)施溫度循環(huán)如下94℃，2分鐘；94℃(1分鐘)，50℃(1分鐘)，72℃(2分鐘)，30個(gè)循環(huán)。
引物序列EcoRIHBcAg(s)(5’-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3’)(SEQ ID NO58)；Lys-HBcAg(as)(5’-CCTAGAGCCACCTTTGCCACCATCTTCTAAATTAG-TACCCACCCAGGTAGC-3’)(SEQ ID NO59)；Lys-HBcAg(s)(5’-GAAGATGGTGGCAAAGGTGGCTCTAGGGACC-TAGTAGTCAGTTATGTC-3’)(SEQ ID NO60)；HBcAg(1-149)Hind(as)(5’-CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG-3’)(SEQ ID NO61)。
為了通過(guò)PCR融合兩個(gè)PCR片段，在含有2單位Pwo聚合酶、0.1mMdNTPs和2mM MgSO4的50ml反應(yīng)混合物中使用100pmol引物EcoRIHBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)和100ng兩種純化的PCR片段。PCR循環(huán)條件是94℃，2分鐘；94℃(1分鐘)，50℃(1分鐘)，72℃(2分鐘)，30個(gè)循環(huán)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析及純化裝配的PCR產(chǎn)物，并且用EcoRI和HindIII限制酶，在適合的緩沖液中消化19小時(shí)。消化的DNA片段連接到EcoRI/HindIII消化的pKK載體中以產(chǎn)生pKK-HBcAg-Lys表達(dá)載體。通過(guò)EcoRI/HindIII限制分析和插入片段的DNA測(cè)序，分析PCR產(chǎn)物是否插入到載體中。
實(shí)施例3HBcAg-Lys的表達(dá)和純化用pKK-HBcAg-Lys轉(zhuǎn)化大腸桿菌株系K802或JM109。1ml細(xì)菌過(guò)夜培養(yǎng)物用于接種含有100μg/ml氨芐青霉素的100ml LB培養(yǎng)基。在37℃，培養(yǎng)該培養(yǎng)物4小時(shí)直到在600nm時(shí)，OD值達(dá)到約0.8。通過(guò)添加IPTG達(dá)到終濃度1mM進(jìn)行HBcAg-Lys合成的誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后，在37℃，進(jìn)一步振蕩細(xì)菌4小時(shí)。通過(guò)以5000×g離心15分鐘收集細(xì)菌。在-80℃冷凍沉淀。融解沉淀，并且在補(bǔ)加有200μg/ml溶菌酶和10μl Benzonase(Merck)的細(xì)菌裂解緩沖液(10mM Na2HPO4，pH 7.0，30mM NaCl，0.25％Tween-20，10mM EDTA)中重懸浮。在室溫下溫育細(xì)胞30分鐘，并且通過(guò)超聲處理破碎。利用含有pKK-HBcAg-Lys表達(dá)質(zhì)?；?qū)φ召|(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞，以IPTG誘導(dǎo)HBcAg-Lys表達(dá)。在添加IPTG前，從帶有pKK-HBcAg-Lys質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)物和從帶有對(duì)照質(zhì)粒的培養(yǎng)物取樣品。IPTG添加后4小時(shí)，再一次從含有pKK-HBcAg-Lys的培養(yǎng)物和從對(duì)照培養(yǎng)物取樣品。通過(guò)SDS-PAGE接著用考馬斯亮藍(lán)染色監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)。
然后以12,000×g離心裂解物30分鐘以移除不溶細(xì)胞殘?jiān)＠每笻BcAg的單克隆抗體(YVS1841，購(gòu)自Accurate Chemical and ScientificCorp.，Westbury，NY，USA)，通過(guò)Western印跡分析上清液和沉淀，表明顯著數(shù)量的HBcAg-Lys蛋白質(zhì)是可溶的。簡(jiǎn)而言之，以14,000×g離心來(lái)源于表達(dá)HBcAg-Lys的大腸桿菌細(xì)胞和來(lái)源于對(duì)照細(xì)胞的裂解物30分鐘。分離上清液(＝可溶級(jí)分)和沉淀(＝不溶級(jí)分)，并且用SDS樣品緩沖液稀釋到相同體積。通過(guò)SDS-PAGE分析樣品，接著用抗HBcAg單克隆抗體YVS1841以Western印跡分析樣品。
利用由4ml 65％蔗糖溶液，其上覆蓋有3ml 15％蔗糖溶液，之后為4ml細(xì)菌裂解物組成的蔗糖分級(jí)梯度，分級(jí)梯度離心澄清細(xì)胞裂解物。在4℃，以100,000×g離心樣品3小時(shí)。離心后，自梯度頂部收集1ml級(jí)分，并且通過(guò)SDS-PAGE和隨后的考馬斯亮藍(lán)染色分析。通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)HBcAg-Lys蛋白質(zhì)。
HBcAg-Lys蛋白質(zhì)在15％和65％蔗糖界面富集，表明該蛋白質(zhì)已經(jīng)形成了衣殼顆粒。大多數(shù)細(xì)菌蛋白質(zhì)保留在沒(méi)有蔗糖的梯度上層，因此，HBcAg-Lys顆粒的分級(jí)梯度離心導(dǎo)致了顆粒的富集和部分純化。
如下所述大規(guī)模進(jìn)行HBcAg-Lys的表達(dá)和純化。通過(guò)在含有100μg/ml氨芐青霉素的100ml LB中接種單菌落，在37℃過(guò)夜培養(yǎng)該培養(yǎng)物，制備過(guò)夜培養(yǎng)物。第二天，在800ml LB氨芐青霉素培養(yǎng)基中稀釋25ml預(yù)培養(yǎng)物，并且培養(yǎng)培養(yǎng)物到0.6-0.8 OD600的光密度。然后，用1mM IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物，并且使其生長(zhǎng)另外4小時(shí)?；救缟纤?，收集細(xì)胞并且裂解。
然后，通過(guò)用硫酸銨(30％飽和度)首先從澄清的細(xì)胞裂解物沉淀蛋白質(zhì)，然后在凝膠過(guò)濾柱子(Sephacryl S-400，Pharmacia)上加樣重溶解的沉淀，純化HBcAg-Lys。用硫酸銨再一次沉淀合并的級(jí)分，第二次重溶解沉淀并在相同凝膠過(guò)濾柱子上加樣。最后合并和濃縮級(jí)分，并且用Bradford試驗(yàn)(BioRad)估測(cè)濃度。
實(shí)施例4無(wú)自由半胱氨酸殘基但含有插入的賴氨酸殘基的HBcAg的構(gòu)建利用下面方法，構(gòu)建這里稱(chēng)為HBcAg-lys-2cys-Mut的肝炎核心抗原(HBcAg)，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO25中48和107的位置沒(méi)有半胱氨酸殘基，但含有插入的賴氨酸殘基。
通過(guò)用下面的PCR引物聯(lián)合，首先分別擴(kuò)增如上述實(shí)施例2中所述制備的HBcAg-Lys基因的3個(gè)片段，以引入兩個(gè)突變。利用PCR方法和常規(guī)克隆技術(shù)制備HBcAg-lys-2cys-Mut基因。簡(jiǎn)言之，下列引物用于制備片段1引物1EcoRIHBcAg(s)CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG(SEQ ID NO58)引物248asGTGCAGTATGGTGAGGTGAGGAATGCTCAGGAGACTC(SEQID NO62)
下面引物用于制備片段2引物348sGSGTCTCCTGAGCATTCCTCACCTCACCATACTGCAC(SEQID NO63)引物4107asCTTCCAAAAGTGAGGGAAGAAATGTGAAACCAC(SEQ ID NO64)下面引物用于制備片段3引物5HBcAg149hind-asCGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGC-GTTGATAG(SEQ ID NO65)引物6107sGTGGTTTCACATTTCTTCCCTCACTTTTGGAAG(SEQ ID NO66)。
然后，用PCR引物EcoRIHBcAg(s)和107as聯(lián)合片段1和2以產(chǎn)生片段4。然后用引物EcoRIHBcAg(s)和HBcAg149hind-as聯(lián)合片段4和片段3以產(chǎn)生全長(zhǎng)基因。然后，用EcoRI(GAATTC)和HindIII(AAGCTT)酶消化全長(zhǎng)基因，并且克隆到在相同限制位點(diǎn)切割的pKK載體(Pharmacia)中。如實(shí)施例3中所述進(jìn)行HBcAg-lys-2cys-Mut的表達(dá)和純化。
實(shí)施例5HBcAg1-185-Lys的構(gòu)建如實(shí)施例2中所述修飾肝炎核心抗原(HBcAg)1-185。用肽Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(SEQ ID NO33)通過(guò)遺傳方式置換c/e1表位(殘基72到88)區(qū)域的一部分(脯氨酸79和丙氨酸80)，產(chǎn)生HBcAg-Lys構(gòu)建體(SEQID NO26)。所引入的賴氨酸殘基在其側(cè)鏈含有反應(yīng)性氨基，該氨基可以用于HBcAg顆粒與含有自由半胱氨酸基團(tuán)的任何抗原的分子間化學(xué)交聯(lián)。PCR方法和常規(guī)克隆技術(shù)用于制備HBcAg1-185-Lys基因。
如上述實(shí)施例2中所述，從pEco63擴(kuò)增HBcAg基因的兩個(gè)單獨(dú)的片段，并且隨后通過(guò)PCR融合兩個(gè)片段以裝配全長(zhǎng)基因，從而插入Gly-Gly-Lys-Gly-Gly序列(SEQ ID NO33)。使用下面PCR引物聯(lián)合片段1引物1EcoRIHBcAg(s)(SEQ ID NO58)(參見(jiàn)實(shí)施例2)引物2Lys-HBcAg(as)(SEQ ID NO59)(參見(jiàn)實(shí)施例2)片段2引物3Lys-HBcAg(s)(SEQ ID NO60)(參見(jiàn)實(shí)施例2)引物4HBcAgwtHindIIIICGCGTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG(SEQID NO67)裝配引物1EcoRIHBcAg(s)(SEQ ID NO58)(參見(jiàn)實(shí)施例2)引物2HBcAgwtHindIIII(SEQ ID NO67)。
然后，用EcoRI(GAATTC)和HindIII(AAGCTT)酶消化裝配的全長(zhǎng)基因，并且克隆到在相同限制位點(diǎn)切割的pKK載體(Pharmacia)中。
實(shí)施例6HBcAg MIR區(qū)域中肽表位的融合用具有序列VNLTWSRASG(SEQ ID NO68)的表位CεH3置換HBcAg1-185殘基79和80。CεH3序列來(lái)源于人IgE重鏈第三恒定區(qū)的序列。利用裝配PCR方法，將表位插入到HBcAg1-185序列中。在第一PCR步驟中，來(lái)源于ATCC克隆pEco63，并且用引物HBcAg-wt EcoRI fwd和引物HBcAg-wt Hind III rev擴(kuò)增的HBcAg1-185基因用做兩個(gè)單獨(dú)反應(yīng)中的模板，以擴(kuò)增含有編碼CεH3序列的序列元件的兩個(gè)片段。然后在第二PCR步驟中，在裝配PCR反應(yīng)中裝配這兩個(gè)片段。
第一PCR步驟中的引物聯(lián)合CεH3 fwd和HBcAg-wt Hind III rev，及HBcAg-wt EcoRI fwd和CεH3 rev。在裝配PCR反應(yīng)中，在沒(méi)有外部引物的3輪PCR循環(huán)中，首先裝配第一PCR步驟中分離的兩個(gè)片段，之后將外部引物添加到反應(yīng)混合物中進(jìn)行下面25輪循環(huán)。外部引物HBcAg-wt EcoRI fwd和HBcAg-wt Hind III rev。
利用EcoRI和HindIII位點(diǎn)，將PCR產(chǎn)物克隆到pKK223.3中，以在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)(參見(jiàn)實(shí)施例2)。如實(shí)施例2中所述，在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)嵌合VLP和純化該嵌合VLP。從凝膠過(guò)濾洗脫HBcAg1-185-CεH3的洗脫體積表明融合蛋白和嵌合VLP實(shí)現(xiàn)裝配。
引物序列CεH3fwd5′GTT AAC TTG ACC TGG TCT CGT GCT TCT GGT GCA TCC AGG GAT CTA GTA GTC 3′(SEQ ID NO69)V N L T W S R A S G A80 S R D L V V86(SEQ ID NO70)CεH3rev5′ACC AGA AGC ACG AGA CCA GGT CAA GTT AAC ATC TTC CAA ATT ATT ACC CAC 3′(SEQ ID NO71)D78 E L N N G V72(SEQ ID NO72)HBcAg-wt EcoRI fwd5’CCGgaattcATGGACATTGACCCTTATAAAG(SEQ ID NO73)HBcAg-wt Hind III rev5’CGCGTCCCaagcttCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG(SEQ ID NO74)實(shí)施例7HBcAg MIR區(qū)域中Aβ1-6肽的融合用Aβ1-6肽序列DAEFRH(SEQ ID NO75)或DAEFGH(SEQ ID NO76)置換HBcAg1-185的殘基79和80。利用實(shí)施例6中所述相同的策略設(shè)計(jì)兩個(gè)重疊引物，并且通過(guò)裝配PCR構(gòu)建融合蛋白質(zhì)。將PCR產(chǎn)物克隆到pKK223.3載體中，并且在大腸桿菌(E.coli)K802中表達(dá)。如實(shí)施例3中所述表達(dá)嵌合VLP，并且純化該嵌合VLP。
實(shí)施例8Aβ1-6肽與在CP延伸的位置19截短的Qβ A1蛋白質(zhì)的C末端融合在使用pQβ10做為模板的PCR反應(yīng)中，使用在Qβ A1基因5’末端退火的引物和在A1基因3’末端退火的引物，并且該引物還包含編碼具有序列DAEFRH(SEQ ID NO75)或DAEFGH(SEQ ID NO76)的Aβ1-6肽的序列元件。PCR產(chǎn)物克隆到pQβ10(Kozlovska T.M.等，Gene 137133-37(1993))中，并且如實(shí)施例1中所述表達(dá)和純化嵌合VLP。
實(shí)施例9在fr外殼蛋白的位置2和3之間插入Aβ1-6肽通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，在pFrd8載體(Pushko，P.et al.，Prot.Eng.6883-91(1993))的Bsp119I位點(diǎn)中插入互補(bǔ)引物，所述互補(bǔ)引物編碼具有DAEFRH(SEQ ID NO75)或DAEFGH(SEQ ID NO76)的Aβ1-6肽序列，并且含有Bsp119I匹配末端及能引起讀框內(nèi)插入的另外核苷酸。做為可替代方案，用Bsp119I消化后，用Klenow補(bǔ)平pFrd8載體的突出端，并且在Klenow處理后，在pFrd8中連接編碼Aβ1-6肽序列的寡核苷酸和用于符合讀框克隆的另外核苷酸。通過(guò)測(cè)序分析具有正確方向插入片段的克隆。如Pushko，P.等，Prot.Eng.6883-91(1993)中所述進(jìn)行大腸桿菌JM109或大腸桿菌K802中嵌合融合蛋白的表達(dá)和純化，但是用SepharoseCL-4B或Sephacryl S-400(Pharmacia)柱子進(jìn)行層析步驟。與實(shí)施例1中所述用于Qβ的方法相似，用硫酸銨沉淀細(xì)胞裂解物，并且通過(guò)兩個(gè)連續(xù)的凝膠過(guò)濾純化步驟純化。
實(shí)施例10在載體pOGS8111中于Ty1蛋白質(zhì)p1的位置67和68之間插入Aβ1-6肽合成編碼序列DAEFRH(SEQ ID NO75)或DAEFGH(SEQ ID NO76)的Aβ1-6肽的兩個(gè)互補(bǔ)寡核苷酸，該寡核苷酸末端與pOGS8111的NheI位點(diǎn)匹配。根據(jù)EP 677’111的描述，添加另外核苷酸以允許編碼Aβ1-6肽的序列以符合讀框的方式插入。由pOGS8111的TyA(d)基因中寡核苷酸插入造成的改變的NheI位點(diǎn)編碼位于插入表位側(cè)翼的氨基酸AS和SS。
如EP0677111和其中參考文獻(xiàn)中所述，將pOGS8111轉(zhuǎn)化到釀酒酵母(S.cervisiae)株系MC2中用于嵌合Ty VLP的表達(dá)。如EP 677’111中所述，通過(guò)蔗糖梯度超離心純化嵌合Ty VLP。
實(shí)施例11Aβ1-6肽插入到乳頭瘤病毒1型(BPV-1)的主要衣殼蛋白L1中如所述(Chackerian，B.等，Proc.Natl.Acad.USA 962373-2378(1999))，用編碼具有序列DAEFRH(SEQ ID NO75)或DAEFGH(SEQID NO76)的Aβ1-6肽的序列置換pFastBac1(GIBCO/BRL)載體中克隆的BPV-1 L1基因氨基酸130-136的編碼序列。通過(guò)核苷酸序列分析證實(shí)構(gòu)建體序列。如制造商所述，利用GIBCO/BRL桿狀病毒系統(tǒng)產(chǎn)生重組桿狀病毒。如Kirnbauer，R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.8912180-84(1992)和Greenstone，H.L.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.951800-05(1998)所述，從桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞純化嵌合VLP。
實(shí)施例12用融合VLP的Aβ1-6肽免疫小鼠如實(shí)施例13和14中所述，使用實(shí)施例7-11中產(chǎn)生的展示序列DAEFRH(SEQ ID NO75)或DAEFGH(SEQ ID NO76)的Aβ1-6肽的嵌合VLP，免疫人轉(zhuǎn)基因APP小鼠或C57/BL6小鼠。如實(shí)施例13中所述，在Aβ1-6肽或Aβ1-40肽或Aβ1-42肽特異的ELISA中分析從免疫小鼠獲得的血清。
如實(shí)施例14中所述，通過(guò)免疫一大組人APP轉(zhuǎn)基因小鼠檢查疫苗的保護(hù)作用。
實(shí)施例13Aβ1-6肽和Qβ VLP的偶聯(lián)(QβAβ1-6)，及用QβAβ1-6免疫小鼠A.Aβ1-6肽和Qβ VLP的偶聯(lián)化學(xué)合成Aβ1-6肽(序列NH2-DAEFRHGGC-CONH2)(SEQ ID NO77)；開(kāi)始的NH2基團(tuán)表示該肽具有自由N末端，并且末端NH2基團(tuán)表示該肽具有酰胺化的羧基末端。如實(shí)施例1中所述，表達(dá)和純化Qβ VLP。在室溫(RT)下，在20mM Hepes，150mM NaCl，pH 8.2(HBS，pH 8.2)中使Qβ VLP以2mg/ml濃度(Bradford測(cè)定法中測(cè)定的)與1.43mMSMPH(Pierce，Rockford IL)(自DMSO中的母液稀釋)反應(yīng)30分鐘。然后，在4℃，用HBS，pH 8.2緩沖液透析該反應(yīng)混合物，并且與反應(yīng)混合物中稀釋的0.36mM Aβ1-6肽(來(lái)自DMSO中的50mM母液)反應(yīng)。在15℃，使偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行2小時(shí)，并且用pH 8.2的1000倍體積HBS透析反應(yīng)混合物2×2小時(shí)，并且在液氮中等份急驟冷凍，在使用前在-80℃貯藏。
融解等份試樣，并且通過(guò)SDS-PAGE估測(cè)Aβ1-6肽與Qβ VLP亞單位的偶聯(lián)，并且在Bradford測(cè)定法中測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。圖1中示出了偶聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果。
圖1表示Aβ1-6肽與Qβ VLP偶聯(lián)反應(yīng)的SDS-PAGE分析。在16％Tris甘氨酸凝膠上，在還原條件下，對(duì)樣品進(jìn)行電泳，用考馬斯亮藍(lán)染色。泳道1是蛋白質(zhì)標(biāo)記，在凝膠左側(cè)邊界標(biāo)出了相應(yīng)的分子量；泳道2，衍生的Qβ VLP蛋白質(zhì)；泳道3，Qβ VLP蛋白質(zhì)與Aβ1-6肽偶聯(lián)反應(yīng)的上清液；泳道4，Qβ VLP蛋白質(zhì)與Aβ1-6肽偶聯(lián)反應(yīng)的沉淀；在圖中，用箭頭指示對(duì)應(yīng)于每個(gè)單體偶聯(lián)1，2和3個(gè)肽的偶聯(lián)產(chǎn)物。平均每個(gè)亞單位偶聯(lián)1.5以上的個(gè)肽；幾乎沒(méi)有亞單位沒(méi)有被偶聯(lián)。
B.用偶聯(lián)Qβ VLP的Aβ1-6肽免疫小鼠和免疫應(yīng)答分析在第0和14天，在小鼠(3只小鼠)中皮下注射偶聯(lián)Aβ1-6肽的Qβ VLP(這里命名為Qb-Ab-1-6)。如上所述，使Aβ1-6肽偶聯(lián)Qβ VLP蛋白質(zhì)。用在PBS中稀釋到200μl的10μg疫苗免疫每只小鼠(C57BL/6)。在21天，從小鼠眼眶后取血，并且在抗Aβ1-6肽的ELISA中測(cè)定對(duì)Aβ1-6肽特異的抗體效價(jià)。利用化學(xué)交聯(lián)劑磺基-SPDP，Aβ1-6肽偶聯(lián)牛RNAase A。用偶聯(lián)的RNAase制備物，以10μg/ml濃度包被ELISA板。封閉該板，然后與系列稀釋的小鼠血清溫育。用酶促標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體檢測(cè)結(jié)合的抗體。做為對(duì)照，也檢測(cè)了相同小鼠的免疫前血清。結(jié)果如圖2中所示。
圖2表示在用偶聯(lián)Qβ VLP的Aβ1-6肽免疫的小鼠的血清中，針對(duì)Aβ1-6肽特異性IgG抗體的ELISA分析。結(jié)果表示免疫的3只小鼠(A1-A3)，在圖中免疫前血清表示為“Pre”；示出了一個(gè)免疫前血清的結(jié)果。免疫前血清和用“Qb-Ab-1-6”免疫的小鼠血清的比較表明，在沒(méi)有佐劑情況下，可以獲得抗肽Aβ1-6的強(qiáng)特異性抗體應(yīng)答。C.抗Aβ1-40肽的ELISA在DMSO中制備人Aβ1-40或Aβ1-42肽母液，并且使用前，在包被緩沖液中稀釋該母液。用0.1μg/孔Aβ1-40肽包被ELISA板。封閉該板，然后與上述獲得小鼠血清的系列稀釋物溫育。用酶學(xué)標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體檢測(cè)結(jié)合的抗體。做為對(duì)照，也包括接種前獲得的血清。計(jì)算表現(xiàn)出高于基線平均3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差的血清稀釋度，并且定義為“ELISA效價(jià)”。在免疫前血清中沒(méi)有檢測(cè)到特異性抗體。針對(duì)3只小鼠獲得的效價(jià)是1∶100000，表明抗Aβ1-40的強(qiáng)特異性免疫應(yīng)答。因此，用偶聯(lián)Qβ VLP的Aβ1-6肽免疫可以激發(fā)與Aβ1-40交叉反應(yīng)的強(qiáng)抗體效價(jià)。
圖3表示ELISA結(jié)果。針對(duì)用如上所述偶聯(lián)Qβ VLP的Aβ1-6肽免疫的3只小鼠(A1-A3)的血清，獲得以405nm光密度表示的ELISA信號(hào)，針對(duì)X軸上表示的每個(gè)稀釋度對(duì)該信號(hào)繪圖。示出了于21天取血時(shí)，來(lái)自3只小鼠的結(jié)果。也包括免疫前的血清。如上所述檢測(cè)血清中抗體的效價(jià)，所有3只小鼠的效價(jià)均是1∶100000。
實(shí)施例14人APP轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫帶有人APP轉(zhuǎn)基因的8月齡雌性APP23小鼠(Sturchler-Pierrat等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9413287-13292(1997))用于接種。用在無(wú)菌PBS中稀釋的25μg疫苗皮下注射小鼠，并且14天后，用相同量的疫苗加強(qiáng)免疫。在開(kāi)始免疫前和加強(qiáng)免疫注射后7天，從小鼠尾靜脈取血。如實(shí)施例13中所述，通過(guò)ELISA，分析血清中對(duì)Aβ1-6、Aβ1-40和Aβ1-42特異的抗體的存在。
實(shí)施例15鼠Aβ1-6肽與Qβ VLP的偶聯(lián)，小鼠中疫苗的注射，和免疫應(yīng)答的分析化學(xué)合成鼠Aβ1-6肽(序列NH2-DAEFGHGGC-CONH2)(SEQ IDNO78)，并且用于如實(shí)施例13中所述偶聯(lián)Qβ VLP。在C57BL/6小鼠中注射疫苗，測(cè)定激發(fā)的抗鼠Aβ1-6、鼠Aβ1-40和鼠Aβ1-42的抗體的效價(jià)。如實(shí)施例13中所述進(jìn)行免疫和ELISA測(cè)定。
實(shí)施例16激發(fā)的抗Aβ1-6的血清與人APP轉(zhuǎn)基因小鼠斑塊和AD斑塊的結(jié)合大腦切片中的免疫組織化學(xué)18月齡雜合APP23小鼠的連續(xù)石蠟大腦切片和來(lái)源于Braak III期AD患者的entorhinalcortex切片(Institute of Pathology，University Basel)用于染色。通過(guò)用濃甲酸處理人大腦切片5分鐘，和在90℃用微波加熱小鼠大腦切片3分鐘，以增強(qiáng)抗原性。在具有3％山羊血清的PBS中以1∶1000稀釋抗人Aβ1-6激發(fā)的小鼠血清(如實(shí)施例13中所述獲得)，并且溫育過(guò)夜。漂洗后，用在PBS中以1∶200稀釋的生物素?；剐∈蟮诙贵w溫育切片1小時(shí)。漂洗后，用抗生物素蛋白-生物素-過(guò)氧化物酶技術(shù)(ABC-Elite Kit PK6100；Vector Laboratories)進(jìn)一步處理切片。最后，切片與二氨基聯(lián)苯胺(DAB)金屬加強(qiáng)的底物(Boehringer，Code 1718096)反應(yīng)，用蘇木精明礬對(duì)染，脫水，在二甲苯中透明并蓋上蓋玻片。
在圖4A和B中示出了組織學(xué)染色的結(jié)果。用經(jīng)偶聯(lián)Qβ VLP的人類(lèi)Aβ1-6免疫的3只小鼠的血清染色切片。每種血清都陽(yáng)性染色來(lái)源于轉(zhuǎn)基因小鼠和AD的淀粉樣斑塊。示出了3種血清之一種的結(jié)果?？谷祟?lèi)Aβ1-6激發(fā)的血清明顯地染色了轉(zhuǎn)基因人APP23小鼠的淀粉樣斑塊，及來(lái)源于AD患者的淀粉樣斑塊。免疫前的血清是陰性的。抗體染色細(xì)胞外淀粉樣斑塊和分離的血管。
實(shí)施例1 7通過(guò)小鼠斑塊組織學(xué)評(píng)價(jià)抗人類(lèi)Aβ1-6激發(fā)的血清的特異性腦切片的免疫組織化學(xué)用如實(shí)施例13中所述抗人類(lèi)Aβ1-6激發(fā)的代表性小鼠血清，或者用對(duì)鼠或人APP的最后20個(gè)氨基酸具特異性并且因此不識(shí)別Aβ的兔多克隆抗體，如實(shí)施例16中所述染色超表達(dá)人類(lèi)APP的3月齡和18月齡雜合APP23小鼠的連續(xù)石蠟?zāi)X切片。除了使用生物素?；目雇玫诙贵w(BA1000，Vector Laboratories)外，如實(shí)施例16中所述，處理與兔多克隆抗體溫育的切片。
在圖5A，B，C，D和E上示出了組織學(xué)染色的結(jié)果。標(biāo)記在切片左下部的Aβ1-6表示抗Aβ1-6激發(fā)的血清已經(jīng)被用于染色，而“Pab”表示切片已經(jīng)用對(duì)鼠或人類(lèi)APP最后20個(gè)氨基酸(對(duì)應(yīng)于APP695中位置676-695)特異的多克隆抗體染色。
對(duì)來(lái)源于18月齡小鼠的切片的染色比較(圖5A和C)，表明抗Aβ1-6激發(fā)的血清不與大腦中表達(dá)的APP交叉反應(yīng)，但是APP被對(duì)照多克隆抗體染色。圖5B表示來(lái)源于3月齡小鼠(在沒(méi)有觀察到淀粉狀蛋白沉積的時(shí)間點(diǎn))的大腦切片被對(duì)APP特異的多克隆抗體染色。圖5D和5E分別表示圖5A和圖5B中的海馬CA1錐體層的放大圖。
實(shí)施例18A.Aβ1-6肽和fr衣殼蛋白的偶聯(lián)在25℃，在搖擺振蕩器上，20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2中的120μM fr衣殼蛋白溶液與從DMSO中母液稀釋的10倍摩爾過(guò)量的SMPH(Pierce)反應(yīng)30分鐘。隨后，在4℃，利用1L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.2透析反應(yīng)溶液2次2小時(shí)。然后，在16℃，在搖擺振蕩器上，透析的fr反應(yīng)混合物與5倍摩爾過(guò)量的Aβ1-6肽(序列NH2-DAEFRHGGC-CONH2)(SEQ ID NO77)反應(yīng)2小時(shí)。通過(guò)SDS-PAGE分析偶聯(lián)產(chǎn)物。
B.Aβ 1-6肽和HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶聯(lián)在25℃，在搖擺振蕩器上，20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2中的1ml 120μM HBcAg-Lys-2cys-Mut溶液與從DMSO中母液稀釋的10倍摩爾過(guò)量的SMPH(Pierce)反應(yīng)30分鐘。隨后，在4℃，利用1L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.2透析反應(yīng)溶液2次2小時(shí)。然后，在16℃，在搖擺振蕩器上，透析的HBcAg-Lys-2cys-Mut反應(yīng)混合物與5倍摩爾過(guò)量的Aβ1-6肽(序列NH2-DAEFRHGGC-CONH2)(SEQ ID NO77)反應(yīng)2小時(shí)。通過(guò)SDS-PAGE分析偶聯(lián)產(chǎn)物。
C.Aβ1-6肽和菌毛的偶聯(lián)在室溫，在搖擺振蕩器上，20mM Hepes，pH 7.4中的125μM1型大腸桿菌菌毛溶液與50倍摩爾過(guò)量的交聯(lián)劑SMPH(Pierce)(從DMSO中的母液稀釋)反應(yīng)60分鐘。在PD-10柱子(Amersham-Pharmacia Biotech)上使反應(yīng)混合物脫鹽。合并從柱子上洗脫的含有蛋白質(zhì)的級(jí)分，并且在16℃，在搖擺振蕩器上，使脫鹽并衍生化的菌毛蛋白質(zhì)與5倍摩爾過(guò)量的Aβ1-6肽(序列NH2-DAEFRHGGC-CONH2)(SEQ ID NO77)反應(yīng)2小時(shí)。通過(guò)SDS-PAGE分析偶聯(lián)產(chǎn)物。
D.用偶聯(lián)fr衣殼蛋白、HBcAg-Lys-2cys-Mut或菌毛的Aβ1-6肽免疫小鼠在第0和14天，在小鼠(3只小鼠)中皮下注射上述偶聯(lián)fr衣殼蛋白、HBcAg-Lys-2cys-Mut或菌毛的Aβ1-6肽。用在PBS中稀釋到200μ1的10μg疫苗免疫每只小鼠(C57BL/6)。在第21天從小鼠眼眶后取血，并且如實(shí)施例13中所述通過(guò)ELISA測(cè)定對(duì)Aβ1-6肽或Aβ1-40或Aβ1-42特異的抗體的效價(jià)。
實(shí)施例19用Qβh Aβ1-6免疫恒河猴因?yàn)槿祟?lèi)和恒河猴之間Aβ序列相同，所以為了檢測(cè)在Aβ1-6是自身抗原的情況下基于人類(lèi)Aβ1-6肽的疫苗對(duì)于抗人類(lèi)Aβ抗體的誘導(dǎo)，用Qβh Aβ1-6免疫恒河猴。如實(shí)施例13中所述制備Qβh Aβ1-6疫苗。在0天，用50μg疫苗免疫10至15步齡的4只恒河猴，并且在28和56天，用25μg疫苗加強(qiáng)免疫2次。背部皮下免疫猴子。在0天(取血前)、42天和70天從動(dòng)物取血。從頭前臂靜脈(V.cephalica antebrachii)收集4ml血液。通過(guò)基本如實(shí)施例13中所述的ELISA，利用對(duì)猴子IgG特異的第二抗體，測(cè)定對(duì)Aβ1-40特異的抗體的效價(jià)。
因?yàn)槿祟?lèi)和恒河猴共有相同的Aβ序列，所以恒河猴中對(duì)Aβ1-40特異的高效價(jià)抗體的產(chǎn)生表明用偶聯(lián)Qβ的hAβ1-6免疫打破了對(duì)自身抗原Aβ的耐受性。而且，在靈長(zhǎng)類(lèi)中，用偶聯(lián)的Aβ1-6片段可以產(chǎn)生識(shí)別全長(zhǎng)Aβ的抗體。
圖6中示出了ELISA結(jié)果。圖中所示的是在用QβhAβ1-6免疫的4只猴子(1-4)血清中測(cè)定的Aβ1-40特異性抗體的效價(jià)和該4只猴子的平均效價(jià)。效價(jià)表示為OD50效價(jià)。OD50是信號(hào)達(dá)到最大信號(hào)值一半時(shí)的抗體稀釋度。從來(lái)源于用QβhAβ1-27免疫的猴子并識(shí)別Aβ1-40的參照血清獲得最大值(OD最大值)，并且該最大值是在相同ELISA平板上測(cè)定的。
在第97，110，117，124，138，143，152，159，166天，從兩只猴子(上述)取血，并且在110天，用25μg疫苗進(jìn)行第三次加強(qiáng)免疫。合并血清(99ml)，并且用于Aβ1-6特異性抗體的親和純化。這些抗體以1.5μg/ml濃度用于免疫組織化學(xué)染色，并且生物素?；牡诙购镒涌贵w用于檢測(cè)。18月齡雜合APP23小鼠和Braak III期AD患者的石蠟?zāi)X切片用于染色。在APP23小鼠腦切片中和AD患者腦切片中均觀察到斑塊特異性染色(圖7)。
圖7A和B中示出了組織學(xué)分析的結(jié)果。圖7A中所示的是用上述對(duì)Aβ1-6特異的親和純化抗血清染色人APP轉(zhuǎn)基因小鼠斑塊(APP23株系)。圖7B表示用相同的純化抗血清染色人類(lèi)AD斑塊。在兩種情況下，都使用1.5μg/ml濃度的純化抗血清。兩圖上均以箭頭指示典型斑塊。
實(shí)施例20鼠Aβ1-6與AP205 VLP的偶聯(lián)，小鼠的免疫和免疫應(yīng)答的分析A.鼠Aβ1-6肽與AP205 VLP的偶聯(lián)化學(xué)合成鼠Aβ1-6肽(mAβ1-6，序列NH2-DAEFGHGGC-CONH2(SEQ ID NO78)；開(kāi)始的NH2基團(tuán)表示該肽具有自由N末端，并且末端NH2基團(tuán)表示該肽具有酰胺化的羧基末端)。在室溫下，20mM Hepes，150mM NaCl，pH 8.0(HBS，pH 8.0)中(如實(shí)施例1中表達(dá)和純化的)AP205VLP以(在Bradford測(cè)定法中測(cè)定的)2mg/ml濃度與從DMSO中100mM母液稀釋的2.86mM SMPH(Pierce，Rockford IL)反應(yīng)30分鐘。然后，在4℃，用pH 7.4的1000倍體積HBS透析反應(yīng)混合物2次2小時(shí)；在液氮中急驟冷凍所得到的經(jīng)透析和衍生化的AP205 VLP，并且在-20℃過(guò)夜貯藏。用1體積pH 7.4，20mM HBS稀釋衍生的AP205 VLP，并且在15℃，在振蕩條件下與反應(yīng)混合物中稀釋的719μM mAβ1-6肽(來(lái)源于DMSO中的50mM母液)反應(yīng)2小時(shí)。用pH 7.4，1000倍體積HBS透析偶聯(lián)反應(yīng)物2次2小時(shí)，并且過(guò)夜。在液氮中急驟冷凍等分的透析的反應(yīng)混合物，在使用前，在-80℃貯藏。
融解等份試樣，并且通過(guò)SDS-PAGE估測(cè)mAβ1-6肽與AP205 VLP亞單位的偶聯(lián)，并且在Bradford測(cè)定法中測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。圖8中示出了偶聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果。
圖8表示mAβ1-6肽與AP205 VLP偶聯(lián)反應(yīng)的SDS-PAGE分析。在16％Tris甘氨酸凝膠上，在還原條件下，對(duì)樣品進(jìn)行電泳，并且用考馬斯亮藍(lán)染色。泳道1是蛋白質(zhì)標(biāo)記，在凝膠左側(cè)邊界標(biāo)出了相應(yīng)的分子量；泳道2，AP205 VLP蛋白質(zhì)；泳道3，衍生的AP205 VLP；泳道4，AP205VLP與mAβ1-6肽偶聯(lián)反應(yīng)的上清液；泳道5，AP205 VLP與mAβ1-6肽偶聯(lián)反應(yīng)的沉淀。在凝膠上沒(méi)有檢測(cè)到未偶聯(lián)的AP205 VLP亞單位，而觀察到了對(duì)應(yīng)于每個(gè)亞單位幾個(gè)肽的條帶，證明了非常高的偶聯(lián)效率。特別地，每個(gè)AP205 VLP亞單位具有遠(yuǎn)多于一個(gè)的Aβ1-6肽。
B.用偶聯(lián)AP205 VLP的mAβ1-6肽免疫小鼠和免疫應(yīng)答分析在0和14天，在小鼠(3只小鼠)中皮下注射偶聯(lián)mAβ1-6肽的AP205VLP。如上所述，mAβ1-6肽偶聯(lián)AP205 VLP。用在PBS中稀釋到200μl的25μg疫苗免疫每只小鼠(C57BL/6)。在21天，從小鼠眼眶后取血，并且在抗mAβ1-6肽的ELISA中測(cè)定對(duì)mAβ1-6肽特異的抗體的效價(jià)。利用化學(xué)交聯(lián)劑磺基-SPDP，mAβ1-6肽偶聯(lián)牛RNAse A。用RNAse-mAβ1-6制備物，以10μg/ml濃度包被ELISA板。封閉該板，然后與系列稀釋的小鼠血清溫育。用酶學(xué)標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體檢測(cè)結(jié)合的抗體。做為對(duì)照，也檢測(cè)了相同小鼠的免疫前血清。結(jié)果如圖9中所示。
圖9表示在用偶聯(lián)AP205 VLP的mAβ1-6肽免疫的小鼠的血清中，針對(duì)mAβ1-6肽特異性IgG抗體的ELISA分析。結(jié)果表示在第21天(A1d21-A3d21)收集的3只免疫小鼠的血清，在圖中免疫前血清表示為“Pre imm”；示出了一個(gè)免疫前血清的結(jié)果。免疫前血清和用偶聯(lián)AP205VLP的mAβ1-6免疫的小鼠血清比較，表明在沒(méi)有佐劑情況下，抗自身抗原肽mAβ1-6可以獲得強(qiáng)特異性抗體應(yīng)答。而且，自身肽與AP205VLP偶聯(lián)可以破壞對(duì)該肽的耐受性，并且引起非常高的特異性免疫應(yīng)答。因此，AP205 VLP適于在沒(méi)有佐劑的情況下產(chǎn)生抗Aβ肽的高抗體效價(jià)。
實(shí)施例21用QβhAβ1-6免疫減少了超表達(dá)“Swedish/London”突變淀粉樣前體蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因小鼠中的淀粉樣斑塊該實(shí)施例證明在發(fā)展有阿爾茨海默氏病樣彌散性(剛果紅陰性)淀粉樣斑塊的小鼠模型中，用QβhAβ1-6免疫在新皮層和皮層下大腦區(qū)域中引起了斑塊密度的大幅度減少。彌散性淀粉樣斑塊的組織學(xué)出現(xiàn)是AD大腦病理學(xué)的顯著特征(Selkoe，1994，Annu.Rev.Neurosci.17489-517)，因此，該實(shí)施例證明了用QβhAβ1-6免疫提供了阿爾茨海默氏病治療的有效方法。
為了評(píng)估用Qβ-Aβ1-6免疫的治療效果，使用在小鼠Thy-1啟動(dòng)子控制下超表達(dá)“Swedish/London”突變淀粉樣前體蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因小鼠(APP24；K670N/M671 L；V717I，專(zhuān)利號(hào).WO980-36-4423)。該小鼠株系的特征在于在18月齡時(shí)，在新皮質(zhì)、海馬、尾狀核及殼核和丘腦中有大量淀粉樣斑塊。在9月齡時(shí)可以首先觀察到斑塊。組織學(xué)上，APP24小鼠中淀粉樣斑塊主要是彌散型的，即，它們?yōu)閯偣t染色陰性的。較少地，也可以發(fā)現(xiàn)緊密的淀粉樣斑塊(剛果紅陽(yáng)性)。
如實(shí)施例13中所述，制備偶聯(lián)Qβ VLP的人Aβ1-6肽(QβhAβ1-6)。根據(jù)下面實(shí)驗(yàn)方法(這些方法對(duì)于描述和實(shí)現(xiàn)本發(fā)明不是必須的)，在0天，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中的25μg QβhAβ1-6(每只小鼠給藥2×100μl)(n＝16)，或者做為陰性對(duì)照用PBS(每只小鼠給藥2×100μl)(n＝9)，或者用無(wú)偶聯(lián)抗原的Qβ病毒樣顆粒(n＝11)，皮下注射9.5月齡APP24轉(zhuǎn)基因小鼠。隨后，在第15，49，76，106，140，169，200，230，259和291天，給小鼠注射25μg QβhAβ1-6疫苗、Qβ或PBS。在第一次免疫前(0天)1-2天和在第56，90，118，188，214，246和272天，通過(guò)尾靜脈從動(dòng)物取血。在305天也收集血清，在這時(shí)也收集大腦用于組織病理學(xué)檢查(在該時(shí)間點(diǎn)，小鼠年齡19.5個(gè)月)。
基本如實(shí)施例13中所述，通過(guò)ELISA測(cè)定對(duì)Aβ1-40特異的抗體效價(jià)。在圖10中示出了ELISA的結(jié)果。圖中所示的是在用QβhAβ1-6免疫的小鼠血清中測(cè)定的Aβ1-40或Aβ1-42特異性抗體的效價(jià)。該效價(jià)表示為OD50％效價(jià)。OD50％是信號(hào)達(dá)到其最大值一半時(shí)的抗體稀釋度。從在相同ELISA平板上測(cè)定的識(shí)別Aβ1-40和Aβ1-42的參照抗體獲得最大值(OD最大值)。所有QβhAβ1-6免疫的小鼠都有1∶8000以上的OD50％效價(jià)(免疫前血清效價(jià)低于1∶100)，證明了甚至在老齡APP24小鼠中也出現(xiàn)對(duì)QβhAβ1-6一致的抗體應(yīng)答(圖10)。在整個(gè)免疫期間，免疫組中，中值OD50％效價(jià)是1∶20’000到1∶50’000。
為了定量淀粉樣斑塊，在4℃，在0.1M PBS中的4％甲醛中浸沒(méi)來(lái)固定大腦。用乙醇脫水后，大腦被包埋在石蠟中，并且用切片機(jī)徑向切成4μm厚度的切片。將切片置于超冷凍的載玻片上，并且在37℃干燥。在PBS中洗切片，并且通過(guò)在90℃，0.1M檸檬酸緩沖液中微波加熱3分鐘加強(qiáng)抗原性。在PBS中，用3％山羊血清以1∶1000稀釋NT11抗血清(抗Aβ1-40，Sturchler-Pierrat等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.9413287-13292)，并且在4℃溫育過(guò)夜。漂洗后，用在PBS中以1∶200稀釋的生物素酰化抗兔IgG第二抗體(BA1000，Vector Laboratories)溫育切片1小時(shí)。漂洗后，用抗生物素蛋白-生物素-過(guò)氧化物酶技術(shù)(ABC-Elite KitPK6100；Vector Laboratories)進(jìn)一步處理切片。最后，切片與二氨基聯(lián)苯胺(DAB)金屬加強(qiáng)的底物(Boehringer，Code 1718096)反應(yīng)，用蘇木精明礬復(fù)染，脫水，在二甲苯中透明和蓋上蓋玻片。每個(gè)動(dòng)物3個(gè)不同解剖平面的系統(tǒng)-隨機(jī)系列大腦切片用于分析。利用MCID圖像分析儀(ImagingResearch，Brock University，Ontario-Canada，Program Version M5 elite)定量淀粉樣斑塊。通過(guò)利用Xillix黑白CCD TV照相機(jī)數(shù)字化該顯微圖像，并且以256灰度，以640480像素分辨率存儲(chǔ)。利用物鏡測(cè)微計(jì)(LeicaNeoplan Obiective)，以5×放大倍數(shù)校準(zhǔn)該像素大小。利用用于鄰近物場(chǎng)精確定位的電動(dòng)機(jī)驅(qū)動(dòng)的顯微鏡載物臺(tái)，分析每個(gè)切片的整個(gè)新皮層和嗅核。對(duì)于每個(gè)物場(chǎng)，用人工輪廓限定解剖面積。對(duì)于每個(gè)單獨(dú)的切片，用免疫陽(yáng)性淀粉樣斑塊和組織背景之間的人工閾值設(shè)定(灰度水平)限定樣品面積。通過(guò)人工輪廓排除分離的組織假象。原始數(shù)據(jù)測(cè)定為單獨(dú)的計(jì)數(shù)(淀粉樣沉積物)和成比例的面積值(免疫陽(yáng)性淀粉樣斑/皮層或嗅核)。
每只小鼠的數(shù)據(jù)被標(biāo)準(zhǔn)化為每mm2的沉積物(斑塊)數(shù)量，和按整個(gè)新皮層的百分?jǐn)?shù)計(jì)的總斑塊面積。與PBS或Qβ注射的對(duì)照組比較，QβhAβ1-6免疫的小鼠顯示了在皮層和皮層下區(qū)域中顯著減少的淀粉樣沉積物(圖11)。在皮層、尾狀核及殼核、海馬和丘腦中，與PBS組比較，沉積物的中值數(shù)量和總斑塊面積均高度顯著地減少了80％-98％(p＜0.001，與PBS組比較，Mann-Whitney檢測(cè)；圖12)。
在第二項(xiàng)研究中，在0天，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中的25μgQβhAβ1-6(每只小鼠給藥2×100μl)(n＝15)，或者做為陰性對(duì)照用PBS(每只小鼠給藥2×100μl)(n＝15)皮下注射13.5月齡APP24轉(zhuǎn)基因小鼠。隨后，在16，46，76，109，140和170天，給小鼠注射25 μg QβhAβ1-6疫苗或PBS。在第一次免疫(0天)前1-2天，和在31，59，128和154天，通過(guò)尾靜脈從動(dòng)物取血。在184天，也收集血清，在該時(shí)間點(diǎn)也收集大腦用于組織病理學(xué)檢查(該時(shí)間點(diǎn)小鼠的年齡19.5個(gè)月)。如上所述測(cè)定和表示對(duì)Aβ1-40特異的抗體效價(jià)，并且再一次發(fā)現(xiàn)所有免疫的小鼠對(duì)QβhAβ1-6免疫產(chǎn)生應(yīng)答，具有至少1∶2000以上的OD50％效價(jià)(未示出)。整個(gè)免疫期間，中值OD50％效價(jià)是1∶10’000到1∶50’000。如上所述進(jìn)行淀粉樣沉積物的定量。與較早(即，在9.5月齡)起始免疫的實(shí)驗(yàn)比較，新皮層中斑塊沉積物數(shù)量(-55％)和面積(-32％)的減少不太劇烈，但是仍舊非常明顯(圖13)并且有高度的顯著性(p＞0.001，與PBS比較，Mann-Whitney檢測(cè))。在QβhAβ1-6免疫組中，在皮層下的區(qū)域中，斑塊沉積物數(shù)量和面積減少了60-90％。與皮層比較，這些區(qū)域中更顯著的效果可能與這些區(qū)域中更長(zhǎng)的斑塊形成時(shí)間有關(guān)。
總之，這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)證明了在超表達(dá)“Swedish/London”突變淀粉樣前體蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因小鼠中，QβhAβ1-6免疫急劇地減少了這些小鼠中淀粉樣沉積物的出現(xiàn)。
圖10超表達(dá)“Swedish/London”突變淀粉樣前體蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因小鼠中血清抗Aβ40/42抗體效價(jià)(OD50％)。用QβhAβ1-6免疫9.5和19個(gè)月齡之間的小鼠。所示的是個(gè)體值(黑點(diǎn))和框圖，其中框的兩端定義第25個(gè)和第75個(gè)百分點(diǎn)，并示出中值處的線條和定義第10個(gè)和第90個(gè)百分點(diǎn)的誤差線(框外值以點(diǎn)表示)。
圖11在徑向大腦切片中淀粉樣斑塊的免疫組織化學(xué)染色。圖中所示是用Qβ(A)或QβhAβ1-6(B)疫苗免疫的超表達(dá)“Swedish/London”突變淀粉樣前體蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因小鼠的徑向大腦切片。
圖12在9.5至19月齡免疫后，超表達(dá)“Swedish/London”突變淀粉樣前體蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因小鼠中斑塊沉積的定量。(A)皮層斑塊密度。(B)皮層斑塊面積。(C)尾狀核殼核中斑塊密度。(D)尾狀核殼核中斑塊面積。(E)海馬中斑塊密度。(F)海馬中斑塊面積。(G)丘腦中斑塊密度。(H)丘腦中斑塊面積。斑塊密度表示為斑塊/mm2，斑塊面積表示為β淀粉狀蛋白覆蓋的組織面積的百分比。數(shù)據(jù)以個(gè)體值(黑點(diǎn))及框圖表示。框兩端定義第25個(gè)和第75個(gè)百分點(diǎn)，并示出中值處的線條和定義第10個(gè)和第90個(gè)百分點(diǎn)的誤差線。**p＜0.001(Mann Whitney Rank Sum檢測(cè))。PBS，n＝9，Qβ，n＝11，QβhAβ1-6，n＝16。
實(shí)施例22用QβhAβ1-6免疫減少了超表達(dá)“Swedish”突變體淀粉樣前體蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因小鼠中的淀粉樣斑塊該實(shí)施例證明了甚至在非常晚的淀粉樣斑塊病理學(xué)階段起始免疫，用QβhAβ1-6免疫也提供了阿爾茨海默氏病治療的有效方法。在該實(shí)施例中使用的AD小鼠模型中淀粉樣斑塊沉積過(guò)程在大約6個(gè)月齡就已經(jīng)開(kāi)始了(Sturchler-Pierrat等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.9413287-13292)。在這里所述研究中，在18個(gè)月齡開(kāi)始用QβhAβ1-6免疫，這時(shí)在皮層中已經(jīng)形成了高數(shù)量的緊密斑塊。該實(shí)施例也證明了在非常年老的動(dòng)物中，QβhAβ1-6也可以誘導(dǎo)Aβ40/42抗體(在19只免疫小鼠中沒(méi)有未應(yīng)答者)。
為了評(píng)估QβhAβ1-6免疫的治療效果，使用超表達(dá)“Swedish”突變淀粉樣前體蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因小鼠(APP23；K670N/M671L，Sturchler-Pierrat等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.9413287-13292)。在這些小鼠中已充分地表征了阿爾茨海默氏病樣病理學(xué)(Calhoun等，1998，Nature 395755-756；Phinney等，1999，J.Neurosci.198552-8559；Bondolfi等，2002，J.Neurosci.22515-522)。
如實(shí)施例13中所述制備偶聯(lián)Qβ VLP的人Aβ1-6肽(QβhAβ1-6)。根據(jù)下面實(shí)驗(yàn)方法(這些方法對(duì)描述和實(shí)施本發(fā)明不是必須的)，在0天，用磷酸緩沖鹽水中溶解的25μg QβhAβ1-6(每只小鼠給藥2×100μl)(n＝19)，或者做為陰性對(duì)照用磷酸緩沖鹽水(n＝17)，皮下注射18個(gè)月齡APP23轉(zhuǎn)基因小鼠，并且在13，27-34，61-63，90-96和123-130天，用25μg疫苗加強(qiáng)免疫。在第一次免疫(0天)前1-2天和在第41-45天和68天，通過(guò)尾靜脈從動(dòng)物取血。也在152-154天收集血清，在該時(shí)間點(diǎn)也收集大腦用于組織病理學(xué)檢查(該時(shí)間點(diǎn)的小鼠年齡23個(gè)月)。
基本如實(shí)施例13中所述，通過(guò)ELISA測(cè)定對(duì)Aβ1-40特異的抗體效價(jià)，并且如實(shí)施例21中所述表示結(jié)果。在圖14中示出了ELISA結(jié)果。所有QβhAβ1-6免疫的小鼠都有1∶2000以上OD50％效價(jià)(免疫前血清效價(jià)低于1∶100)，證明了即使在非常年老的小鼠中對(duì)Qβ-Aβ1-6仍有一致的抗體應(yīng)答(圖14)。整個(gè)免疫期間，中值OD50％效價(jià)是1∶9’000到1∶20’000。
如實(shí)施例21中所述進(jìn)行淀粉樣斑塊的定量。每只小鼠的數(shù)據(jù)被標(biāo)準(zhǔn)化為每mm2沉積物(斑塊)的數(shù)量和以整個(gè)新皮層的％表示的總斑塊面積。QβhAβ1-6免疫的小鼠在皮層中顯示了更少數(shù)量的沉積物(圖15，圖16)，這主要由于小體積的斑塊的減少所致。與未免疫組比較，QμhAβ1-6免疫組中中值等斑塊數(shù)量減少33％(p＜0.001，與PBS組比較，Mann-Whitney檢測(cè))。因?yàn)橹饕切◇w積的斑塊受影響，所以總斑塊面積的減少是中等的，達(dá)到10％(p＜0.01，與PBS組比較，Mann-Whitney檢測(cè))。
圖14超表達(dá)“Swedish”突變淀粉樣前體蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因小鼠中血清抗Aβ40/42抗體效價(jià)(OD50％)。用QβhAβ1-6免疫18至23月齡的小鼠。所示的是個(gè)體值(黑點(diǎn))和框圖，其中框兩端定義了第25個(gè)和75個(gè)百分點(diǎn)，并示出中值處的線條和定義第10個(gè)和第90個(gè)百分點(diǎn)的誤差線(框外以點(diǎn)表示)。
圖15徑向大腦切片中淀粉樣斑塊的免疫組織化學(xué)染色。箭頭指向小體積的沉積物。圖中所示的是來(lái)源于用PBS(A)或Qβ-Aβ1-6(B)免疫的超表達(dá)“Swedish”突變淀粉樣前體蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因小鼠的徑向大腦切片。
圖16在18至23個(gè)月齡免疫后，超表達(dá)“Swedish”突變淀粉樣前體蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因小鼠中斑塊沉積的定量。(A)皮層斑塊密度。(B)皮層斑塊面積。斑塊密度表示為斑塊/mm2，斑塊面積表示為β淀粉狀蛋白覆蓋的組織面積的百分比。數(shù)據(jù)表示為個(gè)體值(黑點(diǎn))和框圖?？騼啥硕x了第25個(gè)和75個(gè)百分點(diǎn)，并示出中值處的線條和定義第10個(gè)和第90個(gè)百分點(diǎn)的誤差線。**p＜0.001(Mann Whitney Rank Sum檢測(cè))。PBS，n＝17，QβhAβ1-6，n＝19。
為了清楚地理解本發(fā)明的目的，現(xiàn)在已經(jīng)通過(guò)示例和實(shí)施例的方式完整地以一定的詳細(xì)程度描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見(jiàn)可以通過(guò)在廣泛等同的條件、制劑和其它參數(shù)范圍內(nèi)修改或改變本發(fā)明而實(shí)施本發(fā)明，而不影響本發(fā)明的范圍和其任何具體實(shí)施方式
，并且所附權(quán)利要求的范圍意欲包括這些修改或改變。
本說(shuō)明書(shū)中提到的所有公開(kāi)出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)指示了本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的水平，并且在這里將它們并入為參考文獻(xiàn)，就如同具體和單獨(dú)地指明每篇單獨(dú)的公開(kāi)出版物，專(zhuān)利或?qū)＠暾?qǐng)并入為參考文獻(xiàn)一樣。
序列表<110>希托斯生物技術(shù)股份公司(Cytos Biotechnology AG)諾瓦提斯醫(yī)藥股份公司(Novartis Pharma AG)<120>含有淀粉樣β1-6抗原陣列的疫苗組合物<130>PA041WO<150>US 60/396,639<151>2002-07-19<150>US 60/470,432<151>2003-05-15<160>93<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>172<212>PRT<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>1Met Ala Val Val Ser Phe Gly Val Asn Ala Ala Pro Thr Thr Pro Gln1 5 10 15Gly Gln Gly Arg Val Thr Phe Asn Gly Thr Val Val Asp Ala Pro Cys20 25 30Ser Ile Ser Gln Lys Ser Ala Asp Gln Ser Ile Asp Phe Gly Gln Leu35 40 45Ser Lys Ser Phe Leu Ala Asn Asp Gly Gln Ser Lys Pro Met Asn Leu50 55 60Asp Ile Glu Leu Val Asn Cys Asp Ile Thr Ala Phe Lys Asn Gly Asn65 70 75 80Ala Lys Thr Gly Ser Val Lys Leu Ala Phe Thr Gly Pro Thr Val Ser85 90 95Gly His Pro Ser Glu Leu Ala Thr Asn Gly Gly Pro Gly Thr Ala Ile100 105 110Met Ile Gln Ala Ala Gly Lys Asn Val Pro Phe Asp Gly Thr Glu Gly115 120 125
Asp Pro Asn Leu Leu Lys Asp Gly Asp Asn Val Leu His Tyr Thr Thr130 135 140Val Gly Lys Lys Ser Ser Asp Gly Asn Ala Gln Ile Thr Glu Gly Ala145 150 155 160Phe Ser Gly Val Ala Thr Phe Asn Leu Ser Tyr Gln165 170<210>2<211>182<212>PRT<213>大腸桿菌<400>2Met Lys Ile Lys Thr Leu Ala Ile Val Val Leu Ser Ala Leu Ser Leu1 5 10 15Ser Ser Thr Ala Ala Leu Ala Ala Ala Thr Thr Val Asn Gly Gly Thr20 25 30Val His Phe Lys Gly Glu Val Val Asn Ala Ala Cys Ala Val Asp Ala35 40 45Gly Ser Val Asp Gln Thr Val Gln Leu Gly Gln Val Arg Thr Ala Ser50 55 60Leu Ala Gln Glu Gly Ala Thr Ser Ser Ala Val Gly Phe Asn Ile Gln65 70 75 80Leu Asn Asp Cys Asp Thr Asn Val Ala Ser Lys Ala Ala Val Ala Phe85 90 95Leu Gly Thr Ala Ile Asp Ala Gly His Thr Asn Val Leu Ala Leu Gln100 105 110Ser Ser Ala Ala Gly Ser Ala Thr Asn Val Gly Val Gln Ile Leu Asp115 120 125Arg Thr Gly Ala Ala Leu Thr Leu Asp Gly Ala Thr Phe Ser Ser Glu130 135 140Thr Thr Leu Asn Asn Gly Thr Asn Thr Ile Pro Phe Gln Ala Arg Tyr145 150 155 160
Phe Ala Thr Gly Ala Ala Thr Pro Gly Ala Ala Asn Ala Asp Ala Thr165 170 175Phe Lys Val Gln Tyr Gln180<210>3<211>853<212>DNA<213>大腸桿菌<400>3acgtttctgt ggctcgacgc atcttcctca ttcttctctc caaaaaccac ctcatgcaat 60ataaacatct ataaataaag ataacaaata gaatattaag ccaacaaata aactgaaaaa 120gtttgtccgc gatgctttac ctctatgagt caaaatggcc ccaatgtttc atcttttggg 180ggaaactgtg cagtgttggc agtcaaactc gttgacaaac aaagtgtaca gaacgactgc 240ccatgtcgat ttagaaatag ttttttgaaa ggaaagcagc atgaaaatta aaactctggc 300aatcgttgtt ctgtcggctc tgtccctcag ttctacgacg gctctggccg ctgccacgac 360ggttaatggt gggaccgttc actttaaagg ggaagttgtt aacgccgctt gcgcagttga 420tgcaggctct gttgatcaaa ccgttcagtt aggacaggtt cgtaccgcat cgctggcaca 480ggaaggagca accagttctg ctgtcggttt taacattcag ctgaatgatt gcgataccaa 540tgttgcatct aaagccgctg ttgccttttt aggtacggcg attgatgcgg gtcataccaa 600cgttctggct ctgcagagtt cagctgcggg tagcgcaaca aacgttggtg tgcagatcct 660ggacagaacg ggtgctgcgc tgacgctgga tggtgcgaca tttagttcag aaacaaccct 720gaataacgga accaatacca ttccgttcca ggcgcgttat tttgcaaccg gggccgcaac 780cccgggtgct gctaatgcgg atgcgacctt caaggttcag tatcaataac ctacctaggt 840tcagggacgt rca 853<210>4<211>132<212>PRT<213>噬菌體Q-beta<400>4Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>5<211>329<212>PRT<213>噬菌體Q-beta<400>5Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly1 5 10 15Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45Val Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser65 70 75 80Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser85 90 95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu100 105 110Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln115 120 125Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Thr Leu Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly130 135 140Ser Lys Pro Asp Pro Val Ile Pro Asp Pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro145 150 155 160Gly Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala Ile Trp Ser Leu Glu Glu165 170 175Val Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Ala180 185 190Val Glu Leu Gln Pro Arg Glu Phe Asp Val Ala Leu Lys Asp Leu Leu195 200 205Gly Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr210 215 220Phe Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr225 230 235 240Leu Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp Ile Arg Glu245 250 255Gly Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu260 265 270Lys Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His275 280 285Ala Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly290 295 300Ala Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile305 310 315 320Gln Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala325
<210>6<211>129<212>PRT<213>噬菌體R17<400>6Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly1 5 10 15Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp20 25 30Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val35 40 45Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val50 55 60Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala65 70 75 80Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala85 90 95Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu100 105 110Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile115 120 125Tyr<210>7<211>130<212>PRT<213>噬菌體fr<400>7Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr1 5 10 15Gly Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu20 25 30
Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser35 40 45Val Arg Gln Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu50 55 60Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Val Gln Gly Gly Val Glu Leu Pro Val65 70 75 80Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Val Phe85 90 95Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu Ile Val Lys Ala Leu Gln Gly Thr100 105 110Phe Lys Thr Gly Asn Pro Ile Ala Thr Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly115 120 125Ile Tyr130<210>8<211>130<212>PRT<213>噬菌體GA<400>8Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly1 5 10 15Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp20 25 30Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr35 40 45Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Ala Ile Lys Leu Glu Val50 55 60Pro Lys Ile Val Thr Gln Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Gly Ser65 70 75 80Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser Ile Asp Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala85 90 95
Ala Thr Asp Asp Val Thr Val Ile Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe100 105 110Lys Val Gly Asn Pro Ile Ala Glu Ala Ile Ser Ser Gln Ser Gly Phe115 120 125Tyr Ala130<210>9<211>132<212>PRT<213>噬菌體SP<400>9Met Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly1 5 10 15Asp Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys50 55 60Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe85 90 95Thr Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>10<211>329<212>PRT
<213>噬菌體SP<400>10Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly Asp1 5 10 15Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys Val50 55 60Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys Asp65 70 75 80Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe Thr85 90 95Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu Ala100 105 110Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu Asn115 120 125Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Val Ala Ser Ser Gly Gly Gly Asp130 135 140Asn Pro Ser Asp Pro Asp Val Pro Val Val Pro Asp Val Lys Pro Pro145 150 155 160Asp Gly Thr Gly Arg Tyr Lys Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Leu Gly165 170 175Ser Ile Tyr Glu Val Gly Lys Glu Gly Ser Pro Asp Ile Tyr Glu Arg180 185 190Gly Asp Glu Val Ser Val Thr Phe Asp Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu195 200 205Gly Asn Thr Asn Trp Arg Asn Trp Asp Gln Arg Leu Ser Asp Tyr Asp210 215 220
Ile Ala Asn Arg Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp225 230 235 240Ala Thr Ala Met Gln Ser Asp Asp Phe Val Leu Ser Gly Arg Tyr Gly245 250 255Val Arg Lys Val Lys Phe Pro Gly Ala Phe Gly Ser Ile Lys Tyr Leu260 265 270Leu Asn Ile Gln Gly Asp Ala Trp Leu Asp Leu Ser Glu Val Thr Ala275 280 285Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser290 295 300Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Gln Phe Asn Ser Ala Asn Cys Pro305 310 315 320Val Gln Thr Val Ile Ile Ile Pro Ser325<210>11<211>130<212>PRT<213>噬菌體MS2<400>11Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr1 5 10 15Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu20 25 30Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser35 40 45Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu50 55 60Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val65 70 75 80Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe85 90 95
Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu100 105 110Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly115 120 125Ile Tyr130<210>12<211>133<212>PRT<213>噬菌體M11<400>12Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Lys Gly1 5 10 15Asp Val Thr Leu Asp Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr65 70 75 80Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ser Asp Val Thr Phe Ser85 90 95Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Val Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu100 105 110Leu Gln Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Val Asn Ala Ile Asp Asn115 120 125Leu Asn Pro Ala Tyr130<210>13<211>133<212>PRT
<213>噬菌體MXl<400>13Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Asn Gly1 5 10 15Asp Val Thr Leu Asn Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr65 70 75 80Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser85 90 95Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu100 105 110Leu Lys Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Ile Asp Ala Ile Asp Asn115 120 125Leu Asn Pro Ala Tyr130<210>14<211>330<212>PRT<213>噬菌體NL95<400>14Met Ala Lys Leu Asn Lys Val Thr Leu Thr Gly Ile Gly Lys Ala Gly1 5 10 15Asn Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45
Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Lys Asp Ala Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Gly Ser Arg Asp Val Thr Leu Ser Phe85 90 95Thr Ser Tyr Ser Thr Glu Arg Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Lys Asp Asp Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ser Pro Gly Gly Gly130 135 140Asn Asn Pro Tyr Pro Gly Val Pro Asp Ser Pro Asn Val Lys Pro Pro145 150 155 160Gly Gly Thr Gly Thr Tyr Arg Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Arg Gly165 170 175Glu Leu Ile Thr Glu Ala Lys Asp Gly Ala Cys Ala Leu Tyr Ala Cys180 185 190Gly Ser Glu Ala Leu Val Glu Phe Glu Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu195 200 205Gly Asn Glu Phe Trp Arg Asn Trp Asp Gly Arg Leu Ser Lys Tyr Asp210 215 220Ile Glu Thr His Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Val Asp Leu Asp225 230 235 240Ala Ser Val Met Gln Ser Asp Glu Tyr Val Leu Ser Gly Ala Tyr Asp245 250 255Val Val Lys Met Gln Pro Pro Gly Thr Phe Asp Ser Pro Arg Tyr Tyr260 265 270Leu His Leu Met Asp Gly Ile Tyr Val Asp Leu Ala Glu Val Thr Ala275 280 285
Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser290 295 300Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Arg Phe Asn Arg His Asn Cys Pro305 310 315 320Val Gln Thr Val Ile Val Ile Pro Ser Leu325 330<210>15<211>129<212>PRT<213>噬菌體f2<400>15Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly1 5 10 15Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp20 25 30Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val35 40 45Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val50 55 60Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala65 70 75 80Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala85 90 95Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu100 105 110Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile115 120 125Tyr<210>16<211>128<212>PRT
<213>噬菌體PP7<400>16Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu1 5 10 15Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val20 25 30Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn35 40 45Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp50 55 60Val Val Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg65 70 75 80Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr85 90 95Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala100 105 110Thr Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg115 120 125<210>17<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體Qbeta 240突變體<400>17Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>18<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體Q-beta 243突變體<400>18Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Lys Ile Gly Lys Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>19<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體Q-beta 250突變體<400>19Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>20<211>132<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>噬菌體Q-beta 251突變體<400>20Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>21<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體Q-beta 259突變體<400>21Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>22<211>185<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>22Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg145 150 155 160Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg165 170 175Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180 185<210>23<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>23Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Asn85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Val Ser Arg Asp100 105 110
Leu Val Val Gly Tyr Val Asn Thr Thr Val Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>24<211>188<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>24Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu1 5 10 15Asn Phe Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp20 25 30Thr Ala Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Asp Glu50 55 60Leu Thr Lys Leu Ile Ala Trp Met Ser Ser Asn Ile Thr Ser Glu Gln65 70 75 80Val Arg Thr Ile Ile Val Asn His Val Asn Asp Thr Trp Gly Leu Lys85 90 95
Val Arg Gln Ser Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln100 105 110His Thr Val Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Ala Pro Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu His Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ala Arg Ala Ser Arg Ser145 150 155 160Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro165 170 175Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ser Thr Asn Cys180 185<210>25<211>185<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>25Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg145 150 155 160Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg165 170 175Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180 185<210>26<211>152<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>26Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Gly65 70 75 80Lys Gly Gly Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val85 90 95Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr100 105 110Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp115 120 125
Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser130 135 140Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val145 150<210>27<211>3635<212>DNA<213>人T序列<220>
<223>質(zhì)粒pAP283-58<400>27cgagctcgcc cctggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcga 60gctcgcccgg ggatcctcta gaattttctg cgcacccatc ccgggtggcg cccaaagtga 120ggaaaatcac atggcaaata agccaatgca accgatcaca tctacagcaa ataaaattgt 180gtggtcggat ccaactcgtt tatcaactac attttcagca agtctgttac gccaacgtgt 240taaagttggt atagccgaac tgaataatgt ttcaggtcaa tatgtatctg tttataagcg 300tcctgcacct aaaccggaag gttgtgcaga tgcctgtgtc attatgccga atgaaaacca 360atccattcgc acagtgattt cagggtcagc cgaaaacttg gctaccttaa aagcagaatg 420ggaaactcac aaacgtaacg ttgacacact cttcgcgagc ggcaacgccg gtttgggttt 480ccttgaccct actgcggcta tcgtatcgtc tgatactact gcttaagctt gtattctata 540gtgtcaccta aatcgtatgt gtatgataca taaggttatg tattaattgt agccgcgttc 600taacgacaat atgtacaagc ctaattgtgt agcatctggc ttactgaagc agaccctatc 660atctctctcg taaactgccg tcagagtcgg tttggttgga cgaaccttct gagtttctgg 720taacgccgtt ccgcaccccg gaaatggtca ccgaaccaat cagcagggtc atcgctagcc 780agatcctcta cgccggacgc atcgtggccg gcatcaccgg cgcacacagt gcggttgctg 840gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga 900gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca 960tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg cggtgcttca acggcctcaa cctactactg 1020ggctgcttcc taatgcagga gtcgcataag ggagagcgtc gatatggtgc actctcagta 1080caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc aactccgcta tcgctacgtg actgggtcat 1140ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc 1200
ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc1260accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagct tgaagacgaa agggcctcgt gatacgccta1320tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg1380ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg1440ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt1500attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt1560gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg1620ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa1680cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt1740gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag1800tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt1860gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga1920ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt1980tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta2040gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg2100caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc2160cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt2220atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg2280gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg2340attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa2400cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa2460atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga2520tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg2580ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact2640ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac2700cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg2760gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg2820gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga2880acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgcgagcatt gagaaagcgc cacgcttccc2940gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg3000
agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc3060tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc3120agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt3180cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc3240gctcgccgca gccgaacgac gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc3300caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tgtggtgtca3360tggtcggtga tcgccagggt gccgacgcgc atctcgactg catggtgcac caatgcttct3420ggcgtcaggc agccatcgga agctgtggta tggccgtgca ggtcgtaaat cactgcataa3480ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac3540ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcgaact agttaactag3600tacgcaagtt cacgtaaaaa gggtatcgcg gaatt 3635<210>28<211>131<212>PRT<213>噬菌體AP205<400>28Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile1 5 10 15Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu20 25 30Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser35 40 45Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly50 55 60Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg65 70 75 80Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu85 90 95Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn100 105 110
Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp115 120 125Thr Thr Ala130<210>29<211>131<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>AP205外殼蛋白<400>29Met Ala Asn Lys Thr Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile1 5 10 15Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu20 25 30Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser35 40 45Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly50 55 60Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg65 70 75 80Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu85 90 95Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn100 105 110Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp115 120 125Thr Thr Ala130<210>30<211>3607<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>質(zhì)粒pAP281-32<400>30cgagctcgcc cctggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcga 60gctcgcccgg ggatcctcta gattaaccca acgcgtagga gtcaggccat ggcaaataag 120acaatgcaac cgatcacatc tacagcaaat aaaattgtgt ggtcggatcc aactcgttta 180tcaactacat tttcagcaag tctgttacgc caacgtgtta aagttggtat agccgaactg 240aataatgttt caggtcaata tgtatctgtt tataagcgtc ctgcacctaa accgaaggtc 300agatgcctgt gtcattatgc cgaatgaaaa ccaatccatt cgcacagtga tttcagggtc 360agccgaaaac ttggctacct taaaagcaga atgggaaact cacaaacgta acgttgacac 420actcttcgcg agcggcaacg ccggtttggg tttccttgac cctactgcgg ctatcgtatc 480gtctgatact actgcttaag cttgtattct atagtgtcac ctaaatcgta tgtgtatgat 540acataaggtt atgtattaat ggtagccgcg ttctaacgac aatatgtaca agcctaattg 600tgtagcatct ggcttactga agcagaccct atcatctctc tcgtaaactg ccgtcagagt 660cggttgggtt ggacagacct ctgagtttct ggtaacgccg ttccgcaccc cggaaatggt 720caccgaacca ttcagcaggg tcatcgctag ccagatcctc tacgccggac gcatcgtggc 780ccgcatcacc ggcgccacag gtgcggtgct ggcgcctata tcgccgacat caccgatggg 840gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg atcgctggtt tccgcctggg tatggtggca 900ggccccgtgg cccgggggac tgttgggcgc catctccttg catgcaccat tccttgcggc 960ggcggtgctc aacggcctca acctactact gggctgcttc ctaatgcagg agtcgcataa 1020gggagagcgt cgatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc 1080caactccgct atcgctacgt gactgggtca tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg 1140ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgcttc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg 1200tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc 1260ttgaagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 1320ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggacccc ctattggttt 1380atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 1440tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 1500cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 1560agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 1620taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgtttttca atgatgagca cttttaaagt 1680
tctgctatgt gtcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg1740catacactat tctcagaatg acttggtggt acctaccagt cacagaaaag catcttacgg1800atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg1860ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca1920tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa1980acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtac gaacggcaac aacgttgcgc aaactattaa2040ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata2100aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat2160ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc2220cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata2280gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt2340actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga2400agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag2460cggtcagacc ccgtagaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa2520tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag2580agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg2640tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat2700acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta2760ccgggttgga ctcaagacga taggtaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg2820gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc2880gcgagcattg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa2940gcggcagggt cggaacaaga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc3000tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt3060caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct3120ttggctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc3180gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gacggcgcag3240cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg3300ttggccgatt cattaatgca gctgtggtgt catggtcggt gatcgccagg gtgccgacgc3360gcatctcgac tgcatggtgc accaatgctt ctggcgtcag gcagccatcg gaagctgtgg3420
tatggccgtg caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc gctcaaggcg cactcccgtt3480ctggataatg ttttttgcgg cgacatcata acggttctgg caaatattct gaaatgagct3540ggtgacaatt aatcatcgaa ctagttaact agtacgcaag ttcacgtaaa aagggtatcg3600cggaatt 3607<210>31<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-端接頭<400>31Cys Gly Asp Glu Gly Gly1 5<210>32<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-端接頭<400>32Gly Gly Glu Asp Gly Cys1 5<210>33<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>接頭<400>33Gly Gly Lys Gly Gly1 5<210>34<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-端甘氨酸接頭
<220>
<221>REPEAT<222>(1)..(1)<223>甘氨酸可以重復(fù)0至5次<220>
<221>REPEAT<222>(3)..(3)<223>甘氨酸可以重復(fù)0至12次<400>34Gly Cys Gly1<210>35<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N端甘氨酸絲氨酸接頭<220>
<221>REPEAT<222>(1)..(1)<223>甘氨酸可以重復(fù)0至5次<220>
<221>REPEAT<222>(3)..(3)<223>甘氨酸可以重復(fù)0至10次<220>
<221>REPEAT<222>(4)..(4)<223>絲氨酸可以重復(fù)0至2次<220>
<221>REPEAT<222>(5)..(9)<223>這些殘基作為一組可以重復(fù)0至3次<400>35Gly Cys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5<210>36<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-端甘氨酸接頭
<220>
<221>REPEAT<222>(1)..(1)<223>甘氨酸可以重復(fù)0至12次<220>
<221>REPEAT<222>(3)..(3)<223>甘氨酸可以重復(fù)0至5次<400>36Gly Cys Gly1<210>37<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-端甘氨酸絲氨酸接頭<220>
<221>REPEAT<222>(1)..(1)<223>甘氨酸可以重復(fù)0至10次<220>
<221>REPEAT<222>(2)..(2)<223>絲氨酸可以重復(fù)0至2次<220>
<221>REPEAT<222>(3)..(7)<223>這些殘基作為一組可以重復(fù)0至3次<220>
<221>REPEAT<222>(8)..(8)<223>甘氨酸可以重復(fù)0至8次<220>
<221>REPEAT<222>(10)..(10)<223>甘氨酸可以重復(fù)0至5次<400>37Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Cys Gly1 5 10<210>38
<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>甘氨酸絲氨酸接頭<220>
<221>REPEAT<222>(1)..(5)<223>這些殘基作為一組可以重復(fù)任意次<400>38Gly Gly Gly Gly Ser1 5<210>39<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-端γ1<400>39Cys Gly Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro1 5 10<210>40<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-端γ1<400>40Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Gly1 5 10<210>41<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-端γ3<400>41Cys Gly Gly Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala1 5 10 15
Pro<210>42<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-端γ3<400>42Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Gly1 5 10 15Cys Gly<210>43<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-端甘氨酸接頭<400>43Gly Cys Gly Gly Gly Gly1 5<210>44<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-端甘氨酸接頭<400>44Gly Gly Gly Gly Cys Gly1 5<210>45<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-端甘氨酸-賴氨酸接頭
<400>45Gly Gly Lys Lys Gly Cys1 5<210>46<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-端甘氨酸-賴氨酸接頭<400>46Cys Gly Lys Lys Gly Gly1 5<210>47<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C.端接頭<400>47Gly Gly Cys Gly1<210>48<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>48ggtaacatcg gtcgagatgg aaaacaaact ctggtcc 37<210>49<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>49ggaccagagt ttgttttcca tctcgaccga tgttacc 37
<210>50<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>50agctcgcccg gggatcctct ag 22<210>51<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>51cgatgcattt catccttagt tatcaatacg ctgggttcag40<210>52<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>52ggcaaaatta gagactgtta ctttaggtaa gatcgg36<210>53<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>53ccgatcttac ctaaagtaac agtctctaat tttgcc36<210>54<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>54ggccatggca cgactcgaga ctgttacttt agg 33
<210>55<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>55gatttaggtg acactatag 19<210>56<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>56gatggacgtc aaactctggt cctcaatccg cgtgggg 37<210>57<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>57ccccacgcgg attgaggacc agagtttgac gtccatc 37<210>58<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>EcoRIHBcAg(s)引物<400>58ccggaattca tggacattga cccttataaa g 31<210>59<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Lys-HBcAg(as)引物<400>59cctagagcca cctttgccac catcttctaa attagtaccc acccaggtag c 51
<210>60<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Lys-HBcAg(s)引物<400>60gaagatggtg gcaaaggtgg ctctagggac ctagtagtca gttatgtc 48<210>61<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HBcAg(1-149)Hind(as)引物<400>61cgcgtcccaa gcttctaaac aacagtagtc tccggaag 38<210>62<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>48as引物<400>62gtgcagtatg gtgaggtgag gaatgctcag gagactc 37<210>63<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>48s引物<400>63gagtctcctg agcattcctc acctcaccat actgcac 37<210>64<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>107as引物<400>64
cttccaaaag tgagggaaga aatgtgaaac cac 33<210>65<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HBcAg149hind-as<400>65cgcgtcccaa gcttctaaac aacagtagtc tccggaagcg ttgatag47<210>66<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>107s引物<400>66gtggtttcac atttcttccc tcacttttgg aag 33<210>67<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HBcAgwtHindIIII引物<400>67cgcgtcccaa gcttctaaca ttgagattcc cgagattg 38<210>68<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>表位CeH3<400>68Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly1 5 10<210>69<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CeH3fwd引物<220>
<221>CDS<222>(1)..(51)<400>69gtt aac ttg acc tgg tct cgt gct tct ggt gca tcc agg gat cta gta48Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Ala Ser Arg Asp Leu Val1 5 10 15gtc51Val<210>70<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CeH3fwd引物<400>70ValAsn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Ala Ser Arg Asp Leu Val1 5 10 15Val<210>71<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CeH3rev引物<400>71accagaagca cgagaccagg tcaagttaac atcttccaaa ttattaccca c 51<210>72<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CeH3rev引物肽<400>72Asp Glu Leu Asn Asn Gly Val1 5
<210>73<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HBcAg-wt EcoRI fwd引物<400>73ccggaattca tggacattga cccttataaa g 31<210>74<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HBcAg-wt Hind III rev引物<400>74cgcgtcccaa gcttctaaca ttgagattcc cgagattg 38<210>75<211>6<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>75Asp Ala Glu Phe Arg His1 5<210>76<211>6<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>76Asp Ala Glu Phe Gly His1 5<210>77<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Aβ1-6 GGC<400>77Asp Ala Glu Phe Arg His Gly Gly Cys
1 5<210>78<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>小鼠Aβ1-6 GGC<400>78Asp Ala Glu Phe Gly His Gly Gly Cys1 5<210>79<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物p1.4 4<400>79aaccatggca aataagccaa tgcaaccg 28<210>80<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物p1.45<400>80aatctagaat tttctgcgca cccatcccgg 30<210>81<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物p1.46<400>81aaaagcttaa gcagtagtat cagacgatac 30<210>82<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物p1.47<400>82gagtgatcca actcgtttat caactacatt ttcagcaagt ctg43<210>83<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物p1.4 8<400>83cagacttgct gaaaatgtag ttgataaacg agttggatca ctc43<210>84<211>6<212>PRT<213>人<400>84Asp Ala Glu Phe Arg His1 5<210>85<211>6<212>PRT<213>兔(Oryctolagus cuniculus)<400>85Asp Ala Glu Phe Arg His1 5<210>86<211>6<212>PRT<213>光滑爪蟾(Xenopus laevis)<400>86Asp Ser Glu Tyr Arg His1 5<210>87<211>6<212>PRT<213>大鼠(Rattus norvegicus)<400>87Asp Ala Glu Phe Gly His
1 5<210>88<211>6<212>PRT<213>豚鼠(Cavia porcellus)<400>88Asp Ala Glu Phe Arg His1 5<210>89<211>15<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>89Val His Glu Pro His Glu Phe Arg His Val Ala Leu Asn Pro Val1 5 10 15<210>90<211>6<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>90Tyr Tyr Glu Phe Arg His1 5<210>91<211>42<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>91Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40<210>92<211>770<212>PRT<213>人(Homo sapiens)
<400>92Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg1 5 10 15Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro20 25 30Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln35 40 45Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp50 55 60Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu65 70 75 80Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn85 90 95Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val100 105 110Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu115 120 125Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys130 135 140Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu145 150 155 160Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile165 170 175Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu180 185 190Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val195 200 205Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys210 215 220
Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu225 230 235 240Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu245 250 255Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile260 265 270Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg275 280 285Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile290 295 300Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe305 310 315 320Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr325 330 335Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr340 345 350Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala355 360 365Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp370 375 380Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala385 390 395 400Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala405 410 415Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile420 425 430Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn435 440 445Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met450 455 460
Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu465 470 475 480Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys485 490 495Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe500 505 510Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser515 520 525Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser530 535 540Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp545 550 555 560Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val565 570 575Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala580 585 590Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro595 600 605Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe610 615 620Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val625 630 635 640Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser645 650 655Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp660 665 670Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu675 680 685Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly690695 700
Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu705 710 715 720Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val725 730 735Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met740 745 750Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met755 760 765Gln Asn770<210>93<211>82<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>93Gly Ser Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys1 5 10 15Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln20 25 30Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile35 40 45Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Ile Ile50 55 60Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Asn His His Gly Val65 70 75 80Val Glu
權(quán)利要求
1.一種組合物，其包含(a)具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的核心顆粒；和(b)至少一個(gè)具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇是Aβ1-6肽，并且其中所述第二附著位點(diǎn)選自(i)非天然存在于所述抗原或抗原決定簇上的附著位點(diǎn)；和(ii)所述抗原或抗原決定簇上天然存在的附著位點(diǎn)，其中所述第二附著位點(diǎn)能與所述第一附著位點(diǎn)締合；并且其中所述Aβ1-6肽和所述核心顆粒通過(guò)所述締合相互作用以形成有序和重復(fù)的抗原陣列。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述核心顆粒選自(i)病毒；(ii)病毒樣顆粒；(iii)噬菌體；(iv)RNA噬菌體的病毒樣顆粒；(v)細(xì)菌菌毛；(vi)病毒衣殼顆粒；和(vii)(i)，(ii)，(iii)，(iv)，(v)或(vi)的重組形式。
3.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述核心顆粒包含，優(yōu)選地是病毒樣顆粒，其中優(yōu)選地所述病毒樣顆粒是重組病毒樣顆粒。
4.如權(quán)利要求2或3所述的組合物，其中所述病毒樣顆粒包含選自如下的重組蛋白質(zhì)或其片段(a)重組乙型肝炎病毒蛋白質(zhì)；(b)重組麻疹病毒蛋白質(zhì)；(c)重組新培斯病毒蛋白質(zhì)；(d)重組輪狀病毒蛋白質(zhì)；(e)重組口蹄疫病毒蛋白質(zhì)；(f)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白質(zhì)；(g)重組諾沃克病毒蛋白質(zhì)；(h)重組甲病毒蛋白質(zhì)；(i)重組人乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)；(j)重組多瘤病毒蛋白質(zhì)；(k)重組噬菌體蛋白質(zhì)；(l)重組RNA噬菌體蛋白質(zhì)；(m)重組Ty蛋白質(zhì)；(n)重組Qβ噬菌體蛋白質(zhì)；(o)重組GA噬菌體蛋白質(zhì)；(p)重組fr噬菌體蛋白質(zhì)；(q)重組AP205噬菌體蛋白質(zhì)；和(r)來(lái)源于(a)到(q)的任何重組蛋白質(zhì)的片段。
5.如權(quán)利要求2或3所述的組合物，其中所述病毒樣顆粒是乙型肝炎病毒核心抗原。
6.如權(quán)利要求2或3所述的組合物，其中所述病毒樣顆粒包含重組RNA噬菌體蛋白質(zhì)或其片段，或者可替代地由重組RNA噬菌體蛋白質(zhì)或其片段組成。
7.如權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述RNA噬菌體選自(a)噬菌體Qβ；(b)噬菌體R17；(c)噬菌體fr；(d)噬菌體GA；(e)噬菌體SP；(f)噬菌體MS2；(g)噬菌體M11；(h)噬菌體MX1；(i)噬菌體NL95；(j)噬菌體f2；(k)噬菌體PP7；和(l)噬菌體AP205。
8.如權(quán)利要求2或3所述的組合物，其中所述病毒樣顆粒包含重組RNA噬菌體Qβ蛋白質(zhì)或其片段，或者可替代地由重組RNA噬菌體Qβ蛋白質(zhì)或其片段組成。
9.如權(quán)利要求2或3所述的組合物，其中所述病毒樣顆粒包含重組RNA噬菌體fr蛋白質(zhì)或其片段，或者可替代地由重組RNA噬菌體fr蛋白質(zhì)或其片段組成。
10.如權(quán)利要求2或3所述的組合物，其中所述病毒樣顆粒包含重組RNA噬菌體AP205蛋白質(zhì)或其片段，或者可替代地由重組RNA噬菌體AP205蛋白質(zhì)或其片段組成。
11.如權(quán)利要求3至10任一所述的組合物，其中所述重組蛋白質(zhì)包含RNA噬菌體外殼蛋白，或者可替代地基本由，或者可替代地由RNA噬菌體外殼蛋白組成。
12.如權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述RNA噬菌體外殼蛋白具有選自下面的氨基酸序列(a)SEQ ID NO4；(b)SEQ ID NO4和SEQ ID NO5的混合物；(c)SEQ ID NO6；(d)SEQ ID NO7；(e)SEQ ID NO8；(f)SEQ ID NO9；(g)SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的混合物；(h)SEQ ID NO11；(i)SEQ ID NO12；(k)SEQ ID NO13；(l)SEQ ID NO14；(m)SEQ ID NO15；(n)SEQ ID NO16；和(o)SEQ ID NO28。
13.如權(quán)利要求3至10任一所述的組合物，其中所述重組蛋白質(zhì)包含RNA噬菌體的突變外殼蛋白，或者可替代地基本由，或者可替代地由RNA噬菌體的突變外殼蛋白組成。
14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述RNA噬菌體選自(a)噬菌體Qβ；(b)噬菌體R17；(c)噬菌體fr；(d)噬菌體GA；(e)噬菌體SP；(f)噬菌體MS2；(g)噬菌體M11；(h)噬菌體MX1；(i)噬菌體NL95；(j)噬菌體f2；(k)噬菌體PP7；和(l)噬菌體AP205。
15.如權(quán)利要求13或14所述的組合物，其中通過(guò)置換方式移除至少一個(gè)賴氨酸殘基已修飾了所述RNA噬菌體的所述突變外殼蛋白。
16.如權(quán)利要求13或14所述的組合物，其中通過(guò)置換方式添加至少一個(gè)賴氨酸殘基已修飾了所述RNA噬菌體的所述突變外殼蛋白。
17.如權(quán)利要求13或14所述的組合物，其中通過(guò)缺失至少一個(gè)賴氨酸殘基已修飾了所述RNA噬菌體的所述突變外殼蛋白。
18.如權(quán)利要求13或14所述的組合物，其中通過(guò)插入方式添加至少一個(gè)賴氨酸殘基已修飾了所述RNA噬菌體的所述突變外殼蛋白。
19.如前述任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述第二附著位點(diǎn)能通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵締合所述第一附著位點(diǎn)。
20.如前述任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述第二附著位點(diǎn)能通過(guò)至少一個(gè)非肽鍵締合所述第一附著位點(diǎn)。
21.如前述任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述Aβ1-6肽與所述核心顆粒融合。
22.如前述任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述Aβ1-6肽選自(a)具有SEQ ID NO75的氨基酸序列的人Aβ1-6肽；(b)具有SEQ ID NO76的氨基酸序列的小鼠Aβ1-6肽；(c)具有SEQ ID NO84的氨基酸序列的靈長(zhǎng)類(lèi)Aβ1-6肽；(d)具有SEQ ID NO85的氨基酸序列的兔Aβ1-6肽；(e)具有SEQ ID NO86的氨基酸序列的光滑爪蟾Aβ1-6肽；(f)具有SEQ ID NO87的氨基酸序列的大鼠Aβ1-6肽；和(g)具有SEQ ID NO88的氨基酸序列的豚鼠Aβ1-6肽。
23.如前述任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述Aβ1-6肽具有SEQ IDNO75的氨基酸序列。
24.如前述任一權(quán)利要求所述的組合物，其還包含氨基酸接頭，其中所述氨基酸接頭包含所述第二附著位點(diǎn)，或者可替代地由所述第二附著位點(diǎn)組成。
25.如前述任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述第二附著位點(diǎn)或具有所述第二附著位點(diǎn)的所述氨基酸接頭與所述Aβ1-6肽在其C末端結(jié)合。
26.如前述任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述第二附著位點(diǎn)或具有所述第二附著位點(diǎn)的所述氨基酸接頭選自(a)GGC；(b)GGC-CONH2；(c)GC；(d)GC-CONH2；(e)C；和(f)C-CONH2。
27.如前述任一權(quán)利要求所述的組合物，其中具有所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的所述Aβ1-6肽是NH2-DAEFRHGGC-CONH2(SEQ ID NO77)。
28.如權(quán)利要求27所述的組合物，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體Qβ外殼蛋白的病毒樣顆粒。
29.一種藥物組合物，其包含(a)如權(quán)利要求1所述的組合物；和(b)可接受的藥物學(xué)載體。
30.如權(quán)利要求29所述的藥物組合物，其還包含佐劑。
31.如權(quán)利要求29或30所述的藥物組合物，其中所述疫苗組合物無(wú)佐劑。
32.一種疫苗組合物，其包含前述任一權(quán)利要求所述的組合物。
33.如權(quán)利要求32所述的疫苗組合物，其還包含佐劑。
34.如權(quán)利要求32或33所述的疫苗組合物，其中所述疫苗組合物無(wú)佐劑。
35.如權(quán)利要求32至34任一所述的疫苗組合物，其中所述病毒樣顆粒包含重組RNA噬菌體蛋白質(zhì)或其片段。
36.如權(quán)利要求32至35任一所述的疫苗組合物，其中所述病毒樣顆粒包含重組RNA噬菌體Qβ蛋白質(zhì)或其片段。
37.如權(quán)利要求32至35任一所述的疫苗組合物，其中所述病毒樣顆粒包含重組RNA噬菌體fr蛋白質(zhì)或其片段。
38.如權(quán)利要求32至35任一所述的疫苗組合物，其中所述病毒樣顆粒包含重組RNA噬菌體AP205蛋白質(zhì)或其片段。
39.如權(quán)利要求32至38任一所述的疫苗組合物，其中所述Aβ1-6肽選自(a)具有SEQ ID NO75的氨基酸序列的人Aβ1-6肽；(b)具有SEQ ID NO76的氨基酸序列的小鼠Aβ1-6肽；(c)具有SEQ ID NO84的氨基酸序列的靈長(zhǎng)類(lèi)Aβ1-6肽；(d)具有SEQ ID NO85的氨基酸序列的兔Aβ1-6肽；(e)具有SEQ ID NO86的氨基酸序列的光滑爪蟾Aβ1-6肽；(f)具有SEQ ID NO87的氨基酸序列的大鼠Aβ1-6肽；和(g)具有SEQ ID NO88的氨基酸序列的豚鼠Aβ1-6肽。
40.如權(quán)利要求32至39任一所述的疫苗組合物，其還包含氨基酸接頭，其中所述氨基酸接頭包含所述第二附著位點(diǎn)，或者可替代地由所述第二附著位點(diǎn)組成。
41.如權(quán)利要求40所述的疫苗組合物，其中具有所述第二附著位點(diǎn)的所述氨基酸接頭與所述Aβ1-6肽在其C末端結(jié)合。
42.如權(quán)利要求40或41所述的疫苗組合物，其中具有所述第二附著位點(diǎn)的所述氨基酸接頭選自(a)GGC；(b)GGC-CONH2；(c)GC；(d)GC-CONH2；(e)C；和(f)C-CONH2。
43.如權(quán)利要求32至42任一所述的疫苗組合物，其中具有所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的所述抗原或抗原決定簇是NH2-DAEFRHGGC-CONH2(SEQ ID NO77)。
44.如權(quán)利要求43所述的疫苗組合物，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體Qβ外殼蛋白的病毒樣顆粒。
45.一種制備前述任一權(quán)利要求所述的組合物的方法，該方法包括(a)提供具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的核心顆粒；(b)提供至少一個(gè)具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇是Aβ1-6肽；并且其中所述第二附著位點(diǎn)選自(i)非天然存在于所述抗原或抗原決定簇上的附著位點(diǎn)；和(ii)所述抗原或抗原決定簇上天然存在的附著位點(diǎn)；且其中所述第二附著位點(diǎn)能締合所述第一附著位點(diǎn)；和(c)混合所述核心顆粒和所述至少一個(gè)抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇和所述核心顆粒通過(guò)所述締合相互作用以形成有序和重復(fù)的抗原陣列。
46.一種免疫的方法，包括向動(dòng)物或人類(lèi)施用前述任一權(quán)利要求所述的組合物。
47.如權(quán)利要求46所述的免疫方法，其中所述抗原或抗原決定簇是自身抗原。
48.如權(quán)利要求46或47所述的免疫方法，其中所述動(dòng)物是人類(lèi)。
49.如權(quán)利要求46至48任一所述的免疫方法，其中所述抗原或抗原決定簇是人Aβ1-6肽。
50.權(quán)利要求1至44任一所述的組合物，其用作藥物。
51.權(quán)利要求1至44任一所述的組合物在制備用于治療阿爾茨海默氏病和相關(guān)疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、病毒學(xué)、免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了包含有序和重復(fù)的抗原或抗原決定簇陣列的組合物，特別是Aβ1－6肽－VLP組合物。更具體地，本發(fā)明提供了包含病毒樣顆粒和與其結(jié)合的至少一個(gè)Aβ1－6肽的組合物。本發(fā)明也提供了用于產(chǎn)生此綴合物或有序重復(fù)陣列的方法。本發(fā)明組合物可以用于生產(chǎn)治療阿爾茨海默氏病的疫苗，和用作預(yù)防或治愈阿爾茨海默氏病及有效地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，特別是抗體應(yīng)答的藥物。而且，在所述上下文中，本發(fā)明組合物特別可以用于有效地誘導(dǎo)自身特異性免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)A61P25/28GK1674934SQ03819734
公開(kāi)日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2003年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月19日
發(fā)明者M·F·巴赫曼, A·蒂索, R·奧特曼, R·隆得, M·施陶芬比爾, P·弗賴 申請(qǐng)人:希托斯生物技術(shù)股份公司, 諾瓦提斯醫(yī)藥股份公司