專利名稱：來自梯牧草的主要過敏原Phl p1的變異體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及來自梯牧草(timothy grass)的主要過敏原Phl p 1的變異體，其特征在于可利用原核表達系統(tǒng)的幫助來制備迄今不可能生產(chǎn)的、可溶的且在生理性介質中穩(wěn)定的單體分子，并且可隨后將其純化。
背景技術：
1型過敏反應具有世界范圍內的重要性。工業(yè)化國家中多達25％的人群患有例如，過敏性鼻炎、結膜炎或支氣管氣喘的疾病，這些疾病是由各種起始存在于空氣中的過敏原(空氣過敏原)引起的，例如植物花粉、螨、貓或狗。在草花粉的病例中，這些1型過敏反應患者的多達40％依次顯示出特異的IgE(免疫球蛋白E)反應(Freidhoff等人，1986，過敏反應臨床免疫學雜志J.Allergy.Clin.Immunol.78，1190-201)。
發(fā)起1型過敏反應的物質是蛋白質、糖蛋白或多肽。經(jīng)粘膜攝取后，在敏感人群中這些過敏原與結合肥大細胞表面的IgE分子起反應。如果兩個IgE分子通過過敏原相互交聯(lián)，這導致效應細胞釋放介質(例如組氨酸、前列腺素)和細胞因子，并因此產(chǎn)生相應的臨床癥狀。
根據(jù)具有針對某些過敏原的IgE抗體的過敏反應患者的相對頻率，在主要和次要過敏原之間是有差別的。在梯牧草(Phleumpratense)的病例中，Phl p 1(Petersen等人，1993，J.Allergy Clin.Immunol.92，789-796)、Phl p 5(Matthiesen和Lwenstein，1991，Clin.Exp.Allergy 21，297-307)、Phl p 6(Petersen等人，1995，Int.Arch.Allergy Immunol.108，49-54)和Phl p 2/3(Dolecek等人，1993)迄今還沒有被鑒定為主要過敏原，而Phl p 4(Lwenstein，1978，過敏反應進展Prog.Allergy 25，1-62)和來自黑麥草(Lolium perenne)的第10和11組(Ansari等人，1987，J.Allergy Clin.Immunol.80，229-235)也沒有被鑒定為次要過敏原。
包括來自梯牧草的Phl p 1的第1組，被分類為草花粉的最相關抗原組之一(Tamborini，E.等人，Eur.J.Biochem.1997，249886-894)。第1組中來自于其他草的其他代表性過敏原有時候與Phl p 1具有大于95％的同源性(Petersen，A.，等人，Allergy Clin.Immunol.1995，95987-994)。由于高同源性，在草致敏的情況下也出現(xiàn)與其他交叉反應種屬的過敏原的反應。因此，這些分子對于相應的診斷和治療方法至關重要。
關于這些過敏原的治療性用途，可利用與T輔助細胞的反應，該反應中出現(xiàn)病理學的TH2細胞重定向為TH1型。這導致細胞因子分布的變化，從而刺激B細胞形成IgG而非IgE。
有效治療過敏反應的經(jīng)典方法是特異性免疫治療或弱敏化作用(Fiebig，1995，Allergo J.4(6)，336-339，Bousquet等人，1998，J.AllergyClin Immunol.102(4)，558-562)，其中用天然的過敏原提取物以增加的劑量對患者進行皮下注射。
然而，在該方法中存在過敏反應或過敏性休克的風險。為了使這些風險最小化，應用類過敏原形式的創(chuàng)新制劑。這些制劑是化學修飾的過敏原提取物，其具有顯著減小的IgE反應性，但與未處理的提取物相比有相同的T-細胞反應性(Fiebig，1995，Allergo J.4(7)，377-382)。
使用通過重組方法制備的過敏原可使更多的基本治療優(yōu)化。通過重組方法制備的高純度過敏原的、任選匹配于個別患者的限定混合物可釋放來自天然過敏原來源的提取物，除包含各種過敏原外，還包含相對大量免疫原性的、但伴隨非過敏原性的蛋白質。通過特異突變的重組過敏原所提供的實際觀點是，其可導致用表達產(chǎn)物進行可靠的弱敏化作用，在該特異突變的重組過敏原中，特異性缺失IgE表位，而不減弱為治療所必需的T-細胞表位(Schramm等人，1999，免疫學雜志J.Immunol.162，2406-2414)。
進一步用于治療影響過敏反應患者中擾亂的Th-細胞平衡的可能性，是用編碼相關過敏原的可表達DNA進行治療。已經(jīng)在注射編碼過敏原DNA的嚙齒類動物中提供免疫應答的過敏原特異性影響的最初實驗證據(jù)(Hsu等人，1996，自然醫(yī)學Nature Medicine 2(5)，540-544)。
Phl p 1是包括240個氨基酸和n-糖基化位點的蛋白質。糖基化部分占分子量的5％，其在天然蛋白質中為大約30-35kDa(Petersen等人，Allergy Clin.Immunol.1995，95987-994；Suck等人，免疫學方法雜志J.Immunol.Meth.199.9，22973-80)。Phl p 1的核酸序列是已知的(Laffer等人，J.Allergy Clin Immunol.1994，94689-698；Petersen等人J.Allergy Clin.Immunol.，1995，95987-94)，并可因此用于該分子的重組制備。
以前試圖在細菌或真核系統(tǒng)中，例如酵母中通過重組方法制備該分子，由此可獲得穩(wěn)定的單體形式，但是由于其較差的溶解性而不是很成功在細菌表達的情況中，Phl p 1以包涵體形式沉積(Vrtala等人，J.Allergy Clin.Immunol，1996；97781-7)，并且在純化前必須先變性。然后除去變性劑。但是迄今為止還沒有實現(xiàn)使該蛋白質完全重折疊成為天然的可溶性構象(Andersson，Lidholm，Int.Arch.Allergy Immunol.2003；13087-107)。
阻止穩(wěn)定構象形成的一個可能原因是由于缺乏糖基化。然而，在可進行糖基化的真核系統(tǒng)中尚未獲得穩(wěn)定的Phl p 1(K.Grobe，論文Dissertation，1998，漢堡大學)。
替代性地，認為溶解性缺失的原因是由于導致分子自身-降解的蛋白水解活性(Grobe等人，Eur.J.Biochem.1999；26333-40；KirstenGehlhar，Dissertation，1998，Medical University of Lübeck，德國)。此外，分子間的疏水性相互作用也可能導致聚集作用。
本發(fā)明基于的目的是提供來自梯牧草的主要過敏原Phl p 1的變異體，其區(qū)別在于該變異體具有改善的溶解性，同時仍然完全保持治療和診斷的重要免疫學特性，并因此可以藥物學上合適的形式進行純化。
附1野生型nPhl p 1(n＝天然)和過敏原變異體rPhl p 1-A236C(r＝重組)的折疊變異體LM和HM，在還原條件(存在二硫蘇糖醇DTT)和非還原條件下(沒有DTT)的SDS-PAGE。
泳道1分子量標準(10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、160、220kDa，基準蛋白質Ladder，Invitrogen，Karlsruhe，德國)泳道2來自梯牧草(Phleum pratense)花粉的提取物泳道3nPhl p 1泳道4rPhl p 1-LM泳道5rPhl p 1-HM圖2在Sephacryl S100柱上的rPhl p 1-HM和rPhl p 1-LM的凝膠過濾。
該圖顯示兩種折疊變異體具有明顯不同的分子量。
圖3用于定量折疊變異體rPhl p 1-A236C-LM和-HM的IgE-結合的酶過敏原-吸附劑測試(EAST)在橫軸上作圖指明mol/l的IgE-nPhl p 1結合抑制劑的濃度，在縱軸上指明[％]的抑制程度。用固相上的nPhl p 1和草花粉過敏反應患者的典型血清進行測量。
發(fā)明詳述令人驚奇地，根據(jù)本發(fā)明現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)導入附加的半胱氨酸殘基，優(yōu)選地在所述分子的羧基端部分(特別是從第140位氨基酸往后，特別優(yōu)選在第230位和第240位氨基酸之間)導入，可導致改善溶解性而不改變IgE活性和T-細胞反應性。
因此本發(fā)明涉及來自梯牧草的主要過敏原Phl p 1的變異體，其與野生型相比具有附加的Cys殘基，并且涉及具有相同或相似有利特性的堿基分子衍生的片段和變異體。
本發(fā)明進一步涉及用于制備重組主要過敏原rPhl p 1的本發(fā)明所述變異體的方法，其特征在于，通過本身已知的方法，經(jīng)插入或置換將編碼Cys殘基的堿基三聯(lián)體導入Phl p 1基因，如此改變的基因在宿主生物體中過表達，并純化由過表達獲得的過敏原變異體。
可使用或不使用經(jīng)基因工程導入的融合元件制備和純化原核重組體，并且通?？傻玫较嗤漠a(chǎn)物。如果使用融合元件，優(yōu)選為His標記。純化的方法可根據(jù)表達載體或系統(tǒng)而不同。
因此本發(fā)明包括重組過敏原rPhl p 1的特異改變的初級序列，該序列有利于其在細菌和其他表達系統(tǒng)中的重組制備并適于隨后的純化。
因此本發(fā)明也涉及編碼本發(fā)明所述的過敏原變異體的DNA分子。
重組蛋白是自發(fā)蛋白水解失活的，因此可根據(jù)應用，以穩(wěn)定的單體形式貯存在生理學緩沖液或其他溶液中。在重組體和天然Phl p 1之間T-細胞刺激未顯示顯著的差異。
因此重組的過敏原變異體和衍生的片段或變異體可用于治療草花粉誘導的過敏原疾病。
由于藥物學適用性，本發(fā)明也涉及其作為藥物特性的新過敏原變異體。
通過重組方法制備的過敏原變異體和片段可進一步用于診斷花粉過敏反應。
在通過基因工程改變來自梯牧草的主要過敏原Phl p 1的制備中，氨基酸置換受到例如PCR方式的定向核苷酸置換的影響。在特別優(yōu)選的實施方案中，如SEQ ID NO 2所示的突變rPhl p 1-A236C中，第236位的丙氨酸被替換為半胱氨酸。然而，置換位點也可以是在該分子的任何所需要的其他位點。但是通常，其位于分子的C端區(qū)域，優(yōu)選從第140位往后，特別是在第230位和第240位之間。
置換的結果是，Phl p 1的已知的蛋白水解活性同時被消除了。
另一個未料到的結果是，根據(jù)本發(fā)明，在分子的分離和純化過程中兩種折疊的變異體可完全相互分離。
第一種構象變異體，稱為rPhl p 1-LM(LM＝低分子量)，顯示與天然蛋白質非常相似的性狀，因為其在非還原的SDS-PAGE(

圖1)和凝膠過濾(例如在圖2的Sepharcryl S-100上)中泳動性狀是相似或相同的，而第二種變異體，稱為rPhl p 1-HM(HM＝高分子量)，則顯示不同的折疊形式。IgE反應性也不同。rPhl p 1-LM具有與天然蛋白質相當?shù)姆磻?，rPhl p 1-HM則極少與IgE抗體結合，并且由于其弱敏性而特別適合于特異的免疫治療(參見圖3)。
然而就原理而論，兩種折疊都適合于治療和診斷的應用。
因此本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明所述的rPhl p 1過敏原變異體的不同折疊形式，并涉及其用于治療和診斷目的的用途。
兩種折疊形式都是易溶的、穩(wěn)定的單體形式并且不具有可檢測的蛋白水解/自發(fā)水解活性。
可例如通過下文列出的兩種制備方法-有或沒有-人工融合元件的方法來獲得本發(fā)明所述的過敏原變異體。
1)具有人工融合元件(His標記)的表達在使用His標記的情況中，經(jīng)多個生化分離步驟純化起始不可溶的粗蛋白，包括一個或多個金屬離子螯合親和色譜步驟，并除去His標記。對于純化前和純化后，可使用各種其他的色譜方法和變性及復性步驟。
制備折疊形式的rPhl p 1-LM-利用鹽酸胍使從宿主生物體分離的包涵體變性，-在螯合親和色譜柱上使溶解的蛋白質復性，-除去His標記，-第一次凝膠過濾，-螯合親和色譜分析，-從流過液分離靶蛋白質，第二次，最后的凝膠過濾。
通過進行下列的方法步驟，在該純化的變異體中可獲得另一種折疊形式的-rPhl p 1-HM-在宿主生物體中過表達具有His標記的rPhl p 1過敏原變異體，-利用鹽酸胍使從宿主生物體分離的包涵體變性，-在螯合親和色譜柱上使溶解的蛋白質復性，-除去His標記，-第一次凝膠過濾，-螯合親和色譜分析，-用咪唑梯度洗脫靶蛋白質，-第二次，最后的凝膠過濾。
2)沒有融合元件(沒有His標記)的表達-利用鹽酸胍使從宿主生物體分離的包涵體變性，其中，如下所述，根據(jù)變性持續(xù)的時間獲得一種或另外一種折疊形式。
-通過在緩沖溶液中稀釋來使溶解的蛋白質復性，其中優(yōu)選使用20-50mM的Tris/HCl pH7-8，但是其他的緩沖液和pH值(例如，7-10.5)也是可行的。對于稀釋，優(yōu)選將每批變性物加入多倍于其體積(大約10至80倍，優(yōu)選20至60倍的體積)的、優(yōu)選為攪拌的或混合的緩沖溶液，例如通過傾析、吹吸或抽打；然而也可以將緩沖溶液加入每批變性物。加入的比例不是至關重要的因此，可以在數(shù)秒內一次性加入全部量或備選地-(但優(yōu)選不是必須的)均一地-在數(shù)小時內分次加入。
-通過螯合親和色譜法和隨后用咪唑梯度(優(yōu)選使用分級梯度進行，但連續(xù)梯度同樣也是可行的)洗脫來濃縮和純化復性的蛋白質。備選或附加地，也可任選進行螯合親和色譜法、疏水性相互作用色譜法和/或陰離子交換色譜法(必須用色譜法完全處理所述分子)。
-最后的凝膠過濾。
在變性步驟中用不同孵育時間的方式，以最小的交叉污染在此可特異獲得替換性的穩(wěn)定折疊形式的LM和HM。對于LM形式的制備，基本上在大約1和50小時之間進行孵育。然而通常使用10至40小時的范圍，優(yōu)選15至30小時，其中18至22小時的范圍是特別優(yōu)選的。
對于HM變異體，需要顯著較長的孵育時間。其為大約60至120小時。然而通常孵育可進行70至100小時，特別優(yōu)選為80至90小時的范圍。
在所有的情況中變性步驟后是用緩沖溶液進行上述稀釋的步驟。
之間的間隔時間(大約50至60小時)表示再形成階段。稀釋步驟明顯決定了折疊過程，沒有發(fā)生進一步的動力學過程。
經(jīng)疏水性相互作用色譜法或通過凝膠過濾可實現(xiàn)分離LM和HM的良好純化，其中該形式具有顯著不同的持續(xù)時間。
可獲得高純度折疊變異體LM和HM的、本發(fā)明所述的過敏原變異體，其具有頗有價值的藥物學相關特性。因此，其可作為混合物、也可單獨用于診斷(特別是rPhlp 1-LM，因為保留IgE活性)和治療(特別是rPhl p 1-HM，因為減弱的IgE活性)過敏性疾病。
因此本發(fā)明同樣涉及過敏原變異體和/或其藥物學上可利用的衍生物，包括其所有比例的混合物在制備用于特異性免疫治療(弱敏化作用)的藥物，以及在診斷過敏反應中的用途，其中該過敏反應的觸發(fā)中涉及來自梯牧草的主要過敏原Phl p 1。
本發(fā)明進一步涉及包括本發(fā)明所述的過敏原變異體和/或其藥物學上可利用的衍生物，包括其所有比例的混合物的藥物組合物，并且如果需要，所述組合物可包括賦形劑和/或佐劑?？蓪⒈景l(fā)明所述的活性成分在此與至少一種固體、液體和/或半液體-賦形劑或佐劑一起以及，如果需要，與一種或多種另外的活性成分組合而轉化為合適的劑型。
如果將根據(jù)本發(fā)明過敏原變異體所基于的DNA分子與合適的載體連接，這些構建體可另外用作免疫治療的制劑(DNA疫苗)。
本發(fā)明因此同樣涉及包含本發(fā)明所述DNA分子的重組DNA表達載體，氣用于通過免疫治療性DNA的疫苗接種來治療過敏反應，其中該過敏反應的觸發(fā)中涉及來自梯牧草的主要過敏原Phl p 1。
本發(fā)明進一步涉及所述表達載體和/或其衍生物，包括其所有比例的混合物在用于制備通過免疫治療性DNA的疫苗接種來治療過敏反應的藥物中的用途，其中該過敏反應的觸發(fā)中涉及來自梯牧草的主要過敏原Phl p 1。
最后，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明所述表達載體和/或其衍生物，和/或其藥物學上可利用的衍生物，包括其所有比例的混合物，并且如果需要，包括賦形劑和/或佐劑的藥物組合物，所述組合物用于通過免疫治療性DNA的疫苗接種來治療過敏反應，其中該過敏反應的觸發(fā)中涉及來自梯牧草的主要過敏原Phl p 1。
為了本發(fā)明的目的，藥物學組合物可在人類醫(yī)學或獸醫(yī)學中用作治療性試劑。合適的賦形劑是有機或無機物質，該物質適合于非腸胃給藥并且不與來自梯牧草的主要過敏原Phl p 1的本發(fā)明所述過敏原變異體起反應。適合于非腸胃給藥的是，特別為溶液，優(yōu)選以油為基礎的或含水的溶液，進一步為懸浮液、乳液或植入物。本發(fā)明所述的過敏原變異體也可被凍干并且所得到的凍干物可用于，例如制備注射制劑。所指定的組合物可以是無菌的和/或包括佐劑，例如潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和/或濕潤劑、乳化劑、用于改變滲透壓的鹽、緩沖物質和/或多種另外的活性成分。
此外，可通過本發(fā)明所述過敏原變異體的相應劑型，例如表面吸附在氫氧化鋁上來獲得延遲釋放的組合物。
根據(jù)本發(fā)明的突變，在不同位置的其他選擇性改變和-例如用于增加弱敏性-的其他改變，當然也是可行的。這些改變可以是，例如過敏原提取物的化學修飾(Fiebig，1995，Allergo J.4(7)，377-382)。然而，也可通過基因工程在DNA水平進行改變，其中，例如氨基酸的插入、缺失和置換，切割蛋白質成為片段以及將蛋白質或其片段與其他蛋白質或肽融合都是合適的。
就第1組草花粉主要過敏原內的高序列同源性而言，在此所描述的通過導入Cis殘基用于改善Phl p 1相關溶解性，并出現(xiàn)折疊變異體的所有效應也可預期適用于該組的其他代表性過敏原。
即使沒有這些評注，認為本領域的技術人也能夠在最廣泛的范圍內利用上述說明。因此下列表1和表2中所描述的，并以變異體rPhl p1-A236C的實施例方式說明的實施方案只被認為是說明性的公開，而絕對不是以任何方式加以限制。
所有的色譜法材料可從Amersham Biosciences(Freiburg，德國)商業(yè)購買。
在所描述的螯合親和色譜方法中選擇的金屬離子不是至關重要的，Ni和Cu都可使用。
實施例1分離具有His標記的rPhl p 1-A236C-LM和-HM-純化變異體用特異于5’-和3’的寡核苷酸，通過PCR方式擴增編碼Phl p 1的序列，并經(jīng)EheI和Hind III限制性位點連接到ProEx載體(GIBCO，LaJolla，美國)中。將3’-引物第706/707位置的堿基GC改變?yōu)門G，由此將編碼丙氨酸的三聯(lián)體轉變?yōu)榫幋a半胱氨酸的三聯(lián)體(基本分子生物學Essential Molecular Biology；T.A.Brown編輯，IRL Press，牛津，1994)。在大腸桿菌生物體中進行轉化。所選擇的起始載體pProEx提供位于N末端的6xHis序列，其后是TEV蛋白酶的識別序列。細菌表達后，將以不溶聚集物存在的初級6xHIS-標記的重組rPhl p 1-A236C分子在6M鹽酸胍(GdmCl)，50mM Tris/HCl，500mM NaCl，pH8.0)中預純化后溶解。然后是兩級的Ni螯合親和色譜分析在第一步中，經(jīng)過90分鐘過程的梯度，將在變性條件下結合螯合瓊脂糖凝膠的蛋白質從變性溶液轉移到由50mM磷酸鹽緩沖液和500mM NaCl(pH 7.4)組成的緩沖液中。然后用磷酸鹽緩沖液中的500mM咪唑逐步洗脫。復性的融合蛋白被特異的TEV蛋白酶切割成rPhl p 1和6xHis融合元件。
為了準備第二次親和色譜分析，用Sephadex G-25和磷酸鹽緩沖液作為洗脫液進行凝膠過濾，結果是除去了咪唑。
然后將緩沖液形式的蛋白質混合物用于第二次Ni螯合親和色譜分析。此中，在流過液中發(fā)現(xiàn)一些成功切割的rPhl p 1。這是LM-形式的分子。除了未切割的分子，顯然由于暴露的組氨酸殘基，構象變異體HM也保留粘附在柱上。在未切割的融合蛋白前，該切割的變異體在咪唑梯度中洗脫出來，從而還能夠以高純度獲得這種形式。在最后的步驟中，用Superdex 75進行凝膠過濾以用于最后的純化，并轉移到所需要的溶劑中。
表1概述利用His標記的本發(fā)明所述的制備和純化方法
實施例2分離沒有His標記的rPhl p 1-A236C-LM和-HM-純化變異體起初，遵循實施例1的步驟，但是其中所選擇的載體不提供作為初級產(chǎn)物的融合蛋白。
細菌表達后，將以不溶聚集物存在的初級rPhl p 1-A236C重組分子(包涵體)在6M鹽酸胍(GdmCl)，50mM Tris/HCl，pH8.0)中預純化后溶解。然后在20mM Tris pH 8.0中稀釋40倍。為此，將變性的溶液輕輕倒入利用磁力攪拌儀攪拌的稀釋溶液。
a)制備LM形式包涵體在變性溶液中孵育20h，然后如上所述稀釋。
b)制備HM形式包涵體在變性溶液中孵育85h，然后如上所述稀釋。
將500mM的NaCl分別加入各批溶液(復性)。通過Cu螯合親和色譜法并用磷酸鹽緩沖液中的200mM咪唑階段(或逐漸經(jīng)過磷酸鹽緩沖液中的500mM咪唑)洗脫來濃縮各批復性溶液中溶解的分子。
在蛋白質的洗脫前，可例如用3M的NaCl溶液進行洗滌，以及3M的NaCl，200mM的咪唑溶液進行洗脫來任選地將螯合親和色譜法用于處理。然后可將高鹽含量的洗脫物直接用于疏水性相互作用色譜法。
表2概述沒有利用His標記的本發(fā)明所述的制備和純化方法
實施例2野生型和過敏原變異體rPhl p 1-A236C的折疊變異體LM和HM的不同IgE結合根據(jù)Suck等人(Int.Arch.過敏反應免疫學Allergy Immunol.2000；121284-291)的方法，用過敏反應患者的血清庫進行EAST抑制試驗，來比較天然的nPhl p 1和重組的rPhl p1變異體HM和LM相互之間對IgE結合的強度(圖3)。發(fā)現(xiàn)與天然的Phl p 1蛋白相比，HM變異體顯著地減小了其與IgE的結合，而LM變異體與IgE的結合與天然Phl p 1蛋白相當。
序列表<110> Merck Patent GmbH<120> 來自梯牧草的主要過敏原Phl p1的變異體<130> P 02/129<140> EP 02 018 157.4<141> 2002-08-19<160> 2<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 723<212> DNA<213> 梯牧草<220>
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<400> 1atc ccc aag gtt ccc ccc ggc ccg aac atc acg gcg acc tac ggc ggc 48Ile Pro Lys Val Pro Pro Gly Pro Asn Ile Thr Ala Thr Tyr Gly Gly1 5 10 15aag tgg ctg gac gcg aag agc acc tgg tac ggc aag ccg acg gcc gcc 96Lys Trp Leu Asp Ala Lys Ser Thr Trp Tyr Gly Lys Pro Thr Ala Ala20 25 30ggt ccc aag gac aac ggc ggc gcg tgc ggg tac aag gac gtg gac aag144Gly Pro Lys Asp Asn Gly Gly Ala Cys Gly Tyr Lys Asp Val Asp Lys35 40 45
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Trp Gly Ala Ile Trp Arg Ile Asp Thr Pro Glu Val Leu Lys Gly Pro195 200 205ttc acc gtc cgc tac acc acc gag ggc ggc acc aag ggc gag gcc aag672Phe Thr Val Arg Tyr Thr Thr Glu Gly Gly Thr Lys Gly Glu Ala Lys210 215 220gac gtc atc ccc gag ggc tgg aag gcc gac acc tgc tac gag tcc aag720Asp Val Ile Pro Glu Gly Trp Lys Ala Asp Thr Cys Tyr Glu Ser Lys225 230 235 240tga723<210> 2<211> 240<212> PRT<213> 梯牧草<400> 2Ile Pro Lys Val Pro Pro Gly Pro Asn Ile Thr Ala Thr Tyr Gly Gly1 5 10 15Lys Trp Leu Asp Ala Lys Ser Thr Trp Tyr Gly Lys Pro Thr Ala Ala20 25 30Gly Pro Lys Asp Asn Gly Gly Ala Cys Gly Tyr Lys Asp Val Asp Lys35 40 45Pro Pro Phe Ser Gly Met Thr Gly Cys Gly Asn Thr Pro Ile Phe Lys50 55 60Ser Gly Arg Gly Cys Gly Ser Cys Phe Glu Ile Lys Cys Thr Lys Pro
65 70 75 80Glu Ala Cys Ser Gly Glu Pro Val Val Val His Ile Thr Asp Asp Asn85 90 95Glu Glu Pro Ile Ala Ala Tyr His Phe Asp Leu Ser Gly Ile Ala Phe100 105 110Gly Ser Met Ala Lys Lys Gly Asp Glu Gln Lys Leu Arg Ser Ala Gly115 120 125Glu Val Glu Ile Gln Phe Arg Arg Val Lys Cys Lys Tyr Pro Glu Gly130 135 140Thr Lys Val Thr Phe His Val Glu Lys Gly Ser Asn Pro Asn Tyr Leu145 150 155 160Ala Leu Leu Val Lys Phe Val Ala Gly Asp Gly Asp Val Val Ala Val165 170 175Asp Ile Lys Glu Lys Gly Lys Asp Lys Trp Ile Ala Leu Lys Glu Ser180 185 190Trp Gly Ala Ile Trp Arg Ile Asp Thr Pro Glu Val Leu Lys Gly Pro195 200 205Phe Thr Val Arg Tyr Thr Thr Glu Gly Gly Thr Lys Gly Glu Ala Lys210 215 220
Asp Val Ile Pro Glu Gly Trp Lys Ala Asp Thr Cys Tyr Glu Ser Lys225 230 235 240
權利要求
1.來自梯牧草的主要過敏原Phl p1的變異體，其特征在于與野生型相比該變異體具有附加的Cys殘基。
2.權利要求1所述的過敏原變異體，其特征在于附加的Cys殘基位于羧基端區(qū)域。
3.權利要求1或2所述的過敏原變異體，其特征在于附加的Cys殘基位于比第140位氨基酸更靠后的位置。
4.權利要求1至3中一項或多項所述的過敏原變異體，其特征在于附加的Cys殘基位于第230位和第240位的氨基酸之間。
5.權利要求1至4中一項或多項所述的過敏原變異體，其特征在于附加的Cys殘基來源于氨基酸置換。
6.權利要求1至5中一項或多項所述的、如SEQ ID NO 2所示的過敏原變異體rPhl p1-A236C，其特征在于已經(jīng)通過置換Ala 236而導入附加的Cys殘基。
7.編碼權利要求1至6中一項或多項所述的過敏原變異體的DNA分子。
8.編碼權利要求6所述的過敏原變異體的、如SEQ ID NO 1所示的DNA分子。
9.用于制備權利要求1至6中一項或多項所述的主要過敏原rPhlp1的重組變異體的方法，其特征在于通過本身已知的方法，-通過插入或置換將編碼Cys殘基的堿基三聯(lián)體導入相應的基因，-以這種方式改變的基因在宿主生物體中過表達，以及-純化由過表達獲得的過敏原變異體。
10.用于制備和純化權利要求9所述可溶形式的主要過敏原rPhl p1的重組變異體的方法，其特征在于使起初不可溶的粗蛋白變性，然后通過稀釋而復性，并經(jīng)生化純化步驟進行純化。
11.用于純化權利要求9所述可溶形式的主要過敏原rPhl p1的重組變異體的方法，其特征在于從過表達開始，為了純化的目的使起初不可溶的粗蛋白具有His標記，進行多個生化純化步驟，包括兩級金屬離子螯合親和色譜法，并除去His標記。
12.權利要求1至6中一項或多項所述的過敏原變異體，其特征在于該變異體存在多種折疊形式。
13.權利要求1至6中一項或多項所述的過敏原變異體的折疊形式rPhl p1-LM，其可通過進行下列方法步驟而獲得-在宿主生物體中過表達具有His標記的rPhl p1過敏原變異體，-利用鹽酸胍使從宿主生物體分離的包涵體變性-在螯合親和色譜柱上使溶解的蛋白質復性-除去His標記-凝膠過濾-進一步的螯合親和色譜分析-從流過液分離靶蛋白質-凝膠過濾。
14.權利要求1至6中一項或多項所述的過敏原變異體的折疊形式rPhl p1-HM，其可通過進行下列方法步驟而獲得-在宿主生物體中過表達具有His標記的rPhl p1過敏原變異體-利用鹽酸胍使從宿主生物體分離的包涵體變性-在螯合親和色譜柱上使溶解的蛋白質復性-除去His標記-凝膠過濾-進一步的螯合親和色譜分析-用咪唑梯度洗脫靶蛋白質-凝膠過濾。
15.用作藥物的權利要求1至6和12至14中一項或多項所述的過敏原變異體。
16.權利要求15所述的過敏原變異體和/或其藥物學上可利用的衍生物，包括其所有比例的混合物在制備用于特異免疫治療過敏反應的藥物中的用途，其中該過敏反應的觸發(fā)中涉及來自梯牧草的主要過敏原Phl p1。
17.一種藥物組合物，所述組合物包括權利要求15所述的過敏原變異體和/或其藥物學上可利用的衍生物，包括其所有比例的混合物，并且如果需要，包括賦形劑和/或佐劑。
18.包括權利要求1至6和12至14中一項或多項所述的過敏原變異體和/或其衍生物，包括其所有比例的混合物在用于體外診斷過敏反應中的用途，其中該過敏反應的觸發(fā)中涉及來自梯牧草的主要過敏原Phl p1。
19.包含權利要求7或8所述DNA分子的重組DNA表達載體，其用于通過免疫治療性DNA的疫苗接種來治療過敏反應，其中該過敏反應的觸發(fā)中涉及來自梯牧草的主要過敏原Phl p1。
20.權利要求19所述的表達載體和/或其衍生物，包括其所有比例的混合物在制備用于通過免疫治療性DNA的疫苗接種來治療過敏反應的藥物中的用途，其中該過敏反應的觸發(fā)中涉及來自梯牧草的主要過敏原Phl p1。
21.藥物組合物，包括權利要求19所述的表達載體和/或其藥物學上可利用的衍生物，包括其所有比例的混合物，并且如果需要，包括賦形劑和/或佐劑的藥物組合物，所述組合物用于通過免疫治療性DNA的疫苗接種來治療過敏反應，其中該過敏反應的觸發(fā)中涉及來自梯牧草的主要過敏原Phl p1。
全文摘要
本發(fā)明涉及來自梯牧草的主要過敏原Phlp1的藥物學上重要的變異體，其特征在于可通過原核表達系統(tǒng)的方式生產(chǎn)先前不可能生產(chǎn)的穩(wěn)定且可溶于生理性介質的單體分子，并且可隨后純化所述的分子。
文檔編號A61K39/36GK1675240SQ03819823
公開日2005年9月28日 申請日期2003年7月31日 優(yōu)先權日2002年8月19日
發(fā)明者R·薩克, H·菲比希, O·克洛姆維爾 申請人:默克專利股份公司