專利名稱：在低氧氣濃度下用骨誘導蛋白包被的金屬植入物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)裝置的方法，包括以下步驟(a)提供包括溶解的骨誘導蛋白(osteoinductive protein)的溶液，(b)讓上述步驟的溶液與包括金屬或金屬合金表面的載體接觸，(c)用所述溶解的蛋白對所述載體的表面進行包被，和(d)對在步驟(c)中獲得的包被的載體進行干燥，其中，步驟(b)-(d)是在降低濃度的氧氣條件下進行的。本發(fā)明還涉及可以通過本發(fā)明方法獲得的裝置。另外，本發(fā)明涉及包括所述裝置的藥用組合物，并且涉及將所述裝置用于制備用來加速骨整合和新骨形成的藥用組合物的用途。最后，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明裝置的試劑盒。
在過去幾十年中，披露了改善植入物質(zhì)量的多種方法，所述質(zhì)量涉及骨植入物接觸和它們的生物兼容性。對植入物的要求是非常嚴格的，因為這些裝置必須牢固地固定在骨骼上，并且對諸如高壓的條件(例如牙齒，關(guān)節(jié))來說是穩(wěn)定的。植入之后最初的組織反應(yīng)取決于從周圍組織中釋放的特殊生長因子的存在，這些因子能刺激細胞生長和分化。
盡管業(yè)已完善了牙齒植入物的固定方法，但仍然存在植入物經(jīng)長時間使用之后松動的傾向。業(yè)已披露了多種方法，以便改善相應(yīng)的植入物的整合(骨整合)。所述方法包括用生物可降解的材料(例如，磷酸三鈣，羥磷灰石)對不同來源的植入物(例如，陶瓷，金屬，或其它材料，參見EP-B1 0 657 146)的植入物進行包被，以及各種用于對金屬表面進行蝕刻的各種方法。提供納米和微米范圍的表面不規(guī)則性，以便改善膠原和細胞向內(nèi)生長(T.Albrektsson inHandbook ofBiomaterials(Black，J and Hastings，G(eds.)，Chapman & Hall，London，1998，pp 500-512)。
披露了用陶瓷表面對金屬植入物進行包被，例如，兩種粉末的混合物一種金屬粉末和一種含有磷酸鈣的粉末(EP 0467948)，在燒結(jié)工藝中將其加工成植入物材料。
業(yè)已披露了多種生產(chǎn)復(fù)合陶瓷材料的其它燒結(jié)方法(Offenlegungsschrift DE 2928007，美國專利4,882,196)。主要關(guān)注點在于用諸如磷酸三鈣或羥磷灰石等磷酸鈣對金屬表面進行包被(Y.Tsui，1998)，它能夠改善所述植入物的整合(美國專利6,312,472；美國申請A-20020038149)。所披露的磷酸鈣和多種其它無機醫(yī)用材料具有成孔的特征。據(jù)說，這些孔有助于植入物整合到天然骨骼中(WO 00/72776；美國專利4,051,598；EP 0806211，H.Jennissen，2001)，因為天然骨骼會生長到所述孔中，與此同時，降解所述植入物的無機磷酸鈣層(WO 96/10370；WO 01/97679)。除了所述組合材料之外，還披露了包括多層的植入物，其中，所述植入物的下層通常包括金屬或合金，如鈦或鈦合金(WO 98/43550；WO00/72777)，用一層磷酸鈣進行包被(EP 0478532)。通常，用磷酸鈣包被是通過以下方法實現(xiàn)的水熱處理(EP 0548365)，或浸泡和沉淀(美國專利6,129,928，WO 97/41273)或等離子噴涂(美國專利5,697,997，美國專利6,113,993，EP 0548365，EP 0739191，Lichtinger，2001)。
位于所述植入物主體上的磷酸鈣層可以是一層內(nèi)的材料混合物的一部分(WO 98/48862，美國專利5,934,287；美國申請A-20020033548)或是多層形式(WO 02/09788，美國專利6,322,728)的一部分。
除了所述表面的改進之外，披露了若干種方法，其中，將蛋白或蛋白混合物(主要是生長因子)涂在整形外科或牙齒植入物上。據(jù)說，所述蛋白能顯著加快植入物的整合(Lichtinger，2001；Shah，1999)。披露了若干種用于將蛋白直接涂敷在金屬表面上的若干種方法。不過，這些方法具有若干缺陷，特別是蛋白從所述金屬表面上的迅速釋放，這不能夠?qū)⑺龅鞍妆３终T導骨形成所需要的時間(Lichtinger，2001)。
為了避免所述蛋白的迅速釋放(自發(fā)分解)，K.Endo(1995)和Voggenreiter等(2001)披露了通過與所述金屬表面共價結(jié)合固定所述蛋白。保持了相應(yīng)蛋白的活性。不過，所述共價結(jié)合可能誘導結(jié)構(gòu)變化，這種變化會影響蛋白的免疫原性。
很多研究者業(yè)已指出，用于軟骨內(nèi)骨形成的生骨因子的成功的植入，需要所述蛋白與合適的載體材料或基質(zhì)結(jié)合，所述材料能夠?qū)⑺龅鞍妆３衷谑褂貌课簧?美國專利5,344,654)。為了克服以上困難，美國專利5,258,029披露了“本發(fā)明的生骨蛋白通常以生骨有效量與可以藥用的固體或液體載體一起配制。所述制劑優(yōu)選包括能夠提供用于形成骨骼和軟骨的結(jié)構(gòu)的基質(zhì)。潛在的基質(zhì)可以是生物可降解的或生物不可降解的，并且可以是化學或生物學定義的”。干燥TGF-β-蛋白和所述載體的懸浮液，然后涂敷在所述帶負荷的假體上。所述方法的缺陷是，來自動物的膠原或無機成分的使用，有可能在植入期間磨損。
Lichtinger等(2001)披露了克服所述蛋白被迅速清洗掉的其它方法，該作者用chromosulfuric acid處理所述鈦合金表面，以便獲得超強親水性生物粘性表面。不過，在生產(chǎn)醫(yī)學制品或醫(yī)療裝置期間，應(yīng)當避免使用chromosulfuric acid，因為保留在所述表面上的殘留量的這種酸，能導致所述蛋白的氧化，造成隨后的結(jié)構(gòu)和功能改變，并且還可能造成對患者的損傷。
在WO 00/72777和WO 00/72778中披露了其它方法，這些方法使用了depot，所述depot是通過在所述鈦表面的厚的氧化層的孔的排列或通過內(nèi)部空間，通道或凹槽形成的。不過，眾所周知的是，蛋白傾向于在存在金屬和金屬離子的情況下被氧化(Li等(1997)，Ann.Occup.Hyg.41，suppl.1，379-383)。因此，上述裝置的缺陷可能是，所述蛋白在所述植入物的表面上被氧化。這種氧化可能導致結(jié)構(gòu)變化，結(jié)構(gòu)變化可能導致免疫原性反應(yīng)的形成。
因此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供改進骨骼擴充的工具。
所述技術(shù)問題通過權(quán)利要求書中所限定的實施方案得到了解決。
因此，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)裝置的方法，包括以下步驟(a)提供包括溶解的骨誘導蛋白的溶液；(b)讓步驟(a)的溶液與包括金屬或金屬合金表面的載體接觸；(c)允許所述溶解的蛋白對所述載體的表面進行包被；和(d)對在步驟(c)中獲得的包被的載體進行干燥，其中，步驟(b)-(d)是在降低濃度的氧氣條件下進行的。
術(shù)語″制造″除了包括明確所述提到的步驟之外，還包括諸如包裝等的其它制造步驟。本發(fā)明的方法優(yōu)選是作為借助于合適的自動儀器的自動化制造方法進行的。術(shù)語“生產(chǎn)”和“制造”在本發(fā)明的含義范圍內(nèi)是可以交換使用的。
本發(fā)明所使用的術(shù)語″裝置″表示包括至少兩個部分的實體。其中的一個部分是載體。
可以在本發(fā)明含義范圍內(nèi)使用的載體包括固體載體，如全金屬或合金載體，以及金屬或合金基質(zhì)。另外，本發(fā)明涵蓋包括空腔和間隙的固體載體。另外，優(yōu)選地，由于大型和小型孔的形成，所述載體具有大的表面。所述大孔或小孔優(yōu)選局限于所述載體的表面層。本發(fā)明還涉及包括至少兩個不同部分的載體，其中，將金屬或合金部分用作核心或核心層，并且，例如陶瓷材料用作表面層。所述載體表面對骨誘導蛋白具有高親和力，不過，仍然允許在體內(nèi)釋放所述蛋白。根據(jù)本發(fā)明，所述載體優(yōu)選是下文所披露的金屬或合金。本發(fā)明裝置所包括的載體可以制成合適的形式，以便在體內(nèi)使用所述裝置。其中包括植入物或完整的外科用假體的形成。正如下文將要更詳細地說明的，所述假體優(yōu)選是用金屬表面制成的或用金屬表面包被。假體是用鈦或鈦合金諸如鈦合金或不銹鋼制成的。
正如下面將要詳細說明的，所述裝置的另一個部分是具有骨誘導特性的蛋白或多肽。將所述蛋白或多肽固定在所述載體的表面上。所述蛋白或多肽與所述載體的結(jié)合優(yōu)選是可逆的。因此，設(shè)想具有骨誘導特性的蛋白或多肽不通過共價結(jié)合結(jié)合在所述載體的金屬表面上的。結(jié)合優(yōu)選是通過靜電相互作用，疏水或非靜電相互作用如范德華力實現(xiàn)的。由于所述骨誘導蛋白的可逆的結(jié)合，所述裝置一旦與諸如骨腔等合適的體內(nèi)環(huán)境接觸，就能夠溶解所述蛋白。所述蛋白的溶解優(yōu)選是允許所述蛋白擴散到環(huán)繞所述裝置的組織中的緩慢釋放。因此，正如在所述實施例中證實的，所述裝置允許骨誘導和天然蛋白的局部存在，這種存在能加快新骨的形成，和骨骼向所述基質(zhì)表面的向內(nèi)生長。本發(fā)明的裝置可以是植入物，這意味著，本文所使用的術(shù)語“裝置”和“植入物”是可以互換的。眾所周知的是，術(shù)語″植入物″表示由本發(fā)明提供的每一種裝置，它被設(shè)計成完全或部分位于上皮表面下面(Koeck，B.和Wagner，W.(Eds.)1996)。所述植入物可以是扁平的，致密的或具有復(fù)雜的形狀，即可以使用任何常用的或可操作的裝置。上述植入物可以包括從例如被用于取代長骨或作為人工牙齒的基礎(chǔ)的簡單的圓柱形狀，到被用于取代頭扁平骨和諸如臀部，膝蓋或肘部等人工關(guān)節(jié)的扁平植入物。
正如下面所披露的，用所述骨誘導蛋白對本發(fā)明的裝置進行包被，是為了啟動和促進間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)化成成骨細胞和軟骨細胞。因此，希望僅僅對本發(fā)明裝置的朝向相應(yīng)的骨骼組織的部分進行包被。所述部分優(yōu)選是整個表面或至少其與所述骨骼組織對合的部分。例如，被用于取代缺少的牙齒的牙齒植入物，包括要擰入頜骨的帶螺紋的部分以及被用于錨定人工齒冠的延長部分(牙槽)。因此，只需要用所述骨誘導蛋白對所述帶螺紋的部分進行包被。不過，沒有用所述骨誘導蛋白包被的部分可以用其它制劑包被，如磷酸鈣類，膠原或類似制劑。
術(shù)語″骨誘導″表示將間充質(zhì)干細胞和前-成骨細胞轉(zhuǎn)化成成骨細胞的能力。骨誘導的先決條件是由所述裝置分配到周圍組織中的信號，在這里，激活了上述造骨細胞前體和其它間充質(zhì)細胞。本文所說的骨誘導包括間充質(zhì)細胞分化成骨前體細胞-造骨細胞。另外，骨誘導還包括所述成骨細胞分化成骨細胞-骨骼的成熟的細胞。因此，骨誘導需要將未分化的或欠分化的細胞分化成能形成骨骼的骨細胞。如上文所述，在植入之后，本發(fā)明所使用的骨誘導蛋白從所述裝置中緩慢地釋放，并且有效地分配到周圍組織中。另外，本發(fā)明所涵蓋的蛋白和多肽具有體內(nèi)骨誘導特性。例如，本領(lǐng)域眾所周知的是，轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族包括具有骨誘導特性的成員。在下文列舉了具有特別好的骨誘導特性的所述TGF-β超家族的不同的成員?？傊?，本發(fā)明裝置的骨誘導蛋白存在于它的表面上，并且在從所述載體上釋放出來之后，可以發(fā)揮對于所述裝置植入部位周圍組織的骨細胞前體的骨誘導信號的作用。
術(shù)語″骨誘導蛋白″或如上文所述，表示具有骨誘導特性的轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族成員，如生長和分化因子-5；參見下文。令人吃驚的是，正如在所述實施例中證實的，所述骨誘導蛋白表現(xiàn)出對金屬表面的高親和力。對所述金屬表面的這種吸附過程的重要的前提條件是，所述蛋白在所述包被溶液中具有足夠的溶解度。
本發(fā)明的裝置或植入物優(yōu)選是如上文所披露的任何類型的金屬表面。在所述含有溶解的骨誘導蛋白的溶液與含有本文所披露的金屬或金屬合金表面的載體接觸之前，希望所述相應(yīng)的金屬表面優(yōu)選是清潔過的或處理過的，以便除去任何表面污染物，并且促進所述涂層的良好的粘著強度。適用于這一目的的若干種方法為本領(lǐng)域所熟知，并且還在所述實施例中進行了說明。例如，本發(fā)明的裝置的所述金屬表面可以用，例如，丙酮，諸如乙醇等烷基醇漂洗，然后用無菌蒸餾水或去離子水充分漂洗。
本發(fā)明的裝置優(yōu)選由于進行了多孔的、珠狀的或網(wǎng)狀的表面修飾具有較大的表面。這種修飾可以通過本領(lǐng)域眾所周知的方法導入，包括化學或機械方法。另外，業(yè)已證實了具有納米和微米范圍不規(guī)則性的增加的表面，有利于骨整合。
披露了多種用于將藥用制品中的蛋白穩(wěn)定化的方法。不過，支持本發(fā)明的實驗證實了在液體或冷凍干燥蛋白制劑中進行蛋白穩(wěn)定化的眾所周知的技術(shù)，不能直接適用于吸附到金屬表面上的蛋白。按照上面所提到的現(xiàn)有技術(shù)中所披露的方法將蛋白涂敷在諸如鈦或鈦合金等金屬表面上，導致出現(xiàn)修飾類型的蛋白，這會導致所述蛋白氧化或聚集(詳情參見實施例5)。另外，即使是添加還原性試劑，也不能減少氧化蛋白的量(詳情參見實施例10)。由于本發(fā)明的方法，可以生產(chǎn)出這樣的裝置，在植入之后，能夠有效地擴充骨骼。有利的是，可以避免由于氧化蛋白的增強了的免疫原性所導致的諸如炎癥等不利的副作用。另外，本發(fā)明的方法在生產(chǎn)本發(fā)明的醫(yī)療裝置時允許使用花費較少的時間，并且更節(jié)省成本的生產(chǎn)工藝，因為不需要用磷酸鈣或膠原層對所述植入物的金屬或合金主體進行包被。本發(fā)明的另一個優(yōu)點是，所述生產(chǎn)工藝中排除了潛在的污染材料，如可能傳播傳染性病毒的膠原。
在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案中，步驟(b)-(d)是在低于10vol％氧氣的氧氣濃度下進行的，所述氧氣濃度優(yōu)選低于5％，最優(yōu)選低于2％。
在本發(fā)明方法的另一種優(yōu)選實施方案中，步驟(b)-(d)是在低于25℃的溫度下進行的，優(yōu)選低于15℃，最優(yōu)選低于8℃。
在本發(fā)明方法的另一種優(yōu)選實施方案中，所述金屬或金屬合金是鈦或鈦合金。
本發(fā)明的金屬/金屬合金優(yōu)選是生物兼容性的。術(shù)語“生物兼容性的”表示對生物學系統(tǒng)沒有毒性或損害作用的品質(zhì)(Williams，D.F.1999)。特別是對于包括下文所提到的成分的鈦或鈦合金來說，所述特性是已知的。
更優(yōu)選的是，所述鈦合金是包括至少50％鈦的鈦合金。更優(yōu)選的是，所述鈦合金是Ti-Al-V-合金，Ti-Al-Fe合金，Ti-Al-Nb-合金或Ti-Mo-Zr-Al-合金，最優(yōu)選Ti6Al4V。
在本發(fā)明方法的另一種優(yōu)選實施方案中，所述包被是通過將所述金屬表面浸泡在所述蛋白溶液中進行的。
在本發(fā)明方法的另一種優(yōu)選實施方案中，所述包被是通過將所述蛋白溶液滴在所述金屬表面上進行的。
作為優(yōu)選實施方案，本發(fā)明還包括這樣一種方法，其中，所述包被是通過將所述蛋白溶液噴灑在所述金屬表面上進行的。
術(shù)語″干燥″包括除去在用所述骨誘導蛋白對所述載體進行包被之后仍然存在的液體，如多余的緩沖溶液。干燥優(yōu)選是通過真空或冷凍干燥實現(xiàn)的。
在本發(fā)明方法的另一種優(yōu)選實施方案中，所述干燥是通過在惰性氣流中在室溫下蒸發(fā)實現(xiàn)的。
在本發(fā)明方法的另一種優(yōu)選實施方案中，所述骨誘導蛋白是TGF-β家族的成員。
術(shù)語″TGF-β家族的成員″包括所述蛋白的生物學活性，成熟的類型，以及相應(yīng)的原形(proforms)，即原蛋白(proproteins)，其包括所述TGF-β家族的成員的相應(yīng)的原結(jié)構(gòu)域(prodomain)，正如在下面更詳細地披露的。
業(yè)已證實生長和分化因子的TGF-β家族參與了多種生物學過程，包括骨形成。所述家族的所有成員都是分泌的多肽，包括特征性的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。在所述TGF-β家族成員的最N-末端包括信號肽或分泌前導序列。在該序列的C-末端是原結(jié)構(gòu)域和所述成熟的多肽的序列。所述成熟的多肽的序列包括七個保守的半胱氨酸，其中的六個是形成分子內(nèi)二硫鍵所必需的，其中的一個是兩個多肽的二聚體化所需要的。所述生物學活性的TGF-β家族成員是二聚體，優(yōu)選包括兩個成熟的多肽。所述TGF-β家族成員通常是作為前蛋白原分泌的，除了所述成熟的序列之外，它還包括前(信號序列)-和原序列。所述信號序列和原結(jié)構(gòu)域是在細胞外被切除的，并且不是所述信號傳導分子的一部分。不過，業(yè)已報導過所述原結(jié)構(gòu)域可能是所述成熟的多肽的細胞外穩(wěn)定化所必須的。有關(guān)TGF-β超家族的成員的綜述，披露于以下文獻中WozneyJM，Rosen V(1998)在骨形成和修復(fù)中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白和骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因家族，Clin Orthop 34626-37。所述TGF-β家族成員的氨基酸序列可以從眾所周知的數(shù)據(jù)庫獲得，如通過互聯(lián)網(wǎng)從一下網(wǎng)址(http//www.expasy.ch/sprot/sprot-top.html)獲得。所述TGF-β家族的具有特別高的成骨潛力的成員BMP2，BMP7和GDF-5的前原形式的氨基酸序列，分別在SEQ ID No1-3中示出。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，術(shù)語″TGF-β家族成員″或下面所提到的所述家族的蛋白，包括所述蛋白或成員的所有生物學活性變體，以及所有變體和它們的無活性前體。因此，僅包括成熟序列蛋白以及包括成熟蛋白和原結(jié)構(gòu)域或成熟蛋白，前結(jié)構(gòu)域和前導序列的蛋白，以及它們的生物學活性片段，都屬于本發(fā)明的范圍?？梢酝ㄟ^生物學測定方法方便地測定TGF-β成員的片段是否具有生物學活性，例如，參見KatagiriT，Yamaguchi A，Ikeda T，Yoshiki S，Wozney JM，Rosen V，WangEA，Tanka H，Omura S，Suda T，(1990)通過重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2誘導非成骨小鼠多能細胞系C3H10T1/2分化成造骨細胞，Biochem.Biophys.Res.Commun.172295-299或Nishitoh H，IchijoH，Kimura M，Matsumoto T，Makishima F，Yamaguchi A，YamashitaH，Enomoto S，Miyazono K(1996)生長/分化因子-5的I型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的鑒定，J.Biol.Chem.27121345-21352。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的生物學活性可以通過在所述實施例中披露的體內(nèi)模型確定。另外，本發(fā)明涉及所述TGF-β成員的變體，這些變體的氨基酸序列與本文所提到的TGF-β家族成員的氨基酸序列，特別是SEQ ID Nos.1-3中任意一項所示出的序列的相同性為至少75％，至少80％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％。
更優(yōu)選的是，所述TGF-β家族的成員是BMP亞家族的成員。
業(yè)已證實了所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)亞家族的成員特別參與了骨組織的誘導和重塑。BMPs最初是從骨基質(zhì)中分離的。所述蛋白特征在于它們的在異位誘導新骨形成的能力。各種體內(nèi)研究證實了通過BMPs能促進前體細胞的骨發(fā)生和軟骨發(fā)生，并提出在骨骼發(fā)育期間每一種BMP分子具有不同作用的可能性。有關(guān)BMPs的分子和生物學特性的更多的細節(jié)，披露于以下文獻中Wozney JM，Rosen V(1998)在骨形成和修復(fù)中骨形態(tài)發(fā)生蛋白和骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因家族，ClinOrthop 34626-27，Schmitt J，Hwang K，Winn，SR，Hollinger J(1999)骨形態(tài)發(fā)生蛋白對基礎(chǔ)生物學和臨床相關(guān)性的更新，JOrthop Res 17269-278和Lind M(1996)生長因子可能的新的臨床工具。綜述。Acta Orthop Scand 67407-17。
最優(yōu)選的是，所述BMP家族的成員是BMP2或BMP7。BMP2的前原形式的氨基酸序列保藏在Swiss-Prot，保藏號為P12643，并且如下文所示。1-23號氨基酸相當于信號序列，24-282號氨基酸相當于前肽，而283-396號氨基酸相當于成熟蛋白。BMP7的前原形式的氨基酸序列保藏在Swiss-Prot，保藏號為P18075，或者如SEQ ID No2所示。1-29號氨基酸相當于前導序列，30-292號氨基酸相當于原形，而293-431號氨基酸相當于成熟蛋白。優(yōu)選的是，BMP-2或BMP7分別表示所述前原形式，所述原形，或表示成熟的BMP-2或BMP7肽。
另外，還包括具有基本上相同的生物學活性，優(yōu)選骨誘導特性的所述蛋白的片段。下面提供了有關(guān)BMP2和BMP7的更多的序列信息。BMP2的原形的氨基酸序列被命名為proBMP-2，并且特別可以從SwissProt中檢索到，編號為Pro BMP2_HUMAN；P12643，并且還在ID NO4中示出。在SEQ ID NO5中示出了rhproBMP2的氨基酸序列，包括位于N-末端的額外的His-標記。rhproBMP-2是人pro-BMP-2的重組形式。
在SEQ ID NO4中示出的rhproBMP-2和在SEQ ID NO5中示出的包括N-末端His-標記的rhproBMP-2，都特別可應(yīng)用于所附實施例中。不過，所述實施例并不分別局限于SEQ ID NO4或5。本文下面所提供的實施例還可以用本文所披露的任何其它氨基酸序列實施。
另外，更優(yōu)選的是，所述TGF-β家族的成員是GDF亞家族的成員。
業(yè)已證實了，生長和分化因子(GDF)特別參與了骨組織的誘導和重塑。生長分化因子5(GDF-5)，又被稱為軟骨衍生的形態(tài)發(fā)生蛋白1(CDMP-1)，是BMP家族的亞類的成員，該家族還包括其它相關(guān)的蛋白，優(yōu)選GDF-6和GDF-7。所述蛋白的成熟的形式是27kDa的同源二聚體。各種體內(nèi)和體外研究證實了在哺乳動物骨骼的不同的形態(tài)學特征形成期間GDF-5的作用。GDF-5的突變導致了骨骼異常，包括肢體長骨長度的減少，在肢體和胸骨中異常的關(guān)節(jié)發(fā)育(Storm & Kingsley(1999)，Development Biology，209，11-27)。小鼠和人之間的氨基酸序列是高度保守的。
所述GDF亞家族的成員優(yōu)選是GDF-5。在最優(yōu)選的實施方案中，所述GDF-5是重組人GDF-5(rhGDF-5)，正如在下面更詳細地披露的。
GDF-5的前原形式的氨基酸序列保藏在Swiss-Prot，保藏號為P43 0 26，或者如SEQ ID No3所示。1-27號氨基酸相當于前導序列，28-381號氨基酸相當于原形，而382-501號氨基酸相當于成熟蛋白。GDF-5優(yōu)選表示所述前原形式、所述原形、或表示成熟的GDF-5肽。
另外，還涵蓋具有大體上相同的生物學活性，優(yōu)選骨誘導特性的GDF-5片段。在更優(yōu)選的實施方案中，所述片段包括SEQ ID No3所示出的序列的383-501號氨基酸。預(yù)計，上述TGF-β家族成員的任何組合，都可能用于在本發(fā)明方法中所使用的溶液中。以下表格示出了BMP-2，BMP-7和GDF-5的前原形式的氨基酸序列人BMP-2的前原形式(Swiss-Prot Prim.保藏號P12643)；SEQID No.1關(guān)鍵詞 從 至 長度信號 1 23 23PROPEP 24 282259hBMP228339611410 20 30 40 50 60| | | | | |MVAGTRCLLA LLLPQVLLGG AAGLVPELGR RKFAAASSGR PSSQPSDEVL SEFELRLLSM70 80 90100110120
| | | | | |FGLKQRPTPS RDAVVPPYML DLYRRHSGQP GSPAPDHRLE RAASRANTVR SFHHEESLEE130140150160170180| | | | | |LPETSGKTTR RFFFNLSSIP TEEFITSAEL QVFREQMQDA LGNNSSFHHR INIYEIIKPA190200210220230240| | | | | |TANSKFPVTR LLDTRLVNQN ASRWESFDVT PAVMRWTAQG HANHGFVVEV AHLEEKQGVS250260270280290300| | | | | |KRHVRISRSL HQDEHSWSQI RPLLVTFGHD GKGHPLHKRE KRQAKHKQRK RLKSSCKRHP310320330340350360| | | | | |LYVDFSDVGW NDWIVAPPGY HAFYCHGECP FPLADHLNST NHAIVQTLVN SVNSKIPKAC370380390| | |CVPTELSAIS MLYLDENEKV VLKNYQDMVV EGCGCR參考文獻[1]核酸序列。
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人BMP-7的前原形式(Swiss-Prot Prim.保藏號P18075)；SEQ ID No.2關(guān)鍵詞 從 至 長度信號 1 29 29PROPEP 30 292 263hBMP-7 293431 13910 20 30 40 50 60| | | | | |MHVRSLRAAA PHSFVALWAP LFLLRSALAD FSLDNEVHSS FIHRRLRSQE RREMQREILS70 80 90100110120| | | | | |ILGLPHRPRP HLQGKHNSAP MFMLDLYNAM AVEEGGGPGG QGFSYPYKAV FSTQGPPLAS130140150160170180| | | | | |LQDSHFLTDA DMVMSFVNLV EHDKEFFHPR YHHREFRFDL SKIPEGEAVT AAEFRIYKDY190200210220230240| | | | | |IRERFDNETF RISVYQVLQE HLGRESDLFL LDSRTLWASE EGWLVFDITA TSNHWVVNPR250260270280290300| | | | | |HNLGLQLSVE TLDGQSINPK LAGLIGRHGP QNKQPFMVAF FKATEVHFRS IRSTGSKQRS310320330340350360| | | | | |QNRSKTPKNQ EALRMANVAE NSSSDQRQAC KKHELYVSFR DLGWQDWIIA PEGYAAYYCE370380390400410420| | | | | |GECAFPLNSY MNATNHAIVQ TLVHFINPET VPKPCCAPTQ LNAISVLYFD DSSNVILKKY430|RNMVVRACGC H
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人GDF-5的前原形式(Swiss-Prot Prim.保藏號P 43026)；SEQ ID No.3
關(guān)鍵詞從至 長度信號 1 27 27PROPEP28381354hGDF-5382 50112010 20 30 40 50 60| | | | | |MRLPKLLTFL LWYLAWLDLE FICTVLGAPD LGQRPQGSRP GLAKAEAKER PPLARNVFRP70 80 90100110120| | | | | |GGHSYGGGAT NANARAKGGT GQTGGLTQPK KDEPKKLPPR PGGPEPKPGH PPQTRQATAR130140150160170180| | | | | |TVTPKGQLPG GKAPPKAGSV PSSFLLKKAR EPGPPREPKE PFRPPPITPH EYMLSLYRTL190200210220230240| | | | | |SDADRKGGNS SVKLEAGLAN TITSFIDKGQ DDRGPVVRKQ RYVFDISALE KDGLLGAELR250260270280290300| | | | | |ILRKKPSDTA KPAVPRSRRA AQLKLSSCPS GRQPAALLDV RSVPGLDGSG WEVFDIWKLF310320330340350360| | | | | |RNFKNSAQLC LELEAWERGR TVDLRGLGFD RAARQVHEKA LFLVFGRTKK RDLFFNEIKA370380390400410420| | | | | |RSGQDDKTVY EYLFSQRRKR RAPLATRQGK RPSKNLKARC SRKALHVNFK DMGWDDWIIA430440450460470480| | | | | |PLEYEAFHCE GLCEFPLRSH LEPTNHAVIQ TLMNSMDPES TPPTCCVPTR LSPISILFID490500| |SANNVVYKQY EDMVVESCGC R參考文獻[1]核酸序列組織＝胎盤；
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可能的情況是，在從Swiss-Prot中提取上文所示出的公開序列時，可能包含有一個或多個錯誤，例如，由于測序期間的不精確性所導致的錯誤。這種測序錯誤的后果是，可能導致一個或多個沉默突變或改變一個或多個密碼子，因此，它編碼一種或多種以前所公開的其它氨基酸。不過，由于Swiss-Prot在業(yè)已證實出現(xiàn)了測序錯誤的情況下，要進行數(shù)據(jù)更新，因此能夠以所述參考編號或上述多肽的相應(yīng)的名稱從Swiss-Prot中獲取最新的序列。
例如，SEQ ID NO3可能包括人GDF-5的前原形式的原形的以下氨基酸取代38號位置上的氨基酸絲氨酸(S)被氨基酸蘇氨酸(T)所取代，SEQ ID NO3的254號位置上的氨基酸纈氨酸(V)被氨基酸丙氨酸(A)所取代，SEQ ID NO3的256號位置上的氨基酸精氨酸(R)被氨基酸甘氨酸(G)所取代，SEQ ID NO3的257號位置上的氨基酸絲氨酸(S)被氨基酸甘氨酸(G)所取代，SEQ ID NO3的258號位置上的氨基酸精氨酸(R)被氨基酸甘氨酸(G)所取代，276號位置上的氨基酸丙氨酸(A)被氨基酸絲氨酸(S)所取代，SEQ ID NO3的321號位置上的氨基酸蘇氨酸(T)被氨基酸丙氨酸(A)所取代。在SEQ ID NO6中示出了所得到的氨基酸序列，在該序列上發(fā)生了上面所提到的氨基酸取代?？梢岳斫獾氖牵赟EQ ID NO3中所示出的GDF-5的前原形式的氨基酸序列的原形上的一個或多個氨基酸取代，不會改變，更改或破壞GDF-5的生理學功能。在本申請的范圍內(nèi)，設(shè)想SEQ ID NO6也可以與本發(fā)明的裝置和方法組合使用。
在本發(fā)明方法的另一種優(yōu)選實施方案中，所述裝置沒有有毒物質(zhì)的。
術(shù)語″有毒物質(zhì)″，優(yōu)選包括在本領(lǐng)域公開方法中所使用的有毒有機溶劑和添加劑，如乙腈或chromosulfuric acid。在將含有所述物質(zhì)的裝置植入之后，所述物質(zhì)會導致炎癥和其它反應(yīng)。由于所述不理想的副作用，所述裝置在治療上不太被接受的，這種副作用不能夠通過本領(lǐng)域所公知的包被方法和某些表面處理方法避免。另外，開發(fā)治療蛋白的國際標準，要求在生產(chǎn)過程中應(yīng)當避免使用有害和有毒物質(zhì)(有關(guān)細節(jié)可以參見International Conference on Harmonisation(ICH)，Topic Q3C；www.emea.eu.int/)。不過，本發(fā)明的裝置或可以通過本發(fā)明方法獲得的裝置，有利地不含有所述有毒物質(zhì)，因此在治療上是完全可以接受的，并且滿足了所述管理當局的要求。
在本發(fā)明方法的另一種優(yōu)選實施方案中，所述溶液允許所述蛋白溶解足夠的時間，以便對所述載體的金屬表面進行均勻的包被。
術(shù)語″允許所述蛋白溶解足夠的時間，以便對所述載體的金屬表面進行均勻的包被的溶液″，表示這樣一種溶液，其中，可以有效地溶解所述骨誘導蛋白。均勻的包被表示所述載體的表面在用所述溶液處理之后被所述骨誘導蛋白完整地包被。均勻的包被以在所述載體表面的每一個和所有區(qū)域存在大體上相同量的蛋白質(zhì)為特征。均勻的包被是所述骨誘導蛋白向植入位點周圍的組織中有效釋放和均勻分布和活性的先決條件。另外，可以理解的是，所述骨誘導蛋白是不會聚集的，并且不會由于沉淀或微沉淀而部分或全部失活，相反，通過均勻的包被獲得了具有生物學活性的，非聚集的蛋白的附著。所述均勻的包被可以通過本發(fā)明的方法實現(xiàn)，并且在所附實施例中披露。另外，在所附實施例中披露了用于控制均勻的包被，固定化蛋白的定量和表征的工具和方法。本領(lǐng)域技術(shù)可以根據(jù)所述骨誘導蛋白的溶解度配制所述溶液，所述溶解度取決于pH，離子強度，以及在所述載體與該溶液接觸之后載體對所述參數(shù)的影響。根據(jù)本發(fā)明，業(yè)已發(fā)現(xiàn)了適用于本發(fā)明方法的溶液僅包括不影響所述骨誘導蛋白的氧化狀態(tài)的成分。例如，常被用作蛋白制劑的賦形劑(穩(wěn)定劑和填充劑)的糖類，如蔗糖或海藻糖(詳情參見實施例9)，不能被用于包被方法，因為它們會減弱所述蛋白與金屬表面的結(jié)合。在下面的附錄的實施例中披露了應(yīng)當避免使用的其它成分。
根據(jù)本發(fā)明的方法，所述溶液允許所述骨誘導蛋白的濃度超過0.5mg/ml，優(yōu)選超過2mg/ml，最優(yōu)選超過3mg/ml。
同樣優(yōu)選的是，所述溶液具有酸性pH的方法。
術(shù)語″弱酸″表示含有至少一個離子型結(jié)合的氫原子的有機或無機化合物。弱酸是本領(lǐng)域所熟知的，并且披露于標準教科書中，如Rmpp，lexicon of chemistry。
所述弱酸優(yōu)選具有低離解度，并且它的pK值為3-7，優(yōu)選4-6。
最優(yōu)選的是，所述酸性溶液包括HCl，乙酸，檸檬酸和/或琥珀酸。
在本發(fā)明方法的另一種最優(yōu)選的實施方案中，所述酸的濃度低于100mmol/l，優(yōu)選低于50mmol/l，更優(yōu)選低于25mmol/l，最優(yōu)選低于15mmol/l。
在本發(fā)明方法的另一種最優(yōu)選的實施方案中，所述溶液是用惰性氣體飽和的，最優(yōu)選用氮，氬或氦飽和的。在它的最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法是在受控制的氣體，濕度，溫度和特定的氣體交換速度的腔室中實施的。
本發(fā)明還涉及可以通過本發(fā)明方法獲得的裝置。
上面結(jié)合本發(fā)明的方法對術(shù)語所作的定義和解釋經(jīng)過必要修正適用于下文所披露的裝置。
所述裝置以上述方法產(chǎn)生的特征為特征。具體地講，所述裝置包括被均勻地涂敷在該裝置的金屬或合金多孔或無孔表面上的骨誘導蛋白，由此，與沒有涂敷到所述金屬或合金表面上的骨誘導蛋白相比，所述骨誘導蛋白的氧化狀態(tài)沒有明顯增強。在附錄的實施例中詳細披露了優(yōu)選裝置。
本發(fā)明涉及包括本發(fā)明裝置或可以通過本發(fā)明方法獲得的裝置的藥用組合物。上面結(jié)合本發(fā)明的方法和裝置對術(shù)語所作的定義和解釋，經(jīng)過必要修正適用于這里所披露的藥用組合物。
本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明裝置或可以通過本發(fā)明方法獲得的裝置用于制備用來加速骨整合和新骨形成的藥用組合物的用途。上面所提到的術(shù)語的定義，經(jīng)過必要修正適用于本發(fā)明的上述用途以及下面所披露的用途。
術(shù)語″骨整合和新骨形成″，表示骨骼具有在所述植入物周圍形成新骨，并且與所述植入物整合的能力。
整合表示骨細胞與植入物表面的附著，導致了在功能性負荷下，所述假體再造的固定的和永久性的錨定，而沒有疼痛，炎癥或松脫。
更優(yōu)選的是，所述加速的骨整合和新骨形成的實施，是為了治療創(chuàng)傷，惡性或人工缺陷，用于治療牙齒缺陷或用于治療髖，肘，脊骨，膝，手指或踝關(guān)節(jié)。上面所提到的疾病和失調(diào)的癥狀詳細披露于標準醫(yī)學教科書中，如Pschyrembel and Stedman。
同樣屬于本發(fā)明范圍的是用于治療在本發(fā)明用途中所提到的一種或多種疾病的方法，其中，所述方法至少包括以下步驟給對象使用可藥用形式的本發(fā)明的裝置或可以通過本發(fā)明方法獲得的裝置。所述對象優(yōu)選是人類。
最后，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明裝置或可以通過本發(fā)明方法獲得的裝置的試劑盒。
上面針對本發(fā)明的所述方法，裝置，藥用組合物和用途對術(shù)語所作的定義和解釋，經(jīng)過必要修改適用于本文所披露的試劑盒。
根據(jù)相應(yīng)的成分，可以將本發(fā)明試劑盒的各個部分獨立地包裝在小瓶或其它合適工具中或在合適的容器或多容器單元中組合包裝。所述試劑盒的生產(chǎn)優(yōu)選按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的標準方法進行。所述裝置優(yōu)選是在不含氧氣的氣體中包裝在容器或小瓶中的，如惰性氣體氛圍，優(yōu)選由氮氣組成的氛圍。
附圖表示

圖1在用10mmol/L HCl提取之后氧化rhGDF-5的百分比。
圖2用存在于10mM HCl中的rhGDF-5包被的金屬片材的熒光染色。
圖3用存在于PBS中的rhGDF-5包被的金屬片材的熒光染色。
圖4用10mmol/l HCl包被的金屬片材的熒光染色。
圖5空白金屬片材的熒光染色。
圖6rhGDF-5從預(yù)先處理過的鈦表面上的釋放。通過ELISA確定的結(jié)果的總結(jié)。
圖7用含和不含蔗糖的rhGDF-5溶液對鈦表面進行包被。
圖8在室溫下從預(yù)處理過的片材中提取后氧化rhGDF-5的百分比。
圖9在4℃下從預(yù)處理過的片材中提取后氧化rhGDF-5的百分比。
圖10與所述包被溶液相比，在包被/提取之后修飾的rhproBMP-2的增加。
現(xiàn)在將結(jié)合下面的生物學實施例對本發(fā)明進行說明，這些實施例僅僅是說明性的，而不被構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限定。
實施例1通過RP-HPLC方法對rhGDF-5進行定量通過反向HPLC分析，測定rhGDF-5的量。將樣品加樣到業(yè)已用0.1％甲酸，21％乙腈平衡的Poros C8-18-柱(R2/10，21×30mm)上。在洗滌所述柱之后，用0.1％甲酸，和21-84％梯度的乙腈進行洗脫(流速0.4ml/min)。通過在220nm波長下測定吸光度觀察所述洗脫。通過洗脫峰和使用剛剛制作的標準曲線進行定量。
實施例2結(jié)合蛋白的提取和定量通過首先在室溫下在PBS中孵育所述包被物體1小時，提取所述蛋白。然后將所述包被物體放在10mmol/l HCl中，在室溫下孵育3小時。在將所述PBS樣品調(diào)整到pH2之后，通過在實施例1中所披露的RP-HPLC分析所述含有提取的骨生長因子的PBS和HCl溶液。
實施例3在含有提取蛋白的溶液中定量可溶性聚集物通過大小排阻HPLC，測定含有提取蛋白的溶液中可溶性聚集物的量。所用柱(TSK 3000)是用50mmol/l乙酸，50mmol/l磷酸，NaOH，pH3.0平衡的。
通過在220nm波長下進行UV檢測觀察洗脫液。定量是通過聚集物峰面積與總峰面積的比例進行的。
實施例4確定所述提取蛋白的化學修飾通過RP-HPLC測定在含有提取蛋白的溶液中骨生長因子的化學修飾即氧化的量。將所述樣品加樣到Vydak C8-18柱(2×250mm)上，該柱業(yè)已用0.15％TFA，20％乙腈平衡過。在洗滌所述柱之后，骨生長因子的洗脫用0.1％TFA，和階式梯度的20％-84％乙腈進行的(流速0.3ml/min)。通過測定220nm波長下的吸光度，觀察所述洗脫液。通過修飾形式的物質(zhì)的峰面積與總峰面積的比例進行定量。
實施例5用骨生長因子包被Ti6Al4V和釋放在用鈦片材作為表面進行包被-釋放循環(huán)之后，rhGDF-5可能氧化到顯著程度。在這里我們披露了用于包被的避免在包被過程中發(fā)生蛋白氧化作用的方法和裝置。
用于用骨生長因子對鈦或鈦合金進行包被的裝置所述包被過程是在惰性氣體環(huán)境中進行的，以便排除氧。為了保持這種條件，要使用腔室。所述腔室包括氣體密封性的空間，具有連續(xù)的惰性氣體流，例如氮氣。在所述腔室內(nèi)部，保持略高一些的壓力。通過不透氣的閉鎖，將所述包被過程所需要的材料轉(zhuǎn)移到所述腔室中。所述腔室可以執(zhí)行手動的和自動的包被過程。為了將所述包被過程明確化和標準化，監(jiān)測并且調(diào)整所述腔室的相對濕度。
包被清潔所述鈦片材，用軟化水洗滌，并且干燥。用60μg的rhGDF-5對所述鈦片材進行包被。將每一個片材平放在培養(yǎng)皿中，并且用rhGDF-5溶液對所述金屬片材的一側(cè)進行包被。包被是在上述腔室中，在氮氣氣體環(huán)境下，并且在0-4℃下進行的。在包被之后，在相應(yīng)的條件下，在真空中使所述片材干燥30分鐘。
提取首先在PBS中孵育rhGDF-5，以便模擬接近生理學條件。為了保持樣品幾乎不含氧氣，對于相應(yīng)的樣品來說，用氮氣氣體飽和所述PBS溶液。
在PBS孵育之后，將所述片材放在10mmol/l HCl中在相應(yīng)的溫度下孵育3小時。通過RP-HPLC對所述提取溶液中的rhGDF-5進行定量(參見實施例1)。還通過RP-HPLC測定氧化rh-GDF-5的量(參見為了能夠比較按上述方法包被和提取的樣品，在室溫下和在氧氣氣氛中進行相同的方法。
表20-在200％溶液添加率下在NaCl溶液中的氣流成網(wǎng)網(wǎng)幅代碼的MDWT
在圖2中，通過熒光顯微鏡檢法可以清楚確定用rhGDF-5包被的區(qū)域。表示與所述蛋白結(jié)合的熒光標記。相反，圖3證實了rhGDF-5的溶劑的重要性，因為含有PBS的包被溶液導致所述蛋白的不均勻分布和蛋白斑點。
為了排除假象，在圖4中示出了用10mmol/l HCl包被的片材。10mmol/l HCl是溶液中的rhGDF-5的溶劑。
為了排除溶劑的任何影響，我們還制備了沒有用rhGDF-5或10mmol/l HCl包被的，但是同樣在熒光標記Alexa FluorTM488中孵育的空白片材(圖5)。
圖片清楚地表明，只有rhGDF-5被所述熒光標記染色。另外，當所使用的溶劑是10mmol/l HCl時，所述表面上的蛋白是均勻的。
實施例7骨生長因子從預(yù)處理過的鈦表面上的長期體外釋放我們開發(fā)了一種用于將骨生長因子涂敷在鈦表面上的方法。在進行標準化提取之后，我們能夠分析所述蛋白的聚集(實施例3)，氧化骨生長因子的量(實施例4)，并且能夠?qū)λ鎏崛〉鞍走M行定量(實施例1)。在本文所披露的實驗中，我們通過在細胞培養(yǎng)基中孵育包被的鈦片材30天，確定了骨生長因子的釋放動力學。為了模擬生理學條件和代謝活性，我們每48小時更換培養(yǎng)基，并且通過ELISA對釋放的蛋白量進行定量。
包被按實施例5所述方法對樣品進行包被。
30天的釋放在4℃下，在6ml釋放培養(yǎng)基中孵育所述片材30天，所述培養(yǎng)基包括89％αMEM，1％青霉素，鏈霉素，10％ FCS。樣品在混合器中不停地滾動。每孵育48小時就采集上清液，并且在-70℃下冷凍保存。將6ml體積的新培養(yǎng)基添加到所述釋放樣品上。
通過骨生長因子ELISA對所述樣品中的釋放的蛋白進行定量。
用抗rhGDF-5的單克隆抗體對96孔平板的孔進行包被。用含有0.05％Tween 20的PBS洗滌所述平板，并且用SuperBloc溶液(Pierce，cat-no.37515)封閉，然后添加含有rhGDF-5的樣品，并且在室溫下孵育所述平板60分鐘。在洗滌所述樣品之后(參見上文)，添加抗rhGDF-5的第二種生物素化的抗體，并且在室溫下孵育所述樣品60分鐘。在洗滌步驟之后，添加鏈霉抗生物素蛋白過氧化物酶復(fù)合物，并且在室溫下孵育所述樣品60分鐘。然后，用含有0.05％Tween20的PBS洗滌所述孔，并且用BM Blue-POD底物(Roche Diagnostics，Cat-No.1 484 28)對結(jié)合的過氧化物酶的量進行定量。檢測波長為450nm，參考波長為630nm。利用rhGDF-5標準曲線計算rhGDF-5的量。
在表2和圖6中歸納了通過ELISA測定的骨生長因子釋放的結(jié)果。通過ELISA測定的在30天之后釋放蛋白的量為100.4±0.8。
表2
實施例8用rhBMP-2對鈦或鈦合金進行的包被和提取在本實施例中，我們研究了在包被-提取過程中rhBMP-2的表現(xiàn)rhBMP2與rhGDF-5類似，是TGF-β蛋白家族的另一個成員。
包被將所述片材平放在培養(yǎng)皿中，并且用10μl的6.0mg/ml骨生長因子或rhBMP2溶液對所述片材的一側(cè)進行包被。所有片材都在真空條件下干燥30分鐘。
提取所有片材都是在室溫下用PBS提取1小時。然后，將用骨生長因子和rhBMP2包被的片材放在10mmol/l HCl中孵育3小時。
在下面的表3中歸納了上述實驗的結(jié)果。
表3
在用PBS孵育期間，沒有rhBMP-2被提取。在PBS中，有8.8％的rhGDF-5被提取。
以上結(jié)果表明，來自TGFβ蛋白家族的蛋白結(jié)合在金屬表面上，并且在PBS中孵育之后，能夠(幾乎)完全被10mmol/l HCl提取。
實施例9在存在蔗糖的條件下用骨生長因子對鈦或鈦合金進行包被在本實施例中，我們披露了用含有10％蔗糖的rhGDF-5溶液對鈦表面進行包被。作為對照，我們用存在于10mmol/l HCl中的骨生長因子對鈦表面進行了包被。
用軟化水洗滌所述鈦片材，干燥，并且分別用存在于10mmol/lHCl中的40μg骨生長因子或存在于10％蔗糖，10mmol/l HAc和5mmol/l HCl中的40μg骨生長因子進行包被。
然后，在室溫下用PBS洗滌所述鈦材料1小時。
然后，在室溫下通過在100mmol/l HCl中孵育3小時提取所述蛋白。所有溶液的蛋白含量都是通過RP-HPLC定量測定的。在定量之前，將PBS溶液調(diào)整到pH2，以便提高骨生長因子的溶解度。
在本文所披露的實驗中，制備了兩種不同的包被金屬片材用含或不含10％蔗糖的骨生長因子溶液包被的鈦片材。
在表4中歸納了包被和提取方法的結(jié)果表4
在用含或不含10％蔗糖的骨生長因子溶液對鈦片材進行包被時存在顯著差別。從含有蔗糖的樣品中回收到了32.5％的蛋白，從不含蔗糖的樣品中回收到了70.3％的骨生長因子(參見圖7)。
在上述實驗中，我們希望評估蔗糖在包被溶液中的存在對骨生長因子在金屬表面上的結(jié)合的影響。結(jié)果表明，與在不存在蔗糖的條件下進行包被后骨生長因子的回收率相比，總回收率顯著降低。
實施例10Ti6Al4V中骨生長因子的包被和釋放-還原劑的影響A)還原劑在所述包被溶液中的影響為了避免在包被和提取循環(huán)期間所述蛋白的氧化，我們在所述包被溶液中添加了還原劑我們向所述骨生長因子包被溶液中添加了10mmol/l的以下化合物或它們的組合10μl樣品1(空白)存在于10mmol/l HCl中的5.04mg/ml骨生長因子。
12μl樣品210mmol/l EDTA+3.94mg/ml骨生長因子10μl樣品310mmol/l Met+4.54mg/ml骨生長因子10μl樣品410mmol/l Na2SO3+4.54mg/ml骨生長因子11μl樣品510mmol/l Met+10mmol/l EDTA+3.84mg/ml骨生長因子11μl樣品610mmol/l EDTA+10mmol/l Na2SO3+3.84mg/ml骨生長因子；并且按實施例5所述方法進行包被。
提取首先，在室溫下用PBS提取骨生長因子1小時(在PBS中孵育表示模擬體內(nèi)的生理學情形)。然后，用10mmol/l HCl提取所述片材3小時。按實施例1所述方法，通過RP-HPLC對每一個樣品的提取溶液中的骨生長因子進行定量。按實施例4所述方法測定氧化蛋白的量。在表5中歸納了上述實驗的結(jié)果表5
*)在HCl提取之后，通過HPLC定量沒有檢測到蛋白所有樣品的回收率在50％和82％之間。所有樣品中用PBS提取到蛋白，只有含有Na2SO3的樣品除外。在用PBS提取的樣品和用HCl提取的樣品中，測定氧化蛋白的量。氧化蛋白的量為8％至23％。
總之，在包被溶液中使用還原劑的方法不是用于避免骨生長因子氧化的優(yōu)選方法?？偦厥章瘦^低，或者所述蛋白已經(jīng)用PBS進行了較大程度的提取，或者氧化骨生長因子的量明顯較高。因此，需要其它方法來避免在包被和提取循環(huán)中骨生長因子的氧化作用。
B)在開始包被處理之前，用還原劑浸泡所述表面我們披露了還原劑在所述包被溶液中的影響。在這里，我們比較了在含有相應(yīng)的還原劑的溶液中孵育預(yù)處理過的金屬片材24小時之后，不同還原劑的作用。然后，包被和提取過程在兩種不同溫度下進行。
所有樣品都是在具有以下還原劑的10mmol/l溶液之一中孵育的硫脲，抗壞血酸，亞硫酸鈉，半胱氨酸，甲硫氨酸，巰基乙醇。
在孵育24小時之后，用軟化水洗滌所述片材，并且在室溫下，在真空條件下干燥15分鐘。
將所有片材平放在培養(yǎng)皿中，并且用10μl的6.95mg/ml rhGDF-5溶液對該金屬片材的一側(cè)進行包被。半數(shù)的片材在4℃下，在真空條件下干燥，另外一半片材在室溫下，在真空條件下干燥。
包被和提取過程是在4℃和室溫下進行的。首先，在室溫下用PBS提取rhGDF-5 1小時。然后在10mmol/l HCl中孵育所述片材3小時。通過RP-HPLC對每一種樣品的提取溶液中的rhGDF-5進行定量(實施例1)。然后，通過RP-HPLC測定氧化形式的量(實施例4)。
在表6中樣品是按照它們的預(yù)處理模式排列的。
表6
所有樣品中氧化rhGDF-5的量為9.0％至12.6％，而被用作原材料的蛋白溶液的氧化物質(zhì)的含量為5％。
在4℃下孵育的樣品中，氧化蛋白的量少于在室溫下處理的相應(yīng)樣品中的氧化蛋白的量。根據(jù)以上結(jié)果可以得出這樣的結(jié)論所使用的賦形劑沒有一種能夠顯著避免氧化作用。
在圖8和9中示出了氧化蛋白的量。
本發(fā)所披露的實驗的主要目的是，用不同的還原劑孵育預(yù)處理過的片材。我們的結(jié)論是，在含有還原劑的溶液中孵育金屬片材24小時，不是可以避免蛋白氧化的優(yōu)選方法。
實施例11通過RP-HPLC對rhproBMP-2和rhBMP-2進行定量通過反相HPLC分析測定rhproBMP-2/rhBMP-2的量。將所述樣品加樣到業(yè)已用0.045％TFA平衡過的PorosC4-柱(20×2mm)上。在洗滌所述柱之后，用0.025％TFA，84％乙腈，和21-84％梯度濃度的乙腈進行洗脫(流速0.4ml/分鐘)。通過在220nm波長下測定吸光度，觀察洗脫液。定量是通過所述峰，并且使用標準曲線完成的。
實施例12測定提取的rhproBMP-2的化學修飾通過RP-HPLC測定含量提取蛋白的溶液中修飾形式的骨生長因子的量。將樣品加樣到業(yè)已用0.1％TFA平衡過的YMC C4柱(4.6×250mm)上，在洗滌所述柱之后，用100％乙腈，0.1％TFA，以及階式梯度的25％-100％乙腈的混合物進行洗脫(流速0.8ml/分鐘)。通過在220nm波長下測定吸收值，觀察洗脫液。根據(jù)相應(yīng)的峰面積和總峰面積的比例，計算修飾形式的相對含量。
實施例13測定在提取之后修飾rhproBMP-2的量在本實施例中，研究了在優(yōu)化條件下進行包被-提取處理期間rhproBMP-2的表現(xiàn)rhproBMP2是重組形式的pro-BMP-2。在SEQ IDNO4中示出了所述rhproBMP2的氨基酸序列。在提取之后，測定修飾形式的量。
包被按上文實施例5所述方法，用rhproBMP-2對鈦片材進行包被。一組片材是在標準條件下進行包被的(空氣，室溫)(第1組)；另一組片材是在氮氣氣氛下進行包被的(第2組)。
將每一個片材平放在培養(yǎng)皿中，并且分別用10μl的1,9mg/mlrhproBMP-2溶液對所述金屬片材的一側(cè)進行包被。
提取提取是按照在上文的實施例5中所披露的方法進行的。修飾的rhproBMP-2的量同樣是通過RP-HPLC測定的；參見上文實施例12。
提取蛋白的表征，是通過修飾蛋白的定量進行的。因此，將修飾rhproBMP-2的量的變化與rhproBMP-2本體溶液進行了比較。在表7中示出了數(shù)據(jù)，表示在提取之后化學修飾的rhproBMP-2的量
表7
在本發(fā)明實驗中測試的參數(shù)對在從鈦片材上提取之后修飾的rhproBMP-2的量有影響與上面表2中所示出的包被溶液相比，在空氣中包被的樣品表現(xiàn)出的修飾rhproBMP-2的量為4.9％±1.2％。
在室溫和氮氣氣氛下處理的樣品在提取之后表現(xiàn)出修飾的rhproBMP-2增加了1.5％±0.6％。
與蛋白本體溶液相比，在空氣中處理的樣品表現(xiàn)出+4,9％的增加(參見下面的圖10)。圖10表示與所述包被溶液相比，在包被/提取之后，修飾rhproBMP-2的增加。在下面的圖10中，相應(yīng)樣品的誤差棒是不重疊的。因此，可以得出的結(jié)論是，周圍的氣體氣氛對在從所述鈦片材上提取之后rhproBMP-2修飾的量具有顯著影響。
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His Glu Lys Ala Leu Phe Leu Val Phe Gly Arg Thr Lys Lys Arg Asp340 345 350Leu Phe Phe Asn Glu Ile Lys Ala Arg Ser Gly Gln Asp Asp Lys Thr355 360 365Val Tyr Glu Tyr Leu Phe Ser Gln Arg Arg Lys Arg Arg Ala Pro Leu370 375 380Ala Thr Arg Gln Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala Arg Cys385 390 395 400Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp Asp Asp405 410 415Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu Gly Leu420 425 430Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Val435 440 445Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro Pro Thr450 455 460Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe Ile Asp465 470 475 480Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val Val Glu485 490 495Ser Cys Gly Cys Arg500
權(quán)利要求
1.一種用于生產(chǎn)裝置的方法，包括以下步驟(a)提供包括溶解的骨誘導蛋白的溶液；(b)讓步驟(a)的溶液與包括金屬或金屬合金表面的載體接觸；(c)允許所述溶解的蛋白對所述載體的表面進行包被；和(d)對在步驟(c)中獲得的包被的載體進行干燥，其中，步驟(b)-(d)在降低濃度的氧氣條件下進行。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中，步驟(b)-(d)在低于10vol％氧氣的氧氣濃度下進行。
3.如權(quán)利要求1或2的方法，其中，步驟(b)-(d)是在低于25℃的溫度下進行的。
4.如權(quán)利要求1-3中任意一項的方法，其中，所述金屬或金屬合金是鈦或鈦合金。
5.如權(quán)利要求4的方法，其中，所述鈦合金是包含至少50％鈦的鈦合金。
6.如權(quán)利要求4或5的方法，其中，所述鈦合金是Ti-Al-V-合金，Ti-Al-Fe合金，Ti-Al-Nb-合金或Ti-Mo-Zr-Al-合金。
7.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述Ti-Al-V-合金是Ti6Al4V。
8.如權(quán)利要求1-7中任意一項的方法，其中，所述包被是通過將所述金屬表面浸泡在所述蛋白溶液中進行的。
9.如權(quán)利要求1-7中任意一項的方法，其中，所述包被是通過將所述蛋白溶液滴在所述金屬表面上進行的。
10.如權(quán)利要求1-7中任意一項的方法，其中，所述包被是通過將所述蛋白溶液噴灑在所述金屬表面上進行的。
11.如權(quán)利要求1-10中任意一項的方法，其中，所述干燥是通過真空干燥完成的。
12.如權(quán)利要求1-10中任意一項的方法，其中，所述干燥是通過冷凍干燥完成的。
13.如權(quán)利要求1-10中任意一項的方法，其中，所述干燥是通過在室溫下，在惰性氣體流中蒸發(fā)完成的。
14.如權(quán)利要求1-13中任意一項的方法，其中，所述骨誘導蛋白是TGF-β家族的成員。
15.如權(quán)利要求14的方法，其中，所述TGF-β家族的成員是BMP亞家族的成員。
16.如權(quán)利要求15的方法，其中，所述BMP家族的成員是BMP2或BMP7。
17.如權(quán)利要求14的方法，其中，所述TGF-β家族的成員是GDF亞家族的成員。
18.如權(quán)利要求17的方法，其中，所述GDF亞家族的成員是GDF-5。
19.如權(quán)利要求1-18中任意一項的方法，其中，所述裝置不含有毒物質(zhì)。
20.如權(quán)利要求1-19中任意一項的方法，其中，所述容器允許所述蛋白溶解足夠的時間，以便對所述載體的所述金屬表面進行均勻的包被。
21.如權(quán)利要求1-20中任意一項的方法，其中，所述溶液允許所述骨誘導蛋白的濃度超過0.5mg/ml。
22.如權(quán)利要求21的方法，其中，所述溶液具有酸性pH。
23.如權(quán)利要求22的方法，其中，所述酸性溶液包括HCl，乙酸，檸檬酸或琥珀酸。
24.如權(quán)利要求22或23的方法，其中，所述酸的濃度低于或等于100mmol/l。
25.如權(quán)利要求1-24中任意一項的方法，其中，所述溶液是用惰性氣體飽和的。
26.如權(quán)利要求25的方法，其中，所述惰性氣體是氮，氬或氦。
27.如權(quán)利要求1-26中任意一項的方法，該方法是在具有受控制的氣體和濕度的腔室中進行的。
28.可以通過權(quán)利要求1-27中任意一項的方法獲得的裝置。
29.一種藥用組合物，包括可以通過權(quán)利要求1-27中任意一項的方法獲得的裝置。
30.可以通過權(quán)利要求1-27中任意一項的方法獲得的裝置用于制備用來加速骨整合和新骨形成的藥用組合物的用途。
31.如權(quán)利要求30的用途，其中，所述加速的骨整合和新骨形成被用于治療創(chuàng)傷，惡性或人工缺陷。
32.如權(quán)利要求30的用途，其中，所述加速的骨整合和新骨形成被用于治療牙齒缺陷。
33.如權(quán)利要求30的用途，其中，所述加速的骨整合和新骨形成被用于治療髖，肘，脊骨，膝，手指或踝關(guān)節(jié)。
34.一種試劑盒，包括可以通過權(quán)利要求1-27中任意一項的方法獲得的裝置。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)裝置的方法，包括以下步驟(a)提供包括溶解的骨誘導蛋白的溶液，(b)讓上述步驟的溶液與包括金屬或金屬合金表面的載體接觸，(c)允許所述溶解的蛋白對所述載體的表面進行包被，和(d)對在步驟(c)中獲得的包被的載體進行干燥，其中，步驟(b)－(d)是在降低濃度的氧氣條件下進行的。本發(fā)明還涉及可以通過本發(fā)明方法獲得的裝置。另外，本發(fā)明涉及包括所述裝置的藥用組合物，并且涉及所述裝置用于制備用來加速骨整合和新骨形成的藥用組合物的用途。最后，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明裝置的試劑盒。
文檔編號A61K38/18GK1681540SQ03821447
公開日2005年10月12日 申請日期2003年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月10日
發(fā)明者K·赫勒布蘭德, N·比尤坎普, U·科納特 申請人:Scil技術(shù)股份有限公司