專利名稱：生物的皮膚修復(fù)和增強的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來說涉及皮膚的修復(fù)，更具體地說涉及使用活細胞來修復(fù)和/或增強皮膚。
背景技術(shù)：
隨著歲月流逝，皮膚自然衰老。陽光的作用加速老化，該過程被稱為光老化，而且暴露于風、鹽和其他因素也加速老化。隨著老化，皮膚擁有或表現(xiàn)出各種問題，包括線紋、皺紋、缺乏堅實性和彈性、粗糙、不均勻角質(zhì)層、老年斑和光線性角化病。
通過用不透明的化妝膜或涂層掩蓋缺陷來暫時地增強皮膚的外觀的化妝品已經(jīng)使用了數(shù)千年。自古以來人們就知道或嘗試了可改善裸露的、未經(jīng)修飾的皮膚的質(zhì)量和外觀而非僅僅掩蓋缺陷的處理。使用水果或乳酸、或醋漂洗的處理方法，如果長期一貫地保持的話，在暫時地阻止某些可見的老化效果方面或許已是成功的。近年來，人們在尋找對于老化皮膚難題的有效處理方法，并且存在著巨大且正在增長的、為老化皮膚的外觀有效地提供結(jié)構(gòu)改善的產(chǎn)品和服務(wù)的市場。
一類為皮膚提供結(jié)構(gòu)改善的產(chǎn)品是皮膚更新酸(skin renewal acids)，尤其是α-羥基酸和視黃酸，或它們的酯。這些酸、酸性化合物或酯不是作用于細胞內(nèi)就是作用于細胞間以刺激皮膚細胞增殖。在授予Yu和Van Scott的各種專利中公開了一些利用皮膚更新酸的處理方法，這些專利包括，例如，美國專利No.4,363,815、No.5,091,171和No.5,422,370，以及國際專利申請No.WO94/06640。類維生素A代表了另一類刺激皮膚更新的產(chǎn)品，例如如在Kligman的美國專利No.5,051,449中公開的那樣。然而，這些產(chǎn)品只限于改變小規(guī)模的皮膚紊亂并且對許多人作用不夠好。
皮膚更新酸提供了某些益處但易于引起刺激、起效慢且會引起干皮病問題。一種利用乳酸與水楊酸的新組合的刺激性特別低的處理方法公開于國際專利申請出版物No.WO/94/06640，其描述了可有效地提供對皮膚水屏障的持久并且顯著破壞的屏障破壞處理的局部應(yīng)用。將這種持久破壞保持足夠長的時間以引起皮膚的結(jié)構(gòu)改善。被破壞的水屏障是水蒸氣通過皮膚的固體部分擴散或蒸發(fā)的天然障礙，而不涉及出汗。這種技術(shù)通常也只限于小規(guī)模的暫時改善并且對許多人不適用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個實施方案是整修個體皮膚的方法，其包括從皮膚表面去除死細胞以形成準備好的表面并以成肌細胞營養(yǎng)液形式將成肌細胞涂到準備好的皮膚表面。本發(fā)明的另一個實施方案是用于個體皮膚改善的成肌細胞懸浮液，其包含得自個體的自體的人成肌細胞、得自個體的血清、血管生成因子和用于成肌細胞的受控快速細胞融合的大6硫酸軟骨素(large 6 chondroitin sulfate)。本發(fā)明的另一個實施方案在類似的過程中利用包皮成纖維細胞懸浮液，單獨或與成肌細胞組合。在又一個實施方案中，使用了來自具有影響外源識別，如影響加至細胞表面的α-1，3-半乳糖的雙剔除(knockout)突變的另一動物如豬的非免疫原性細胞。
具體實施例方式
已發(fā)現(xiàn)可以將來自乳膏樣懸浮液的成肌細胞以薄層(一層或多層)的形式涂到準備好的皮膚表面以使成肌細胞存活、生長并且并入到皮膚中，從而填充裂縫及皮膚的其他裂隙。成肌細胞消除皮膚中的缺陷并提供更多的諸如彈性、甚至色澤和強度的性質(zhì)。
在一個有利的實施方案中，首先處理要處理的個體的皮膚，優(yōu)選用柔滑的研磨劑或用一種或多種化學(xué)品如乳酸處理。在去除死細胞的處理后，將含或不含包皮成纖維細胞的成肌細胞懸浮液，平抹到所希望的區(qū)域以填補瑕疵、皺紋和/或孔。然后，將溫暖濕潤的含氧空氣，或更優(yōu)選純氧，吹到處理的地方至少0.1、1、3、6、12、24或更多小時。將該區(qū)域靜置至少12、24至30或更多小時?？梢园凑臻g隔如1、2、3、6或12個月來重復(fù)所述整個過程，以得到更光滑和看起來更年輕的皮膚。
在另一個實施方案中，懸浮液包含來自另一動物的細胞如皮膚細胞，所述動物具有外源組織特異性抗原如加到細胞表面上的α-1，3-半乳糖所必需的基因的雙剔除去除。
用于處理的成肌細胞成肌細胞可以是自體的(從所處理的個體獲得的)，可以從其他人獲得，或者甚至從其他動物獲得。如果不是自體的，優(yōu)選預(yù)先給予環(huán)孢霉素。雖然可使用其他的免疫系統(tǒng)抑制劑，但優(yōu)選使用環(huán)孢霉素5天，因為通過環(huán)孢霉素對某些淋巴細胞的作用而抑制皮膚中的炎癥。通常，有嚴重皮膚病的病人服用環(huán)孢霉素最少幾個月并多至數(shù)年，并且典型地以每天5mg/(kg體重)的口服劑量來使用環(huán)孢霉素。
如果得自正在接受處理的個體，優(yōu)選在去除前用機械探針法(mechanicalprobing)刺激一或更多肌肉1天、2至3天、4至5天或更多天。例如，可刺激四個肌肉點左、右三角肌和左、右四頭肌，用Emgel局部麻醉2小時后使用2.5英寸的針(26規(guī)格)，每個點6次。2至3天后，對于總共獲得的2.0g肌肉，可用針(穿孔器)刺法活檢0.5g肌肉。將細胞分散并培養(yǎng)成10億至500億個成肌細胞的培養(yǎng)物。
將培養(yǎng)的成肌細胞懸浮于任何合適的介質(zhì)中。特別是對于自體細胞，優(yōu)選將細胞再懸浮于得自待處理的個體的血清或血中。例如，可從所述個體獲得50至100ml的血并分離血清。連同其他因子一起，例如，NGF、胰島素、VEGF165(血管生成因子)、TGF-β、血管緊張素、葡萄糖、胎球蛋白、脂質(zhì)、白蛋白、大6硫酸軟骨素和雞胚提取物(或其他來源的生長因子)，優(yōu)選以1億個細胞/ml將希望量的成肌細胞懸浮在血清(優(yōu)選至少25％、50％、75％或更多血清)中。熟練的技術(shù)人員會知道每種因子的使用量。常規(guī)的優(yōu)化試驗可使用，例如，0.01ng至1μg/ml的血管生成因子。更有營養(yǎng)的物質(zhì)如葡萄糖、脂質(zhì)、白蛋白和雞胚提取物，可在更高的、1μg/ml至25mg/ml之間的濃度下優(yōu)化?？墒褂米罱K濃度在0.01μg/ml至1mg/ml之間并更優(yōu)選在1μg/ml和100μg/ml之間的大6硫酸軟骨素。在室溫下將懸浮介質(zhì)滴定至pH 6.8-7.2。將細胞懸浮并優(yōu)選在其后迅速地施用于準備好的皮膚。細胞的濃度應(yīng)為1百萬-10億個細胞/ml，優(yōu)選為1千萬-5億個細胞/ml，并且更優(yōu)選為5千萬-1.5億個細胞/ml。
細胞懸浮液任選地包含一種或多種調(diào)節(jié)黏度的試劑，以適合機械地附著于皮膚表面。例如，可使用如U.S.6,387,413中描述的透明質(zhì)酸和如U.S.6,365,149中描述的多孔組織支架及如U.S.6,306,424中描述的泡沫復(fù)合材料。在另一個用于除皮膚整修外的其他情況如血管修復(fù)和內(nèi)臟修復(fù)的實施方案中，本文所描述的成肌細胞可用于被覆用作體內(nèi)的支架的材料。這種材料可被處理以促進成肌細胞的附著，并且在一個實施方案中可以用硫酸軟骨素被覆。用于這些進一步的方法的塑料和無機材料是已知的，例如在U.S.6,107,453、U.S.5,843,781和U.S.5,503,771中提及的。在另一個實施方案中，如本文中所述的成肌細胞層用作人造或生物器官的被覆層，包括用作實體瘤的被覆層。使用這種成肌細胞層既可以被覆又可以保護還可以機械地固定這樣的器官，同時允許大分子甚至細胞如淋巴細胞移動進出被固定的器官。
在一個尤其用于填充大的皮膚區(qū)域如大皺紋的實施方案中，使用了個體成肌細胞和小肌管的混合物。肌管的存在幫助機械地橋接大縫隙，并且可以根據(jù)需要制備并調(diào)整混合物中的肌管的比率和平均大小，這可被熟練技術(shù)人員所理解。
在另一個實施方案中，可以單用包皮成纖維細胞或?qū)⑵渑c成肌細胞和/或肌管合用來產(chǎn)生近似的結(jié)果。包皮成纖維細胞可有利地提供光滑細膩的肌理。
皮膚的準備在使用成肌細胞前將死皮膚細胞去除?？梢允褂醚心ヌ幚?，如用微粒狀水滾石英卵砂和高級體霜按摩以去除死皮和碎屑。其他物理方法也可有效，例如，通過用膠帶，或氰基丙烯酸酯粘合劑，或石蠟剝離皮膚的外層。其他破裂處理可以使用化學(xué)藥品從角質(zhì)層中去除屏障脂質(zhì)。有機溶劑如己烷、丙酮或甲醇和強洗滌劑如十二烷基硫酸鈉不能物理去除角質(zhì)層的層，但對清潔表面有效，因為它們通過從角質(zhì)層去除相當多的脂質(zhì)物質(zhì)來破壞水蒸氣屏障。可以使用表皮脫落劑如α-羥基酸，獨立地使用或與研磨劑按摩合用。在處理后，應(yīng)該用水沖洗經(jīng)過處理的皮膚，優(yōu)選在體溫下進行。
將成肌細胞應(yīng)用到準備好的皮膚上優(yōu)選地，在潔凈室(等級100、等級1000、或等級10,000)中，將成肌細胞，任選地與填充大范圍皮膚的肌管和/或包皮成纖維細胞(或其他細胞)一起，平抹到準備好的表面上，以填充瑕疵、皺紋和孔。優(yōu)選地將平抹的成肌細胞表面暴露于氧并靜置至少6小時、12小時、18小時、24小時、30小時，或如果希望的話，甚至至少36小時。優(yōu)選地將含有至少20％、35％、50％、70％或者甚至高于95％的氧的溫暖濕潤空氣連續(xù)地吹到成肌細胞層至少4、6、9、12或更多小時。優(yōu)選地至少在24、30、36、48或更多小時里不清洗所處理的區(qū)域。在一個實施方案中，通過噴霧或其他方法將抗菌劑添加到涂抹了成肌細胞的表面，或者可以在涂抹到皮膚表面之前添加到細胞懸浮液中。
對于本發(fā)明的實施方案的作用方式，不想受任何理論的約束，要指出的是成肌細胞可以在寬范圍的培養(yǎng)物、應(yīng)用溶液和環(huán)境條件中存活并生長。每一種這樣的試劑都適合于本發(fā)明的實施方案。許多受處理的外皮層包括比成肌細胞大很多的成纖維細胞。涂敷的成肌細胞會發(fā)育成肌管，并可在皮膚表面形成肌纖維系統(tǒng)，使得至少一些成纖維細胞向外生長并從皮膚表面排出。而且，成肌細胞是運動的并可避開毛囊，因而保持皮膚的有毛的表面。又進一步，當涂敷的成肌細胞(其中很多永不會成熟為肌纖維)衰老并開始死亡時，它們變?yōu)榻Y(jié)締組織并可形成一些彈性物或膠原。也就是說，一些涂敷的成肌細胞懸浮液退化成在皮膚上形成堅固層的其他組織。因此，本發(fā)明的一些實施方案的一個特征是觸感性的去除或降低。根據(jù)本發(fā)明的實施方案的使用成肌細胞的處理的另一個特征是可以產(chǎn)生更加(同質(zhì)的)理想的皮膚顏色。在一個特別的實施方案中，在成肌細胞的體外培養(yǎng)期間或就在將成肌細胞涂抹到皮膚之前，在黑色素反應(yīng)中涉及到的酪氨酸酶和/或其他酶的一個或多個基因被開啟或調(diào)節(jié)。這個實施方案允許使用成肌細胞來校正皮膚的不均勻色素沉著。
在本文中引用的每一文件都明確地以其整體并入作為參考。
當然，在閱讀本說明書之后，熟練的技術(shù)人員會容易理解對在本文中所提出的實施方案的改變和修改，而且，這樣的改變和修改可在所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)實施。
權(quán)利要求
1.一種整修個體的皮膚的方法，其包括下列步驟a)從皮膚表面除去死的細胞，生成準備好的表面；b)將在成肌細胞營養(yǎng)液中的成肌細胞涂到準備好的皮膚表面。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述成肌細胞是自體的并且是從所述個體的肌肉活檢獲得的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述肌細胞是從非自體的人樣品制備的。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述成肌細胞營養(yǎng)液包括血清、大6硫酸軟骨素和至少一種血管生成因子。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種血管生成因子是VEGF165、TGFB或血管緊張素。
6.權(quán)利要求1的方法，進一步包括在潔凈室中在涂敷成肌細胞之后將溫暖、濕潤的氧循環(huán)到所述皮膚表面的步驟。
7.權(quán)利要求1的方法，其中步驟a)是通過用微粒狀水滾石英卵砂和高級體霜按摩以除去死皮和碎屑然后漂洗而完成的。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述成肌細胞營養(yǎng)液包括從所述個體獲得的血清。
9.權(quán)利要求1的方法，其中以至少0.25億個細胞/ml的濃度涂敷至少5億個成肌細胞。
10.權(quán)利要求2的方法，其中所述成肌細胞是在刺激一塊或多塊所述個體的肌肉后通過穿刺活檢而獲得的。
11.一種用于個體的皮膚增強的成肌細胞懸浮液，其包括來自所述個體的自體人成肌細胞、來自所述個體的血清、血管生成因子和大6硫酸軟骨素。
12.如權(quán)利要求11所述的用于個體的皮膚增強的成肌細胞懸浮液，其進一步包括NGF、胰島素白蛋白和雞胚提取物。
13.如權(quán)利要求11所述的用于個體的皮膚增強的成肌細胞懸浮液，其進一步包括胎球蛋白。
14.一種用于個體的皮膚增強的成肌細胞懸浮液，其在乳狀懸浮液中包括成肌細胞、血清和大6硫酸軟骨素，所述乳狀懸浮液適合作為填充皮膚的缺陷并掩蓋皮膚形態(tài)(skin mold)的黏性物來涂敷。
15.如權(quán)利要求14中所述的成肌細胞懸浮液，它進一步包括血管生成因子。
16.一種用于個體的皮膚增強的包皮成纖維細胞懸浮液，其在乳狀懸浮液中包括包皮成纖維細胞、血清和大6硫酸軟骨素，所述乳狀懸浮液適合作為填充皮膚的缺陷并掩蓋皮膚形態(tài)的黏性物來涂敷。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于整修皮膚的肌細胞材料和方法。通過去除死細胞準備皮膚表面，并將成肌細胞添加到細胞營養(yǎng)液中。一個實施方案提供了來自將被處理的個體的自體的人成肌細胞、來自所述個體的血清以及用于刺激血管形成的血管生成因子。大6硫酸軟骨素可用于所述成肌細胞的受控的快速細胞融合。也可以單獨地或與成肌細胞組合地使用包皮成纖維細胞的懸浮液。在另一個實施方案中，可以將具有影響外源識別的雙剔除突變的另一動物如豬的非免疫原性細胞添加到細胞表面。
文檔編號A61K31/715GK1700915SQ03819963
公開日2005年11月23日 申請日期2003年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月23日
發(fā)明者彼得·K·羅 申請人:彼得·K·羅