專(zhuān)利名稱(chēng)：促紅細(xì)胞生成素的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及促紅細(xì)胞生成素的新用途，尤其是治療糖尿病中的鐵分布紊亂。
已知鐵代謝在多種疾病中是不正常的。在貧血中，由于體內(nèi)全面缺鐵而不能形成足夠的血液。與鐵有關(guān)的另一種代謝狀況是血色病，其中體內(nèi)總體鐵濃度高于正常，導(dǎo)致多種狀況，諸如器官破壞。
鐵分布紊亂與上文所述的貧血癥和血色病不同，因?yàn)轶w內(nèi)總體鐵濃度是正常的。一方面，鐵在多個(gè)器官中積累，而且能夠?qū)е逻@些器官的損傷甚至破壞。另一方面，以正常數(shù)量存在的鐵在形成血液中的用途受到削弱，導(dǎo)致與貧血相關(guān)效應(yīng)相當(dāng)?shù)拇紊?yīng)。
至今仍不知道糖尿病患者很有可能被鐵分布紊亂影響。鐵分布紊亂能夠通過(guò)常用于診斷鐵狀況的多種參數(shù)來(lái)診斷。根據(jù)鐵蛋白和可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的測(cè)量，有可能評(píng)估糖尿病患者體內(nèi)的總體鐵濃度是否正常。如果是這種情況，那么網(wǎng)織紅細(xì)胞中的降低濃度血紅蛋白是鐵分布紊亂的指標(biāo)。另一項(xiàng)指標(biāo)是患有糖尿病且展示正?？傮w鐵濃度的患者體內(nèi)持續(xù)/延續(xù)升高的C反應(yīng)性蛋白質(zhì)(CRP)濃度。用于診斷鐵分布紊亂的一種方法描述于P.Lehmann、M.Volkmann、J.Lotz、A.Baldauf、R.Roeddiger，海報(bào)展示，AACC/CSCC年會(huì)，2001年7月29日-8月2日，伊利諾斯州，芝加哥。
至今尚未提出針對(duì)遭受鐵分布紊亂的糖尿病患者的治療方法。因此，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是為糖尿病中的鐵分布紊亂提供治療方法，從而減小或遏制上述不利情況。出人意料的已發(fā)現(xiàn)了促紅細(xì)胞生成素對(duì)于糖尿病中的鐵分布紊亂具有有益效果。因此，依照本發(fā)明，通過(guò)提供促紅細(xì)胞生成素在治療糖尿病中的鐵分布紊亂中的用途而解決了問(wèn)題。
除非另外說(shuō)明，陳述下列定義以說(shuō)明和限定用于描述本發(fā)明的各種術(shù)語(yǔ)的含義和范圍。
術(shù)語(yǔ)“低級(jí)烷基”在用于本文時(shí)指具有1-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基。低級(jí)烷基的范例包括甲基、乙基、和異丙基，優(yōu)選甲基。
術(shù)語(yǔ)“低級(jí)烷氧基”在用于本文時(shí)指R’-O-基團(tuán)，其中R’是上文所述低級(jí)烷基。
術(shù)語(yǔ)“糖尿病中的鐵分布紊亂”指糖尿病患者中發(fā)生的鐵分布紊亂。鐵分布紊亂可以如上文所述表征。具體而言，鐵分布紊亂由下列參數(shù)表征可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體濃度[mg/L]除以log(鐵蛋白濃度[μg/L])小于3.5，同時(shí)C反應(yīng)性蛋白質(zhì)濃度超過(guò)5mg/L。
術(shù)語(yǔ)“促紅細(xì)胞生成素”或“促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)”指具有引起骨髓細(xì)胞生成網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞增加的體內(nèi)生物學(xué)活性且選自下組的蛋白質(zhì)人促紅細(xì)胞生成素及其下文定義的類(lèi)似物。
術(shù)語(yǔ)“PEG化促紅細(xì)胞生成素(Peg-EPO或PEG-EPO)”指如下所述共價(jià)連接1-3個(gè)聚乙烯衍生物的促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)。
附圖描述

圖1人EPO的一級(jí)結(jié)構(gòu)(165個(gè)氨基酸)(SEQ ID NO1)。
圖2人EPO的一級(jí)結(jié)構(gòu)(166個(gè)氨基酸)(SEQ ID NO2)。
更詳細(xì)的說(shuō)，本發(fā)明涉及促紅細(xì)胞生成素在制造用于治療糖尿病中的鐵分布紊亂的藥物中的用途。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及上文定義的用途，其中糖尿病是非胰島素依賴(lài)性糖尿病。
本發(fā)明對(duì)于包含促紅細(xì)胞生成素作為藥物活性成分的藥物組合物的制備尤其有用。術(shù)語(yǔ)“促紅細(xì)胞生成素”或“促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)”或“EPO”如下具體而言，這些術(shù)語(yǔ)指糖蛋白，如人促紅細(xì)胞生成素，如具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所列氨基酸序列或與其基本同源的氨基酸序列，它的生物學(xué)特性涉及在骨髓中刺激紅細(xì)胞的生成和刺激定向類(lèi)紅細(xì)胞祖先的分裂和分化。在用于本文時(shí)，這些術(shù)語(yǔ)包括經(jīng)過(guò)故意修飾的這些蛋白質(zhì)，例如通過(guò)定點(diǎn)誘變或偶然突變。這些術(shù)語(yǔ)還包括具有1-6個(gè)額外糖基化位點(diǎn)的類(lèi)似物、在糖蛋白的羧基末端具有至少一個(gè)額外氨基酸的類(lèi)似物(其中額外氨基酸包括至少一個(gè)糖基化位點(diǎn))、和具有包括至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)重排的氨基酸序列的類(lèi)似物。這些術(shù)語(yǔ)包括天然和重組生成的這兩類(lèi)人促紅細(xì)胞生成素。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)是人促紅細(xì)胞生成素。
如下文詳細(xì)所述，EPO的制備和純化在本領(lǐng)域是眾所周知的。促紅細(xì)胞生成素指由任何常規(guī)來(lái)源諸如組織、蛋白質(zhì)合成、天然或重組細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)獲得的天然或重組蛋白質(zhì)，優(yōu)選人的，如epoetinα或epoetinβ。涵蓋具有促紅細(xì)胞生成素活性的任何蛋白質(zhì)，諸如突變型蛋白質(zhì)或其它經(jīng)修飾蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)是epoetinα或epoetinβ?？梢酝ㄟ^(guò)重組DNA技術(shù)或通過(guò)內(nèi)源基因激活經(jīng)由CHO、BHK、或HeLa細(xì)胞系的表達(dá)來(lái)制備重組EPO。包括通過(guò)內(nèi)源基因激活在內(nèi)的蛋白質(zhì)表達(dá)在本領(lǐng)域是眾所周知的，而且公開(kāi)于例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,733,761、5,641,670、和5,733,746，以及國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)WO 93/09222、WO 94/12650、WO95/31560、WO 90/11354、WO 91/06667、和WO 91/09955(將它們的內(nèi)容收入本文作為參考)。優(yōu)選上文定義的用途，其中促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)是通過(guò)內(nèi)源基因激活而表達(dá)的。用于制備促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物的優(yōu)選EPO種類(lèi)是人EPO種類(lèi)。更優(yōu)選的是，EPO種類(lèi)是具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所列氨基酸序列的人EPO，更優(yōu)選氨基酸序列SEQ ID NO1。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及上文所述用途，其中促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO1或SEQID NO2的氨基酸序列。
此外，促紅細(xì)胞生成素可以是具有1-6個(gè)額外糖基化位點(diǎn)的糖蛋白類(lèi)似物。因此，本發(fā)明還涉及上文所述用途，其中促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)具有通過(guò)添加1-6個(gè)糖基化位點(diǎn)而修飾的人促紅細(xì)胞生成素序列。具有一個(gè)或多個(gè)寡糖基團(tuán)的蛋白質(zhì)的糖基化沿著多肽主鏈發(fā)生于特定位置，而且大大影響蛋白質(zhì)的物理特性，諸如蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、分泌、亞細(xì)胞定位、和生物學(xué)活性。糖基化通常有兩類(lèi)。O連接寡糖附著于絲氨酸或蘇氨酸殘基，而N連接寡糖附著于天冬酰胺殘基。在N連接和O連接寡糖中都發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)寡糖是N-乙酰神經(jīng)氨酸(唾液酸)，它是含有9個(gè)或更多碳原子的氨基糖家族。唾液酸常常是N連接和O連接寡糖的末端殘基，而且由于它攜帶一個(gè)負(fù)電荷而賦予糖蛋白以酸性特性。具有165個(gè)氨基酸的人促紅細(xì)胞生成素含有3個(gè)N連接寡糖鏈和1個(gè)O連接寡糖鏈，它們占到糖蛋白總分子量的大約40％。N連接糖基化發(fā)生于第24、38、和83位天冬酰胺殘基，而O連接糖基化發(fā)生于第126位絲氨酸殘基。寡糖鏈由末端唾液酸殘基得到修飾。糖基化促紅細(xì)胞生成素中所有唾液酸殘基的酶促清除導(dǎo)致體內(nèi)活性而非體外活性的損失，因?yàn)榇偌t細(xì)胞生成素的唾液酸化防止其結(jié)合肝結(jié)合蛋白及隨后的清除。
術(shù)語(yǔ)“促紅細(xì)胞生成素”包括人促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列中具有一處或多處改變而導(dǎo)致唾液酸附著位點(diǎn)數(shù)目增加的人促紅細(xì)胞生成素類(lèi)似物。可以通過(guò)定點(diǎn)誘變來(lái)生成這些糖蛋白類(lèi)似物，它們具有氨基酸殘基的添加、刪除、或替代從而增加或改變能夠糖基化的位點(diǎn)。唾液酸水平高于人促紅細(xì)胞生成素的糖蛋白類(lèi)似物是通過(guò)添加不干擾生物學(xué)活性所必需的二級(jí)或三級(jí)構(gòu)象的糖基化位點(diǎn)而生成的。本發(fā)明的糖蛋白還包括在糖基化位點(diǎn)具有升高的碳水化合物附著水平的類(lèi)似物，這常常涉及密切接近N連接或O連接位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代。本發(fā)明的糖蛋白還包括由促紅細(xì)胞生成素的羧基末端具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸延伸并提供至少一個(gè)額外碳水化合物位點(diǎn)的類(lèi)似物。本組合物的促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)還包括具有包含至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)重排的氨基酸序列的類(lèi)似物。這種糖基化位點(diǎn)重排涉及人促紅細(xì)胞生成素中一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的刪除和一個(gè)或多個(gè)非天然存在糖基化位點(diǎn)的添加。增加促紅細(xì)胞生成素上碳水化合物鏈的數(shù)目因而每個(gè)促紅細(xì)胞生成素分子的唾液酸數(shù)目可以賦予有利特性，諸如溶解性增加、蛋白水解抗性增強(qiáng)、免疫原性降低、血清半衰期延長(zhǎng)、和生物學(xué)活性增加。具有額外糖基化位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素類(lèi)似物更加詳細(xì)的公開(kāi)于1995年3月1日公開(kāi)的授予Elliot的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)640 619。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)，它具有包含至少一個(gè)額外糖基化位點(diǎn)的氨基酸序列，諸如但不限于包含通過(guò)選自下組的修飾而修飾的人促紅細(xì)胞生成素序列的促紅細(xì)胞生成素Asn30Thr32；Asn51Thr53；Asn57Thr59；Asn69；Asn69Thr71；Ser68Asn69Thr71；Val87Asn88Thr90；Ser87Asn88Thr90；Ser87Asn88Gly89Thr90Ser87Asn88Thr90Thr92；Ser87Asn88Thr90Ala162；Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90；Asn30Thr32Val87Asn88Thr90；Asn89Ile90Thr91；Ser87Asn89Ile90Thr91；Asn136Thr138；Asn138Thr140；Thr125；和Pro124Thr125。
本文中用于變更氨基酸序列的符號(hào)指相應(yīng)未變更蛋白質(zhì)(如SEQID NO1或SEQ ID NO2的hEPO)中上標(biāo)數(shù)值指示的位置變更成緊挨著各個(gè)上標(biāo)數(shù)值前面的氨基酸。
促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)還可以是在糖蛋白的羧基末端具有至少一個(gè)額外氨基酸的類(lèi)似物，其中額外氨基酸包括至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)。額外氨基酸可以包括由人絨毛膜促性腺激素羧基末端衍生的肽片段。優(yōu)選的是，糖蛋白是選自下組的類(lèi)似物(a)羧基末端具有延伸氨基酸序列Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro SerPro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln的人促紅細(xì)胞生成素；(b)還包括Ser87Asn88Thr90EPO在內(nèi)的(a)中的類(lèi)似物；和(c)還包括Asn30Thr32Val87Asn88Thr90EPO在內(nèi)的(a)中的類(lèi)似物。
促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)還可以是具有包含至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)重排的氨基酸序列的類(lèi)似物。重排可以包括人促紅細(xì)胞生成素中任何N連接碳水化合物位點(diǎn)的刪除和人促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列第88位處N連接碳水化合物位點(diǎn)的添加。優(yōu)選的是，糖蛋白是選自下組的類(lèi)似物Gln24Ser87Asn88Thr90EPO；Gln38Ser87Asn88Thr90EPO；和Gln83Ser87Asn88Thr90EPO。另一種類(lèi)似物是darbepoetinα。上文所述用途中的一種優(yōu)選促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)是darbepoetinα。
更具體的說(shuō)，上文所述本發(fā)明藥物組合物的促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)還可以包括它的PEG化衍生物。促紅細(xì)胞生成素的PEG化衍生物及其制備在本領(lǐng)域是知道的，而且描述于例如WO 01/02017、EP-A-1,064,951、EP-A-539,167、EP-A-605,963、WO 93/25212、WO94/20069、WO 95/11924、US專(zhuān)利號(hào)5,56、EP-A-584,876、WO 92/16555、WO 94/28024、WO 97/04796、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,359,030和5,681,811、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,179,337、日本專(zhuān)利、WO 98/32466、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,324,650。優(yōu)選的是，在上文所述用途中，促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)是PEG化的。PEG化促紅細(xì)胞生成素種類(lèi)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及下文所述衍生物。
因此，本發(fā)明還涉及上文所述用途，其中促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)是綴合物，所述綴合物包含的上文所述促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)具有至少一個(gè)游離氨基且具有引起骨髓細(xì)胞生成網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞增加的體內(nèi)生物學(xué)活性，而且選自人促紅細(xì)胞生成素及其類(lèi)似物，即具有通過(guò)添加1-6個(gè)糖基化位點(diǎn)或至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的重排而修飾的人促紅細(xì)胞生成素序列；所述促紅細(xì)胞生成素共價(jià)連接n個(gè)通式為-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR的聚乙二醇基團(tuán)，每個(gè)聚乙二醇基團(tuán)的-CO(即羰基)與所述氨基之一形成酰胺鍵；其中R是低級(jí)烷基；x是2或3；m是大約450-大約900；n是1-3；且n和m的選擇使得綴合物減去促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)的分子量是20kDa-100kDa。本發(fā)明還提供了包含本文所述綴合物的藥物組合物，其中n是1的綴合物的百分率是組合物中所有綴合物的至少90％，優(yōu)選至少92％，更優(yōu)選96％。
更具體的說(shuō)，上述綴合物可以表述成通式(I)P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n(I)其中P是具有引起骨髓細(xì)胞生成網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞增加的體內(nèi)生物學(xué)活性的本文所述促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)殘基(即不含通式I中所示與羰基形成酰胺鍵的一個(gè)或多個(gè)氨基)；而且其中R是低級(jí)烷基；x是2或3；m是大約450-大約900；n是1-3；且n和m的選擇使得綴合物減去促紅細(xì)胞生成素糖蛋白的分子量是20kDa-100kDa。依照本發(fā)明，R是任何低級(jí)烷基。優(yōu)選R是甲基的綴合物。
符號(hào)“m”代表聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)中環(huán)氧乙烷殘基(OCH2CH2)的數(shù)目。單個(gè)PEG(聚乙二醇)亞基的環(huán)氧乙烷分子量是大約44道爾頓。由此，綴合物的分子量(減去EPO的分子量)取決于“m”的數(shù)值。在本發(fā)明的綴合物中，“m”是大約450-大約900(對(duì)應(yīng)于分子量大約20kDa-大約40kDa)，優(yōu)選大約650-大約750(對(duì)應(yīng)于分子量大約30kDa)。數(shù)值m的選擇使得由此產(chǎn)生的本發(fā)明綴合物的生理學(xué)活性與未修飾EPO相當(dāng)，這種活性可以表述成與未修飾EPO的相應(yīng)活性相同、更高、或其部分?！按蠹s”某一數(shù)值的分子量指它位于通過(guò)常規(guī)分析技術(shù)測(cè)定的該數(shù)值的合理范圍內(nèi)。數(shù)值“m”的選擇使得與促紅細(xì)胞生成素糖蛋白共價(jià)連接的每個(gè)聚乙二醇基團(tuán)的分子量是大約20kDa-大約40kDa，優(yōu)選大約30kDa。
在本發(fā)明的綴合物中，數(shù)值“n”指通過(guò)酰胺鍵與促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)的游離氨基(包括賴(lài)氨酸的ε-氨基和/或氨基末端的氨基)共價(jià)結(jié)合的聚乙二醇基團(tuán)的數(shù)目。本發(fā)明的綴合物可以是每個(gè)EPO分子具有一個(gè)、兩個(gè)、或三個(gè)PEG基團(tuán)?！皀”是1-3的整數(shù)，優(yōu)選“n”是1或2，更優(yōu)選“n”是1。上文所述綴合物的一種優(yōu)選綴合物包括x是2、m是650-750、n是1、且R是甲基的化合物。
可以由已知聚合材料通過(guò)通式II的化合物與促紅細(xì)胞生成素糖蛋白的縮合來(lái)制備通式(I)的化合物 其中R和m如上文所述。x是3的通式(II)化合物是α-低級(jí)烷氧基聚乙二醇丁酸琥珀酰亞胺酯(低級(jí)烷氧基-PEG-SBA)。x是2的通式(II)化合物是α-低級(jí)烷氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亞胺酯(低級(jí)烷氧基-PEG-SPA)?？梢圆捎檬够罨ヅc胺反應(yīng)而形成酰胺的任何常規(guī)方法。在上文所述反應(yīng)中，例示性琥珀酰亞胺酯是引起酰胺形成的離去基團(tuán)。琥珀酰亞胺酯諸如通式II化合物用于與蛋白質(zhì)生成綴合物的用途公開(kāi)于1997年9月30日授權(quán)的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,672,662(Harris等人)。
人EPO含有九個(gè)游離氨基，氨基末端的氨基和8個(gè)賴(lài)氨酸殘基的ε-氨基。在PEG化試劑與通式II的SBA化合物聯(lián)合后，發(fā)現(xiàn)在pH7.5、蛋白質(zhì)∶PEG比率1∶3、和反應(yīng)溫度20-25℃的條件下，生成了單-、雙-、和痕量三-PEG化種類(lèi)的混合物。當(dāng)PEG化試劑是通式II的SPA化合物時(shí)，在相似條件下(只是蛋白質(zhì)∶PEG比率是1∶2)，主要生成單-PEG化種類(lèi)?？梢砸曰旌衔铮蛘呤峭ㄟ^(guò)陽(yáng)離子交換層析分離的不同PEG化種類(lèi)的形式施用PEG化EPO。通過(guò)操控反應(yīng)條件(如試劑比率、pH、溫度、蛋白質(zhì)濃度、反應(yīng)時(shí)間、等)，可以改變不同PEG化種類(lèi)的相對(duì)量。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及上文定義的用途，其中促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)是綴合物，所述綴合物包含的上文定義的促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)具有至少一個(gè)游離氨基且具有引起骨髓細(xì)胞生成網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞增加的體內(nèi)生物學(xué)活性，而且選自人促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)及其類(lèi)似物，即具有通過(guò)添加1-6個(gè)糖基化位點(diǎn)而修飾的人促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)；所述促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)共價(jià)連接1-3個(gè)低級(jí)烷氧基聚乙二醇基團(tuán)，每個(gè)聚乙二醇基團(tuán)通過(guò)通式為-C(O)-X-S-Y-的接頭共價(jià)連接促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)，接頭的C(O)與所述氨基之一形成酰胺鍵，X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，k是1-10，Y是 或 每個(gè)聚乙二醇模塊的平均分子量是大約20kDa-大約40kDa，且綴合物的分子量是大約51kDa-大約175kDa。
這一促紅細(xì)胞生成素種類(lèi)也表述成通式(III)P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH2CH2)m-OR]n(III)其中R可以是任何低級(jí)烷基。優(yōu)選的低級(jí)烷基是甲基。X可以是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，其中k是1-約10。優(yōu)選的是，k是1-大約4，更優(yōu)選的是，k是1或2。最優(yōu)選的是，X是-(CH2)。
在通式I中，Y是 或
優(yōu)選 或 更優(yōu)選 在通式(III)中，數(shù)值m的選擇使得由此產(chǎn)生的通式(III)的綴合物具有與未修飾EPO相當(dāng)?shù)纳韺W(xué)活性，這種活性可以表述成與未修飾EPO的相應(yīng)活性相同、更高、或其部分。m代表PEG單元中環(huán)氧乙烷殘基的數(shù)目。單個(gè)PEG亞基-(OCH2CH2)-的分子量是大約44道爾頓。由此，綴合物的分子量(減去EPO的分子量)取決于數(shù)值m。“大約”某一數(shù)值的分子量指它位于通過(guò)常規(guī)分析技術(shù)測(cè)定的該數(shù)值的合理范圍內(nèi)。m是大約450-大約900的整數(shù)(對(duì)應(yīng)于分子量20kDa-40kDa)，優(yōu)選的是，m是大約550-大約800(大約24kDa-35kDa)，最優(yōu)選的是，m是大約650-大約700(大約29kDa-大約31kDa)。
在通式(III)中，數(shù)值n是通過(guò)酰胺鍵與PEG單元共價(jià)結(jié)合的促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)中賴(lài)氨酸ε-氨基的數(shù)目。本發(fā)明的綴合物可以是每個(gè)EPO分子具有一個(gè)、兩個(gè)、或三個(gè)PEG單元。n是1-3的整數(shù)，優(yōu)選n是1或2，更優(yōu)選n是1。
通式(III)的優(yōu)選促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)表述成通式
和 在本發(fā)明的最優(yōu)選實(shí)施方案中，促紅細(xì)胞生成素綴合物表述成通式 其中n是1-3的整數(shù)；m是大約450-900的整數(shù)；R是低級(jí)烷基；X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，且P是促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)不含與X形成酰胺鍵的一個(gè)或多個(gè)氨基的殘基。
其它優(yōu)選促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物表述成通式 和 更優(yōu)選的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物表述成通式
可以如下制備這些促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)(a)使由通式P-[NH2]n代表的促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)賴(lài)氨酸ε-氨基與由通式Z-CO-X-S-Q代表的雙功能試劑共價(jià)反應(yīng)而形成具有酰胺鍵的中間物，通式為P-[NH-CO-X-S-Q]n其中P是不含形成酰胺鍵的氨基的促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)；n是1-3的整數(shù)；Z是反應(yīng)基，如羧基-NHS酯；X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，其中k是1-大約10；且Q是保護(hù)基，像烷酰基，如乙?；?br> (b)使步驟(a)中具有酰胺鍵的中間物與由通式W-[OCH2CH2]m-OR代表的活化聚乙二醇衍生物共價(jià)反應(yīng)而形成促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物，表述成通式 其中W是Y的巰基反應(yīng)性形式；m是大約450-大約900的整數(shù)；R是低級(jí)烷基；且Y如上文定義。
在這個(gè)實(shí)施方案中，雙功能試劑優(yōu)選N-琥珀酰亞胺-S-乙酰硫代丙酸酯或N-琥珀酰亞胺-S-乙酰硫代乙酸酯，Z優(yōu)選N-羥基-琥珀酰亞胺，且活化聚乙二醇衍生物W-[OCH2CH2]m-OR優(yōu)選選自下組碘代-乙?；?甲氧基-PEG、甲氧基-PEG-乙烯基砜、和甲氧基-PEG-馬來(lái)酰亞胺。
更加詳細(xì)的說(shuō)，可以通過(guò)將硫醇基共價(jià)連接到EPO上(“活化”)并將由此產(chǎn)生的活化EPO與聚乙二醇(PEG)衍生物偶聯(lián)來(lái)制備通式(III)的促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)。用于制備依照本發(fā)明的PEG化EPO的第一步包括通過(guò)EPO的NH2基團(tuán)共價(jià)連接硫醇基。這一EPO活化使用攜帶受保護(hù)硫醇基和額外反應(yīng)基的雙功能試劑來(lái)進(jìn)行，分別諸如活性酯(如琥珀酰亞胺酯)、酸酐、磺酸酯、羧酸和磺酸的鹵化物。硫醇基受到本領(lǐng)域已知基團(tuán)的保護(hù)，如乙?；?。這些雙功能試劑能夠通過(guò)形成酰胺鍵而與賴(lài)氨酸的ζ-氨基反應(yīng)。第一步反應(yīng)表示如下 EPO、n、和X如上文定義，而且Z是本領(lǐng)域已知的反應(yīng)基，如N-羥基-琥珀酰亞胺(NHS)取代基，通式如下 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，ε-氨基賴(lài)氨酸的活化是使用具有琥珀酰亞胺部分的雙功能試劑進(jìn)行的。雙功能試劑可以攜帶不同的間隔物種類(lèi)，如-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-部分，其中k是1-大約10，優(yōu)選1-大約4，更優(yōu)選l和2，最優(yōu)選1。這些試劑的實(shí)例是N-琥珀酰亞胺-S-乙酰硫代丙酸酯(SATP)和N-琥珀酰亞胺-S-乙酰硫代乙酸酯(SATA) 乙酰硫代烷基-羧基-NHS-酯，像
或 2-(乙?；虼?-(乙氧基)k-乙酸-NHS-酯k如上文定義。
雙功能試劑的制備在本領(lǐng)域是知道的。2-(乙酰基硫代)-(乙氧基)k-乙酸-NHS-酯的前體描述于DE-3924705，而乙酰硫代化合物的衍生化描述于March，J.，Advanced Organic Chemistry，McGraw-Hill，1977年，第375-376頁(yè)。SATA可以通過(guò)商業(yè)途徑獲得(MolecularProbes，尤金，俄勒岡州，美國(guó)和Pierce，洛克福特，伊利諾斯州)。
可以通過(guò)調(diào)節(jié)反應(yīng)參數(shù)來(lái)選擇添加到EPO分子上的硫醇基數(shù)目，即蛋白質(zhì)(EPO)濃度和蛋白質(zhì)/雙功能試劑比率。優(yōu)選的是，通過(guò)每個(gè)EPO分子共價(jià)連接1-5個(gè)硫醇基更優(yōu)選每個(gè)EPO分子1.5-3個(gè)硫醇基來(lái)活化EPO。這些范圍指硫醇基相對(duì)于EPO蛋白質(zhì)群的統(tǒng)計(jì)學(xué)分布。
反應(yīng)在例如pH6.5-8.0的水性緩沖溶液中進(jìn)行，如10mM磷酸鉀、50mM NaCl pH7.3?？梢栽贒MSO中添加雙功能試劑。反應(yīng)完成后，優(yōu)選30分鐘后，通過(guò)添加賴(lài)氨酸來(lái)終止反應(yīng)?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域知道的方法來(lái)分離過(guò)量的雙功能試劑，如通過(guò)透析或柱過(guò)濾。可以通過(guò)例如Grasetti，D.R.和Murray，J.F.，J.Appl.Biochem.Biotechnol.，11941-49，1967中描述的光度法來(lái)測(cè)定添加到EPO上的硫醇基平均數(shù)。
上述反應(yīng)之后跟隨活化聚乙二醇(PEG)衍生物的共價(jià)偶聯(lián)。合適的PEG衍生物是平均分子量大約20kDa-大約40kDa的活化PEG分子，更優(yōu)選大約24kDa-大約35kDa，最優(yōu)選大約30kDa。
活化PEG衍生物在本領(lǐng)域是知道的，而且例如Morpurgo，M.等人，J.Bioconj.Chem.，7363，1996描述了PEG-乙烯基砜。直鏈和支鏈PEG種類(lèi)適于制備通式I的化合物。反應(yīng)性PEG試劑的范例是碘代-乙?；?甲氧基-PEG和甲氧基-PEG-乙?；?或 這些碘代活化物質(zhì)的用途在本領(lǐng)域是知道的，而且描述于例如Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic出版社，圣迭戈，1996，第147-148頁(yè)。
最優(yōu)選的是，PEG種類(lèi)是通過(guò)馬來(lái)酰亞胺活化的，使用低級(jí)烷氧基-PEG-馬來(lái)酰亞胺，諸如甲氧基-PEG-馬來(lái)酰亞胺(MW 30000；Shearwater Polymers公司)。低級(jí)烷氧基-PEG-馬來(lái)酰亞胺的結(jié)構(gòu)如下 或 R和m如上文定義，優(yōu)選 低級(jí)烷氧基-PEG-馬來(lái)酰亞胺的偶聯(lián)反應(yīng)在水性緩沖溶液中在原位切割硫醇保護(hù)基后進(jìn)行，水性緩沖溶液如10mM磷酸鉀、50mM NaCl、2mM EDTA pH6.2。例如，保護(hù)基的切除可以用羥胺在DMSO中于25℃、pH6.2進(jìn)行大約90分鐘。對(duì)于PEG修飾，活化EPO/低級(jí)烷氧基-PEG-馬來(lái)酰亞胺的摩爾比應(yīng)當(dāng)是大約1∶3-大約1∶6，優(yōu)選1∶4。可以通過(guò)添加半胱氨酸和剩余硫醇(-SH)基與N-甲基馬來(lái)酰亞胺或能夠形成二硫鍵的其它合適化合物的反應(yīng)來(lái)終止反應(yīng)。由于任何剩余活潑硫醇基與保護(hù)基諸如N-甲基馬來(lái)酰亞胺或其它合適保護(hù)基的反應(yīng)，本發(fā)明綴合物中的EPO糖蛋白可能含有這些保護(hù)基。一般而言，根據(jù)糖蛋白上未與PEG-馬來(lái)酰亞胺綴合的活化硫醇基的數(shù)目，本文描述的流程將生成具有受到不同數(shù)目保護(hù)基保護(hù)的不同數(shù)目硫醇的分子的混合物。
盡管N-甲基馬來(lái)酰亞胺在用于阻斷PEG化蛋白質(zhì)上的剩余硫醇基時(shí)形成相同類(lèi)型的共價(jià)鍵，二硫化物化合物將引導(dǎo)分子間硫化物/二硫化物交換反應(yīng)趨向阻斷劑的二硫橋偶聯(lián)。用于這類(lèi)阻斷反應(yīng)的優(yōu)選阻斷劑是氧化型谷胱甘肽(GSSG)、半胱氨酸、和胱胺。盡管在使用半胱氨酸時(shí)未向PEG化蛋白質(zhì)中導(dǎo)入額外凈電荷，阻斷劑GSSG或胱胺的使用導(dǎo)致額外的負(fù)或正電荷。
通式(III)的化合物的進(jìn)一步純化，包括單-、雙-、和三-PEG化EPO種類(lèi)的分離，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行，如柱層析。
PEG化促紅細(xì)胞生成素衍生物優(yōu)選含有至少90％的單-PEG綴合物。通常希望促紅細(xì)胞生成素糖蛋白的單-PEG綴合物，因?yàn)樗鼈冓呌诰哂斜入p-PEG綴合物更高的活性。通過(guò)合并洗脫峰周?chē)鼘拸V的級(jí)分以降低組合物中單-PEG的百分率或者合并更狹窄的級(jí)分以提高單-PEG的百分率，可以控制單-PEG綴合物的百分率以及單-PEG與雙-PEG種類(lèi)的比率。大約90％單-PEG綴合物是產(chǎn)量與活性之間的較好平衡。有時(shí)可能希望例如其中至少92％百分率或至少96％的綴合物是單-PEG種類(lèi)(n＝1)的組合物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，n是1的綴合物的百分率是90％-96％。
包含PEG化促紅細(xì)胞生成素的藥物組合物在本領(lǐng)域是已知的，而且描述于如國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 01/87329。如上文所定義的，組合物可以含有10-10000μg/ml促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)。優(yōu)選的是，組合物含有10-1000μg/ml，如10、50、100、400、800、或2500μg/ml。另外，組合物可以含有10-10000μg/ml促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)、10-200mmol/L硫酸鹽、10-50mmol/L磷酸鹽pH6.0-6.5。這種組合物還可以含有可高達(dá)20mM甲硫氨酸、1-5％多元醇(w/v)、可高達(dá)0.1％pluronic F68(w/v)、和任選的可高達(dá)1mM CaCl2。這種組合物的一個(gè)實(shí)例含有10μg-10000μg/ml促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)、40mmol/L硫酸鹽、10mmol/L磷酸鹽、3％甘露醇(w/v)、10mM甲硫氨酸、0.01％pluronic F68(w/v)pH6.2。或者，組合物可以含有10μg-10000μg/ml促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)、10-100mmol/L NaCl、10-50mmol/L磷酸鹽pH6.0-7.0，任選1-5％(w/v)多元醇。另外，這種組合物可以含有可高達(dá)20mM甲硫氨酸、可高達(dá)0.1％pluronic F68(w/v)、和任選的7.5μmol/L CaCl2。具體而言，這種組合物可以含有10μg-10000μg/ml促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)、100mmol/L NaCl、10mM甲硫氨酸、0.01％pluronic F68(w/v)、和10mmol/L磷酸鹽pH7.0。
本發(fā)明還涉及含有10μg-10000μg/ml促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)、10-50mmol/L精氨酸pH6-6.5、10-100mmol/L硫酸鈉的上述組合物。另外，這種組合物可以含有可高達(dá)20mM甲硫氨酸、可高達(dá)0.1％pluronic F68(w/v)、任選的可高達(dá)1mmol/L CaCl2、和任選的1-5％(w/v)多元醇。具體而言，這種組合物可以含有10μg-10000μg/ml促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)、40mmol/L精氨酸pH6.2、30mmol/L硫酸鈉、3％甘露醇(w/v)、10mM甲硫氨酸、0.01％pluronicF68(w/v)、和任選的1mmol/L CaCl2。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及含有10-10000μg/ml促紅細(xì)胞生成素、優(yōu)選25-2500μg/ml促紅細(xì)胞生成素和下列成分的組合物a)10mM磷酸鈉/鉀，100mM NaCl pH7.0或b)10mM磷酸鈉，120mM硫酸鈉pH6.2或c)10mM磷酸鈉，40mM硫酸鈉，3％甘露醇(w/v)pH6.2或d)10mM磷酸鈉，40mM硫酸鈉、3％甘露醇(w/v)、10mM甲硫氨酸，0.01％pluronic F68(w/v)pH6.2或
e)40mM精氨酸，30mM硫酸鈉，3％甘露醇(w/v)pH6.2或f)40mM精氨酸，30mM硫酸鈉，3％甘露醇(w/v)、10mM甲硫氨酸，0.01％pluronic F68(w/v)pH6.2。
在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物含有50，100，400，800或2500μg/ml量的促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)。最優(yōu)選的組合物含有10mM磷酸鈉，40mM硫酸鈉，3％甘露醇(w/v)，10mM甲硫氨酸，0.01％pluronic F68(w/v)pH 6.2或40mM精氨酸，30mM硫酸鈉，3％甘露醇(w/v)，10mM甲硫氨酸，0.01％pluronic F68(w/v)pH6.2。可以由WO 01/87329了解這些組合物的其它細(xì)節(jié)。
本發(fā)明還涉及用于治療糖尿病中的鐵分布紊亂的方法，包括施用有效量的上文定義的促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)。此外，本發(fā)明涉及用于治療糖尿病中的鐵分布紊亂的藥物，特征是它包含有效量的促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)。在上述情況中，糖尿病的優(yōu)選形式是非胰島素依賴(lài)性糖尿病。
在糖尿病中的鐵分布紊亂的治療中，可以例如以150U/kg體重的劑量每周兩次施用EPO。劑量可以根據(jù)個(gè)別患者的需要而變化，而且還可以在如100-200U/kg的范圍內(nèi)。根據(jù)所用EPO衍生物的半衰期，可以例如每周1-3次施用劑量。根據(jù)個(gè)別患者的需要，醫(yī)師還可以選擇不同的劑量。
可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種測(cè)定法來(lái)測(cè)定依照本發(fā)明的EPO或EPO綴合物的比活。純化的本發(fā)明EPO蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性是通過(guò)注射將EPO蛋白質(zhì)施用于人類(lèi)患者后導(dǎo)致與未注射或?qū)φ战M患者相比骨髓細(xì)胞生成網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞增加。可以通過(guò)依照Annable等人，Bull.Wld.Hlth.Org，4799-112，1972和Pharm.Europa Spec.Issue Erythropoietin BRP Bio，1997(2)的方法來(lái)測(cè)試依照本發(fā)明獲得并純化的EPO蛋白質(zhì)或其片段的生物學(xué)活性。本領(lǐng)域描述了用于測(cè)定EPO蛋白質(zhì)活性的另一種生物學(xué)測(cè)定法即normocythaemic(正常紅細(xì)胞貧血癥)小鼠測(cè)定法(如Pharm.Europa Spec.IssueErythropoietin BRP Bio，1997(2)和Ph.Eur.BRP.的促紅細(xì)胞生成素專(zhuān)論)。
通過(guò)參照下面的實(shí)施例將更好的理解本發(fā)明，它們是舉例說(shuō)明而非限制本文所述發(fā)明。
實(shí)施例通過(guò)測(cè)定下列參數(shù)對(duì)患有糖尿病的中年婦女檢查鐵分布紊亂CRP(C反應(yīng)性蛋白質(zhì))、鐵蛋白和可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體—如P.Lehmann、M.Volkmann、J.Lotz、A.Baldauf、R.Roeddiger，AACC/CSCC海報(bào)展示，年會(huì)，2001年7月29日-8月2日，伊利諾斯州，芝加哥所述。結(jié)果顯示了鐵分布紊亂?；颊呓邮?50U/kg RecormonTM(商品化促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì))的皮下處理，每周兩次，最多12周。此后，如上所述測(cè)定的參數(shù)顯示缺鐵紊亂得到改善。
序列表(1)常規(guī)信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱(chēng)霍夫曼-拉羅奇有限公司(B)街道124 Grenzacherstrasse(C)城市巴塞爾(E)國(guó)家瑞士(F)郵政編碼(ZIP)CH-4070(G)電話(huà)(61)688 11 11(H)傳真(61)688 13 95(I)電報(bào)962 292 hlr ch(ii)發(fā)明名稱(chēng)新藥物組合物(iii)序列數(shù)2(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)WORD(D)軟件PatentIn Release 2.0<170>PatentIn Ver.2.0<210>1
<211>165<212>PRT<213>人<400>1Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp165<210>2<211>166<212>PRT<213>人<400> 2Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95
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序列表(1)常規(guī)信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱(chēng)霍天曼-拉羅奇有限公司(B)街道124 Grenzacherstrasse(C)城市巴塞爾(E)國(guó)家瑞士(F)郵政編碼(ZIP)CH-4070(G)電話(huà)(61)688 11 11(H)傳真(61)688 13 95(I)電報(bào)962 292 hlr ch(ii)發(fā)明名稱(chēng)新藥物組合物(iii)序列數(shù)2(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)WORD(D)軟件PatentIn Release 2.0<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>165<212>PRT<213>人<400>1Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp165<210>2<211>166<212>PRT<213>人
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1.促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)在制造用于治療糖尿病中的鐵分布紊亂的藥物中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中糖尿病是非胰島素依賴(lài)性糖尿病。
3.依照權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)是人促紅細(xì)胞生成素。
4.依照權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)是epoetinα或epoetinβ。
5.依照權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)是通過(guò)內(nèi)源基因激活而表達(dá)的。
6.依照權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列。
7.依照權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)具有通過(guò)添加1-6個(gè)糖基化位點(diǎn)而修飾的人促紅細(xì)胞生成素序列。
8.依照權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)是darbepoetinα。
9.依照權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中權(quán)利要求3-8任一項(xiàng)中定義的促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)是PEG化的。
10.依照權(quán)利要求9的應(yīng)用，其中促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)是綴合物，所述綴合物包含的促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)具有至少一個(gè)游離氨基且具有引起骨髓細(xì)胞生成網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞增加的體內(nèi)生物學(xué)活性，而且選自由人促紅細(xì)胞生成素及其類(lèi)似物組成的組，其具有通過(guò)添加1-6個(gè)糖基化位點(diǎn)或至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的重排而修飾的人促紅細(xì)胞生成素序列；所述促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)共價(jià)連接n個(gè)通式為-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR的聚乙二醇基團(tuán)，每個(gè)聚乙二醇基團(tuán)的-CO與所述氨基之一形成酰胺鍵；其中R是低級(jí)烷基；x是2或3；m是大約450-大約900；n是1-3；且n和m的選擇使得綴合物減去促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)的分子量是20kDa-100kDa。
11.依照權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中x是2，m是650-750，n是1，且R是甲基。
12.依照權(quán)利要求9的應(yīng)用，其中促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)是綴合物，所述綴合物包含的促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)具有至少一個(gè)游離氨基且具有引起骨髓細(xì)胞生成網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞增加的體內(nèi)生物學(xué)活性，而且選自由人促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)及其類(lèi)似物組成的組，其具有通過(guò)添加1-6個(gè)糖基化位點(diǎn)而修飾的人促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)；所述促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)共價(jià)連接1-3個(gè)低級(jí)烷氧基聚乙二醇基團(tuán)，每個(gè)聚乙二醇基團(tuán)通過(guò)通式為-C(O)-X-S-Y-的接頭共價(jià)連接促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)，接頭的C(O)與所述氨基之一形成酰胺鍵，X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，k是1-10，Y是 或 每個(gè)聚乙二醇部分的平均分子量是大約20kDa-大約40kDa，且綴合物的分子量是大約51kDa-大約175kDa。
13.依照權(quán)利要求12的應(yīng)用，促紅細(xì)胞生成素綴合物的通式是 其中n是1-3的整數(shù)；m是450-900的整數(shù)；R是低級(jí)烷基；X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，k是1-10，且P是促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)不含與X形成酰胺鍵的n個(gè)氨基的殘基。
14.一種用于治療糖尿病中的鐵分布紊亂的方法，包含施用有效量的促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)。
15.一種用于治療糖尿病中的鐵分布紊亂的藥物，特征為它包含有效量的促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)。
16.如上文定義的發(fā)明。
全文摘要
本發(fā)明涉及促紅細(xì)胞生成素用于治療糖尿病中的鐵分布紊亂的用途。
文檔編號(hào)A61P39/00GK1678341SQ03820545
公開(kāi)日2005年10月5日 申請(qǐng)日期2003年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月29日
發(fā)明者保羅·萊曼, 拉爾夫·羅勒迪格, 露特·瓦爾特－馬茨蘇 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司