專利名稱：用于保護(hù)、恢復(fù)和增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞、組織和器官的組織保護(hù)性細(xì)胞因子的制作方法
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背景技術(shù)：
多年以來，人們只清楚紅細(xì)胞生成素的生理作用是控制紅細(xì)胞的產(chǎn)生。近年來，一些證據(jù)表明，紅細(xì)胞生成素作為細(xì)胞因子超家族成員，具有通過與紅細(xì)胞生成素受體(紅細(xì)胞生成素-R)相互作用介導(dǎo)的其它重要生理功能。這些作用包括有絲分裂發(fā)生、鈣流入平滑肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)節(jié)、紅細(xì)胞的產(chǎn)生、超活化血小板、凝血細(xì)胞的產(chǎn)生和對(duì)中間代謝的影響。據(jù)信，紅細(xì)胞生成素提供用于改善含氧量低的細(xì)胞微環(huán)境以及調(diào)節(jié)由代謝應(yīng)激引起的程序性細(xì)胞死亡的補(bǔ)償反應(yīng)。雖然研究已確定，顱內(nèi)注射紅細(xì)胞生成素能保護(hù)神經(jīng)元免遭含氧量低的神經(jīng)元傷害，但是，顱內(nèi)給藥對(duì)于治療應(yīng)用、尤其是對(duì)正常個(gè)體來說是不切實(shí)際的，也是不可接受的給藥途徑。此外，以前對(duì)貧血患者給予紅細(xì)胞生成素的研究已有結(jié)論，即外周給予紅細(xì)胞生成素不會(huì)輸送到腦部(Marti等，1997，Kidney Int.51416-8；Juul等，1999，Pediatr.Res.46543-547；Buemi等，2000，Nephrol.Dial.Transplant.15422-433)。
已經(jīng)描述了具有針對(duì)改進(jìn)所述分子紅細(xì)胞生成活性的活性的紅細(xì)胞生成素的各種修飾形式，例如在其羧基端具有改變的氨基酸的修飾形式，描述于美國(guó)專利5,457,089和美國(guó)專利4,835,260；每個(gè)分子中具有不同數(shù)目的唾液酸殘基的紅細(xì)胞生成素同種型，例如描述于美國(guó)專利5,856,298；多肽，描述于美國(guó)專利4,703,008；激動(dòng)劑，描述于美國(guó)專利5,767,078；與紅細(xì)胞生成素受體結(jié)合的肽，描述于美國(guó)專利5,773,569和5,830,851；和小分子模擬物，描述于美國(guó)專利5,835,382。
本發(fā)明涉及由紅細(xì)胞生成素化學(xué)修飾所產(chǎn)生的組織保護(hù)性細(xì)胞因子及其它們?cè)谠缓碗x體保護(hù)、維持、增強(qiáng)或恢復(fù)紅細(xì)胞生成素-效應(yīng)細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞、組織和器官中的用途，以及為了保護(hù)和增強(qiáng)離開血管系統(tǒng)的紅細(xì)胞生成素-效應(yīng)細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞、組織和器官的目的而遞送組織保護(hù)性細(xì)胞因子穿越內(nèi)皮細(xì)胞屏障或者攜帶相關(guān)分子穿越內(nèi)皮細(xì)胞屏障的用途。
發(fā)明概述在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及組織保護(hù)性細(xì)胞因子即缺乏紅細(xì)胞生成素對(duì)骨髓的一方面或多方面影響的化學(xué)修飾紅細(xì)胞生成素的如下用途用于保護(hù)、維持、增強(qiáng)或恢復(fù)哺乳動(dòng)物效應(yīng)細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞、組織和器官的功能或活力的藥用組合物的制備。在一個(gè)具體的方面，所述哺乳動(dòng)物效應(yīng)細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞、組織或器官因?yàn)榫o密的內(nèi)皮細(xì)胞屏障而離開血管系統(tǒng)。在另一個(gè)具體的方面，所述細(xì)胞、組織、器官或其它機(jī)體部分是從哺乳動(dòng)物體內(nèi)分離的，例如預(yù)期用于移植或再附著的部分。作為非限制性實(shí)例，所述效應(yīng)細(xì)胞或組織可以是神經(jīng)元細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、肌細(xì)胞、心細(xì)胞、肺細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、小腸細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、骨細(xì)胞、皮膚細(xì)胞或子宮內(nèi)膜細(xì)胞或組織。此外，效應(yīng)細(xì)胞的非限制性實(shí)例包括感光細(xì)胞(桿細(xì)胞和錐細(xì)胞)、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞、米勒(Müeller)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、起搏細(xì)胞、竇房結(jié)細(xì)胞、竇房結(jié)細(xì)胞、竇結(jié)細(xì)胞、結(jié)合組織細(xì)胞、房室結(jié)細(xì)胞、房室束細(xì)胞、肝細(xì)胞、星形細(xì)胞、肝巨噬細(xì)胞、系膜細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞、管狀腸細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、腸腺細(xì)胞(crypt)、腸細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、腎小球細(xì)胞、束狀細(xì)胞(fasciculate)、網(wǎng)狀細(xì)胞、嗜鉻細(xì)胞、外膜細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、滋養(yǎng)細(xì)胞、精細(xì)胞、成熟濾泡細(xì)胞(Graffian follicles)、原始濾泡細(xì)胞、胰島、α-細(xì)胞、β-細(xì)胞、γ-細(xì)胞、F-細(xì)胞、骨原細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞、干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞的這些實(shí)例僅僅是說明性的。在一個(gè)方面，所述效應(yīng)細(xì)胞或其相關(guān)細(xì)胞、組織或器官既不是可興奮細(xì)胞、組織或器官，占優(yōu)勢(shì)的也不包含可興奮細(xì)胞或組織。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用了上述組織保護(hù)性細(xì)胞因子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞、組織或器官是在至少一種不利于所述細(xì)胞、組織或器官的活力的條件下已經(jīng)度過或即將度過一段時(shí)間的細(xì)胞。所述條件包括創(chuàng)傷性原位低氧或代謝功能障礙、手術(shù)誘導(dǎo)的原位低氧或代謝功能障礙或原位毒素暴露；后者可能與化療或放療有關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述不利條件是例如用于某些外科手術(shù)的心肺分流術(shù)(心肺機(jī))的結(jié)果。
本文的組織保護(hù)性細(xì)胞因子可用于以下人類疾病的治療性治療和預(yù)防性治療主要具有神經(jīng)病學(xué)癥狀或精神病學(xué)癥狀的CNS疾病或周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病、以及眼病、心血管疾病、心肺疾病、呼吸道疾病、腎病、尿道疾病和生殖道疾病、胃腸道疾病和內(nèi)分泌異常和代謝異常和炎癥。
本發(fā)明也涉及包含給予哺乳動(dòng)物、最好是人類的特定的組織保護(hù)性細(xì)胞因子的藥用組合物。所述藥用組合物可配制成供口服、鼻內(nèi)或胃腸外給藥用，或者以用于維持離體細(xì)胞、組織或器官活力的灌注液形式。
用于前述目的的組織保護(hù)性細(xì)胞因子和藥用組合物包括與天然紅細(xì)胞生成素、最好與天然人紅細(xì)胞生成素相比至少被一個(gè)修飾所改變的紅細(xì)胞生成素。所述至少一個(gè)修飾可以是紅細(xì)胞生成素分子上至少一個(gè)氨基酸的改變，或者是紅細(xì)胞生成素分子上至少一個(gè)糖的改變。當(dāng)然，用于本文的目的的組織保護(hù)性細(xì)胞因子分子與天然分子相比，可以有多個(gè)修飾，例如所述分子氨基酸部分的多個(gè)修飾、所述分子糖部分的多個(gè)修飾、或所述分子氨基酸部分的至少一個(gè)修飾、所述分子糖部分的至少一個(gè)修飾。組織保護(hù)性細(xì)胞因子分子雖然保留其保護(hù)、維持、增強(qiáng)或恢復(fù)哺乳動(dòng)物效應(yīng)細(xì)胞的功能或活力的能力，但是，與天然紅細(xì)胞生成素相比，所述紅細(xì)胞生成素與前述所需特性無(wú)關(guān)的一個(gè)或多個(gè)特性可以喪失。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，組織保護(hù)性細(xì)胞因子缺乏紅細(xì)胞生成素對(duì)骨髓的作用，即增加血細(xì)胞比容(紅細(xì)胞發(fā)生)、血管收縮(高血壓)、增加血壓、超活化血小板、促凝血活性和增加凝血細(xì)胞的產(chǎn)生。更優(yōu)選組織保護(hù)性細(xì)胞因子缺乏紅細(xì)胞發(fā)生作用；最優(yōu)選組織保護(hù)性細(xì)胞因子缺乏紅細(xì)胞生成素對(duì)骨髓的所有作用。
作為實(shí)例，本發(fā)明的組織保護(hù)性細(xì)胞因子可以是脫唾液酸紅細(xì)胞生成素。在另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的組織保護(hù)性細(xì)胞因子可以是紅細(xì)胞生成素或脫唾液酸紅細(xì)胞生成素，所述紅細(xì)胞生成素或脫唾液酸紅細(xì)胞生成素已與一種或多種修飾天然紅細(xì)胞生成素或脫唾液酸紅細(xì)胞生成素的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基的試劑反應(yīng)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，組織保護(hù)性細(xì)胞因子是非紅細(xì)胞生成的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是沒有唾液酸部分的紅細(xì)胞生成素。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是脫唾液酸紅細(xì)胞生成素，最優(yōu)選人脫唾液酸紅細(xì)胞生成素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子具有1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12或13個(gè)唾液酸部分。這樣的部分脫唾液酸的紅細(xì)胞生成素在本文中稱為低唾液酸紅細(xì)胞生成素(hyposialoerythropoietin)。它們可以通過天然紅細(xì)胞生成素的化學(xué)修飾或酶促修飾來制備，或者可以通過在紅細(xì)胞生成素不完全唾液酸化或只部分唾液酸化的系統(tǒng)中表達(dá)而得到。無(wú)論采用什么方法制備的脫唾液酸紅細(xì)胞生成素和低唾液酸紅細(xì)胞生成素，都包括在本發(fā)明中。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子包含紅細(xì)胞生成素分子的至少一個(gè)或多個(gè)修飾賴氨酸殘基或N端氨基的修飾，所述修飾是由賴氨酸的ε氨基或N端氨基與一種或多種氨基修飾試劑反應(yīng)而來。還可以用化學(xué)方法還原修飾的賴氨酸殘基或修飾的N端氨基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素在一個(gè)或多個(gè)賴氨酸基團(tuán)或在N端上被生物素化、氨甲酰化、琥珀?；蛞阴；?。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，賴氨酸與醛或還原糖反應(yīng)，形成亞胺，隨后任選通過化學(xué)還原(例如通過采用氰基硼氫鈉)形成N-烷基化賴氨酸殘基例如葡萄糖醇基賴氨酸而穩(wěn)定，或者在還原糖的情況下可以通過Amadori或Heyns重排形成α-脫氧-α-氨基糖(例如α-脫氧-α-果糖基賴氨酸)而穩(wěn)定。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，賴氨酸或N端氨基例如通過與氰酸根離子反應(yīng)而被氨甲酰化，通過分別與烷基-異氰酸鹽、芳基-異氰酸鹽或芳基異硫氰酸鹽反應(yīng)而被烷基-氨甲?；?、芳基-氨甲?；蚍蓟?硫代氨甲?；蛘呖梢岳缤ㄟ^與乙酸酐、琥珀酸酐或鄰苯二甲酸酐反應(yīng)被活性烷基羧酸或芳基羧酸衍生物所?；Ｖ辽僖粋€(gè)賴氨酸基團(tuán)或N端氨基也可以通過與三硝基苯磺酸、或者最好與其鹽反應(yīng)而被三硝基苯基修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，賴氨酸殘基可以通過與乙二醛反應(yīng)(例如與乙二醛、甲基乙二醛或3-脫氧葡糖醛酮反應(yīng))形成相應(yīng)的α-羧基烷基衍生物而被修飾。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，組織保護(hù)性細(xì)胞因子可以通過使用親電子試劑、通過修飾紅細(xì)胞生成素的至少一個(gè)酪氨酸殘基而產(chǎn)生，所述修飾例如但不限于被硝化或碘化所修飾，以修飾一個(gè)芳環(huán)位置。
如上所述，用于本文目的的組織保護(hù)劑可具有至少一個(gè)上述修飾，但也可以具有一個(gè)以上的上述修飾。作為在其分子的氨基酸部分具有一個(gè)修飾并且任選在其分子的糖部分具有修飾的組織保護(hù)性細(xì)胞因子的實(shí)例，組織保護(hù)性細(xì)胞因子是氨甲酰紅細(xì)胞生成素、氨甲酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素、氨甲酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素、乙酰紅細(xì)胞生成素、乙酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素、乙酰次脫唾液酸紅細(xì)胞生成素、琥珀酰紅細(xì)胞生成素、琥珀酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素、琥珀酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素、生物素紅細(xì)胞生成素、生物素脫唾液酸紅細(xì)胞生成素、生物素低唾液酸紅細(xì)胞生成素、碘紅細(xì)胞生成素、碘脫唾液酸紅細(xì)胞生成素、碘低唾液酸紅細(xì)胞生成素、N-ε-羧甲基紅細(xì)胞生成素、N-ε-羧甲基紅細(xì)胞生成素、N-ε-羧甲基低唾液酸紅細(xì)胞生成素和葡萄糖醇基紅細(xì)胞生成素、葡萄糖醇基脫唾液酸紅細(xì)胞生成素、葡萄糖醇基脫唾液酸次紅細(xì)胞生成素。這些化合物僅僅是本發(fā)明的修飾紅細(xì)胞生成素的實(shí)例。上述俗名僅僅是天然紅細(xì)胞生成素分子修飾的代表，而且如上文所述，氨基的修飾可以是在一個(gè)或多個(gè)賴氨酸殘基的ε氨基上或N端氨基上的修飾，或者，在硝基修飾的或碘代修飾的紅細(xì)胞生成素的情況下是在一個(gè)或多個(gè)酪氨酸殘基上的修飾。上述任何組合都包括在本文中。本發(fā)明也包括組合物，所述組合物包括藥用組合物，所述藥用組合物包含一種或多種上述的組織保護(hù)性細(xì)胞因子。所述組合物的任一種也包括天然紅細(xì)胞生成素。
在本發(fā)明的另一方面，提供用于保護(hù)、維持、增強(qiáng)或恢復(fù)哺乳動(dòng)物效應(yīng)細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞、組織和器官的功能或活力的方法，即給予有效量的一種或多種上述組織保護(hù)性細(xì)胞因子。在該方法的一個(gè)具體的方面，哺乳動(dòng)物效應(yīng)細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞、組織或器官因?yàn)榫o密的內(nèi)皮細(xì)胞屏障而離開血管系統(tǒng)。在另一個(gè)具體的方面，細(xì)胞、組織、器官或其它機(jī)體部分是從哺乳動(dòng)物體內(nèi)分離的，例如預(yù)期用于移植或再附著的部分。作為非限制性實(shí)例，效應(yīng)細(xì)胞或組織可以是神經(jīng)元細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、肌細(xì)胞、心細(xì)胞、肺細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、小腸細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、骨細(xì)胞或子宮內(nèi)膜細(xì)胞或組織。效應(yīng)細(xì)胞的這些實(shí)例僅僅是說明性的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述效應(yīng)細(xì)胞或其相關(guān)細(xì)胞、組織或器官既不是可興奮細(xì)胞、組織或器官，占優(yōu)勢(shì)的也不包含可興奮細(xì)胞或組織。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，給予上述組織保護(hù)性細(xì)胞因子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞、組織或器官在至少一種不利于所述細(xì)胞、組織或器官的活力的條件下已經(jīng)度過或即將度過一段時(shí)間。所述條件可包括創(chuàng)傷性原位低氧或代謝功能障礙、手術(shù)誘導(dǎo)的原位低氧或代謝功能障礙或原位毒素暴露；后者可能與化療或放療有關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明防止由心肺分流術(shù)產(chǎn)生的不利條件。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，任何上述組織保護(hù)性細(xì)胞因子都可為了保護(hù)、維持、增強(qiáng)或恢復(fù)哺乳動(dòng)物效應(yīng)細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞、組織和器官的功能或活力的目的，而用于細(xì)胞、組織和器官的離體處理的藥用組合物的制備。所述離體處理可用于例如供移植用的細(xì)胞、組織或器官的保存，不管是自體移植還是異體移植。所述細(xì)胞、組織或器官可以浸在包含組織保護(hù)性細(xì)胞因子的溶液中，或者所述灌注液可以通過血管系統(tǒng)或其它方式滴注到所述器官中，在所述細(xì)胞、組織或器官不與供體或受體的血管系統(tǒng)整合期間維持細(xì)胞功能。可以在器官收獲之前，將灌注液給予供體，以及給予收獲的器官和受體。此外，當(dāng)細(xì)胞、組織或器官與個(gè)體血管系統(tǒng)分離并因此必須離體存在一段時(shí)間時(shí)，可以使用任何組織保護(hù)性細(xì)胞因子的上述用途，術(shù)語(yǔ)分離是指限制或鉗制細(xì)胞、組織、器官或機(jī)體部分的血管系統(tǒng)，或通向細(xì)胞、組織、器官或機(jī)體部分的血管系統(tǒng)，例如可以在手術(shù)中、尤其是在心肺分流手術(shù)中進(jìn)行；分流細(xì)胞、組織、器官或機(jī)體部分的血管系統(tǒng)；從哺乳動(dòng)物體內(nèi)取出細(xì)胞、組織、器官或機(jī)體部分，這些可以在異體移植之前或者在自體移植之前或期間進(jìn)行；或者在細(xì)胞、組織、器官或機(jī)體部分的創(chuàng)傷性切斷術(shù)中進(jìn)行。因此，本發(fā)明的該方面涉及用組織保護(hù)性細(xì)胞因子進(jìn)行原位和離體灌注。可以在細(xì)胞、組織或器官保存液中離體提供紅細(xì)胞生成素。對(duì)于任一方面來說，暴露可以通過連續(xù)灌注、脈沖灌注、輸注、浸泡、注射或插管等方式進(jìn)行。
在又一方面，本發(fā)明涉及用于保護(hù)、維持、增強(qiáng)或恢復(fù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞、組織、器官或機(jī)體部分(包含效應(yīng)細(xì)胞或組織)的活力的方法，其中所述細(xì)胞、組織、器官或機(jī)體部分是從哺乳動(dòng)物體內(nèi)分離的。所述方法包括在一段時(shí)間內(nèi)至少將分離的哺乳動(dòng)物細(xì)胞、組織、器官或機(jī)體部分暴露給一定量的上述組織保護(hù)性細(xì)胞因子，以達(dá)到有效地保護(hù)、維持、增強(qiáng)或恢復(fù)上述活力。在非限制性實(shí)例中，分離是指限制或鉗制細(xì)胞、組織、器官或機(jī)體部分的血管系統(tǒng)，或通向細(xì)胞、組織、器官或機(jī)體部分的血管系統(tǒng)，例如可以在手術(shù)中、尤其是在心肺分流手術(shù)中進(jìn)行；分流細(xì)胞、組織、器官或機(jī)體部分的血管系統(tǒng)；從哺乳動(dòng)物體內(nèi)取出細(xì)胞、組織、器官或機(jī)體部分，這些可以在異體移植之前或在自體移植之前或期間進(jìn)行；或者在細(xì)胞、組織、器官或機(jī)體部分的創(chuàng)傷性切斷術(shù)中進(jìn)行。因此，本發(fā)明的該方面涉及用組織保護(hù)性細(xì)胞因子進(jìn)行原位和離體灌注。可以在細(xì)胞、組織或器官保存液中離體提供所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子。對(duì)于任一方面來說，暴露可以通過連續(xù)灌注、脈沖灌注、輸注、浸泡、注射或插管等方式進(jìn)行。
作為非限制性實(shí)例，上述離體效應(yīng)細(xì)胞或組織可以是或者可以包括神經(jīng)元細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、肌細(xì)胞、心細(xì)胞、肺細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、小腸細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、骨細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞或子宮內(nèi)膜細(xì)胞或組織。效應(yīng)細(xì)胞的這些實(shí)例僅僅是說明性的。
所有上述方法和用途最好是用于人類，但也可用于任何哺乳動(dòng)物，例如但不限于陪伴動(dòng)物、馴養(yǎng)動(dòng)物、家畜和動(dòng)物園動(dòng)物。上述藥用組合物的給藥途徑包括口服、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、局部、管腔內(nèi)、吸入或胃腸外給藥，后者包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、粘膜下或皮內(nèi)。對(duì)于離體應(yīng)用來說，最好是灌注液或浸泡液。這包括原位灌注血管結(jié)構(gòu)的分離部分。
在本發(fā)明的再一個(gè)方面，任何上述組織保護(hù)性細(xì)胞因子用于制備供恢復(fù)有功能障礙的細(xì)胞、組織或器官功能用的藥用組合物，在引起功能障礙的疾病或病癥發(fā)作后給藥。作為非限制性實(shí)例，在先前具有腦創(chuàng)傷的動(dòng)物中，給予包含組織保護(hù)性細(xì)胞因子的藥用組合物能恢復(fù)認(rèn)知功能，甚至當(dāng)所述創(chuàng)傷已經(jīng)消退以后很久(例如3天、5天、1周、1月或更長(zhǎng)時(shí)間)給藥時(shí)。
在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述組織保護(hù)性細(xì)胞因子的使用方法，所述方法當(dāng)在引起所述功能障礙的疾病或病癥發(fā)作之后給藥時(shí)，供恢復(fù)有功能障礙的細(xì)胞、組織或器官功能用。作為非限制性實(shí)例，在先前具有腦創(chuàng)傷的動(dòng)物中，包含組織保護(hù)性細(xì)胞因子的藥用組合物的給藥方法能恢復(fù)認(rèn)知功能，甚至當(dāng)所述創(chuàng)傷已經(jīng)消退以后很久(例如3天、5天、1周、1月或更長(zhǎng)時(shí)間)給藥時(shí)。用于所述方法的組織保護(hù)性細(xì)胞因子包括任何具體的上述修飾的紅細(xì)胞生成素。
在本發(fā)明的又一方面，提供用于促進(jìn)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的分子穿越內(nèi)皮細(xì)胞屏障的胞轉(zhuǎn)作用的方法，即通過給予與上述組織保護(hù)性細(xì)胞因子締合的分子的組合物。待轉(zhuǎn)運(yùn)分子和所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子間的締合可以是例如不穩(wěn)定的共價(jià)鍵、穩(wěn)定的共價(jià)鍵或與所述分子結(jié)合位點(diǎn)的非共價(jià)締合。內(nèi)皮細(xì)胞屏障可以是血-腦屏障、血-眼屏障、血-睪屏障、血-卵巢屏障和血-胎屏障。通過本發(fā)明方法轉(zhuǎn)運(yùn)的合適分子包括激素例如生長(zhǎng)激素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(TGFβ2)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3(TGFβ3)、白介素1、白介素2、白介素3和白介素6、AZT、抗腫瘤壞死因子的抗體、抗病毒藥和環(huán)孢菌素等免疫抑制藥。此外，染料或標(biāo)記可以連接到紅細(xì)胞生成素上或本發(fā)明的組織保護(hù)性細(xì)胞因子上，以便為了診斷目的在腦和其它屏障器官內(nèi)顯現(xiàn)細(xì)胞、組織或器官。
本發(fā)明的另一方面提供一種用于促進(jìn)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的分子穿越內(nèi)皮細(xì)胞屏障的胞轉(zhuǎn)作用的組合物，所述組合物包含與上述組織保護(hù)性細(xì)胞因子締合的分子。所述締合可以是例如不穩(wěn)定的共價(jià)鍵、穩(wěn)定的共價(jià)鍵或與所述分子結(jié)合位點(diǎn)的非共價(jià)締合。內(nèi)皮細(xì)胞屏障可以是血-腦屏障、血-眼屏障、血-睪屏障、血-卵巢屏障和血-胎屏障。通過本發(fā)明方法轉(zhuǎn)運(yùn)的合適分子包括激素例如生長(zhǎng)激素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(TGFβ2)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3(TGFβ3)、白介素1、白介素2、白介素3和白介素6、AZT、抗腫瘤壞死因子的抗體、抗病毒藥和環(huán)孢菌素等免疫抑制藥。此外，染料或標(biāo)記可以連接到紅細(xì)胞生成素上或本發(fā)明的組織保護(hù)性細(xì)胞因子上，以便為了診斷目的在腦和其它屏障器官內(nèi)顯現(xiàn)細(xì)胞、組織或器官。
在本發(fā)明的再一方面，任何上述組織保護(hù)性細(xì)胞因子可用于制備促進(jìn)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的分子穿越內(nèi)皮細(xì)胞屏障的胞轉(zhuǎn)作用的藥用組合物。所述締合可以是例如不穩(wěn)定的共價(jià)鍵、穩(wěn)定的共價(jià)鍵或與所述分子結(jié)合位點(diǎn)的非共價(jià)締合。內(nèi)皮細(xì)胞屏障可以是血-腦屏障、血-眼屏障、血-睪屏障、血-卵巢屏障和血-胎屏障。通過本發(fā)明方法轉(zhuǎn)運(yùn)的合適分子包括激素例如生長(zhǎng)激素、抗生素、抗病毒藥、染料、標(biāo)記物和抗癌藥，作為少數(shù)非限制性實(shí)例。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用組合物包含治療有效量的組織保護(hù)性細(xì)胞因子、至少一種抗炎藥和藥學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，所述抗炎藥選自皮質(zhì)類固醇、糖皮質(zhì)激素、類固醇、非甾體抗炎藥、β-激動(dòng)劑、抗膽堿能藥、甲基黃嘌呤、金注射劑、柳氮磺吡啶、青霉胺、抗血管形成藥、氨苯砜、補(bǔ)骨脂素、抗瘧藥、抗病毒藥和抗生素。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含治療有效量的組織保護(hù)性細(xì)胞因子、至少一種抗炎藥和/或至少一種免疫調(diào)節(jié)劑和藥學(xué)上可接受的載體的本發(fā)明藥用組合物，條件是所述抗炎藥或免疫調(diào)節(jié)劑不是αMSH或抗TNF。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，所述抗炎藥或免疫調(diào)節(jié)劑不是抗體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供基本由治療有效量的組織保護(hù)性細(xì)胞因子組成并且包含至少一種抗炎藥和/或至少一種免疫調(diào)節(jié)劑和藥學(xué)上可接受的載體的本發(fā)明藥用組合物。
本發(fā)明提供包含治療有效量的組織保護(hù)性細(xì)胞因子、至少一種免疫調(diào)節(jié)劑和藥學(xué)上可接受的載體的藥用組合物。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，所述抗炎藥選自甲氨蝶呤、來氟米特、環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺制劑、Immuran、環(huán)孢菌素A、二甲胺四環(huán)素、硫唑嘌呤、抗生素、甲潑尼龍、皮質(zhì)類固醇、類固醇、麥考酚酸嗎乙酯、雷帕霉素、咪唑立賓、脫氧精胍菌素、布喹那、丙二腈酰胺(malononitriloaminde)、T細(xì)胞受體調(diào)節(jié)劑和細(xì)胞因子受體調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明也提供一種上述的藥用組合物，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子選自i)缺乏唾液酸部分的紅細(xì)胞生成素；ii)缺乏N聯(lián)糖或缺乏O聯(lián)糖的紅細(xì)胞生成素；iii)通過用至少一種糖苷酶處理天然紅細(xì)胞生成素而具有降低糖含量的紅細(xì)胞生成素；iv)具有至少一個(gè)或多個(gè)氧化糖的紅細(xì)胞生成素；v)包含至少一個(gè)或多個(gè)經(jīng)化學(xué)還原的氧化糖的紅細(xì)胞生成素；vi)包含至少一個(gè)或多個(gè)修飾精氨酸殘基的紅細(xì)胞生成素；vii)包含至少一個(gè)或多個(gè)修飾賴氨酸殘基或該紅細(xì)胞生成素分子的一個(gè)N端氨基修飾的紅細(xì)胞生成素；viii)包含至少一個(gè)修飾酪氨酸殘基的紅細(xì)胞生成素；ix)包含至少一個(gè)修飾天冬氨酸或一個(gè)谷氨酸殘基的紅細(xì)胞生成素；x)包含至少一個(gè)修飾色氨酸殘基的紅細(xì)胞生成素；xi)至少去除一個(gè)氨基的紅細(xì)胞生成素；xii)在紅細(xì)胞生成素分子內(nèi)包含至少一個(gè)胱氨酸鍵的至少一個(gè)口的紅細(xì)胞生成素；和xiii)截短的紅細(xì)胞生成素。
在一個(gè)實(shí)施方案中，一種用于治療包含效應(yīng)細(xì)胞、組織和/或器官的哺乳動(dòng)物的炎癥的方法，所述方法包括給予哺乳動(dòng)物一種包含治療有效量的組織保護(hù)性細(xì)胞因子和藥學(xué)上可接受的載體的藥用組合物。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子缺乏選自以下的至少一種活性增加血細(xì)胞比容、血管收縮、超活化血小板、促凝血活性和增加凝血細(xì)胞的產(chǎn)生。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種用于治療包含效應(yīng)細(xì)胞、組織和/或器官的哺乳動(dòng)物的炎癥的方法，所述方法包括給予有需要的哺乳動(dòng)物一種包含預(yù)防有效量或治療有效量的組織保護(hù)性細(xì)胞因子和藥學(xué)上可接受的載體的藥用組合物，并且給予所述哺乳動(dòng)物預(yù)防有效量或治療有效量的一種或多種抗炎藥或免疫調(diào)節(jié)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗炎藥選自皮質(zhì)類固醇、糖皮質(zhì)激素、類固醇、非甾體抗炎藥、β-激動(dòng)劑、抗膽堿能藥、甲基黃嘌呤、金注射劑、柳氮磺吡啶、青霉胺、抗血管形成藥、氨苯砜、補(bǔ)骨脂素、抗瘧藥、抗病毒藥和抗生素。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于治療包含效應(yīng)細(xì)胞、組織和/或器官的哺乳動(dòng)物的炎癥的方法，所述方法包括給予有需要的哺乳動(dòng)物一種包含預(yù)防有效量或治療有效量的組織保護(hù)性細(xì)胞因子和藥學(xué)上可接受的載體的藥用組合物，并且給予所述哺乳動(dòng)物預(yù)防有效量或治療有效量的一種或多種抗炎藥或免疫調(diào)節(jié)劑，條件是所述抗炎藥或免疫調(diào)節(jié)劑不是αMSH或抗TNF。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，所述抗炎藥或免疫調(diào)節(jié)劑不是抗體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫調(diào)節(jié)劑選自蛋白質(zhì)藥物、肽模擬物、抗體、核酸分子、小分子、有機(jī)化合物、無(wú)機(jī)化合物、甲氨蝶呤、來氟米特、環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺制劑、Immuran、環(huán)孢菌素A、二甲胺四環(huán)素、硫唑嘌呤、抗生素、甲潑尼龍(MP)、皮質(zhì)類固醇、類固醇、麥考酚酸嗎乙酯、雷帕霉素、咪唑立賓、脫氧精胍菌素、布喹那、丙二腈酰胺、T細(xì)胞受體調(diào)節(jié)劑和細(xì)胞因子受體調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明提供一種上述方法，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是i)缺乏唾液酸部分的紅細(xì)胞生成素；ii)缺乏N聯(lián)糖或缺乏O聯(lián)糖的紅細(xì)胞生成素；iii)通過用至少一種糖苷酶處理天然紅細(xì)胞生成素而具有降低糖含量的紅細(xì)胞生成素；iv)具有至少一個(gè)或多個(gè)氧化糖的紅細(xì)胞生成素；v)包含至少一個(gè)或多個(gè)經(jīng)化學(xué)還原的氧化糖的紅細(xì)胞生成素；vi)包含至少一個(gè)或多個(gè)修飾精氨酸殘基的紅細(xì)胞生成素；vii)包含至少一個(gè)或多個(gè)修飾賴氨酸殘基或該紅細(xì)胞生成素分子的一個(gè)N端氨基修飾的紅細(xì)胞生成素；viii)包含至少一個(gè)修飾酪氨酸殘基的紅細(xì)胞生成素；ix)包含至少一個(gè)修飾天冬氨酸或一個(gè)谷氨酸殘基的紅細(xì)胞生成素；x)包含至少一個(gè)修飾色氨酸殘基的紅細(xì)胞生成素；xi)至少去除一個(gè)氨基的紅細(xì)胞生成素；xii)在紅細(xì)胞生成素分子內(nèi)包含至少一個(gè)胱氨酸鍵的至少一個(gè)口的紅細(xì)胞生成素；和xiii)截短的紅細(xì)胞生成素。
在一個(gè)實(shí)施方案中，上述組合物和方法的組織保護(hù)性細(xì)胞因子是脫唾液酸紅細(xì)胞生成素或苯基乙二醛-紅細(xì)胞生成素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子能夠穿越內(nèi)皮細(xì)胞屏障。所述內(nèi)皮細(xì)胞屏障可選自血-腦屏障、血-眼屏障、血-睪屏障、血-卵巢屏障和血-子宮屏障。
在一個(gè)實(shí)施方案中，作為本發(fā)明藥用組合物和方法的目標(biāo)的哺乳動(dòng)物的效應(yīng)細(xì)胞、組織和/或器官選自神經(jīng)元細(xì)胞、肌細(xì)胞、心細(xì)胞、肺細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、小腸細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞、毛細(xì)血管細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞和干細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物效應(yīng)細(xì)胞還包括選自以下的細(xì)胞感光細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞、米勒細(xì)胞、心肌細(xì)胞、起搏細(xì)胞、竇房結(jié)細(xì)胞、竇房結(jié)細(xì)胞、竇結(jié)細(xì)胞、房室結(jié)細(xì)胞、房室束細(xì)胞、肝細(xì)胞、星形細(xì)胞、肝巨噬細(xì)胞、系膜細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、腸腺細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、腎小球細(xì)胞、束狀細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、嗜鉻細(xì)胞、外膜細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、滋養(yǎng)細(xì)胞、精細(xì)胞、成熟濾泡細(xì)胞、原始濾泡細(xì)胞、子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和子宮內(nèi)膜細(xì)胞。
本發(fā)明也提供一種用于治療哺乳動(dòng)物的炎癥的上述藥用組合物和方法，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是脫唾液酸紅細(xì)胞生成素。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述脫唾液酸紅細(xì)胞生成素是人脫唾液酸紅細(xì)胞生成素。所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子最好是不含N聯(lián)糖的紅細(xì)胞生成素。所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子最好是不含O聯(lián)糖的紅細(xì)胞生成素。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是用至少一種糖苷酶處理的紅細(xì)胞生成素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是高碘酸鹽氧化的紅細(xì)胞生成素。所述高碘酸鹽氧化的紅細(xì)胞生成素最好是被氰基硼氫鈉化學(xué)還原。在一個(gè)實(shí)施方案中，組織保護(hù)性細(xì)胞因子是在一個(gè)或多個(gè)精氨酸殘基上包含R-乙二醛部分的紅細(xì)胞生成素，其中R為芳基或烷基部分。所述紅細(xì)胞生成素最好是苯基乙二醛紅細(xì)胞生成素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是其中至少一個(gè)精氨酸殘基通過與選自2，3-丁二酮和環(huán)己二酮的連二酮反應(yīng)而被修飾的紅細(xì)胞生成素。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組織保護(hù)性細(xì)胞因子是其中至少一個(gè)精氨酸殘基與3-脫氧葡糖醛酮反應(yīng)的紅細(xì)胞生成素。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是包含至少一個(gè)生物素化賴氨酸或N端氨基的紅細(xì)胞生成素分子。所述紅細(xì)胞生成素分子可以是生物素化紅細(xì)胞生成素。
本發(fā)明也提供一種用于治療哺乳動(dòng)物的炎癥的藥用組合物和方法，所述組合物包含組織保護(hù)性細(xì)胞因子，所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是葡萄糖醇基賴氨酸紅細(xì)胞生成素或果糖基賴氨酸紅細(xì)胞生成素。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明藥用組合物和方法的組織保護(hù)性細(xì)胞因子是具有至少一個(gè)氨甲酰化賴氨酸殘基的紅細(xì)胞生成素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述氨甲?；t細(xì)胞生成素選自α-N-氨甲酰紅細(xì)胞生成素；N-ε-氨甲酰紅細(xì)胞生成素；α-N-氨甲酰，N-ε-氨甲酰紅細(xì)胞生成素；α-N-氨甲酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；N-ε-氨甲酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；α-N-氨甲酰，N-ε-氨甲酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；α-N-氨甲酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素；N-ε-氨甲酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素；和α-N-氨甲酰，N-ε-氨甲酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明藥用組合物和方法的組織保護(hù)性細(xì)胞因子是其中至少一個(gè)賴氨酸殘基被?；募t細(xì)胞生成素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述紅細(xì)胞生成素的一個(gè)賴氨酸殘基被乙酰化。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述乙?；t細(xì)胞生成素選自α-N-乙酰紅細(xì)胞生成素；N-ε-乙酰紅細(xì)胞生成素；α-N-乙酰，N-ε-乙酰紅細(xì)胞生成素；α-N-乙酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；N-ε-乙酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；α-N-乙酰，N-ε-乙酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；α-N-乙酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素；N-ε-乙酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素；和α-N-乙酰，N-ε-乙酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明藥用組合物和方法的組織保護(hù)性細(xì)胞因子是包含一個(gè)琥珀?；嚢彼釟埢募t細(xì)胞生成素。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述紅細(xì)胞生成素選自α-N-琥珀酰紅細(xì)胞生成素；N-ε-琥珀酰紅細(xì)胞生成素；α-N-琥珀酰，N-ε-琥珀酰紅細(xì)胞生成素；α-N-琥珀酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；N-ε-琥珀酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；α-N-琥珀酰，N-ε-琥珀酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；α-N-琥珀酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素；N-ε-琥珀酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素；和α-N-琥珀酰，N-ε-琥珀酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明藥用組合物和方法的組織保護(hù)性細(xì)胞因子是至少一個(gè)賴氨酸殘基被2，4，6-三硝基苯磺酸鹽修飾的紅細(xì)胞生成素。在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述鹽是2，4，6-三硝基苯磺酸鈉。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明藥用組合物和方法的組織保護(hù)性細(xì)胞因子是其中至少一個(gè)酪氨酸殘基被硝化和/或碘化的紅細(xì)胞生成素。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明藥用組合物和方法的組織保護(hù)性細(xì)胞因子是其中天冬氨酸殘基和/或谷氨酸殘基與碳二亞胺反應(yīng)后再與胺反應(yīng)的紅細(xì)胞生成素。在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述胺是甘氨酰胺。
在一個(gè)實(shí)施方案中，上述本發(fā)明的藥用組合物和方法的組織保護(hù)性細(xì)胞因子用于治療疾病或創(chuàng)傷引起的炎癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述創(chuàng)傷選自脈管炎、慢性支氣管炎、胰腺炎、骨髓炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎小球性腎炎、視神經(jīng)炎、顳動(dòng)脈炎、腦炎、腦膜炎、橫貫性脊髓炎、皮肌炎、多肌炎、壞死性筋膜炎、肝炎和壞死性小腸結(jié)腸炎。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明藥用組合物和方法的組織保護(hù)性細(xì)胞因子抑制由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子引起的炎癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述炎癥由細(xì)胞凋亡觸發(fā)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，組織保護(hù)性細(xì)胞因子可用于制備藥用組合物，所述組合物用于治療包含效應(yīng)細(xì)胞、組織和/或器官的哺乳動(dòng)物的炎癥。根據(jù)某些方面，所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子缺乏至少一種選自以下的活性增加血細(xì)胞比容、血管收縮、超活化血小板、促凝血活性和增加凝血細(xì)胞的產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述炎癥是由疾病或創(chuàng)傷引起的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述創(chuàng)傷是由以下引起癲癇、多發(fā)性硬化、中風(fēng)、低血壓、心搏停止、局部缺血、心肌梗塞、年齡相關(guān)認(rèn)知功能減退、輻射損傷、大腦麻痹、神經(jīng)變性性疾病、早老性癡呆(Alzheimer′s disease)、帕金森病(Parkinson′s disease)、亞急性壞死性腦脊髓病(Leigh disease)、艾滋病性癡呆、記憶力減退、肌萎縮性側(cè)索硬化、醇中毒、心境障礙、焦慮癥、注意力不集中、孤獨(dú)癥、傳染性海綿樣腦病(Creutzfeld-Jakob disease)、腦創(chuàng)傷、脊髓創(chuàng)傷、腦缺血、脊髓缺血、心肺分流術(shù)、慢性心力衰竭、黃斑變性、糖尿病性神經(jīng)病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、青光眼、視網(wǎng)膜缺血或視網(wǎng)膜創(chuàng)傷。
本發(fā)明提供一種組織保護(hù)性細(xì)胞因子在制備用于治療在包含效應(yīng)細(xì)胞、組織和/或器官的哺乳動(dòng)物的炎癥的藥用組合物中的用途，其中所述藥用組合物包含治療有效量的組織保護(hù)性細(xì)胞因子；至少一種抗炎藥或免疫調(diào)節(jié)劑；和藥學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是i)缺乏唾液酸部分的紅細(xì)胞生成素；ii)缺乏N聯(lián)糖或缺乏O聯(lián)糖的紅細(xì)胞生成素；iii)通過用至少一種糖苷酶處理天然紅細(xì)胞生成素而具有降低糖含量的紅細(xì)胞生成素；iv)具有至少一個(gè)或多個(gè)氧化糖的紅細(xì)胞生成素；v)包含至少一個(gè)或多個(gè)經(jīng)化學(xué)還原的氧化糖的紅細(xì)胞生成素；vi)包含至少一個(gè)或多個(gè)修飾精氨酸殘基的紅細(xì)胞生成素；vii)包含至少一個(gè)或多個(gè)修飾賴氨酸殘基或該紅細(xì)胞生成素分子的一個(gè)N端氨基修飾的紅細(xì)胞生成素；viii)包含至少一個(gè)修飾酪氨酸殘基的紅細(xì)胞生成素；ix)包含至少一個(gè)修飾天冬氨酸或一個(gè)谷氨酸殘基的紅細(xì)胞生成素；x)包含至少一個(gè)修飾色氨酸殘基的紅細(xì)胞生成素；xi)至少去除一個(gè)氨基的紅細(xì)胞生成素；xii)在紅細(xì)胞生成素分子內(nèi)包含至少一個(gè)胱氨酸鍵的至少一個(gè)口的紅細(xì)胞生成素；和xiii)截短的紅細(xì)胞生成素。
通過參考如下附圖和詳述將會(huì)更好地理解本發(fā)明的這些方面和其它方面。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示在用抗紅細(xì)胞生成素抗體染色的薄切片中，紅細(xì)胞生成素受體在正常人腦中的分布。
圖2是圖1的更高放大倍數(shù)的圖像。
圖3顯示使用金標(biāo)記的第二抗體，紅細(xì)胞生成素受體的超顯微分布。
圖4，按類似圖3的方法制備，顯示人腦毛細(xì)血管管腔表面和反面的高密度紅細(xì)胞生成素受體。
圖5比較紅細(xì)胞生成素和脫唾液酸紅細(xì)胞生成素對(duì)血清饑餓的P19細(xì)胞活力的體外功效。
圖6是比較紅細(xì)胞生成素和脫唾液酸紅細(xì)胞生成素對(duì)血清饑餓的P19細(xì)胞活力的體外功效的另一個(gè)實(shí)驗(yàn)。
圖7顯示紅細(xì)胞生成素和脫唾液酸紅細(xì)胞生成素在大鼠局灶性腦缺血模型中的保護(hù)作用。
圖8顯示比較人紅細(xì)胞生成素和人脫唾液酸紅細(xì)胞生成素在局部缺血性中風(fēng)模型的中腦動(dòng)脈閉塞中的功效的劑量反應(yīng)。
圖9顯示碘化紅細(xì)胞生成素在P19測(cè)定中的活性。
圖10顯示生物素化紅細(xì)胞生成素和脫唾液酸紅細(xì)胞生成素在P19測(cè)定中的效應(yīng)。
圖11比較紅細(xì)胞生成素和苯基乙二醛修飾的紅細(xì)胞生成素對(duì)血清饑餓的P19細(xì)胞活力的體外功效。
圖12顯示在水中毒測(cè)定中組織保護(hù)性細(xì)胞因子的效應(yīng)。
圖13描述胃腸外給予的紅細(xì)胞生成素向腦脊液中的轉(zhuǎn)運(yùn)。
圖14顯示紅細(xì)胞生成素對(duì)為移植準(zhǔn)備的心臟功能的維護(hù)。
圖15顯示暫時(shí)性血管閉塞后紅細(xì)胞生成素保護(hù)心肌細(xì)胞防止局部缺血性損傷。
圖16A-圖16D描述了紅細(xì)胞生成素在大鼠青光眼模型中的治療效果。
圖17顯示紅細(xì)胞生成素在大鼠青光眼模型中對(duì)視網(wǎng)膜功能的保護(hù)程度。
圖18描述腦創(chuàng)傷后5天開始給予紅細(xì)胞生成素對(duì)由腦創(chuàng)傷引起的認(rèn)知功能的恢復(fù)。
圖19描述腦創(chuàng)傷后30天開始給予紅細(xì)胞生成素對(duì)由腦創(chuàng)傷引起的認(rèn)知功能的恢復(fù)。
圖20描述人脫唾液酸紅細(xì)胞生成素在腦毒性紅藻氨酸模型中的功效。
圖21描述組織保護(hù)性細(xì)胞因子在大鼠脊髓損傷模型中的功效。
圖22顯示組織保護(hù)性細(xì)胞因子在兔脊髓損傷模型中的功效。
圖23A-圖23C顯示蘇木精和伊紅染色的大腦皮層冠狀冠狀切片。
圖24A-圖24C顯示用GFAP抗體染色的鄰近梗塞區(qū)前皮層的冠狀冠狀切片。
圖25A和圖25B顯示用OX-42抗體染色的大腦皮層的冠狀冠狀切片。
圖26A和圖26B顯示用OX-42抗體染色的鄰近梗塞區(qū)的大腦皮層冠狀冠狀切片。
圖27顯示紅細(xì)胞生成素在EAE模型中的抗炎效果。
圖28比較了地塞米松和紅細(xì)胞生成素在EAE模型中的抗炎效果。
圖29A和圖29B顯示紅細(xì)胞生成素抑制與神經(jīng)元死亡相關(guān)的炎癥。
發(fā)明詳述本發(fā)明的方法提供了在各種正常和不利條件下對(duì)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞、組織和器官的局部或全身保護(hù)或增強(qiáng)作用，或者提供對(duì)預(yù)定移植(relocation)到另一哺乳動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞、組織或器官的保護(hù)作用。另外，也提供功能障礙的恢復(fù)或再生。如上所述，紅細(xì)胞生成素穿越緊密的內(nèi)皮細(xì)胞屏障并對(duì)離開血管系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞(以及其它類型的細(xì)胞)發(fā)揮積極作用的能力，提供了預(yù)防以及治療各種病癥和疾病的潛能(否則所述病癥和疾病在包括人在內(nèi)的動(dòng)物中引起明顯的細(xì)胞損害和組織損傷)，而且也使得迄今為止未經(jīng)嘗試的、傳統(tǒng)上認(rèn)為風(fēng)險(xiǎn)大于利益的外科手術(shù)獲得成功。
紅細(xì)胞生成素是糖蛋白激素，在人體內(nèi)的分子量約為34kDa。其成熟蛋白包含165個(gè)氨基酸，而且糖殘基約占分子量的40％。紅細(xì)胞生成素可市售獲得，例如，得自O(shè)rtho Biotech Inc.，Raritan，NJ，商標(biāo)為PROCRIT，以及得自Amgen，Inc.，Thousand Oaks，CA，商標(biāo)為EPOGEN。此外，多種宿主系統(tǒng)可用于重組紅細(xì)胞生成素的表達(dá)和產(chǎn)生，所述系統(tǒng)包括但不限于細(xì)菌細(xì)胞系統(tǒng)、酵母細(xì)胞系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)、植物細(xì)胞系統(tǒng)和包括人細(xì)胞在內(nèi)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。例如，細(xì)菌產(chǎn)生的產(chǎn)物沒有糖基化或唾液酸化的重組紅細(xì)胞生成素可用于產(chǎn)生紅細(xì)胞生成素的非糖基化形式?；蛘撸亟M紅細(xì)胞生成素可以在包括人類細(xì)胞在內(nèi)的其它進(jìn)行糖基化的系統(tǒng)例如植物中產(chǎn)生。用于本發(fā)明實(shí)踐的紅細(xì)胞生成素的形式包括人和其它哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞生成素的天然存在形式、合成形式和重組形式的化學(xué)修飾和/或表達(dá)系統(tǒng)介導(dǎo)的糖基化修飾。
“效應(yīng)細(xì)胞”是指其功能或活力可以通過暴露給紅細(xì)胞生成素而維持、促進(jìn)、增強(qiáng)、再生或以其它任何方式獲益的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。所述細(xì)胞的非限制性實(shí)例包括神經(jīng)元細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、肌細(xì)胞、心細(xì)胞、肺細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、小腸細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、骨細(xì)胞和子宮內(nèi)膜細(xì)胞。具體地講，效應(yīng)細(xì)胞包括但不限于神經(jīng)元細(xì)胞；視網(wǎng)膜細(xì)胞感光細(xì)胞(桿細(xì)胞和錐細(xì)胞)、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞和米勒細(xì)胞；肌細(xì)胞；心細(xì)胞心肌細(xì)胞、起搏細(xì)胞、竇房結(jié)細(xì)胞、竇房結(jié)細(xì)胞、竇結(jié)細(xì)胞和結(jié)合組織細(xì)胞(房室結(jié)和房室束)；肺細(xì)胞；肝細(xì)胞肝細(xì)胞、星形細(xì)胞和肝巨噬細(xì)胞；腎細(xì)胞系膜細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞和管狀腸細(xì)胞；小腸細(xì)胞杯狀細(xì)胞、腸腺細(xì)胞(crypts)和腸內(nèi)分泌細(xì)胞；腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞腎小球細(xì)胞、束狀細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞；腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞嗜鉻細(xì)胞；毛細(xì)血管細(xì)胞外膜細(xì)胞；睪丸細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞、滋養(yǎng)細(xì)胞和精細(xì)胞及其原始細(xì)胞；卵巢細(xì)胞成熟濾泡細(xì)胞和原始濾泡細(xì)胞；子宮內(nèi)膜細(xì)胞子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和子宮內(nèi)膜細(xì)胞；胰腺細(xì)胞胰島、α-細(xì)胞、β-細(xì)胞、γ-細(xì)胞和F-細(xì)胞；皮膚細(xì)胞；骨細(xì)胞骨原細(xì)胞、破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞；以及存在于以上列出的器官中的干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。此外，所述效應(yīng)細(xì)胞和由紅細(xì)胞生成素提供的益處可以擴(kuò)大到為并非直接效應(yīng)的其它細(xì)胞、或含有所述非效應(yīng)細(xì)胞的組織或器官提供間接的保護(hù)或增強(qiáng)作用。這些從作為細(xì)胞、組織或器官的一部分而存在的效應(yīng)細(xì)胞的增強(qiáng)作用而間接獲益的其它細(xì)胞或組織或器官為“相關(guān)”細(xì)胞、組織和器官。因此，組織或器官中存在少量或小比例的效應(yīng)細(xì)胞可提供本文所述的紅細(xì)胞生成素的益處，所述效應(yīng)細(xì)胞例如存在于所述組織中的可興奮組織或神經(jīng)元組織，或產(chǎn)生睪酮的睪丸中的間質(zhì)細(xì)胞。一方面，效應(yīng)細(xì)胞或其相關(guān)細(xì)胞、組織或器官既不是可興奮細(xì)胞、組織或器官，占優(yōu)勢(shì)的也不包含可興奮細(xì)胞或組織。
為了最終益處而引起的有目的的不利條件的持續(xù)時(shí)間和程度，例如高劑量化療和放療、延長(zhǎng)的離體移植存活期和延長(zhǎng)的手術(shù)誘導(dǎo)局部缺血周期，可以通過本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)來克服。然而，本發(fā)明并不限于此，作為本發(fā)明的一方面還包括其中靶效應(yīng)細(xì)胞因?yàn)閮?nèi)皮細(xì)胞屏障和內(nèi)皮緊密連接而離開血管系統(tǒng)的方法或組合物。一般而言，本發(fā)明涉及可從通過暴露給紅細(xì)胞生成素而獲益的任何效應(yīng)細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞、組織和器官。此外，細(xì)胞、組織或器官功能障礙可以在急性不利事件(例如創(chuàng)傷)后通過暴露給紅細(xì)胞生成素而恢復(fù)或再生。
因此，本發(fā)明總的來講涉及紅細(xì)胞生成素在制備用于上述目的的藥用組合物中的用途，其中細(xì)胞功能被維持、促進(jìn)、增強(qiáng)、再生或以任何方式獲益。本發(fā)明也涉及通過給予哺乳動(dòng)物有效量的如本文所述的紅細(xì)胞生成素以維持、增強(qiáng)、促進(jìn)或再生細(xì)胞功能的方法。本發(fā)明還涉及通過將細(xì)胞、組織或器官暴露給紅細(xì)胞生成素以維持、促進(jìn)、增強(qiáng)或再生離體細(xì)胞功能的方法。本發(fā)明也涉及包含紅細(xì)胞生成素的、用于器官或組織保存的灌注液組合物。
本發(fā)明的各種方法使用這樣的種藥用組合物所述組合物至少包括用于具體的暴露途徑和持續(xù)時(shí)間的有效量的紅細(xì)胞生成素，使得對(duì)哺乳動(dòng)物體內(nèi)或來自哺乳動(dòng)物體內(nèi)的效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮積極作用或益處。當(dāng)預(yù)期治療的靶細(xì)胞、組織或器官需要紅細(xì)胞生成素穿越內(nèi)皮細(xì)胞屏障時(shí)，所述藥用組合物包括其濃度在穿越內(nèi)皮細(xì)胞屏障后能對(duì)效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮其所需效應(yīng)的紅細(xì)胞生成素。在本文中能與紅細(xì)胞生成素受體相互作用并調(diào)節(jié)該受體活性的分子是指紅細(xì)胞生成素或紅細(xì)胞生成素受體活性調(diào)節(jié)劑，所述分子用于本發(fā)明。這些分子可以是例如上述紅細(xì)胞生成素分子的天然存在形式、合成形式和重組形式，或者是除了如本文所述調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成素效應(yīng)細(xì)胞活性之外未必可以以任何方式與紅細(xì)胞生成素相似的其它分子。
除了以上鑒定的組織保護(hù)性特征之外，紅細(xì)胞生成素更經(jīng)常與其對(duì)骨髓的效應(yīng)相關(guān)，也就是說，增加血細(xì)胞比容(紅細(xì)胞發(fā)生)、血管收縮(高血壓)、超活化血小板、促凝血活性和增加凝血細(xì)胞的產(chǎn)生。然而，這些對(duì)骨髓的效應(yīng)在慢性和急性給予紅細(xì)胞生成素以治療如上討論的細(xì)胞、組織或器官功能障礙中可能會(huì)帶來一定的風(fēng)險(xiǎn)。因此，本發(fā)明總的來講涉及由優(yōu)選缺乏紅細(xì)胞生成素對(duì)骨髓的一個(gè)或多個(gè)效應(yīng)的化學(xué)修飾紅細(xì)胞生成素組成的組織保護(hù)性細(xì)胞因子的用途。更優(yōu)選所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子缺乏紅細(xì)胞發(fā)生；最優(yōu)選所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子缺乏紅細(xì)胞生成素對(duì)骨髓的所有效應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子缺乏任意兩個(gè)上述效應(yīng)，或任意三個(gè)上述效應(yīng)。
此外，如本文所述用途所需的組織保護(hù)性細(xì)胞因子可以通過如下方法產(chǎn)生胍化(guanidination)、酰胺化、氨甲?；?、三硝基苯基化、乙?；?、琥珀?；?、硝化，或者在其它方法例如有限蛋白酶解、氨基的去除中對(duì)精氨酸、賴氨酸、酪氨酸、色氨酸或半胱氨酸殘基或羧基的修飾，和/或通過分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)紅細(xì)胞生成素的精氨酸、賴氨酸、酪氨酸、色氨酸或半胱氨酸殘基進(jìn)行突變?nèi)〈?。這些化學(xué)修飾最好影響4個(gè)典型特征性受體區(qū)-VLQRY(SEQ ID NO1)、TKVNFYAW(SEQ ID NO2)、SGIRSLTTL(SEQ ID NO3)或SNFLRG(SEQ ID NO4)。更優(yōu)選這些本來是堿性的受體區(qū)通過這些區(qū)內(nèi)堿性氨基酸(精氨酸和賴氨酸)的化學(xué)修飾而被修飾。此外，這些受體區(qū)周圍分子區(qū)域可以被化學(xué)修飾并影響所述分子的動(dòng)力學(xué)特性或受體結(jié)合特性。這產(chǎn)生維持特定器官和組織的適當(dāng)活性水平、但不維持其它器官和組織(例如紅細(xì)胞)活性水平的組織保護(hù)性細(xì)胞因子(例如Satake等；1990，Biochim.Biophys.Acta 1038125-9；所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中)。一個(gè)如下所述的非限制性實(shí)例是通過與諸如苯基乙二醛等的乙二醛反應(yīng)來修飾紅細(xì)胞生成素精氨酸殘基(按照Takahashi，1977，J Biochem.81395-402中的方案)。正如下面將會(huì)看到的，所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子分子完全保留其神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)。所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子分子完全包括在本文所述的各種用途和組合物中。
紅細(xì)胞生成素和紅細(xì)胞生成素樣分子的活性(以單位計(jì))通常根據(jù)其在嚙齒動(dòng)物模型中刺激紅細(xì)胞產(chǎn)生的效力來定義(也作為紅細(xì)胞生成素的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的來源)。通常紅細(xì)胞生成素(MW為～34,000)的一個(gè)單位(U)約為8ng蛋白(1mg蛋白約為125,000U)。然而，因?yàn)閷?duì)紅細(xì)胞發(fā)生的效應(yīng)伴隨著本文所需活性，并且不一定是本發(fā)明的某些組織保護(hù)性細(xì)胞因子的可檢測(cè)特性，所以根據(jù)紅細(xì)胞生成活性來定義本發(fā)明的某些組織保護(hù)性細(xì)胞因子的活性是不適當(dāng)?shù)?。因此，本文所用的紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子的活性單位定義為在神經(jīng)細(xì)胞系統(tǒng)或其它效應(yīng)細(xì)胞系統(tǒng)引起與WHO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞生成素在同一系統(tǒng)中引起的相同活性所需的蛋白量。技術(shù)人員根據(jù)本文的指導(dǎo)將會(huì)容易地確定非紅細(xì)胞發(fā)生的紅細(xì)胞生成素或相關(guān)組織保護(hù)性細(xì)胞因子分子的單位。
除了上述組織保護(hù)性細(xì)胞因子以外，以下討論詳細(xì)描述了本發(fā)明的各種組織保護(hù)性細(xì)胞因子。
本發(fā)明的組織保護(hù)性細(xì)胞因子可由至少?zèng)]有唾液酸部分的紅細(xì)胞生成素組成，稱為脫唾液酸紅細(xì)胞生成素。本發(fā)明的組織保護(hù)性細(xì)胞因子最好是人脫唾液酸紅細(xì)胞生成素。它們可以通過用唾液酸酶將紅細(xì)胞生成素脫唾液酸化而制備，例如由ProZyme Inc.，SanLeandro，California的唾液酸酶A生產(chǎn)商包裝上所描述的方法。通常，PROZYME GLYCOPRO測(cè)序級(jí)唾液酸酶ATM(N-乙酰神經(jīng)氨酸糖基水解酶，EC 3.2.1.18)用于從復(fù)雜糖和糖蛋白例如紅細(xì)胞生成素中切割所有非還原端唾液酸殘基。它也會(huì)切割支化唾液酸(連接內(nèi)部殘基)。唾液酸酶A是從產(chǎn)脲節(jié)桿菌(Arthrobacter ureafaciens)的克隆中分離出來的。
在上述方法的非限制性實(shí)施例中，紅細(xì)胞生成素可用唾液酸酶(0.025U/mg EPO)于37℃處理3小時(shí)進(jìn)行脫唾液酸，然后可以將紅細(xì)胞生成素脫鹽并濃縮。通過使用AKTAPRIMETM系統(tǒng)(AmershamPharmacia Biotech)的離子交換柱后，用所選緩沖液洗脫，選擇用免疫電泳(在IEF凝膠上在pI～8.5和～7.9進(jìn)行電泳)鑒定的只含最上兩個(gè)條帶的流分。在這個(gè)組織保護(hù)性細(xì)胞因子制劑中沒有檢測(cè)到明顯的唾液酸含量。
在替代實(shí)施方案中，本發(fā)明的組織保護(hù)性細(xì)胞因子可以是通過上述方法被部分脫唾液酸化的具有至少1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12或13個(gè)唾液酸殘基的紅細(xì)胞生成素。紅細(xì)胞生成素的部分脫唾液酸化的這些組織保護(hù)性細(xì)胞因子在本文中也可以稱為低唾液酸紅細(xì)胞生成素，并且可以是例如每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子只有2個(gè)唾液酸的均一組合物，或者可以是各種不同程度的唾液酸化的、或者例如每個(gè)紅細(xì)胞生成素上平均具有少數(shù)例如約1個(gè)至約4個(gè)唾液酸分子、或者在另一個(gè)實(shí)例中更多數(shù)目例如每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子上平均有約10個(gè)至13個(gè)唾液酸的不均一混合物。所述混合物可包括脫唾液酸紅細(xì)胞生成素或紅細(xì)胞生成素。
用于上述用途的紅細(xì)胞生成素可具有至少一個(gè)或多個(gè)修飾精氨酸殘基。例如，修飾紅細(xì)胞生成素可以包含在一個(gè)或多個(gè)精氨酸殘基上的R-乙二醛部分，其中R可以是芳基、雜芳基、低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基或環(huán)烷基，或α-脫氧糖醇基。本文所用的術(shù)語(yǔ)低級(jí)“烷基”是指最好含有1-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈飽和脂族烴基。代表性的所述基團(tuán)是甲基、乙基、異丙基、異丁基、丁基、戊基、己基等。術(shù)語(yǔ)“烷氧基”是指通過氧連接所述分子其余部分的上述低級(jí)烷基。烷氧基的實(shí)例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基等。術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”是指3個(gè)至至多約8個(gè)碳的環(huán)烷基，包括例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)己基等。術(shù)語(yǔ)芳基是指苯基和萘基。術(shù)語(yǔ)雜芳基是指含有4-10個(gè)環(huán)原子和1-3個(gè)選自氧、氮和硫的雜原子的雜環(huán)基。實(shí)例包括但不限于異唑基、苯基異唑基、呋喃基、嘧啶基、喹啉基、四氫喹啉基、吡啶基、咪唑基、吡咯烷基、1，2，4-三唑基、噻唑基、噻吩基等。R基團(tuán)可以被取代，例如3-脫氧葡糖醛酮的2，3，4-三羥丁基。R-乙二醛化合物的典型實(shí)例是乙二醛、甲基乙二醛、3-脫氧葡糖醛酮和苯基乙二醛。優(yōu)選的R-乙二醛化合物是甲基乙二醛或苯基乙二醛。使用苯基乙二醛進(jìn)行所述修飾的示例性方法可見于Werber等，1975，Isr.J.Med.Sci.11(11)1169-70。
在另一個(gè)實(shí)例中，最好在約50毫摩爾的硼酸鹽緩沖液中，在pH8-9，可以通過與例如2，3-丁二酮或環(huán)己二酮等連二酮反應(yīng)，修飾至少一個(gè)精氨酸殘基。用2，3-丁二酮的后一個(gè)修飾方法可以按照Riordan，1973，Biochemistry 12(20)3915-3923的方法進(jìn)行；而用環(huán)己酮的方法可以按照Patthy等，1975，J.Biol.Chem 250(2)565-9的方法進(jìn)行。
本發(fā)明的組織保護(hù)性細(xì)胞因子可以包含至少一個(gè)或多個(gè)修飾賴氨酸殘基或該紅細(xì)胞生成素的一個(gè)N端氨基修飾，所述修飾例如來自賴氨酸殘基與氨基改性劑反應(yīng)所得到的修飾。例如，紅細(xì)胞生成素或上述脫唾液酸紅細(xì)胞生成素或低唾液酸紅細(xì)胞生成素可以通過乙?；?、氨甲?；㈢牾；⒀趸碗S后在其它方法中的羧甲基賴氨酸反應(yīng)而被修飾，從而修飾氨基。
在非限制性實(shí)施例中，組織保護(hù)性細(xì)胞因子可以通過紅細(xì)胞生成素的氨甲?；a(chǎn)生，或通過脫唾液酸化紅細(xì)胞生成素例如脫唾液酸紅細(xì)胞生成素與硼酸鹽緩沖液中重結(jié)晶的氰酸鉀而產(chǎn)生，然后徹底透析。
同樣，上述紅細(xì)胞生成素可以通過與琥珀酸酐反應(yīng)而琥珀?；?，接著通過透析，形成本發(fā)明的組織保護(hù)性細(xì)胞因子。
在再一個(gè)實(shí)施方案中，組織保護(hù)性細(xì)胞因子可以通過將紅細(xì)胞生成素與乙酸酐在磷酸緩沖液中反應(yīng)、將紅細(xì)胞生成素乙?；a(chǎn)生。該反應(yīng)可以通過對(duì)水透析而終止。該方法描述于Satake等，(1990).Chemical modification of erythropoietinan increase in in-vitro activityby guanidination(紅細(xì)胞生成素的化學(xué)修飾通過胍化增加體外活性).Biochimica et Biophysica Acta.1038125-129。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是來自紅細(xì)胞生成素或脫唾液酸紅細(xì)胞生成素的Nε-(羧甲基)賴氨酸(CML)加合物，是通過在磷酸鈉緩沖液中與乙醛酸和NaBH3CN反應(yīng)、接著通過透析而制備。Akhtar等，(1999).Conformational study of Nε-(carboxymethyl)lysine adducts of recombinant a-crystallins(重組a-晶體蛋白的Nε-(羧甲基)賴氨酸加合物的構(gòu)象研究).Current Eye Research，18270-276。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，組織保護(hù)性細(xì)胞因子是如下產(chǎn)生的通過與例如乙二醛、甲基乙二醛和3-脫氧葡糖醛酮等乙二醛衍生物反應(yīng)形成α-羧基烷基衍生物而修飾紅細(xì)胞生成素的賴氨酸殘基。實(shí)例包括與乙二醛的反應(yīng)以形成羧甲基賴氨酸殘基，如在Glomb和Monnier，1995，J.Biol.Chem.270(17)10017-26中，或者與甲基乙二醛反應(yīng)以形成(1-羧乙基)賴氨酸殘基，如在Degenhardt等，1998，Cell.Mol.Biol.(Noisy-le-grand)44(7)1139-45中。修飾的賴氨酸殘基還可被化學(xué)還原。例如，紅細(xì)胞生成素可以通過賴氨酸基團(tuán)被生物素化，例如按照實(shí)施例2描述的方法，其中D-生物素酰-ε-氨基己酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯與紅細(xì)胞生成素反應(yīng)，接著按照如下文獻(xiàn)的描述通過在Centricon 10柱上凝膠過濾除去未反應(yīng)的生物素Wojchowski和Caslake，1989，Blood 74(3)952-8。在該文獻(xiàn)中，作者使用了紅細(xì)胞生成素生物素化的3種不同方法，每種方法都可用來制備用于本文用途的組織保護(hù)性細(xì)胞因子。生物素可以加入到(1)唾液酸部分(2)羧基或(3)氨基上。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述賴氨酸可以與醛或還原糖反應(yīng)形成亞胺，所述亞胺可以通過被氰基硼氫鈉還原形成N-烷基化賴氨酸殘基例如葡萄糖醇基賴氨酸而穩(wěn)定，或者在還原糖的情況下可以通過Amadori或Heyns重排以在紅細(xì)胞生成素分子中形成α-脫氧-α-氨基糖例如α-脫氧-α-果糖基賴氨酸殘基而穩(wěn)定。作為實(shí)例，通過與0.5M葡萄糖的磷酸鈉緩沖液(pH7.4)保溫60天，可以制備果糖基賴氨酸修飾的蛋白，該方法描述于Makita等，1992，J.Biol.Chem.2675133-5138。在另一個(gè)實(shí)例中，賴氨酸基團(tuán)可以例如通過與氰酸根離子反應(yīng)而被氨甲?；蛘吲c烷基-異氰酸鹽或芳基-異氰酸鹽、烷基-異硫氰酸鹽或芳基-異硫氰酸鹽反應(yīng)而被烷基-氨甲?；蚍蓟?氨甲?；蛲榛?硫代氨甲?；蚍蓟?硫代氨甲酰化，或者可以通過活性烷基羧酸衍生物或芳基羧酸衍生物而被乙酰化，例如通過與乙酸酐或琥珀酸酐或鄰苯二甲酸酐反應(yīng)。實(shí)例是用4-磺苯基異硫氰酸鹽或乙酸酐修飾賴氨酸基團(tuán)，這兩者都描述于Gao等，1994，Proc Natl AcadSci USA 91(25)12027-30。賴氨酸基團(tuán)也可以通過與三硝基苯磺酸、或者最好與其鹽反應(yīng)而被三硝基苯基修飾。該方法描述于以下實(shí)施例2。
紅細(xì)胞生成素的至少一個(gè)酪氨酸殘基可以通過親電子試劑在芳環(huán)位置內(nèi)被例如硝化或碘化而修飾，產(chǎn)生組織保護(hù)性細(xì)胞因子。作為非限制性實(shí)例，紅細(xì)胞生成素可以與四硝基甲烷反應(yīng)(Nestler等，1985，J.Biol.Chem.260(12)7316-21；或者如實(shí)施例3所述被碘化。例如，可以在磷酸鈉緩沖液中用紅細(xì)胞生成素或脫唾液酸紅細(xì)胞生成素來完成與NaI和IODO-GEN預(yù)先包被的碘化管(Pierce，28601)的碘化反應(yīng)。
紅細(xì)胞生成素的至少一個(gè)天冬氨酸殘基或一個(gè)谷氨酸殘基可以例如通過與碳二亞胺反應(yīng)后再與胺(例如但不限于甘氨酰胺)反應(yīng)而修飾。
在另一個(gè)實(shí)例中，紅細(xì)胞生成素的一個(gè)色氨酸殘基可以例如通過與正溴琥珀酰亞胺或正氯琥珀酰亞胺反應(yīng)、接著通過例如描述于Josse等，Chem Biol Interact 1999 May 14；119-120的方法而修飾。
在再一個(gè)實(shí)例中，組織保護(hù)性細(xì)胞因子可以通過除去天然紅細(xì)胞生成素的至少一個(gè)氨基而制備，這可以通過與茚三酮反應(yīng)后再與硼氫化物反應(yīng)還原隨后產(chǎn)生的羰基而完成。
在又一個(gè)實(shí)例中，提供在紅細(xì)胞生成素分子中至少一個(gè)胱氨酸鍵具有至少一個(gè)口的組織保護(hù)性細(xì)胞因子，其中紅細(xì)胞生成素分子通過與例如二硫蘇糖醇等還原劑反應(yīng)，接著通過隨后產(chǎn)生的巰基與碘乙酰胺、碘乙酸或另一種親電子試劑反應(yīng)，從而阻止二硫鍵重新形成。如上所述，可以通過以下兩種方法之一或兩法聯(lián)用來消除二硫鍵，即改變參與實(shí)際交聯(lián)的半胱氨酸分子、或至少一個(gè)導(dǎo)致紅細(xì)胞生成素不能形成至少一個(gè)天然分子中存在的二硫鍵的其它氨基酸殘基。
可以通過對(duì)紅細(xì)胞生成素進(jìn)行靶向特定殘基的有限化學(xué)蛋白酶解(例如在色氨酸殘基后切割)而制備組織保護(hù)性細(xì)胞因子。所得紅細(xì)胞生成素片斷包括在本文中。
如上所述，用于本文目的的組織保護(hù)性細(xì)胞因子可具有至少一個(gè)上述修飾，但也可具有不止一個(gè)以上修飾。作為實(shí)例的在其分子的糖部分具有一個(gè)修飾和在其氨基部分具有一個(gè)修飾組織保護(hù)性細(xì)胞因子，組織保護(hù)性細(xì)胞因子可以是脫唾液酸紅細(xì)胞生成素并且其賴氨酸殘基被生物素化或氨甲?；?br> 此外，化學(xué)修飾的紅細(xì)胞生成素還可以通過紅細(xì)胞生成素的至少一個(gè)氨基酸突變而被進(jìn)一步修飾。所述突變可包括取代、包括內(nèi)部缺失在內(nèi)的缺失、包括產(chǎn)生融合蛋白的添加在內(nèi)的添加或者在氨基酸序列內(nèi)或其附近的氨基酸殘基的保守取代，但是所述保守取代導(dǎo)致產(chǎn)生功能等同的紅細(xì)胞生成素的“沉默”變化。保守氨基酸取代可以在所涉及的殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性的相似性基礎(chǔ)上進(jìn)行。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；帶正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸；和帶負(fù)電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸?；蛘?，非保守氨基酸的變化以及較大的插入和缺失可用于產(chǎn)生功能改變的紅細(xì)胞生成素。所述突變可用于按所需方式改變紅細(xì)胞生成素的特性。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明實(shí)踐的紅細(xì)胞生成素可以在影響受體結(jié)合的紅細(xì)胞生成素的如下4個(gè)功能域內(nèi)改變一個(gè)或多個(gè)氨基酸VLQRY(SEQ ID NO1)和/或TKVNFYAW(SEQ ID NO2)和/或SGLRSLTTL(SEQ ID NO3)和/或SNFLRG(SEQID NO4)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用在其分子的周圍區(qū)域含有突變并影響分子的動(dòng)力學(xué)或受體結(jié)合特性的紅細(xì)胞生成素。
這些額外的修飾可以用于增強(qiáng)組織保護(hù)性細(xì)胞因子的組織保護(hù)性效應(yīng)、抑制骨髓效應(yīng)或改變物理特性例如電荷。
用于制備本發(fā)明組織保護(hù)性細(xì)胞因子的上述示例性方法僅僅是說明性的和非限制性的，這些方法或其它方法都可用于制備本發(fā)明的化合物。其中所述制備方法中含有的上文中的名稱例如“乙?；被颉吧锼鼗痹诒疚闹袃H僅用作理解所述化合物是如何制備的手段，然而本發(fā)明涉及作為上述反應(yīng)產(chǎn)物的化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解所述化合物是上述反應(yīng)的產(chǎn)物。迄今為止，本發(fā)明的化合物都以非正式名稱或俗名命名以表明本發(fā)明修飾的范圍，而且它們可存在于紅細(xì)胞生成素或修飾紅細(xì)胞生成素分子的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上。作為非限制性實(shí)例，下面的具體化合物是本文所包括的化合物的成員。
1.氨甲?；t細(xì)胞生成素下列化合物表示在紅細(xì)胞生成素分子N端氨基酸上的氨甲酰基部分(“α-N-氨甲酰-”)或在紅細(xì)胞生成素賴氨酰殘基的一個(gè)(或多個(gè))ε氨基上的氨甲?；糠?“N-ε-氨甲酰-”)。當(dāng)然，可以存在含有或不含α-N修飾的多個(gè)N-ε修飾。
i.α-N-氨甲酰紅細(xì)胞生成素；
ii.N-ε-氨甲酰紅細(xì)胞生成素；iii.α-N-氨甲酰，N-ε-氨甲酰紅細(xì)胞生成素；iv.α-N-氨甲酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；v.N-ε-氨甲酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；vi.α-N-氨甲酰，N-ε-氨甲酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；vii.α-N-氨甲酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素；viii.N-ε-氨甲酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素；和ix.α-N-氨甲酰，N-ε-氨甲酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素。
2.琥珀?；t細(xì)胞生成素下列化合物表示在紅細(xì)胞生成素分子N端氨基酸上的琥珀?；糠?“α-N-琥珀酰-”)或在紅細(xì)胞生成素賴氨酰殘基的一個(gè)(或多個(gè))ε氨基上的琥珀酰基部分(“N-ε-琥珀酰-”)。當(dāng)然，可以存在含有或不含α-N-修飾的多個(gè)N-ε修飾。
i.α-N-琥珀酰紅細(xì)胞生成素；ii.N-ε-琥珀酰紅細(xì)胞生成素；iii.α-N-琥珀酰，N-ε-琥珀酰紅細(xì)胞生成素；iv.α-N-琥珀酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；v.N-ε-琥珀酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；vi.α-N-琥珀酰，N-ε-琥珀酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；vii.α-N-琥珀酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素；viii.N-ε-琥珀酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素；和ix.α-N-琥珀酰，N-ε-琥珀酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素。
3.乙?；t細(xì)胞生成素下列化合物表示在紅細(xì)胞生成素分子N端氨基酸上的乙?；糠?“α-N-乙酰-”)或在紅細(xì)胞生成素賴氨酰殘基的一個(gè)(或多個(gè))ε氨基上的乙酰基部分(“N-ε-乙酰-”)。當(dāng)然，可以存在含有或不含α-N-修飾的多個(gè)N-ε修飾。
i.α-N-乙酰紅細(xì)胞生成素；ii.N-ε-乙酰紅細(xì)胞生成素；
iii.α-N-乙酰，N-ε-乙酰紅細(xì)胞生成素；iv.α-N-乙酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；v.N-ε-乙酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；vi.α-N-乙酰，N-ε-乙酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；vii.α-N-乙酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素；viii.N-ε-乙酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素；和ix.α-N-乙酰，N-ε-乙酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素。
4.生物素化紅細(xì)胞生成素下列化合物表示在紅細(xì)胞生成素分子N端氨基酸上的生物素基部分(“α-N-生物素-”)或在紅細(xì)胞生成素賴氨酰殘基的一個(gè)(或多個(gè))ε氨基上的生物素部分(“N-ε-生物素-”)。當(dāng)然，可以存在含有或不含α-N-修飾的多個(gè)N-ε修飾。
i.α-N-生物素紅細(xì)胞生成素；ii.N-ε-生物素紅細(xì)胞生成素；iii.α-N-生物素，N-ε-生物素紅細(xì)胞生成素；iv.α-N-生物素脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；v.N-ε-生物素脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；vi.α-N-生物素，N-ε-生物素脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；vii.α-N-生物素低唾液酸紅細(xì)胞生成素；viii.N-ε-生物素低唾液酸紅細(xì)胞生成素；和ix.α-N-生物素，N-ε-生物素低唾液酸紅細(xì)胞生成素。
5.碘化紅細(xì)胞生成素當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道紅細(xì)胞生成素內(nèi)若干不同的酪氨酸殘基以及酪氨酸殘基的組合可以被碘化，而且下面提供的僅僅是說明性的。
i.碘化紅細(xì)胞生成素；ii.碘化脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；和iii.碘化低唾液酸紅細(xì)胞生成素。
6.羧甲基賴氨酰-紅細(xì)胞生成素下列化合物表示在紅細(xì)胞生成素賴氨酰殘基的一個(gè)(或多個(gè))ε氨基上的羧甲基部分(“N-ε-羧甲基-”)。當(dāng)然，可以存在多個(gè)N-ε-修飾。
i.N-ε-羧甲基紅細(xì)胞生成素；ii.N-ε-羧甲基脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；和iii.N-ε-羧甲基低唾液酸紅細(xì)胞生成素。
各種宿主表達(dá)載體系統(tǒng)可用于產(chǎn)生本發(fā)明的紅細(xì)胞生成素和紅細(xì)胞生成素相關(guān)分子。所述宿主表達(dá)系統(tǒng)代表載體但也可代表細(xì)胞，通過所述載體，目標(biāo)紅細(xì)胞生成素可產(chǎn)生并隨后被純化，所述細(xì)胞當(dāng)用合適核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染時(shí)，可在原位表現(xiàn)出修飾的紅細(xì)胞生成素基因產(chǎn)物。這些包括但不限于細(xì)菌宿主系統(tǒng)、昆蟲宿主系統(tǒng)、植物宿主系統(tǒng)、包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物宿主系統(tǒng)，例如但不限于用含有修飾紅細(xì)胞生成素產(chǎn)物編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用含有紅細(xì)胞生成素相關(guān)分子編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)感染的植物細(xì)胞系統(tǒng)，或用含有紅細(xì)胞生成素相關(guān)分子編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或包含含有來自哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子(例如金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或來自哺乳動(dòng)物病毒啟動(dòng)子(例如腺病毒晚期啟動(dòng)子；痘苗病毒7.5K啟動(dòng)子)的重組表達(dá)構(gòu)建體的包括人細(xì)胞系統(tǒng)在內(nèi)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(例如HT1080、COS、CHO、BHK、293、3T3)。
另外，可以選擇調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)或者按所需特定方式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。蛋白產(chǎn)物的所述修飾(例如糖基化)和加工(例如切割)對(duì)蛋白功能可能是重要的。不同宿主細(xì)胞對(duì)蛋白和基因產(chǎn)物翻譯后加工和修飾具有特征性的特有機(jī)制?？梢赃x擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)，保證表達(dá)的外源蛋白的正確修飾和加工。為此，可使用對(duì)初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的正確加工、基因產(chǎn)物的糖基化和磷酸化的細(xì)胞機(jī)器的真核宿主細(xì)胞。包括人宿主細(xì)胞在內(nèi)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括但不限于HT1080、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3和WI38。
為了長(zhǎng)期、高產(chǎn)地產(chǎn)生重組蛋白，最好是穩(wěn)定地表達(dá)。例如，可以對(duì)穩(wěn)定表達(dá)紅細(xì)胞生成素相關(guān)分子基因產(chǎn)物的細(xì)胞系進(jìn)行工程改造。不使用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，可以用被合適表達(dá)控制元件(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、序列、轉(zhuǎn)錄終止子、聚腺苷酸化位點(diǎn)等)控制的DNA和選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。導(dǎo)入外源DNA后，可以讓工程細(xì)胞在滋養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天，然后轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基中。重組質(zhì)粒中的選擇標(biāo)記賦予對(duì)選擇物的抗性，并且允許細(xì)胞將質(zhì)粒穩(wěn)定整合到其染色體中，讓其生長(zhǎng)以形成轉(zhuǎn)化灶，隨后可以被克隆并擴(kuò)增成細(xì)胞系。該方法可有利地用于將表達(dá)紅細(xì)胞生成素相關(guān)分子基因產(chǎn)物的細(xì)胞系進(jìn)行工程改造。所述工程細(xì)胞系在篩選和評(píng)價(jià)影響紅細(xì)胞生成素相關(guān)分子基因產(chǎn)物的內(nèi)源活性的化合物中特別有用。
或者，可以通過將異源DNA調(diào)節(jié)元件插入到穩(wěn)定細(xì)胞系或克隆化微生物的基因組中，使插入的調(diào)節(jié)元件與內(nèi)源紅細(xì)胞生成素基因有效連接，從而修飾細(xì)胞系內(nèi)或微生物內(nèi)的內(nèi)源紅細(xì)胞生成素的表達(dá)特性。例如，可以通過插入在所述細(xì)胞系或微生物中能啟動(dòng)正常表達(dá)基因產(chǎn)物表達(dá)的調(diào)節(jié)元件，來激活通?！稗D(zhuǎn)錄沉默”的內(nèi)源紅細(xì)胞生成素基因即在細(xì)胞系中通常不表達(dá)或僅表達(dá)非常低水平的紅細(xì)胞生成素基因?；蛘?，可以通過插入可穿越細(xì)胞類型的混棲調(diào)節(jié)元件，來激活轉(zhuǎn)錄沉默的內(nèi)源紅細(xì)胞生成素基因。
可以采用例如靶向同源重組等技術(shù)，將異源調(diào)節(jié)元件插入到穩(wěn)定的細(xì)胞系或克隆化微生物中，使其與內(nèi)源紅細(xì)胞生成素基因有效連接，所述技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并描述于例如授予巴斯德研究所的法國(guó)專利第2646438號(hào)、授予Chappel的美國(guó)專利第4,215,051號(hào)；授予Sherwin等的美國(guó)專利第5,578,461號(hào)；Selden等的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US92/09627(WO93/09222)；和Skoultchi等的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US90/06436(WO91/06667)，所述每個(gè)專利都通過引用全部結(jié)合到本文中。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，組織保護(hù)性細(xì)胞因子是缺失唾液酸殘基或完全缺乏唾液酸殘基的化學(xué)修飾的紅細(xì)胞生成素分子，并且可以在包括人細(xì)胞在內(nèi)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生。所述細(xì)胞可以被工程化，以缺失或缺乏加入唾液酸的酶，即β-半乳糖苷-α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶@)和β-半乳糖苷-α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶@)活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用其中α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因和/或α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因中的一個(gè)或兩個(gè)都缺失的哺乳動(dòng)物細(xì)胞?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域眾所周知的基因剔除技術(shù)構(gòu)建所述缺失。在另一個(gè)實(shí)施方案中，二氫葉酸還原酶(DHFR)缺陷型中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞用作產(chǎn)生重組紅細(xì)胞生成素相關(guān)分子的宿主細(xì)胞。CHO細(xì)胞不表達(dá)α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，因此不加入以2，6鍵連接這些細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白的N聯(lián)寡糖的唾液酸。結(jié)果，CHO細(xì)胞產(chǎn)生的重組蛋白缺乏以2，6鍵連接半乳糖的唾液酸(Sasaki等，(1987；Takeuchi等，參見上文；Mutsaers等，Eur.J.Biochem.156，651(1986)；Takeuchi等，J.Chromotgr.400，207(1987)。在一個(gè)實(shí)施方案中，為了產(chǎn)生用于產(chǎn)生脫唾液酸紅細(xì)胞生成素的宿主細(xì)胞，使在CHO細(xì)胞中編碼α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的基因缺失。所述剔除α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的CHO細(xì)胞完全缺乏唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性，結(jié)果可用于由脫唾液酸紅細(xì)胞生成素組成的組織保護(hù)性細(xì)胞因子的重組表達(dá)和產(chǎn)生。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過干擾唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體而產(chǎn)生脫唾液酸糖蛋白，例如Eckhardt等，1998，J.Biol.Chem.27320189-95)。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法(例如Oelmann等，2001，J.Biol.Chem.27626291-300)，可以完成核苷酸糖CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的誘變，產(chǎn)生中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的突變體。這些細(xì)胞不能向糖蛋白例如紅細(xì)胞生成素上加入唾液酸殘基，所以只能產(chǎn)生脫唾液酸紅細(xì)胞生成素。
產(chǎn)生紅細(xì)胞生成素的轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞也產(chǎn)生胞質(zhì)唾液酸酶，所述酶如果滲漏到培養(yǎng)基中會(huì)高效降解唾液酸紅細(xì)胞生成素(例如Gramer等，1995 Biotechnology 13692-698)。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法(例如由Ferrari等，1994，Glycobiology 4367-373提供的信息)，細(xì)胞系可以被轉(zhuǎn)染、突變或其它方法以組成型方式產(chǎn)生唾液酸酶。脫唾液酸紅細(xì)胞生成素可以按這種方式在脫唾液酸紅細(xì)胞生成素生產(chǎn)過程中產(chǎn)生。
本發(fā)明的組織保護(hù)性細(xì)胞因子在紅細(xì)胞生成素的氨基酸殘基上具有至少一個(gè)修飾，而與所述分子的糖基化狀態(tài)無(wú)關(guān)。如上所述，化學(xué)修飾可以是至少一個(gè)氨基酸例如賴氨酸殘基的至少一個(gè)氨基或N端氨基的至少一個(gè)修飾，或至少一個(gè)酪氨酸殘基的碘化。
產(chǎn)生本發(fā)明的重組組織保護(hù)性細(xì)胞因子和化學(xué)修飾的重組組織保護(hù)性細(xì)胞因子后，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能采用眾所周知的測(cè)定來檢驗(yàn)所述細(xì)胞因子的組織保護(hù)性特性和對(duì)骨髓效應(yīng)的缺乏。
例如，可以通過使用TF-1測(cè)定來檢驗(yàn)重組組織保護(hù)性細(xì)胞因子的非紅細(xì)胞發(fā)生的效應(yīng)。在該項(xiàng)測(cè)定中，將TF-1細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中在補(bǔ)充5ng/ml GM-CSF和10％FCS的完全RPMI培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)1天。然后將所述細(xì)胞在饑餓培養(yǎng)基(5％FCS，沒有GM-CSF)中洗滌并以106細(xì)胞/ml的密度在饑餓培養(yǎng)基(5％FCS，沒有GM-CSF)中懸浮16小時(shí)。通過以下步驟準(zhǔn)備96孔板(1)在外圍孔中加入100μl無(wú)菌水以保持濕度；(2)向5孔中加入培養(yǎng)基(10％FCS，無(wú)細(xì)胞或GM-CSF)；和(3)在其余孔中以25,000細(xì)胞/孔接種含10％FCS和所述重組組織保護(hù)性細(xì)胞因子的培養(yǎng)基(每種待測(cè)細(xì)胞因子5孔)。如果細(xì)胞增殖，則重組組織保護(hù)性細(xì)胞因子可以是紅細(xì)胞發(fā)生的。然后可以在監(jiān)測(cè)由重組組織保護(hù)性細(xì)胞因子引起的血細(xì)胞比容增加的體內(nèi)測(cè)定中，測(cè)試所述化合物的體內(nèi)效應(yīng)。陰性結(jié)果—在TF-1體外測(cè)定中細(xì)胞未增殖和/或在體內(nèi)測(cè)定中血細(xì)胞比容未增加—表明重組組織保護(hù)性細(xì)胞因子是非紅細(xì)胞發(fā)生的。
可以采用P-19體外測(cè)定或者在小鼠水中毒體內(nèi)測(cè)定，來檢驗(yàn)重組組織保護(hù)性細(xì)胞因子的組織保護(hù)特性，這兩種測(cè)定在下面有更詳細(xì)地概述。以上測(cè)定僅作為實(shí)例，確定所述細(xì)胞因子對(duì)骨髓效應(yīng)和組織保護(hù)效應(yīng)的其它合適測(cè)定是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，也是本發(fā)明所預(yù)期的。
在本發(fā)明一方面的實(shí)踐中，可以通過在血管系統(tǒng)中提供足夠水平的組織保護(hù)性細(xì)胞因子的任何途徑，將上述含有組織保護(hù)性細(xì)胞因子的藥用組合物給予哺乳動(dòng)物，以允許轉(zhuǎn)運(yùn)穿越內(nèi)皮細(xì)胞屏障并對(duì)效應(yīng)細(xì)胞有有益影響。當(dāng)用于灌注組織或器官時(shí)，可得到類似結(jié)果。在其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子用于離體灌注的情況下，所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子可以是任何上述化學(xué)修飾的紅細(xì)胞生成素。在細(xì)胞或組織是非血管化和/或給藥是通過用本發(fā)明組合物浸泡細(xì)胞或組織的情況下，所述藥用組合物提供對(duì)效應(yīng)細(xì)胞有益的有效量的組織保護(hù)性細(xì)胞因子。組織保護(hù)性細(xì)胞因子所穿越的內(nèi)皮細(xì)胞屏障包括緊密連接、穿孔(perforated)連接、穿通(fenestrated)連接和哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在的任何其它類型的內(nèi)皮屏障。優(yōu)選的屏障是內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接，但本發(fā)明并不限于此。
上述組織保護(hù)性細(xì)胞因子通常用于以下人類疾病的治療性治療和預(yù)防性治療主要具有神經(jīng)病學(xué)癥狀或精神病學(xué)癥狀的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及眼病、心血管疾病、心肺疾病、呼吸道疾病、腎病、尿道疾病和生殖道疾病、骨病、皮膚病、胃腸道疾病和內(nèi)分泌異常和代謝異常。具體地講，所述病癥和疾病包括低氧病癥，所述病癥對(duì)可興奮組織有不利影響，所述可興奮組織例如在腦、心、視網(wǎng)膜/眼等中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織、周圍神經(jīng)系統(tǒng)組織或心臟組織或視網(wǎng)膜組織中的可興奮組織。因此，本發(fā)明可用于治療或預(yù)防由各種病癥和情況的低氧病癥引起的可興奮組織的損害。所述病癥和情況的非限制性實(shí)例如下表所提供。
在按本發(fā)明可治療的神經(jīng)元組織病理病癥保護(hù)的實(shí)例中，所述病理病癥包括由神經(jīng)元組織氧合降低所導(dǎo)致的病癥。可以通過本發(fā)明的方法，治療降低神經(jīng)元組織的氧利用度而導(dǎo)致的應(yīng)激、損傷并最終導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡的任何病癥。通常稱為低氧和/或局部缺血的這些病癥是由以下疾病引起的或者包括但不限于以下疾病中風(fēng)、血管閉塞、產(chǎn)前缺氧或產(chǎn)后缺氧、窒息(suffocation)、噎塞、近似淹溺、一氧化碳中毒、煙霧吸入、包括外科手術(shù)和放療在內(nèi)的創(chuàng)傷、窒息(asphyxia)、癲癇、低血糖、慢性阻塞性肺部疾病、肺氣腫、成人呼吸窘迫綜合征、低血壓休克、敗血癥性休克、過敏性休克、胰島素休克、鐮狀細(xì)胞危象、心搏停止、節(jié)律障礙、氮麻醉和心肺分流手術(shù)所致神經(jīng)缺陷。
在一個(gè)實(shí)施方案中，例如可以給予具體的組織保護(hù)性細(xì)胞因子的組合物，以防止在例如腫瘤切除或動(dòng)脈瘤切除等外科手術(shù)中損傷或組織損傷風(fēng)險(xiǎn)所引起的損傷或組織損傷?？梢酝ㄟ^本文所述方法治療的由低血糖引起或?qū)е碌钠渌±聿“Y包括胰島素過量，也稱為醫(yī)源性高胰島素血癥、胰島瘤、生長(zhǎng)激素缺乏、腎上腺皮質(zhì)功能減退、藥物過量和某些腫瘤。
由可興奮神經(jīng)元組織損傷引起的其它病理病癥包括癲癇，例如癲癇、驚厥或慢性癲癇。其它可治療病癥和疾病包括例如中風(fēng)、多發(fā)性硬化、低血壓、心搏停止、早老性癡呆、帕金森病、大腦麻痹、腦創(chuàng)傷或脊髓創(chuàng)傷、艾滋病性癡呆、年齡相關(guān)認(rèn)知功能減退、記憶力減退、肌萎縮性側(cè)索硬化、癲癇、醇中毒、視網(wǎng)膜缺血、由青光眼導(dǎo)致的視神經(jīng)損害和神經(jīng)元損失。
本發(fā)明具體的組合物和方法可用于治療由病癥或各種創(chuàng)傷引起的炎癥，例如物理或化學(xué)誘發(fā)的炎癥。所述創(chuàng)傷可包括脈管炎、慢性支氣管炎、胰腺炎、骨髓炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎小球性腎炎、視神經(jīng)炎、顳動(dòng)脈炎、腦炎、腦膜炎、橫貫性脊髓炎、皮肌炎、多肌炎、壞死性筋膜炎、肝炎和壞死性小腸結(jié)腸炎。
有證據(jù)表明，活化星形膠質(zhì)細(xì)胞可以通過產(chǎn)生神經(jīng)毒素對(duì)神經(jīng)元發(fā)揮細(xì)胞毒作用。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞響應(yīng)腦缺血時(shí)可釋放一氧化氮、活性氧組分和細(xì)胞因子(參見Becker，K.J.2001.Targeting the centralnervous system inflammatory response in ischemic stroke(靶向局部缺血性中風(fēng)中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)).Curr Opinion Neurol 14349-353和Mattson，M.P.，Culmsee，C.和Yu，Z.F.2000.Apoptotic andAntiapoptotic mechanisms in stroke(中風(fēng)中的細(xì)胞凋亡和抗凋亡機(jī)制).Cell Tissue Res 301173-187.)。研究進(jìn)一步表明，在神經(jīng)變性模型中，神經(jīng)膠質(zhì)的活化和隨后產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子取決于原發(fā)性神經(jīng)元損傷(參見Viviani，B.，Corsini，E.，Galli，C.L.，Padovani，A.，Ciusani，E.和Marinovich，M.2000.Dying neural cells activate glia through the releaseof a protease product(瀕死神經(jīng)細(xì)胞通過釋放蛋白酶產(chǎn)物激活神經(jīng)膠質(zhì)).Glia 3284-90和Rabuffetti，M.，Scioratti，C.，Tarozzo，G.，Clementi，E.，Manfredi，A.A.和Beltramo，M.2000)Inhibition of caspase-1-likeactivity by Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-chloromethyl ketone includes long lastingneuroprotection in cerebral ischemia through apoptosis reduction anddecrease of proinflammatory cytokines(由Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-氯甲酮引起的胱冬蛋白酶-1樣活性的抑制包括在腦缺血中通過細(xì)胞凋亡的降低和促炎性細(xì)胞因子的減少，長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)性神經(jīng)保護(hù)).J Neurosci.204398-4404)。炎癥和神經(jīng)膠質(zhì)的活化對(duì)于包括腦缺血、腦創(chuàng)傷和實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎在內(nèi)的神經(jīng)變性性疾病的不同形式是常見的，在這些疾病中紅細(xì)胞生成素發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。由紅細(xì)胞生成素引起的對(duì)細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制可以至少部分介導(dǎo)其保護(hù)效應(yīng)。然而，不同于直接抑制腫瘤壞死因子產(chǎn)生的諸如IL-10和IL-13等“經(jīng)典”抗炎細(xì)胞因子，紅細(xì)胞生成素看來僅在存在神經(jīng)元死亡時(shí)才有活性。
雖然不希望受任何具體理論的束縛，但是似乎抗炎活性可以用若干非限制性理論假設(shè)性地解釋。首先，因?yàn)榧t細(xì)胞生成素阻止細(xì)胞凋亡，所以將阻止由細(xì)胞凋亡觸發(fā)的炎性事件。此外，紅細(xì)胞生成素可阻止瀕死神經(jīng)元釋放分子信號(hào)，所述信號(hào)可刺激神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或者可以直接作用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以降低它們對(duì)這些產(chǎn)物的反應(yīng)。另一個(gè)可能性是紅細(xì)胞生成素靶向更接近而觸發(fā)細(xì)胞凋亡和炎癥的炎癥級(jí)聯(lián)成員(例如胱冬蛋白酶1、活性氧或氮中間產(chǎn)物)。
此外，紅細(xì)胞生成素似乎提供抗炎保護(hù)，而沒有通常與其它抗炎化合物例如地塞米松相關(guān)的彈回效應(yīng)。而且，雖然不希望受任何具體理論的束縛，但是這似乎是因?yàn)榧t細(xì)胞生成素對(duì)多目標(biāo)神經(jīng)毒素例如一氧化氮(NO)的效應(yīng)。盡管活化星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在響應(yīng)不同創(chuàng)傷時(shí)產(chǎn)生神經(jīng)毒性量的NO，但是NO在機(jī)體內(nèi)有許多用途，包括必要的生理功能的調(diào)節(jié)。因此，盡管使用抗炎藥可以通過抑制NO或其它神經(jīng)毒素來緩解炎癥，如果抗炎藥具有太長(zhǎng)半壽期，也會(huì)干擾導(dǎo)致炎癥的由創(chuàng)傷引起的損傷恢復(fù)中的這些化學(xué)作用。假設(shè)本發(fā)明的組織保護(hù)性細(xì)胞因子能緩解炎癥而不干擾神經(jīng)毒素例如NO的恢復(fù)能力。
本發(fā)明提供包含一種或多種組織保護(hù)性細(xì)胞因子和一種或多種不同于組織保護(hù)性細(xì)胞因子的預(yù)防劑或治療劑(即活性劑)的組合物，并且用于預(yù)防、治療或緩解哺乳動(dòng)物的一種或多種哺乳動(dòng)物效應(yīng)細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞、組織和器官的炎癥的相關(guān)癥狀的方法，所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物一種或多種所述組合物。本發(fā)明還提供包含一種或多種組織保護(hù)性細(xì)胞因子的組合物，和用于預(yù)防、治療或緩解哺乳動(dòng)物的一種或多種哺乳動(dòng)物效應(yīng)細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞、組織和器官的炎癥的相關(guān)癥狀的方法，所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物一種或多種所述組合物，其中所述組合物與不同于組織保護(hù)性細(xì)胞因子的一種或多種預(yù)防劑或治療劑聯(lián)合用藥。所述炎癥可以由損傷或疾病引起，所述損傷和疾病例如但不限于哮喘、腦炎(encephilitis)、炎性腸病、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、關(guān)節(jié)炎或變應(yīng)性疾病。治療劑或預(yù)防劑包括但不限于肽、多肽、融合蛋白、核酸分子、小分子、模擬劑、合成藥、無(wú)機(jī)分子和有機(jī)分子。已知可用于或已用于或正在用于預(yù)防、治療或緩解炎癥相關(guān)的一種或多種癥狀的任何藥物都可與根據(jù)本發(fā)明所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子聯(lián)合使用。所述試劑的實(shí)例包括但不限于用于皮疹和紅腫的皮膚用制劑(例如光線療法(即紫外B輻射)、光化學(xué)療法(例如PUVA)和局部用藥物例如潤(rùn)滑藥、水楊酸、煤焦油、局部用類固醇、局部用皮質(zhì)類固醇、局部用維生素D3類似物(例如卡泊三烯)、他扎羅汀和局部用類視色素)、抗炎藥(例如皮質(zhì)類固醇(例如潑尼松和氫化可的松)、糖皮質(zhì)激素、類固醇、非甾體抗炎藥(例如阿司匹林、布洛芬、雙氯芬酸和COX-2抑制劑)、β-激動(dòng)劑、抗膽堿能藥和甲基黃嘌呤)、免疫調(diào)節(jié)劑(例如有機(jī)小分子、T細(xì)胞受體調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞因子受體調(diào)節(jié)劑、T細(xì)胞排空劑(depletingagent)、細(xì)胞因子拮抗劑、單核因子拮抗劑、淋巴細(xì)胞抑制劑或抗癌藥)、金注射劑、柳氮磺吡啶、青霉胺、抗血管形成藥(例如血管抑制素、TNF-α拮抗劑(例如抗TNFα抗體)和內(nèi)皮生長(zhǎng)抑素)、氨苯砜、補(bǔ)骨脂素(例如甲氧沙林和三甲沙林)、抗瘧藥(例如羥氯喹)、抗病毒藥和抗生素(例如紅霉素和青霉素)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的任何免疫調(diào)節(jié)劑都可用于本發(fā)明的方法和組合物。免疫調(diào)節(jié)劑可影響患者的一個(gè)或多個(gè)或所有方面的免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答方面包括但不限于炎癥反應(yīng)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將免疫調(diào)節(jié)劑給予患者可抑制或降低該患者的一個(gè)或多個(gè)方面的免疫應(yīng)答能力。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述免疫調(diào)節(jié)劑抑制患者的炎癥反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組織保護(hù)性細(xì)胞因子與一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)合用藥，以治療即緩解癥狀或預(yù)防炎癥。
免疫調(diào)節(jié)劑的實(shí)例包括但不限于蛋白質(zhì)性藥物例如細(xì)胞因子、肽模擬物和抗體(例如人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單克隆抗體、多克隆抗體、Fv、ScFv、Fab或F(ab)2片段或表位結(jié)合片段)、核酸分子(例如反義核酸分子和三股螺旋)、小分子、有機(jī)化合物和無(wú)機(jī)化合物。具體地講，免疫調(diào)節(jié)劑包括但不限于甲氨蝶呤、來氟米特、環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺制劑、Immuran、環(huán)孢菌素A、二甲胺四環(huán)素、硫唑嘌呤、抗生素(例如FK506(他克莫司))、甲潑尼龍(MP)、皮質(zhì)類固醇、類固醇、麥考酚酸嗎乙酯、雷帕霉素(西羅莫司)、咪唑立賓、脫氧精胍菌素、布喹那、丙二腈酰胺(例如leflunamide)、T細(xì)胞受體調(diào)節(jié)劑和細(xì)胞因子受體調(diào)節(jié)劑。T細(xì)胞受體調(diào)節(jié)劑的實(shí)例包括但不限于抗T細(xì)胞受體的抗體(例如抗CD4抗體(例如cM-T412(Boeringer)、IDEC-CE9.1(IDEC和SKB)、mAB 4162W94、Orthoclone和OKTcdr4a(Janssen-Cilag))、抗CD3抗體、抗CD5抗體(例如抗CD5蓖麻毒素連接免疫綴合物)、抗CD7抗體(例如CHH-380(Novartis))、抗CD8抗體、抗CD40配體單克隆抗體、抗CD52抗體(例如CAMPATH 1H(Ilex))、抗CD2單克隆抗體)和CTLA4-免疫球蛋白。
細(xì)胞因子受體調(diào)節(jié)劑的實(shí)例包括但不限于可溶性細(xì)胞因子受體(例如TNF-α受體或其片段的胞外結(jié)構(gòu)域，IL-1β受體或其片段的胞外結(jié)構(gòu)域和IL-6受體或其片段的胞外結(jié)構(gòu)域)、細(xì)胞因子或其片段(例如白介素(IL)-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、TNF-α、TNF-β、干擾素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ和GM-CSF)、抗細(xì)胞因子受體的抗體(例如抗IL-2受體的抗體、抗IL-4受體的抗體、抗IL-6受體的抗體、抗IL-10受體的抗體和抗IL-12受體的抗體)、抗細(xì)胞因子的抗體(例如抗IFN受體的抗體、抗TNF-α的抗體、抗IL-1β的抗體、抗IL-6的抗體和抗IL-12的抗體)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，細(xì)胞因子受體調(diào)節(jié)劑是IL-4、IL-10或其片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞因子受體調(diào)節(jié)劑是抗IL-1β的抗體、抗IL-6的抗體、抗IL-12受體的抗體、抗TNF-α的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞因子受體調(diào)節(jié)劑是TNF-α受體或其片段的胞外結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子受體調(diào)節(jié)劑不是TNF-α拮抗劑。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用作免疫調(diào)節(jié)劑的蛋白、多肽或肽(包括抗體)來源于與所述蛋白、多肽或肽受體相同的物種，以降低對(duì)這些蛋白、多肽或肽免疫應(yīng)答的可能性。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)所述患者是人時(shí)，用作免疫調(diào)節(jié)劑的蛋白、多肽或肽是人蛋白、人多肽或人肽，或者是人源化蛋白、人源化多肽或人源化肽。
根據(jù)本發(fā)明，在給予炎癥患者本發(fā)明治療劑和/或預(yù)防劑之前、之后或同時(shí)給予一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑。必要時(shí)，最好給予炎癥患者一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑以降低或抑制一個(gè)或多個(gè)方面的免疫應(yīng)答。本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的任何技術(shù)都可用于測(cè)定具體患者體內(nèi)一個(gè)或多個(gè)方面的免疫應(yīng)答，從而確定何時(shí)有必要給予所述患者免疫調(diào)節(jié)劑。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，給予炎癥患者一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑，以一過性降低或抑制一個(gè)或多個(gè)方面的免疫應(yīng)答。一個(gè)或多個(gè)方面免疫應(yīng)答的一過性降低或抑制可以持續(xù)數(shù)小時(shí)、數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月。一個(gè)或多個(gè)方面免疫應(yīng)答的一過性降低或抑制最好可持續(xù)數(shù)小時(shí)(例如2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、14小時(shí)、16小時(shí)、18小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)或48小時(shí))、數(shù)天(例如3天、4天、5天、6天、7天或14天)或數(shù)周(例如3周、4周、5周或6周)。一個(gè)或多個(gè)方面免疫應(yīng)答的一過性降低或抑制增強(qiáng)組織保護(hù)性細(xì)胞因子的預(yù)防和/或治療能力。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的方法將降低或減少T細(xì)胞、最好是記憶T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)劑給予炎癥患者。參見例如美國(guó)專利第4,658,019號(hào)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的方法將鈍化CD8+T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)劑給予炎癥患者。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，抗CD8的抗體用于降低或減少CD8+T細(xì)胞。
CD40配體(CD40L)-CD40相互作用是希望阻斷免疫應(yīng)答的目標(biāo)，因?yàn)槠湓赥輔助細(xì)胞活化和功能上的廣泛活性以及在其信號(hào)傳導(dǎo)途徑中不存在豐余現(xiàn)象。因此，在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，CD40L與CD40間相互作用在給予一種或多種所述免疫調(diào)節(jié)劑的時(shí)候被瞬時(shí)阻斷。這可以通過用阻斷TH細(xì)胞上CD40配體并干擾T輔助細(xì)胞上CD40配體與B細(xì)胞上CD40抗原的正常結(jié)合的藥物進(jìn)行治療來完成。可以根據(jù)本發(fā)明的方法來選擇CD40配體的抗體(抗CD40L)(可得自Bristol-Myers Squibb Co；參見例如公布于1993年8月18日的歐洲專利申請(qǐng)555,880)或可溶性CD40分子，并用作免疫調(diào)節(jié)劑。
可用于本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)劑的其它實(shí)例包括但不限于皮質(zhì)類固醇、硫唑嘌呤、麥考酚酸嗎乙酯、環(huán)孢菌素A、氫化可的松、FK506、甲氨蝶呤、來氟米特和環(huán)磷酰胺。環(huán)磷酰胺的短療程已證明能成功阻斷CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞對(duì)腺病毒衣殼蛋白的活化(Jooss等，1996，Hum.Gene Ther.71555-1566)。氫化可的松或環(huán)孢菌素A治療已成功用于降低細(xì)胞因子的誘導(dǎo)，這其中有些可參與細(xì)菌感染和炎癥的清除。
可以按照本發(fā)明的方法將編碼具有免疫調(diào)節(jié)活性的蛋白、多肽或肽的核酸分子或具有免疫調(diào)節(jié)活性的蛋白、多肽或肽給予炎癥患者。此外，可以按照本發(fā)明的方法將編碼具有免疫調(diào)節(jié)活性的蛋白、多肽或肽的衍生物、類似物、片段或變異體的核酸分子或具有免疫調(diào)節(jié)活性的蛋白、多肽或肽的衍生物、類似物、片段或變異體給予炎癥患者。所述衍生物、類似物、變異體和片段最好保留全長(zhǎng)野生型蛋白、多肽或肽的免疫調(diào)節(jié)活性。
可以通過本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)或本文所述技術(shù)，產(chǎn)生可用作免疫調(diào)節(jié)劑的蛋白、多肽或肽。參見例如Ausubel等(編著)，1999，ShortProtocols in Molecular Biology，第4版，第16章，John Wiley & Sons，NY，所述文獻(xiàn)描述了產(chǎn)生蛋白、多肽或肽的方法，所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。可以通過例如描述于美國(guó)專利第6,245,527號(hào)和Harlow和Lane.AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1988的方法，產(chǎn)生用作免疫調(diào)節(jié)劑的抗體，所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。市售的和已知用作免疫調(diào)節(jié)劑的試劑最好用于本發(fā)明的組合物和方法。可以通過包括例如用于特定蛋白(例如共刺激分子和細(xì)胞因子)的CTL測(cè)定、增殖測(cè)定和免疫測(cè)定(例如ELISA)在內(nèi)的本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)，測(cè)定試劑在體外和/或體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)活性。
本發(fā)明具體的組合物和方法可用于治療視網(wǎng)膜組織的病癥和損害。所述疾病包括但不限于視網(wǎng)膜缺血、黃斑變性、視網(wǎng)膜脫落、色素性視網(wǎng)膜炎、動(dòng)脈硬化性視網(wǎng)膜病、高血壓性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜動(dòng)脈阻塞、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、低血壓和糖尿病性視網(wǎng)膜病。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和原理可用于保護(hù)或治療可興奮組織的輻射損傷引起的損害。本發(fā)明方法的進(jìn)一步用途是用于治療諸如軟骨藻酸蛤貝中毒、山黧豆中毒等神經(jīng)毒素中毒以及Guam病、肌萎縮性側(cè)索硬化和帕金森病。
如上所述，本發(fā)明也涉及增強(qiáng)哺乳動(dòng)物可興奮組織功能的方法，即通過外周給予上述組織保護(hù)性細(xì)胞因子。各種疾病和病癥可以用該方法進(jìn)行治療，而且該方法用于在無(wú)任何病癥或疾病時(shí)增強(qiáng)認(rèn)知功能。本發(fā)明這些用途在下文中有更詳細(xì)的描述，包括在人和非人類哺乳動(dòng)物學(xué)習(xí)和訓(xùn)練上的增強(qiáng)。
可以通過本發(fā)明該方面的方法治療的病癥和疾病涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，所述病癥和疾病包括但不限于心境障礙、焦慮癥、抑郁癥、孤獨(dú)癥、注意力不集中的過度反應(yīng)癥和認(rèn)知功能障礙。這些病癥受益于神經(jīng)元功能的增強(qiáng)。根據(jù)本發(fā)明所述可治療的其它障礙包括睡眠中斷，例如睡眠性呼吸暫停和旅行相關(guān)障礙；蛛網(wǎng)膜下出血和動(dòng)脈瘤出血、低血壓休克、震蕩損傷、敗血癥性休克、過敏性休克和各種腦炎和腦膜炎后遺癥，例如結(jié)締組織病相關(guān)性腦炎(cerebritide)例如狼瘡。其它用途包括預(yù)防或保護(hù)作用，以免于諸如軟骨藻酸蛤貝中毒、山黧豆中毒等神經(jīng)毒素中毒以及Guam病、肌萎縮性側(cè)索硬化、帕金森?。凰ㄈ該p傷或局部缺血性損傷的術(shù)后治療；全腦輻照；鐮狀細(xì)胞危象；和驚厥。
可以用通過本發(fā)明的方法治療的其它類型病癥包括遺傳性或獲得性線粒體功能障礙，所述障礙是以神經(jīng)元損傷和死亡為典型特征的各種神經(jīng)病的原因。例如亞急性壞死性腦脊髓病(亞急性壞死性腦病)的特征是進(jìn)行性視覺損失和腦病，是因?yàn)樯窠?jīng)元損失和肌病。在這些病例中，缺陷型線粒體代謝不能供應(yīng)足夠高的能量底物，以給可興奮細(xì)胞代謝供給能量。紅細(xì)胞生成素受體活性調(diào)節(jié)劑在各種線粒體疾病中能使破壞的功能最佳化。如上所述，低氧病癥對(duì)可興奮組織有不利影響。所述可興奮組織包括但不限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織、周圍神經(jīng)系統(tǒng)組織和心臟組織。除了上述病癥之外，本發(fā)明的方法用于治療吸入性中毒例如吸入一氧化碳和煙霧、嚴(yán)重哮喘、成人呼吸窘迫綜合征和窒息和近似淹溺。產(chǎn)生低氧病癥或通過其它方式誘導(dǎo)可興奮組織損傷的其它病癥包括可發(fā)生在不合適劑量給予胰島素的低血糖或產(chǎn)生胰島素的腫瘤(胰島瘤)。
認(rèn)為起源于可興奮組織損傷的各種神經(jīng)精神障礙可以通過本發(fā)明方法治療。其中涉及神經(jīng)元損傷并用本發(fā)明治療的慢性障礙包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)和/或周圍神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)障礙，包括年齡相關(guān)認(rèn)知功能減退和老年性癡呆、慢性癲癇、早老性癡呆、帕金森病、癡呆、記憶力減退、肌萎縮性側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化、結(jié)節(jié)性硬化、Wilson病、大腦麻痹和進(jìn)行性核上麻痹、Guam病、雷維小體性癡呆(Lewy bodydementia)、朊病毒病例如海綿樣腦病例如傳染性海綿樣腦病、亨廷頓舞蹈病(Huntington′s disease)、肌強(qiáng)直性營(yíng)養(yǎng)不良、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)(Freidrich ataxia)和其它共濟(jì)失調(diào)以及圖雷特綜合征(Gilles de laTourettle′s disease)、癲癇例如癲癇和慢性癲癇、中風(fēng)、腦創(chuàng)傷或脊髓創(chuàng)傷、艾滋病性癡呆、醇中毒、孤獨(dú)癥、視網(wǎng)膜缺血、青光眼、自主功能障礙例如高血壓和睡眠障礙，以及包括但不限于如下精神病學(xué)障礙精神分裂癥、分裂情感障礙、注意力不集中、情緒惡劣性障礙、重型憂郁性障礙、躁狂癥、強(qiáng)迫性神經(jīng)失調(diào)、精神作用藥物使用障礙、焦慮癥、驚恐性障礙以及單相性和雙相性情感障礙。其它神經(jīng)精神障礙和神經(jīng)變性性疾病包括例如美國(guó)精神病學(xué)協(xié)會(huì)(American Psychiatric Association)的精神障礙(DSM)診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)中列出的障礙，所述文獻(xiàn)的最新版本IV通過引用全部結(jié)合到本文中。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含紅細(xì)胞生成素的重組嵌合毒素分子可用于治療性給予毒素，以治療增生性疾病例如癌癥，或病毒性疾病例如亞急性硬化性全腦炎。
下表列出作為可以通過上述組織保護(hù)性細(xì)胞因子治療的各種病癥和疾病的額外的示例性、非限制性適應(yīng)征。
如上所述，這些疾病、障礙或病癥僅僅是說明本發(fā)明組織保護(hù)性細(xì)胞因子提供益處的范圍。因此，本發(fā)明總的來講提供對(duì)由機(jī)械創(chuàng)傷或人類疾病導(dǎo)致的結(jié)果的治療性治療或預(yù)防性治療。優(yōu)選用于CNS和/或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的疾病、障礙或病癥的治療性治療或預(yù)防性治療。提供用于具有精神病學(xué)問題的疾病、障礙或病癥的治療性治療或預(yù)防性治療。提供用于包括但不限于以下疾病、障礙或病癥的治療性治療或預(yù)防性治療眼病、心血管疾病、心肺疾病、呼吸道疾病、腎病、尿道疾病和生殖道疾病、胃腸道疾病、內(nèi)分泌異常和代謝異常。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，本發(fā)明的藥用組合物可由本發(fā)明的組織保護(hù)性細(xì)胞因子的混合物以及紅細(xì)胞生成素來制備。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以系統(tǒng)給予紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子的藥用組合物，以保護(hù)或增強(qiáng)靶細(xì)胞、組織或器官。所述給藥可以經(jīng)胃腸外、通過吸入或經(jīng)粘膜給藥，例如口服、經(jīng)鼻腔、直腸、陰道內(nèi)、舌下、粘膜下或經(jīng)皮。給藥最好是經(jīng)胃腸外，例如通過靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射，并且也包括但不限于動(dòng)脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)和皮下給藥。
對(duì)于例如通過使用灌注液、注射到器官或其它局部給藥途徑等其它給藥途徑，將提供導(dǎo)致如上所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子的相似水平的藥用組合物。優(yōu)選水平約為15pM-30nM。
本發(fā)明的藥用組合物可以包含治療有效量的化合物和藥學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”是指由聯(lián)邦政府或州政府管理部門批準(zhǔn)的，或者列入美國(guó)藥典或其它公認(rèn)外國(guó)藥典可用于動(dòng)物、尤其是人。術(shù)語(yǔ)“載體”是指用于給予治療劑的稀釋劑、輔料、賦形劑或溶媒。所述藥用載體可以是無(wú)菌液體，例如鹽水溶液和包括石油、動(dòng)物、植物或合成來源在內(nèi)的油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當(dāng)藥用組合物經(jīng)靜脈內(nèi)給藥時(shí)，優(yōu)選鹽水溶液作為載體。鹽水溶液和葡萄糖水和甘油溶液也可用作液體載體，尤其用于注射液。合適的藥用賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽糖、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述組合物也可以含有有少量潤(rùn)濕劑或乳化劑或pH緩沖劑。這些組合物可呈以下形式溶液劑、混懸劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、散劑、緩釋制劑等。所述組合物可與傳統(tǒng)粘合劑和載體例如甘油三酯一起配制成栓劑。本發(fā)明的化合物可配制成中性形式或鹽形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括與游離氨基形成的鹽，例如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的鹽；和與游離羧基形成的鹽，例如衍生自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的鹽。合適的藥用載體的實(shí)例描述于E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”。所述組合物可含有治療有效量的化合物，最好以純形式，并與適量的載體一起，以便提供適合給予患者的形式。所述制劑應(yīng)適合給藥模式。
適于口服給藥的藥用組合物可以為膠囊劑或片劑；粉劑或顆粒劑；溶液劑、糖漿劑或混懸劑(在水或非水液體中)；食用泡沫劑或攪打劑(whip)；或乳劑。片劑或硬明膠膠囊劑可以包含乳糖、淀粉或其衍生物、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂、硬脂酸或其鹽。軟明膠膠囊劑可以包含植物油、蠟、脂肪、半固體或液體多元醇等。溶液劑和糖漿劑可以包含水、多元醇和糖。
預(yù)期用于口服給藥的活性劑可以用延遲該活性劑在胃腸道內(nèi)崩解和/或吸收的材料包衣或與所述材料混合(例如可使用甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯)。因此，活性劑的持續(xù)釋放可達(dá)到數(shù)小時(shí)，而且必要時(shí)可保護(hù)所述活性劑避免在胃中被降解。可配制供口服給藥的藥用組合物，以使活性劑因規(guī)定pH或酶解條件而在特定胃腸道部位釋放。
適于經(jīng)皮給藥的藥用組合物可以是預(yù)期保持與受體表皮長(zhǎng)時(shí)間密切接觸分散的貼劑。適于局部給藥的藥用組合物可以是軟膏劑、乳膏劑、混懸劑、洗劑、散劑、溶液劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣溶膠或油劑。對(duì)于皮膚、口腔、眼或其它外部組織的局部給藥，最好采用局部用軟膏劑或乳膏劑。當(dāng)配制成軟膏劑時(shí)，活性成分可以與石蠟或水混溶性軟膏基質(zhì)一起使用?；蛘?，活性成分可與水包油基質(zhì)或油包水基質(zhì)一起配制在乳膏劑中。適于眼局部給藥的藥用組合物包括滴眼劑。在這些組合物中，活性成分可溶于或懸浮于合適載體例如水性溶劑中。適于口腔局部給藥的藥用組合物包括糖錠劑、軟錠劑和漱口劑。
適于鼻腔和肺部給藥的藥用組合物可以包含例如粉劑(最好粒徑范圍為20-500微米)等固體載體。粉劑可以吸入(例如通過將盛裝粉劑的容器靠近鼻子而快速吸入鼻腔的方式)給藥。或者，適于鼻腔給藥的組合物可以包含液體載體，例如鼻腔噴霧劑或滴鼻劑?；蛘?，可以通過深部吸入或通過通向咽部的口腔裝置，給予直接吸入肺部的化合物。這些組合物可以包含活性成分的水性溶液劑或油性溶液劑。用于吸入給藥的組合物可以以特殊合適的裝置來提供，所述裝置包括但不限于加壓的氣溶膠、噴霧器或吹藥器，可以生產(chǎn)所述裝置，以便提供預(yù)先確定的活性成分劑量。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過鼻腔或咽部將本發(fā)明的藥用組合物直接給予鼻腔或肺部。
適于直腸給藥的藥用組合物可以是栓劑或灌腸劑。適于陰道給藥的藥用組合物可以是陰道栓劑、棉球、乳膏劑、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴霧制劑。
適于胃腸外給藥的藥用組合物包括可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑以及賦予所述組合物與預(yù)期受體血液基本等滲的溶質(zhì)的水性和非水性無(wú)菌注射溶液劑或混懸劑。所述組合物中可具有的其它成分包括例如水、醇類、多元醇、甘油和植物油。適于胃腸外給藥的組合物可以呈單劑量或多劑量容器，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以貯存在冷凍-干燥(凍干)條件下，只需要在臨用前加入無(wú)菌液體載體例如注射用無(wú)菌鹽溶液即可。臨配的注射用溶液劑和混懸劑可從無(wú)菌粉針劑、粒劑和片劑制備。在一個(gè)實(shí)施方案中，可提供用于救護(hù)車、急診室和戰(zhàn)場(chǎng)情況下緊急使用的包含紅細(xì)胞生成素注射液的自動(dòng)注射器，甚至還可用于在家中自我給藥、特別是在可能發(fā)生創(chuàng)傷性切斷例如割草機(jī)使用不慎的情況下。通過盡快(甚至在醫(yī)務(wù)人員到達(dá)現(xiàn)場(chǎng)之前，或者腳趾被切斷的傷者到達(dá)急診室之前)在切斷部位多位點(diǎn)給予紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子，當(dāng)切斷的腳或腳趾被復(fù)植后，其細(xì)胞或組織存活的可能性會(huì)提高。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物按照常規(guī)方法配制成適于靜脈內(nèi)給予人類的藥用組合物。通常用于靜脈內(nèi)給藥的組合物是溶于無(wú)菌等滲水性緩沖劑中的溶液劑。如有必要，所述組合物也可包括增溶劑和局部麻醉藥例如利多卡因，以減輕注射部位的疼痛。通常，所述組分可單獨(dú)或在單位劑型中混合提供，例如在指示活性劑數(shù)量的密封容器例如安瓿或小藥囊中的凍干粉劑或無(wú)水濃縮劑。當(dāng)經(jīng)輸注給予所述組合物時(shí)，它可用含有無(wú)菌藥用級(jí)水或鹽水的輸液瓶分散。當(dāng)經(jīng)注射給予所述組合物時(shí)，可提供無(wú)菌鹽水的安瓿以便所述組分在給藥前可以混合。
栓劑通常含有范圍在0.5％(重量)至10％(重量)的活性成分；口服制劑最好含有10％至95％的活性成分。
可提供用于移植器官浸泡、原位灌注或在收獲器官之前給予器官供體血管的灌注液組合物。所述藥用組合物可以包含不適用于急性或慢性、局部或系統(tǒng)給予個(gè)體的紅細(xì)胞生成素、組織保護(hù)性細(xì)胞因子或者這兩者之一的水平，但所述紅細(xì)胞生成素、組織保護(hù)性細(xì)胞因子、或者這兩者之一的水平可以在消除或降低其中所含紅細(xì)胞生成素的水平之前、在將經(jīng)處理的器官或組織暴露或回輸正常循環(huán)之前，在尸體、器官浸泡液、器官灌注液或原位灌注液中發(fā)揮本文預(yù)期作用。用于本發(fā)明這一方面的紅細(xì)胞生成素可以是任何紅細(xì)胞生成素，例如天然存在的形式例如人紅細(xì)胞生成素，或以上所述的任何組織保護(hù)性細(xì)胞因子，例如脫唾液酸紅細(xì)胞生成素和苯基乙二醛-紅細(xì)胞生成素，作為非限制性實(shí)例。
本發(fā)明提供用于治療、預(yù)防和緩解炎癥相關(guān)的一種或多種癥狀的藥用組合物。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，組合物包含一種或多種組織保護(hù)性細(xì)胞因子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含一種或多種組織保護(hù)性細(xì)胞因子和不同于組織保護(hù)性細(xì)胞因子的一種或多種預(yù)防劑或治療劑，所述預(yù)防劑或治療劑已知將用于或已用于或正在用于預(yù)防、治療或緩解炎癥相關(guān)的一種或多種癥狀。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物是藥用組合物。所述組合物包含預(yù)防有效量或治療有效量的一種或多種預(yù)防劑或治療劑(例如組織保護(hù)性細(xì)胞因子或其它預(yù)防劑或治療劑)，以及藥學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“治療有效量”意指包括制劑當(dāng)單獨(dú)給藥時(shí)不一定有效、但當(dāng)與另一種制劑聯(lián)合用藥時(shí)有效的量。
本發(fā)明也提供一種包含裝有一種或多種本發(fā)明藥用組合物的組分的一個(gè)或多個(gè)容器的藥物包裝或藥盒。所述容器任選帶有政府部門對(duì)藥物或生物制品的生產(chǎn)、使用或銷售要求的規(guī)定形式的通知，所述通知反映了對(duì)人類給藥的生產(chǎn)、使用或銷售的批準(zhǔn)。
具體地講，本發(fā)明提供一種或多種本發(fā)明的預(yù)防劑或治療劑或藥用組合物是包裝在標(biāo)明所述制劑數(shù)量的密封容器例如安瓿或小藥囊中。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種本發(fā)明的預(yù)防劑或治療劑或藥用組合物是以密封容器中無(wú)菌凍干粉劑或無(wú)水濃縮劑的形式提供，并且可以用例如水或鹽水重建成用于給予患者的合適濃度。一種或多種本發(fā)明的預(yù)防劑或治療劑或藥用組合物最好是以密封容器中無(wú)菌凍干散劑、以至少5mg、更優(yōu)選至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg、至少75mg或至少100mg的單位劑量提供。凍干的本發(fā)明預(yù)防劑或治療劑或藥用組合物應(yīng)在其原有容器中貯存于2-8℃，而且本發(fā)明預(yù)防劑或治療劑或藥用組合物應(yīng)在恢復(fù)后的1周內(nèi)、最好5天內(nèi)、72小時(shí)內(nèi)、48小時(shí)內(nèi)、24小時(shí)內(nèi)、12小時(shí)內(nèi)、6小時(shí)內(nèi)、5小時(shí)內(nèi)、3小時(shí)內(nèi)或1小時(shí)內(nèi)給藥。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，一種或多種本發(fā)明的預(yù)防劑或治療劑或藥用組合物在標(biāo)明制劑數(shù)量和濃度的密封容器中以液體形式提供。給藥組合物的液體形式在密封容器中提供優(yōu)選至少0.25mg/ml、更優(yōu)選至少0.5mg/ml、至少1mg/ml、至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/kg、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml或至少100mg/ml。所述液體形式應(yīng)在其原有容器中貯存于2-8℃。
所述組合物如需要的話，可以是含有含所述活性成分的一種或多種單位劑型的包裝或分配器裝置形式。所述包裝可包括例如金屬箔或塑料箔例如泡眼包裝。所述包裝或分散裝置可以附帶給藥指南。
通常，本發(fā)明組合物的組分來自與所述組合物的受體相同物種來源或相同種屬反應(yīng)的受試者。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將人抗體或人源化抗體給予人以用于治療或預(yù)防。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，例如可在控釋系統(tǒng)中給予組織保護(hù)性細(xì)胞因子。例如可采用靜脈內(nèi)輸注、可植入滲透泵、透皮貼劑、脂質(zhì)體或其它給藥方式給予所述多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用泵(參見Langer，參見上文；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14201；Buchwald等，1980，Surgery 88507；Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321574)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可在載體、尤其是脂質(zhì)體中給予所述化合物(參見Langer，Science 2491527-1533(1990)；Treat等，inLiposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein和Fidler(編著)，Liss，New York，第353-365頁(yè)(1989)；WO91/04014；美國(guó)專利第4,704,355號(hào)；LopezBerestein，出處同上，第317-327頁(yè)；一般參見出處同上)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用聚合材料(參見Medical Applications of Controlled Release，Langer和Wise(編著)，CRC PressBoca Raton，F(xiàn)lorida，1974；Controlled DrugBioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball(編著)，WileyNew York(1984)；Ranger和Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361，1953；另參Levy等，1985，Science 228190；During等，1989，Ann.Neurol.25351；Howard等，1989，J.Neurosurg.71105)。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，控釋系統(tǒng)可放置在治療靶例如靶細(xì)胞、組織或器官的附近，因此只需要系統(tǒng)給藥量的一小部分(參見例如Goodson，載于Medical Applications of Controlled Release，第2卷，第115-138頁(yè)，參見上文，1984)。有關(guān)其它控釋系統(tǒng)的綜述可參見Langer(1990，Science 2491527-1533)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以經(jīng)鼻腔、口服、直腸、陰道或舌下給藥，給予適當(dāng)配制的組織保護(hù)性細(xì)胞因子。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，希望向需要治療的部位局部給予本發(fā)明的紅細(xì)胞生成素和/或組織保護(hù)性細(xì)胞因子；這可以例如但不限于通過手術(shù)中局部輸注、局部應(yīng)用例如與手術(shù)后傷口敷劑一起使用、通過注射、通過導(dǎo)管、通過栓劑或通過植入物來完成，所述植入物是多孔、無(wú)孔或明膠類材料，包括諸如硅橡膠膜等在內(nèi)的膜或纖維。
技術(shù)人員將根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的若干因素，容易地確定優(yōu)選有效劑量的選擇。所述因素包括紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子的具體形式及其生物利用度、代謝、半壽期等藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)，這些參數(shù)在通常用于獲得藥用化合物法定批準(zhǔn)的常規(guī)開發(fā)程序中已經(jīng)建立。在考慮劑量時(shí)的其它因素包括待治療病癥或疾病或在正常個(gè)體中想獲得的益處、患者體重、給藥途徑(不管給藥是急性還是慢性的)、同時(shí)給予的藥物和影響所給藥物功效的眾所周知的其它因素。因此精確劑量將根據(jù)醫(yī)生的判斷和每個(gè)患者的情況來決定，例如根據(jù)每個(gè)患者的病癥和免疫狀態(tài)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)。
在本發(fā)明的另一方面，提供用于移植器官的灌注和保存的灌注液或灌注用溶液，所述灌注液包括保護(hù)效應(yīng)細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞、組織或器官有效量的紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子。移植包括但不限于異體移植和自體移植，所述異體移植也就是從供體收獲器官(包括細(xì)胞、組織或其它機(jī)體部分)并移植到不同受體中；所述自體移植也就是器官?gòu)臋C(jī)體的一部分取出并取代另一部分，包括其中器官被取出、離體、切除、修補(bǔ)或進(jìn)行其它操作例如腫瘤切除、然后放回原先位置的離體外科手術(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述灌注液是威斯康星大學(xué)(UW)溶液(美國(guó)專利第4,798,824號(hào))，所述溶液含有約1U/ml至約25U/ml紅細(xì)胞生成素、5％羥乙基淀粉(分子量為約200,000至約300,000，并且基本上不含乙二醇、2-氯乙醇、氯化鈉和丙酮)；25mMKH2PO4；3mM谷胱甘肽；5mM腺苷；10mM葡萄糖；10mM HEPES緩沖液；5mM葡萄糖酸鎂；1.5mM CaCl2；105mM葡萄糖酸鈉；200,000單位青霉素；40單位胰島素；16mg地塞米松；12mg酚紅；并且pH為7.4-7.5和摩爾滲透壓濃度約為320mOsm/l。所述溶液用于在移植前維持尸體的腎臟和胰臟。使用所述溶液，保存期可延長(zhǎng)超過推薦用于尸體腎臟保存的30小時(shí)的極限。該具體的灌注液僅僅用來說明包含有效量的紅細(xì)胞生成素和/或組織保護(hù)性細(xì)胞因子的大量的溶液可適于目前的使用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述灌注液含有約1ng/ml至約500ng/ml紅細(xì)胞生成素，或約40ng/ml至約320ng/ml紅細(xì)胞生成素。如上所述，在本發(fā)明的該方面，可以使用任何形式的紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子。
雖然用于本文目的的組織保護(hù)性細(xì)胞因子的優(yōu)選受體是人，但是本文的方法可同樣應(yīng)用于其它哺乳動(dòng)物、尤其是馴養(yǎng)動(dòng)物、家畜、陪伴動(dòng)物和動(dòng)物園動(dòng)物。然而，本發(fā)明并不限于此，其益處可應(yīng)用于任何哺乳動(dòng)物。
在本發(fā)明的另一個(gè)離體的方面，例如但不限于上述紅細(xì)胞生成素和任何組織保護(hù)性細(xì)胞因子都可以使用。
在本發(fā)明的另一方面，提供用于增強(qiáng)沒有因內(nèi)皮細(xì)胞屏障而與血管系統(tǒng)隔離的細(xì)胞、組織或器官活力的方法和組合物，即通過將所述細(xì)胞、組織或器官直接接觸包含紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子的藥用組合物，或者將包含紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子的藥用組合物給予或接觸所述細(xì)胞、組織或器官的血管系統(tǒng)。在被處理組織或器官中效應(yīng)細(xì)胞增強(qiáng)的活性是積極效應(yīng)發(fā)揮作用的原因。
如上所述，本發(fā)明部分基于以下發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞生成素分子可以從具有內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接器官的毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞管腔表面轉(zhuǎn)運(yùn)到基底膜表面，所述內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接包括例如腦、視網(wǎng)膜和睪丸。因此，穿越屏障的效應(yīng)細(xì)胞是易受紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子的有益影響的靶，而含有效應(yīng)細(xì)胞和全部或部分依賴效應(yīng)細(xì)胞的其它細(xì)胞類型或組織或器官也是本發(fā)明方法的靶。雖然不希望受任何具體理論的束縛，但是在紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子的胞轉(zhuǎn)作用后，紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子可以與如下效應(yīng)細(xì)胞上的紅細(xì)胞生成素受體相互作用例如，神經(jīng)元細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、肌細(xì)胞、心細(xì)胞、肺細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、小腸細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、卵巢細(xì)胞或子宮內(nèi)膜細(xì)胞，并且受體結(jié)合可以啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致所述效應(yīng)細(xì)胞或組織內(nèi)基因表達(dá)程序的激活，導(dǎo)致保護(hù)所述細(xì)胞或組織或器官免遭例如毒素、化療藥、放療、低氧等損傷。因此，在下文中詳細(xì)描述了用于保護(hù)含效應(yīng)細(xì)胞的組織免遭損傷或低氧應(yīng)激反應(yīng)并增強(qiáng)所述組織功能的方法。
在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的實(shí)踐中，哺乳動(dòng)物患者經(jīng)歷了用于治療癌癥的全身化療，包括通常具有神經(jīng)損害、肺損傷、心臟損傷、卵巢損傷或睪丸損傷等副作用的放療。在化療和/或放療之前和同時(shí)給予包含上述紅細(xì)胞生成素和/或組織保護(hù)性細(xì)胞因子的藥用組合物，以保護(hù)各種組織和器官免遭化療藥的損傷，例如保護(hù)睪丸。治療可持續(xù)到化療藥在循環(huán)中的水平降至對(duì)哺乳動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生潛在危險(xiǎn)的水平之下。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案的實(shí)踐中，計(jì)劃從車禍的受害者收獲各種器官用于移植給多個(gè)受體，這其中有些需要長(zhǎng)距離和長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)輸。在收獲器官之前，用包含如本文所述的紅細(xì)胞生成素和/或組織保護(hù)性細(xì)胞因子的藥用組合物輸注受害者。用于運(yùn)輸?shù)氖斋@的器官用含有如本文所述的紅細(xì)胞生成素和/或組織保護(hù)性細(xì)胞因子的灌注液灌注，并貯存在包含紅細(xì)胞生成素和/或組織保護(hù)性細(xì)胞因子的浸泡液中。某些器官用脈沖式灌注設(shè)備、用含有根據(jù)本發(fā)明的紅細(xì)胞生成素和/或組織保護(hù)性細(xì)胞因子的灌注液持續(xù)灌注。在運(yùn)輸和移植和器官原位再灌注過程中，器官功能發(fā)生最小限度的退化。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，恢補(bǔ)心臟瓣膜的外科手術(shù)需要暫時(shí)的心麻痹和動(dòng)脈閉塞。術(shù)前給患者輸注組織保護(hù)性細(xì)胞因子即每公斤體重4μg氨甲?；撏僖核峒t細(xì)胞生成素。所述治療預(yù)防含氧量低的局部缺血性細(xì)胞損傷、尤其是在再灌注后。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在任何外科手術(shù)例如心肺分流術(shù)中，可使用本發(fā)明的天然存在的紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，在分流術(shù)之前、期間和/或之后，給予包含上述紅細(xì)胞生成素和/或組織保護(hù)性細(xì)胞因子的藥用組合物，以保護(hù)腦、心臟和其它器官的功能。
在其中本發(fā)明天然存在的紅細(xì)胞生成素和/或組織保護(hù)性細(xì)胞因子用于離體應(yīng)用、或處理效應(yīng)細(xì)胞例如神經(jīng)元組織、視網(wǎng)膜組織、心細(xì)胞、肺細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、小腸細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、卵巢細(xì)胞或子宮內(nèi)膜細(xì)胞或組織的上述實(shí)例中，本發(fā)明提供這樣一種藥用組合物，其劑量單位形式適用于保護(hù)或增強(qiáng)離開血管系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞、組織或器官，所述組合物包含劑量范圍約為1pg-5mg、500pg-5mg、1ng-5mg、500ng-5mg、1μg-5mg、500μg-5mg或1mg-5mg的組織保護(hù)性細(xì)胞因子，以及藥學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子的量在約1pg-1mg范圍內(nèi)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述制劑含有非紅細(xì)胞發(fā)生的組織保護(hù)性細(xì)胞因子。
在本發(fā)明的另一方面，發(fā)現(xiàn)給予經(jīng)歷腦創(chuàng)傷的動(dòng)物組織保護(hù)性細(xì)胞因子能恢復(fù)認(rèn)知功能。延遲或者5天或者30天后，與安慰劑治療動(dòng)物相比，給予紅細(xì)胞生成素仍能恢復(fù)功能，這表明紅細(xì)胞生成素再生或恢復(fù)腦活動(dòng)的能力。因此，本發(fā)明也涉及紅細(xì)胞生成素和/或組織保護(hù)性細(xì)胞因子在制備用于治療腦創(chuàng)傷(包括在損傷后很久例如3天、5天、1周、1月或更長(zhǎng)時(shí)間的治療)和其它認(rèn)知功能障礙的藥用組合物中的用途。本發(fā)明也涉及用于在損傷后通過給予有效量的紅細(xì)胞生成素和/或組織保護(hù)性細(xì)胞因子治療認(rèn)知功能障礙的方法。如本文所述的任何紅細(xì)胞生成素和/或組織保護(hù)性細(xì)胞因子可用于本發(fā)明的這一方面。
此外，本發(fā)明的這一恢復(fù)方面涉及本文的任何紅細(xì)胞生成素和/或組織保護(hù)性細(xì)胞因子在制備用于恢復(fù)細(xì)胞、組織或器官功能障礙的藥用組合物中的用途，其中在導(dǎo)致所述功能障礙的最初傷害之后開始治療和之后很久開始治療。此外，用本發(fā)明的紅細(xì)胞生成素和/或組織保護(hù)性細(xì)胞因子進(jìn)行治療可以在急性期以及慢性期跨過疾病或病癥的病程中。
在其中本發(fā)明紅細(xì)胞生成素具有紅細(xì)胞生成活性的情況下，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素每次給藥可以以介于約1μg和約100μg/kg體重之間、最好約5-50μg/kg體重、最優(yōu)選約10-30μg/kg體重的劑量系統(tǒng)給藥。在給予紅細(xì)胞生成素后，該有效劑量應(yīng)足以達(dá)到血清中大于約10,000mU/ml、15,000mU/ml或20,000mU/ml(80ng/ml、120ng/ml或160ng/ml)的紅細(xì)胞生成素的血清水平。所述血清水平在給藥后約1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)、7小時(shí)、8小時(shí)、9小時(shí)或10小時(shí)可以達(dá)到。如有必要，所述給藥可以重復(fù)。例如，只要臨床需要，可以每天重復(fù)給藥，或者在合適間隔后重復(fù)給藥，例如每1-12周、最好每1-3周。在一個(gè)實(shí)施方案中，有效量的紅細(xì)胞生成素和藥學(xué)上可接受的載體可以包裝成單劑量小瓶或其它容器。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用能發(fā)揮其活性、但不引起血紅蛋白濃度或血細(xì)胞比容增加的組織保護(hù)性細(xì)胞因子。在其中預(yù)期長(zhǎng)期提供本發(fā)明的方法的情況下，優(yōu)選所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，以大于最大刺激紅細(xì)胞發(fā)生所需劑量給予紅細(xì)胞生成素。如上所述，本發(fā)明的組織保護(hù)性細(xì)胞因子不一定具有紅細(xì)胞生成活性，因此以上用造血單位表示的劑量對(duì)紅細(xì)胞發(fā)生的紅細(xì)胞生成素來說僅僅是示例性的；在上文中，提供用于組織保護(hù)性細(xì)胞因子的劑量相當(dāng)?shù)闹亓俊?br> 在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)，確定本發(fā)明組合物在預(yù)防、治療或緩解炎癥相關(guān)的一種或多種癥狀中的有效量。在制劑中使用的精確劑量也可根據(jù)給藥途徑、病癥的嚴(yán)重程度，并應(yīng)根據(jù)醫(yī)生的判斷和每個(gè)哺乳動(dòng)物的情況來確定?？梢詮捏w外或動(dòng)物模型試驗(yàn)系統(tǒng)的劑量反應(yīng)曲線外推有效劑量。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，用于給予哺乳動(dòng)物以預(yù)防、治療或緩解炎癥相關(guān)的一種或多種癥狀的本發(fā)明組合物或預(yù)防劑或治療劑的劑量按哺乳動(dòng)物每公斤體重為150μg/kg或以下、優(yōu)選125μg/kg或以下、100μg/kg或以下、95μg/kg或以下、90μg/kg或以下、85μg/kg或以下、80μg/kg或以下、75μg/kg或以下、70μg/kg或以下、65μg/kg或以下、60μg/kg或以下、55μg/kg或以下、50μg/kg或以下、45μg/kg或以下、40μg/kg或以下、35μg/kg或以下、30μg/kg或以下、25μg/kg或以下、20μg/kg或以下、15μg/kg或以下、10μg/kg或以下、5μg/kg或以下、2.5μg/kg或以下、2μg/kg或以下、1.5μg/kg或以下、1μg/kg或以下、0.5μg/kg或以下或0.5μg/kg或以下。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于給予哺乳動(dòng)物以預(yù)防、治療或緩解炎癥相關(guān)的一種或多種癥狀的本發(fā)明組合物或預(yù)防劑或治療劑的劑量是0.1mg-20mg、0.1mg-15mg、0.1mg-12mg、0.1mg-10mg、0.1mg-8mg、0.1mg-7mg、0.1mg-5mg、0.1-2.5mg、0.25mg-20mg、0.25-15mg、0.25-12mg、0.25-10mg、0.25-8mg、0.25-7mg、0.25mg-5mg、0.5mg-2.5mg、1mg-20mg、1mg-15mg、1mg-12mg、1mg-10mg、1mg-8mg、1mg-7mg、1mg-5mg或1mg-2.5mg的單位劑量。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，給予患者一劑或多劑的預(yù)防或治療有效量的一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑，其中給予所述患者預(yù)防或治療有效量的所述藥物的劑量在所述患者體內(nèi)達(dá)到平均絕對(duì)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)約為500細(xì)胞/mm3至低于1500細(xì)胞/mm3，優(yōu)選低于1400細(xì)胞/mm3、低于1300細(xì)胞/mm3、低于1250細(xì)胞/mm3、低于1200細(xì)胞/mm3、低于1100細(xì)胞/mm3或低于1000細(xì)胞/mm3。
本發(fā)明還涉及用于促進(jìn)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的分子轉(zhuǎn)運(yùn)穿越內(nèi)皮細(xì)胞屏障的方法，即通過給予包含與上文所述紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子締合的特定分子的組合物。如上所述，機(jī)體的某些器官中內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接對(duì)某些分子的進(jìn)入產(chǎn)生屏障。對(duì)于在屏障器官內(nèi)各種病癥的治療，需要促進(jìn)藥用制劑穿越的手段。本發(fā)明的紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子用作載體，用于傳遞其它分子穿越血-腦屏障或其它類似屏障。制備包含希望穿越屏障的分子以及紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子的組合物，并將所述組合物外周給藥，導(dǎo)致所述組合物通過胞轉(zhuǎn)作用穿越屏障。待轉(zhuǎn)運(yùn)以穿越屏障的分子和紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子之間的締合可以是不穩(wěn)定的共價(jià)鍵，在這種情況下當(dāng)穿越屏障后所述分子從與紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子的締合中被釋放出來。如果所述分子與紅細(xì)胞生成素和/或組織保護(hù)性細(xì)胞因子間的締合仍能保持或不影響所述分子所需藥理學(xué)活性的話，可以給予所述復(fù)合物。
技術(shù)人員知道用于將分子與本發(fā)明的紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子和上述其它藥物締合的各種方式，即通過共價(jià)、非共價(jià)和其它方式。此外，在實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中可容易地進(jìn)行所述化合物功效的評(píng)價(jià)?？梢酝ㄟ^包括不穩(wěn)定的、共價(jià)結(jié)合、交聯(lián)等在內(nèi)的各種方式達(dá)到分子與紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子的締合?？墒褂蒙锼?抗生物素蛋白的相互作用；例如，本發(fā)明的生物素化紅細(xì)胞生成素可以與抗生物素蛋白和希望轉(zhuǎn)運(yùn)的分子的不穩(wěn)定綴合物復(fù)合。如上所述，可以通過重組或合成方式制備雜種分子，例如包含具有所需藥理學(xué)活性的分子的結(jié)構(gòu)域和負(fù)責(zé)紅細(xì)胞生成素受體活性調(diào)節(jié)的結(jié)構(gòu)域的融合多肽或嵌合多肽。在所述分子內(nèi)可以包含蛋白酶切割位點(diǎn)。
一個(gè)分子可以通過多官能分子即多官能交聯(lián)劑與本發(fā)明的紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子綴合。本文所用的術(shù)語(yǔ)“多官能分子”包括具有能不止一次連續(xù)反應(yīng)的官能團(tuán)的分子例如甲醛，以及具有不止一個(gè)活性基團(tuán)的分子。本文所用的術(shù)語(yǔ)“活性基團(tuán)”是指交聯(lián)劑上與分子(例如有待穿越內(nèi)皮細(xì)胞屏障而傳遞的肽、蛋白、糖、核酸、尤其是激素抗生素或抗癌藥)上的官能團(tuán)反應(yīng)形成交聯(lián)劑和所述分子間共價(jià)鍵的官能團(tuán)。術(shù)語(yǔ)“官能團(tuán)”保留其在有機(jī)化學(xué)中的標(biāo)準(zhǔn)含義。可以使用的所述多官能分子最好是生物相容性連接劑，即它們?cè)隗w內(nèi)是非致癌的、無(wú)毒的和基本上沒有免疫原性的。在動(dòng)物模型中可以容易地檢測(cè)例如本領(lǐng)域已知的和在本文中描述的多官能交聯(lián)劑，以確定它們的生物相容性。所述多官能分子最好是雙官能的。本文所用的術(shù)語(yǔ)“雙官能分子”是指具有兩個(gè)活性基團(tuán)的分子。所述雙官能分子可以是異型雙官能分子或同型雙官能分子。異型雙官能交聯(lián)劑允許矢量結(jié)合。特別優(yōu)選多官能分子在水中具有足夠溶解性，因?yàn)榻宦?lián)反應(yīng)發(fā)生在水溶液例如pH6-8的緩沖水溶液中，而且為了更有效的生物分布，所得綴合物保持水溶性。通常，多官能分子與氨基或巰基官能團(tuán)共價(jià)鍵合。然而，與其它官能團(tuán)例如羧酸或羥基反應(yīng)的多官能分子也包括在本發(fā)明中。
同型雙官能分子具有至少兩個(gè)相同的活性官能團(tuán)。同型雙官能分子上的活性官能團(tuán)包括例如醛基和活性酯基團(tuán)。具有醛基的同型雙官能分子包括例如戊二醛和subaraldehyde。戊二醛作為交聯(lián)劑的應(yīng)用公開于Poznansky等，Science 223，1304-1306(1984)。具有至少兩個(gè)活性酯單元的同型雙官能分子包括二羧酸和N-羥基琥珀酰亞胺的酯。N-琥珀酰亞胺酯的一些實(shí)例包括二琥珀酰亞胺基辛二酸二琥珀酰亞胺酯和二硫代-雙-(琥珀酰亞胺基丙酸酯)及其可溶性雙磺酸和雙磺酸鹽例如它們的鈉鹽或鉀鹽。這些同型雙官能試劑可得自Pierce、Rockford、Illinois。
異型雙官能分子具有至少兩個(gè)不同的活性基團(tuán)。所述活性基團(tuán)與不同官能團(tuán)(例如紅細(xì)胞生成素和所述分子上存在的基團(tuán))反應(yīng)。與異型雙官能交聯(lián)劑上活性基團(tuán)反應(yīng)的這兩個(gè)不同官能團(tuán)通常是氨基，例如賴氨酸的ε氨基；巰基，例如半胱氨酸的巰基；羧酸例如天冬氨酸上的羧酸酯基；或羥基例如絲氨酸上的羥基。
當(dāng)然，本發(fā)明的各種組織保護(hù)性細(xì)胞因子中的某些細(xì)胞因子和紅細(xì)胞生成素可以沒有適于與某種交聯(lián)劑反應(yīng)的基團(tuán)；然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將充分理解，根據(jù)用于與本發(fā)明紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子交聯(lián)的可用基團(tuán)來選擇交聯(lián)劑。
當(dāng)異型雙官能分子活性基團(tuán)與氨基形成共價(jià)鍵時(shí)，所述共價(jià)鍵通常是酰氨鍵或亞氨鍵。與氨基形成共價(jià)鍵的活性基團(tuán)可以是例如活化的羧酸酯基、鹵羰基或酯基。所述鹵羰基最好是氯羰基。酯基最好是例如N-羥基-琥珀酰亞胺酯基等活性酯基。
通常，其它官能團(tuán)可以是巰基、能轉(zhuǎn)化成巰基的基團(tuán)或能與巰基形成共價(jià)鍵的基團(tuán)。通常，所述共價(jià)鍵是硫醚鍵或二硫鍵。與巰基形成共價(jià)鍵的活性基團(tuán)可以是例如與巰基或活化的二硫化物反應(yīng)的雙鍵。含有能與巰基反應(yīng)的雙鍵的活性基團(tuán)可以是馬來酰亞胺基和其它基團(tuán)，例如丙烯腈。活性二硫鍵可以是例如2-吡啶二硫代基或5，5′-二硫代-雙-(2-硝基苯甲酸)基團(tuán)。含有活性二硫鍵的異型雙官能試劑的一些實(shí)例包括3-(2-吡啶-二硫代)丙酸N-琥珀酰亞胺酯(Carlsson等，1978，Biochem J.，173723-737)、S-4-琥珀酰亞胺基氧羰基-α-甲基芐基硫代硫酸鈉和4-琥珀酰亞胺基氧羰基-α-甲基-(2-吡啶二硫代)甲苯。優(yōu)選3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亞胺酯。包含具有與巰基反應(yīng)的雙鍵的活性基團(tuán)的異型雙官能試劑的一些實(shí)例包括4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯和間馬來酰亞胺苯甲酸琥珀酰亞胺酯。
其它異型雙官能分子包括3-(馬來酰亞胺)丙酸琥珀酰亞胺酯、4-(對(duì)馬來酰亞胺-苯基)丁酸磺基琥珀酰亞胺酯、4-(N-馬來酰亞胺甲基-環(huán)己烷)-1-羧酸磺基琥珀酰亞胺酯、馬來酰亞胺苯甲?；?N-羥基-琥珀酰亞胺酯。優(yōu)選間馬來酰亞胺苯甲酸琥珀酰亞胺酯的磺酸鈉鹽。許多上述異型雙官能試劑及其磺酸鹽可得自Pierce Chemical Co.，Rockford，Illinois USA。
技術(shù)人員可以容易地確定對(duì)上述綴合是可逆的或不穩(wěn)定的需要?？梢栽隗w外測(cè)試綴合物的紅細(xì)胞生成素和所需藥理學(xué)活性。如果所述綴合物保留這兩種特性，則其適合性可以在體內(nèi)進(jìn)行檢驗(yàn)。如果所述綴合的分子需要按活性從紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子中分離出來，優(yōu)選與紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子的不穩(wěn)定鍵合或可逆締合。在體內(nèi)試驗(yàn)之前，用標(biāo)準(zhǔn)體外方法也可以測(cè)試不穩(wěn)定特性。
有關(guān)怎樣制備和使用它們以及其它多官能試劑的額外信息可從下列出版物或本領(lǐng)域其它可用信息中得到1.Carlsson，J.等，1978，Biochem.J.173723-737.
2.Cumber，J.A.等，1985，Methods in Enzymology 112207-224.
3.Jue，R.等，1978，Biochem 175399-5405.
4.Sun，T.T.等，1974，Biochem.132334-2340.
5.Blattler，W.A.等，1985，Biochem.241517-152.
6.Liu，F(xiàn).T.等，1979，Biochem.18690-697.
7.Youle，R.J.和Neville，D.M.Jr.，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.775483-5486.
8.Lerner，R.A.等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.783403-3407.
9.Jung，S.M.和Moroi，M.，1983，Biochem.Biophys.Acta 761162.
10.Caulfield，M.P.等，1984，Biochem.817772-7776.
11.Staros，J.V.，1982，Biochem.213950-3955.
12.Yoshitake，S.等，1979，Eur.J.Biochem.101395-399.
13.Yoshitake，S.等，1982，J.Biochem.921413-1424.
14.Pilch，P.F.和Czech，M.P.，1979，J.Biol.Chem.2543375-3381.
15.Novick，D.等，1987，J.Biol.Chem.2628483-8487.
16.Lomant，A.J.和Fairbanks，G.，1976，J.Mol.Biol.104243-261.
17.Hamada，H.和Tsuruo，T.，1987，Anal.Biochem.160483-488.
18.Hashida，S.等，1984，J.Applied Biochem.656-63.
此外，交聯(lián)方法的綜述參見Means和Feeney，1990，BioconjugateChem.12-12。
本發(fā)明的上述方法和組合物所穿越的屏障包括但不限于血-腦屏障、血-眼屏障、血-睪屏障、血-卵巢屏障和血-子宮屏障。
用于轉(zhuǎn)運(yùn)穿越內(nèi)皮細(xì)胞屏障的候選分子包括例如激素例如生長(zhǎng)激素、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、抗生素、抗病毒藥、或者通常被腦和其它屏障保護(hù)的器官排除在外的抗真菌藥、肽類放射性藥物、反義藥物、抗生物活性因子的抗體和抗病毒藥、藥用物質(zhì)和抗癌藥。所述分子的非限制性實(shí)例包括激素例如生長(zhǎng)激素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(TGFβ2)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3(TGFβ3)、白介素1、白介素2、白介素3和白介素6、AZT、抗腫瘤壞死因子的抗體和免疫抑制藥例如環(huán)孢菌素。此外，為了診斷目的而顯現(xiàn)腦和其它屏障器官內(nèi)的細(xì)胞、組織或器官，可以將染料或標(biāo)記連接到紅細(xì)胞生成素上或本發(fā)明組織保護(hù)性細(xì)胞因子之一上。作為一個(gè)實(shí)例，為了確定患者體內(nèi)早老性癡呆的進(jìn)程，可以將用于顯現(xiàn)腦內(nèi)病斑的標(biāo)記連接到紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子。
本發(fā)明也涉及一種包含待通過胞轉(zhuǎn)作用穿越內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接屏障而轉(zhuǎn)運(yùn)的分子和上述紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子的組合物。本發(fā)明還涉及分子和上述紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子間的綴合物在制備用于遞送所述分子穿越上述屏障的藥用組合物中的用途。
在以下實(shí)施例中，提供神經(jīng)保護(hù)和胞轉(zhuǎn)作用的各種動(dòng)物模型和體外試驗(yàn)，以證明本發(fā)明組織保護(hù)性細(xì)胞因子的效力。所述模型包括使用P-19細(xì)胞的體外模型和小鼠體內(nèi)水中毒模型，所述體外模型用來測(cè)定所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，而所述體內(nèi)模型用來測(cè)定本發(fā)明的組織保護(hù)性細(xì)胞因子的體內(nèi)神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。對(duì)于胞轉(zhuǎn)作用，評(píng)價(jià)與本發(fā)明紅細(xì)胞生成素綴合的模型蛋白在胃腸外給藥后轉(zhuǎn)運(yùn)到腦內(nèi)。這些在體外模型和動(dòng)物模型中的試驗(yàn)預(yù)測(cè)本發(fā)明化合物在包括人在內(nèi)的其它各種哺乳動(dòng)物中的功效。此外，實(shí)施例1證明人腦具有大量紅細(xì)胞生成素受體，提供了紅細(xì)胞生成素以及組織保護(hù)性細(xì)胞因子的胞轉(zhuǎn)作用的機(jī)制。
通過參考以下作為本發(fā)明示例性的非限制性實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。提供以下實(shí)施例是為了更充分說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。然而，它們決不應(yīng)該以任何方式限制本發(fā)明的寬范圍。
實(shí)施例1紅細(xì)胞生成素受體在人腦中的分布在外科手術(shù)中切取的正常人腦(例如在腫瘤切除術(shù)中提供無(wú)腫瘤邊緣)立即放在5％丙烯醛的0.1M磷酸緩沖液(pH7.4)中固定3小時(shí)。用振動(dòng)切片機(jī)切成40微米厚的切片。用自由漂浮切片并采用間接抗體過氧化物酶-抗過氧化物酶方法，用1∶500稀釋度的紅細(xì)胞生成素受體抗血清(得自Santa Cruz Biotechnology)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。用過氧化氫預(yù)處理組織切片，猝滅內(nèi)源過氧化物酶活性(3％過氧化氫的甲醇溶液處理30分鐘)。也通過第一抗體省略并通過使用合適的封閉性肽(得自Santa Cruz Biotech.)處理組織對(duì)照，證實(shí)染色對(duì)紅細(xì)胞生成素(EPO)受體是特異性的。
圖1顯示通過使用特異性抗EPO受體的抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)測(cè)定，人腦毛細(xì)血管表達(dá)非常高水平的EPO受體。這提供了EPO之所以能從體循環(huán)穿透血腦屏障進(jìn)入大腦的機(jī)制。
圖2顯示EPO受體集中位于人腦中形成血腦屏障的毛細(xì)血管中及其周圍。
圖3中進(jìn)行了與圖1和圖2類似的方案，除了10微米切片是用石蠟切片、包埋的切片浸泡在4％低聚甲醛中固定以外。圖3顯示人腦毛細(xì)血管管腔表面和反面的高密度EPO受體，構(gòu)成將EPO從循環(huán)運(yùn)輸?shù)侥X內(nèi)的解剖學(xué)基礎(chǔ)。
圖4是得自與圖3類似的方案，除了組織用超薄切片機(jī)切片并供電鏡用、第二抗體用膠體金顆粒標(biāo)記外。該圖顯示，發(fā)現(xiàn)EPO受體在人腦的內(nèi)皮表面(*)上、在胞質(zhì)小泡(箭頭)內(nèi)和在神經(jīng)膠質(zhì)突觸小結(jié)(+)上，提供了EPO從循環(huán)運(yùn)輸?shù)侥X內(nèi)的解剖學(xué)基礎(chǔ)。
實(shí)施例2組織保護(hù)性細(xì)胞因子如本文所述用途所需的組織保護(hù)性細(xì)胞因子可以通過如下方法產(chǎn)生胍化、氨甲酰化、酰胺化、三硝基苯基化、乙酰化、琥珀?；⑾趸?，或者在上文提到的其它方法中對(duì)紅細(xì)胞生成素的精氨酸或賴氨酸殘基或羧基的修飾。這些修飾產(chǎn)生保留其對(duì)特殊器官和組織的活性、但沒有保留其對(duì)其它器官的組織例如紅細(xì)胞的活性的組織保護(hù)性細(xì)胞因子。當(dāng)紅細(xì)胞生成素經(jīng)歷以上反應(yīng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)所得的分子通常缺乏體內(nèi)和體外紅細(xì)胞生成活性(例如Satake等；1990，Biochim.Biophys.Acta 1038125-9)。下面描述了制備組織保護(hù)性細(xì)胞因子的一些實(shí)施例。盡管以下實(shí)施例用紅細(xì)胞生成素作為原料，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，也可以使用脫唾液酸化紅細(xì)胞生成素、胍化紅細(xì)胞生成素、氨甲?；t細(xì)胞生成素、酰胺化紅細(xì)胞生成素、三硝基苯基化紅細(xì)胞生成素、乙?；t細(xì)胞生成素、琥珀?；t細(xì)胞生成素、硝化紅細(xì)胞生成素等紅細(xì)胞生成素衍生物。
A.通過脫唾液酸紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生組織保護(hù)性細(xì)胞因子可以通過以下示例性方法，將紅細(xì)胞生成素進(jìn)行脫唾液酸。唾液酸酶(分離自鏈球菌(Streptococcacs sp)6646K.)得自SEIKAGAKUAMERICA(編號(hào)120050)。紅細(xì)胞生成素用唾液酸酶(0.05U/mg EPO)于37℃處理3小時(shí)以脫唾液酸。反應(yīng)混合物用Ultrafree離心過濾單元脫鹽并濃縮。然后樣品加樣到AKTAprimeTM系統(tǒng)的離子交換柱。蛋白用所選緩沖液洗脫。然后用含有大量蛋白的洗脫流分進(jìn)行IEF凝膠分析。合并只含最上兩個(gè)條帶的流分(在IEF凝膠上在pI～8.5和pI～7.9遷移)，測(cè)定合并流分的蛋白質(zhì)含量，加入1/9體積的10x鹽溶液(1M NaCl、0.2M檸檬酸鈉、3mM檸檬酸)。然后測(cè)定溶液的唾液酸含量。應(yīng)該檢測(cè)不到明顯的唾液酸含量。
如圖5-6所示，脫唾液酸紅細(xì)胞生成素和苯基乙二醛紅細(xì)胞生成素在體外對(duì)神經(jīng)細(xì)胞同天然紅細(xì)胞生成素一樣有效。用經(jīng)歷了去除血清后細(xì)胞凋亡的神經(jīng)樣胚胎癌性細(xì)胞(P19)進(jìn)行體外試驗(yàn)。在去除血清后24小時(shí)，向培養(yǎng)物中加入1-1000ng/ml紅細(xì)胞生成素或修飾紅細(xì)胞生成素。翌日去除培養(yǎng)基，用不含血清的新鮮培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，向培養(yǎng)物中加入含有試驗(yàn)物質(zhì)的培養(yǎng)基(無(wú)血清)，再培養(yǎng)48小時(shí)。為了測(cè)定活細(xì)胞數(shù)，進(jìn)行四氮唑還原試驗(yàn)(CellTiter 96；Promega，Inc.)。如圖5-6所示，脫唾液酸紅細(xì)胞生成素顯示出同紅細(xì)胞生成素本身在防止細(xì)胞死亡中的同等效力。
用大鼠局灶性局部缺血模型證實(shí)體內(nèi)神經(jīng)保護(hù)活性的持久性，在所述模型中可以如前所述形成中腦動(dòng)脈區(qū)可逆損害(Brines等，2000，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.9710526-31)。在Sprague-Dawley成年雄性大鼠動(dòng)脈閉塞發(fā)作時(shí)，給予脫唾液酸紅細(xì)胞生成素或紅細(xì)胞生成素(5000U(40μg)/kgBW腹膜內(nèi))或溶媒。24小時(shí)后，處死動(dòng)物取腦供研究用。進(jìn)行連續(xù)切片并用四氮唑鹽染色以鑒定腦內(nèi)的存活區(qū)。如圖7所示，脫唾液酸紅細(xì)胞生成素在1小時(shí)局部缺血時(shí)提供神經(jīng)保護(hù)同天然紅細(xì)胞生成素一樣有效。圖8顯示另一個(gè)局灶性局部缺血模型的結(jié)果，其中用紅細(xì)胞生成素和脫唾液酸紅細(xì)胞生成素進(jìn)行比較劑量反應(yīng)。在250U(2μg)/kg的最低劑量時(shí)，脫唾液酸紅細(xì)胞生成素提供保護(hù)，而未修飾的紅細(xì)胞生成素不提供保護(hù)。
B.通過氨甲酰化紅細(xì)胞生成素制備組織保護(hù)性細(xì)胞因子按照如Jin Zeng(1991)描述的以下方法，天然紅細(xì)胞生成素可用于制備相應(yīng)的氨甲?；肿?。通過氨甲?；碗一磻?yīng)對(duì)金屬硫蛋白進(jìn)行賴氨酸修飾。Methods in Enzymology 205433-437。首先，將氰酸鉀重結(jié)晶。制備1M硼酸緩沖液(pH8.8)。將紅細(xì)胞生成素溶液與等體積硼酸緩沖液混合。將氰酸鉀直接加入到反應(yīng)管，至終濃度為0.5M。將溶液混合均勻并于37℃保溫6小時(shí)。然后用蒸餾水徹底透析溶液。從透析管中取出產(chǎn)物，收集到新的試管中。測(cè)量體積，向溶液中加入1/9體積的10X鹽溶液(1M NaCl、0.2M檸檬酸鈉、3mM檸檬酸)。測(cè)定蛋白質(zhì)含量，計(jì)算產(chǎn)物回收率。通過IEF凝膠以及用TF-1細(xì)胞體外試驗(yàn)來分析產(chǎn)物。
C.通過琥珀?；t細(xì)胞生成素制備組織保護(hù)性細(xì)胞因子按照如Alcalde等(2001)描述的以下方法，天然紅細(xì)胞生成素可用于制備相應(yīng)的琥珀?；肿印碜詿釁捬鯒U菌(Thermoanaerobactersp.)501的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的琥珀?；磻?yīng)用淀粉作為供體時(shí)增強(qiáng)其轉(zhuǎn)移酶活性。J.Biotechnology 8671-80。紅細(xì)胞生成素(100μg)的0.5M NaHCO3(pH8.0)與15摩爾過量的琥珀酸酐在15℃保溫1小時(shí)。通過對(duì)蒸餾水透析終止反應(yīng)。
用于紅細(xì)胞生成素琥珀?；牧硪环N方法是將27mg/ml琥珀酸酐溶于無(wú)水丙酮中。反應(yīng)在10mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)的微量離心管中進(jìn)行。向試管中加入紅細(xì)胞生成素和50倍摩爾量的琥珀酸酐。將溶液混合均勻，試管于4℃旋轉(zhuǎn)1小時(shí)。用透析盒(Slide-A-Laze 7K，Pierce 66373)通過對(duì)10mM磷酸鈉緩沖液透析終止反應(yīng)。從透析管中取出產(chǎn)物，收集到新的試管中。測(cè)量體積，加入1/9體積的10X鹽溶液(1M NaCl、0.2M檸檬酸鈉、3mM檸檬酸)。測(cè)定蛋白質(zhì)含量，計(jì)算產(chǎn)物回收率。通過IEF凝膠以及用TF-1細(xì)胞體外試驗(yàn)來分析產(chǎn)物。
D.通過乙酰化紅細(xì)胞生成素制備組織保護(hù)性細(xì)胞因子按照如Satake等(1990)描述的以下方法，天然紅細(xì)胞生成素可用于制備相應(yīng)的乙?；肿印＜t細(xì)胞生成素的化學(xué)修飾通過胍化反應(yīng)增加體外活性。Biochimica et Biophysica Acta.1038125-129。
反應(yīng)在80mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)的微量離心管中進(jìn)行。向試管中加入紅細(xì)胞生成素和等摩爾量的乙酸酐?；旌暇鶆蚝?，溶液在冰上保溫1小時(shí)。用透析盒(Slide-A-Laze 7K，Pierce 66373)通過對(duì)水透析終止反應(yīng)。從透析盒中取出產(chǎn)物，收集到新的試管中。測(cè)量產(chǎn)物體積后，加入1/9體積的10X鹽溶液(1M NaCl、0.2M檸檬酸鈉、3mM檸檬酸)。測(cè)定蛋白質(zhì)含量，計(jì)算產(chǎn)物回收率。通過IEF凝膠以及用TF-1細(xì)胞體外試驗(yàn)來分析產(chǎn)物。
E.通過羧甲基化紅細(xì)胞生成素的賴氨酸制備組織保護(hù)性細(xì)胞因子按照如Akhtar等(1999)描述的以下方法，天然紅細(xì)胞生成素可用于制備相應(yīng)的Nε-(羧甲基)賴氨酸(CML)修飾分子，其中紅細(xì)胞生成素的一個(gè)或多個(gè)賴氨酰殘基被修飾。Conformational study of Nε-(carboxymethyl)lysine adducts of recombinant a-crystallins(重組a-晶體蛋白的Nε-(羧甲基)賴氨酸加合物的構(gòu)象研究).Current Eye Research，18270-276。
在磷酸鈉緩沖液(50mM，pH7.5)中制備乙醛酸(200mM)和NaBH3CN(120mM)。在微量離心管中，加入紅細(xì)胞生成素(溶于磷酸緩沖液)。然后計(jì)算出溶液中的賴氨酸等同物(約8個(gè)賴氨酸殘基/mol)。接著，向試管中加入3倍以上的NaBH3CN以及5倍以上或10倍以上的乙醛酸。每管蝸旋震蕩后，于37℃保溫5小時(shí)。樣品于4℃對(duì)磷酸緩沖液透析過夜。透析后，測(cè)量各產(chǎn)物體積。
測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，計(jì)算產(chǎn)物回收率。通過IEF凝膠以及用TF-1細(xì)胞體外試驗(yàn)來分析產(chǎn)物。
F.通過碘化紅細(xì)胞生成素制備組織保護(hù)性細(xì)胞因子按照如Pierce Chemical Company(Rockford，IL)提供的用于IODO-Gen預(yù)包埋碘化管(產(chǎn)品目錄號(hào)28601)的說明書描述的以下方法，天然紅細(xì)胞生成素可用于制備相應(yīng)的碘化分子。
1.制備0.1M的NaI，在IODO-Gen預(yù)包埋碘化管(產(chǎn)品目錄號(hào)28601)中用溶于磷酸鈉緩沖液(40mM，pH7.4)進(jìn)行碘化反應(yīng)，總反應(yīng)體積為0.1ml/管。蛋白底物(紅細(xì)胞生成素)與磷酸鈉緩沖液混合，然后轉(zhuǎn)移到IODO-Gen預(yù)包埋碘化管中。加入NaI，至終濃度為1-2mM，使NaI/蛋白摩爾比為14-20。然后將溶液混合均勻并在室溫下溫和攪拌中保溫15分鐘。通過除去反應(yīng)混合物終止反應(yīng)，向其中加入一管3.9ml鈉緩沖液(即40倍稀釋)。通過預(yù)先潤(rùn)濕的Ultrafree離心過濾單元濃縮產(chǎn)物。測(cè)定濃縮液體積，加入1/9體積的10X鹽溶液(1MNaCl、0.2M檸檬酸鈉、3mM檸檬酸)。測(cè)定蛋白質(zhì)含量，然后計(jì)算產(chǎn)物回收率。通過IEF凝膠以及用TF-1細(xì)胞體外試驗(yàn)來分析產(chǎn)物。
2.用于碘化紅細(xì)胞生成素的另一種方法涉及在含有1mCi游離Na123I的100μlPBS(20mM磷酸鈉，0.15M NaCl，pH7.5)中保溫碘珠(Pierce，Rockford，Il)達(dá)5分鐘。然后將溶于100μlPBS的紅細(xì)胞生成素(100μg)加入到混合物中。在室溫下保溫10分鐘后，通過從反應(yīng)容器中取出200μl溶液終止反應(yīng)(留下碘珠)。然后通過在Centricon10柱上進(jìn)行凝膠過濾除去過量碘。如圖9所示，按此法產(chǎn)生的碘化紅細(xì)胞生成素在去除血清的P19細(xì)胞保護(hù)中是有效的。
3.紅細(xì)胞生成素也可用氯胺T碘化。將溶于100μlPBS的紅細(xì)胞生成素(100μg)加入到500uCi N125I中，然后將混合物在微量離心管中混合在一起。然后加入25μl氯胺T(2mg/ml)，將混合物在室溫下保溫1分鐘。然后加入50μl氯胺T終止緩沖液(2.4mg/ml偏亞硫酸鈉、10mg/ml酪氨酸、10％甘油、0.1％二甲苯的PBS)。然后通過用Centricon 10柱進(jìn)行凝膠過濾，將碘化酪氨酸和碘化紅細(xì)胞生成素分開。
G.通過生物素化紅細(xì)胞生成素制備組織保護(hù)性細(xì)胞因子1.在Wojchowski等“Biotinylated recombinant humanerythropoietinsBioactivity and Utility as a receptor ligand(生物素化重組人紅細(xì)胞生成素作為受體的配體的生物活性和用途)”.Blood，1989，74(3)952-8中，作者采用使紅細(xì)胞生成素生物素酰化的3種不同方法。將生物素加入到(1)唾液酸部分(2)羧基和(3)氨基上。作者使用小鼠脾細(xì)胞增殖測(cè)定，證明(1)將生物素加入到唾液酸部分上不會(huì)使紅細(xì)胞生成素的生物學(xué)活性失活(2)將生物素加入到羧基上導(dǎo)致紅細(xì)胞生成素的生物學(xué)活性基本失活(3)將生物素加入到氨基上導(dǎo)致紅細(xì)胞生成素的生物學(xué)活性完全失活。這些方法和修飾全都包括在本文中。圖10顯示在血清饑餓P19測(cè)定中生物素化紅細(xì)胞生成素和脫唾液酸紅細(xì)胞生成素的活性。
2.此外，按照如Pierce Chemical Company(Rockford，IL)提供的用于EZ-Link NHS-LC-生物素(產(chǎn)品目錄號(hào)21336)說明書描述的以下方法，天然紅細(xì)胞生成素可用于制備相應(yīng)的生物素化分子。
就在反應(yīng)之前，將2mg/ml的EZ-Link NHS-LC-生物素(pierce，21336)溶于DMSO中。在盛有總體積1ml的含有50mM碳酸氫鈉(pH8.3)的試管(17×100mm)中進(jìn)行反應(yīng)。加入紅細(xì)胞生成素和＜10％的EZ-Link NHS-LC-生物素，產(chǎn)生生物素/蛋白摩爾比為～20的溶液。將溶液混合均勻并在冰上保溫2小時(shí)。溶液用Ultrafree離心過濾單元脫鹽并濃縮。然后將產(chǎn)物收集到新的試管中。測(cè)定產(chǎn)物體積，向產(chǎn)物中加入1/9體積的10X鹽溶液(1M NaCl、0.2M檸檬酸鈉、3mM檸檬酸)。測(cè)定產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量，然后計(jì)算產(chǎn)物回收率。通過IEF凝膠以及用TF-1細(xì)胞體外試驗(yàn)來分析產(chǎn)物。
3.采用如下方法，紅細(xì)胞生成素的游離氨基也可以被生物素化。首先，將0.2mg D-生物素-ε-氨基己酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(Boehringer Mannheim #1418165)溶于100μl DMSO中。然后將溶液在鋁箔蓋著的試管中與含有約0.2mg紅細(xì)胞生成素的400μl PBS混合。該溶液在室溫下保溫4小時(shí)后，通過在Centricon 10柱上進(jìn)行凝膠過濾分離出未反應(yīng)的生物素。
預(yù)期若干這些修飾可以在紅細(xì)胞生成素或紅細(xì)胞生成素衍生物上進(jìn)行，以便制備組織保護(hù)性細(xì)胞因子。例如，紅細(xì)胞生成素可以按照實(shí)施例2(A)所述方法進(jìn)行脫唾液酸，并按照實(shí)施例2(B)所述方法進(jìn)行氨甲?；?，產(chǎn)生脫唾液酸氨甲酰紅細(xì)胞生成素。
實(shí)施例3通過其它方法制備組織保護(hù)性細(xì)胞因子1.三硝基苯基化如Plapp等(“Activity of bovine pancreaticdeoxyribonuclease A with modified amino groups(具有修飾氨基的牛胰腺脫氧核糖核酸酶A的活性)”1971，J.Biol.Chem.246，939-845)描述的方法，紅細(xì)胞生成素(100μg)用2，4，6-三硝基苯磺酸鹽進(jìn)行修飾。
2.精氨酸修飾如Riordan(“Functional arginyl residues incarboxypeptidase A.Modification with butanedione(羧肽酶A中的功能性精氨酰殘基。用丁二酮修飾).”Riordan JF，Biochemistry 1973，12(20)3915-3923)描述的方法，紅細(xì)胞生成素用2，3-丁二酮進(jìn)行修飾。
3.如Patthy等(“Identification of functional arginine residues inribonuclease A and lysozyme(核糖核酸酶A和溶菌酶的功能性精氨酸殘基的鑒定).”Patthy，L，Smith EL，J.Biol.Chem 1975 250(2)565-9)描述的方法，紅細(xì)胞生成素用環(huán)己酮進(jìn)行修飾。
4.如Werber等(“ProceedingsCarboxypeptidase Bmodification offunctional arginyl residues(會(huì)議錄羧肽酶B功能性精氨酰殘基的修飾).”Werber，MM，Sokolovsky M Isr J Med Sci 1975 11(11)1169-70)描述的方法，紅細(xì)胞生成素用苯基乙二醛進(jìn)行修飾。苯基乙二醛修飾的紅細(xì)胞生成素用上述神經(jīng)樣P19細(xì)胞測(cè)定來檢測(cè)。如圖11所示，該化學(xué)修飾的紅細(xì)胞生成素完全保留其神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。
5.酪氨酸修飾如Nestler等“Stimulation of rat ovarian cellsteroidogenesis by high density lipoproteins modified withtetranitromethane(用四硝基甲烷修飾的高密度脂蛋白對(duì)大鼠卵巢細(xì)胞類固醇產(chǎn)生的刺激).”Nestler JE，Chacko GK，Strauss JF 3rd.J BiolChem 1985 Jun 25；260(12)7316-21)描述的方法，將紅細(xì)胞生成素(100μg)與四硝基甲烷一起保溫。
6.谷氨酸(和天冬氨酸)修飾如Caraway等“Carboxyl groupmodification in chymotrypsin and chymotrypsinogen(胰凝乳蛋白酶和胰凝乳蛋白酶原的羧基修飾).”Carraway KL，Spoerl P，Koshland DE Jr.JMol Biol 1969 May 28；42(1)133-7描述的方法，為了修飾羧基，在室溫下，將紅細(xì)胞生成素(100μg)與0.02M EDC的1M甘氨酰胺pH4.5保溫60分鐘。
7.色氨酸殘基修飾如Ali等，J Biol Chem.1995 Mar 3；270(9)4570-4描述的方法，在室溫下，將紅細(xì)胞生成素(100μg)與20μM正溴琥珀酰亞胺的20mM磷酸鉀緩沖液(pH6.5)一起保溫。按照Korotchkina(Korotchkina，LG等，Protein Expr Purif.1995 Feb；6(1)79-90)描述的方法，測(cè)定氧化色氨酸殘基數(shù)。
8.氨基的去除如Kokkini等(Kokkini，G.等“Modification ofhemoglobin by ninhydrin(茚三酮對(duì)血紅蛋白的修飾.”Blood，第556卷，第4期，1980701-705)描述的方法，為了除去氨基，將紅細(xì)胞生成素(100μg)與含有20mM茚三酮(Pierce Chemical，Rockford，Il)的PBS(pH7.4)于37℃保溫2小時(shí)。通過使產(chǎn)物與硼氫化鈉或氫化鋁鋰反應(yīng)，完成所得醛的還原。具體地講，將紅細(xì)胞生成素(100μg)與0.1M硼氫化鈉的PBS在室溫下保溫30分鐘。通過將樣品在冰上冷卻10分鐘終止還原反應(yīng)，并對(duì)PBS透析3次，過夜。(Kokkini，G.，Blood，第556卷，第4期，1980701-705)。在室溫下，通過將紅細(xì)胞生成素(100μg)與0.1M氫化鋁鋰的PBS一起保溫30分鐘，完成用氫化鋁鋰的還原。通過將樣品在冰上冷卻10分鐘終止還原反應(yīng)，并對(duì)PBS透析3次，過夜。
9.二硫鍵還原和穩(wěn)定化紅細(xì)胞生成素(100μg)與500mM DTT于60℃保溫15分鐘。然后向混合物中加入20mM碘乙酰胺的水溶液，并在室溫下避光保溫25分鐘。
10.有限蛋白酶解紅細(xì)胞生成素可以經(jīng)歷靶向特定殘基的有限化學(xué)蛋白酶解。紅細(xì)胞生成素與2-(2-硝基苯基亞磺酰基)-3-甲基-3′-溴假吲哚反應(yīng)，所述反應(yīng)在氮?dú)鈮合略谟忻痹嚬苤性?0倍過量的50％乙酸中在室溫下避光達(dá)48小時(shí)，在色氨酸殘基后特異性切割。通過用色氨酸猝滅和脫鹽終止反應(yīng)。
如上所述，紅細(xì)胞生成素或脫唾液酸紅細(xì)胞生成素可以被修飾，雖然紅細(xì)胞生成素分子的多個(gè)修飾以及額外修飾也可在不偏離本發(fā)明的精神下進(jìn)行。任何上述實(shí)施例可以用如下所述方法制備的部分脫唾液酸紅細(xì)胞生成素進(jìn)行。例如，可以通過使用例如苯基乙二醛、按照Takahashi(1977，J.Biochem.81395-402)描述的方法，在一個(gè)或多個(gè)精氨酸殘基上修飾任何上述修飾的紅細(xì)胞生成素，所述反應(yīng)可以在室溫下范圍在0.5小時(shí)至3小時(shí)間的可變時(shí)間進(jìn)行。反應(yīng)通過將反應(yīng)混合物對(duì)水透析而終止。使用紅細(xì)胞生成素的這樣的修飾形式全都包括在本發(fā)明中。
實(shí)施例4組織保護(hù)性細(xì)胞因子具有神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)按照Manley等，2000，Aquaporin-4 deletion in mice reduces brainedema after acute water intoxication and ischemic stroke(小鼠水通道蛋白-4缺失降低急性水中毒和局部缺血性中風(fēng)后腦水腫)，Nat Med 2000Feb；6(2)159-63，用水中毒測(cè)定評(píng)價(jià)本發(fā)明的組織保護(hù)性細(xì)胞因子的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。使用C3H/HEN雌性小鼠。腹膜內(nèi)給予小鼠其體重20％的水和400ng/kg bw DDAVP(去氨加壓素)。給予小鼠紅細(xì)胞生成素(A)或組織保護(hù)性細(xì)胞因子脫唾液酸紅細(xì)胞生成素(B)、氨甲?；撏僖核峒t細(xì)胞生成素(C)、琥珀?；撏僖核峒t細(xì)胞生成素(D)、乙酰化脫唾液酸紅細(xì)胞生成素(E)、碘化脫唾液酸紅細(xì)胞生成素(F)、羧甲基化脫唾液酸紅細(xì)胞生成素(G)、氨甲?；t細(xì)胞生成素(H)、乙?；t細(xì)胞生成素(I)、碘化紅細(xì)胞生成素(J)或Nε-羧甲基紅細(xì)胞生成素(K)。在給予水前24小時(shí)和在給予水的時(shí)候，腹膜內(nèi)給予小鼠100微克/kg劑量的紅細(xì)胞生成素或組織保護(hù)性細(xì)胞因子，給予兩次。來自Manley等的改良等級(jí)量表用于評(píng)價(jià)小鼠。修改的評(píng)分如下列出1.探究籠子/桌子是 0否 12.視覺追蹤目標(biāo)是 0否 13.胡須運(yùn)動(dòng)存在0不存在 14.腿-尾運(yùn)動(dòng)正常0僵硬1癱瘓25.痛苦撤回(腳趾夾)是 0否 16.運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性正常0
異常17.在桌邊停止是 0否 1可能的總評(píng)分8在以下時(shí)間點(diǎn)對(duì)小鼠進(jìn)行評(píng)分15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、75分鐘、90分鐘、120分鐘、150分鐘和180分鐘。所做的評(píng)分是整個(gè)時(shí)間曲線下的面積，以僅接受鹽水動(dòng)物的百分率計(jì)。圖12顯示接受紅細(xì)胞生成素或一種本發(fā)明的組織保護(hù)性細(xì)胞因子小鼠的評(píng)分，以得自對(duì)照小鼠的評(píng)分的百分率計(jì)。接受本發(fā)明組織保護(hù)性細(xì)胞因子的小鼠表現(xiàn)出更少的神經(jīng)病學(xué)損傷，因此在改良等級(jí)量表中評(píng)分更好。圖12顯示本發(fā)明的組織保護(hù)性細(xì)胞因子保護(hù)神經(jīng)元組織。
實(shí)施例5紅細(xì)胞生成素穿越血-腦脊液緊密屏障Sprague-Dawley成年雄性大鼠麻醉后，腹膜內(nèi)給予重組人紅細(xì)胞生成素。在30分鐘間隔直到4小時(shí)從大池取腦脊液樣，用靈敏和特異性酶聯(lián)免疫測(cè)定測(cè)定紅細(xì)胞生成素濃度。如圖13所示，CSF中基線紅細(xì)胞生成素濃度為8mU/ml。在數(shù)小時(shí)延遲后，測(cè)量的CSF中紅細(xì)胞生成素水平開始上升，到2.5小時(shí)和以后與基線濃度顯著不同(p＜0.01水平)。約100mU/ml的峰水平在已知發(fā)揮體外保護(hù)效應(yīng)的范圍內(nèi)(0.1-100mU/ml)。到達(dá)峰的時(shí)間發(fā)生在約3.5小時(shí)，所述時(shí)間從峰血清水平顯著延遲(不到1小時(shí))。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紅細(xì)胞生成素的顯著水平可以通過大劑量胃腸外給予合適濃度的紅細(xì)胞生成素穿越緊密細(xì)胞連接而達(dá)到。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的組織保護(hù)性細(xì)胞因子也可以預(yù)期得到類似結(jié)果。
實(shí)施例6以備移植用心臟功能的維護(hù)按照Delcayre等，1992，Amer.J.Physiol.263H1537-45的方案，對(duì)于體重在300-330g的Wistar雄性大鼠，在進(jìn)行離體研究而取出心臟前24小時(shí)，給予細(xì)胞生成素(5000U/kg體重)或溶媒。用戊巴比妥(0.3mL)處死動(dòng)物并在靜脈內(nèi)肝素化(0.2mL)。心臟開始讓其平衡15分鐘。然后，使左心房囊膨脹至舒張期末壓為8mmHg的體積。通過增加囊體積膨脹至0.02ml，構(gòu)建左心室壓力體積曲線。零體積定義為其中左心室舒張期末壓為零的點(diǎn)。在完成壓力體積曲線時(shí)，在檢查冠狀動(dòng)脈流動(dòng)后，使左心室囊縮小至舒張期末壓恢復(fù)到8mmHg而且控制周期繼續(xù)15分鐘。然后，心臟用50mL Celsior+分子停止，以在壓力為60cm H2O下于4℃靜息。然后切取心臟并在裝滿相同溶液且周圍放滿碎冰的塑料容器中于4℃貯存5小時(shí)。
在完成貯存后，將心臟轉(zhuǎn)移到Langendorf裝置上。將囊導(dǎo)管重新插入到左心室并使其重新膨脹到與缺血前期相同的體積。在37℃，將心臟再灌注至少2小時(shí)。再灌注壓力設(shè)置在50cm H2O達(dá)重新流動(dòng)15分鐘，然后恢復(fù)到100cm H2O，再進(jìn)行2小時(shí)。重建心博(320次/分)。在再灌注25分鐘、45分鐘、60分鐘和120分鐘，進(jìn)行收縮指數(shù)和舒張壓的等容測(cè)量，重復(fù)3次。在該時(shí)間點(diǎn)完成壓力體積曲線，并收集45分鐘再灌注期間的冠狀動(dòng)脈流出液，測(cè)量肌酸激酶滲漏。運(yùn)用非配對(duì)t-檢驗(yàn)比較這兩個(gè)治療組，用舒張期末壓數(shù)據(jù)的線性回歸用于設(shè)計(jì)依從曲線。如圖14所示，在用紅細(xì)胞生成素治療后，發(fā)生左心室壓力變化的明顯改善，以及改善的體積-壓力曲線，降低左心室舒張壓并降低肌酸激酶滲漏。用本發(fā)明組織保護(hù)性細(xì)胞因子進(jìn)行治療，預(yù)期可得到類似結(jié)果。
實(shí)施例7紅細(xì)胞生成素保護(hù)心肌細(xì)胞免于局部缺血性損傷麻醉前24小時(shí)，給予成年雄性大鼠重組人紅細(xì)胞生成素(5000U(40μg)/kg體重)，并準(zhǔn)備進(jìn)行冠狀動(dòng)脈閉塞。手術(shù)開始時(shí)，給予額外劑量的紅細(xì)胞生成素，并使左主冠狀動(dòng)脈閉塞30分鐘，然后再釋放。處理后，每天給予相同劑量的紅細(xì)胞生成素達(dá)1周。然后研究動(dòng)物的心臟功能。如圖15所示，接受假注射(鹽水)的動(dòng)物證明在左舒張期末壓有大的增加，表明繼發(fā)心肌梗塞后擴(kuò)大的、僵硬的心臟。相比之下，與假手術(shù)對(duì)照相比，接受紅細(xì)胞生成素的動(dòng)物沒有經(jīng)歷心臟功能減退(顯著性差異在p＜0.01的水平)。用本發(fā)明組織保護(hù)性細(xì)胞因子進(jìn)行治療，預(yù)期可得到類似結(jié)果。
實(shí)施例8外周給予紅細(xì)胞生成素對(duì)視網(wǎng)膜缺血的保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞對(duì)局部缺血非常敏感，所以在缺血性應(yīng)激反應(yīng)30分鐘后，許多細(xì)胞死亡。此外，亞急性或慢性局部缺血是伴有大量的人類常見疾病(例如糖尿病、青光眼和黃斑變性)的變性癥狀的基礎(chǔ)。迄今為止，尚沒有保護(hù)細(xì)胞免于局部缺血的有效療法。緊密內(nèi)皮屏障存在于血和視網(wǎng)膜之間，該屏障可排除大多數(shù)大分子。為了檢測(cè)外周給予紅細(xì)胞生成素是否能夠保護(hù)對(duì)局部缺血敏感的細(xì)胞，使用如Rosenbaum等(1997；Vis.Res.373443-51)描述的的急性可逆青光眼大鼠模型。具體地講，將鹽水注射到成年雄性大鼠的眼前房，給全身動(dòng)脈壓力加壓并維持60分鐘。誘導(dǎo)局部缺血前24小時(shí)，腹膜內(nèi)給予動(dòng)物鹽水或5000U(40μg)/kg體重的紅細(xì)胞生成素，并再連續(xù)給予3天的日劑量。治療后1周對(duì)適應(yīng)黑暗的大鼠進(jìn)行視網(wǎng)膜電描記術(shù)。圖16-17說明，與僅給予鹽水治療、只保留極少功能的動(dòng)物(圖面C)相比，給予紅細(xì)胞生成素在視網(wǎng)膜電圖(ERG)(圖面D)上有著良好的保留。圖16比較了紅細(xì)胞生成素治療組和鹽水治療組的視網(wǎng)膜電圖a-波和b-波振幅，顯示出紅細(xì)胞生成素提供顯著保護(hù)。用本發(fā)明組織保護(hù)性細(xì)胞因子進(jìn)行治療，可得到類似結(jié)果。
實(shí)施例9紅細(xì)胞生成素對(duì)由腦創(chuàng)傷所致減退的認(rèn)知功能的恢復(fù)效應(yīng)在證明紅細(xì)胞生成素對(duì)接受腦創(chuàng)傷后小鼠恢復(fù)減退的認(rèn)知功能能力的研究中，按照Brines等，PNAS 2000，97；10295-10672描述的方法，讓雌性Balb/c小鼠遭受鈍器腦創(chuàng)傷，5天后開始腹膜內(nèi)每天給予5000U(40μg)/kg-bw紅細(xì)胞生成素。損傷后12天，在Morris水迷宮中測(cè)試動(dòng)物的認(rèn)知功能，每天4次試驗(yàn)。雖然在試驗(yàn)中治療動(dòng)物和未經(jīng)治療的動(dòng)物表現(xiàn)都不好(游泳時(shí)間約為80秒，而不是可能的90秒)，圖18顯示經(jīng)紅細(xì)胞生成素治療的動(dòng)物表現(xiàn)較好(在該圖中，負(fù)值較好)。即使延遲到創(chuàng)傷后30天才開始進(jìn)行紅細(xì)胞生成素治療(圖19)，也可觀察到認(rèn)知功能的恢復(fù)。用本發(fā)明組織保護(hù)性細(xì)胞因子進(jìn)行治療，預(yù)期可得到類似結(jié)果。
實(shí)施例10紅藻氨酸模型在紅藻氨酸神經(jīng)毒性模型中，按照Brines等，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.2000，97；10295-10672的方案，在給予25mg/kg紅藻氨酸前24小時(shí)，腹膜內(nèi)給予劑量為5000U(40μg)/kg-bw的脫唾液酸紅細(xì)胞生成素，顯示同紅細(xì)胞生成素一樣有效，正如死亡時(shí)間顯示的(圖20)。用本發(fā)明組織保護(hù)性細(xì)胞因子進(jìn)行治療，可得到類似結(jié)果。
實(shí)施例11脊髓損傷模型1.測(cè)試紅細(xì)胞生成素和組織保護(hù)性細(xì)胞因子的大鼠脊髓壓迫在該項(xiàng)研究中使用重量在180-300g的Wistar大鼠(雌性)。動(dòng)物在手術(shù)前禁食12小時(shí)并被人道地限制，然后腹膜內(nèi)注射硫噴妥鈉(40mg/kg-bw)而麻醉。滲透到皮膚(布比卡因0.25％)后，借助解剖顯微鏡，通過2cm切口進(jìn)行完全單水平(T-3)椎板切除術(shù)。通過硬膜外應(yīng)用暫時(shí)動(dòng)脈瘤夾對(duì)脊髓施加0.6牛頓(65克)閉合力達(dá)1分鐘，誘導(dǎo)創(chuàng)傷性脊髓損傷。除去夾子后，縫合皮膚切口，讓動(dòng)物從麻醉中完全恢復(fù)，放回籠子。每天至少2次膀胱觸診，連續(xù)監(jiān)測(cè)大鼠直到自動(dòng)進(jìn)行排泄為止。
將40只動(dòng)物隨機(jī)分成5組。接受普通鹽水(通過靜脈內(nèi)注射)的對(duì)照組(I)動(dòng)物(n＝8)在切開后立即縫合。組(II；n＝8)接受rhEPO@ 16微克/kg-bw iv，組(III)接受本發(fā)明的脫唾液酸組織保護(hù)性細(xì)胞因子(脫唾液酸紅細(xì)胞生成素)@ 16微克/kg-bw iv，組(IV)接受脫唾液酸組織保護(hù)性細(xì)胞因子@ 30微克/kg-bw iv，和組(V)接受本發(fā)明的脫唾液酸組織保護(hù)性細(xì)胞因子(脫唾液酸紅細(xì)胞生成素)@ 30微克/kg-bw；所有都是在去除動(dòng)脈瘤夾子后立即進(jìn)行單次大劑量靜脈內(nèi)注射。
大鼠的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能將通過使用Basso等的運(yùn)動(dòng)等級(jí)量表來評(píng)價(jià)。在該量表中，動(dòng)物的評(píng)分范圍從0(沒有觀察到后肢運(yùn)動(dòng))到21(正常步態(tài))。將在損傷后1小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和1周，由不知道每只動(dòng)物接受的治療的同一檢查人員檢查大鼠的功能缺陷。
圖21是一幅曲線圖，證明大鼠在脊髓創(chuàng)傷30天內(nèi)恢復(fù)的運(yùn)動(dòng)等級(jí)。由圖可見，給予紅細(xì)胞生成素(組II)或組織保護(hù)性細(xì)胞因子(組III-組V)的大鼠很容易從損傷恢復(fù)過來，并證明比對(duì)照鼠有更好的總體恢復(fù)。用本發(fā)明組織保護(hù)性細(xì)胞因子進(jìn)行治療性治療，預(yù)期可得到類似結(jié)果。
2.測(cè)試紅細(xì)胞生成素和組織保護(hù)性細(xì)胞因子的兔脊髓缺血在該項(xiàng)研究中使用重量在1.5-2.5kg的36只新西蘭白兔(8-12月齡，雄性)。動(dòng)物禁食12小時(shí)并被人道地限制。通過吸入3％氟烷的100％氧并在50％氧和50％空氣混合物中的0.5-1.5％氟烷中維持，誘導(dǎo)麻醉。將靜脈內(nèi)插管(22號(hào))放置在左耳靜脈中。在外科手術(shù)中，以每小時(shí)4ml/kg體重(bw)的速率輸注Ringers乳酸鹽。術(shù)前靜脈內(nèi)給予10mg/kg-bw頭孢唑林以防感染。將動(dòng)物放置成右側(cè)臥位置，用聚維酮碘備皮，用布比卡因(0.25％)滲透并且在第12肋骨平行于脊骨開一個(gè)脅下皮膚切口。當(dāng)切開皮膚和皮下胸腰筋膜后，腰最長(zhǎng)肌和腰髂肋肌收縮。通過左腹膜后途徑將腹部主動(dòng)脈暴露并轉(zhuǎn)移到左腎動(dòng)脈下。一條PE-60管環(huán)繞在離開左腎動(dòng)脈的主動(dòng)脈周圍且兩端穿過大橡膠管。通過拉緊PE管，大動(dòng)脈被無(wú)創(chuàng)傷地閉塞20分鐘。在主動(dòng)脈閉塞前，大劑量靜脈內(nèi)給予肝素(400IU)。20分鐘閉塞后，去除管子和導(dǎo)管，縫合切口，監(jiān)測(cè)動(dòng)物直至完全恢復(fù)，然后連續(xù)評(píng)價(jià)其神經(jīng)功能。
將36只動(dòng)物隨機(jī)分成6組。在對(duì)照組(I)中，動(dòng)物(n＝6)在主動(dòng)脈閉塞釋放后立即靜脈內(nèi)接受普通鹽水。組(II)接受rhEPO@ 6.5微克/kg-bw；組(III)接受組織保護(hù)性細(xì)胞因子(氨甲?；t細(xì)胞生成素)@6.5微克/kg-bw；組(IV)接受另一種組織保護(hù)性細(xì)胞因子(脫唾液酸紅細(xì)胞生成素)@ 6.5微克/kg-bw；組(V)接受與組(IV)相同的組織保護(hù)性細(xì)胞因子，但為@ 20微克/kg-bw；和組(VI)接受又一種組織保護(hù)性細(xì)胞因子(脫唾液酸氨甲?；t細(xì)胞生成素)@ 20微克/kg-bw；所有都是在再灌注后立即經(jīng)靜脈內(nèi)給予。
按照Drummond和Moore的標(biāo)準(zhǔn)，由不知道在再灌注后1小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)治療的調(diào)查人員評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)功能。如下對(duì)每個(gè)動(dòng)物進(jìn)行從0到4的評(píng)分0＝?jīng)]有下肢運(yùn)動(dòng)功能的截癱；1＝下肢運(yùn)動(dòng)功能差，僅有微弱反重力運(yùn)動(dòng)；2＝有良好反重力力量，但不能在身體下邁動(dòng)腿的中等下肢運(yùn)動(dòng)功能；3＝良好運(yùn)動(dòng)功能，能在身體下拖動(dòng)腿跳躍，但不正常；4＝正常運(yùn)動(dòng)功能。在截癱動(dòng)物中每天2次手工給膀胱排便。
圖22是一幅曲線圖，描繪恢復(fù)的兔的運(yùn)動(dòng)功能。圖上證明，甚至在僅2天周期內(nèi)，紅細(xì)胞生成素和本發(fā)明的組織保護(hù)性細(xì)胞因子就能讓兔從脊髓損傷中完全恢復(fù)過來。用本發(fā)明組織保護(hù)性細(xì)胞因子進(jìn)行治療性治療，預(yù)期將得到類似結(jié)果。
實(shí)施例12紅細(xì)胞生成素的抗炎效應(yīng)體內(nèi)研究1.大鼠中腦動(dòng)脈閉塞(MCAO)研究重量在250-280g的雄性CrlCD(SD)BR大鼠得自Charles River，Calco，Italy。按照Brines，M.L.，Ghezzi，P.，Keenan，S.，Agnello，D.，deLanerolle，N.C.，Cerami，C.，Itri，L.M.和Cerami，A.2000.Erythropoietincrosses the blood-brain barrier to protect against experimental brain injury(紅細(xì)胞生成素穿越血-腦屏障以防止實(shí)驗(yàn)性腦創(chuàng)傷).[In ProcessCitation]Proc Natl Acad Sci USA 9710526-10531所述，對(duì)這些大鼠進(jìn)行手術(shù)。簡(jiǎn)而言之，將大鼠用水合氯醛(400mg/kg-bw，i.p.)麻醉，露出頸動(dòng)脈，用兩次縫合閉塞右頸動(dòng)脈并切開。鄰近和朝向右眶的鋸齒孔讓MCA清楚呈現(xiàn)，所述孔在離開鼻動(dòng)脈處進(jìn)行燒灼。為了產(chǎn)生圍繞該固定MCA損害的半影(邊界)，使用細(xì)鉗牽引，對(duì)側(cè)頸動(dòng)脈閉塞1小時(shí)后再放開。MCAO后立即給予PBS或rhEPO(5,000U/kg-bw，i.p.；先前顯示在該模型(1)中有保護(hù)性)。當(dāng)需要時(shí)，如前所述(8)定量測(cè)定大腦皮層勻漿的TNF和IL-6。用市售ELISA試劑盒(biosource，Camarillo，CA)，測(cè)定勻漿中的MCP-1。
MCAO后24小時(shí)，如上所述麻醉大鼠，并通過心臟灌注100ml鹽水，接著是250ml磷酸鈉緩沖的4％低聚甲醛溶液。快速切下腦，在磷酸鈉緩沖的4％低聚甲醛溶液中固定2小時(shí)，轉(zhuǎn)移到20％蔗糖溶液的PBS過夜，然后在30％蔗糖溶液中直到它們被浸沒，然后在2-甲基丁烷中在-45℃冷凍。在-20℃，在恒冷切片機(jī)(HM 500 OM，Microm)上以橫向平面通過腦進(jìn)行切片(30μm)并選擇每隔5片的切片用于針對(duì)不同抗原或蘇木精-伊紅染色的組織化學(xué)。分別按照Houser等所述的方案和生產(chǎn)商的方案，用抗神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)小鼠單克隆抗體(1∶250，Boehringher Mannheim，Monza，Italy)和用抗cdl11b(MRC OX-42)小鼠單克隆抗體(1∶50，Serotec，UK)處理自由漂浮切片用于免疫反應(yīng)性。所有切片在包埋的玻片上在鹽水中制成用于光學(xué)顯微鏡的浸片，通過逐級(jí)酒精脫水，在二甲苯中固定并用DPX mountant(BDH，Poole，UK)蓋上玻片。鄰近切片如(10)所述用蘇木精-伊紅染色。
圖23顯示經(jīng)蘇木精和伊紅染色的大腦皮層冠狀冠狀切片。對(duì)照大鼠(A)、局部缺血性大鼠(B)用PBS治療，局部缺血性大鼠(C)用rhEPO(5,000U/kg-bw，i.p.，MCAO后立即給予)治療。切片B顯示與對(duì)照(A)相比，與炎癥一致的組織染色的明顯降低，伴隨神經(jīng)元成分的損失。系統(tǒng)給予rhEPO大大降低了細(xì)胞死亡部位的局部缺血性損傷或局部區(qū)域的損傷(C)。(放大倍數(shù)2.5x.比例尺＝800μm.)圖24顯示用GFAP抗體染色的鄰近梗塞區(qū)前皮層的冠狀冠狀切片。對(duì)照大鼠(A)、局部缺血性大鼠用PBS治療(B)，局部缺血性大鼠用rhEPO治療(C)。活化星形膠質(zhì)細(xì)胞通過其GFAP陽(yáng)性過程而顯現(xiàn)出來(圖面B)。在數(shù)量上以及在代表性的經(jīng)rhEPO治療動(dòng)物中活化星形膠質(zhì)細(xì)胞的染色強(qiáng)度都明顯下降(圖面C)。(放大倍數(shù)10x.比例尺＝200μm.)圖25用OX-42抗體染色的大腦皮層的冠狀冠狀切片。局部缺血性大鼠用PBS治療(A)，局部缺血性大鼠用rhEPO治療(B)。在局部缺血性腦半球中，在兩個(gè)治療組中圍繞梗塞組織的細(xì)胞染色特別突出，但是在鹽水治療組中更密集更廣泛。(放大倍數(shù)20x；比例尺＝100μm)。
圖26顯示用OX-42抗體染色的鄰近梗塞區(qū)的大腦皮層冠狀冠狀切片。與用rhEPO治療的局部缺血性大鼠(B)相比，用PBS治療的局部缺血性大鼠(A)中觀察到高得多的單核炎性細(xì)胞密度。具有典型的圓形的浸潤(rùn)性白細(xì)胞將會(huì)擴(kuò)大梗塞體積。(放大倍數(shù)10x；比例尺＝200μm)。
用本發(fā)明組織保護(hù)性細(xì)胞因子進(jìn)行治療性治療，預(yù)期將得到類似結(jié)果。
2.Lewis大鼠的急性實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)6-8周齡的雌性Lewis大鼠購(gòu)自Charles River(Calco，Italy)。通過在輕微醚麻醉下，向大鼠的兩個(gè)后足墊注射用加有熱滅活結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)H37Ra(Difco，Detroit，MI)的等體積的完全弗氏佐劑(CFA，Sigma)乳化的50μg豚鼠MBP(Sigma，St.Louis，MO)水溶液(使終體積為100μ)，誘發(fā)大鼠EAE。盲法檢查大鼠EAE體征并如下評(píng)分0，沒有疾?。?，尾弛緩；2，共濟(jì)失調(diào)；3，后肢完全癱瘓并伴有小便失禁。自免疫后3天開始，腹膜內(nèi)(i.p.)給予大鼠指定劑量溶于PBS的r-Hu-EPO(EPOetin alfa，Procrit，Ortho Biotech，Raritan，NJ)，一天一次。因?yàn)榕R床級(jí)EPO含有人血清白蛋白，所以通常給予對(duì)照動(dòng)物含有相同數(shù)量的人血清白蛋白的PBS。每日給予5,000U/kg-bw的EPO增加血細(xì)胞比容達(dá)30％(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)需要時(shí)，從3天到18天用相當(dāng)于1mg/kg-bw的地塞米松(DEX)的溶于PBS的1.3mg/kg-bw的DEX的磷酸二鈉鹽(Sigma)注射(s.c.)大鼠。當(dāng)需要時(shí)，如前所述[Agnello，2000#10]定量測(cè)定腦和脊髓勻漿中的TNF和IL-6。
圖27顯示經(jīng)MBP免疫后3天到18天給予不同劑量EPO對(duì)EAE臨床體征的保護(hù)效應(yīng)。EPO以劑量依賴方式延遲疾病的發(fā)作并降低疾病的嚴(yán)重程度。但是，EPO不延遲達(dá)到最大嚴(yán)重程度的時(shí)間。
在疾病恢復(fù)后不繼續(xù)用EPO治療并監(jiān)測(cè)大鼠達(dá)2月之久的實(shí)驗(yàn)中，沒有觀察到復(fù)發(fā)，相反在延緩其給藥后用DEX導(dǎo)致疾病惡化(圖28)。用本發(fā)明組織保護(hù)性細(xì)胞因子進(jìn)行治療性治療，預(yù)期將得到類似結(jié)果。
體外研究從1-2日齡的新生Sprague-Dawley大鼠制備神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)物。將腦半球從腦膜剝離并機(jī)械破壞。將細(xì)胞分散在2.5％胰蛋白酶和1％DNA酶溶液中，通過100μm尼龍網(wǎng)過濾并接種(140,000細(xì)胞/35mm皿)在補(bǔ)充10％胎牛血清、0.6％葡萄糖、鏈霉素(0.1mg/ml)和青霉素(100Ul/ml)的Eagle氏極限必需培養(yǎng)基上。每周2次喂養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)培養(yǎng)物并讓其在5％CO2的增濕培養(yǎng)箱中于37℃生長(zhǎng)。所有實(shí)驗(yàn)均在2-3周齡的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物上進(jìn)行，所述培養(yǎng)物用oGFAP和Griffonia sirnplicifolia同工凝集素B4的免疫化學(xué)測(cè)定，其中有97％的星形膠質(zhì)細(xì)胞和3％的小膠質(zhì)細(xì)胞。從18天的大鼠胎兒海馬建立神經(jīng)元培養(yǎng)物。取出大腦并從腦膜剝離，分離海馬。通過在2.5％胰蛋白酶溶液中于37℃保溫15-20分鐘，將細(xì)胞分散，然后測(cè)定濃度。將細(xì)胞懸液在用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基中稀釋并以160,000細(xì)胞每蓋玻片的密度接種到聚鳥氨酸包埋的蓋玻片上。接種后一天，將蓋玻片轉(zhuǎn)移到含有神經(jīng)膠質(zhì)單層的、補(bǔ)充阿糖胞苷5μM的神經(jīng)元維持培養(yǎng)基(補(bǔ)充5μg/ml胰島素、100μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、100μg/ml腐胺、30nM亞硒酸鈉、20nM孕酮和100U/ml青霉素的Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基和Ham氏營(yíng)養(yǎng)混合F12)培養(yǎng)皿上。翻轉(zhuǎn)蓋玻片，使海馬神經(jīng)元面向神經(jīng)膠質(zhì)單層。粘在蓋玻片上的石蠟點(diǎn)支撐它們?cè)谏窠?jīng)膠質(zhì)上，產(chǎn)生狹縫，防止兩種細(xì)胞類型彼此接觸，但又允許可溶性物質(zhì)擴(kuò)散。這些培養(yǎng)條件允許分化神經(jīng)元培養(yǎng)物生長(zhǎng)，所述培養(yǎng)物用微管相關(guān)蛋白2和GFAP的免疫化學(xué)測(cè)定具有＞98％的同源性。然后在rhEPO(10U(80ng)/ml)存在或不存在下，用1μM三甲基錫(TMT)將細(xì)胞處理24小時(shí)，上清液用于TNF測(cè)定，細(xì)胞活力如上所述進(jìn)行評(píng)價(jià)。當(dāng)需要時(shí)，在LPS存在下，有或沒有rhEPO時(shí)，將神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)，測(cè)定培養(yǎng)上清液中的TNF。通過3-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)測(cè)定，測(cè)定細(xì)胞活力。Denizot，F(xiàn).和Lang，R.1986.Rapid colorimetric assay for cell growth andsurvival.Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improvedsensitivity and reliability.(細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的快速比色測(cè)定。對(duì)四氮唑染料方法的修改以得到改善的靈敏度和可靠性).J Immunol Methods89271-277。簡(jiǎn)而言之，將MTT四氮唑鹽溶于無(wú)血清培養(yǎng)基中，至終濃度為0.75mg/ml，加入到處于于37℃處理了3小時(shí)結(jié)束的細(xì)胞中。然后除去培養(yǎng)基，用1N HCl∶異丙醇(1∶24)萃取甲。在微量板讀數(shù)器上讀出560nm吸光度。
圖29顯示rhEPO在混合神經(jīng)元膠質(zhì)培養(yǎng)物中預(yù)防誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡的TNF產(chǎn)生。圖面A有或沒有用rhEPO(10U/ml)處理時(shí)，由1μMTMT誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡百分率。圖面B在神經(jīng)元存在(陰影條帶)或不存在(填黑條帶)、有或沒有rhEPO(10U/ml)時(shí)，從暴露給1μMTMT的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放的TNF。用本發(fā)明組織保護(hù)性細(xì)胞因子進(jìn)行治療性治療，預(yù)期將得到類似結(jié)果。
本發(fā)明的范圍并不受用來作為本發(fā)明各個(gè)方面的個(gè)別說明的具體實(shí)施方案的限制并且功能等同的方法和組成都在本發(fā)明范圍內(nèi)。甚至從上所述和附圖中對(duì)本發(fā)明的各種修改，除本文所示和所述外，也將對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。所述修改都包括在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
以上引用的所有參考文獻(xiàn)都通過引用全部結(jié)合到本文中，用于所有目的。
序列表<110>肯尼思S.沃倫協(xié)會(huì)有限公司(The Kenneth S.Warren Institute，Inc.)<120>用于保護(hù)、恢復(fù)和增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞、組織和器官的組織保護(hù)性細(xì)胞因子<130>10165-026-228<140>
<141>
<150>10/188,905<151>2002-07-03<160>4<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述功能域<400>1Val Leu Gln Arg Tyr1 5<210>2<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述功能域
<400>2Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp1 5<210>3<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述功能域<400>3Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu1 5<210>4<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述功能域<400>4Ser Asn Phe Leu Arg Gly1 權(quán)利要求
1.一種藥用組合物，所述組合物包含治療有效量的組織保護(hù)性細(xì)胞因子、至少一種抗炎藥和藥學(xué)上可接受的載體。
2.權(quán)利要求1的藥用組合物，其中所述抗炎藥選自皮質(zhì)類固醇、糖皮質(zhì)激素、類固醇、非甾體抗炎藥、β-激動(dòng)劑、抗膽堿能藥、甲基黃嘌呤、金注射劑、柳氮磺吡啶、青霉胺、抗血管形成藥、氨苯砜、補(bǔ)骨脂素、抗瘧藥、抗病毒藥和抗生素。
3.一種藥用組合物，所述組合物包含治療有效量的組織保護(hù)性細(xì)胞因子、至少一種免疫調(diào)節(jié)劑和藥學(xué)上可接受的載體。
4.權(quán)利要求3的藥用組合物，所述抗炎藥選自甲氨蝶呤、來氟米特、環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺制劑、Immuran、環(huán)孢菌素A、二甲胺四環(huán)素、硫唑嘌呤、抗生素、甲潑尼龍、皮質(zhì)類固醇、類固醇、麥考酚酸嗎乙酯、雷帕霉素、咪唑立賓、脫氧精胍菌素、布喹那、丙二腈酰胺、T細(xì)胞受體調(diào)節(jié)劑和細(xì)胞因子受體調(diào)節(jié)劑。
5.權(quán)利要求1或3的藥用組合物，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子選自i)缺乏唾液酸部分的紅細(xì)胞生成素；ii)缺乏N聯(lián)糖或缺乏O聯(lián)糖的紅細(xì)胞生成素；iii)通過用至少一種糖苷酶處理天然紅細(xì)胞生成素而具有降低糖含量的紅細(xì)胞生成素；iv)具有至少一個(gè)或多個(gè)氧化糖的紅細(xì)胞生成素；v)包含至少一個(gè)或多個(gè)經(jīng)化學(xué)還原的氧化糖的紅細(xì)胞生成素；vi)包含至少一個(gè)或多個(gè)修飾精氨酸殘基的紅細(xì)胞生成素；vii)包含至少一個(gè)或多個(gè)修飾賴氨酸殘基或該紅細(xì)胞生成素分子的一個(gè)N端氨基修飾的紅細(xì)胞生成素；viii)包含至少一個(gè)修飾酪氨酸殘基的紅細(xì)胞生成素；ix)包含至少一個(gè)修飾天冬氨酸或一個(gè)谷氨酸殘基的紅細(xì)胞生成素；x)包含至少一個(gè)修飾色氨酸殘基的紅細(xì)胞生成素；xi)至少去除一個(gè)氨基的紅細(xì)胞生成素；xii)在紅細(xì)胞生成素分子內(nèi)包含至少一個(gè)胱氨酸鍵的至少一個(gè)口的紅細(xì)胞生成素；和xiii)截短的紅細(xì)胞生成素。
6.一種用于治療包含效應(yīng)細(xì)胞、組織和/或器官的哺乳動(dòng)物的炎癥的方法，所述方法包括給予哺乳動(dòng)物包含治療有效量的組織保護(hù)性細(xì)胞因子和藥學(xué)上可接受的載體的藥用組合物。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子缺乏至少一種選自以下的活性增加血細(xì)胞比容、血管收縮、超活化血小板、促凝血活性和增加凝血細(xì)胞的產(chǎn)生。
8.一種用于治療包含效應(yīng)細(xì)胞、組織和/或器官的哺乳動(dòng)物的炎癥的方法，所述方法包括給予有需要的哺乳動(dòng)物包含預(yù)防有效量或治療有效量的組織保護(hù)性細(xì)胞因子和藥學(xué)上可接受的載體的藥用組合物，并且給予所述哺乳動(dòng)物預(yù)防有效量或治療有效量的一種或多種抗炎藥或免疫調(diào)節(jié)劑。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述抗炎藥選自皮質(zhì)類固醇、糖皮質(zhì)激素、類固醇、非甾體抗炎藥、β-激動(dòng)劑、抗膽堿能藥、甲基黃嘌呤、金注射劑、柳氮磺吡啶、青霉胺、抗血管形成藥、氨苯砜、補(bǔ)骨脂素、抗瘧藥、抗病毒藥和抗生素。
10.權(quán)利要求8的方法，所述免疫調(diào)節(jié)劑選自蛋白質(zhì)藥物、肽模擬物、抗體、核酸分子、小分子、有機(jī)化合物、無(wú)機(jī)化合物、甲氨蝶呤、來氟米特、環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺制劑、Immuran、環(huán)孢菌素A、二甲胺四環(huán)素、硫唑嘌呤、抗生素、甲潑尼龍(MP)、皮質(zhì)類固醇、類固醇、麥考酚酸嗎乙酯、雷帕霉素、咪唑立賓、脫氧精胍菌素、布喹那、丙二腈酰胺、T細(xì)胞受體調(diào)節(jié)劑和細(xì)胞因子受體調(diào)節(jié)劑。
11.權(quán)利要求6或8的方法，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是i)缺乏唾液酸部分的紅細(xì)胞生成素；ii)缺乏N聯(lián)糖或缺乏O聯(lián)糖的紅細(xì)胞生成素；iii)通過用至少一種糖苷酶處理天然紅細(xì)胞生成素而具有降低糖含量的紅細(xì)胞生成素；iv)具有至少一個(gè)或多個(gè)氧化糖的紅細(xì)胞生成素；v)包含至少一個(gè)或多個(gè)經(jīng)化學(xué)還原的氧化糖的紅細(xì)胞生成素；vi)包含至少一個(gè)或多個(gè)修飾精氨酸殘基的紅細(xì)胞生成素；vii)包含至少一個(gè)或多個(gè)修飾賴氨酸殘基或該紅細(xì)胞生成素分子的一個(gè)N端氨基修飾的紅細(xì)胞生成素；viii)包含至少一個(gè)修飾酪氨酸殘基的紅細(xì)胞生成素；ix)包含至少一個(gè)修飾天冬氨酸或一個(gè)谷氨酸殘基的紅細(xì)胞生成素；x)包含至少一個(gè)修飾色氨酸殘基的紅細(xì)胞生成素；xi)至少去除一個(gè)氨基的紅細(xì)胞生成素；xii)在紅細(xì)胞生成素分子內(nèi)包含至少一個(gè)胱氨酸鍵的至少一個(gè)口的紅細(xì)胞生成素；和xiii)截短的紅細(xì)胞生成素。
12.權(quán)利要求6或8的方法，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是脫唾液酸紅細(xì)胞生成素或苯基乙二醛-紅細(xì)胞生成素。
13.權(quán)利要求6或8的方法，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子能夠越過內(nèi)皮細(xì)胞屏障。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述內(nèi)皮細(xì)胞屏障選自血-腦屏障、血-眼屏障、血-睪屏障、血-卵巢屏障和血-子宮屏障。
15.權(quán)利要求6或8的方法，其中哺乳動(dòng)物體內(nèi)的效應(yīng)細(xì)胞、組織和/或器官選自神經(jīng)元細(xì)胞、肌細(xì)胞、心細(xì)胞、肺細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、小腸細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞、毛細(xì)血管細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞和干細(xì)胞。
16.權(quán)利要求6或8的方法，其中所述哺乳動(dòng)物效應(yīng)細(xì)胞還包括選自以下的細(xì)胞感光細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞、米勒細(xì)胞、心肌細(xì)胞、起搏細(xì)胞、竇房結(jié)細(xì)胞、竇房結(jié)細(xì)胞、竇結(jié)細(xì)胞、房室結(jié)細(xì)胞、房室束細(xì)胞、肝細(xì)胞、星形細(xì)胞、肝巨噬細(xì)胞、系膜細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、腸腺細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、腎小球細(xì)胞、束狀細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、嗜鉻細(xì)胞、外膜細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、滋養(yǎng)細(xì)胞、精細(xì)胞、成熟濾泡細(xì)胞、原始濾泡細(xì)胞、子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和子宮內(nèi)膜細(xì)胞。
17.權(quán)利要求6或8的方法，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是脫唾液酸紅細(xì)胞生成素。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述脫唾液酸紅細(xì)胞生成素是人脫唾液酸紅細(xì)胞生成素。
19.權(quán)利要求6或8的方法，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是不含N聯(lián)糖的紅細(xì)胞生成素。
20.權(quán)利要求6或8的方法，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是不含O聯(lián)糖的紅細(xì)胞生成素。
21.權(quán)利要求6或8的方法，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是經(jīng)至少一種糖苷酶處理的紅細(xì)胞生成素。
22.權(quán)利要求6或8的方法，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是高碘酸鹽氧化的紅細(xì)胞生成素。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述高碘酸鹽氧化的紅細(xì)胞生成素是被氰基硼氫鈉化學(xué)還原的。
24.權(quán)利要求6或8的方法，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是在一個(gè)或多個(gè)精氨酸殘基上包含R-乙二醛部分的紅細(xì)胞生成素，其中R為芳基或烷基部分。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述紅細(xì)胞生成素是苯基乙二醛-紅細(xì)胞生成素。
26.權(quán)利要求6或8的方法，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是其中至少一個(gè)精氨酸殘基通過與選自2，3-丁二酮和環(huán)己二酮的連二酮反應(yīng)而被修飾的紅細(xì)胞生成素。
27.權(quán)利要求6或8的方法，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是其中至少一個(gè)精氨酸殘基與3-脫氧葡糖醛酮反應(yīng)的紅細(xì)胞生成素。
28.權(quán)利要求6或8的方法，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是包含至少一個(gè)生物素化賴氨酸或N端氨基的紅細(xì)胞生成素分子。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述紅細(xì)胞生成素分子是生物素化紅細(xì)胞生成素。
30.權(quán)利要求6或8的方法，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是葡萄糖醇基賴氨酸紅細(xì)胞生成素或果糖基賴氨酸紅細(xì)胞生成素。
31.權(quán)利要求6或8的方法，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是具有至少一個(gè)氨甲?；嚢彼釟埢募t細(xì)胞生成素。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述氨甲酰化紅細(xì)胞生成素選自α-N-氨甲酰紅細(xì)胞生成素；N-ε-氨甲酰紅細(xì)胞生成素；α-N-氨甲酰，N-ε-氨甲酰紅細(xì)胞生成素；α-N-氨甲酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；N-ε-氨甲酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；α-N-氨甲酰，N-ε-氨甲酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；α-N-氨甲酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素；N-ε-氨甲酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素；和α-N-氨甲酰，N-ε-氨甲酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素。
33.權(quán)利要求6或8的方法，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是其中至少一個(gè)賴氨酸殘基被?；募t細(xì)胞生成素。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述紅細(xì)胞生成素的一個(gè)賴氨酸殘基被乙?；?。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述乙?；t細(xì)胞生成素選自α-N-乙酰紅細(xì)胞生成素；N-ε-乙酰紅細(xì)胞生成素；α-N-乙酰，N-ε-乙酰紅細(xì)胞生成素；α-N-乙酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；N-ε-乙酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；α-N-乙酰，N-ε-乙酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；α-N-乙酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素；N-ε-乙酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素；和α-N-乙酰，N-ε-乙酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素。
36.權(quán)利要求6或8的方法，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是包含琥珀?；嚢彼釟埢募t細(xì)胞生成素。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述紅細(xì)胞生成素選自α-N-琥珀酰紅細(xì)胞生成素；N-ε-琥珀酰紅細(xì)胞生成素；α-N-琥珀酰，N-ε-琥珀酰紅細(xì)胞生成素；α-N-琥珀酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；N-ε-琥珀酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；α-N-琥珀酰，N-ε-琥珀酰脫唾液酸紅細(xì)胞生成素；α-N-琥珀酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素；N-ε-琥珀酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素；和α-N-琥珀酰，N-ε-琥珀酰低唾液酸紅細(xì)胞生成素。
38.權(quán)利要求6或8的方法，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是至少一個(gè)賴氨酸殘基被2，4，6-三硝基苯磺酸鹽修飾的紅細(xì)胞生成素。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述鹽是2，4，6-三硝基苯磺酸鈉。
40.權(quán)利要求6或8的方法，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是其中至少一個(gè)酪氨酸殘基被硝化和/或碘化的紅細(xì)胞生成素。
41.權(quán)利要求6或8的方法，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是其中天冬氨酸殘基和/或谷氨酸殘基與碳二亞胺反應(yīng)后再與胺反應(yīng)的紅細(xì)胞生成素。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述胺是甘氨酰胺。
43.權(quán)利要求6或8的方法，其中所述炎癥是由疾病或創(chuàng)傷引起的。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述創(chuàng)傷選自脈管炎、慢性支氣管炎、胰腺炎、骨髓炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎小球性腎炎、視神經(jīng)炎、顳動(dòng)脈炎、腦炎、腦膜炎、橫貫性脊髓炎、皮肌炎、多肌炎、壞死性筋膜炎、肝炎和壞死性小腸結(jié)腸炎。
45.權(quán)利要求6或8的方法，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子抑制由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子引起的炎癥。
46.權(quán)利要求6或8的方法，其中所述炎癥是由細(xì)胞凋亡觸發(fā)的。
47.組織保護(hù)性細(xì)胞因子在制備用于治療包含效應(yīng)細(xì)胞、組織和/或器官的哺乳動(dòng)物的炎癥的藥用組合物中的用途。
48.權(quán)利要求47的用途，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子缺乏至少一種選自以下的活性增加血細(xì)胞比容、血管收縮、超活化血小板、促凝血活性和增加凝血細(xì)胞的產(chǎn)生。
49.權(quán)利要求47的用途，其中所述炎癥是由疾病或創(chuàng)傷引起的。
50.權(quán)利要求49的用途，其中所述創(chuàng)傷是由以下引起癲癇、多發(fā)性硬化、中風(fēng)、低血壓、心搏停止、局部缺血、心肌梗塞、年齡相關(guān)認(rèn)知功能減退、輻射損傷、大腦麻痹、神經(jīng)變性性疾病、早老性癡呆、帕金森病、亞急性壞死性腦脊髓病、艾滋病性癡呆、記憶力減退、肌萎縮性側(cè)索硬化、醇中毒、心境障礙、焦慮癥、注意力不集中、孤獨(dú)癥、傳染性海綿樣腦病、腦創(chuàng)傷、脊髓創(chuàng)傷、腦缺血、脊髓缺血、心肺分流術(shù)、慢性心力衰竭、黃斑變性、糖尿病性神經(jīng)病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、青光眼、視網(wǎng)膜缺血或視網(wǎng)膜創(chuàng)傷。
51.組織保護(hù)性細(xì)胞因子在制備用于治療包含效應(yīng)細(xì)胞、組織和/或器官的哺乳動(dòng)物的炎癥的藥用組合物中的用途，其中所述藥用組合物包含治療有效量的組織保護(hù)性細(xì)胞因子；至少一種抗炎藥或免疫調(diào)節(jié)劑；和藥學(xué)上可接受的載體。
52.權(quán)利要求47的用途，其中所述組織保護(hù)性細(xì)胞因子是i)缺乏唾液酸部分的紅細(xì)胞生成素；ii)缺乏N聯(lián)糖或缺乏O聯(lián)糖的紅細(xì)胞生成素；iii)通過用至少一種糖苷酶處理天然紅細(xì)胞生成素而具有降低糖含量的紅細(xì)胞生成素；iv)具有至少一個(gè)或多個(gè)氧化糖的紅細(xì)胞生成素；v)包含至少一個(gè)或多個(gè)經(jīng)化學(xué)還原的氧化糖的紅細(xì)胞生成素；vi)包含至少一個(gè)或多個(gè)修飾精氨酸殘基的紅細(xì)胞生成素；vii)包含至少一個(gè)或多個(gè)修飾賴氨酸殘基或該紅細(xì)胞生成素分子的一個(gè)N端氨基修飾的紅細(xì)胞生成素；viii)包含至少一個(gè)修飾酪氨酸殘基的紅細(xì)胞生成素；ix)包含至少一個(gè)修飾天冬氨酸或一個(gè)谷氨酸殘基的紅細(xì)胞生成素；x)包含至少一個(gè)修飾色氨酸殘基的紅細(xì)胞生成素；xi)至少去除一個(gè)氨基的紅細(xì)胞生成素；xii)在紅細(xì)胞生成素分子內(nèi)包含至少一個(gè)胱氨酸鍵的至少一個(gè)口的紅細(xì)胞生成素；和xiii)截短的紅細(xì)胞生成素。
全文摘要
提供用于治療患有炎癥的哺乳動(dòng)物的方法和組合物，即通過保護(hù)或增強(qiáng)炎癥相關(guān)的或表現(xiàn)出炎癥的效應(yīng)細(xì)胞、組織、器官或機(jī)體部分，通過系統(tǒng)或局部給予包含組織保護(hù)性細(xì)胞因子的組合物。本發(fā)明也包括聯(lián)合治療，所述聯(lián)合治療包括給予包含本發(fā)明組織保護(hù)性細(xì)胞因子的組合物和給予至少一種抗炎藥或至少一種免疫調(diào)節(jié)劑。
文檔編號(hào)A61P25/22GK1852731SQ03820404
公開日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2003年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月3日
發(fā)明者M·布賴恩斯, A·切拉米, C·切拉米 申請(qǐng)人:肯尼思S·沃倫協(xié)會(huì)有限公司