專利名稱：用于治療性治療的組合物和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及治療組合物和診斷組合物和方法，所述組合物和方法利用具有抗癌活性、抗轉移活性、抗白血病活性、抗病毒活性、抗感染活性和/或抗其它疾病活性的藥物和抗體，所述其它疾病例如炎性疾病、涉及異常粘著或致病性粘著的疾病、血栓形成和/或再狹窄、涉及異常聚集或致病性聚集的疾病和自身免疫病、心血管疾病例如心肌梗塞、視網膜病、由硫酸化酪氨酸依賴性蛋白質相互作用引起的疾病和通常的患病細胞。
背景技術：
抗體、噬菌體展示和組織靶向治療藥的組織選擇性靶向是制藥工業(yè)中的新興方向。已設計基于靶向的新的癌癥療法，以增加治療的特異性和效力，同時降低毒性并提高總體療效。針對腫瘤相關抗原的小鼠單克隆抗體(MAb)已用于將毒素、放射性核苷酸和化療綴合物靶向腫瘤的嘗試。另外，已開發(fā)出CD19、CD20、CD22和CD25等分化抗原在治療造血惡性腫瘤中作為癌特異性靶。雖然進行了深入的研究，但是這種方法仍有幾處局限性。一個局限性是難以分離適當的展示選擇性結合的單克隆抗體。第二個局限性是需要高抗體免疫原性作為成功分離抗體的先決條件。第三個局限性是最終產品包含有非人類序列，使得產生對非人類物質的免疫應答(例如人抗小鼠抗體-HAMA應答)。該HAMA應答經常產生較短的血清半壽期并且阻止重復治療，因而減少了抗體的治療價值。該后一局限性已激起人們在鼠源工程嵌合單克隆抗體或人源化單克隆抗體和發(fā)現人抗體這兩方面的興趣。該方法的另一個局限性是它僅能分離僅針對已知的和純化抗原的一種抗體。而且，該方法對允許分離針對存在于正常細胞及惡性細胞上的抗細胞表面標記的抗體沒有選擇性。
有許多影響單克隆抗體治療癌癥的治療效果的因素。這些因素包括腫瘤細胞表達的抗原特異性、表達水平、抗原異質性和腫瘤塊的可及性。白血病和淋巴瘤對于抗體的治療通常比實體瘤如癌更具有反應性。單克隆抗體迅速地結合到血流中的白血病細胞和淋巴瘤細胞，并容易地滲透到淋巴組織中的惡性細胞，因而淋巴腫瘤成為基于單克隆抗體治療的極好候選者。一個理想的系統必需能鑒定識別產生惡性子代細胞的干細胞細胞表面標記的單克隆抗體。
噬菌體文庫可用于隨機篩選結合到分離的、預定的靶蛋白如抗體、激素和受體的單鏈Fv(scFv)。另外，通常應用抗體展示文庫，特別是噬菌體scFv文庫，可促使發(fā)現用于靶向特異性、尚未鑒別和尚未確定的細胞表面部分的獨特分子的替代方法。
白血病、淋巴瘤和骨髓瘤是源自骨髓和淋巴組織并且涉及細胞不受控制生長的癌癥。急性成淋巴細胞性白血病(ALL)是根據特定的臨床特征和免疫學特征定義的異質性疾病。同其它的ALL形式一樣，雖然大多數的B細胞ALL(B-ALL)病例的確切病因是未知的，但是在許多病例中，該病由單細胞DNA的獲得性遺傳改變所致，使細胞成為異常并連續(xù)增殖。罹患B-ALL的患者的預后，在兒童和成人兩者中，都比患其它白血病的患者要顯著更差些。
急性髓性白血病(AML)是在正常條件下產生終末分化的骨髓系細胞(紅細胞、粒細胞、單核細胞和血小板)的祖細胞的異質性腫瘤群體。同其它腫瘤形式一樣，AML與獲得性遺傳改變有關，它導致正常分化的骨髓細胞被表現出一種或多種早期骨髓分化類型的相對未分化的胚細胞所置換。通常AML在骨髓中并且在更小程度上在二級造血器官中發(fā)展。AML主要影響成人，最大影響范圍是15-40歲年齡段的人，但同樣已知它既影響兒童又影響老年人。幾乎所有AML患者都需要在診斷后立即進行治療以達到臨床緩解，其中沒有循環(huán)的未分化胚細胞異常水平的證據。
迄今為止，已開發(fā)出多種誘導抗腫瘤細胞的溶細胞活性的單克隆抗體。FDA批準了針對P185-生長因子受體(HER2)胞外結構域的單克隆抗體的人源化形式MuMAb4D5，并將其用于治療人乳腺癌(美國專利第5,821,337號和第5,720,954號)。在結合后，所述抗體能夠抑制依賴于HER2生長因子受體的腫瘤細胞生長。另外，抗引起外周B細胞快速耗盡的包括那些與淋巴瘤相關的CD20的嵌合抗體，近期已由FDA批準(美國專利第5,843,439號)。該抗體與靶細胞的結合產生補體依賴性溶胞作用。該產品近期已獲批準并且目前在臨床上用于治療低級B細胞非霍奇金淋巴瘤。
其它一些人源化抗體和嵌合抗體正在開發(fā)之中或正在進行臨床試驗。另外，與既在正常骨髓細胞表面又在大多數類型的髓性白血病細胞表面表達的CD33抗原特異性反應的人源化Ig，可與抗癌藥加利車霉素CMA-676綴合(Sievers等，Blood增刊，308，504a(1997))。該綴合物俗稱藥物MYLOTARGT，近期已得到FDA的批準(Caron等，Cancer增刊，73，1049-1056(1994))。根據它的溶細胞活性，另外一種近期在臨床試驗中的抗CD33抗體(HumM195)，可與數種細胞毒性劑綴合，包括與白樹毒素(McGraw等，Cancer Immunol.Immunother，39，367-374(1994))和放射性同位素131I(Caron等，Blood83，1760-1768(1994))、90Y(Jurcic等，Blood增刊，92，613a(1998))和213Bi(Humm等，Blood增刊，38231P(1997))綴合。
一種用于治療人類白血病和淋巴瘤的抗白細胞抗原CD45的嵌合抗體(cHuLym3)正在進行臨床研究(Sun等，Cancer Immunol.Immunother.，48，595-602(2000))。在體外實驗中，在ADCC(抗體依賴性細胞介導的細胞毒性)實驗中觀察到特異性溶胞作用(Henkart，Immunity，1，343-346(1994)；Squier和Cohen，Current Opin.Immunol.，6，447-452(1994))。
與小鼠單克隆人源化抗體和嵌合抗體的構建相反，應用噬菌體展示技術能夠分離包含完全人序列的scFv。最近開發(fā)一株基于scFv克隆，源于噬菌體展示技術的抗人TGFb2受體的完全人抗體。這種被轉換到完全人IgG4中，能與TGFb2競爭結合的scFv(Thompson等，J.Immunol Methods，227，17-29(1999))具有極強的抗增殖活性。這種本領域技術人員已知的技術更具體地描述在下列出版物中Smith，Science，228，1315(1985)；Scott等，Science，249，386-390(1990)；Cwirla等，PNAS，87，6378-6382(1990)；Devlin等，Science，249，404-406(1990)；Griffiths等，EMBO J.，13(14)，3245-3260(1994)；Bass等，Proteins，8，309-314(1990)；McCafferty等，Nature，348，552-554(1990)；Nissim等，EMBO J.，13，692-698(1994)；美國專利第5,427,908號、第5,432,018號、第5,223,409號和第5,403,484號，lib.。
分離的scFv抗體分子的配體血小板、血纖蛋白原、GPIb、選擇蛋白和P選擇蛋白糖蛋白配體-1(PSGL-1)等各自在一些病癥或疾病狀態(tài)例如異常或致病性炎癥、異常或致病性免疫反應、自身免疫反應、轉移、異常或致病性粘著、血栓形成和/或再狹窄和異?；蛑虏⌒跃奂衅鹬匾饔谩Ｒ虼?，與血小板和這些分子交叉反應的抗體將可用于診斷和治療包括這些和其它致病性病癥在內的疾病和障礙。
血小板血小板是血液系統典型特征成分，并且在止血、血栓形成和/或再狹窄以及再狹窄中起重要作用。對血管的損傷使例如已知的止血過程處于運轉中，其特征在于一系列連續(xù)事件。對損傷的血管的起始反應是血小板粘著到血管內表面的受侵襲區(qū)。下一步是多層血小板聚集到先前粘著的血小板上，形成止血栓。這種血小板決封閉所述血管壁。這種止血栓因血纖蛋白聚合物的沉積作用而加強。該血凝塊只有在所述損傷被修復時才被降解。
血小板在轉移中的重要性腫瘤轉移或許是限制癌癥患者生存的最重要因素。已積累的數據表明，腫瘤細胞與宿主血小板相互作用的能力是轉移不可缺少的決定因素之一。Leslie Oleksowicz，Z.M.，″Characterization Of Tumor-Induced Platelet AggregationThe Role Of Immunorelated GPIb AndGPIIb/IIIa Expression By MCF-7 Breast Cancer Cells(腫瘤誘發(fā)的血小板聚集特征由MCF-7乳腺癌細胞表達的免疫相關GPIb和GPIIb/IIIa的作用)，″Thrombosis Research 79261-274(1995)。
已經證明腫瘤細胞聚集血小板的能力和腫瘤細胞的轉移潛力相關，并且已經表明抑制腫瘤誘發(fā)的血小板聚集和嚙齒動物模型中的轉移抑制相關。已經證明腫瘤細胞與血小板的相互作用涉及膜粘著分子和激動劑的分泌。免疫相關血小板糖蛋白的表達已在腫瘤細胞系中鑒定出來。已經證明血小板免疫相關的糖蛋白GPIb、GPIIb/IIIa、GPIb/IX和整聯蛋白αv亞基在乳腺腫瘤細胞系表面表達。Oleksowicz，Z.M.，″Characterization Of Tumor-Induced Platelet AggregationTheRole Of Immunorelated GPIb And GPIIb/IIIa Expression By MCF-7Breast Cancer Cells(腫瘤誘發(fā)的血小板聚集特征由MCF-7乳腺癌細胞表達的免疫相關GPIb和GPIIb/IIIa的作用)，″Thrombosis Research79261-274(1995)；Kamiyama，M等，″Inhibition of platelet GPIIb/IIIabinding to fibrinogen by serum factorsstudies of circulating immunecomplexes and platelet antibodies in patients with hemophilia，immunethrombocytopenic purpura，human immunodeficiency virus-relatedimmune thrombocytopenic purpura，and systemic lupus erythematosus(血清因子對結合血纖蛋白原的血小板GPIIb/IIIa的抑制血友病、免疫性血小板減少性紫癜、人免疫缺陷病毒相關的免疫性血小板減少性紫癜和系統性紅斑狼瘡患者體內循環(huán)免疫復合物和血小板抗體的研究)，″J Lab Clin Med 117(3)209-17(1991)。
Gasic(J.T.B.Gasic等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 6146-52(1968))及其同事證明，抗體誘發(fā)的血小板減少顯著地減少由CT26結腸腺癌、路易斯肺癌和B16黑素瘤產生的轉移瘤的數目和體積。Karpatkin等，″Role of adhesive proteins in platelet tumor interaction in vitro andmetastasis formation in vivo(血小板腫瘤體外相互作用和體外轉移形成中粘著蛋白的作用)，″J.Clin.Invest.81(4)1012-9(1988)；Clezardin，P.等，″Role of platelet membrane glycoproteins Ib/IX and IIb/IIIa，and ofplatelet alpha-granule proteins in platelet aggregation induced by humanosteosarcoma cells(血小板膜糖蛋白Ib/IX和IIb/IIIa的作用以及人骨肉瘤細胞誘導的血小板聚集中血小板α粒蛋白的作用)，″Cancer Res.53(19)4695-700(1993)。此外，發(fā)現一條單多肽鏈(60kd)在與GPIb密切相關的HEL細胞膜表面表達，并對應于一個不完全或異常O糖基化GPIbα亞基。Kieffer，N.等，″Expression of platelet glycoprotein Ibalpha in HEL cells(HEL細胞中血小板糖蛋白Ibα的表達)，″J.Biol.Chem.261(34)15854-62(1986)。
GPIb復合物在止血過程中每一步都需要血小板表面受體的存在。一種在止血中重要的受體是糖蛋白Ib-IX復合物(也稱為CD42)。該受體介導血小板通過結合內皮下馮·維勒布蘭德氏因子(vWF)粘著(起始附著)到受傷部位的血管壁。它也在其它兩項止血中重要的血小板功能中起至關緊要的作用(a)由動脈狹窄區(qū)的高剪切誘導的血小板聚集和(b)由低濃度凝血酶誘導的血小板活化。
GPIb-IX復合物是血小板質膜外表面的主要成分之一。GPIb-IX復合物包含三種跨膜多肽-二硫鍵連接的GPIb 130kDaα-鏈和25kDaβ-鏈和非共價締合的GPIX(22kDa)。為了有效的細胞表面表達和CD42復合物的功能，所有這4個單位都以等摩爾量存在于血小板膜上，表明這3個亞基正確地裝配成復合物是在質膜上完全表達所需要的。GPIbα-鏈含有3個獨特的結構域(1)富含亮氨酸重復序列和半胱氨酸鍵合的側翼序列的球狀N末端肽結構域；(2)高度糖基化粘蛋白樣巨糖肽結構域和(3)含有GPIbβ與跨膜序列和胞質序列二硫橋的膜相關C末端區(qū)。
數條證據顯示，vWF和GPIb-IX復合物的凝血酶結合結構域位于包含GPIbα的氨基末端約300個氨基酸的球狀區(qū)。人血小板GPIb-IX復合物是介導血小板功能和反應性兩方面的關鍵性膜受體。通過GPIb識別內皮下結合的vWF可使血小板粘著到受損傷的血管上。此外，vWF與GPIbα的結合也誘導血小板活化，這可能涉及GPIb-IX的胞質結構域與細胞骨架或磷脂酶A2的相互作用。而且，GPIbα含有α凝血酶的高親和性結合部位，其通過一種至今仍知之甚少的機制促進血小板的活化。
GPIbα的N末端球狀結構域含有負電荷氨基簇。數條證據表明，在表達GPIb-IX復合物的轉染CHO細胞中和在血小板GPIbα中，這三個酪氨酸殘基經過硫酸化包含在該結構域(Tyr-276、Tyr-278和Tyr-279)中。
蛋白質硫酸化蛋白質硫酸化是普遍存在的翻譯后修飾，包括硫酸的酶促共價連接到或者糖側鏈或者多肽主鏈上。這種修飾發(fā)生在高爾基體外側區(qū)室，因此僅影響穿過該區(qū)室的蛋白質。這樣的蛋白質包括分泌蛋白、粒靶向蛋白和質膜蛋白的胞外區(qū)。酪氨酸是目前已知的經過硫酸化的氨基酸殘基。J.W.Kehoe等，Chemistry and Biol 7R57-R61(2000)。其它的氨基酸例如蘇氨酸或許也會經過硫酸化，特別在患病細胞中。
已發(fā)現許多蛋白質是酪氨酸硫酸化的，但是在單一多肽鏈中存在3個或多個硫酸化酪氨酸并不常見，如在GPIb上所發(fā)現的。由血小板和巨核細胞表達的GPIbα(CD42)介導血小板通過與vWF結合而附著到內皮下并在內皮下前滾，在其N末端結構域也帶有許多負電荷。認為這樣的高酸性高親水性環(huán)境是硫酸化先決條件，因為酪氨酰蛋白磺基轉移酶特異性識別酸性氨基殘基并使酸性氨基殘基附近的酪氨酸硫酸化。J.R.Bundgaard等，JBC 27221700-21705(1997)。GPIbα的酸性區(qū)的完全硫酸化產生一個具有負電荷高密度的區(qū)-在一個19個氨基酸序列段中有13個負電荷，使它成為與其它蛋白質靜電作用的候選部位。
選擇蛋白和PSGL-1P、E和L選擇蛋白是粘著分子家族，其功能尤其可介導白細胞在血管內皮上的前滾。P選擇蛋白貯藏在血小板的顆粒中，并且在經過凝血酶、組胺、佛波醇酯或其它刺激分子活化后轉運到顆粒表面。P選擇蛋白也可在活化內皮細胞上表達。E選擇蛋白在內皮細胞上表達，而L選擇蛋白在嗜中性粒細胞、單核細胞、T細胞和B細胞上表達。
PSGL-1(也稱為CD162)是P選擇蛋白、E選擇蛋白和L選擇蛋白的粘蛋白糖蛋白配體。PSGL-1是二硫鍵連接的具有PACE(成對堿性氨基酸轉化酶)切割位點的同型二聚體。PSGL-1也具有三個潛在的酪氨酸硫酸化位點，所述位點緊接約15個富含脯氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的十聚體重復。PSGL-1的胞外部分含有三個N聯糖基化位點和眾多的唾液酸化、巖藻糖基化O聯寡糖分支。K.L.Moore等，JBC118445-456(1992)。大多數N聚糖位點和許多O聚糖位點已被占據。人HL-60細胞PSGL-1的O聚糖的結構已經確定。這些O聚糖的亞群是結合選擇蛋白所需的核心-2、唾液酸化和巖藻糖基化結構。PSGL-1的氨基末端區(qū)的酪氨酸硫酸化也是結合P選擇蛋白和L選擇蛋白所必需的。此外，存在或許翻譯后切割的N末端前肽。
PSGL-1在HL60細胞中具有361個殘基，包括一個267個殘基的胞外區(qū)，一個25個殘基的跨膜區(qū)和一個69個殘基的胞內區(qū)。編碼PSGL-1的序列是在一個外顯子中，所以可變剪接應該是不可能的。然而，HL60細胞中和大多數細胞系中的PSGL-1具有在胞外區(qū)中存在的10個殘基共有序列的15個連續(xù)重復，但該序列在多形核白細胞、單核細胞和包括大多數天然白細胞在內的其它幾個細胞系中卻具有14個和16個重復。PSGL-1在細胞表面形成二硫鍵聯接的同型二聚體。V.Afshar-Kharghan等，Blood 973306-3312(2001)。
PSGL-1在嗜中性粒細胞上表達為二聚體，表觀分子量既有250kDa又有160kDa，然而在HL60上，所述二聚體形式是～220kDa。當在還原條件下分析時，每個亞基只一半被還原。分子質量的差異可能是由于所述分子中由不同數目的十聚體重復存在產生的多態(tài)現象所致。Leukocyte Typing第五版，T.Kishimoto等編著，(1997)。
PSGL-1在大多數血液白細胞例如嗜中性粒細胞、單核細胞、白細胞、B細胞亞群和所有T細胞上表達，并且介導嗜中性粒細胞在P選擇蛋白上前滾。Leukocyte Typing第五版，T.Kishimoto等編著，(1997)。PSGL-1也可以通過與L選擇蛋白結合的相互作用來介導嗜中性粒細胞-嗜中性粒細胞，從而介導炎癥。Snapp等，Blood91(1)154-64(1998)。
PSGL-1介導白細胞在活化內皮、活化血小板和其它白細胞和炎癥部位上的前滾。
一種可商業(yè)化獲得的抗人PGSL-1單克隆抗體KPL1已產生并顯示可抑制PGSL-1和P選擇蛋白之間以及PGSL-1和L選擇蛋白之間的相互作用。KPL1表位作圖至PGSL-1的酪氨酸硫酸化共有基序(YEYLDYD)。KPL1僅識別這個特殊的表位，并且不與其它細胞上例如B-CLL細胞、AML細胞、轉移細胞、多發(fā)性骨髓瘤細胞等上存在的硫酸化表位交叉反應。
白細胞前滾在炎癥中是重要的，并且P選擇蛋白(由活化內皮在血小板上表達，可固定在受傷部位)和PSGL-1間的相互作用對白細胞在血管壁上的粘連和前滾是有幫助的。Ramachandran等，PNAS98(18)10166-71(2001)；Afshar-Kharghan等，Blood 97(10)3306-7(2001)。
細胞前滾在轉移中也是重要的，并且相信內皮細胞上的P選擇蛋白和E選擇蛋白結合轉移細胞，從而促使從血流中外滲進入到周圍組織中。
血小板也參與轉移過程；當轉移性癌細胞進入血流時，可形成由血小板和包被腫瘤細胞的白細胞所組成的多細胞復合物。這些復合物，可稱作微栓塞，幫助腫瘤細胞逃避免疫系統。由血小板包被的腫瘤細胞需要由血小板表達P選擇蛋白。
用肝素(P選擇蛋白和L選擇蛋白的抑制劑)治療可抑制腫瘤細胞-血小板的相互作用。用去除了唾液酸化、巖藻糖基化粘蛋白配體的O唾液酸糖蛋白酶預處理腫瘤細胞，也抑制腫瘤細胞-血小板復合物的形成。體內實驗表明這些處理中任一項可產生更多的與循環(huán)腫瘤細胞相關的單核細胞，提示減少血小板結合可增強免疫細胞接近循環(huán)的腫瘤細胞。Varki和Varki，Braz.J.Biol.Res.34(6)711-7(2001)。
PSGL-1和GPIb共享具有粘蛋白樣、高度糖基化配體結合區(qū)的結構相似性。Afshar-Kharghan等，Blood 97(10)3306-7(2001)。
PSGL-1存在于已在所有白細胞即嗜中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞、活化外周T細胞、粒細胞、嗜酸性粒細胞、血小板上以及存在于某些CD34陽性干細胞和某些B細胞亞群上。P選擇蛋白在活化血小板和內皮細胞上選擇性表達。P選擇蛋白和PSGL-1之間的相互作用促進白細胞在血管壁上的前滾，并且白細胞在血管部位的異常累積引起各種病理性炎癥。PSGL-1上個別酪氨酸硫酸化的立體特異性貢獻對P選擇蛋白與PSGL-1的結合是重要的。電荷對于結合也是重要的減少NaCl(從150mM減至50mM)增強結合(Kd～75nM)。PSGL-1上酪氨酸硫酸化可增強PSGL-1粘著在P選擇蛋白上，但畢竟不是PSGL-1粘著在P選擇蛋白上所必需的。PSGL-1酪氨酸硫酸化支持以各種剪切速率較緩慢地前滾粘著，又支持以高得多的剪切速率前滾粘著。(Rodgers SD等，Biophys J.812001-9(2001))。
血纖蛋白原正常的人血纖蛋白原有兩種形式血纖蛋白原γ主要變體和血纖蛋白原γ′次要變體，其中每一種都存在于正常個體中。正常的血纖蛋白原，是更高豐度的形式(約占體內存在的血纖蛋白原的90％)，是由兩條相同的55kDaα鏈、兩條相同的95kDaβ鏈和兩條相同的49.5kDaγ鏈組成。正常的血纖蛋白原變體，是較少豐度的形式(約占體內存在的血纖蛋白原的10％)，是由兩條相同的55kDaα鏈、兩條相同的95kDaβ鏈、一條49.5kDaγ鏈和一條50.5kDaγ′鏈組成。γ鏈和γ′鏈都由同一基因編碼，該基因具有在3′端存在的可變剪接。正常的γ鏈由氨基酸1-411組成。正常的γ′鏈變體由427個氨基酸組成氨基酸1-407是與正常γ鏈中的那些氨基酸一樣的，而氨基酸408-427是VRPEHPAETEYDSLYPEDDL。該區(qū)通常被凝血酶分子占據。
血纖蛋白原在離子化鈣存在時，通過凝血酶的作用轉變成血纖蛋白，導致血液凝固。血纖蛋白也是血栓成分和急性炎癥滲出物。
血小板以及在細胞-細胞相互作用、細胞-基質相互作用、血小板-血小板相互作用、血小板-細胞相互作用、血小板-基質相互作用、細胞前滾和粘著以及止血中起重要作用的分子(例如血纖蛋白原、GPIb、選擇蛋白和PSGL-1)也在致病性病癥或疾病狀態(tài)例如異?；蛑虏⌒匝装Y、異?；蛑虏⌒悦庖叻磻?、自身免疫反應、腫瘤轉移、異?；蛑虏⌒哉持?、血栓形成和/或再狹窄以及異?；蛑虏⌒跃奂衅鹬匾饔谩Ｒ虼?，與血小板和這些分子交叉反應的抗體可用于診斷和治療中包括這些和其它致病性病癥在內的疾病和障礙。
本發(fā)明的一個目的是提供抗體或其片段和藥物的組合物，所述藥物包括抗癌藥、抗轉移藥、抗白血病藥、抗病藥、抗粘著藥、抗血栓形成藥、抗再狹窄藥、抗自身免疫藥、抗聚集藥、抗菌藥、抗病毒藥或抗炎藥等藥物。
本發(fā)明的另一個目的提供利用藥物以及抗體或其片段來治療各種病癥的方法，所述病癥包括那些與細胞前滾相關的疾?。谎装Y；自身免疫??；腫瘤轉移；腫瘤細胞的生長和/或增殖；腫瘤細胞的死亡率；白血病細胞的生長和/或增殖；白血病細胞的死亡率；患病細胞對抗病藥損傷的敏感性；腫瘤細胞對抗腫瘤藥損傷的敏感性；白血病細胞對抗白血病藥損傷的敏感性；腫瘤或癌癥患者體內腫瘤細胞數和白血病患者體內白血病細胞數。
本發(fā)明的再一個目的是提供利用藥物以及抗體或其片段進行治療性治療的方法，其中所述藥物和/或抗體或其片段在組合物中的含量低于所述藥物通常單獨給予時發(fā)現的該藥物的臨床有效量的量。
本文提供了本發(fā)明的這些目的和其它目的。
發(fā)明概述本發(fā)明提供含有藥物以及抗體或其片段的組合物。本發(fā)明組合物是這樣的組合物以致于所述藥物可以與所述抗體或其片段復合；所述藥物可以與所述抗體或其片段結合；或者所述藥物可以與抗體或其片段綴合。本發(fā)明組合物的抗體或其片段可以以一種或多種抗體或片段的復合物或聚集體存在。
在本發(fā)明組合物中，所述藥物和/或所述抗體或其片段可以為亞臨床量。這種亞臨床量不足以有效改變對藥物的敏感性，特別是患病細胞的敏感性。所述藥物可以是抗癌藥、抗轉移藥、抗白血病藥、抗病藥、抗粘著藥、抗血栓形成藥、抗再狹窄藥、抗自身免疫藥、抗聚集藥、抗菌藥、抗病毒藥或抗炎藥。優(yōu)選所述藥物是蒽環(huán)霉素或其衍生物，可以是多柔比星、柔紅霉素、伊達比星、嗎啉多柔比星、嗎啉柔紅霉素、甲氧嗎啉多柔比星或它們的衍生物或組合。最優(yōu)選所述藥物是多柔比星或其衍生物。
此外，所述藥物的亞臨床量不足以有效抑制細胞前滾、炎癥、自身免疫病、血栓形成、再狹窄、腫瘤轉移、或者腫瘤細胞或白血病細胞的存活、生長和/或增殖。另外，所述藥物的亞臨床量不足以有效抑制腫瘤患者體內腫瘤細胞數的增加或者不足以有效抑制白血病患者體內白血病細胞數的增加。同樣，所述藥物的亞臨床量不足以有效減少腫瘤患者體內的腫瘤細胞數或者不足以有效減少白血病患者體內的自血病細胞數。另外，所述藥物的亞臨床量不足以有效增加腫瘤細胞或白血病細胞的死亡率、不足以有效增加腫瘤細胞對抗癌藥損傷的敏感性、或者不足以有效增加白血病細胞對抗白血病藥損傷的敏感性。最后，所述藥物的亞臨床量不足以有效抑制細胞-細胞、細胞-基質、血小板-基質、血小板-血小板和/或細胞-血小板復合物形成、聚集或粘著。
本發(fā)明組合物的抗體或其片段可以具有SEQ ID NO1、SEQ IDNO2或SEQ ID NO3的scFv抗體片段的結合能力。另外，所述抗體或其片段可以具有肽或多肽的結合能力，其中所述肽或多肽具有SEQ ID NO4的第一高變區(qū)。這種肽或多肽還可以具有SEQ ID NO5的第二高變區(qū)和/或SEQ ID NO6、SEQ ID NO7或SEQ ID NO8的第三高變區(qū)。所述抗體或其片段可以是scFv或Fab片段。
本發(fā)明組合物也可以含有藥物以及抗體或其片段，其中所述抗體或其片段結合長度約3個至約126個氨基酸殘基的肽或多肽表位，所述肽或多肽表位具有至少2個酸性氨基酸和至少一個硫酸化酪氨酸殘基。另外，本發(fā)明的組合物可含藥物以及抗體或其片段，其中所述抗體或其片段結合至少兩種不同的分子，所述分子選自PSGL-1、血纖蛋白原γ′、GP1bα、肝素、腔蛋白聚糖(lumican)、補體化合物4(CC4)、interalpha抑制劑和凝血酶原。另外同樣，本發(fā)明的組合物可含藥物以及抗體或其片段，其中所述抗體或其片段結合至少兩種不同的分子和結合至少一種細胞類型，所述分子選自PSGL-1、血纖蛋白原γ′、GP1bα、肝素、腔蛋白聚糖、補體化合物4(CC4)、interalpha抑制劑和凝血酶原，所述細胞類型選自B細胞白血病細胞、B-CLL細胞、AML細胞、多發(fā)性骨髓瘤細胞和轉移細胞。此外，本發(fā)明的組合物可以含有藥物以及抗體或其片段，其中所述抗體或其片段與兩個或多個表位交叉反應，每個表位包含一個或多個硫酸化酪氨酸殘基和兩個或多個酸性氨基酸的至少一個聚簇。
在本發(fā)明的組合物中，所述抗體或其片段可與媒介物或載體偶聯或復合或結合，所述媒介物或載體與不止一種藥物偶聯或聯合或結合。這種媒介物或載體可選自葡聚糖、親脂聚合物、親水聚合物、HPMA和脂質體。所述媒介物或載體優(yōu)選是多柔比星修飾的脂質體?；蛘?，所述媒介物或載體優(yōu)選是聚乙二醇(PEG)或葡聚糖。
本發(fā)明也提供將本發(fā)明的組合物給予有需要的患者的方法。例如，通過將本發(fā)明的任一種組合物給予有需要的患者，本發(fā)明也提供緩解疾病效應、預防疾病、治療疾病或者抑制疾病進程的方法。本發(fā)明提供一種抑制細胞前滾、炎癥、自身免疫病、血栓形成、再狹窄、轉移、腫瘤細胞生存、生長和/或增殖、白血病細胞生長和/或增殖、增加腫瘤患者體內的腫瘤細胞數或增加白血病患者體內的白血病細胞數的方法。另外，本發(fā)明提供增加腫瘤細胞的死亡率、增加白血病細胞的死亡率、增加患病細胞對抗病藥損傷的敏感性、增加腫瘤細胞對抗癌藥損傷的敏感性或增加白血病細胞對抗癌藥損傷的敏感性的方法。此外，本發(fā)明提供減少腫瘤患者體內的腫瘤細胞數、減少白血病患者體內的白血病細胞數的方法。最后，本發(fā)明提供抑制細胞-細胞、細胞-基質、血小板-基質、血小板-血小板和/或細胞-血小板復合物形成、聚集或粘著的方法。
本發(fā)明也提供一種治療性治療的方法，所述方法通過給予有需要的患者(i)抗體或其片段和(ii)藥物，其中一種或兩種所述抗體或其片段和/或所述藥物以亞臨床量給予。在該方法中，所述藥物以及抗體或其片段可以綴合、復合或聯合給予。此外，所述藥物可單獨給予，在給予抗體或其片段之前或之后給予，或者按任一種其它的順序給予，反之亦然。
定義抗體(Ab)或免疫球蛋白(IgG)是結合抗原的蛋白質分子。它們由通過二硫鍵連接在一起的四條多肽鏈(2條重鏈和2條輕鏈)單位組成。每條鏈都具有恒定區(qū)和可變區(qū)。根據它們的重鏈組分，可將其分成五類IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。IgG類包括幾個亞類，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。免疫球蛋白由B淋巴細胞在體內產生，并識別特定的外源抗原決定簇并促使該抗原的清除。
抗體可以以多種形式制備和使用，包括抗體復合物。如本文所用的術語“一種抗體復合物”或“多種抗體復合物”用于指一種或多種抗體與另一種抗體或與一條抗體片段或多條抗體片段形成的復合物，或者兩條或多條抗體片段的復合物?？贵w片段的實例包括Fv、Fab、F(ab′)2、F(ab′)、Fc和Fd片段。
如本發(fā)明說明書中和權利要求中所用的，Fv定義為由人抗體的重鏈可變區(qū)和人抗體的輕鏈可變區(qū)組成的分子，它們可以相同或不同，并且其中重鏈可變區(qū)連接、聯接、融合或共價連接到或締合到輕鏈可變區(qū)。Fv可以是單鏈Fv(scFV)或二硫鍵穩(wěn)定的Fv(dsFV)。scFV由抗體的每一條重鏈和輕鏈的可變區(qū)組成，由柔性氨基酸多肽間隔區(qū)或接頭連接。該接頭可以是分支的或不分支的。優(yōu)選接頭是0-15個氨基酸殘基，最優(yōu)選接頭是(Gly4Ser)3。
Fv分子本身包含第一鏈和第二鏈，每條鏈包含第一、第二和第三高變區(qū)。輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)中的高變環(huán)被稱為互補決定區(qū)(CDR)。每條重鏈和輕鏈中有CDR1區(qū)、CDR2區(qū)和CDR3區(qū)。相信這些區(qū)形成抗原結合部位，并可以特異地修飾以產生增強的結合活性。這些區(qū)最可變的實際上是重鏈的CDR3區(qū)。CDR3區(qū)推定是Ig分子的最暴露區(qū)，并且如本文所示和提供的是主要負責選擇性和/或觀察到的特異性結合特性的部位。
Fv分子的片段定義為小于原始Fv但仍保持原始Fv的選擇性和/或特異性結合特性的任何分子。這種片段的實例包括但不限于(1)小型抗體(minibody)，僅包含Fv重鏈的片段，(2)微型抗體(microbody)，包含抗體重鏈可變區(qū)的小片段(PCT申請?zhí)朠CT/IL99/00581)，(3)包含輕鏈片段的相似抗體，和(4)包含輕鏈可變區(qū)的功能單位的相似體。
本文所用的術語“Fab片段”是免疫球蛋白的單價抗原結合片段。Fab片段由輕鏈和重鏈的一部分組成。
F(an′)2片段是通過胃蛋白酶消化獲得的免疫球蛋白的二價抗原結合片段。它含有兩條輕鏈和兩條重鏈的一部分。
Fc片段是免疫球蛋白的非抗原結合部分。它包含重鏈的羧基末端部分和Fc受體結合部位。
Fd片段是免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)和第一恒定區(qū)。
多克隆抗體是免疫應答的產物，并由許多不同的B-淋巴細胞形成。單克隆抗體源自單個細胞。
適用于多肽和在本發(fā)明中所定義的盒是指一段給定的連續(xù)氨基酸序列，其用作構架并認為是一個單位，并且可按一個單位操作。氨基酸可以在一端或兩端置換、插入、去除或連接。同樣，氨基酸序列段可以在一端或兩端置換、插入、去除或連接。
本文所用的術語“表位”是指與抗體、抗體片段、抗體復合物或包含其結合片段的復合物或T細胞受體相互作用的抗原決定簇或抗原部位。術語表位與術語配體、結構域和結合區(qū)在本文中可互換使用。
選擇性在本文中定義為靶向分子從可能對所述靶向分子特異性各種細胞類型或細胞狀態(tài)、所有的細胞類型或細胞狀態(tài)的混合物中選擇和結合一種細胞類型或細胞狀態(tài)的能力。
本文所用的術語“親和性”是受體(例如抗體上的一個結合部位)和配體(例如抗原決定簇)之間結合強度的測量值(締合常數)。抗體上的一個抗原結合部位和一個表位之間的非共價相互作用之和的強度是該抗體對該表位的親和性。低親和性抗體弱結合抗原并趨向容易解離，然而高親和性抗體更緊密地結合抗原并保持更長久的結合。術語“親合性”不同于親和性，因為前者反映抗原-抗體相互作用的價位。
抗體-抗原相互作用的特異性雖然抗原-抗體反應是特異性的，但在某些情況下由一種抗原誘發(fā)的抗體可以和另外的無關抗原交叉反應。如果兩個不同的抗原共享同源或相似的結構、表位或其錨定區(qū)、或者如果一種表位特異性抗體結合擁有相似結構構象或化學性質的無關表位時，可發(fā)生這種交叉反應。
血小板為巨核細胞的圓盤形胞質碎片，它在骨髓竇中脫落，隨后在外周血流中循環(huán)。血小板具有某些生理功能，包括在凝血中起的主要作用。血小板包含位于中心的顆粒和外周透明胞質，但沒有明確的核。
本文使用的凝集指懸浮的細菌、細胞、血小板或其它類似大小的顆粒粘附形成凝塊的過程。該過程與沉淀相似，但顆粒較大，多為懸浮液而不是溶液。
術語聚集指血小板與凝血酶和膠原共同作為連續(xù)機制的一部分在體外引起的結塊，形成血栓或止血栓。
保守氨基酸取代定義為通過改變肽、多肽或蛋白質或其片段的一個或兩個氨基酸而改變氨基酸的組成。所述取代通常是具有相似特性(例如酸性、堿性、芳族、大小、正電荷或負電荷、極性、非極性)的氨基酸，所以取代基本不會在主要方面改變肽、多肽或蛋白質特征(例如電荷、IEF、親和性、親合性、構象、溶解性)或活性?？赡軐崿F這種保守氨基酸取代的典型取代可以在下列氨基酸組中發(fā)生甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)和異亮氨酸(I)天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)組氨酸(H)、賴氨酸(K)和精氨酸(R)天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)
保守氨基酸取代也可在鄰接主要負責分子選擇性和/或特異性結合特性的高變區(qū)中，以及分子的其它部分，例如重鏈可變盒中進行。另外，可通過重建分子形成完整大小的抗體、雙功能抗體(diabody)(二聚體)、三功能抗體(triabody)(三聚體)和/或四功能抗體(tetrabody)(四聚體)或形成小型抗體或微型抗體完成修飾。
噬菌粒定義為攜帶質粒DNA的噬菌體顆粒。噬菌粒是設計包含絲狀噬菌體復制起始點如fd的ml3的質粒載體。因為它攜帶質粒DNA，所以該噬菌粒顆粒沒有足夠的空間來包含完整的噬菌體基因組的互補序列。在所述噬菌體基因組中缺少的成分是噬菌體粒子包裝所必需的信息。所以，為了繁殖所述噬菌體，有必要與補充了所述缺少包裝信息的輔助噬菌體株一起培養(yǎng)所需的噬菌體顆粒。
啟動子是DNA上RNA聚合酶結合并起始轉錄的區(qū)。
噬菌體展示文庫(也稱為噬菌體肽/抗體文庫、噬菌體文庫或肽/抗體文庫)包含一個大的噬菌體群體(通常108-109)，每個噬菌體顆粒展示一個不同的肽或多肽序列。這些肽或多肽片段可構建成可變的長度。被展示的肽或多肽可源自但不限于人抗體重鏈或輕鏈。
藥用組合物是指包含本發(fā)明的肽或多肽及其藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑的制劑。
藥物是指可用于預防性治療或診斷哺乳動物(包括但不限于人、牛、馬、豬、鼠、犬、貓或任一其它溫血動物)的藥物。所述藥物選自放射性同位素、毒素、寡核苷酸、重組蛋白、抗體片段和抗癌藥。這類藥物的實例包括但不限于抗病毒藥，包括阿昔洛韋、更昔洛韋和齊多夫定；抗血栓形成藥/抗再狹窄藥，包括西洛他唑、達肝素鈉、瑞肝素鈉和阿司匹林；抗炎藥，包括扎托洛芬、普拉洛芬、屈噁昔康、乙酰水揚酸17、雙氯芬酸、布洛芬、右布洛芬、舒林酸、萘普生、氨托美丁、塞來考昔、吲哚美辛、羅非考昔、尼美舒利；抗自身免疫藥，包括來氟米特、地尼白介素2、subreum、WinRho SDF、去纖苷和環(huán)磷酰胺；抗粘著藥/抗聚集藥，包括利馬前列素、氯克羅孟和透明質酸。
抗白血病藥是具有抗白血病活性的藥物。例如，抗白血病藥包括抑制或停止白血病細胞或未成熟的前白血病細胞生長的藥物、殺死白血病細胞或前白血病細胞的藥物、增加白血病細胞或前白血病細胞對其它抗白血病藥物的敏感性的藥物和抑制白血病細胞轉移的藥物。在本發(fā)明中，抗白血病藥也可以是具有抗血管生成活性的藥物，從而預防、抑制、延遲或停止腫瘤血管形成。
可以通過分析基因在各種條件下、在特定時間、在各種組織中等產生的產物量，對基因的表達模式進行研究。當基因產物的量比在正常對照例如非患病對照中發(fā)現的產物量高時，則可認為基因是“過量表達的”。
給定細胞可以在其表面表達具有給定抗體結合部位(或表位)的蛋白質，但是該結合部位可以以隱藏的形式(例如被位阻或被封閉，或缺乏抗體結合必需的特征)存在于所述細胞的一種狀態(tài)中，這種現象可稱作第一期(I期)。I期可以是例如正常的、健康的、非患病狀態(tài)。當表位以隱藏的形式存在時，它不能由給定的抗體識別，即不會有抗體結合到這個表位或I期的給定細胞上。然而，所述表位可通過例如經過自身修飾，或因為鄰近或相關的分子被修飾或因為某個區(qū)經構象變化去除封閉而暴露。修飾的實例包括折疊變化、翻譯后修飾變化、磷脂化變化、硫酸化變化、糖基化變化等。當細胞進入不同的狀態(tài)時，可以發(fā)生這些修飾，這種現象稱作第二期(II期)。第二期等的實例包括活化、增殖、轉化或處于惡性狀態(tài)。經過修飾，則可以暴露表位并且抗體可以結合。
肽模擬物是具有相同的功能作用或另一實體例如抗體的活性的小分子、肽、多肽、脂質、多糖或其綴合物。
附圖簡述

圖1圖示單獨、序貫或聯合給予多柔比星和Y1后攜帶MOLT-4腫瘤的小鼠的存活百分率對時間(天)的曲線圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及包括藥物以及抗體或其片段的組合物和方法。本發(fā)明組合物可以是，致使一種或多種抗體或其片段與一種或多種不同的藥物聚集、締合、復合或結合或者綴合、融合或連接，例如藥物、毒素和放射性同位素任選連同藥學上有效的載體一起形成具有抗病活性和/或抗癌活性的藥物-肽復合物、組合物或綴合物。這種復合物、組合物或綴合物也可用于診斷目的。此外，所述藥物和抗體在所述組合物中可以為亞臨床量。亞臨床量是指小于當所述藥物和/或抗體單獨給予時通常發(fā)現的藥物和/或抗體臨床最佳有效量的量。亞臨床量也可以指小于通常發(fā)現的、引起已知的臨床反應必需的藥物和/或抗體量的量。人們將會認識到，當根據本發(fā)明組合物和方法給藥時，亞臨床量不是指所述藥物和/或抗體在臨床上是無效的。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述藥物的亞臨床量可以是不足以有效改變對藥物的敏感性，特別是患病細胞的敏感性。例如，所述藥物的亞臨床量可以是不足以有效抑制細胞前滾、炎癥、自身免疫病、血栓形成、再狹窄、轉移或者腫瘤細胞或白血病細胞的生長和/或增殖。另外，所述藥物的亞臨床量可以是不足以有效抑制腫瘤患者體內腫瘤細胞數的增加或者不足以有效抑制白血病患者體內白血病細胞數的增加。所述藥物的亞臨床量也可以是不足以有效減少腫瘤患者體內腫瘤細胞數或者不足以有效減少白血病患者體內白血病細胞數。另外，所述藥物的亞臨床量可以是不足以有效增加腫瘤細胞或白血病細胞的死亡率，不足以有效增加腫瘤細胞對抗癌藥損傷的敏感性，或者不足以有效增加白血病細胞對抗白血病藥損傷的敏感性。最后，所述藥物的亞臨床量可以是不足以有效抑制細胞-細胞、細胞-基質、血小板-基質、血小板-血小板和/或細胞-血小板復合物形成、聚集或粘著。
優(yōu)選本發(fā)明組合物含具有結合SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的scFv抗體片段能力的抗體或其片段。SEQ ID NO1的scFv抗體片段已經指定為Y1，SEQ ID NO2的scFv抗體片段已經指定為Y17，SEQ ID NO3的scFv抗體片段已經指定為L32。通過篩選僅在重鏈CDR3區(qū)中具有多樣性的人抗體噬菌體文庫可鑒定這些抗體。就人scFv Y1和Y17抗體而論，為了鑒定結合血小板的抗體，可篩選固定化人血小板。篩選抗白血病細胞的L32以選擇識別白血病細胞表面決定簇的特異性抗體，其中特異性受體不是以前已知的或表征的。利用同樣的方法可鑒定另一抗體L31。
先前，用于本發(fā)明組合物中的抗體已在美國申請第10/032,423號；第10/032,037號；第10/029,988號；第10/029,926號；第09/751,181號；和第60/258,948號和國際申請?zhí)朠CT/US01/49442和PCT/US01/49440中利用相同的噬菌體文庫進行了鑒定。在這些申請中公開的具體的抗體實例包括Y1和Y17抗體。發(fā)現在這些申請中公開的抗體可特異地結合到造血細胞蛋白上存在的表位上，這些蛋白質的N末端酪氨酸已硫酸化并且認為其參與細胞遷移如腫瘤的轉移。
Y1抗體的表位位于糖萼蛋白，一個CD42復合物的亞單位上的氨基酸272和285間，其中CD42復合物具有由硫酸化基團產生的帶負電荷氨基酸簇，為Y1與糖萼蛋白結合所必需的。另外，Y1結合PSGL-1的N末端，PSGL-1是E、L和P選擇蛋白的受體，包含硫酸化伴隨帶負電荷氨基酸簇的酪氨酸殘基。雖然Y1抗體結合幾個分子，例如血小板上的糖萼蛋白分子、血纖蛋白原γ′、人血漿補體化合物4和KG-1細胞上的PSGL-1分子，它對源自AML或多發(fā)性骨髓瘤(MM)患者的原代白細胞的親和性相對于先前提及的表位要高幾個數量級。
另外，L32和L31抗體公開在2002年7月1日申請的美國申請第60/＿＿,＿＿號中，發(fā)明名稱為“L32 Antibodies and Uses Thereof(L32抗體及其應用)”。雖然L32以比Y1高大約5倍的親和性結合白血病細胞，但是L32抗體和在Y1/Y17申請中公開的抗體都可結合白血病細胞。雖然L32和Y1/Y17抗體均從共同的種系(DP32)中分離出來，并且L32似乎結合與Y1/Y17相同的硫酸化表位，但是L32不結合血小板，而且不影響血小板聚集。
先前鑒定的結合本發(fā)明優(yōu)選抗體的硫酸化表位的特征在于存在硫酸化部分，例如硫酸化酪氨酸殘基或硫酸化糖部分或脂質部分，優(yōu)選在兩個或多個酸性氨基酸簇內，在配體和受體上發(fā)現的所述聚簇在不同的過程如炎癥、免疫反應、感染、自身免疫反應、轉移、粘著、血栓形成和/或再狹窄、細胞前滾和聚集中起重要作用。這種表位也存在于患病細胞例如B細胞白血病細胞、B-CLL細胞、AML細胞、多發(fā)性骨髓瘤細胞和轉移細胞上。這些表位對這些過程的治療介導和診斷手術是有用的靶。
優(yōu)選本發(fā)明組合物的抗體結合參與炎癥的不同分子或表位，例如PSGL-1、血纖蛋白原γ′、GP1b、肝素、腔蛋白聚糖、補體化合物4(CC4)、interalpha抑制劑和凝血酶原。還優(yōu)選抗體結合存在于至少一種參與炎癥或腫瘤發(fā)生的細胞類型上的表位，包括B-CLL細胞、T-ALL細胞、AML細胞、B-白血病細胞、多發(fā)性骨髓瘤細胞和轉移細胞。更優(yōu)選本發(fā)明組合物的抗體結合脂質、糖、肽、糖脂、糖蛋白、脂蛋白和/或脂多糖分子上的表位。這樣的表位優(yōu)選具有至少一個硫酸化部分?；蛘撸且矁?yōu)選所述抗體與兩個和多個表位交叉反應，每個表位具有一個或多個硫酸化酪氨酸殘基和至少一個含兩個或多個酸性氨基酸簇，其實例是PSGL-1。
參與形成抗原結合部位的是本發(fā)明抗體的高變區(qū)。所述抗原結合部位與抗體結合的表位結構互補；因此這些結合位被稱為互補性決定區(qū)(CDR)。在抗體的每條輕鏈和重鏈上有三個CDR(CDR1、CDR2和CDR3)，每一個都位于連接VH區(qū)和VL區(qū)的β鏈的環(huán)上。這些區(qū)中最可變的是重鏈的CDR3區(qū)。認為CDR3區(qū)是Ig分子最暴露的區(qū)，如本文所提供的具有觀察到的決定選擇性和/或特異性結合特征的中心作用。
在本發(fā)明組合物的一個優(yōu)選實施方案中，所述抗體或其片段具有SEQ ID NO4的第一高變區(qū)(CDR3)。另外，或者，所述抗體或其片段具有SEQ ID NO5的第二高變區(qū)(CDR2)。另外，或者，所述抗體或其片段具有SEQ ID NO6、SEQ ID NO7或SEQ ID NO8的第三高變區(qū)(CDR1)。
根據本發(fā)明，CDR也可以插入到盒中，產生抗體。如適用于多肽和如本發(fā)明中定義的盒，是指用作構架的連續(xù)氨基酸的給定序列和考慮為一個單位和作為一個單位操作。氨基酸可在一端或兩端被置換、插入、去除或連接。同樣，氨基酸序列段可以在一端或兩端被置換、插入、去除或連接。所述盒的氨基酸序列可以表面上是固定的，而被置換、插入或連接的序列可以是高變的。所述盒可以包含幾個結構域，每個結構域包含對最終的構建體至關緊要的功能。本發(fā)明的一個具體實施方案的盒自N末端起包括構架區(qū)1(FR1)、CDR1、構架區(qū)2(FR2)、CDR2、構架區(qū)3(FR3)和構架區(qū)4(FR4)。在本發(fā)明的一個實施方案中，在所述盒內置換獨特的區(qū)是可能的。例如，所述盒的CDR2和CDR1高變區(qū)可以被非保守氨基酸取代，或者優(yōu)選保守氨基酸取代置換或修飾。
對于所有本文中詳細描述的≤25個氨基酸殘基的氨基酸序列(例如CDR區(qū)、CDR側翼區(qū))，人們知道和認識到，作為本發(fā)明的又一實施方案，這些氨基酸序列包括在一個或兩個氨基酸取代范圍內，優(yōu)選所述取代是保守氨基酸取代。對于所有本文中詳細描述的＞25個氨基酸殘基的氨基酸序列，人們知道和認識到，作為本發(fā)明的一個實施方案，這些氨基酸序列包括在一條氨基酸序列具有對原始序列有＞90％序列相似性范圍內(Altschul等，Nucleic Acids Res.253389-402(1997))。相似或同源的氨基酸定義為表現相似特性例如酸性、堿性、芳族、大小、正電荷或負電荷、極性、非極性的不同氨基酸。
氨基酸相似性或同源性或序列相似性的百分比可通過比較兩條不同的肽或多肽的氨基酸序列確定。抗體序列可通過DNA測序確定。通?？赏ㄟ^利用為此目的設計的多種計算機程序之一對兩條序列進行比對，并且比較每個位置上的氨基酸殘基。然后確定氨基酸同一性或同源性。然后應用算法測定氨基酸相似性百分比。由于極度增強的檢測肽、多肽或蛋白質分子間敏感關系的靈敏度，通常優(yōu)選比較氨基酸序列。蛋白質比較可以考慮保守氨基酸取代的存在，如果不同氨基酸具有相似的物理和/或化學特性，錯配還可能產生正分值(Altschul等，(1997)，同上)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，每條輕鏈和重鏈的三個高變區(qū)可以在兩條鏈間和在三個高變部位中的鏈內和/或鏈間互換。
本發(fā)明提供具有抗體或其片段、其構建體、或片段構建體的肽或多肽。根據本發(fā)明，抗體包括IgG、IgA、IgD、IgE或IgM抗體。IgG類包括幾個亞類，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
抗體可以以多種形式提供，例如片段，復合物和多聚體。根據本發(fā)明，抗體片段包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab2和Fd分子。較小的抗體片段例如各種Fv片段和各種Fab片段也包括在術語“片段”中，只要它們保留原始抗體或較大片段的結合特征。這些片段的實例會是(1)小型抗體，僅包含Fv重鏈片段，(2)微型抗體，包含抗體重鏈可變區(qū)的小部分單位(國際申請?zhí)朠CT/IL99/00581)，(3)具有輕鏈片段的相似抗體；和(4)具有輕鏈可變區(qū)的功能單位的相似抗體。構建體包括例如多聚體如雙功能抗體、三功能抗體和四功能抗體。短語“抗體或其片段或者具有抗體或其片段的復合物”以及“抗體或片段”預期包括所有的這些分子以及其衍生物和同源物、模擬物和變體，除非基于上下文和/或本領域的知識另外詳細說明或另外指出。
已建立scFv滲透組織并比完整大小的抗體更快地從血液中清除的方法，因為它們在大小上更小些(Adams等，Br.J.Cancer 771405-12(1988)；Hudson，Curr.Opin.Immunol.11(5)548-557(1999)；Wu等，Tumor Targeting 447(1999))。因而，scFv經常應用于診斷學，包括放射性標記例如腫瘤造影，以便更快地從身體中清除所述放射性標記。許多癌靶向scFv多聚體近期已對體內穩(wěn)定性和功效經過臨床前評估(Adams等，(1988)，參見上文；Wu(1999)，參見上文)。
通常，設計具有VH區(qū)的C末端通過多肽接頭連接到VL的N末端殘基的scFv單體。可任選用相反方向VL區(qū)的C末端通過多肽接頭連接到VH的N末端殘基(Power等，J.Immmun.Meth.242193-204(2000))。所述多肽接頭長度通常為約十五個氨基酸。當接頭減少到約三至七個氨基酸時，則scFv不能折疊成功能性Fv區(qū)中并改為與第二scFv締合形成雙功能抗體。根據接頭長度、組成和Fv區(qū)方向，更進一步減少所述接頭的長度到少于三個氨基酸，迫使scFv締合成三聚體或四聚體(Powers(2000)，參見上文)。
最近，已發(fā)現多價抗體片段例如scFv二聚體、三聚體和四聚體常常能比其親本抗體提供更高的親和性結合到靶上。這種更高的親和性提供了潛在的優(yōu)勢，包括改善腫瘤靶向應用的藥代動力學。另外，在研究參與白細胞的粘連和前滾的P選擇蛋白和其配體PSGL-1中，科學家們已推斷，表達PSGL-1二聚體形式的細胞，因為這種更高的結合親和性而建立了更穩(wěn)定的前滾粘著。這些粘著在前滾速度方面更完全抵抗并表現更少的波動(Ramachandran等，PNAS，98(18)10166-71(2001))。
這些多價形式的較高結合親和性可能有利于診斷和治療方案。例如，可應用scFv作為結合靶受體的阻斷劑，并且因此阻斷“天然”配體的結合。在這種情況下，人們所需的是，在scFv和所述受體間具有較高親和性的締合，以減少解離的可能性，這種解離可能使得天然配體不合需要地結合到靶上。另外，當所述靶受體參與粘著和前滾時，或當所述靶受體存在于高流動區(qū)的細胞例如血小板上時，這種高親和性可能是有益的。
一旦篩選和/或開發(fā)出具有所需結合能力的抗體、片段或構建體，則產生保持原始抗體的特征的構建體和片段，正好在利用本文提供指導的本領域技術人員能力范圍內。例如，可制備保持所需原始篩選的或開發(fā)的抗體、片段或構建體特性的完全抗體分子、Fv片段、Fab片段、Fab2片段、二聚體、三聚體和其它構建體。
如果需要取代氨基酸，但是仍保留抗體或片段的特征，則制備保守氨基酸取代正好在本領域技術范圍內。也可以對抗體或片段進行各種修飾，例如與藥劑或診斷劑復合或結合或綴合而不改變它們的結合特征。也可以對抗體或片段進行其它的例如那些產生更穩(wěn)定的抗體或片段的各種修飾而不改變它們的特異性。例如，可進行擬肽(peptoid)修飾、半擬肽(semipeptoid)修飾、環(huán)肽修飾、N末端修飾、C末端修飾、肽鍵修飾、主鏈修飾和殘基修飾。也可在遵從本說明書指導的技術人員的能力范圍內，測試經修飾的抗體或片段，以評價它們的結合特性是否改變。
同樣，改變抗體、片段或構建體的結合特性以獲得具有更多所需特性的分子，在利用本文提供指導的技術人員的能力范圍內。例如，一旦鑒定具有所需特性的抗體，則可用隨機或定點誘變產生所述抗體的變體和那些用于篩選所需特性的變體。
利用本領域已知的常規(guī)方法，技術人員也能夠確定用于本發(fā)明組合物中有結合能力的附加抗體或其片段。例如，附加抗體可用本文描述的生物淘選方法分離，其中結合到固定的人血小板或白血病細胞的分子或細胞常常篩選具體的噬菌體展示庫，特別是從白血病、淋巴瘤或骨髓瘤患者中制備的文庫。
利用本領域已知的常規(guī)方法，技術人員還能夠確定具有SEQ IDNO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的scFv抗體片段結合能力的抗體或其片段。另外的結合參與炎癥的不同分子或表位，例如PSGL-1、血纖蛋白原γ′、GP1B、肝素、腔蛋白聚糖、補體化合物4(CC4)、interalpha抑制劑和凝血酶原的抗體，也可利用本領域已知的常規(guī)方法確定。利用常規(guī)方法，本領域技術人員還能夠確定結合至少一種參與炎癥或腫瘤發(fā)生細胞類型上存在的表位的附加抗體，所述細胞類型包括B-CLL細胞、T-ALL細胞、AML細胞、B-白血病細胞、多發(fā)性骨髓瘤細胞和轉移細胞。此外，可用常規(guī)方法測定結合脂質、糖、肽、糖脂、糖蛋白、脂蛋白和/或脂多糖分子表位的抗體，其中所述表位優(yōu)選具有至少一個硫酸化部分?；蛘撸部捎贸Ｒ?guī)方法測定與兩個或多個表位交叉反應的抗體，每個表位具有一個或多個硫酸化酪氨酸殘基，和含兩個或多個酸性氨基酸的至少一個聚簇，其實例是PSGL-1。例如結合數據可用生物傳感器分析確定，例如用商業(yè)化的生物傳感器，BIACORE(Piscataway，N.J.)(Myszka，J.Mol.Recognition，12279-84(1999)；Malmborg&Borrebaeck，J.Immunol.Meth.，1837-13(1999))。
本發(fā)明提供scFv抗體。本文所用的scFv定義為由可以相同或不同的人抗體重鏈可變區(qū)和人抗體輕鏈可變區(qū)構成的分子，并且其中所述重鏈可變區(qū)連接、聯接、融合、或共價連接或締合所述輕鏈可變區(qū)。
scFv構建體可以是scFv分子的多聚體(例如二聚體、三聚體、四聚體等)，其結合一個或多個抗體高變區(qū)。為了選擇性和/或特異性結合到有利于其它細胞的靶細胞，所有scFv源性構建體和片段都保留增強的結合特征。結合的選擇性和/或特異性主要由高變區(qū)決定。可以構建本發(fā)明的抗體以折疊成多價Fv型，可能改善結合親和性和特異性，并且增加在血液中的半壽期。
其他人設計和制備了多價型的scFv。一種方法是用接頭連接兩個scFv。另一個方法包括利用二硫鍵在兩個scFv間連接。最簡單的制備二聚或三聚Fv的方法是由Holliger等，PNAS 906444-48(1993)和Kortt等，Protein Eng.10423-33(1997)報道的。已設計了一種這樣的方法，通過添加FOS和JUN蛋白區(qū)的一段序列，在它們之間、在scFv的C末端形成亮氨酸拉鏈結構，制備scFv的二聚體(Kostelny等，J Immunol.148(5)1547-53(1992)；De Kruif等，J Biol Chem.271(13)7630-34(1996))。設計了另一種方法，通過在scFv的C末端添加鏈霉親和素編碼序列，制備四聚體。鏈霉親和素由4個亞基組成，這樣當scFv-鏈霉親和素折疊時，4個亞基自我調節(jié)形成四聚體(Kipriyanov等，Hum Antibodies Hybridomas 6(3)93-101(1995))。在又一個方法中，在目標蛋白質中引入游離的半胱氨酸，制備二聚體、三聚體和四聚體。具有可變數目(2-4)的順丁烯二酰亞胺基團的基于肽的交叉接頭可用于交叉連接目標蛋白質和游離的半胱氨酸(Cochran等，Immunity 12(3)241-50(2000))。
在該系統中，可以設計噬菌體文庫(如本文以上描述的)以展示多種可以折疊成抗體Fv區(qū)的單價形式的scFv，此外，也在以上本文中所討論的，所述構建體適合于細菌表達。遺傳工程的scFv包含由連續(xù)編碼的15個氨基酸柔性肽間隔區(qū)連接的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。優(yōu)選的間隔區(qū)是(Gly4Ser)3。這種間隔區(qū)的長度，連同它的氨基酸、組分一起提供非大體積間隔區(qū)，使得VH區(qū)和VL區(qū)折疊為其靶提供有效結合的功能性Fv結構域。
改變所述間隔區(qū)的長度是又一個形成二聚體、三聚體和triamers(通常在本領域中分別是指雙功能抗體、三功能抗體和四功能抗體)的優(yōu)選方法。二聚體可在連接scFv兩條可變鏈的間隔區(qū)縮短到通常的5-12個氨基酸殘基的條件下形成。這種縮短的間隔區(qū)可阻止相同分子的兩條可變鏈折疊成功能性Fv結構域。而所述結構域被迫與另一個分子的互補結構域配對，產生兩個結合結構域。在一個優(yōu)選的方法中，只有5個氨基酸的間隔區(qū)(Gly4Ser)用于雙功能抗體構建。這個二聚體可由兩個相同的scFv或者由兩個不同的scFv群體形成并保留親本scFv選擇性和/或特異性增強的結合活性和/或顯示增加的結合強度或親和性。
按相似的方式，三功能抗體可在連接scFv兩條可變鏈的間隔區(qū)縮短到通常少于5個氨基酸殘基的條件下形成，其阻止相同分子的兩條可變鏈折疊成功能性Fv結構域。而三個單獨的scFv分子締合形成三聚體。在一個優(yōu)選的方法中，三功能抗體由完全除去這個柔性間隔區(qū)獲得。該三功能抗體可由三個相同的scFv，或者由兩個或三個不同的scFv群體形成，并保留親本scFv選擇性和/或特異性增強的結合活性和/或顯示增加的結合強度或親和性。
四功能抗體同樣可在連接scFv兩條可變鏈的間隔區(qū)縮短到通常少于5個氨基酸殘基的條件下形成，其阻止相同分子的兩條可變鏈折疊成功能性Fv結構域。而四個單獨的scFv分子締合形成四聚體。該四功能抗體可由四個相同的scFv，或者由1-4個不同scFv群體的個體單位形成，并應保留親本scFv選擇性和/或特異性增強的結合活性和/或顯示增加的結合強度或親和性。在所述間隔區(qū)通常少于5個氨基酸殘基長的條件下，三功能抗體或四功能抗體是否形成，取決于混合物中具體的scFv的氨基酸序列和反應條件。
可以在原核或真核表達系統中產生抗體、抗體片段或其構建體、肽、多肽、蛋白質及其片段和構建體。在原核系統或真核系統中產生抗體和片段的方法是本領域中眾所周知的。
真核細胞系統，如本發(fā)明中定義和論述的，是指通過基因工程方法產生肽或多肽的表達系統，其中宿主細胞是真核細胞。真核表達系統可以是哺乳動物系統，并且在哺乳動物表達系統中產生的肽或多肽，純化后，優(yōu)選基本無哺乳動物污染物。其它利用真核表達系統的實例包括酵母表達系統。
優(yōu)選的產生本發(fā)明肽或多肽的原核系統利用大腸桿菌(E.coli)作為表達載體的宿主。在大腸桿菌系統中產生的肽或多肽，純化后，基本無大腸桿菌污染蛋白。應用原核表達系統可能導致在本發(fā)明提供的某些或所有序列的N末端增加一個甲硫氨酸殘基。在肽或多肽產生使所述肽或多肽完全表達后，可按本領域中已知的，在適合的條件下應用氣單胞菌氨肽酶的一個實例，去除N末端的甲硫氨酸殘基(美國專利第5,763,215號)。
根據本發(fā)明的抗體和片段還可以有一個可以插入或與其連接的標志，以幫助制備和鑒定和診斷。該標志稍后可以從所述分子上去除。使用的標志實例包括AU1、AU5、BTag、c-myc、FLAG、Glu-Glu、HA、His6、HSV、HTTPHH、IRS、KT3、C蛋白、S-TAG、T7、V5和VSV-G(Jarvik和Telmer，Ann.Rev.Gen.，32，601-18(1998))。該標志優(yōu)選是c-myc或KAK。
本發(fā)明組合物中可以使用任何合適的藥物。這種藥物通常有抗癌活性、抗轉移活性、抗白血病活性、抗疾病活性、抗粘著活性、抗血栓形成活性、抗再狹窄活性、抗自身免疫活性、抗聚集活性、抗細菌活性、抗病毒活性或抗炎活性。因此，本發(fā)明組合物的藥物可以是抗癌藥、抗腫瘤藥、抗病毒藥、抗轉移藥、抗炎藥、抗血栓形成藥、抗再狹窄藥、抗聚集藥、抗自身免疫藥、抗粘著藥、抗心血管病藥或其它抗病藥或藥用物質。藥用物質是指用于預防性治療或診斷哺乳動物的藥物，所述哺乳動物包括但不限于人、牛、馬、豬、鼠、犬、貓或任一種其它溫血動物。
這種藥物的實例包括但不限于抗病毒藥，包括阿昔洛韋、更昔洛韋和齊多夫定；抗血栓形成藥/抗再狹窄藥，包括西洛他唑、達肝素鈉、瑞肝素鈉和阿司匹林；抗炎藥，包括扎托洛芬、普拉洛芬、屈噁昔康、乙酰水揚酸17、雙氯芬酸、布洛芬、右布洛芬、舒林酸、萘普生、氨托美丁、塞來考昔、吲哚美辛、羅非考昔、尼美舒利；抗自身免疫藥，包括來氟米特、地尼白介素2、subreum、WinRho SDF、去纖苷和環(huán)磷酰胺；抗粘著藥/抗聚集藥，包括利馬前列素、氯克羅孟和透明質酸。
其它示例性藥物包括順鉑、紫杉醇、加利車霉素、長春新堿、阿糖胞苷(Ara-C)、環(huán)磷酰胺、潑尼松、氟達拉濱、苯丁酸氮芥、干擾素α、羥基脲、替莫唑胺、沙利度胺和博來霉素和它們的衍生物和化合物。優(yōu)選所述藥物是蒽環(huán)霉素或其衍生物，更優(yōu)選所述藥物是多柔比星(阿霉素)、柔紅霉素、伊達比星、嗎啉多柔比星、嗎啉柔紅霉素、甲氧嗎啉多柔比星或其衍生物和組合，最優(yōu)選所述藥物是多柔比星(阿霉素)。
抗癌藥是具有抗癌活性的藥物。例如，抗癌藥包括抑制或停止癌細胞或未成熟的前癌細胞生長的藥物，殺死癌細胞或前癌細胞的藥物，增加癌細胞或前癌細胞對其它抗癌藥敏感性的藥物，和抑制癌細胞轉移的藥物。在本發(fā)明中，抗癌藥也可以是具有抗血管生成活性的藥物，從而預防、抑制、延遲或停止腫瘤血管形成。抑制癌細胞的生長包括，例如(i)預防癌性或轉移性生長，(ii)減慢癌性或轉移性生長，(iii)當讓癌細胞完整和活著時，總預防癌細胞的生長過程或轉移過程，(iv)干擾癌細胞與微環(huán)境的接觸，或(v)殺死癌細胞。
抗白血病藥是具有抗白血病活性的藥物。例如，抗白血病藥包括抑制或停止白血病細胞或未成熟的前白血病細胞生長的藥物、殺死白血病細胞或前白血病細胞的藥物、增加白血病細胞或前白血病細胞對其它抗白血病藥物的敏感性的藥物和抑制白血病細胞轉移的藥物。在本發(fā)明中，抗白血病藥也可以是具有抗血管生成活性的藥物，從而預防、抑制、延遲或停止腫瘤血管形成。抑制癌細胞的生長包括，例如(i)預防癌性或轉移性生長，(ii)減慢癌性或轉移性生長，(iii)當讓癌細胞完整和活著時，總預防癌細胞的生長過程或轉移過程，(iv)干擾癌細胞與微環(huán)境的接觸，或(v)殺死癌細胞。
可用于連接本發(fā)明的抗體和片段的抗病藥、抗癌藥和抗白血病藥的實例包括毒素、放射性同位素和藥用物質。毒素的實例包括白樹毒素、假單胞菌外毒素(PE)、PE40、PE38、白喉毒素、蓖麻毒素或其修飾物或衍生物。放射性同位素的實例包括可用于定位和/或治療的γ發(fā)射體、正電子發(fā)射體和X射線發(fā)射體，及可用于治療的β發(fā)射體和α發(fā)射體。先前描述的用于診斷的放射性同位素也可用于治療?？拱┧幓蚩拱籽∷幍姆窍拗菩詫嵗ǘ嗳崦顾?阿霉素)、順鉑、紫杉醇、加利車霉素、長春新堿、阿糖胞苷(Ara-C)、環(huán)磷酰胺、潑尼松、道諾霉素、依達比星、氟達拉濱、苯丁酸氮芥、干擾素α、羥基脲、替莫唑胺、沙利度胺和博來霉素及其衍生物，以及它們的組合或修飾物。
另外，抗病藥、抗癌藥或抗白血病藥還可以是生長因子受體拮抗劑，其通過生長因子受體配體抑制生長因子受體的刺激，因此抑制表達生長因子受體的細胞生長。一些生長因子受體的實例是表皮生長因子(EGFR)、血管內皮生長因子(VEGFR)、血小板衍生生長因子(PDGFR)、胰島素樣生長因子(IGFR)、神經生長因子(NGFR)和成纖維細胞生長因子(FGF)。
本發(fā)明抗體及其片段還可以任選與藥學上有效的載體締合、復合或結合或者綴合、融合或連接。本發(fā)明使用的載體實例包括葡聚糖、親脂聚合物(如HPMA)和親水聚合物?；蛘?，可以使用修飾的脂質體，如用scFv Y1分子修飾的脂質體，例如Doxil，這是一種市售的含有大量多柔比星的脂質體?？梢灾苽溥@種含有一種或多種所需藥物和與本發(fā)明抗體混合以提供一種高藥物抗體比率的脂質體。優(yōu)選所述媒介物或載體是多柔比星修飾的脂質體。或者，但也可優(yōu)選所述媒介物或載體是親水聚合物聚乙二醇(PEG)或葡聚糖。
或者，抗體或其片段和藥物間的連接可以是直接連接。兩個或多個相鄰分子間的直接連接可以通過分子中元素或元素族基團的化學鍵產生。所述化學鍵可以是例如離子鍵、共價鍵、疏水鍵、親水鍵、靜電鍵或氫鍵。所述鍵可以是例如胺鍵、羧鍵、酰胺鍵、羥鍵、肽鍵和/或二硫鍵。所述直接連接可以優(yōu)選是蛋白酶抗性鍵。
在肽和藥物間或肽和載體間，或載體和藥物間可以通過接頭化合物連接。如本發(fā)明說明書和權利要求中所用的，接頭化合物定義為連接兩個或更多部分的化合物。所述接頭可以是直鏈或分支的。分支接頭化合物可以由雙分支、三分支或四分支或更多分支的化合物組成。本發(fā)明中所用的接頭化合物包括那些選自具有二羧酸、順丁烯二酰亞胺基酰肼(malemido hydrazides)、PDPH、羧酰肼和小肽的接頭化合物。
根據本發(fā)明，接頭化合物的更具體實例包括(a)二羧酸，如丁二酸、戊二酸和己二酸；(b)順丁烯二酰亞胺基酰肼，如N-[順丁烯二酰亞胺基己酸]酰肼、4-[N-順丁烯二酰亞胺基甲基]環(huán)己烷基-1-羧酰肼和N-[順丁烯二酰亞胺基十一酸]酰肼；(c)PDPH接頭，如與巰基反應蛋白綴合的(3-[2-吡啶基二硫]丙酰肼)；和(d)選自2-5個碳原子的羧酰肼。
通過利用小肽接頭直接偶聯的連接也是有用的。例如，在抗癌藥物多柔比星的游離糖和scFv間的直接偶聯可以利用小肽來完成。小肽的實例包括AU1、AU5、BTag、c-myc、FLAG、Glu-Glu、HA、His6、HSV、HTTPHH、IRS、KT3、C蛋白、S-TAG、T7、V5、VSV-G和KAK。
本發(fā)明的抗體和其片段可以與造影劑(也稱為指示標記)例如放射性同位素結合、綴合、復合或締合，并且這些綴合物可用于診斷和造影目的。提供具有這種放射性同位素-抗體(或片段)綴合物的試劑盒。
用于診斷的放射性同位素的實例包括111銦、113銦、99m錸、105錸、101錸、99m锝、121m碲、122m碲、125m碲、165銩、167銩、168銩、123碘、126碘、131碘、133碘、81m氪、33氙、90釔、213鉍、77溴、18氟、95釕、97釕、103釕、105釕、107汞、203汞、67鎵和68鎵。優(yōu)選的放射性同位素是不透X射線的或任一種合適的順磁離子。
所述指示標記分子也可以是熒光標記分子。熒光標記分子的實例包括熒光素、藻紅蛋白或羅丹明或它們的修飾物或綴合物。
與指示標記綴合的抗體或片段可以用于診斷或監(jiān)測疾病狀態(tài)。這種監(jiān)測可以在體內、體外或離體進行。在體內或離體進行監(jiān)測或診斷的情況下，造影劑優(yōu)選是生理上可接受的，因為它不會將患者傷害到無法接受的水平?？山邮艿膫λ娇赏ㄟ^臨床醫(yī)師利用如疾病的嚴重程度和其它任選的利用度的標準來確定。
本發(fā)明提供一種在治療前、治療期間或治療后體外分析治療效果的診斷試劑盒，該試劑盒包含一種帶有與指示標記分子連接的本發(fā)明肽的造影劑或造影劑。本發(fā)明還提供將該造影劑用于診斷定位和癌造影，更準確地講是腫瘤造影的方法，所述方法具有下列步驟(a)使細胞與組合物接觸；(b)測定與所述細胞結合的放射性；和因此(c)呈現腫瘤。
合適的造影劑的實例包括熒光染料，如FITC、PE等等，和熒光蛋白，如綠色熒光蛋白。其它的實例包括可與底物反應產生可識別的變化(如顏色變化)的放射性分子和酶。
在一個實例中，所述試劑盒的造影劑是熒光染料，如FITC，并且所述試劑盒提供對癌癥、更準確地講是對血液相關癌例如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤的治療效果的分析。FACS分析用于確定被造影劑染色的細胞的百分比和在疾病的每一階段，例如在診斷時、治療期間、緩解期間和復發(fā)期間的染色強度。
本發(fā)明也提供通過給予有需要的患者任一本發(fā)明組合物，從而緩解疾病效應、預防疾病、治療疾病或者抑制疾病進程的方法。例如，本發(fā)明提供抑制細胞前滾、抑制炎癥、抑制自身免疫病、抑制血栓形成、抑制再狹窄、抑制轉移、抑制腫瘤細胞的生長和/或增殖、抑制白血病細胞的生長和/或增殖、抑制腫瘤患者體內的腫瘤細胞數增加或者抑制白血病患者體內的白血病細胞數增加的方法。另外，本發(fā)明提供增加腫瘤細胞的死亡率、增加白血病細胞的死亡率、增加患病細胞對抗病藥損傷的敏感性、增加腫瘤細胞對抗癌藥損傷的敏感性或增加白血病細胞對抗癌藥損傷的敏感性的方法。此外，本發(fā)明提供減少腫瘤患者體內的腫瘤細胞數、減少白血病患者體內的白血病細胞數的方法。最后，本發(fā)明提供抑制細胞-細胞、細胞-基質、血小板-基質、血小板-血小板和/或細胞-血小板復合物形成、聚集或粘著的方法。
本發(fā)明的各種方法優(yōu)選用亞臨床量給予的藥物和抗體的一者或兩者進行。因此，本發(fā)明提供治療性治療的方法，所述方法包括給予有需要的患者(i)抗體或其片段和(ii)藥物，其中所述抗體、或其片段和/或所述藥物之一或兩者以亞臨床有效量給予。這種應用的有效量將取決于疾病的嚴重程度和患者自身免疫系統的一般狀態(tài)。用藥方案也將因疾病的狀態(tài)和患者的狀況而不同，并且通常范圍從一次大劑量或連續(xù)輸注到每天多次用藥(例如每4-6小時)，或如治療醫(yī)師所指示的和患者的病癥。然而，應該注意到，本發(fā)明不限于任何具體的劑量。
此外，本領域技術人員將會認識到，本發(fā)明方法包括以一次給藥或多次給藥給予所述藥物和抗體，它可以是這樣，在給予所述抗體或其片段之前、同時或之后給予所述藥物?？梢栽诮o予所述抗體或其片段之前、同時或之后給予所述藥物，或者接任何其它順序或安排給藥，反之亦然。因此，所述藥物和抗體可以存在于不同的組合物中。
本發(fā)明的抗體、構建體、綴合物、結合物和片段可以通過任一種適當的方法給予有需要的患者。示例方法包括靜脈內、肌內、皮下、局部、氣管內、鞘內、腹膜內、淋巴內、鼻、舌下、口服、直腸、陰道、呼吸道、口腔、皮內、透皮或胸膜內給藥。
對于靜脈內給藥，最好制備制劑，致使給予患者所需組合物的量將是從約0.1mg至約1000mg的有效量。更優(yōu)選給予所需組合物的量將在約1mg至約500mg之間。本發(fā)明的組合物在寬劑量范圍內有效，并取決于各種因素例如待治療疾病的具體情況、基于肽和多肽的藥用組合物在患者體內的半壽期、藥物和藥用組合物的理化性質、藥用組合物的給藥模式、待治療或診斷患者的具體情況等，以及治療醫(yī)師所認為其它重要的參數。
口服藥用組合物可以是任何適當的形式。實例包括片劑、液體制劑、乳劑、混懸劑、糖漿劑、丸劑、囊片和膠囊劑。藥用組合物的制備方法是本領域熟知的。參見例如Remington，The Science andPractice of Pharmacy，Alfonso R.Gennaro(主編)Lippincott，Williams&Wilkins(出版)。
也可以配制所述藥用組合物以便于定時釋放、持續(xù)釋放、脈沖釋放或連續(xù)釋放。所述藥用組合物也可以在裝置(例如定時釋放、持續(xù)釋放、脈沖釋放或連續(xù)釋放裝置)中給予。
局部給藥用藥用組合物可以是任何適當的形式，如乳膏劑、軟膏劑、洗劑、貼劑、溶液劑、混懸劑、凍干劑和凝膠劑。
包含本發(fā)明抗體、構建體、綴合物、結合物和片段的組合物可包含常規(guī)的藥學上可接受的稀釋劑、賦形劑、載體等。片劑、丸劑、囊片、膠囊劑可包括常規(guī)的賦形劑如乳糖、淀粉和硬脂酸鎂。栓劑可以包括賦形劑如蠟和甘油。注射液包含無菌無熱原介質如鹽水，并且可以包括緩沖劑、穩(wěn)定劑或防腐劑。還可使用常規(guī)的腸衣。
給出以下實施例以幫助理解本發(fā)明，但是并不預示且不應該認為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。雖然描述了具體的試劑和反應條件，但是可對其進行修改仍然屬于本發(fā)明的范疇。因此，提供以下的實例以進一步舉例說明本發(fā)明。所有本文提及或描述的參考文獻都全部結合到本文中。
實施例實施例1本實施例檢查在帶有MOLT-4腫瘤的小鼠中化療和Y1間的相互作用。
最初，SCID小鼠(Jackson)用100mg/kg CTX(Cytoxan-注射用環(huán)磷酰胺，Mead Johnson)預處理。CTX注射5天后，MOLT-4(T白血病)細胞通過尾靜脈以2×107個細胞靜脈內(i.v.)接種。小鼠隨機分成5個治療組(每組13只)，并在細胞接種后5天開始，如下表所示進行治療。在Dox療程的同時或之后，用亞適劑量的多柔比星(Dox)與給定的Y1聯合治療荷瘤小鼠兩周。根據存活時間監(jiān)測對治療的反應。如上所述，實驗組如下
表1組別所給予的藥物(靜脈內注射) 治療頻率對照組 不進一步治療 -----阿霉素組2mg Dox/kg小鼠 2劑，每周一次，自接種后第5天開始Y1組0.1mg Y1scFv/小鼠 6劑，每周三次，自接種后第5天開始序貫治療組 2mg Dox/kg小鼠， 2劑，每周一次，自接種后第5然后0.1mg Y1scFv/小鼠 天開始，然后6劑，每周一次聯合治療組 2mg Dox/kg小鼠+2劑，每周一次，自接種后第50.1mg Y1scFv/小鼠 天開始，然后6劑，每周三次圖1的結果表明，相對于對照組(MTS 39.08±0.8天)，單獨用亞適劑量Dox治療，對荷瘤小鼠的生存時間有副作用(平均生存時間MST是33.5+1.68天)。然而，先用Dox治療，然后用Y1序貫治療的小鼠的生存時間非常顯著地延長。雖然Y1單獨對荷瘤小鼠的生存率有驚人的影響，但是Dox+Y1臨床亞適量具有最好的效果。顯著提高的生存率看來是化療和Y1抗體間協同效應的結果。
序列表<110>薩文特醫(yī)藥公司(Savient Pharmaceuticals，Inc.)<120>用于治療性治療的組合物和方法<130>10793/73<140>PCT/US03/20604<141>06/30/2003<150>10/189,025<151>07/01/2002<160>8<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>277<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala1 5 10 15 20Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu25 30 35 40Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asp Asp Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg45 50 55 60Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr65 70 75 80Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser85 90 95 100Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg105 110 115 120
Met Arg Ala Pro Val Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly125 130 135 140Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala145 150 155 160Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser165 170 175 180Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly185 190 195 200Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr205 210 215 220Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser225 230 235 240Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gy Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly245 250255 260Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala265 270 275<210>2<211>278<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala5 10 15 20Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu25 30 35 40
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Leu Thr His Pro Tyr Phe trp Val45 50 55 60Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser65 70 75 80Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn85 90 95 100Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala105 110 115 120Arg Met Arg Ala Pro Val Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly125 130 135 140Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro145 150 155 160Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg165 170 175 180Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr185 190 195 200Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn205 210 215 220Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn225 230 235 240Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu245 250 255 260Gly Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala265 270 275<210>3<211>280<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)<400>3Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala5 10 15 20Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu25 30 35 40Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Leu Asn Pro Lys Val Lys His Met45 50 55 60Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly65 70 75 80Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala85 90 95 100Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Glu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr105 110 115 120Cys Ala Arg Met Arg Ala Pro Val Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg125 130 135 140Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln145 150 155 160Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser165 170 175 180Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val185 190 195 200Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser205 210 215 220Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr225 230 235 240Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr245 250 255 260
Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala265 270 275 280<210>4<211>6<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>4Met Arg Ala Pro Val Ile5<210>5<211>16<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>5Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys5 10 15<210>6<211>5<212>PRT<213>人(Homo sapiens)
<400>6Asp Tyr Gly Met Ser5<210>7<211>6<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>7Leu Thr His Pro Tyr Phe5<210>8<211>8<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>8Leu Asn Pro Lys Val Lys His Met權利要求
1.一種包含藥物以及抗體或其片段的組合物。
2.權利要求1的組合物，其中所述藥物與所述抗體或其片段復合。
3.權利要求1的組合物，其中所述藥物與所述抗體或其片段結合。
4.權利要求1的組合物，其中所述藥物與所述抗體或其片段綴合。
5.權利要求1的組合物，其中所述藥物為亞臨床量。
6.權利要求5的組合物，其中所述藥物的亞臨床量不足以有效改變患病細胞對抗病藥的敏感性。
7.權利要求5的組合物，其中所述藥物的亞臨床量不足以有效抑制細胞前滾、炎癥、自身免疫病、血栓形成、再狹窄、轉移或者腫瘤細胞或白血病細胞的生長和/或增殖。
8.權利要求5的組合物，其中所述藥物的亞臨床量不足以有效抑制腫瘤患者體內腫瘤細胞數的增加或者不足以有效抑制白血病患者體內白血病細胞數的增加。
9.權利要求5的組合物，其中所述藥物的亞臨床量不足以減少腫瘤患者體內的腫瘤細胞數或者不足以減少白血病患者體內的白血病細胞數。
10.權利要求5的組合物，其中所述藥物的亞臨床量不足以增加腫瘤細胞或白血病細胞的死亡率，不足以增加腫瘤細胞對抗癌藥損傷的敏感性，或者不足以增加白血病細胞對抗白血病藥損傷的敏感性。
11.權利要求5的組合物，其中所述藥物的亞臨床量不足以有效抑制細胞-細胞、細胞-基質、血小板-基質、血小板-血小板和/或細胞-血小板復合物形成、聚集或粘著。
12.權利要求1的組合物，其中所述抗體或其片段為亞臨床量。
13.權利要求1的組合物，其中所述抗體或其片段具有SEQ IDNO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的scFv抗體片段的結合能力。
14.權利要求1的組合物，其中所述抗體或其片段具有肽或多肽的結合能力，其中所述肽或多肽包含具有SEQ ID NO4的第一高變區(qū)。
15.權利要求14的組合物，其中所述肽或多肽還包含具有SEQ IDNO5的第二高變區(qū)和/或具有SEQ ID NO6、SEQ ID NO7或SEQ IDNO8的第三高變區(qū)。
16.權利要求1的組合物，其中所述抗體或其片段是scFv或Fab片段。
17.一種包含藥物以及抗體或其片段的組合物，其中所述抗體或其片段結合長度約3個至約126個氨基酸殘基的肽或多肽表位，其中所述肽或多肽表位具有至少2個酸性氨基酸和至少一個硫酸化酪氨酸殘基。
18.一種包含藥物以及抗體或其片段的組合物，其中所述抗體或其片段結合至少兩種不同的分子，所述分子選自PSGL-1、血纖蛋白原γ′、GP1bα、肝素、腔蛋白聚糖、補體化合物4(CC4)、interalpha抑制劑和凝血酶原。
19.一種包含藥物以及抗體或其片段的組合物，其中所述抗體或其片段結合至少兩種不同的分子并且結合至少一種細胞類型，所述分子選自PSGL-1、血纖蛋白原γ′、GP1bα、肝素、腔蛋白聚糖、補體化合物4(CC4)、interalpha抑制劑和凝血酶原，所述細胞類型選自B細胞白血病細胞、B-CLL細胞、AML細胞、多發(fā)性骨髓瘤細胞和轉移細胞。
20.一種包含藥物以及抗體或其片段的組合物，其中所述抗體或其片段與兩個或多個表位交叉反應，每個表位包含一個或多個硫酸化酪氨酸殘基以及兩個或多個酸性氨基酸的至少一個聚簇。
21.權利要求1的組合物，其中所述藥物選自抗癌藥、抗轉移藥、抗白血病藥、抗病藥、抗粘著藥、抗血栓形成藥、抗再狹窄藥、抗自身免疫藥、抗聚集藥、抗菌藥、抗病毒藥和抗炎藥。
22.權利要求21的組合物，其中所述藥物是選自以下的抗病毒藥阿昔洛韋、更昔洛韋和齊多夫定。
23.權利要求21的組合物，其中所述藥物是選自以下的抗血栓形成藥/抗再狹窄藥西洛他唑、達肝素鈉、瑞肝素鈉和阿司匹林。
24.權利要求21的組合物，其中所述藥物是選自以下的抗炎藥扎托洛芬、普拉洛芬、屈噁昔康、乙酰水楊酸17、雙氯芬酸、布洛芬、右布洛芬、舒林酸、萘普生、氨托美丁、塞來考昔、吲哚美辛、羅非考昔和尼美舒利。
25.權利要求21的組合物，其中所述藥物是選自以下的抗自身免疫藥來氟米特、地尼白介素2、subreum、WinRho SDF、去纖苷和環(huán)磷酰胺。
26.權利要求21的組合物，其中所述藥物是選自以下的抗粘著藥/抗聚集藥利馬前列素、氯克羅孟和透明質酸。
27.權利要求21的組合物，其中所述藥物選自毒素、放射性同位素和藥用物質。
28.權利要求27的組合物，其中所述毒素選自白樹毒素、假單胞菌外毒素(PE)、PE40、PE38、蓖麻毒素以及它們的修飾物和衍生物。
29.權利要求27的組合物，其中所述放射性同位素選自γ發(fā)射體、正電子發(fā)射體、X射線發(fā)射體、β發(fā)射體和α發(fā)射體。
30.權利要求27的組合物，其中所述放射性同位素選自111銦、113銦、99m錸、105錸、101錸、99m锝、121m碲、122m碲、125m碲、165銩、167銩、168銩、123碘、126碘、131碘、133碘、81m氪、33氙、90釔、213鉍、77溴、18氟、95釕、97釕、103釕、105釕、107汞、203汞、67鎵和68鎵。
31.權利要求27的組合物，其中所述藥物選自順鉑、紫杉醇、加利車霉素、長春新堿、阿糖胞苷(Ara-C)、環(huán)磷酰胺、潑尼松、氟達拉濱、苯丁酸氮芥、干擾素α、羥基脲、替莫唑胺、沙利度胺和博來霉素以及它們的衍生物和結合物。
32.權利要求27的組合物，其中所述藥用物質是蒽環(huán)霉素或其衍生物。
33.權利要求32的組合物，其中所述藥用物質選自多柔比星、柔紅霉素、伊達比星、嗎啉多柔比星、嗎啉柔紅霉素、甲氧嗎啉多柔比星以及它們的衍生物和結合物。
34.權利要求32的組合物，其中所述藥用物質是多柔比星或其衍生物。
35.權利要求1的組合物，其中所述抗體或其片段與媒介物或載體偶聯或復合或結合，所述媒介物或載體與不止一種藥物偶聯或復合或結合。
36.權利要求35的組合物，其中所述媒介物或載體選自葡聚糖、親脂聚合物、親水聚合物、HPMA和脂質體。
37.權利要求36的組合物，其中所述媒介物或載體是多柔比星修飾的脂質體。
38.權利要求36的組合物，其中所述媒介物或載體是聚乙二醇(PEG)或葡聚糖。
39.一種抑制細胞前滾的方法，所述方法包括給予有需要的患者權利要求1的組合物。
40.一種抑制炎癥的方法，所述方法包括給予有需要的患者權利要求1的組合物。
41.一種抑制自身免疫病的方法，所述方法包括給予有需要的患者權利要求1的組合物。
42.一種抑制血栓形成的方法，所述方法包括給予有需要的患者權利要求1的組合物。
43.一種抑制再狹窄的方法，所述方法包括給予有需要的患者權利要求1的組合物。
44一種抑制轉移的方法，所述方法包括給予有需要的患者權利要求1的組合物。
45.一種抑制腫瘤細胞生長和/或增殖的方法，所述方法包括給予有需要的患者權利要求1的組合物。
46.一種增加腫瘤細胞死亡率的方法，所述方法包括給予有需要的患者權利要求1的組合物。
47.一種抑制白血病細胞生長和/或增殖的方法，所述方法包括給予有需要的患者權利要求1的組合物。
48.一種增加白血病細胞死亡率的方法，所述方法包括給予有需要的患者權利要求1的藥用組合物。
49.一種增加患病細胞對抗病藥損傷的敏感性的方法，所述方法包括給予有需要的患者權利要求1的組合物。
50.一種增加腫瘤細胞對抗癌藥損傷的敏感性的方法，所述方法包括給予有需要的患者權利要求1的組合物。
51.一種增加白血病細胞對抗癌藥損傷的敏感性的方法，所述方法包括給予有需要的患者權利要求1的組合物。
52.一種抑制腫瘤患者體內腫瘤細胞數增加的方法，所述方法包括給予有需要的患者權利要求1的組合物。
53.一種減少腫瘤患者體內腫瘤細胞數的方法，所述方法包括給予有需要的患者權利要求1的組合物。
54.一種抑制白血病患者體內白血病細胞數增加的方法，所述方法包括給予有需要的患者權利要求1的組合物。
55.一種減少白血病患者體內白血病細胞數的方法，所述方法包括給予有需要的患者權利要求1的組合物。
56.一種抑制細胞-細胞、細胞-基質、血小板-基質、血小板-血小板和/或細胞-血小板復合物形成的方法，所述方法包括給予有需要的患者權利要求1的組合物。
57.一種抑制細胞-細胞、細胞-基質、血小板-基質、血小板-血小板和/或細胞-血小板聚集的方法，所述方法包括給予有需要的患者權利要求1的組合物。
58.一種抑制細胞-細胞、細胞-基質、血小板-基質、血小板-血小板和/或細胞-血小板粘著的方法，所述方法包括給予有需要的患者權利要求1的組合物。
59.一種緩解疾病效應、預防疾病、治療疾病或者抑制疾病進程的方法，所述方法包括給予有需要的患者權利要求1的組合物。
60.一種治療性治療的方法，所述方法包括給予有需要的患者(i)抗體或其片段，和(ii)藥物，其中所述抗體或其片段和/或所述藥物中的一個或它們兩者以亞臨床量給予。
61.權利要求60的方法，其中所述抗體或其片段以及所述藥物獨立給予。
62.權利要求61的方法，其中在給予所述藥物之前給予所述抗體或其片段。
63.權利要求61的方法，其中在給予所述藥物之后給予所述抗體或其片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用藥物以及抗體或其片段的組合物。在這些組合物中，所述藥物，包括抗癌藥、抗轉移藥、抗白血病藥、抗病藥、抗粘著藥、抗血栓形成藥、抗再狹窄藥、抗自身免疫藥、抗聚集藥、抗菌藥、抗病毒藥和抗炎藥等藥物，可與所述抗體或其片段復合或結合或綴合。另外，所述藥物和/或所述抗體或其片段在所述組合物中可以為亞臨床量，即小于當藥物單獨給予時所述藥物通常為臨床有效量的量。優(yōu)選在本發(fā)明的這些組合物中，所述藥物是蒽環(huán)霉素或其衍生物，例如多柔比星(阿霉素)或其衍生物。
文檔編號A61P7/02GK1678348SQ03820441
公開日2005年10月5日 申請日期2003年6月30日 優(yōu)先權日2002年7月1日
發(fā)明者J·拉扎羅維茨, A·尼姆羅德, H·霍奇馬－哈伊姆, A·萊瓦農 申請人:薩文特醫(yī)藥公司