專利名稱：可用于治療慢性髓細胞性白血病的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及借助含有氯原酸類似物和/或其鹽，例如從氯原酸或其類似物制得的氯原酸鈉或鉀或銨鹽，的組合物對慢性髓細胞樣白血病(CML)的治療。
慢性髓細胞樣白血病是致死的，沒有針對破壞白血病細胞的藥物，而且這些細胞對化學(xué)療法的反應(yīng)較差，這些化學(xué)療法總是非特異性的因此對正常細胞產(chǎn)生不良影響。使用NaChl的這一療法其獨特之處在于殺死骨髓癌細胞而不使正常細胞受影響。
背景技術(shù)：
髓細胞樣白血病通常分為兩組急性髓細胞樣白血病(AML)和慢性髓細胞樣白血病(CML)。AML的特征是在骨髓中骨髓細胞數(shù)量的增長以及骨髓細胞成熟停止。在美國，AML的年發(fā)生率約為每100,000中2.4人，而且它隨年齡逐漸上升，達到每100,000名65歲或以上成年人中12.6人的高峰。CML是一種造血干細胞惡性無性系失調(diào)。發(fā)病的中值年齡是53歲，但它出現(xiàn)在所有年齡組，包括兒童。CML的自然進程是在三至五年內(nèi)甚至更早從良性慢性期向快速致命疾病的驟變發(fā)展。盡管在臨床藥物上有巨大的進展，但是CML的預(yù)后仍然是薄弱的(1)。CD33扮演著骨髓細胞分化過程中的一個特異的有用標(biāo)記(2)。近來的報道暗示，CD33與單克隆抗體的結(jié)合誘導(dǎo)導(dǎo)致體外AML和CML細胞增殖生長抑制的細胞凋亡(2，3)。利用CD33的骨髓特異性表達，已在AML病人中極大成功地使用了與抗癌藥物綴合的人源化抗-CD33單克隆抗體(4)。類似地，淋巴系白血病也分作兩組急性淋巴細胞性白血病(ALL)和慢性淋巴細胞性白血病(CLL)。淋巴系白血病對T和B細胞系都可感染，并且在兒童中普遍。早前已經(jīng)請求保護了蔞葉(Piper betel)葉片提取物的抗髓細胞活性(2002年12月12日提交的專利申請no.PCT/IN00/00118)。從蔞葉提取物中分離的兩種化合物也顯示出抗髓細胞樣白血病活性。一種化合物是3-O-香豆?？崴?3-O-Coumaryl quinic acid)(2002年5月31日遞交的專利申請no.US 60/384 163)。另一種化合物是氯原酸(2002年7月8日遞交的專利申請no.US 60/393750)。
因此，申請人早前的發(fā)現(xiàn)與關(guān)于從蔞葉提取物級分制備的、用于治療慢性髓細胞樣白血病的氯原酸鈉的本專利申請一致。已知氯原酸(Chl)具有抗-變應(yīng)活性(5)。Chl還抑制肝和腎葡萄糖-6-磷酸酶系統(tǒng)(6)。Chl是表皮脂肪氧化酶(epidermal lypoxygenase)活性以及TPA-誘導(dǎo)的耳炎癥的抑制劑(7)。Chl還在小鼠皮膚中表現(xiàn)對TPA-誘導(dǎo)的腫瘤促進作用的抑制效應(yīng)(7)。還報道了Chl的抗-HIV活性(8)。Bcr與Abl基因的意外融合導(dǎo)致產(chǎn)生組成型活性酪氨酸激酶(Bcr-Abl)，該酶將細胞轉(zhuǎn)化為慢性骨髓性白血病(CML)9。已知了抑制Bcr-Abl依賴性細胞生長的高潛力小分子10，11。近來關(guān)于對一種這樣的化合物的抗性發(fā)展的報道強調(diào)了對控制CML12的進一步治療性研究的需求。在此，我們請求保護一種分離自植物即蔞葉的化合物抑制Abl蛋白質(zhì)酪氨酸激酶，從而開啟表達Bcr-Abl的CML細胞K562的凋亡。結(jié)構(gòu)解釋將該分子鑒定為氯原酸。其鈉、鉀、銨及其它鹽也表現(xiàn)對CML細胞的殺滅活性，盡管鈉鹽氯原酸鈉(NaChl)稍比氯原酸的其它鹽表現(xiàn)出更高的潛力。在殺傷K562細胞上，氯原酸鈉比氯原酸表現(xiàn)出高2.0倍的效率。有趣的是，NaChl還破壞CML病人中表達Bcr-Abl的外周血細胞而對Bcr-Abl陰性CML病人的外周血細胞沒有任何影響。分子模型分析指示，Na-Chl占據(jù)Abl激酶結(jié)構(gòu)域的ATP-結(jié)合位點。NaChl因此成為CML的又一種治療試劑。本專利申請中，首次宣稱了Na-Chl的抗髓細胞樣白血病活性。
參考文獻1.Sawyers CL，The New England Journal of Medicine，340(17)1330-1340，1999。
2.Vitale C，Romagnani C等人，Proc.Natl.Acd.Sci.USA，96(26)15091-15096，1999。
3.Vitale C等人，Proc.Natl.Acd.Sci，USA.，98(10)5764-5769，2001。
4.Sievers EL，Appelbaum FR等人，Blood，933678-3684，1999。
5.Ito H，Miyazaki T，Ono M和Sakurai H.Bioorg.Med.Chem.6(7)1051-1056，1998。
6.Arion WJ等人，Arch.Biochem.Biophys.351(2)279-285，1998。
7.Conney AH等人，Adv.Enzyme Regul.31385-396，1991。
8.Supriyatna G等人，Phytomedicine，7(Suppl.II)87，2000。
9.Rowley JD.Nature 243290-293，1973。
10.Druker BJ等人，Nature Medicine 2561-566，1996。
11.Nagar B等人，Cancer Research 624236-4243，2002。
12.Coutre PL等人，Blood 951758-1766，2000。
發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是提供一種含有氯原酸類似物和/或其鹽的藥物組合物。
本發(fā)明的另一目的是為治療慢性髓細胞樣白血病提供一種含有氯原酸類似物和/或其鹽的藥物組合物。
本發(fā)明的另一目的是為治療慢性髓細胞樣白血病提供一種含有氯原酸鹽和/或其鹽，例如從氯原酸或其類似物制得的氯原酸鈉(Na-Chl)或鉀或銨鹽，的藥物組合物。
本發(fā)明的另一目的是提供從蔞葉提取物或任何其它來源分離的氯原酸(Chl)制備而成的化合物氯原酸鈉(NaChl)用于治療慢性髓細胞樣白血病的新用途。
本發(fā)明的另一目的是為治療慢性髓細胞樣白血病提供含有化合物氯原酸鈉和載體的新藥物組合物。
本發(fā)明的再一目的是提供從氯原酸制備氯原酸鈉以治療CML的方法。
本發(fā)明的再一目的是提供從氯原酸制備NaChl的簡化方法，其中氯原酸分離自蔞葉所有具有與CML治療相關(guān)生物活性的植物部分。
本發(fā)明的再一目的是為CML治療提供氯原酸的鈉鹽，即一種來自蔞葉葉片或其任何其它植物部分的草藥產(chǎn)物。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明通過一種含有氯原酸類似物和/或其鹽，例如從氯原酸或其類似物制得的氯原酸鈉(Na-Chl)或鉀或銨鹽，的組合物為慢性髓細胞樣白血病(CML)的治療提供一種藥物組合物。
特別是，本發(fā)明提供一種藥物組合物，它殺死骨髓癌細胞而保持其它正常細胞不受影響。慢性髓細胞樣白血病是致死的，沒有針對破壞白血病細胞的藥物，而且這些細胞對化學(xué)療法的反應(yīng)較差，這些化學(xué)療法總是非特異性的因此對正常細胞產(chǎn)生不良影響。
使用氯原酸的類似物和/或鹽的這一療法其獨特之處在于殺死骨髓癌細胞而使正常細胞不受影響。
發(fā)明詳述因此，本發(fā)明提供對治療慢性髓細胞樣白血病有用的藥物組合物，該慢性髓細胞樣白血病中Bcr-Abl激酶在動物及人體內(nèi)組成型表達，所述組合物含有有效量的氯原酸類似物和/或其鹽以及藥學(xué)可接受的添加劑。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述組合物還在治療由Abl型激酶過表達引起的疾病中有用。
在另一種實施方式中，所述氯原酸的類似物選自新氯原酸(5-O-咖啡?？崴?、隱氯原酸(cryptochlorogenic acid)(4-O-咖啡?？崴?、3-O-(3’-甲基咖啡酰)奎尼酸和5-O-(咖啡酰-4’-甲基)奎尼酸。
仍在另一實施方式中，氯原酸類似物獲自天然來源或由合成制得。
仍在另一實施方式中，氯原酸類似物的鹽選自鈉、鉀和銨鹽。
仍是另一實施方式，添加劑選自象蛋白質(zhì)、碳水化合物、糖類這樣的營養(yǎng)成分，滑石粉，硬脂酸鎂，纖維素，碳酸鈣，淀粉-明膠糊劑和/或藥學(xué)可接受的載體，賦形劑，稀釋劑或溶劑。
本發(fā)明的另一實施方式涉及對受試者施用組合物的方法。該組合物可以經(jīng)口服、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下途徑給藥。
仍是另一實施方式，所述組合物以約1至100mg每kg體重/天，優(yōu)選1至25mg/kg體重/天，的劑量水平給藥。
仍是另一實施方式，所述組合物可以以介于至少四周至高達十二周的時間段給藥，而且在復(fù)發(fā)情況下還可以再次對受試者給藥而不具毒性。
仍是另一實施方式，所述組合物抑制白血病細胞類型K562.和Molt-4.的生長。
仍是另一實施方式，所述組合物抑制白血病細胞類型Molt-4的生長。
仍是另一實施方式，所述組合物，對濃度為104/孔的K562細胞的體外活性IC50值高達27.0納摩爾/ml。
本發(fā)明的再一實施方式提供一種治療患有慢性髓細胞樣白血病或者任何由Abl型激酶過表達引起的疾病的受試者的方法，其中所述慢性髓細胞樣白血病中Bcr-Abl激酶在動物及人體內(nèi)組成型表達。
在另一實施方式中，氯原酸和氯原酸鈉對K562細胞的IC50值分別為13.5和27.0μm/104細胞(附圖2C&2D)。
另一實施方式，氯原酸鈉在小鼠模型中的急性毒性，其中化合物經(jīng)口服途徑在高達2mg/kg體重劑量水平下是非毒性的。
參照以下給出的實施例，本發(fā)明得到了詳細描述，所提供的這些實施例是為了闡述本發(fā)明，而不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。
附圖簡述附

圖1氯原酸鈉(一種氯原酸鹽)的結(jié)構(gòu)。
附圖2氯原酸自蔞葉葉片中的純化，以及其在體外對細胞系和Ph+/-CML病人PBMC的效果。示出了純化流程圖。利用光譜法(IR，NMR，13CNMR，F(xiàn)ABMS)將用HPLC分離自級分E的峰09的結(jié)構(gòu)推斷為氯原酸。通過將細胞鋪平板于含或不含指定量的提取物(a)、級分(b)、純化混合物(c)及其鈉鹽(d)的常規(guī)細胞培養(yǎng)基上完成了細胞計數(shù)分析。每天，根據(jù)錐蟲藍排除法來估算活細胞數(shù)。(e)，獲自三名Ph+CML病人以及一名Ph-CML病人的PBMC用Na-Chl(67.5nmole/105細胞)處理后的活力。(f)，K562細胞在用NaChl(67.5nmole/105細胞)處理六小時(相差顯微圖，×400)后的形態(tài)學(xué)變化。
附圖3氯原酸鈉誘導(dǎo)Ph+CML細胞系和CML病人的PBMC凋亡。
a)對細胞不做處理(NT)或與NaChl(67.5nmole/105細胞)溫育六小時，并在用膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI染色后做流式細胞術(shù)分析。有活力的細胞在方框的左下四分之一中。被膜聯(lián)蛋白V染色的凋亡細胞在方框的右下四分之一中。被膜聯(lián)蛋白V和PI二者染色的末期凋亡細胞在方框的右上四分之一中。
b)用NaChl處理導(dǎo)致Ph+細胞中細胞周期早期停止以及之后的細胞凋亡。將細胞在NaChl存在或不存在下培養(yǎng)。培養(yǎng)1或2天后，收集、透化細胞，并用PI染色以做DNA含量分析。設(shè)置閾值以評估死亡(＜2n DNA，M1)、G0/G1(2n DNA，M2)、和S+G2+M(＞2n DNA，M3)細胞的百分?jǐn)?shù)。
c)用NaChl處理并用膜聯(lián)蛋白V-AllexaTM染色、用膜聯(lián)蛋白V染色的K562和Molt-4細胞的熒光圖示于左版，亮視野相差圖示于右版。
d)用NaChl處理導(dǎo)致Ph+細胞中的procaspase-3活化。對細胞不做處理或用NaChl處理24小時(T)。收集、裂解細胞，將等量裂解物用SDS-PAGE分離以及電轉(zhuǎn)移。濾膜用識別procaspase-3(32Kda，上帶)和caspase-3切割產(chǎn)物(17Kda，下帶)二者的抗-caspase-3探測。
附圖4.氯原酸鈉抑制Ph+細胞中Bcr-Abl自磷酸化。
a)Abl磷酸化狀態(tài)的流式細胞確定。對細胞不做處理(NT)或用NaChl處理3小時(T)，透化并用兔抗-磷酸-c-Abl(Tyr245)抗體染色。虛線，用正常兔IgG染色；實線，用免疫IgG染色。
b)基于免疫印跡的Abl磷酸化狀態(tài)的確定。收集、裂解細胞，將等量裂解物用SDS-PAGE分離以及電轉(zhuǎn)移。濾膜用抗-磷酸-c-Abl(Tyr 245)(上版)或抗-c-Abl抗體(中版)探測。為證實所分析樣品中的等量蛋白質(zhì)水平，還將抗-肌動蛋白抗體用作載樣對照(下版)。
c)Abl表達狀態(tài)的流式細胞確定。細胞做透化處理并用兔抗-c-Abl抗體染色。虛線，用正常兔IgG染色；實線，用免疫IgG染色。
d)Abl酪氨酸激酶失活(版A&B)形式與gleevec(A)和Chl(B)的復(fù)合物以及激酶活性(版C&D)形式與PD173955(C)和Chl(D)的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。失活形式與gleevec(A)的復(fù)合物以及活性形式與PD173955(C)的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)通過X-射線結(jié)晶法獲得。用那些X-射線結(jié)構(gòu)對失活形式與Chl(B)以及活性形式與Chl(D)的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)建模。條帶顯示激酶的結(jié)合袋；黃線是部分活化環(huán)，其在失活(A&B)和活性(C&D)構(gòu)象中不同。環(huán)繞抑制劑分子的封套是它們的Connolly表面。
實施例實施例1氯原酸鈉的制備新鮮收集4.7kg蔞葉葉片，用蒸餾水洗滌，之后切成小片。收集葉的小碎片，與1.0升蒸餾水混合，并在混合器中徹底勻漿。將勻漿物濾過細棉布以過濾掉大塊顆粒，收集濾過物。將該過程重復(fù)2～3次以得到最大量的收集物。之后將混在一起的濾過物離心，將等分試樣(一種澄清的溶液)收集起來，并凍干成半固態(tài)，其約為110gm。檢測所收集材料的生物活性，即，CML細胞的破壞。觀察到陽性活性時，即開始純化。將10gm上述材料上載入Sephadex LH-20柱，并用水、水-甲醇(1∶1)以及甲醇做洗脫液進行層析。分別對由三種不同的溶劑系統(tǒng)獲得的三種不同級分做生物活性檢測。只在甲醇-水(1∶1)中檢測到了活性，稱作級分E。之后用M-Bonda pak柱(19×300mm)以及溶劑系統(tǒng)甲醇∶水∶乙酸(23∶76∶1)、以流速12ml/min對級分E(0.23g)進行制備型HPLC，并在280nm下檢測。從滯留時間為9.16分鐘的峰(第09號峰)處分離到了一種純化的化合物，即氯原酸(4mg)。
將10.5mg氯原酸與碳酸氫鈉(3.6mg)在2ml水中攪拌，并凍干所得溶液，由此制得了氯原酸鈉(13mg)。測試了其生物活性。將其結(jié)構(gòu)確定為氯原酸鈉(附圖1)IR，NMR，13CNMR和FABMS m/2。
KBrIRγmaxcm-13398(OH)，1685(CO)，1593，15271449，1443，1394，1279，1159，11181081，1038，975，916和8101H-NMR(D2O)7.45(1H)，6.99(1H)，6.93(1H)，6.77(1H)6.18(1H)，5.16(1H)，4.11(1H)，3.75(1H)和2.09-1.85(4H)13C NMR(D2O)181.28，169.49，147.69，146.45，144.67，127.14，123.10，116.51，115.40，114.68，77.28，73.33，71.56，71.17，38.88和37.72FABMS m/Z355(M++H)和377(M++Na)
實施例2氯原酸可以在市場上以純的形式獲得。將氯原酸(1gm)與碳酸氫鈉(0.24g，溶于5ml水)溶液手搖混合。將溶液凍干成純氯原酸鈉(1.12gm)并測試生物活性。從分離自蔞葉或者從商業(yè)獲得的氯原酸制得的氯原酸鈉具有相似的結(jié)構(gòu)和活性。
實施例3Bcr-Abl陽性CML細胞系(K562)、CML病人外周血細胞、Bcr-Abl-陰性ALL細胞系(Molt-4)和CML病人外周血細胞的培養(yǎng)。通過將細胞鋪平板于含或不含指定量的提取物、級分、純化化合物及其鈉鹽的常規(guī)細胞培養(yǎng)基上完成了細胞計數(shù)分析。每天，根據(jù)錐蟲藍排除法估算活細胞數(shù)目。
實施例4用相差顯微鏡對Bcr-Abl陽性CML細胞系K562做形態(tài)學(xué)分析。對細胞不做處理(NT)或用NaChl(Nachl；67.5nmole/105細胞)處理，并在相差顯微鏡下觀察(放大×400)。
實施例5用流式細胞術(shù)測定凋亡。對細胞不做處理或用NaChl(67.5nmole/105細胞)處理6小時。洗滌后，用異硫氰酸熒光素(FITC)綴合的膜聯(lián)蛋白V和碘化丙錠(PI)對細胞染色，并在流式細胞儀(FACSCalibur，Beckton Dickinson，USA)中分析。
實施例6共焦顯微術(shù)。用NaChl處理K562和Molt-4細胞，之后如實施例5中所述用Annexin-V-AllexaTM染色，并允許其粘附于聚-L-賴氨酸包被的蓋玻片上10分鐘。用Leica TCS SP2共焦激光掃描顯微鏡(Heidolberg，Germany)分析代表性視野中的細胞。
實施例7DNA細胞周期分析。如實施例5中所述用NaChl培養(yǎng)細胞。培養(yǎng)1或2天后，收集細胞，透化處理并用PI染色以做DNA細胞周期分析。
實施例8
免疫印跡分析。收集、裂解細胞，將等量裂解物用SDS-PAGE分離以及電轉(zhuǎn)移。濾膜用抗-caspase-3抗體(B.D.Pharmingen)、抗-c-Abl抗體或抗-磷酸-c-Abl抗體(Cell Signaling Technology)探測。
實施例9Abl磷酸化或Abl表達狀態(tài)的流式細胞測定。透化細胞，用兔抗-磷酸-c-Abl抗體、抗-c-Abl抗體或?qū)φ胀每贵w染色，并在流式細胞儀中分析。
實施例10用InsightII98.0(Accelrys)對Chl與失活和活性形式的激酶的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)建立模型。用近來確定的該酶與兩種重要藥物分子的兩種復(fù)合物的結(jié)構(gòu)建立復(fù)合物模型，這兩種藥物分子與Chl具有某些結(jié)構(gòu)及功能相似性。通過反復(fù)的極小化和動力學(xué)模擬建立和優(yōu)化了Chl結(jié)構(gòu)。通過將Chl的功能基團與藥物分子試驗結(jié)構(gòu)的類似基團重疊建立了復(fù)合物的初始結(jié)構(gòu)。用cff91力場通過能量極小化(100步，每一急劇下降和綴合梯度方法)將其優(yōu)化。進行千萬億分之一秒的1000步動力學(xué)，每一步在100步的平衡之后，于300°K下于10步中的一步進行構(gòu)象取樣。模擬末期選擇具有最低勢能的構(gòu)象進行下一循環(huán)的模擬。重復(fù)這種極小化與動力學(xué)的組合直到獲得令人滿意的構(gòu)象。在結(jié)合袋腔中用不同的初始條件做了一系列的優(yōu)化。對在能量極小化和分子動力學(xué)過程中距離大于10的原子施加位置約束。
實施例3和4的結(jié)果蔞葉葉片水提物以劑量依賴方式殺死K562細胞(附圖2a)。該提取物對AAL細胞系Molt-4沒有可以感知的效應(yīng)。級分E誘導(dǎo)的對K562細胞的殺傷活性限制在峰09(附圖2b)，該峰09隨后被鑒定為氯原酸(附圖2c)，并且顯示出比粗提物或級分E更高的對K562細胞的殺傷活性。有趣的是，氯原酸鈉(NaChl)在殺傷K562細胞的潛力上比氯原酸高兩倍(附圖2d)。NaChl對殺傷Philadelphia染色體(Bcr-Abl)陽性CML病人外周血單核細胞(PBMC)也有活性(附圖2e)。NaChl對Bcr-Abl陰性CML病人PBMC(附圖2e)沒有活性。相差顯微術(shù)顯示，NaChl誘導(dǎo)K562細胞中的形態(tài)學(xué)變化(核濃縮)，即凋亡跡象(附圖2f)。
氯原酸和氯原酸鈉對K562細胞的IC50值分別為13.5和27.0μm/104細胞(附圖2C和2D)。至于氯原酸鈉在小鼠模型中的急性毒性，該化合物經(jīng)口服途徑在高至2gm/kg體重下是非毒性的。
實施例5和9的結(jié)果用NaChl處理未誘導(dǎo)Molt-4細胞、正常PBMC或Bcr-Abl陰性CML病人PBMC中的凋亡。相反，相同的處理導(dǎo)致Bcr-Abl陽性K562細胞和Bcr-Abl陽性CML病人PBMC中的凋亡(附圖3a)。DNA細胞周期分析也指示，NaChl在Bcr-Abl陽性CML細胞系K562細胞和Bcr-Abl陽性CML病人PBMC中誘導(dǎo)細胞周期停止以及之后的DNA降解(附圖3b)。共焦顯微術(shù)指示，用NaChl處理后在K562細胞中而非Molt-4細胞中出現(xiàn)了陽性膜聯(lián)蛋白V染色，其示于附圖3c中。通過對caspase3活化的免疫印跡探測進一步證實了在K562細胞、Bcr-Abl(Ph)陽性CML病人PBMC中，但非Molt-4細胞、或Bcr-Abl陰性CML病人或正常供體的PBMC中，的凋亡(附圖3d)。NaChl抑制Bcr-Abl蛋白質(zhì)酪氨酸激酶的磷酸化而不影響Abl蛋白質(zhì)表達水平。借助對磷酸-c-Abl狀態(tài)的流式細胞探測(附圖4a)、以及借助免疫印跡探測(附圖4b，上版)，證實了這一結(jié)果。Abl蛋白質(zhì)的表達也用流式細胞術(shù)(附圖4c)和免疫印跡(附圖4b，中版)做了分析。因此，我們的發(fā)現(xiàn)表明，氯原酸鈉抑制Abl蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(包括Bcr-Abl激酶)的磷酸化，導(dǎo)致細胞凋亡。氯原酸和氯原酸鈉對K562細胞的IC50值分別為13.5和27.0μm/104細胞，附圖2C和2D。至于氯原酸鈉在小鼠模型中的急性毒性，該化合物經(jīng)口服途徑在高至2gm/kg體重下是非毒性的。
實施例10的結(jié)果附圖-4d顯示，氯原酸(Chl，版B)能夠在與Gleevec相似的位置正好進入處于失活構(gòu)象的Abl激酶的結(jié)合袋中(版A)，以及在與PD173955相似的位置(版C)正好進入活性構(gòu)象(版D)。與配體錨定進入激酶的活性和失活構(gòu)象的結(jié)合袋中相關(guān)的實驗?zāi)苁秦?fù)的，并且與其它表現(xiàn)穩(wěn)定復(fù)合物形成的小分子抑制劑例如Gleevec和PD173955的那些實驗?zāi)芟喈?dāng)。帶電荷以及不帶電形式的Chl的結(jié)合能是不同的，而且與不帶電抑制劑不同，電互作的大小依賴于分子的電狀態(tài)。模型研究指示，Chl和PD173955一樣能結(jié)合激酶的活性和失活兩種構(gòu)象。如同在Gleevec復(fù)合物中所發(fā)現(xiàn)的，Chl與周圍的殘基形成大量氫鍵而同時保持一些疏水互作不受影響。與PD173955相比，Chl形成較多的氫鍵而同時保持相似的疏水接觸數(shù)量。已發(fā)現(xiàn)，Chl的芳香羥基基團在結(jié)合袋中形成一個氫鍵網(wǎng)絡(luò)，這暗示著這些基團在復(fù)合物形成中的重要性。
權(quán)利要求
1.一種可用于治療其中Bcr-Abl激酶在動物和人中組成型表達的慢性髓細胞樣白血病的藥物組合物，所述組合物含有有效量的氯原酸類似物和/或其鹽以及藥學(xué)可接受的添加劑。
2.如權(quán)利要求1中所請求保護的組合物，其中所述組合物還可用于由Abl型激酶過表達引起的疾病。
3.如權(quán)利要求1中所請求保護的組合物，其中所述氯原酸類似物選自新氯原酸(5-O-咖啡?？崴?、隱氯原酸(4-O-咖啡?？崴?、3-O-(3’-甲基咖啡酰)奎尼酸和5-O-(咖啡酰-4’-甲基)奎尼酸。
4.如權(quán)利要求1中所請求保護的組合物，其中所述氯原酸類似物獲自天然來源或者由合成制備。
5.如權(quán)利要求1中所請求保護的組合物，其中所述氯原酸類似物的鹽選自鈉、鉀和銨鹽。
6.如權(quán)利要求1中所請求保護的組合物，其中所述添加劑選自象蛋白質(zhì)、碳水化合物、糖類這樣的營養(yǎng)成分，滑石粉，硬脂酸鎂，纖維素，碳酸鈣，淀粉-明膠糊劑和/或藥學(xué)可接受的載體，賦形劑，稀釋劑或溶劑。
7.如權(quán)利要求1中所請求保護的組合物是經(jīng)口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑給藥的。
8.如權(quán)利要求1中所請求保護的組合物是以介于1和20mg每kg體重/天的劑量水平給藥的。
9.如權(quán)利要求1中所請求保護的組合物，它給藥至少四周，多至十二周。
10.如權(quán)利要求1中所請求保護的組合物，其中所述組合物還可用于CML的復(fù)發(fā)病癥。
11.如權(quán)利要求1中所請求保護的組合物，其中所述組合物抑制白血病細胞類型K562和Molt-4的生長。
12.如權(quán)利要求1中所請求保護的組合物，對濃度為104/孔的K562細胞的體外活性的IC50值高達27.0nanomole/ml。
13.如權(quán)利要求1中所請求保護的藥物組合物用于治療受試者中慢性髓細胞樣白血病的用途，其中所述白血病中Bcr-Abl激酶在動物和人中組成型表達，所述組合物含有有效量的氯原酸類似物和/或其鹽以及藥學(xué)可接受的添加劑。
14.如權(quán)利要求13所請求保護的用途，其中所述受試者選自哺乳動物，優(yōu)選為人。
15.如權(quán)利要求13所請求保護的用途，其中所述組合物還可用于由Abl型激酶過表達引起的疾病。
16.如權(quán)利要求13所請求保護的用途，其中所述氯原酸類似物選自新氯原酸(5-O-咖啡酰奎尼酸)、隱氯原酸(4-O-咖啡?？崴?、3-O-(3’-甲基咖啡酰)奎尼酸和5-O-(咖啡酰-4’-甲基)奎尼酸。
17.如權(quán)利要求13所請求保護的用途，其中所述氯原酸類似物獲自天然來源或者由合成制備。
18.如權(quán)利要求13所請求保護的用途，其中所述氯原酸類似物的鹽選自鈉、鉀和銨鹽。
19.如權(quán)利要求13所請求保護的用途，其中所述添加劑選自象蛋白質(zhì)、碳水化合物、糖類這樣的營養(yǎng)成分，滑石粉，硬脂酸鎂，纖維素，碳酸鈣，淀粉-明膠糊劑和/或藥學(xué)可接受的載體，賦形劑，稀釋劑或溶劑。
20.如權(quán)利要求13所請求保護的用途，其中所述組合物是經(jīng)口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑給藥的。
21.如權(quán)利要求13所請求保護的用途，其中所述組合物是以介于1和20mg每kg體重/天的劑量水平給藥的。
22.如權(quán)利要求13所請求保護的用途，其中所述組合物給藥至少四周，多至十二周。
23.如權(quán)利要求13所請求保護的用途，其中所述組合物還可用于CML的復(fù)發(fā)病癥。
24.如權(quán)利要求13所請求保護的用途，其中所述組合物抑制白血病細胞類型K562和Molt-4的生長。
25.如權(quán)利要求13所請求保護的用途，其中該組合物對濃度為104/孔的K562細胞的體外活性的IC50值高達27.0nanomole/ml。
26.一種治療慢性髓細胞樣白血病CML的方法，該白血病中Bcr-Abl激酶在動物和人中組成型表達，所述方法包括施用藥物組合物，所述藥物組合物含有有效量的氯原酸類似物和/或其鹽以及藥學(xué)可接受的添加劑。
27.如權(quán)利要求26中所請求保護的方法，其中所述組合物還可用于由Abl型激酶過表達引起的疾病。
28.如權(quán)利要求26中所請求保護的方法，其中所述氯原酸類似物選自新氯原酸(5-O-咖啡?？崴?、隱氯原酸(4-O-咖啡酰奎尼酸)、3-O-(3’-甲基咖啡酰)奎尼酸和5-O-(咖啡酰-4’-甲基)奎尼酸。
29.如權(quán)利要求26中所請求保護的方法，其中所述氯原酸類似物獲自天然來源或者由合成制備。
30.如權(quán)利要求26中所請求保護的方法，其中所述氯原酸類似物的鹽選自鈉、鉀和銨鹽。
31.如權(quán)利要求26中所請求保護的方法，其中，所述添加劑選自象蛋白質(zhì)、碳水化合物、糖類這樣的營養(yǎng)成分，滑石粉，硬脂酸鎂，纖維素，碳酸鈣，淀粉-明膠糊劑和/或藥學(xué)可接受的載體，賦形劑，稀釋劑或溶劑。
32.如權(quán)利要求26中所請求保護的方法，其中所述組合物是經(jīng)口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑給藥的。
33.如權(quán)利要求26中所請求保護的方法，其中所述組合物是以介于1和20mg每kg體重/天的劑量水平給藥的。
34.如權(quán)利要求26中所請求保護的方法，其中所述組合物給藥至少四周，多至十二周。
35.如權(quán)利要求26中所請求保護的方法，其中所述組合物還可用于CML的復(fù)發(fā)病癥。
36.如權(quán)利要求26中所請求保護的方法，其中所述組合物抑制白血病細胞類型K562和Molt-4的生長。
37.如權(quán)利要求26中所請求保護的方法，其中該組合物對濃度為104/孔的K562細胞的體外活性的IC50值高達27.0nanomole/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及可用于治療慢性髓細胞樣白血病的藥物組合物，在該慢性髓細胞樣白血病中，Bcr－Abl激酶在動物和人中組成型表達，所述組合物含有有效量的氯原酸類似物例如新氯原酸(5－O－咖啡?？崴?、隱氯原酸(4－O－咖啡?？崴?、3－O－(3’－甲基咖啡酰)奎尼酸和5－O－(咖啡酰－4’－甲基)奎尼酸和/或其鹽例如鈉、鉀和銨以及藥學(xué)可接受的添加劑。
文檔編號A61P35/02GK1678300SQ03820559
公開日2005年10月5日 申請日期2003年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月8日
發(fā)明者S·班德約帕德亞, B·C·帕爾, S·巴塔查爾亞, K·C·洛伊, G·班德約帕德亞 申請人:科學(xué)與工業(yè)研究會