專利名稱：通過施加超高靜水壓力的移植用生物體組織的處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種完成從移植用的生物來源組織的供體細(xì)胞的破壞、細(xì)胞的死滅和病毒的失活的技術(shù)。
背景技術(shù)：
通過用戊二醛這樣的固定劑對(duì)生物體組織進(jìn)行化學(xué)處理，或者通過除去生物體組織中的細(xì)胞成分，而制作成的移植用組織片，這被廣泛地應(yīng)用于臨床。例如，在心臟瓣膜置換術(shù)中，異種生物體瓣膜是指用戊二醛固定化豬的心臟瓣膜或牛的心臟瓣膜以降低免疫原性。這種異種生物體瓣膜在抗凝固性方面具有優(yōu)勢(shì)，但如果用于年輕人，只有大約5至10年的耐久性，通常適用于60歲以上的高齡人群。歐美從1985年開始，而日本國內(nèi)也從近幾年開始建立了通過冷凍保存的組織庫，由尸體提供的冷凍保存同種瓣膜正用于臨床。這種同種瓣膜與機(jī)械瓣膜比較具有抗血栓性，與異種生物體瓣膜比較具有耐久性，并且與這二者相比較，在抗感染性方面也具有優(yōu)勢(shì)。然而，提供數(shù)量絕對(duì)不夠是個(gè)大問題。另外，有報(bào)道年輕人在移植后比較早期出現(xiàn)功能不全的病例，提示與免疫反應(yīng)強(qiáng)烈相關(guān)。對(duì)年輕人有效的Ross手術(shù)的特點(diǎn)是，把患者自身的肺動(dòng)脈瓣置換移植到主動(dòng)脈瓣的位置上，再用冷凍保存的同種瓣膜重新構(gòu)建缺損的肺動(dòng)脈瓣，而移植到主動(dòng)脈瓣位置上的自身的肺動(dòng)脈瓣會(huì)隨著患者的成長逐漸增大。與此相比，更不必說機(jī)械瓣膜和異種生物體瓣膜，就連冷凍保存的同種瓣膜也沒有成長性，所以，很多兒科患者都需要重新移植。最近為了解決這些問題，出現(xiàn)了關(guān)于通過除去同種瓣膜中來源于供體的細(xì)胞來減弱抗原性而降低免疫反應(yīng)的關(guān)聯(lián)性，從而提高瓣膜的耐久性和自體化的研究的報(bào)道。美國CryoLife公司發(fā)表了通過名為SynerGraft的藥液處理的細(xì)胞除去方法，報(bào)道了在移植后幾個(gè)月內(nèi)自體細(xì)胞向組織內(nèi)浸潤而自體組織化。另外，德國的Hannover醫(yī)科大學(xué)的Haverich等的小組將作為表面活性劑的TritonX-100或作為蛋白質(zhì)分解酶的胰蛋白酶(tripsin)溶液用于除去細(xì)胞。然而，只通過僅僅利用過去的表面活性劑或者藥液的清洗工序，除去組織片內(nèi)部的細(xì)胞成分以及細(xì)菌或病毒是通過藥液從表面的擴(kuò)散或浸潤進(jìn)行的，所以不夠充分。另外，因?yàn)榫哂羞@樣的限制，在對(duì)大塊的組織片的處理中，很難完全地除去細(xì)胞或細(xì)菌、病毒。另外，用化學(xué)方法處理時(shí)，為了達(dá)到充分的效果，有必要提高處理的程度，這樣就會(huì)產(chǎn)生埋入后的鈣化和處理試劑等的問題。而且，通過在硬膜移植中的BSE和CJD的感染已經(jīng)很明確了，確保移植組織的安全性是極其重要的，可是用現(xiàn)在的化學(xué)藥液處理并不能保證使組織內(nèi)的病毒完全失活。另外，在處理過程中的污染所導(dǎo)致的來自移植用組織的感染事故也經(jīng)常發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了改善如上所述的以往技術(shù)的問題點(diǎn)。即，首先第一是完成用藥液處理不能完成的除去大塊組織內(nèi)部的細(xì)胞成分及細(xì)胞、病毒，第二是進(jìn)行不破壞組織的生物體力學(xué)特性的處理過程，第三是簡便而快速地對(duì)組織進(jìn)行滅菌。
本發(fā)明為了解決上述課題進(jìn)行了潛心研究，結(jié)果是考慮利用高壓條件細(xì)胞膜的破壞、細(xì)菌的死滅、病毒的失活，用作移植用的生物來源組織的處理方法。
本發(fā)明提供一種移植用生物體組織的處理方法，其特征在于，通過在介質(zhì)中對(duì)可移植的動(dòng)物來源組織施加超高靜水壓力后，在保持構(gòu)造及生物體力學(xué)性質(zhì)完整的狀態(tài)下，可以將結(jié)締組織從含有細(xì)胞的其它成分分離。


圖1是表示豬心臟瓣膜組織的組織斷面照片。左圖是用表面活性劑處理24小時(shí)、右圖是用高壓處理10000個(gè)大氣壓10分鐘，用表面活性劑處理時(shí)在組織深部內(nèi)(左下方)細(xì)胞核的殘存。
圖2是表示豬心臟瓣膜組織的組織斷面照片。左圖是用表面活性劑處理24小時(shí)、右圖是用高壓處理10000個(gè)大氣壓10分鐘，二者均沒有出現(xiàn)組織松散等，膠原組織保存良好。
圖3是表示豬心臟瓣膜葉的斷裂強(qiáng)度的處理時(shí)間依賴性。左圖是用表面活性劑處理、右圖是用高壓10000個(gè)大氣壓處理，用細(xì)胞表面活性劑處理時(shí)斷裂強(qiáng)度有隨著處理時(shí)間的延長而增加的傾向，而高壓處理時(shí)沒有出現(xiàn)變化。
圖4是表示豬心臟瓣膜葉的彈性率的處理時(shí)間依賴性。左圖是用表面活性劑處理、右圖是用高壓10000個(gè)大氣壓處理。用表面活性劑處理時(shí)彈性率有隨著處理時(shí)間的延長而增加的傾向，而高壓處理時(shí)沒有出現(xiàn)變化。
圖5是表示預(yù)先感染了常見菌的血管組織經(jīng)高壓處理后培養(yǎng)一天的結(jié)果?？梢娪?000個(gè)大氣壓處理的細(xì)胞的增殖造成的培養(yǎng)基混濁，而用5000個(gè)大氣壓以上處理時(shí)沒有出現(xiàn)。
具體實(shí)施例方式
這里所用的高壓是指從5000個(gè)大氣壓到15000個(gè)大氣壓左右的范圍，在食品領(lǐng)域的研究中，早已顯示出可以滅菌。另外，也有報(bào)道造成細(xì)菌的破壞及病毒的失活?？蓞s沒有綜合考慮這些而提出把它作為移植用處理法的先例。全面考慮這些主要因素，而且，重新設(shè)定各個(gè)主要因素的條件范圍以及新的處理溫度范圍，開發(fā)了新的移植用生物來源組織的處理方法。施加超高靜水壓力可以使用神戶制鋼所制造的Dr.CHEF等裝置。或者也可以使用光工學(xué)制造的超高壓實(shí)驗(yàn)裝置。二者都把處理組織放置在小腔內(nèi)，把液體作為介質(zhì)，可以施加靜水壓力達(dá)到15000個(gè)大氣壓左右。另外，同時(shí)可以通過控制腔外殼的溫度來控制腔內(nèi)的溫度。與食品領(lǐng)域不同，移植用生物體組織的情況為了不改變生物體力學(xué)特性，有必要防止構(gòu)成基質(zhì)的變性，還必須避免施加高壓時(shí)溫度到達(dá)冰點(diǎn)以下和40℃以上。藥液處理的時(shí)候，細(xì)胞核的除去是通過細(xì)胞表明活性劑的從表面的擴(kuò)散及浸潤，所以除去組織深部的細(xì)胞需要長時(shí)間處理。對(duì)于超高壓處理，可以用30分鐘這樣的短時(shí)間完全破壞組織內(nèi)的細(xì)胞并除去。而且，能夠進(jìn)行均質(zhì)的處理直到細(xì)胞片的內(nèi)部。應(yīng)用領(lǐng)域及用途1)移植用動(dòng)物來源軟組織例如來源于腦死亡或心臟死亡的供體的移植用軟組織處理?；蛘邅碓从谪i、牛等異種動(dòng)物的移植用軟組織處理。能夠飛躍提高除去細(xì)胞成分的清洗處理工序的效率。另外，還能達(dá)到大幅度減少具有抗原性的物質(zhì)的目的。
2)移植用動(dòng)物來源硬組織例如與上述一樣，能夠進(jìn)行骨、軟骨、牙齒等硬組織處理。
3)醫(yī)療用生物組織的處理例如能夠用于對(duì)動(dòng)物及植物來源的組織中含有細(xì)胞的組織的細(xì)胞破壞處理。
實(shí)施例1.從食用豬養(yǎng)殖場(chǎng)買進(jìn)豬心臟，在4℃條件下搬運(yùn)。摘出心臟時(shí)的熱缺血時(shí)間為20分鐘以內(nèi)。摘出肺動(dòng)脈瓣、血管，用Hank’s液清洗。把供體細(xì)胞放入神戶制鋼所制造的Dr.CHEF裝置中，在37℃下施加1000～10000個(gè)大氣壓的靜水壓力10～30分鐘。處理后，用PBS液清洗除去。把處理后的標(biāo)本的組織斷面用HE及EVG染色并置光學(xué)顯微鏡下觀察，由此進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。對(duì)于生物體力學(xué)特性，是把高壓處理后的心臟瓣膜葉切割成寬3mm、長約15mm的短冊(cè)狀，用力學(xué)試驗(yàn)機(jī)(tensilon)進(jìn)行拉伸試驗(yàn)，測(cè)定斷裂時(shí)使用的張力。用測(cè)定后的切割片的重量和密度求得瓣膜的厚度，通過應(yīng)力歪斜性來計(jì)算彈性率。對(duì)于組織的感染性，是在對(duì)預(yù)先感染了常見菌的血管組織進(jìn)行高壓處理后，通過培養(yǎng)評(píng)價(jià)細(xì)菌增殖能力而進(jìn)行的。如圖1所示，其結(jié)果是在通過超高壓處理而使脫細(xì)胞化的豬肺動(dòng)脈瓣膜葉組織中，能完全地除去細(xì)胞直到組織深部。與之相比，在用表面活性劑處理后的肺動(dòng)脈瓣膜葉斷面，對(duì)于數(shù)百μm厚的瓣膜葉內(nèi)，在浸潤處理6小時(shí)以后細(xì)胞核不被染色，可瓣膜葉基部的心肌組織內(nèi)細(xì)胞的核即使在處理24小時(shí)以后，距表面1mm以外仍被染色。另外，如圖2所示，即使在超高壓處理以后也可以保存瓣膜葉內(nèi)的膠原纖維和彈性纖維。從生物體力學(xué)特性來看，正常豬的肺動(dòng)脈瓣膜葉的密度約為1.05，與血管壁的值大致相等。以瓣膜葉的血管壁切線方向作為基準(zhǔn)0°，如果研究力學(xué)特性的各向異性，則具有在90°方向上是柔軟且微弱的、而在0°方向上是堅(jiān)硬且強(qiáng)大的特性。如圖3及圖4所示，在用超高壓進(jìn)行脫細(xì)胞化處理時(shí)，對(duì)力學(xué)特性完全沒有影響。與此相對(duì)，通過表面活性劑處理，強(qiáng)度、彈性率因處理時(shí)間而都具有增加的傾向。而且，對(duì)預(yù)先感染了常見菌的血管組織進(jìn)行高壓處理，如圖4所示，在施加5000個(gè)以上的大氣壓的情況下，無細(xì)菌感染發(fā)生。
權(quán)利要求
1.一種移植用生物體組織的處理方法，其特征在于，通過在介質(zhì)中對(duì)可用于移植的動(dòng)物來源組織施加超高靜水壓力，在保持構(gòu)造及生物體力學(xué)特性完整的狀態(tài)下可以將結(jié)締組織從包括細(xì)胞的其它成分分離。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，處理的組織是含有血管、心臟瓣膜、角膜、羊膜及硬膜的軟組織。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，處理的組織是含有骨、軟骨、牙齒的硬組織。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，處理的組織是含有心臟、腎臟、肝臟、胰臟、骨、腦的臟器或其一部分。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，超高靜水壓力為5000-15000個(gè)大氣壓。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，施加超高靜水壓力是在0℃～4℃的溫度下實(shí)施的。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的介質(zhì)是含有水、高張液、低張液、表面活性劑溶液、酶溶液及小比例的有機(jī)溶劑的介質(zhì)。
8.如權(quán)利要求1～7中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，包含在處理后通過清洗從組織中除去被破壞的細(xì)胞的工序。
全文摘要
本發(fā)明提供一種移植用生物體組織的處理方法，是在介質(zhì)中對(duì)可用于移植的動(dòng)物來源組織施加超高靜水壓力。通過該處理，在保持構(gòu)造和生物體力學(xué)性質(zhì)完整的狀態(tài)下可以將結(jié)締組織從含有細(xì)胞的其他成分中分離。
文檔編號(hào)A61L27/36GK1691950SQ0382148
公開日2005年11月2日 申請(qǐng)日期2003年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月10日
發(fā)明者藤里俊哉, 岸田晶夫, 船本誠一, 中谷武嗣, 北村惣一郎 申請(qǐng)人:國立循環(huán)器病中心總長代表的日本國, 尼普洛株式會(huì)社