專利名稱：用于鑒定,評估,預防和治療子宮頸癌的組合物,試劑盒及方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明的領域是子宮頸癌，包括子宮頸癌的診斷、鑒定、處理和治療。
背景技術(shù)：
在美國以及甚至在世界范圍內(nèi)報告的癌癥病例增加的數(shù)量都備受關注。當前對于特定類型癌癥僅有少數(shù)幾種治療方法有效，并且無法提供絕對成功的保證。為使療效最好，這些治療方法不僅需要對惡性腫瘤早期檢測，還需要對惡性腫瘤的嚴重程度進行可靠的評估。
子宮頸癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一，并且在世界范圍內(nèi)仍然是一個重要的公眾健康問題。僅在美國，擴散性子宮頸癌大約占所有婦產(chǎn)科癌癥的19％。在1996年，估計有14,700個新診斷的病例和4900人因該疾病死亡(American Cancer Society，Cancer Facts & Figures1996，Atlanta，Ga.American Cancer Society，1996)。在許多發(fā)展中國家，大規(guī)模普查計劃無法廣泛進行，臨床問題更為嚴重。在世界范圍內(nèi)，新病例數(shù)量估計達471,000，且四年生存率僅有40％(Munoz等.，1989，Epidemiology of CervicalCancer In“HumanPapillomavirus”，New York，Oxford Press，pp 9-39；National Institutesof Health，Consensus Development Conference Statement on CervicalCancer，Apr.1-3，1996)。
鑒于如此，當及早檢測到擴散前病變時，子宮頸癌仍然是一種可以很好預防的癌癥類型。當前，脫落細胞染色的(Papanicolaou-stained)子宮頸涂片(也稱為巴氏涂片或巴氏試驗)的細胞學檢查是用于檢測子宮頸癌的主要方法，并且是迄今為止所發(fā)展的最具性價比的癌癥篩選試驗方法(Greenberg，M.D等.，1995，Clin Obstet Gynecol38(3)600-609)。引人注目的是因為該方法的提出，在美國及世界上許多其它國家中子宮頸癌的發(fā)病率和死亡率減少了超過70％。(EddyD.M.，1990，Ann.Intern.Med.113(3)214-226)。Bethesda系統(tǒng)描繪了巴氏試驗的異常形態(tài)改變，該系統(tǒng)包括ASCUS(未確定意義的非典型鱗狀細胞)、AGUS(未確定意義的非典型腺細胞)、LSIL(低度鱗狀上皮內(nèi)病變)、HSIL(高度鱗狀上皮內(nèi)病變)和鱗狀細胞癌及腺癌(National Cancer Institute WorkshopThe 1988 Bethesda Systemfor reporting cervical/vaginal cytologic diagnosis.JAMA，262(7)931-934)。巴氏試驗的成就最主要歸因于對癌前病變的診斷和治療。
當前，對具有HSIL和更重疾病患者的處理是相對標準化的。大多數(shù)具有上述病變的婦女經(jīng)歷了陰道鏡檢查和合適定向的活組織檢查。如果組織學診斷確診，可進行消融或切除治療如環(huán)形電切術(shù)(LEEP)、冷凍手術(shù)或錐形切除術(shù)。然而，對于不確定或低度細胞學結(jié)果(ASCUS和LSIL)的處理爭論很大。主要是因為基于形態(tài)學檢驗的特性，其不可避免地導致觀測者之間的差異性以及巴氏試驗與后續(xù)的組織學結(jié)果的不一致。據(jù)報道初步巴氏試驗的平均靈敏度大約為58％，重復試驗的準確度僅有約66％(Fahey M.T.，等.，1995，Am.J.Epidemiol.141680-689)。低靈敏度和不佳的再現(xiàn)性使得對ASCUS和LSIL患者的處理復雜化。如果在婦女初步診斷為ASCUS和LSIL后推薦使用“加速重復巴氏試驗”，患者將冒延誤診為潛在的高度病變的危險。但是，如果這些患者普遍地使用陰道鏡檢查，大多數(shù)婦女可結(jié)束治療。在陰道鏡檢查中只有5-10％具有ASCUS的婦女具有高度病變，且超過80％的LSIL將消退為正?；蚶^續(xù)保持它們目前的狀態(tài)(Cox，J.T.，2000，Clinics in Laboratory Medicine.20(2)303-343，Ostor A.G.，1993，Int.J.Gynecol.Pathol.12(2)186-192)。
AGUS代表了較ASCUS或LSIL更大的危險，因為對于該情形細胞學檢查靈敏度低且疾病進展更快(Anderson M.C.，1995，BaillieresClin.Obstet.Gynecol.9105)。發(fā)現(xiàn)9-54％具有AGUS的婦女經(jīng)活組織檢查證實具有子宮頸上皮內(nèi)瘤樣變，0-8％的婦女經(jīng)活組織檢查證實患有原位腺癌(AIS)，以及小于1-9％的婦女患有擴散性癌(Wright，T.C.，等.，2002，JAMA，287(16)2120-2129)。由于此巨大危險，所有具有AGUS的患者應使用陰道鏡檢查(Wright，T.C.，等，2002)。
通過使用測定發(fā)育異常細胞的存在和嚴重程度的客觀標記物可減少子宮頸細胞學檢查的主觀性。因為高危人乳頭狀病毒(HPV)感染與子宮頸癌的發(fā)展密切相關(Walboomers，J.M.，等.，1999，J.Pathol.18912-19)，所以使用類似于Hybrid Capture II(Digene Diagnostics，Silver Spring，MD)或PCR的HPV測試方法似乎提供了一種客觀量度(Wick，M.J.，2000，Clinics in Laboratory Medicine，20(2)271-287)。但是，因為特別是在年輕婦女中大多數(shù)HPV感染和所產(chǎn)生的鱗狀上皮內(nèi)病變可自發(fā)消退，HPV檢測無法特異地鑒定其病變持續(xù)或發(fā)展為擴散性癌的患者(Sasieni，P.D.，2000，J.Am.Med.Womens Assoc.55(4)216-219，Sasieni，P.D.，2000，Br.J.Cancer，83(5)561-565)。在ASCUS-LSIL治療類選法研究(Triage Study)(ALTS)的報道中，對于高危HPV類型，83％具有LSIL的婦女巴氏試驗結(jié)果是陽性，該水平太高以至無法在治療類選法中使用(Humanpapillomavirus testing for triage of women with cytologic evidence oflow-grade squamous intraepithelial lesionsbaseline data from arandomized trial.The Atypical Squamous Cells of UndeterminedSignificance/Low-Grade Squamous Intraepithelial Lesions Triage Study(ALTS)Group，2000，J.Natl.Cancer Ist.92397-402)。雖然對于檢測具有ASCUS的婦女中HSIL的巴氏試驗結(jié)果，使用HPV檢測的治療類選法明顯改善了靈敏度，但是特異性與使用常規(guī)細胞學檢查相當(Solomon，D.，等.，2001，J.Natl.Cancer Inst.93(4)293-299)。在巴氏試驗中，更理想的子宮頸篩選標記可鑒定所有的子宮頸癌，大多數(shù)HSIL以及在具有LSIL和ASCUS的患者中小百分比的真正的初期癌。
現(xiàn)在通常認為子宮頸致癌作用以一種分步方式發(fā)生(Ried，T.，等.，1999，Genes Chromosomes Cancer，25(3)195-204)。正常的上皮細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榱銮安∽兒蛿U散性癌是相繼發(fā)生的。形態(tài)學上定義的發(fā)育異常和惡性畸形步驟是腫瘤遺傳過程中細胞基因改變的反映。因此，需要提供用于鑒定、評估、預防和治療子宮頸癌的生物標記物。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及癌標記物(在下文中“標記物”或“本發(fā)明的標記物”)，其列于表1中。本發(fā)明提供了編碼或相應于標記物的核酸和蛋白(在下文中分別為“標記物核酸”的“標記物蛋白”)。表1提供了標記物核酸和蛋白序列的序列號，列于附帶的序列表中(SEQ ID NOs1-44)。表2列出了新鑒定的核苷酸和氨基酸序列。表3列出了新鑒定的核苷酸序列。表1-3提供了一些所述標記物核酸和蛋白序列的序列號，列于附帶的序列表中，和標記物的基因名稱。本發(fā)明進一步提供了與所述蛋白和/或該蛋白片段特異結(jié)合的抗體、抗體衍生物和抗體片段。
本發(fā)明也涉及用于診斷、疾病分期、預測、監(jiān)測和治療子宮頸癌的各種方法、試劑和試劑盒。在本文中使用的“子宮頸癌”包括癌(如，原位癌、擴散性癌、轉(zhuǎn)移癌)和癌前狀態(tài)(如，發(fā)育異常，包括CIN或SIL)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種評估是否患者患子宮頸癌或?qū)τ诎l(fā)展為子宮頸癌具有較正常更高的危險的診斷方法，包含步驟如下比較患者樣本中本發(fā)明標記物的表達水平和對照，如來自不患子宮頸癌的患者中所述標記物的正常表達水平。與正常水平比較，患者樣本中所述標記物的表達水平明顯提高表明所述患者患子宮頸癌或?qū)τ诎l(fā)展為子宮頸癌具有較正常更高的危險。
根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容，所述標記物選自根據(jù)本發(fā)明方法的陽性預測值為至少約10％，優(yōu)選約25％，更優(yōu)選約50％以及最優(yōu)選約90％的標記物。在至少約20％，更優(yōu)選約50％以及最優(yōu)選約75％的任一如下狀態(tài)中病期0子宮頸癌患者，病期I子宮頸癌患者，病期II子宮頸癌患者，病期III子宮頸癌患者，病期IV子宮頸癌患者，I級子宮頸癌患者，II級子宮頸癌患者，III級子宮頸癌患者，鱗狀上皮細胞(表皮樣的)子宮頸癌患者，子宮頸腺癌患者，子宮頸腺鱗癌患者，小細胞子宮頸癌患者，惡性子宮頸癌患者，原發(fā)性子宮頸瘤患者，原發(fā)性惡性子宮頸淋巴瘤患者和繼發(fā)性惡性子宮頸淋巴瘤患者，以及所有與子宮頸相關的其它類型癌、惡性腫瘤和轉(zhuǎn)化，也優(yōu)選用于本發(fā)明方法的標記物與正常子宮頸細胞相比具有至少兩倍的差異表達。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種評估是否患者患子宮頸癌的診斷方法(如，新的檢測(“篩選”)，復發(fā)的檢測，反射測定)，所述方法包含比較
a)患者樣本中本發(fā)明標記物的表達水平，和b)對照的非子宮頸癌樣本中所述標記物的正常表達水平。
與正常水平比較，患者樣本中標記物明顯更高的表達水平表明該患者患子宮頸癌。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種評估是否患者患子宮頸癌的診斷方法(如，新的檢測(“篩選”)，復發(fā)的檢測，反射測定)，所述方法包含比較a)患者樣本中本發(fā)明的標記物組的表達水平，和b)對照的非子宮頸癌樣本中所述標記物組的正常表達水平。
與正常水平比較，患者樣本中標記物組明顯更高的表達水平表明該患者患子宮頸癌。
本發(fā)明也提供了用于評估用于抑制患者子宮頸癌的治療的有效性的診斷方法。所述方法包含比較a)在提供給患者至少部分治療前獲得自該患者的第一樣本中本發(fā)明標記物的表達，和b)在提供部分治療后獲得自該患者的第二樣本中所述標記物的表達。
相對于第一樣本，第二樣本中標記物明顯更低的表達水平表明所述用于抑制患者子宮頸癌的療法是有效的。
可以理解的是在這些方法中，所述“療法”可以是任何用于治療子宮頸癌的療法包括，但不限于，化學療法、放射療法、腫瘤組織的外科手術(shù)切除、基因治療和生物學療法如給予抗體及化學增活素。因此，本發(fā)明的方法可用于評估治療前、治療中和治療后的患者，例如，用于評估腫瘤負荷的減輕。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述診斷方法用于指導使用化學或生物試劑的治療。這些方法包含比較a)獲得自患者并保持在存在化學或生物試劑條件下的第一樣本中本發(fā)明標記物的表達，和b)獲得自患者并保持在不存在所述試劑條件下的第二樣本中所述標記物的表達。
相對于第一樣本，第二樣本中標記物明顯更低的表達水平表明所述試劑能有效用于抑制患者子宮頸癌。在一個實施方案中，所述第一和第二樣本可以是獲得自患者一次抽樣樣本的部分或是獲得自患者混合樣本的部分。
本發(fā)明另外提供了一種用于評估患者子宮頸癌進展的監(jiān)測方法，所述方法包含a)在第一時間點檢測患者樣本中本發(fā)明標記物的表達；b)在隨后的時間點按時重復步驟a)；和c)比較步驟a)和b)中檢測到的表達水平，以及由此監(jiān)測患者中子宮頸癌的進展。
較在第一時間點樣本中標記物的表達水平，在隨后時間點樣本中標記物明顯更高的表達水平表明子宮頸癌有進展，但是明顯更低的表達水平則表明子宮頸癌有退化。
本發(fā)明進一步提供了一種用于確定是否子宮頸癌有轉(zhuǎn)移或在未來可能轉(zhuǎn)移的診斷方法，所述方法包含比較a)患者樣本中本發(fā)明標記物的表達水平，和b)對照樣本中所述標記物體的正常表達水平(或非轉(zhuǎn)移水平)。
與正常水平(或非轉(zhuǎn)移水平)比較，患者樣本中明顯更高的表達水平表明子宮頸癌有轉(zhuǎn)移或在未來可能轉(zhuǎn)移。
此外，本發(fā)明提供了一種用于選擇用于抑制患者子宮頸癌的組合物的測試方法。所述方法包含如下步驟a)從患者處獲得包含癌細胞的樣本；b)將所述樣本的等分試樣分別保持在存在多種測試組合物的條件下；c)比較每個等分試樣中本發(fā)明標記物的表達；和d)相對于在存在其它測試組合物條件下的所述標記物表達水平，選擇一種能明顯減低含有所述測試組合物的等分試樣中所述標記物表達水平的測試組合物。
另外，本發(fā)明提供了一種評估化合物子宮頸致癌作用潛力的測試方法。所述方法包含如下步驟a)將子宮頸細胞的等分試樣分別保持在存在和不存在所述化合物的條件下；和b)比較每一個等分試樣中本發(fā)明標記物的表達。
相對于在不存在所述化合物的條件下所保持的等分試樣，在存在所述化合物的條件下所保持的等分試樣中所述標記物明顯更高的表達水平表明所述化合物具有子宮頸致癌潛力。
另外，本發(fā)明進一步提供了一種抑制患者子宮頸癌的方法。所述方法包含如下步驟a)從患者處獲得包含癌細胞的樣本；b)將所述樣本的等分試樣分別保持在存在多種組合物的條件下；c)比較每個等分試樣中本發(fā)明標記物的表達；和d)相對于在存在其它組合物的條件下所述標記物的表達水平，給予患者至少一種能明顯減低在含有所述組合物的等分試樣中所述標記物表達水平的組合物。
在前述方法中，所述樣本或患者樣本包含獲得自患者的細胞。所述細胞可在收集的子宮頸涂片中發(fā)現(xiàn)，例如，通過子宮頸刷收集。在另一個實施方案中，所述樣本是體液。所述液體包括，例如，血液、淋巴液、腹水、婦科分泌液、尿液和通過陰道沖洗收集的液體。在更進一步實施方案中，所述患者樣本是體內(nèi)樣本。
根據(jù)本

發(fā)明內(nèi)容
，可評估樣本中本發(fā)明標記物的表達水平，例如，通過檢測樣本中如下物質(zhì)的存在·相應的標記物蛋白(如，具有在表1中列為“SEQ ID NO(AAs)”序列之一的蛋白)，或所述蛋白片段(如，通過使用一種試劑，如一種抗體、抗體衍生物、抗體片段或單鏈抗體，其與所述蛋白或蛋白片段特異性結(jié)合)·相應的標記物核酸(如，具有在表1中列為“SEQ ID NO(nts)”的核酸序列之一的核苷酸轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，或其互補物)，或所述核酸片段(如，通過將獲得自樣本的轉(zhuǎn)錄的多核苷酸與其上附著有一或多個核酸的底物接觸，所述核酸具有SEQ ID NO(nts)任一核酸序列的全部或片段，或其互補物)·一種代謝物，其直接(即，催化)或間接產(chǎn)生自相應的標記物蛋白。
根據(jù)本

發(fā)明內(nèi)容
，通過使用多種(如，2、3、5或10或更多)子宮頸癌標記物，包括本領域已知的子宮頸癌標記物，執(zhí)行任一前述方法。在所述方法中，將樣本中多種標記物的每一種標記物的表達水平與獲得自對照的不患子宮頸癌的人樣本中同類型多種標記物的每一種標記物的正常表達水平比較，多種標記物中至少一種標記物是本發(fā)明的標記物。相對于標記物的相應正?；?qū)φ账?，樣本中一或多種本發(fā)明標記物或它們某些組合的表達水平明顯改變(即，在上述使用單標記物的方法中所規(guī)定的增加或減少)，表明患者患子宮頸癌。對于所有前述方法，優(yōu)選那些所述方法的陽性預測值為至少約10％的標記物。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種抗體、抗體衍生物或抗體片段，其與標記物蛋白(如，具有列于序列表中氨基酸序列之一的蛋白)或所述蛋白片段特異性結(jié)合。本發(fā)明也提供了用于制造上述抗體、抗體衍生物和抗體片段的方法。上述方法可包含用含有標記物蛋白(如，具有列于序列表中氨基酸序列之一的蛋白)的全部，或具有10或更多個氨基酸的片段免疫哺乳動物，其中所述蛋白或肽可獲得自細胞或通過化學合成獲得。本發(fā)明的方法也包含生產(chǎn)單克隆和單鏈抗體，其中可進一步包含從免疫的哺乳動物中分離脾細胞，將分離的脾細胞與無限增殖化細胞系融合以形成雜交瘤，以及篩選那些能產(chǎn)生特異性結(jié)合標記物蛋白或所述蛋白片段的抗體的特殊雜交瘤。
在另一方面，本發(fā)明涉及各種診斷和化驗試劑盒。在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種用于評估是否患者患子宮頸癌的試劑盒。所述試劑盒包含一種用于評估本發(fā)明標記物表達的試劑。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于評估用于抑制患者子宮頸癌的化學或生物試劑適用性的試劑盒。所述試劑盒包含一種用于評估本發(fā)明標記物表達的試劑，和可還包含一或多種上述試劑。在更進一步實施方案中，本發(fā)明提供了用于評估子宮頸癌細胞存在或治療子宮頸癌的試劑盒。所述試劑盒包含一種抗體、抗體衍生物或抗體片段，其特異性結(jié)合標記物蛋白或所述蛋白片段。所述試劑盒也可包含多種抗體、抗體衍生物或抗體片段，其中所述多種所述抗體試劑特異性結(jié)合標記物蛋白或所述蛋白片段。
在另外一個實施方案中，本發(fā)明也提供了一種用于評估子宮頸癌細胞存在的試劑盒，其中所述試劑盒包含一種核酸探針，其特異性結(jié)合標記物核酸或所述核酸片段。所述試劑盒也可包含多種探針，其中每個探針特異性結(jié)合標記物核酸或所述核酸片段。
在另一方面，本發(fā)明涉及用于治療患子宮頸癌或處于發(fā)展為子宮頸癌危險的患者的方法。上述方法可包含減少本發(fā)明標記物表達和/或干擾其生物學功能。在一個實施方案中，所述方法包含提供給患者一種標記物核酸或其片段的反義寡核苷酸或互補多核苷酸。例如，通過載體遞送提供給患者一種反義多核苷酸，所述載體表達標記物核酸或其片段的反義多核苷酸。在另一個實施方案中，所述方法包含提供給患者一種抗體、抗體衍生物或抗體片段，其特異性結(jié)合標記物蛋白或所述蛋白片段。在一個優(yōu)選實施方案中，所述抗體、抗體衍生物或抗體片段特異性結(jié)合具有列于序列表中氨基酸序列之一的蛋白或所述蛋白片段。
可以理解的是本發(fā)明的方法和試劑盒也可包括已知的癌標記物，包括已知的子宮頸癌標記物?？筛M一步理解所述方法和試劑盒可用于鑒定除子宮頸癌之外的其它癌癥。
附圖簡要說明

圖1描述了子宮頸組織樣本的簇狀圖表。通過34個正常、LSIL、HSIL和子宮頸癌組織樣本轉(zhuǎn)錄分布圖的分級群聚創(chuàng)建了樹狀圖。每一個樣本標記物具有其組織類型和標識碼。圖1中縮寫定義如下Necto正常子宮頸陰道部；Nendo正常子宮頸內(nèi)膜；LSIL低度鱗狀上皮內(nèi)病變；HSIL高度鱗狀上皮內(nèi)病變；Tscc鱗狀細胞癌；Taca腺癌。虛線將34個樣本劃分為兩大組對照組和疾病組。實心圓表示錯誤的簇樣本。
圖2描述了在正常、發(fā)育異常和子宮頸癌組織中通過cDNA微陣列雜交得到的MCM6和Claudin 1轉(zhuǎn)錄分布圖(TP)。每個數(shù)據(jù)點代表兩次微陣列雜交的平均值。通過對陣列上所有點取中值強度歸一化TP強度。圖2中縮寫定義如下Endo正常子宮頸內(nèi)膜組織；Ecto正常子宮頸陰道部組織；LSIL低度鱗狀上皮內(nèi)病變；HSIL高度鱗狀上皮內(nèi)病變；SCC鱗狀細胞癌；ACA腺癌。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及新發(fā)現(xiàn)的列于表1的與子宮頸細胞癌狀態(tài)相關的癌標記物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些標記物任一或這些標記物組合表達水平高于它們正常表達水平，就與患者中子宮頸癌包括癌前狀態(tài)如發(fā)育異常的存在相關。提供了用于檢測樣本中子宮頸癌存在、樣本中子宮頸癌不存在、子宮頸癌病期和與在患者中預防、診斷、鑒定和治療子宮頸癌相關的子宮頸癌其它特性的方法。也提供了治療子宮頸癌的方法。
表1列出了本發(fā)明的標記物，相對于正常(即非癌)子宮頸細胞和包含列于表2-13中的標記物，它們在子宮頸癌細胞中過表達。表1提供了核苷酸轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的cDNA序列和其編碼的或相應于每一個標記的蛋白的氨基酸序列的序列表標識，也提供了蛋白編碼序列在cDNA序列中的位置。表2列出了新鑒定的核苷酸和氨基酸序列。表3列出了新鑒定的核苷酸序列。表4通過轉(zhuǎn)錄分布試驗和在SCC、ACA和HSIL中它們的標記物得分鑒定了所選擇的本發(fā)明標記物。表5通過原位雜交鑒定了在子宮頸癌中過表達的本發(fā)明標記物并指出了標記物表達的位置。表6使用子宮頸組織微陣列鑒定了本發(fā)明標記物和它們表達頻率。表7鑒定了基因特異性引物。表8列出了組織欄的末端PCR溴化乙錠瓊脂糖凝膠圖片中范圍在0-5的得分。表9-13列出了在每個測試組織中靶基因的表達。
定義在本文中使用時，下列每個術(shù)語具有與在該段落中其定義相關的含義。
本文中所用的冠詞“一”和“一個”指一或多于一(即，至少一)的本文中語法上的對象。作為例子，“一種元件”指一種元件或多于一種元件。
“標記物”是一種基因，與其在正?；蚪】到M織或細胞中表達水平相比，在組織或細胞中其改變的表達水平與疾病狀態(tài)相關，例如與癌癥相關?！皹擞浳锖怂帷笔且环N本發(fā)明標記物編碼的或相應于本發(fā)明標記物的核酸(如，mRNA，cDNA)。上述標記物核酸包括DNA(如，cDNA)，所述DNA包含列于序列表的任一核酸序列的完整或部分序列或該序列的互補物。標記物核酸也包括RNA，所述RNA包含列于序列表的任一核酸序列的完整或部分序列或該序列的互補物，其中用尿嘧啶殘基取代所有的胸腺嘧啶殘基。“標記物蛋白”是一種本發(fā)明標記物編碼的或相應于本發(fā)明標記物的蛋白。標記物蛋白包含列于序列表的任一序列的完整或部分序列。術(shù)語“蛋白”和“多肽”可交換使用。
“標記組”指多于一個標記物的組。
術(shù)語“探針”指任何分子，其能選擇性結(jié)合特別指定的靶分子，例如，核苷酸轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或本發(fā)明標記物編碼的或相應于本發(fā)明標記的蛋白。探針可由本領域技術(shù)人員合成，也可來自合適的生物制品。為達到檢測靶分子的目的，可特別設計帶標記的探針，如本文中所描述的。能用作為探針的分子的例子包括，但不限于，RNA、DNA、蛋白、抗體和有機分子。
“子宮頸相關的”體液是一種液體，當其在患者體內(nèi)時，接觸或經(jīng)過子宮頸細胞或進入所述細胞，或接觸或經(jīng)過可通過的子宮頸細胞中流出的蛋白。所述細胞可在收集的子宮頸涂片中發(fā)現(xiàn)，例如，通過子宮頸刷收集。子宮頸相關的體液的例子包括血液、淋巴液、腹水、婦科分泌液、膽囊液、尿液和通過陰道沖洗收集的液體。
標記物的“正?！北磉_水平是在受試人或不患子宮頸癌患者的子宮頸細胞中所述標記物的表達水平。
標記物的“過表達”或“明顯更高的表達水平”指在測試樣本中的表達水平高于用于評估表達的試驗的標準誤，和較對照樣本(如，來自不具有所述標記物相關疾病的健康患者的樣本)中所述標記物表達水平以及優(yōu)選地，在一些對照樣本中所述標記物的平均表達水平，優(yōu)選至少高兩倍，和更優(yōu)選高3、4、5或10倍。
標記物的“明顯更低的表達水平”指在測試樣本中的表達水平較對照樣本(如，來自不具有所述標記物相關疾病的健康患者的樣本)中所述標記物表達水平以及優(yōu)選地，在一些對照樣本中所述標記物的平均表達水平，至少低兩倍，和更優(yōu)選低3、4、5或10倍。
在本文中使用時，術(shù)語“啟動子/調(diào)節(jié)序列”指可操作地連接著所述啟動子/調(diào)節(jié)序列的基因產(chǎn)物表達所必需的核酸序列。在一些例子中，所述序列可以是核心啟動子序列以及在其它例子中，所述序列也可包括增強子序列和其它基因產(chǎn)物表達所必需的調(diào)控元件。例如，所述啟動子/調(diào)節(jié)序列可以是一種以組織特異性方式表達基因產(chǎn)物的序列。
“組成型”啟動子是一種核苷酸序列，當其可操作地與編碼或規(guī)定基因產(chǎn)物的多核苷酸連接時，在所述細胞大多數(shù)或所有的生理條件下，導致在活的人細胞中產(chǎn)生所述基因產(chǎn)物。
“誘導型”啟動子是一種核苷酸序列，當其可操作地與編碼或規(guī)定基因產(chǎn)物的多核苷酸連接時，僅當相應于所述啟動子的誘導劑在所述細胞中存在時，才導致在活的人細胞中實質(zhì)上產(chǎn)生所述基因產(chǎn)物。
“組織特異型”啟動子是一種核苷酸序列，當其可操作地與編碼或規(guī)定基因產(chǎn)物的多核苷酸連接時，僅在如果所述細胞是相應于所述啟動子的組織類型的細胞條件下，才導致在活的人細胞中實質(zhì)上產(chǎn)生所述基因產(chǎn)物。
“轉(zhuǎn)錄的多核苷酸”或“核苷酸轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物”是一種多核苷酸(如，mRNA、hnRNA、cDNA或上述RNA或cDNA的類似物)，其與成熟mRNA的全部或部分互補或同源，所述成熟mRNA由本發(fā)明的標記物轉(zhuǎn)錄以及正常的轉(zhuǎn)錄后加工(如，剪接)所產(chǎn)生，如果可能的話，由RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄，以及RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。
“互補的”指在兩個核酸鏈區(qū)之間或在同一個核酸鏈兩個區(qū)之間序列互補的概括性概念。已知第一核酸區(qū)的腺嘌呤殘基能與第二核酸區(qū)的殘基形成特定的氫鍵(“堿基配對”)，如果第二核酸區(qū)的殘基是胸腺嘧啶或尿嘧啶，第二區(qū)對于第一區(qū)是反平行的。同樣地，已知第一條核酸鏈的胞嘧啶殘基能與第二條核酸鏈的殘基堿基配對，如果第二條鏈的殘基是鳥嘌呤，第二條鏈對于第一條鏈是反平行的。如果，當所述兩個區(qū)排列為反平行方式時，核酸的第一區(qū)與同樣或不同的核酸的第二區(qū)互補，至少一個第一區(qū)的核苷酸殘基能與第二區(qū)的殘基堿基配對。優(yōu)選地，第一區(qū)包含第一部分和第二區(qū)包含第二部分，由此，當?shù)谝缓偷诙糠忠苑雌叫蟹绞脚帕袝r，至少約50％，和優(yōu)選至少約75％，至少約90％，或至少約95％的第一區(qū)核苷酸殘基能與第二區(qū)中核苷酸殘基堿基配對。更優(yōu)選地，所有的第一區(qū)核苷酸殘基能與第二區(qū)中核苷酸殘基堿基配對。
本文中所使用的“同源的”指在同一個核酸鏈兩個區(qū)之間或在兩個不同核酸鏈區(qū)之間的核苷酸序列相似性。當在兩個區(qū)中核苷酸殘基位置被同樣的核苷酸殘基所占據(jù)時，那么在該位置上這兩個區(qū)是同源的。如果每個區(qū)的至少一個核苷酸殘基位置被同樣的核苷酸殘基所占據(jù)，第一區(qū)與第二區(qū)是同源的。根據(jù)這兩個區(qū)中被同樣的核苷酸殘基所占據(jù)的核苷酸殘基位置的比例表示兩個區(qū)之間的同源性。作為例子，具有核苷酸序列5′-ATTGCC-3′的區(qū)和具有核苷酸序列5′-TATGGC-3′的區(qū)具有50％同源性。優(yōu)選地，第一區(qū)包含第一部分和第二區(qū)包含第二部分，由此，至少約50％，和優(yōu)選至少約75％，至少約90％，或至少約95％的每個部分的核苷酸殘基位置被同樣的核苷酸殘基所占據(jù)。更優(yōu)選地，每個部分的所有核苷酸殘基位置都被同樣的核苷酸殘基所占據(jù)。
如果分子與底物共價或非共價相連，對于底物該分子是“固定的”或“附著的”，上述底物可用液體(如，標準枸櫞酸鹽水，pH7.4)沖洗，所述分子的實質(zhì)部分沒有從底物上分離。
當在本文中所用時，“天然存在的”核酸分子指具有在自然界中發(fā)現(xiàn)的生物體中出現(xiàn)的核苷酸序列的RNA或DNA分子。
如果癌癥的至少一種癥狀減輕、終止、放緩或阻止，該癌癥被“抑制”。在本文中使用時，如果子宮頸癌的復發(fā)或轉(zhuǎn)移減少、放緩、延遲或阻止，其也被“抑制”。
試劑盒是任何一種產(chǎn)品(如，一種包裝或容器)，其包含至少一種試劑，如一種探針，用于特異性檢測本發(fā)明標記物的表達。該試劑盒可以標準單位的形式推廣、分發(fā)或出售用于執(zhí)行本發(fā)明的方法。
“本發(fā)明的蛋白”包含標記物蛋白及其片段；標記物蛋白變體及其片段；包含標記物或標記物蛋白變體至少15個氨基酸片段的肽和多肽；和包含標記物或標記物蛋白變體，或標記物或標記物蛋白變體至少15個氨基酸片段的融合蛋白。
除非在本文中另有規(guī)定，術(shù)語“抗體”和“抗體”概括地包含了天然存在的抗體類型(如，IgG，IgA，IgM，IgE)和重組抗體，如單鏈抗體、嵌合和人源化抗體以及多特異性抗體，也包括前述所有抗體的片段和衍生物，該片段和衍生物具有至少一個抗原結(jié)合位點?？贵w衍生物可包含與抗體結(jié)合的蛋白或化學部分。
描述本發(fā)明部分基于新鑒定的標記物，與它們在正常的(即，非癌)子宮頸細胞中表達相比，所述標記物在子宮頸癌細胞中過表達。在本文中子宮頸細胞中一或多種這些標記物增強的表達與組織的癌狀態(tài)相關。本發(fā)明提供了用于評估子宮頸細胞(如，獲得自人細胞、培養(yǎng)的人細胞、存檔或保藏的人細胞和體內(nèi)細胞)癌狀態(tài)和治療患子宮頸癌的患者的組合物、試劑盒和方法。
本發(fā)明所述的組合物、試劑盒、和方法具有如下用途，其中1)評估是否患者患子宮頸癌；2)評估人類患者子宮頸癌的病期；3)評估患者子宮頸癌的級別；4)評估患者子宮頸癌的良性或惡性性質(zhì)；5)評估患者子宮頸癌的轉(zhuǎn)移潛力；6)評估患者子宮頸癌相關的新生物的組織學類型；7)制造用于治療子宮頸癌和/或評估是否患者患子宮頸癌的抗體、抗體片段或抗體衍生物；8)評估子宮頸癌細胞的存在；9)評估用于抑制患者子宮頸癌一或多種受試化合物的效力；10)評估用于抑制患者子宮頸癌的治療的有效性；11)監(jiān)測患者子宮頸癌的進展；12)選擇用于抑制患者子宮頸癌的組合物或治療；13)治療患子宮頸癌的患者；14)抑制患者子宮頸癌；15)評估受試化合物的子宮頸致癌作用潛力；和16)預防處于發(fā)展為子宮頸癌危險的患者子宮頸癌的發(fā)作。
因此，本發(fā)明包括一種評估是否患者患子宮頸癌的方法，其包括評估是否患者具有轉(zhuǎn)移前子宮頸癌。該方法包含比較患者樣本中本發(fā)明標記物(列于表1)的表達水平和對照中所述標記物的正常表達水平，如非子宮頸癌樣本。與正常水平相比，患者樣本中標記物明顯更高的表達水平表明該患者患子宮頸癌。
本發(fā)明也提供了含有核酸的基因運載工具、宿主細胞和組合物(所有本文中描述的)，所述核酸包含列于序列表中任一核酸序列的全部、或15個或更多核苷酸的片段，或上述序列的互補物，和多肽，所述多肽包含列于序列表中任一氨基酸序列的全部、或10個或更多氨基酸的片段。
如本文所述，患者子宮頸癌與本發(fā)明一或多種標記物增加的表達水平相關。雖然，如上所討論，其中一些表達水平改變導致了子宮頸癌的發(fā)生，其它一些改變誘導、保持并促進子宮頸癌細胞的癌狀態(tài)。因此，可通過減少和/或干擾標記物表達和/或那些標記物編碼蛋白的功能來抑制通過一或多種本發(fā)明標記物表達水平增加而鑒定的子宮頸癌。
通常在本領域中已知許多方法可抑制本發(fā)明標記物的表達。例如，給子宮頸癌細胞提供反義寡核苷酸以抑制標記物的轉(zhuǎn)錄、翻譯或同時抑制兩者。另一方面，編碼能特異性結(jié)合標記物蛋白的抗體、抗體衍生物或抗體片段的多核苷酸，和可操作地與合適的啟動子/調(diào)控區(qū)連接，能提供給細胞以產(chǎn)生能抑制標記物蛋白功能或活性的細胞內(nèi)抗體。也可通過用能特異性結(jié)合標記物蛋白的抗體、抗體衍生物或抗體片段處理子宮頸癌細胞來抑制標記物表達和/或功能。使用本文中描述的方法，能篩選多種分子，特別是包括足夠小的以致能穿過細胞膜的分子，以鑒定能抑制標記物表達或抑制標記物蛋白功能的分子。給患者提供所鑒定的化合物以抑制患者的子宮癌細胞。
任何本發(fā)明的標記物或標記物組合，也包括任何已知的標記物與本發(fā)明標記物的組合，可用于本發(fā)明的組合物、試劑盒和方法中。一般而言，優(yōu)選使用在子宮頸癌細胞中標記物表達水平和在正常子宮頸細胞中相同標記物表達水平之間差異越可能大的標記物。盡管該差異可小到用于評估該標記物表達的方法的檢測極限，但是優(yōu)選該差異至少大于該評估方法的標準誤，以及優(yōu)選較正常子宮頸組織中相同標記物的表達水平至少2-，3-，4-，5-，6-，7-，8-，9-，10-，15-，20-，25-，100-，500-，1000-倍或更大的差異。
認為某些標記物蛋白從子宮頸細胞(即，正常和癌細胞的一種或兩者)分泌到圍繞著細胞的胞外空間。這些標記物優(yōu)選用于本發(fā)明某些實施方案中的組合物、試劑盒和方法，基于在子宮頸相關的體液樣本中能檢測到上述標記物蛋白的事實，較組織的活組織檢查切片樣本，這些標記物能更容易地收集自人類患者。另外，優(yōu)選用于檢測標記物蛋白的體內(nèi)技術(shù)，包括將抗該蛋白的標記的抗體導入患者體內(nèi)。例如，可用放射性標記物標記抗體，可通過標準成像技術(shù)檢測患者體內(nèi)該放射性標記物的存在和位置。
對于本領域技術(shù)人員而言，測定任何特殊標記物蛋白是否是分泌蛋白是一件簡單的事情。為進行該測定，標記物蛋白表達在，例如，哺乳動物細胞中，優(yōu)選人子宮頸細胞系中，收集細胞外液，評估在細胞外液中存在或不存在標記物蛋白(如，使用特異性結(jié)合該蛋白的標記的抗體)。
接下來的例子是一種用于檢測蛋白分泌的方法。在5％(v/v)CO2，95％空氣氣氛中，在含有培養(yǎng)液(補充有10％胎牛血清的Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)液{DMEM})的加樣孔中，約8×105293T細胞在37℃下溫育至約60-70％匯合。接著用每孔中含有2微克包含編碼標記物蛋白表達載體的DNA和10微升LipofectAMINETM(GIBCO/BRLCatalog no.18342-012)的標準轉(zhuǎn)染混合物轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染混合物保持約5小時，接著用新鮮的培養(yǎng)液更換并保持在空氣氣氛中。每個孔用不含有甲硫氨酸或半胱氨酸的DEME(DMEM-MC；ICN Catalog no.16-424-54)輕輕地沖洗兩次。在每個孔中加入約1毫升的DMEM-MC和約50微居里的Trans-35STM試劑(ICN Catalog no.51006)。加樣孔保持在上述的5％CO2氣氛中并在37℃下溫育選定的一段時間。接著溫育，除去150微升的條件培養(yǎng)液并離心除去漂浮細胞和碎片。在上清液中標記物蛋白的存在表明該蛋白被分泌。
可以理解的是含有子宮頸細胞的患者樣本可用于本發(fā)明的方法。在這些實施方案中，通過評估子宮頸細胞樣本(如，獲得自患者的子宮頸涂片)中標記物的數(shù)量(如，絕對數(shù)量或濃度)可評估標記物的表達水平。當然，在評估樣本中標記物數(shù)量前，可用多種眾所周知的收集后制備或貯藏技術(shù)(如核酸和/或蛋白提取、固定、貯藏、冷凍、超濾、濃縮、蒸發(fā)、離心等)處理細胞樣本。同樣地，也可用收集后制備或貯藏技術(shù)(如，固定)處理子宮頸涂片。
本發(fā)明的組合物、試劑盒和方法可用于檢測標記物蛋白的表達，該標記物蛋白至少有一部分在表達該蛋白的細胞表面展示。對于本領域技術(shù)人員而言，測定標記物蛋白或其部分是否暴露于細胞表面是一件簡單的事情。例如，可用免疫學方法檢測全細胞中的標記物蛋白，或用眾所周知的基于計算機的序列分析方法來預測至少一個胞外域(即，包括分泌蛋白和具有至少一個細胞表面域的蛋白)的存在。無需裂解該細胞(如，使用與標記物蛋白的細胞表面域特異性結(jié)合的標記抗體)就可檢測到具有至少一部分在表達該蛋白的細胞表面展示的標記物蛋白的表達。
通過用于檢測轉(zhuǎn)錄核酸或蛋白的任一眾所周知的方法可評估本發(fā)明標記物的表達。上述方法非限制性的例子包括用于檢測分泌、細胞表面、胞質(zhì)或核蛋白的免疫學方法、蛋白純化方法、蛋白功能或活性分析方法、核酸雜交方法、核酸反轉(zhuǎn)錄方法和核酸擴增方法。
在一個優(yōu)選實施方案中，使用能特異性結(jié)合標記物蛋白或其片段，包括全部或部分進行了常規(guī)的翻譯后修飾的標記物蛋白，的一種抗體(如，一種放射性標記的、發(fā)色團標記的、熒光團標記的或酶標記的抗體)、抗體衍生物(如，結(jié)合有底物或或蛋白—配體對{如，生物素—抗生物素蛋白鏈菌素}的蛋白或配體的抗體)，或抗體片段(如，單鏈抗體、分離的抗體超變區(qū)，等)來評估標記物的表達。
在另一個優(yōu)選實施方案中，通過制備來自患者樣本細胞的mRNA/cDNA(即，轉(zhuǎn)錄的多核苷酸)，和通過將mRNA/cDNA和與標記物核酸或其片段互補的對照多核苷酸雜交來評估標記物的表達。在與對照多核苷酸雜交前，能使用任一多聚酶鏈式反應方法來任選地擴增cDNA；優(yōu)選不被擴增。同樣地，可使用定量PCR評估標記物的表達水平以檢測一或多種標記物的表達?？蛇x地，任何已知檢測本發(fā)明標記物突變或變體(如，單核苷酸多態(tài)性、缺失等)的方法可用于檢測患者中標記物的存在。
在一個相關實施方案中，將獲得自樣本的轉(zhuǎn)錄多核苷酸混合物和底物接觸，該底物固定有與標記物核酸的至少一部分(如，至少7，10，15，20，25，30，40，50，100，500或更多的核苷酸殘基)互補的或同源的多核苷酸。如果在底物上，互補的或同源的多核苷酸的檢測有差別(如，使用不同的發(fā)色團或熒光團，或固定在不同的所選擇的位置)，那么使用一種單一底物就可同時評估多種標記物的表達水平(如，固定在所選擇位置的多核苷酸的“基因芯片”微陣列)。當使用包括將一種核酸與另一種雜交的用于評估標記物表達的一種方法時，優(yōu)選在嚴謹雜交條件下進行雜交。
因為本發(fā)明的組合物、試劑盒和方法依賴于檢測本發(fā)明一或多種標記物的表達水平的差異，優(yōu)選標記物的表達水平明顯大于用于在至少一種正常子宮頸細胞和子宮頸癌細胞中評估表達的方法的最小檢測極限。
很清楚通過使用一或多種本發(fā)明的標記物來常規(guī)篩選額外的患者樣本，可認識到在不同類型的癌癥中某些標記物是過表達的，包括特殊的子宮頸癌，也包括另外的癌癥如乳癌、卵巢癌等。例如，可證實某些本發(fā)明的標記物在大多數(shù)(即，50％或更多)或基本上全部(即，80％或更多)的子宮頸癌中過表達。此外，可證實某些本發(fā)明的標記物與不同病期的(即，病期0，I，II，III和IV子宮頸癌，也包括亞分類IA1，IA2，IB，IB1，IB2，IIA，IIB，IIIA，IIIB，IVA和IVB，對于子宮頸原發(fā)癌使用FIGO病期分組系統(tǒng)(見GynecologicOncology，1991，41199和Cancer，1992，69482))，以及癌前狀態(tài)的(如，發(fā)育異常包括CIN或SIL)，不同組織學亞型的(如，鱗狀上皮細胞癌和鱗狀上皮細胞癌變體如疣狀癌、淋巴上皮癌類似癌、乳頭狀鱗狀新生物和梭形細胞鱗狀細胞癌(見，Cervical Cancer andPreinvasive Neoplasia，1996，pp.90-91)漿液樣、粘蛋白狀、子宮內(nèi)膜樣和透明細胞亞型，也包括亞分類和交叉分類的腺癌、乳頭腺癌、乳頭狀囊腺癌、表面乳頭狀癌、惡性腺纖維瘤、囊腺纖維瘤、腺癌、囊腺癌、腺棘皮癌、子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤、中胚層{富勒氏}混合瘤、惡性瘤、混合上皮細胞瘤和未分化癌，對于惡性子宮頸瘤的分類，使用WHO/FIGO系統(tǒng)；Scully，Atlas of Tumor Pathology，第3輯，Washington DC)，和不同級別的(即，I級{良好分化的}，II級{中度良好分化的}和III級{從周圍正常組織低分化的})子宮頸癌相關。此外，對于本發(fā)明標記物的表達而言，評估了大量的患者樣本，且來自所獲得樣本中的單獨的患者結(jié)果是相關的，也可證實某些本發(fā)明標記物改變的表達與惡性腫瘤密切相關，以及本發(fā)明其它標記物改變的表達與良性腫瘤密切相關。因此，本發(fā)明的組合物、試劑盒和方法可用于鑒定患者中子宮頸癌的一或多種病期、級別、組織學類型和良性/惡性性質(zhì)。
當本發(fā)明的組合物、試劑盒和方法用于鑒定患者中子宮頸癌的一或多種病期、級別、組織學類型和良性/惡性性質(zhì)時，優(yōu)選，標記物或本發(fā)明的標記物組選自在至少約20％、和優(yōu)選至少約40％、60％或80％，和更優(yōu)選基本上全部患子宮頸癌的患者中獲得陽性結(jié)果的，該子宮頸癌具有相應的病期、級別、組織學類型和良性/惡性性質(zhì)。優(yōu)選地，標記物或本發(fā)明的標記物組選自在一般人群中陽性預測值(PPV)大于約10％的(更優(yōu)選外加特異性測定大于80％的)。
當多種本發(fā)明的標記物用于本發(fā)明的組合物、試劑盒和方法中時，可在一種單獨的反應混合物中(即，對于每種標記物使用試劑，如不同的熒光探針)或在相應于一或多種標記物的單獨的反應混合物中，將患者樣本中每種標記物的表達水平與同類型的非癌樣本中多種標記物的每種正常表達水平比較。在一個實施方案中，相對于相應的正常水平，在樣本中多種表達標記物中超過一種的表達水平的明顯增加表明患者患子宮頸癌。當使用多種標記物時，優(yōu)選使用2，3，4，5，8，10，12，15，20，30或50或更多的單獨的標記物，其中優(yōu)選更少的標記物。
為使本發(fā)明的組合物、試劑盒和方法的靈敏度最大化(即，因為患者樣本中非癌器官的細胞的干擾)，優(yōu)選在此使用的本發(fā)明的標記物是一種具有受限的組織分布，如通常不在非癌組織中表達的標記物。
已知僅有少量標記物與子宮頸癌相關(如，bcl-2，15A8抗原，cdc6，Mcm5和EGFR)。當然這些標記物不包括本發(fā)明的標記物，盡管在一個標記物組中它們可與一或多種本發(fā)明的標記物聯(lián)合使用，例如。眾所周知某些類型的基因，如癌基因、腫瘤抑制基因、生長因子類似基因、蛋白酶類似基因和蛋白激酶類似基因通常與不同類型的癌的發(fā)生相關。因此，在本發(fā)明的標記物中，優(yōu)選使用那些類似由已知癌基因和腫瘤抑制基因編碼的已知蛋白的相應蛋白，和那些類似生長因子、蛋白酶和蛋白激酶的相應蛋白。
認為本發(fā)明的組合物、試劑盒和方法對于具有增加的發(fā)展為子宮頸癌危險的患者和他們的醫(yī)學顧問具有特殊的效用。認可的具有增加的發(fā)展為子宮頸癌危險的患者包括，例如，具有子宮頸癌家族史的患者，鑒定為具有突變的癌基因(即，至少一種等位基因)的患者，和大齡患者(即，大于50或60歲的婦女)。
可用不同的方法來評估正常(即，非癌)人子宮頸組織中標記物的表達。在一個實施方案中，通過評估看來是非癌的子宮頸細胞的一部分中標記物的表達水平和通過將正常表達水平與懷疑是患癌的子宮頸細胞的一部分中的表達水平比較來評估該正常表達水平?？蛇x地，和特別地作為可獲得自按程序進行的本文中所描述方法的結(jié)果的詳細信息，對于本發(fā)明的標記物的正常表達而言，可使用種群平均值。在另一個實施方案中，標記物的‘正常的’表達水平可通過評估獲得自非癌患者的患者樣本，獲得自在懷疑該患者患子宮頸癌之前獲得的患者樣本，來自存檔的患者樣本和類似物中標記物的表達來測定。
本發(fā)明包括用于評估樣本(如，存檔的組織樣本或獲得自患者的樣本)中子宮頸癌細胞存在的組合物、試劑盒和方法。這些組合物、試劑盒和方法基本上與那些上述的，除了其中不可避免的用于不同于患者樣本的樣本中的組合物、試劑盒和方法外，基本上是相同的。例如，當所用的樣本是蠟封(parafinized)的、存檔的人組織樣本時，需要調(diào)節(jié)用于評估樣本中標記物表達水平的本發(fā)明組合物、試劑盒或方法中化合物的比率。在本領域和本領域普通技術(shù)人員中這樣的方法是眾所周知的。
本發(fā)明包括用于評估子宮頸癌細胞(如，在樣本，如在患者樣本中)存在的試劑盒。該試劑盒包含多種試劑，每種都能特異性結(jié)合標記物核酸或蛋白。合適用于與標記物蛋白結(jié)合的試劑包括抗體、抗體衍生物、抗體片段和類似物。合適用于與標記物核酸(如，基因組DNA、mRNA、剪接的mRNA、cDNA或類似物)結(jié)合的試劑包括互補的核酸。例如，核酸試劑可包括固定于底物的寡核苷酸(標記的或未標記的)，不與底物結(jié)合的標記的寡核苷酸，PCR引物對，分子信標探針和類似物。
本發(fā)明的試劑盒也可任選地包含用于操作本發(fā)明方法的額外成分。作為例子，該試劑盒可包含合適用于互補核苷酸退火或用于特異性結(jié)合該蛋白的抗體和蛋白的結(jié)合的液體(如，SSC緩沖液)，一或多個樣本室，一份描述操作本發(fā)明方法的說明書，一種正常子宮頸樣本，一種子宮頸癌細胞樣本，和類似物。
本發(fā)明也包括一種制造分離的雜交瘤的方法，該雜交瘤產(chǎn)生用于評估患者是否患子宮頸癌的抗體。在此方法中，合成或分離包含標記物蛋白全部或片段的蛋白或多肽(如，通過從表達其的細胞中純化或通過在體內(nèi)或體外用已知方法轉(zhuǎn)錄并翻譯編碼蛋白或多肽的核酸)。一種脊椎動物，優(yōu)選哺乳動物如小鼠、大鼠、兔或綿羊用上述蛋白或多肽免疫。該脊椎動物可任選地(和優(yōu)選地)用上述蛋白或多肽免疫至少一段額外時間，使得該脊椎動物對于上述蛋白或多肽顯示加強的免疫響應。使用本領域眾所周知的任一方法，分離自免疫的脊椎動物的脾細胞與無限增殖化細胞系融合形成雜交瘤。該方法中形成的雜交瘤接著用標準方法篩選以鑒定能產(chǎn)生特異性結(jié)合標記物蛋白或其片段的抗體的一或多種雜交瘤。本發(fā)明也包括根據(jù)上述方法制得的雜交瘤和使用該雜交瘤制得的抗體。
本發(fā)明也包括一種評估用于抑制子宮頸癌細胞的受試化合物的效力的方法。如上所述，本發(fā)明標記物的表達水平的差異與子宮頸細胞的癌狀態(tài)相關。盡管認為本發(fā)明某些標記物表達水平的改變類似于子宮頸細胞癌狀態(tài)所產(chǎn)生的結(jié)果，但是同樣也認為本發(fā)明其它標記物的表達水平改變導致、保持并促進了那些細胞的癌狀態(tài)。因此，能抑制患者子宮頸癌的化合物可導致本發(fā)明一或多種標記物的表達水平改變至接近該標記物的正常表達水平的水平(即，非癌子宮頸細胞中該標記物的表達水平)。
因此，該方法包含比較在第一子宮頸細胞樣本中并保持在存在受試化合物的條件下標記物的表達與在第二子宮頸細胞樣本中并保持在不存在受試化合物的條件下標記物的表達。在存在受試化合物條件下，本發(fā)明標記物的表達明顯減少表明該受試化合物抑制子宮頸癌。子宮頸細胞樣本可以，例如，是獲得自患者的正常子宮頸細胞的一次抽樣樣本，獲得自患者的正常子宮頸細胞的混合樣本的等分試樣，正常子宮頸細胞系的細胞，獲得自患者的子宮頸癌細胞的一次抽樣樣本，獲得自患者的子宮頸癌細胞的混合樣本的等分試樣，子宮頸癌細胞系的細胞，或類似物。在一個實施方案中，樣本是獲得自患者的子宮頸癌細胞，測試多種已知能有效地用于抑制的不同子宮頸癌的化合物以鑒定出能最好的抑制患者子宮頸癌的化合物。
同樣地，該方法可用于評估用于患者子宮頸癌的治療的有效性。在該方法中，評估了一對樣本中(一個樣本給予該治療，另一個樣本不給予該治療)本發(fā)明一或多種標記物的表達水平。當用評估受試化合物效力的方法時，如果該治療導致本發(fā)明標記物明顯更低的表達水平，那么對于抑制子宮頸癌而言，該治療是有效的。同上，如果來自所選擇的患者的樣本用于該方法中，那么可在體外評估可選擇的治療以選擇一種對于抑制患者子宮頸癌最有效的治療。
如上所述，人子宮頸細胞的癌狀態(tài)與本發(fā)明標記物的表達水平的改變相關。本發(fā)明包括一種用于評估受試化合物的人子宮頸細胞致癌作用潛力的方法。該方法包含將人子宮頸細胞等分試樣分別保持在存在和不存在受試化合物的條件下。比較每個等分試樣中本發(fā)明標記物的表達。保持在存在受試化合物的條件下的等分試樣中本發(fā)明標記物表達水平明顯更高(相對于保持在不存在受試化合物條件下的等分試樣)，表明該受試化合物具有潛在的人子宮頸細胞致癌作用。通過比較相應標記物表達水平增強或抑制的程度，通過比較表達水平增強或抑制的標記物的數(shù)量，或兩者都比較，可評估不同受試化合物的相對致癌作用潛力。
在下列段落中更詳細描述了本發(fā)明的不同方面。
I.分離的核酸分子本發(fā)明的一個方面涉及分離的核酸分子，包括編碼標記物體蛋白或其部分的核酸。本發(fā)明分離的核酸也包括足以用作為雜交探針以鑒定標記物核酸分子及其片段的核酸分子，如，那些合適用作為用于標記物核酸分子的擴增或突變的PCR引物的。在本文中使用時，術(shù)語“核酸分子”意指包括DNA分子(如，cDNA或基因組DNA)和RNA分子(如，mRNA)以及用核苷酸類似物所制備的DNA或RNA類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選雙鏈DNA。
“分離的”核酸分子是從核酸分子的天然來源中所存在的其它核酸分子中分離的核酸分子。優(yōu)選地，在該核酸所源自的生物體基因組DNA中，“分離的”核酸分子不具備側(cè)接該核酸的天然(即，位于該核酸5′和3′末端的序列)序列(優(yōu)選蛋白編碼序列)。例如，在各種實施方案中，該分離的核酸分子可含有低于約5kB，4kB，3kB，2kB，1kB，0.5kB或0.1kB的在該核酸分子源自的細胞基因組DNA中側(cè)接該核酸分子的天然核苷酸序列。此外，“分離的“核酸分子，如cDNA分子，當通過重組技術(shù)上生產(chǎn)時，可基本上不含有其它細胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或當化學合成時，基本上不含有化合物前體或其它化合物。
可使用標準的分子生物學技術(shù)和本文所述的數(shù)據(jù)庫記錄的序列信息分離本發(fā)明的核酸分子。使用所記錄的核酸序列的全部或部分，使用標準的雜交和克隆技術(shù)可分離本發(fā)明的核酸分子(如，描述于Sambrook等，編.，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。
根據(jù)標準PCR擴增技術(shù)，使用cDNA、mRNA或基因組DNA作為模板和合適的寡核苷酸引物可擴增本發(fā)明的核酸分子。所擴增的核酸可克隆自合適的載體中并通過DNA序列分析來鑒定。此外，通過標準的合成技術(shù)，如使用自動DNA合成儀，可制備相應于本發(fā)明核酸分子的全部或部分的核苷酸。
在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明分離的核酸分子包含具有與標記物核酸的核苷酸序列或編碼標記物蛋白的核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的核酸分子。與給定的核苷酸序列互補的核酸分子是一種與給定的核苷酸序列完全互補，并能與所給定的核苷酸序列雜交從而形成穩(wěn)定的雙鏈體。
此外，本發(fā)明的核酸分子可僅包含部分核酸序列，其中全長的核酸序列包含標記物核酸或編碼標記物蛋白。這樣的核酸可用作為，例如，探針或引物。通常用一或多種基本上純化的寡核苷酸作為探針/引物。該寡核苷酸通常包含在嚴謹條件下能與本發(fā)明的核酸的至少約7，優(yōu)選約15，更優(yōu)選約25，50，75，100，125，150，175，200，250，300，350或400或更多的連續(xù)核苷酸雜交的核苷酸序列的一個區(qū)。
基于本發(fā)明的核酸分子序列的探針可用于檢測相應于本發(fā)明一或多個標記物的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或基因組序列。該探針包含附于其上的標記基團，如，放射性同位素、熒光化合物、酶、或酶輔因子。這樣的探針可用作為用于鑒定蛋白表達異常的細胞或組織的診斷試劑盒的一部分，例如通過測定患者細胞樣本中編碼蛋白的核酸分子的水平，如檢測mRNA水平或確定編碼該蛋白的基因是否已突變或缺失。
本發(fā)明進一步包含由于遺傳密碼簡并性而不同于編碼標記物蛋白(如，具有列于序列表中氨基酸序列之一的蛋白)的核酸的核苷酸序列的核酸分子，并因此編碼同樣的蛋白。
本領域的技術(shù)人員可以理解的是DNA序列多態(tài)性導致的氨基酸序列改變可存在于種群中(如，人群中)。由于等位基因自然變異，這樣的遺傳多態(tài)性可在種群的個體間存在。等位基因是可選擇出現(xiàn)在給定的基因位點的一組基因之一。此外，可以理解的是影響RNA表達水平的DNA多態(tài)性也存在可影響該基因總的表達水平(如，通過影響調(diào)控或降解)。
在本文中使用時，詞組“等位基因變體”指在給定的位點出現(xiàn)的核苷酸序列或指該核苷酸序列編碼的多肽。
在本文中使用時，術(shù)語“基因”和“重組基因”指包含編碼相應于本發(fā)明標記物多肽的開放閱讀框的核酸分子。在給定基因的核苷酸序列中該天然產(chǎn)生的等位基因變體通常能導致1-5％變異。通過對許多不同個體中感興趣的基因測序可鑒定可選擇的等位基因。通過使用雜交探針來鑒定不同個體中此同樣的基因位點可容易地進行上述鑒定。任一和所有這樣的核苷酸變體和產(chǎn)生的氨基酸多態(tài)性或變體是天然等位基因變異的結(jié)果，并且不改變本發(fā)明保護范圍所規(guī)定的功能活性。
在另一個實施方案中，本發(fā)明分離的核酸分子長度至少是7，15，20，25，30，40，60，80，100，150，200，250，300，350，400，450，550，650，700，800，900，1000，1200，1400，1600，1800，2000，2200，2400，2600，2800，3000，3500，4000，4500，或更多個核苷酸，并在嚴謹條件下與標記物核酸或與編碼標記物蛋白的核酸雜交。在本文中使用時，術(shù)語“在嚴謹條件下雜交”是用來描述用于雜交和洗滌的條件，在該條件下，彼此之間具有至少60％(65％，70％，優(yōu)選75％)同一性的核苷酸序列通常仍能互相雜交。這樣的嚴謹條件為本領域技術(shù)人員所眾所周知，并能在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)6.3.1-6.3.6節(jié)中找到。一個優(yōu)選的，非限制性的嚴謹雜交條件的例子是在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，在45℃下雜交，接著用0.2X SSC，0.1％SDS在50-65℃下洗滌一或多次。
除了能存在于種群中的本發(fā)明核酸分子的天然存在的等位基因變體外，本領域的技術(shù)人員可進一步理解能通過突變導入序列改變，因此導致了所編碼蛋白的氨基酸序列的改變，但不改變所編碼蛋白的生物活性。例如，可進行核苷酸取代導致在“非必需的”氨基酸殘基處的氨基酸取代。“非必需的”氨基酸殘基是一種在野生型序列中能被改變但不改變生物活性的殘基，但是，“必需的”氨基酸殘基對生物活性而言是必需的。例如，對于活性而言，在不同物種同系物之間非保守的或僅是半保守的氨基酸殘基可能是非必需的，因此很可能成為改變的對象?？蛇x地，對于活性而言，在不同物種(如，鼠和人)同系物之間保守的氨基酸殘基可能是必需的，因此就不可能作為改變的對象。
因此，本發(fā)明的另一個方面是關于編碼不同標記物蛋白的核酸分子，該標記物蛋白含有對于活性而言是非必需的氨基酸殘基改變。這樣的標記物蛋白變體的氨基酸序列不同于天然存在的標記物蛋白，但仍保持生物活性。在一個實施方案中，這樣一個標記物蛋白變體具有與標記物蛋白的氨基酸序列至少約40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或98％同一性的氨基酸序列。
通過在標記物核酸的核苷酸序列中導入一或多個核苷酸取代、添加或缺失得到編碼標記物蛋白變體的分離的核酸分子，使得一或多個氨基酸殘基取代、添加或缺失導入所編碼的蛋白。通過標準技術(shù)可導入突變，如定點誘變和PCR-介導的誘變。優(yōu)選地，在一或多個預測的非必需氨基酸殘基處進行保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”指氨基酸殘基被具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基所取代。在本領域中已經(jīng)定義了具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸殘基(如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，酸性側(cè)鏈的氨基酸殘基(如，天冬氨酸、谷氨酸)，不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸殘基(如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非極性側(cè)鏈的氨基酸殘基(如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，β-分支側(cè)鏈的氨基酸殘基(如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈的氨基酸殘基(如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)?？蛇x地，突變可隨機導入編碼序列的全部或部分中，如通過飽和誘變，可通過鑒定仍保持活性的突變體的生物活性來篩選所產(chǎn)生的突變體。在誘變后，重組表達編碼蛋白并測定該蛋白活性。
本發(fā)明包含反義核酸分子，即能與本發(fā)明的有義核酸互補的分子，如，與雙鏈標記物cDNA分子的編碼鏈互補或與標記物mRNA序列互補。因此，本發(fā)明的反義核酸能通過氫鍵(即，退火)與本發(fā)明的有義核酸結(jié)合。該反義核酸能與完整編碼鏈或其部分互補，如，蛋白編碼區(qū)(或開放閱讀框)的全部或部分。反義核酸分子也可以與編碼標記物蛋白的核苷酸序列的編碼鏈的非編碼區(qū)的全部或部分反義。非編碼區(qū)(“5′和3′非翻譯區(qū)”)是側(cè)接在編碼區(qū)且不翻譯為氨基酸的5′和3′序列。
反義寡核苷酸長度可以是，例如，約5，10，15，20，25，30，35，40，45或50或更多個核苷酸。使用本領域已知的化學合成和酶連反應方法可得到本發(fā)明的反義核酸。例如，使用天然存在的核苷酸或設計用于增加分子生物學穩(wěn)定性或增加在反義和有義核酸之間形成的雙鏈的物理穩(wěn)定性的不同的修飾的核苷酸的可化學合成反義核酸，如可使用磷硫酰衍生物和吖啶取代的核苷酸?？捎糜诋a(chǎn)生反義核酸的修飾的核苷酸的例子包括5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黃嘌呤，黃嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羥甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基-2-硫尿核苷，5-羧甲基氨甲基尿嘧啶，二氫尿嘧啶，β-D-半乳糖基queosine，肌苷，N6-異戊烯腺嘌呤，1-甲基鳥嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鳥嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鳥嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鳥嘌呤，5-甲基氨甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-甘露糖基queosine，5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基硫代-N6-異戊烯腺嘌呤，尿嘧啶-5-乙醇酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-巰基胞嘧啶，5-甲基-2-巰基尿嘧啶，2-巰基尿嘧啶，4-巰基尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-乙醇酸甲酯，尿嘧啶-5-乙醇酸(v)，5-甲基-2-巰基尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-3-羧丙基)尿嘧啶，(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤?？蛇x地，可用生物學方法產(chǎn)生反義核酸，該方法使用表達載體，其中核酸已被亞克隆入該載體的反義方向(即，由插入的核酸轉(zhuǎn)錄的RNA與感興趣的靶核酸呈反義方向，在以下部分作進一步說明)。
通常給予受試者本發(fā)明的反義核酸分子，或在原位產(chǎn)生該反義核酸分子以使它們與編碼標記物蛋白的細胞mRNA和/或基因組DNA雜交或結(jié)合以抑制標記物的表達，如，通過抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。雜交通過常規(guī)的核苷酸互補可形成穩(wěn)定的雙鏈體，或，例如，通過雙螺旋的大溝中的特異性相互作用，在這種情況下，反義核酸分子結(jié)合DNA雙鏈體。給予本發(fā)明反義核酸分子的途徑的例子包括在組織部位直接注射或?qū)⒎戳x核酸灌輸入子宮頸相關的體液中。可選地，可修飾反義核酸分子以靶定所選擇的細胞，和接著通過全身方式給予。例如，對于全身性給藥而言，可修飾反義核酸使之與所選擇的細胞表面的受體或表達的抗原特異性結(jié)合，如，通過將反義核酸分子與肽或抗體連接，所述肽或抗體與細胞表面受體或抗原結(jié)合。使用本文中所述的載體也可將反義核酸分子遞送至細胞中。為達到反義分子足夠的細胞內(nèi)濃度，優(yōu)選在載體構(gòu)建體中反義核酸分子可置于強pol II或pol III啟動子的控制下。
本發(fā)明的反義核酸分子可以是α-端基核酸分子。α-端基核酸分子難過與互補的RNA形成特殊的雙鏈雜合體，與通常使用的α-單位不同，鏈之間互相平行延伸(Gaultier等，1987，Nucleic Acids Res.156625-6641)。反義核酸分子也可包含2′-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等.，1987，Nucleic Acids Res.156131-6148)或嵌合的RNA-DNA類似物(Inoue等，1987，F(xiàn)EBS Lett.215327-330)。
本發(fā)明也包含核酶。核酶是催化性RNA分子，其具有核糖核酸酶活性，能裂解單鏈核酸，如mRNA，其具有與所裂解的單鏈核酸互補的互補區(qū)。因此，核酶(如，在Haselhoff和Gerlach，1988，Nature334585-591中所述的錘頭狀核酶)可用于催化裂解mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物由此抑制mRNA編碼蛋白的翻譯?；谙鄳谠摌擞浳锏腸DNA的核苷酸序列，可設計對編碼標記物蛋白的核酸分子具有特異性的核酶。例如，可構(gòu)建四膜蟲(Tetrahymena)L-19 IVS RNA的衍生物，其中，活性部位的核苷酸序列與要裂解的核苷酸序列互補(見，Cech等，美國專利第4,987,071號；和Cech等，美國專利第5,116,742號)。可選地，編碼本發(fā)明多肽的mRNA可用于從RNA分子庫中選擇具有特定核糖核酸酶活性的催化性RNA(參見如Bartel和Szostak，1993，Science2611411-1418)。
本發(fā)明也包含形成三螺旋結(jié)構(gòu)的核酸分子。例如，通過將靶核苷酸序列與編碼標記物核酸或蛋白的基因的調(diào)控區(qū)(如，啟動子和/或增強子)互補以形成三螺旋結(jié)構(gòu)阻止了該基因在靶細胞中的轉(zhuǎn)錄，來抑制本發(fā)明標記物的表達。通常見Helene(1991)Anticancer Drug Des.6(6)569-84；Helene(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.66027-36；和Maher(1992)Bioassays 14(12)807-15。
在各種實施方案中，可修飾本發(fā)明核酸分子的堿基部分、糖部分或磷酸酯主鏈以改良，如分子的穩(wěn)定性、雜交性或溶解性。例如，可修飾核酸的脫氧核糖磷酸酯主鏈以產(chǎn)生肽核酸(見，Hyrup等，1996，Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1)5-23)。在本文中使用時，術(shù)語“肽核酸”或“PNAs”指核酸模擬物，如，DNA模擬物，其中偽肽(pseudopeptide)主鏈取代了脫氧核糖磷酸主鏈，且僅保留有4種天然核苷堿基。在低離子強度的條件下，已顯示PNAs中性主鏈可與DNA和RNA特異性雜交。可通過使用標準固相肽合成技術(shù)進行PNA寡聚體的合成，如描述于Hyrup等.(1996)，出處同上；Perry-O′Keefe等.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9314670-675。
PNAs可作為治療和診斷應用。例如，PNAs可用作為反義或反基因(antigene)試劑用于基因表達的序列特異性調(diào)控，通過如，在基因中分析單堿基配對突變，通過如，PNA定向PCR鉗制(clamping)；當與其它酶(如S1核酸酶)結(jié)合使用時，作為人工限制性酶(Hyrup(1996)，出處同上)；或作為DNA測序和雜交的探針或引物(Hyrup，1996，出處同上；Perry-O′Keefe等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9314670-675)。
在另一個實施方案中，通過在PNA上連接親脂性或其它輔助基團，通過形成PNA-DNA嵌合體，或通過使用脂質(zhì)體或其它本領域已知的藥物遞送技術(shù)可修飾PNAs，如以增加它們的穩(wěn)定性或細胞攝取能力。例如，產(chǎn)生的PNA-DNA嵌合體可將PNA和DNA的有益特性結(jié)合。當PNA部分能提供高親和力和特異性時，這樣的嵌合體允許DNA識別與DNA部分相互作用的酶，如核糖核酸酶H和DNA聚合酶。使用合適長度的接頭可連接PNA-DNA嵌合體，根據(jù)堿基堆積、在核堿基之間鍵的數(shù)目和取向選擇接頭(Hyrup，1996，出處同上)。根據(jù)Hyrup(1996)，出處同上，和Finn等.(1996)Nucleic Acids Res.24(17)3357-63所描述的方法進行PNA-DNA嵌合體的合成。例如，，使用標準的亞磷酰胺偶聯(lián)化學和修飾的核苷類似物在固相支持物上合成DNA鏈。化合物，如5′-(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5′-脫氧-胸苷亞磷酰胺可用于連接PNA和DNA的5′末端(Mag等，1989，Nucleic AcidsRes.175973-88)。接著以逐步進行的方法偶聯(lián)上PNA單體以產(chǎn)生具有5′PNA片段和3′DNA片段的嵌合分子(Finn等，1996，Nucleic AcidsRes.24(17)3357-63)?？蛇x地，可合成具有5′DNA片段和3′PNA片段的嵌合分子(Peterser等，1975，Bioorganic Med.Chem.Lett.51119-11124)。
在另一個實施方案中，寡核苷酸包括其它附加的基團如肽(如，用于體內(nèi)靶定宿主細胞受體)，或有利于轉(zhuǎn)運通過細胞膜(參見如Letsinger等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866553-6556；Lemaitre等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84648-652；PCT公開號WO88/09810)或血腦屏障的試劑(參見如PCT公開號WO 89/10134)。此外，可用啟動的雜交裂解試劑修飾寡核苷酸(參見如，Krol等，1988，Bio/Techniques 6958-976)或嵌入試劑(參見如，Zon，1988，Pharm.Res.5539-549)。為此，寡核苷酸可與其它分子綴合，如，肽、啟動雜交的交聯(lián)劑、運輸載體、啟動雜交的裂解劑等。
本發(fā)明也包括分子信標核酸，其具有至少一個區(qū)，該區(qū)能與本發(fā)明核酸互補，使得該分子信標可用于樣本中本發(fā)明核酸的定量?！胺肿有艠恕焙怂崾且环N包含一對互補區(qū)并具有與之相連的熒光團和熒光猝滅劑的核酸。熒光團和猝滅劑以這樣的定向連接于該核酸的不同部分，當互補區(qū)相互退火時，猝滅劑猝滅了熒光團的熒光。當該核酸的互補區(qū)彼此間不退火時，熒光團的熒光被猝滅到較低程度。分子信標核酸描述于，例如，美國專利第5,876,930號中。
II.分離的蛋白和抗體本發(fā)明的一個方面涉及分離的標記物蛋白及其生物活性部分，也關于合適作為免疫原來提取抗標記物蛋白或其片段的抗體的多肽片段。在一個實施方案中，通過使用標準蛋白純化技術(shù)的合適純化方法可從細胞或組織來源的物質(zhì)中分離出天然的標記物蛋白。在另一個實施方案中，通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生包含標記物蛋白全部或片段的蛋白或肽。對于重組表達，還可選擇的是使用化學肽合成技術(shù)合成這樣的蛋白或肽。
“分離的”或“純化的”蛋白或其生物活性片段是基本上不含有來自產(chǎn)生該蛋白的細胞或組織來源的細胞物質(zhì)或其它污染蛋白，或當化學合成時，基本上不含有化合物前體或其它化合物。術(shù)語“基本上不含有細胞物質(zhì)”包括在蛋白制備物，其中該蛋白與其中分離或重組產(chǎn)生這種蛋白的細胞的細胞成分分離。因此，蛋白基本上不含有細胞物質(zhì)，包括具有小于約30％，20％，10％或5％(干重)的異源蛋白(在本文中也稱為“污染蛋白”)的蛋白制備物。當該蛋白或其生物活性部分是重組產(chǎn)生時，也優(yōu)選實際上不含有培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基含量小于約20％，10％或5％的蛋白制備物的體積。當該蛋白通過化學合成產(chǎn)生時，優(yōu)選基本上不含有化合物前體或其它化合物，即，在蛋白的合成過程中與化合物前體或其它化合物分離。因此，這樣的蛋白制備物具有小于約30％，20％，10％，5％(干重)的化合物前體或除了感興趣的多肽外的化合物。
標記物蛋白的生物活性部分包括多肽，該多肽包含與標記物蛋白的氨基酸序列基本上同一的或源自其的氨基酸序列，包括與全長蛋白相比更少的氨基酸，并顯示相應全長蛋白的至少一種活性。通常，生物活性部分包含一個具有相應全長蛋白的至少一種活性的區(qū)域或基序。本發(fā)明標記物蛋白的生物活性部分可以是一種多肽，其長度是，例如10，25，50，100或更多個氨基酸。而且，在標記物蛋白所缺失的其它區(qū)域的其它生物活性部分可通過重組技術(shù)制備，并用于鑒定天然形式標記物蛋白的一或多種功能活性。
優(yōu)選的標記物蛋白編碼自核苷酸序列包含列于序列表中任一序列的序列。其它有用的蛋白與這些序列之一是基本上同一的(如，至少約40％，優(yōu)選50％，60％，70％，80％，90％，95％或99％)，且保留相應天然存在的標記物蛋白的功能活性，但由于天然等位基因變異或誘變在氨基酸序列上不同。
為測定兩個氨基酸序列或兩個核酸之間的同一性百分數(shù)，比對序列以尋求最佳的比較效果(如，可在第一個氨基酸或核酸序列中導入空位以與第二個氨基酸或核酸序列進行最佳的比對)。接著比較在相應的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸。當在第一個序列中一個位置與第二個序列中相應位置被同樣的氨基酸或核苷酸占據(jù)時，那么該分子在該位點是相同的。兩個序列間的同一性百分數(shù)序列所具有相同位置的數(shù)量的函數(shù)(即，％同一性＝#相同的位置數(shù)/總的#位置數(shù)(如，重疊的位置)×100)。在一個實施方案中，兩個序列具有相同的長度。
可使用數(shù)學算法來確定兩個序列之間的同一性百分數(shù)。一個優(yōu)選的，非限制性的用于比較兩個序列數(shù)學算法例子是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268的算法，其改良自Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877的算法。該算法被并入Altschul，等.(1990)J.Mol.Biol.215403-410的BLASTN和BLASTX程序中?？捎肂LASTN程序進行BLAST核苷酸搜索，得分＝100，字符長度＝12以獲得與本發(fā)明核酸分子同源的核酸序列?？捎肂LASTP程序進行BLAST蛋白搜索，得分＝50，字符長度＝3以獲得與本發(fā)明蛋白分子同源的氨基酸序列。為獲得用于比較目的的空位比對，可使用Altschul等.(1997)Nucleic Acids Res.253389-3402中所描述的稱為有空位的(Gapped)BLAST的新版本BLAST算法，對于BLASTN，BLASTP和BLASTX程序，其能執(zhí)行局部空位比對。可選地，PSI-Blast可用于執(zhí)行重復搜索檢測兩個分子之間的遠緣關系。當使用BLAST，有空位的BLAST和PSI-Blast程序時，使用各個程序(如，BLASTX和BLASTN)的默認參數(shù)。見http//www.ncbi.nlm.nih.gov。另一個優(yōu)選的，非限制性的用于序列比較的算法例子是Myers和Miller，(1988)CABIOS 411-17的算法。該算法被并入ALIGN程序(2.0版)中，該程序是GCG序列比對軟件包的一部分。當使用ALIGN程序用于比較氨基酸序列時，可使用PAM120權(quán)重殘基表，空位長度罰分為12，和空位罰分為4。然而另一個對于鑒定局部序列區(qū)域相似性和比對的有用的算法是FASTA算法，描述于Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444-2448。當使用FASTA算法用于比較核苷酸或氨基酸序列時，例如，可使用具有κ-元組值為2的PAM 120權(quán)重殘基表。
使用類似于那些上述的，允許有或不允許有空位的方法，可確定兩個序列之間的同一性百分數(shù)。在計算同一性百分數(shù)中，僅有準確匹配被計算在內(nèi)。
本發(fā)明也提供包含標記物蛋白或其片段的嵌合或融合蛋白。在本文中使用時，“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含可操作地連接到異源多肽(即，不同于標記物蛋白的多肽)的標記物蛋白的全部或部分(優(yōu)選生物活性部分)。在融合蛋白中，術(shù)語“可操作地連接”用來表示標記物蛋白或其片段和異源多肽互相進行符合讀框的融合。異源多肽可融合到標記物蛋白或片段的氨基末端或羧基末端。
一種有用的融合蛋白是GST融合蛋白，其中標記物蛋白或片段融合到GST序列的羧基末端。這樣的融合蛋白能方便本發(fā)明重組多肽的純化。
在另一個實施方案中，融合蛋白在其氨基末端含有異源信號序列。例如，能除去標記物蛋白的天然信號序列并用來自另外蛋白的信號序列取代。例如，桿狀病毒包膜蛋白的gp67分泌序列可用作為異源信號序列(Ausubel等，編，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY，1992)。其它真核異源信號序列的例子包括蜂毒肽和人胎盤堿性磷酸酶的分泌序列(Stratagene；La Jolla，California)。還在另一個例子中，有用的原核異源信號序列包括phoA分泌信號(Sambrook等，出處同上)和蛋白A分泌信號(PharmaciaBiotech；Piscataway，New Jersey)。
還在另一個實施方案中，融合蛋白是一種免疫球蛋白融合蛋白，其中標記物蛋白的全部或部分與源自免疫球蛋白家族一員的序列融合。本發(fā)明的免疫球蛋白融合蛋白可摻入藥物組合物中并給予患者以抑制配體(可溶的或膜結(jié)合的)與細胞表面蛋白(受體)之間的相互作用，因此抑制了體內(nèi)信號轉(zhuǎn)導。免疫球蛋白融合蛋白可用于影響標記物蛋白的同源配體的生物利用度。配體/受體相互作用的抑制在治療上能用于治療增生和分化紊亂，并用于調(diào)節(jié)(如，促進或抑制)細胞存活。此外，本發(fā)明的免疫球蛋白融合蛋白可用作為免疫原在患者體中來產(chǎn)生抗標記物蛋白的抗體，來純化配體和在篩選試驗中鑒定抑制標記物蛋白與配體相互作用的分子。
本發(fā)明的嵌合和融合蛋白可通過標準的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。在另一個實施方案中，通過常規(guī)技術(shù)包括自動化DNA合成儀可合成融合基因。可選地，使用錨定引物可進行基因片段的PCR擴增，所述錨定引物產(chǎn)生了兩個連續(xù)的基因片段之間的互補的突出物，所述突出物隨后退火并再擴增產(chǎn)生嵌合基因序列(參見如，Ausubel等，出處同上)。此外，許多也編碼融合部分(如，GST多肽)的表達載體是商業(yè)上可獲得的。編碼本發(fā)明多肽的核酸可克隆入上述表達載體中使得融合部分與本發(fā)明的多肽進行符合讀框的連接。
使用信號序列可便于標記物蛋白的分泌和分離。信號序列通常通過疏水氨基酸核而被鑒定，在一或更多的裂解過程中該疏水氨基酸核通常裂解自分泌過程中的成熟蛋白。當成熟蛋白通過分泌途徑時，含有加工位點的上述信號肽可允許信號序列從成熟蛋白上裂解下來。因此，本發(fā)明涉及具有信號序列的標記物蛋白、融合蛋白或其片段，以及涉及信號序列已經(jīng)蛋白水解裂解的上述蛋白(即，裂解產(chǎn)物)。在一個實施方案中，在表達載體中編碼信號序列的核酸序列能可操作地連接感興趣的蛋白，如標記物蛋白或其片段。信號序列指導蛋白的分泌，如從該表達載體所轉(zhuǎn)染的真核宿主中，且該信號序列隨后或同時被裂解。接著通過本領域所眾所周知的方法能容易地從細胞外培養(yǎng)基中純化蛋白。可選地，通過使用能便于純化的序列，如具有GST結(jié)構(gòu)域的，信號序列能被連接到感興趣的蛋白。
本發(fā)明也涉及標記物蛋白變體。該變體具有改變的氨基酸序列，其能起激動劑(模擬物)或拮抗劑的作用。通過誘變作用能產(chǎn)生變體，如不連續(xù)的點突變或截短。激動劑能基本上保持相同或部分的蛋白天然存在形式的生物活性。蛋白的拮抗劑能抑制一或多種蛋白天然存在形式的活性，通過例如，競爭性結(jié)合細胞信號級聯(lián)的下游或上游元件，包括感興趣的蛋白。因此，通過用具有有限功能的變體治療能引發(fā)特定的生物效應。相對于用蛋白天然形式的治療，用具有部分蛋白天然存在形式的生物活性的變體治療患者可在患者中產(chǎn)生更少的副作用。
能起激動劑(模擬物)或拮抗劑作用的標記物蛋白變體可通過篩選本發(fā)明蛋白的突變體組合文庫，如截短突變體組合文庫，以鑒定激動劑或拮抗劑活性。在一個實施方案中，通過在核酸水平上組合誘變產(chǎn)生變體雜文庫(variegated library)，以及該變體雜文庫編碼自雜基因文庫(variegated gene library)。變體雜文庫可通過，例如，合成的寡核苷酸混合物通過酶連接入基因序列，使得潛在蛋白序列的簡并組表達為單獨多肽，或可選地，表達為一組大的融合蛋白(如，對于噬菌體展示而言)。許多方法能用于從簡并的寡核苷酸序列產(chǎn)生標記物蛋白潛在變體文庫。用于合成簡并寡核苷酸的方法是本領域眾所周知的(見，例如，Narang，1983，Tetrahedron 393；Itakura等，1984，Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura等，1984，Science 1981056；Ike等，1983 Nucleic Acid Res.11477)。
另外，標記物蛋白片段文庫可用于產(chǎn)生多肽雜群(variegatedpopulation)用于篩選和隨后標記物蛋白或其片段變體的選擇。例如，可產(chǎn)生編碼序列片段文庫，包括通過在每個分子僅存在約一個切口條件下，用核酸酶處理感興趣的編碼序列的雙鏈標準PCR片段，退火該雙鏈DNA，復性該DNA以形成雙鏈DNA，該雙鏈DNA包括來自不同帶切口產(chǎn)物的有義/反義對，通過用S1核酸酶從重新形成的雙鏈體上切除單鏈部分，并將產(chǎn)生的片段連接如表達載體中。通過這種方法，可得到編碼不同大小的感興趣蛋白氨基末端和內(nèi)部片段的表達文庫。
本領域已知一些技術(shù)，可用于篩選通過點突變或截短產(chǎn)生的組合文庫基因產(chǎn)物，和用于篩選具有所選特性的基因產(chǎn)物的cDNA文庫。最普遍使用的技術(shù)應適用于高通量分析，對于篩選大基因文庫而言，通常包括將基因文庫克隆入可復制的表達載體中，用所產(chǎn)生的載體文庫轉(zhuǎn)染合適的細胞，和在其中所需活性的檢測便于編碼其產(chǎn)物被檢測的基因的載體的分離的條件下，表達該組合基因?；貧w總體誘變(REM)，一種能增加功能突變體在文庫中出現(xiàn)頻率的技術(shù)，可與篩選試驗結(jié)合使用來鑒定本發(fā)明蛋白的變體(Arkin和Yourvan，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897811-7815；Delgrave等，1993，ProteinEngineering 6(3)327-331)。
本發(fā)明另一個方面涉及抗本發(fā)明蛋白的抗體。在優(yōu)選實施方案中，該抗體特異性結(jié)合標記物蛋白或其片段。可交換使用的術(shù)語“抗體”和“抗體”指免疫球蛋白分子和包含其免疫活性部分的片段和衍生物(即，上述部分含有抗原結(jié)合位點，其能特異性結(jié)合抗原，例如標記物蛋白，如標記物蛋白的表位)。能特異性結(jié)合本發(fā)明蛋白的抗體是一種能結(jié)合該蛋白，但在樣本中，如天然含有該蛋白的生物樣本中基本上不結(jié)合其它分子的抗體。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的例子包括，但不限于，單鏈抗體(scAb)、F(ab)和F(ab′)2片段。
本發(fā)明分離的蛋白或其片段可用作為免疫原來產(chǎn)生抗體。可使用全長蛋白或，可選地，本發(fā)明提供了用作為免疫原的抗原肽片段。本發(fā)明蛋白的抗原肽包含至少8個(優(yōu)選10，15，20或30或更多個)本發(fā)明蛋白之一的氨基酸序列的氨基酸殘基，和包含至少一個該蛋白的表位，使產(chǎn)生的抗該肽抗體與該蛋白形成免疫復合物。優(yōu)選的表位包含位于蛋白表面區(qū)，如親水區(qū)的抗原肽。疏水性序列分析、親水性序列分析、或類似的分析可用于鑒定親水區(qū)。在優(yōu)選的實施方案中，一種分離的標記物蛋白或其片段用作為免疫原。
免疫原通常用于制備抗體，通過免疫合適的(即，免疫活性的)對象，如兔、山羊、小鼠或其它哺乳動物或脊椎動物。一種合適的免疫原制劑包含，例如，重組體表達或化學合成的蛋白或肽。該制劑可進一步包括一種佐劑，如福氏完全或不完全佐劑，或一種類似的免疫刺激劑。優(yōu)選的免疫原組合物是那些不含有其它人蛋白的，例如，使用非人宿主細胞重組表達本發(fā)明蛋白得到的免疫原組合物。在該方法中，所產(chǎn)生的抗體組合物具有與除本發(fā)明蛋白外的其它人蛋白減少的結(jié)合或不結(jié)合。
本發(fā)明提供了多克隆和單克隆抗體。術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”，在本文中使用時，指僅含有一種能與特定的表位起免疫反應的抗原結(jié)合位點的抗體分子的群體。優(yōu)選的多克隆和單克隆抗體組合物是一種抗本發(fā)明蛋白的抗體已選擇的組合物。特別優(yōu)選的多克隆和單克隆抗體制劑是一種僅含有抗標記物蛋白或其片段的抗體的制劑。
多克隆抗體可通過用本發(fā)明的蛋白作為免疫原免疫合適的對象制備。通過標準方法可全程監(jiān)測免疫對象中的抗體濃度，如通過使用固定化多肽的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。在免疫后的合適時間點，如，當特異性抗體濃度最高時，從對象中獲得產(chǎn)生抗體的細胞并通過標準技術(shù)用于制備單克隆抗體(mAb)，如雜交瘤技術(shù)，最初描述于Kohler和Milstein(1975)Nature 256495-497，人B細胞雜交瘤技術(shù)(見Kozbor等，1983，Immunol.Today 472)，EBV-雜交瘤技術(shù)(見Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy中pp.77-96，AlanR.Liss，Inc.，1985)或三體雜交瘤技術(shù)。用于產(chǎn)生雜交瘤的技術(shù)是眾所周知的(通常見，Current Protocols in Immunology，Coligan等，編，John Wiley & Sons，New York，1994)。通過對雜交瘤培養(yǎng)物上清液篩選結(jié)合感興趣多肽的抗體可檢測產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤細胞，如，使用標準ELISA方法。
可選的為制備分泌單克隆抗體的雜交瘤，通過用感興趣的多肽篩選組合免疫球蛋白文庫(如，抗體噬菌體展示文庫)可鑒定并分離抗本發(fā)明蛋白的單克隆抗體。用于產(chǎn)生和篩選噬菌體展示文庫的試劑盒是商業(yè)上可獲得的(如，Pharmacia重組噬菌體抗體系統(tǒng)，目錄號27-9400-01；和Stratagene SurfZAP噬菌體展示試劑盒，目錄號240612)。此外，特別適用于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫的方法和試劑的例子可發(fā)現(xiàn)于，例如，美國專利第5,223,409號；PCT公開號WO 92/18619；PCT公開號WO 91/17271；PCT公開號WO 92/20791；PCT公開號WO92/15679；PCT公開號WO 93/01288；PCT公開號WO 92/01047；PCT公開號WO 92/09690；PCT公開號WO 90/02809；Fuchs等.(1991)Bio/Technology 91370-1372；Hay等.(1992)Hum.Antibod.Hybridomas381-85；Huse等.(1989)Science 2461275-1281；Griffiths等.(1993)EMBO J.12725-734。
本發(fā)明也提供了特異性結(jié)合本發(fā)明蛋白的重組抗體。在優(yōu)選的實施方案中，該重組抗體特異性結(jié)合標記物蛋白或其片段。重組抗體包括，但不限于，嵌合和人源化單克隆抗體，包含人和非人部分，單鏈抗體或多特異性抗體。嵌合抗體是一種其中不同部分源自不同動物種類的分子，如那些具有源自鼠mAb的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的(參見如Cabilly等，美國專利第4,816,567號；和Boss等，美國專利第4,816,397號，其全文在此合并作為參考)。單鏈抗體具有由單個多肽組成的抗原結(jié)合位點。它們可通過本領域已知的技術(shù)生產(chǎn)，例如使用描述于Ladner等，美國專利第4,946,778號(其全文在此合并作為參考)；Bird等，(1988)Science 242423-426；Whitlow等，(1991)Methods in Enzymology 21-9；Whitlow等，(1991)Methods inEnzymology 297-105；和Huston等，(1991)Methods in EnzymologyMolecular Design and ModelingConcepts and Applications 20346-88的方法。多特異性抗體是具有至少兩個特異性結(jié)合不同抗原的抗原結(jié)合位點的抗體分子。這樣的分子可通過本領域已知的技術(shù)生產(chǎn)，例如使用描述于Segal，美國專利第4,676,980號(其所公開的全文在此合并作為參考)；Holliger等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448；Whitlow等，(1994)Protein Eng.71017-1026和美國專利第6,121,424號的方法。
人源化抗體是來自非人物種的具有一或多個來自非人物種互補決定區(qū)(CDRS)和來自人免疫球蛋白分子框架區(qū)的抗體分子(參見如，Queen，美國專利第5,585,089號，其全文在此合并作為參考)。人源化單克隆抗體可通過本領域已知的重組DNA技術(shù)生產(chǎn)，例如使用描述于PCT公開號WO 87/02671；歐洲專利申請?zhí)?84,187；歐洲專利申請?zhí)?71,496；歐洲專利申請?zhí)?73,494；PCT公開號WO86/01533；美國專利第4,816,567號；歐洲專利申請?zhí)?25,023；Better等.(1988)Science2401041-1043；Liu等.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 843439-3443；Liu等.(1987)J.Immunol.1393521-3526；Sun等.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84214-218；Nishimura等.(1987)Cancer Res.47999-1005；Wood等.(1985)Nature 314446-449；和Shaw等.(1988)J.Natl.Cancer Inst.801553-1559)；Morrison(1985)Science2291202-1207；Oi等.(1986)Bio/Techniques 4214；美國專利第5,225,539號；Jones等.(1986)Nature 321552-525；Verhoeyan等.(1988)Science 2391534；和Beidler等.(1988)J.Immunol.1414053-4060。
更優(yōu)選地，人源化抗體可產(chǎn)生自，例如，使用不能表達內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因，但能表達人重鏈和輕鏈基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。用選定的抗原，如相應于本發(fā)明標記物的多肽的全部或部分，以常規(guī)方法免疫轉(zhuǎn)基因小鼠。使用常規(guī)雜交瘤技術(shù)可獲得抗該抗原的單克隆抗體。通過在B細胞分化過程中轉(zhuǎn)基因小鼠重排，進行了人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因，和隨后經(jīng)歷了類轉(zhuǎn)換和體細胞突變。因此，使用該技術(shù)，可產(chǎn)生在治療上有用的IgG、IgA和IgE抗體。用于生產(chǎn)人抗體該技術(shù)的綜述見Lonberg和Huszar(1995)Int.Rev.Immunol.1365-93)。用于生產(chǎn)人抗體和人單克隆抗體技術(shù)的詳細討論以及用于生產(chǎn)上述抗體的實驗方法參見如美國專利第5,625,126號；美國專利第5,633,425號；美國專利第5,569,825號；美國專利第5,661,016號和美國專利第5,545,806號。此外，公司如Abgenix，Inc.(Freemont，CA)使用類似于上述的技術(shù)可允諾提供抗選定的抗原的人抗體。
使用稱為“引導選擇”的技術(shù)可產(chǎn)生識別選定表位的完整人抗體。在該方法中，選定的非人單克隆抗體，如鼠抗體，被用于引導選擇識別相同表位的完整人抗體(Jespers等，1994，Bio/technology 12899-903)。
本發(fā)明的抗體在產(chǎn)生(如，從對象的血液或血清)或合成后可通過眾所周知的技術(shù)分離，并進一步純化。例如，使用蛋白A層析可純化IgG抗體。通過如親和層析，對本發(fā)明蛋白特異的抗體可被選擇或(如，部分純化)或純化。例如，如在本文中所描述的，產(chǎn)生重組表達和純化(或部分純化)的本發(fā)明的蛋白，并共價地或非共價地偶聯(lián)到固相載體，如層析柱。接著用該柱子親和純化對本發(fā)明蛋白特異的抗體，該抗體來自含有抗許多表位的抗體的樣本，因此產(chǎn)生了基本上純化的抗體組合物，即，一種基本上不含有污染抗體的抗體。在上下文中，基本上純化的抗體組合物表示抗體樣本含有至多僅30％(干重)的污染抗體，該抗體所抗的表位不同于本發(fā)明所需蛋白的那些表位，和優(yōu)選至多20％，還更優(yōu)選至多10％，和最優(yōu)選至多5％(干重)的樣本是污染抗體。純化的抗體組合物指組合物中至少99％的抗體是抗本發(fā)明所需蛋白。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明基本上純化的抗體可特異性結(jié)合本發(fā)明蛋白的信號肽、分泌序列、胞外域、跨膜或胞質(zhì)域或細胞質(zhì)膜。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明基本上純化的抗體特異性結(jié)合本發(fā)明蛋白氨基酸序列的分泌序列或胞外域。在一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明基本上純化的抗體特異性結(jié)合標記物蛋白氨基酸序列的分泌序列或胞外域。
通過標準技術(shù)，如親和層析或免疫沉淀，抗本發(fā)明蛋白的抗體可用于分離蛋白。此外，該抗體可用于檢測標記物蛋白或其片段(如，在細胞裂解液或細胞上清液中)以評估標記物表達的水平和分布。該抗體也可用于診斷以監(jiān)測組織或體液中(如，在子宮頸相關體液中)蛋白水平，作為臨床試驗程序的一部分，如，用于確定給定治療的用藥法的有效性。通過使用抗體衍生物，其包含偶聯(lián)有可檢測物質(zhì)的本發(fā)明的抗體，可有利于檢測?？蓹z測物質(zhì)的例子包括多種酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)和放射性物質(zhì)。合適的酶的例子包括辣根過氧化酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復合物的例子包括抗生物素蛋白鏈菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適的熒光物質(zhì)的例子包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、若丹明、二氯三吖嗪胺熒光素(dichlorotriazinylaminefluorescein)、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的例子包括魯米諾；生物發(fā)光物質(zhì)的例子包括熒光酶、蟲熒光素和水母發(fā)光蛋白，以及合適的放射性物質(zhì)的例子包括125I、131I、35S或3H。
在治療癌癥中本發(fā)明的抗體也可用作為治療劑。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明完整的人抗體被用于治療性處理人癌癥患者，特別是那些患子宮頸癌的患者。在另一個優(yōu)選實施方案中，特異性結(jié)合標記物蛋白或其片段的抗體被用于治療性處理。此外，該治療性抗體可以是抗體衍生物或免疫毒素，包含綴合有治療部分如細胞毒素、治療劑或放射性金屬離子的抗體。細胞毒素或細胞毒素劑包括任何對細胞有害的試劑。例子包括紫杉醇、細胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根堿、絲裂霉素、鬼臼乙叉甙、鬼臼噻吩苷、長春新堿、長春堿、秋水仙堿、阿霉素、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracin dione)、米托蒽醌、光輝霉素，放線菌素D、1-去氫睪甾酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、萘氧丙醇胺和嘌呤霉素以及它們的類似物或同系物。治療劑包括，但不限于，抗代謝物(如，甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)，烷化劑(如，氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡氮芥(BSNU)和羅氮芥(CCNU)、cyclothosphamide、白消安、二溴甘露醇、鏈唑霉素、絲裂霉素C和順鉑(II)(DDP))，蒽環(huán)類抗生素(如，柔紅霉素(原柔紅霉素)和阿霉素)，抗生素(如，放線菌素D(原放線菌素)、博來霉素、光輝霉素和安曲霉素(AMC))，和抗有絲分裂劑(如，長春新堿和長春堿)。
本發(fā)明綴合的抗體可用于減輕特定的生物反應，對于藥物部分而言，并不解釋為限制經(jīng)典的化學治療劑。例如，藥物部分可以是具有所需生物活性的蛋白或多肽。該蛋白可包括，例如，毒素，如核糖體抑制蛋白(見，Better等，美國專利第6,146,631號，其所公開的全文在此合并作為參考)，相思豆毒素、蓖麻毒素A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白，如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經(jīng)生長因子、血小板衍生的生長因子、組織纖維蛋白溶酶原激活劑；或，生物反應調(diào)節(jié)劑，如，淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生長因子。
用于將上述治療部分綴合到抗體的技術(shù)是眾所周知的，參見如，Arnon等，“Monoclonal Antibodies ForImmunotargeting Of Drugs InCancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等.(編)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，in Controlled Drug Delivery(第二版)，Robinson等.(編)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer TherapyA Review”，in Monoclonal Antibodies′84Biological And ClinicalApplications，Pinchera，等，(編)，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，in Monoclonal AntibodiesFor Cancer Detection And Therapy，Baldwin等，(編)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等，“THE Preparation AndCytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.，62119-58(1982)。
因此，在一方面，本發(fā)明提供了基本上純化的抗體、抗體片段和衍生物，其全部都特異性結(jié)合本發(fā)明的蛋白，以及優(yōu)選地，結(jié)合標記物蛋白。在各種實施方案中，本發(fā)明基本上純化的抗體，或其片段或衍生物，可以是人、非人、嵌合和/或人源化抗體。在另一方面，本發(fā)明提供了非人抗體、抗體片段和衍生物，其全部都特異性結(jié)合本發(fā)明的蛋白，以及優(yōu)選地，結(jié)合標記物蛋白。上述非人抗體可以是山羊、小鼠、綿羊、馬、小雞、兔或大鼠抗體。可選地，本發(fā)明的非人抗體可以是嵌合和/或人源化抗體。此外，本發(fā)明的非人抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。還在另一方面，本發(fā)明提供了單克隆抗體、抗體片段和衍生物，其全部都特異性結(jié)合本發(fā)明的蛋白，以及優(yōu)選地，結(jié)合標記物蛋白。單克隆抗體可以是人、人源化、嵌合和/或非人抗體。
本發(fā)明也提供了一種試劑盒，其含有綴合有可檢測物質(zhì)的本發(fā)明抗體和使用說明書。本發(fā)明的另一方面是包含本發(fā)明抗體的藥物組合物。在一個優(yōu)選實施方案中，藥物組合物包含一種本發(fā)明的抗體和一種藥學上可接受的載體。
III.重組表達載體和宿主細胞本發(fā)明的另一方面涉及載體，優(yōu)選表達載體，含有編碼標記物蛋白(或該蛋白一部分)的核酸。在本文中使用時，術(shù)語“載體”指能轉(zhuǎn)運與它連接的另一種核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)粒”，指一種環(huán)狀雙鏈DNA，在它上面可以連接其它DNA片段。另一種類型的載體是病毒載體，可以將其它DNA片段連接到該病毒基因組上。某些載體在其所導入的宿主細胞中能自主復制(如，具有細菌復制起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其它載體(如，非附加型哺乳動物載體)在導入該宿主細胞的條件下被整合入宿主細胞基因組中，以及因此與宿主基因組一起復制。此外，某些載體，稱為表達載體，能指導可操作地與它連接的基因的表達。一般而言，在重組DNA技術(shù)中所用的表達載體通常是質(zhì)粒(載體)的形式。然而，本發(fā)明還包括這樣的其它形式的表達載體，如病毒載體(如，復制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，它們能發(fā)揮相同的功能。
本發(fā)明的重組表達載體包含本發(fā)明的核酸，其以合適于在宿主細胞中表達該核酸的形式存在。意味著該重組表達載體包括一或多種調(diào)節(jié)序列，根據(jù)要用于表達的宿主細胞選擇該序列，其可操作地連接要表達的核酸序列。重組表達載體中“可操作地連接”規(guī)定為表示感興趣的核苷酸序列以一種能夠表達該核苷酸序列的方式連接到調(diào)節(jié)序列(如，當該載體導入宿主細胞時，存在一種體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)或宿主細胞中)。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”意在包括啟動子、增強子和其它表達調(diào)控元件(如，多腺苷酸化信號)。上述調(diào)節(jié)序列被描述，例如，于Goeddel，Methods in EnzymologyGene Expression Technology vol.185，Academic Press，San Diego，CA(1991)中。調(diào)節(jié)序列包括那些在許多種宿主細胞中指導核苷酸序列組成型表達的和那些僅在某些宿主細胞中指導核苷酸序列表達的序列(如，組織特異性調(diào)節(jié)序列)。本領域的技術(shù)人員可以理解的是表達載體的設計可基于這些因素，如所選擇的要轉(zhuǎn)化的宿主細胞、所需蛋白的表達水平和類似的。本發(fā)明的表達載體可導入宿主細胞中，因此產(chǎn)生蛋白或多肽，包括融合蛋白或多肽，由本文所述的核酸編碼。
本發(fā)明的重組表達載體可設計用于在原核(如，大腸桿菌)或真核細胞(如，昆蟲細胞{使用桿狀病毒表達載體}、酵母細胞或哺乳動物細胞)中表達標記物蛋白或其片段。合適的宿主細胞進一步討論于Goeddel，出處同上。可選地，重組表達載體可在體外轉(zhuǎn)錄并翻譯，例如使用T7啟動子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶。
在原核生物中進行的蛋白表達最通常在大腸桿菌中進行，采用含有指導融合或非融合蛋白表達的組成型或誘導型啟動子的載體。融合載體添加許多氨基酸到編碼蛋白中，通常在重組蛋白的氨基末端。上述融合載體一般提供三種用途1)增加重組蛋白的表達；2)增加重組蛋白的可溶性；和3)通過在親和純化中作為配體有助于重組蛋白的純化。通常，在融合表達載體中，在融合部分和重組蛋白連接處導入蛋白酶裂解位點，以便能夠在純化融合蛋白后將重組蛋白與融合部分分離。上述酶和它們的相關識別序列，包括因子Xa、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達載體包括分別與目標重組蛋白融合有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白或蛋白A的pGEX(Pharmacia BiotechInc；Smith和Johnson，1988，Gene 6731-40)，pMAL(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)。
合適的誘導型非融合大腸桿菌表達載體的例子包括pTrc(Amann等，1988，Gene 69301-315)和pET 11d(Studier等，p.60-89，GeneExpression TechnologyMethods in Enzymology vol.185，AcademicPress，San Diego，CA，1991)。來自pTrc載體的目標基因表達取決于從雜交的trp-lac融合啟動子啟動的宿主RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。來自pET11d載體的目標基因表達取決于從T7gn10-lac融合啟動子啟動的通過病毒RNA聚合酶(T7gn1)共表達介導的轉(zhuǎn)錄。在lacUV5啟動子轉(zhuǎn)錄控制的條件下，通過T7 gn1基因的駐留原噬菌體的宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)提供了病毒聚合酶。
一種使大腸桿菌中重組蛋白表達增強的方法是在具有受抑制的蛋白酶裂解重組蛋白能力的細菌宿主中表達該蛋白(Gottesman，p.119-128，Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology vol.185，Academic Press，San Diego，CA，1990)。另一種方法是改變要被插入表達載體的核酸的核酸序列，使得對于每個氨基酸而言各自的密碼子是那些在大腸桿菌中能優(yōu)先利用的(Wada等，1992，Nucleic AcidsRes.202111-2118)。上述本發(fā)明核酸序列的改變可通過標準的DNA技術(shù)進行。
在另一個實施方案中，表達載體是酵母表達載體。在釀酒酵母(S.Cerevisiae)中用于表達的載體的例子包括pYepSec1(Baldari等，1987，EMBO J.6229-234)，pMFa(Kurjan和Herskowitz，1982，Cell 30933-943)，pJRY88(Schultz等，1987，Gene 54113-123)，pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)和pPicZ(InvitrogenCorp，San Diego，CA)。
可選地，表達載體是桿狀病毒表達載體?？捎糜谠谂囵B(yǎng)的昆蟲細胞(如，Sf9細胞)中表達蛋白的桿狀病毒表達載體包括pAc系列(Smith等，1983，Mol.Cell.Biol.32156-2165)和pVL系列(Luchlow和Summers，1989，Virology 17031-39)。
還在另一個實施方案中，使用哺乳動物表達載體在哺乳動物細胞中表達本發(fā)明的核酸。哺乳動物表達載體的例子包括pCDM8(Seed，1987，Nature 329840)和pMT2PC(Kaufman等，1987，EMBO J.6187-195)。當用于哺乳動物細胞時，表達載體的控制功能通常提供自病毒調(diào)控元件。例如，一般使用的啟動子是來源自多瘤病毒、腺病毒2、巨細胞病毒和猿猴病毒40。其它合適于原核和真核細胞的表達系統(tǒng)見Sambrook等，出處同上，的16和17章。
在另一個實施方案中，重組哺乳動物表達載體能夠優(yōu)先在特定細胞類型中指導核酸表達(如，組織特異性調(diào)控元件被用于表達核酸)。組織特異性調(diào)控元件為本領域已知。合適的組織特異性啟動子非限制性例子包括白蛋白啟動子(肝特異性；Pinkert等，1987，Genes Dev.1268-277)，淋巴特異性啟動子(Calame和Eaton，1988，Adv.Immunol.43235-275)，特別是T細胞受體(Winoto和Baltimore，1989，EMBOJ.8729-733)和免疫球蛋白的啟動子(Banerji等，1983，Cell33729-740；Queen和Baltimore，1983，Cell 33741-748)，神經(jīng)細胞特異性啟動子(如，神經(jīng)微絲啟動子；Byrne和Ruddle，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 865473-5477)，胰腺特異性啟動子(Edlund等，1985，Science 230912-9160)和乳腺特異性啟動子(如，牛奶乳清啟動子；美國專利第4,873,316號和歐洲專利公開號264,166)。也包含發(fā)育調(diào)節(jié)啟動子，例如鼠hox啟動子(Kessel和Gruss，1990，Science249374-379)和α-胎蛋白啟動子(Camperand Tilghman，1989，GenesDev.3537-546)。
本發(fā)明進一步提供了包含克隆入表達載體反義方向的本發(fā)明DNA分子的重組表達載體。就是說，該DNA分子以一種允許RNA分子表達的方式(通過該DNA分子的轉(zhuǎn)錄)可操作地連接調(diào)節(jié)序列，該RNA分子反義于編碼本發(fā)明多肽的mRNA。與克隆入反義方向核酸可操作地連接的調(diào)節(jié)序列可選自指導反義RNA分子在不同細胞中連續(xù)表達的序列，例如病毒啟動子和/或增強子，或調(diào)節(jié)序列可選自指導反義RNA組成型、組織特異性或細胞特異性表達的序列。反義表達載體可以是重組質(zhì)粒、噬菌粒或減毒病毒，其中在高效調(diào)節(jié)區(qū)調(diào)控下產(chǎn)生反義核酸，其活性可通過該載體導入的細胞類型來決定。調(diào)節(jié)使用反義基因的基因表達的討論見Weintraub等，1986，Trends in Genetics，Vol.1(1)。
本發(fā)明的另一方面涉及已導入本發(fā)明重組表達載體的宿主細胞。術(shù)語“宿主細胞”和“重組宿主細胞”在本文中可交換地使用?？梢岳斫獾氖窃撔g(shù)語不僅指特定的受試者細胞，也指該細胞后代或潛在的后代。因為，由于突變或環(huán)境影響，某些修飾可存在于后代中，所以后代實際上與親本細胞并不相同，但仍包括在本文中所使用的該術(shù)語的范圍內(nèi)。
宿主細胞可以是任何原核(如，大腸桿菌)或真核細胞(如，昆蟲細胞、酵母或哺乳動物細胞)。
通過常規(guī)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)，載體DNA可導入原核或真核細胞中。在本文中使用時，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”規(guī)定為指將外源核酸導入宿主細胞的多種本領域公認的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或電穿孔。合適用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞的方法可發(fā)現(xiàn)于Sambrook等(出處同上)，和其它實驗室手冊。
為了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞，業(yè)已了解的是，根據(jù)所使用的表達載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，僅有少數(shù)細胞可將外源DNA整合入它們基因組中。為鑒定和選擇這些整合體，通常將編碼選擇標記(如，對抗生素有抗性的)的基因與感興趣的基因一同導入宿主細胞中。優(yōu)選的選擇標記包括那些對藥物如G418、潮霉素和甲氨蝶呤具抗性的標記。具有導入核酸的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞可通過藥物篩選來鑒定(如，已整合選擇標記的細胞將存活，而其它細胞則死亡)。
本發(fā)明的一種宿主細胞，如培養(yǎng)中的原核或真核宿主細胞可用于產(chǎn)生標記物蛋白或其片段。因此，本發(fā)明進一步提供了使用本發(fā)明的宿主細胞用于生產(chǎn)標記物蛋白或其片段的方法。在一個實施方案中，該方法包含在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞(其中導入了編碼標記物蛋白或其片段的重組表達載體)，使得產(chǎn)生標記物蛋白或其片段。在另一個實施方案中，該方法進一步包含從培養(yǎng)基或宿主細胞中分離標記物蛋白或其片段。
本發(fā)明的宿主細胞也可用于產(chǎn)生非人轉(zhuǎn)基因動物。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明的宿主細胞是已導入編碼標記物蛋白或其片段的序列的受精卵母細胞或胚胎干細胞。接著，該宿主細胞可用于產(chǎn)生非人轉(zhuǎn)基因動物，其中編碼本發(fā)明標記物蛋白的外源基因序列已導入它們的基因組中，或產(chǎn)生同源重組動物，其中編碼標記物蛋白的外源基因已改變。上述動物可用于研究標記物蛋白的功能和/或活性，以及用于鑒定和/或評估標記物蛋白的調(diào)節(jié)劑。在本文中使用時，“轉(zhuǎn)基因動物”指非人動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選嚙齒動物如大鼠或小鼠，其中一或多個動物細胞包括轉(zhuǎn)基因。其它的轉(zhuǎn)基因動物的例子包括非人靈長類、綿羊、狗、奶牛、山羊、小雞、兩棲動物等。轉(zhuǎn)基因是外源DNA，其整合入發(fā)育的轉(zhuǎn)基因動物的細胞基因組中，以及在成熟動物的基因組中仍存在，因此在該轉(zhuǎn)基因動物一或多種細胞型或組織中指導編碼基因產(chǎn)物的表達。在本文中使用時，“同源重組動物”指非人動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選小鼠，其中在動物發(fā)育前，通過內(nèi)源基因和導入動物細胞(如動物的胚細胞的)外源DNA分子之間同源重組改變了內(nèi)源基因。
可通過將編碼標記物蛋白的核酸導入受精卵母細胞的雄性原核中產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物，如通過顯微注射、反轉(zhuǎn)錄病毒感染和將卵母細胞在假孕雌性養(yǎng)育動物體中發(fā)育。在轉(zhuǎn)基因中也包括內(nèi)含子序列和多腺苷酸化信號以增加該轉(zhuǎn)基因表達效率。組織特異性調(diào)節(jié)序列可操作地與轉(zhuǎn)基因連接以指導本發(fā)明多肽在特定細胞中的表達。通過胚胎操作和顯微注射用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物，特別是動物，如小鼠的方法，已經(jīng)成為本領域的常規(guī)方法，以及描述于，例如，美國專利第4,736,866號和4,870,009號，美國專利第4,873,191號和Hogan，Manipulating theMouse Embryo，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，1986中。類似的方法被用于產(chǎn)生其它的轉(zhuǎn)基因動物?；谠谄浠蚪M中轉(zhuǎn)基因的存在和/或編碼轉(zhuǎn)基因的mRNA在該動物組織或細胞中的表達可鑒定轉(zhuǎn)基因生成動物。接著，轉(zhuǎn)基因生成動物可用于繁殖帶有轉(zhuǎn)基因的其它動物。此外，具有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物可進一步培育成具有其它轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物。
為產(chǎn)生同源重組動物，制備含有編碼標記物蛋白的基因的至少一部分的載體，在該基因中已導入缺失、添加或取代，因此改變了該基因，如，功能上破壞。在一個優(yōu)選實施方案中，載體可設計使得在同源重組下，內(nèi)源基因功能上受到破壞(即，不再編碼功能蛋白；也稱為“敲除”載體)。可選地，載體可設計使得在同源重組下，內(nèi)源基因突變或以別的方式改變，但仍然編碼功能蛋白(如，上游調(diào)控區(qū)可改變，由此改變了該內(nèi)源蛋白的表達)。在同源重組載體中，基因改變的部分在其5′和3′末端側(cè)接有額外的基因核酸，以便于在載體攜帶的外源基因與胚胎干細胞中內(nèi)源基因之間的同源重組產(chǎn)生。額外的側(cè)接核酸序列具有足夠的長度以便于成功地與內(nèi)源基因同源重組。通常，幾千個堿基的側(cè)接DNA(在5′和3′末端)包括在載體中(參見如Thomas和Capecchi，1987，Cell 51503 for a description of homologousrecombination vectors)。該載體被導入胚胎干細胞系中(如，通過電穿孔)，以及該細胞中導入的基因已與選定的內(nèi)源基因同源重組(參見如，Li等，1992，Cell 69915)。接著將選定的細胞注射到動物(如，小鼠)胚泡中以形成凝聚嵌合體(參見如Bradley，Teratocarcinomas andEmbryonic Stem CellsA Practical Approach，Robertson，編.，IRL，Oxford，1987，pp.113-152)。接著，嵌合胚被植入合適的假孕雌性養(yǎng)育動物體中，并讓該胚胎發(fā)育成熟。在它們生殖細胞中獲得了同源重組DNA的后代可用于繁殖動物，其中通過種系傳遞轉(zhuǎn)基因，該動物的所有細胞含有同源重組DNA。用于構(gòu)建同源重組載體和同源重組動物的方法進一步描述于Bradley(1991)Current Opinion inBio/Technology 2823-829和PCT公開號WO 90/11354，WO 91/01140，WO 92/0968，和WO 93/04169中。
在另一個實施方案中，可產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人動物，其含有能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達的選擇系統(tǒng)。該系統(tǒng)的一個例子是噬菌體P1的cre/loxP重組酶系統(tǒng)。對于cre/loxP重組酶系統(tǒng)的描述參見如，Lakso等.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896232-6236。另一個重組酶系統(tǒng)的例子是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的FLP重組酶系統(tǒng)(O′Gorman等，1991，Science 2511351-1355)。如果cre/loxP重組酶系統(tǒng)用于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因的表達，需要含有編碼Cre重組酶和一種選定蛋白的轉(zhuǎn)基因的動物?？赏ㄟ^構(gòu)建“雙”轉(zhuǎn)基因動物來提供上述動物，如，通過將兩種轉(zhuǎn)基因動物交配，一種含有編碼一種選定蛋白的轉(zhuǎn)基因和另一種含有編碼重組酶的轉(zhuǎn)基因。
根據(jù)描述于Wilmut等.(1997)Nature 385810-813和PCT公開號WO 97/07668及WO 97/07669中的方法也可產(chǎn)生非人轉(zhuǎn)基因動物的克隆。
IV.藥物組合物可將本發(fā)明的核酸分子、多肽、和抗體(在本文中也被稱為“活性化合物”)摻入適合施用的藥物組合物中。所述所述組合物通常包含所述核酸分子、蛋白或抗體以及藥學上可接受載體。在本文中所使用的術(shù)語“藥學上可接受載體”意在包括與藥用施用相容的任何或所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、抗細菌和抗真菌劑、等滲和緩釋吸收劑，及類似物。用于藥用活性物質(zhì)的所述介質(zhì)和制劑的使用在本領域中是眾所周知的。除非與所述活性化合物不相容，任何常見介質(zhì)或制劑都可預見應用于所述組合物中。還可將補充性活性化合物摻入所述組合物中。
本發(fā)明包括制備調(diào)節(jié)核酸或蛋白標記物表達或活性的藥物組合物的方法。所述方法包括把藥學上可接受載體與調(diào)節(jié)核酸或蛋白標記物表達或活性的試劑相配伍。所述方法可進一步包括額外的活性物質(zhì)。因此，本發(fā)明進一步包括用于制備藥物組合物的方法，包括將藥學上可接受載體與調(diào)節(jié)核酸或蛋白標記物表達或活性的試劑和一或多種額外的活性物質(zhì)相配伍。
本發(fā)明也提供了鑒定調(diào)節(jié)物的方法(在本文中也被稱為“篩選試驗”)，調(diào)節(jié)物即候選或受試化合物或試劑(如，肽、模擬肽、類肽、小分子或其它藥物)，其可以(a)與所述標記物結(jié)合，或(b)對所述標記物活性具有調(diào)節(jié)(如，刺激或抑制)效應，或更特別地(c)對所述標記物與其一個或多個天然底物(如，肽、蛋白、激素、輔因子或核酸)的相互作用具有調(diào)節(jié)效應，或(d)對所述標記物的表達具有調(diào)節(jié)效應。所述試驗通常包含在所述標記物和一或多個試驗成分之間的反應。其它成分可以是受試化合物本身，或是受試化合物與所述標記物天然結(jié)合配體的組合物。
本發(fā)明的受試化合物可從任何可能的來源獲得，包括天然和/或合成化合物的系統(tǒng)文庫。受試化合物也可通過本領域已知眾多組合文庫方法中的任一方法而獲得，包括生物文庫；類肽文庫(具有肽功能以及新的、非肽主鏈的分子文庫，其抗酶降解但仍然具有生物活性；參見如Zuckermann等，1994，J.Med.Chem.372678-85)；立體尋址的平行固相或液相文庫；需要解卷積的合成文庫方法；“一珠一化合物”文庫方法；以及使用親合層析選擇的合成文庫方法。所述生物文庫和類肽文庫方法僅限用于肽文庫，而所述其它四種方法可適用于化合物的肽、非肽寡聚物或小分子文庫(Lam，1997，Anticancer Drug Des.12145)。
分子文庫合成方法的例子可在現(xiàn)有技術(shù)中找到，例如在DeWitt等.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.906909；Erb等.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111422；Zuckermann等(1994).J.Med.Chem.372678；Cho等(1993)Science 2611303；Carrell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl 332059；Carell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl 332061；以及在Gallop等(1994)J.Med.Chem.371233。
化合物文庫可呈溶液形式(如，Houghten，1992，Biotechniques13412-421)，或在珠(Lam，1991，Nature 35482-84)、芯片(Fodor，1993，Nature 364555-556)、細菌和/或孢子(Ladner，美國專利第5,223,409號)、質(zhì)粒(Cull等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992，891865-1869)上或在噬菌體上(Scott和Smith，1990，Science249386-390；Devlin，1990，Science 249404-406；Cwirla等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.876378-6382；Felici，1991，J.Mol.Biol.222301-310；Ladner，出處同上)。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了篩選候選或受試化合物的試驗方法，其中所述化合物是蛋白的底物，所述蛋白由標記物或其生物活性部分編碼或相應于標記物或其生物活性部分。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了篩選候選或受試化合物的試驗方法，其中所述化合物與蛋白結(jié)合，所述蛋白由標記物或其生物活性部分編碼或相應于標記物或其生物活性部分?？蛇M行受試化合物直接與蛋白結(jié)合能力的測定，例如通過將所述化合物與放射性同位素或酶標記偶聯(lián)，從而使所述化合物與標記物的結(jié)合可通過檢測復合物中標記的標記物化合物來測定。例如，化合物(如標記物底物)可用125I、35S、14C或3H直接或間接地，以及能用放射輻射直接計數(shù)或閃爍計數(shù)檢測的同位素來標記?？蛇x地，試驗成分可用如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或熒光素酶、以及能檢測合適底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶標記來進行酶標記。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了篩選候選或受試化合物的試驗方法，其中所述化合物調(diào)節(jié)標記物的表達或蛋白的活性，所述蛋白由標記物或其生物活性部分編碼或相應于標記物或其生物活性部分。在所有的可能性中，由標記物或其生物活性部分編碼或相應于標記物或其生物活性部分的蛋白可在體內(nèi)與一或多個分子相互作用，例如但不僅限于，肽、蛋白、激素、輔因子和核酸。為了論述的目的，所述細胞和細胞外分子在本文中被稱為“結(jié)合配體”或標記物“底物”。
為了便于所述篩選，本發(fā)明的一個必要實施方案是使用由標記物或其生物活性部分編碼或相應于標記物或其生物活性部分的蛋白鑒定蛋白天然的體內(nèi)結(jié)合配體。對于本領域技術(shù)人員而言，有許多已知的方法可完成上述篩選。一個例子是在雙雜交實驗或三雜交實驗中把標記物蛋白用作為“誘餌蛋白”(參見如美國專利第5,283,317號；Zervos等，1993，Cell 72223-232；Madura等，1993，J.Biol.Chem.26812046-12054；Bartel等，1993，Biotechniques 14920-924；Iwabuchi等，1993 Oncogene 81693-1696；Brent WO94/10300)，以鑒定能與所述標記物(結(jié)合配體)結(jié)合或相互作用的其它蛋白，并因此可能涉及所述標記物的天然功能。所述標記物結(jié)合配體也可能涉及通過標記物蛋白或標記物蛋白介導的信號途徑的下游元件進行的信號傳播?？蛇x地，所述標記物蛋白結(jié)合配體也被發(fā)現(xiàn)可以是所述標記物蛋白的抑制劑。
雙雜交系統(tǒng)是基于大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子組件性質(zhì)的，其由可分離的DNA結(jié)合和活化結(jié)構(gòu)域組成。簡而言之，所述試驗方法利用兩個不同的DNA構(gòu)建體。在一個構(gòu)建體中，編碼標記物蛋白的基因與編碼已知轉(zhuǎn)錄因子(如，GAL-4)的DNA結(jié)合域的基因融合。在另一個構(gòu)建體中，來自DNA序列文庫的編碼未鑒定蛋白(“獵物”或“樣本”)的DNA序列與編碼已知轉(zhuǎn)錄因子活化結(jié)構(gòu)域的基因融合。如果“誘餌”和“獵物”蛋白能在體內(nèi)相互作用，形成標記物依賴的復合物，則轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合和活化結(jié)構(gòu)域變得很靠近。這種靠近使得與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)位點可操作地相連的報告基因(如，LacZ)的轉(zhuǎn)錄對轉(zhuǎn)錄因子相應。報告基因的表達可容易地被檢測出，并且包括功能性轉(zhuǎn)錄因子的細胞集落可被分離并用于獲得克隆的基因，所述基因編碼與所述標記物蛋白相互作用的蛋白。
在另一個實施方案中，為鑒定調(diào)節(jié)(如正或負效應)標記物蛋白與其底物和/或結(jié)合配體之間相互作用的化合物，可通過應用本發(fā)明來設計試驗方法。所述化合物可包括，但不僅限于，諸如抗體、肽、激素、寡核苷酸、核酸及其類似物的分子。所述化合物也可從任何可能的來源中獲得，包括天然和/或合成化合物的系統(tǒng)文庫。用于本實施方案中的優(yōu)選的試驗成分是在本文中鑒定出的子宮頸癌標記物蛋白、已知的結(jié)合配體和/或相同的底物、以及受試化合物。受試化合物可從任何來源獲得。
用于鑒定干擾所述標記物蛋白與其結(jié)合配體之間相互作用的化合物的試驗系統(tǒng)的基本原理涉及在足以使兩個產(chǎn)物相互作用和結(jié)合從而形成復合物的條件和時間下，制備包括標記物蛋白及其結(jié)合配體的反應混合物。為測試試劑的抑制活性，在受試化合物存在或不存在的條件下制備反應混合物。受試化合物可一開始就包括在反應混合物中，或在加入標記物蛋白及其結(jié)合配體后再被添加。對照反應混合物在不存在受試化合物或具有安慰劑的條件下溫育。然后檢測所述標記物蛋白及其結(jié)合配體之間形成的任一復合物。對照反應中形成復合物，但在包含受試化合物的反應混合物中較少或沒有所述的形成，表明所述化合物干擾標記物蛋白及其結(jié)合配體的相互作用。反之，在存在化合物的條件下比對照反應中形成了更多的復合物，表明所述化合物可增強標記物蛋白及其結(jié)合配體的相互作用。
可以異質(zhì)(heterogeneous)或同質(zhì)(homogeneous)形式進行干擾標記物蛋白及其結(jié)合配體相互作用的化合物的試驗。異質(zhì)試驗包括把標記物蛋白或其結(jié)合配體錨定在固相上并在反應后檢測錨定在固相上的復合物。同質(zhì)試驗中，在液相中進行整個反應。在兩種方法中，可以改變添加反應物的順序以獲得不同的關于受試化合物的信息。例如，干擾標記物蛋白及其結(jié)合配體相互作用(如通過競爭)的化合物可通過在存在受試物質(zhì)的條件下進行反應來鑒定，即在標記物及其相互反應的結(jié)合配體加入前或同時把受試物質(zhì)加進反應混合物?？蛇x地，受試化合物破壞形成的復合物，如能置換復合物中一個具有較高結(jié)合常數(shù)的化合物，可通過在復合物形成后把受試化合物加入反應混合物中來進行測試。所述不同的方式簡要描述如下。
在異質(zhì)試驗系統(tǒng)中，標記物蛋白或其結(jié)合配體錨定在固體表面或基質(zhì)上，而其它相應的非錨定成分可直接或間接地被標記。實際上，微滴定板常用于該方法。通過許多非共價或共價的方法固定錨定的物種，這些方法對本領域所屬技術(shù)人員來說通常是眾所周知的。經(jīng)常僅通過用標記物蛋白或其結(jié)合配體溶液包被固體表面并烘干來進行非共價結(jié)合?？蛇x地，錨定固定的試驗成分的特異性抗體也可用于此。所述表面經(jīng)常被預制備并儲存起來。
在相關的實施方案中，提供一種融合蛋白，其增加了使一或兩個試驗成分錨定于基質(zhì)的結(jié)構(gòu)域。例如，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/標記物融合蛋白或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/結(jié)合配體可吸附于谷胱甘肽瓊脂糖珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生化的微滴定板上，然后其與受試化合物，或與受試化合物與非吸附標記物或其結(jié)合配體化合，并且所述混合物在有利于形成復合物的條件(如生理條件)下溫育。溫育后，洗滌珠或微滴定板上的孔以直接或間接除去任何未結(jié)合的試驗成分、未固定的試驗復合物，例如，如上所述的?？蛇x地，所述復合物可從基質(zhì)上解離，并可利用標準技術(shù)確定標記物結(jié)合或活性水平。
其它把蛋白固定于基質(zhì)上的技術(shù)也可用于本發(fā)明的篩選試驗中。例如，標記物蛋白或標記物蛋白結(jié)合配體可以利用綴合生物素和抗生物素蛋白鏈菌素來固定。利用本領域已知技術(shù)(如，生物素化試劑盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)用生物素-NHS(N-羥基-琥珀酰亞胺)制備生物素化的標記物蛋白或靶分子，并固定于抗生物素蛋白鏈菌素包被的96孔板(Pierce Chemical)的孔中。在某些實施方案中，可預制備蛋白固定的表面并儲存起來。
為了進行所述測試，固定的試驗成分的相應部分與或不與受試化合物一起暴露于包被的表面。反應完成后，除去(如洗去)未反應的試驗成分以及任何形成的復合物仍然固定于固相表面上。有許多方法可進行錨定在固相表面上的復合物的檢測。在預標記的未固定的成分的位置，檢測到固定在表面上的標記表明形成了復合物。在沒有預標記的未固定的成分的位置，一種間接標記可用于檢測錨定在表面上的復合物；如，利用對最初未固定物特異性的標記的抗體(所述抗體依次可直接標記或用如標記的抗Ig抗體來間接標記)。根據(jù)加入反應成分的順序，可檢測調(diào)節(jié)(抑制或增強)復合物形成的或破壞預形成復合物的受試化合物。
在本發(fā)明替換的實施方案中，可使用同質(zhì)試驗。這通常是一個與上述那些反應相似的反應，其在受試化合物存在或不存在的條件下在液相中進行。然后從未反應的成分中分離生成的復合物，并測定復合物的生成量。如異質(zhì)試驗系統(tǒng)所述的，反應物加入液相的順序可得出受試化合物調(diào)節(jié)(抑制或增強)復合物形成和破壞預形成復合物的信息。
在所述的同質(zhì)試驗中，通過使用眾多標準技術(shù)，包括但不僅限于差速離心、層析、電泳和免疫沉淀，從未反應的試驗成分中分離反應產(chǎn)物。在差速離心中，通過一系列離心步驟，根據(jù)基于復合物不同大小和密度的不同沉淀平衡狀態(tài)，復合的分子可從未復合的分子中分離出來(參見如，Rivas，G.，和Minton，A.P.，Trens Biochem Sci 1993Aug；18(8)284-7)。標準的層析技術(shù)也可用于從未復合的分子中分離復合的分子。例如，凝膠過濾層析以大小為基礎，并通過利用層析柱中合適的凝膠過濾樹脂分離分子，例如，相對較大的復合物可從相對較小的未復合成分中分離出來。相似地，復合物較之未復合分子相對不同的電荷性質(zhì)可用來從殘留的反應物單體中特異分離所述復合物，例如通過應用離子交換層析樹脂。所述樹脂和層析技術(shù)對本領域技術(shù)人員而言是眾所周知的(參見如，Heegaard，1998，J Mol.Recognit11141-148；Hage和Tweed，1997，J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.，699499-525)。也可用凝膠電泳從未結(jié)合物中分離復合的分子(參見如，Ausubel等(編)，Current Protocols in Molecular Biology，J.Wiley & Sons，New York.1999)。例如，在該技術(shù)中，蛋白或核酸復合物根據(jù)大小或電荷來分離。為了在電泳過程中保持互相結(jié)合作用，通常優(yōu)選不存在還原劑的變性膠，而適合特定相互作用物的條件對于本領域技術(shù)人員來說是眾所周知的。免疫沉淀是另一種用于從溶液中分離蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復合物的常用技術(shù)(參見如，Ausubel等(編)，Current Protocols in Molecular Biology，J.Wiley & Sons，New York.1999)。在該技術(shù)中，通過將抗體與可便于離心收集的多聚物珠綴和，與特異于結(jié)合分子之一的抗體結(jié)合的所有蛋白可從溶液中沉淀出來。所述結(jié)合的試驗成分從珠中釋放出來(通過特異性酶解過程或其它不干擾復合物中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的眾所周知的技術(shù))，并進行第二步免疫沉淀，這次利用的是對相應地不同相互反應性的試驗成分的特異的抗體。在該方法中，僅有形成的復合物仍將附著于珠上?？梢员容^在受試化合物存在或不存在的條件下復合物形成的變化，從而提供了與調(diào)節(jié)標記物蛋白及其結(jié)合體的化合物的能力相關的信息。
在同質(zhì)或異質(zhì)試驗系統(tǒng)中，不進行進一步樣本操作而直接檢測標記物蛋白及其天然結(jié)合配體和/或受試化合物之間相互作用的方法也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，可用熒光能量轉(zhuǎn)換技術(shù)(參見如Lakowicz等，美國專利第5,631,169號；Stavrianopoulos等，美國專利第4,868,103號)，一般而言，該技術(shù)包括在第一“供體”分子(如標記物或受試化合物)上添加熒光標記從而通過第二“受體”分子(如標記物或受試化合物)上的熒光標記吸收發(fā)出的熒光能量，接著基于吸收的能量而發(fā)出熒光?？蛇x地，“供體”蛋白分子可僅利用色氨酸殘基的天然熒光能量。選擇釋放不同光波長的標記，從而使“受體”分子標記可與“供體”分子區(qū)分。由于標記間能量轉(zhuǎn)換的效率與分子分離距離相關，因此可測定分子間空間關系。在分子之間發(fā)生結(jié)合的條件下，在所述試驗中“受體”分子標記的熒光發(fā)射應最大化?？赏ㄟ^眾所周知的標準熒光檢測方法(如利用熒光計)方便地測量FET結(jié)合情況。能參與增強或阻止預形成復合物中的一種物質(zhì)的受試物質(zhì)會導致與背景不同的信號產(chǎn)生。在這種方法中，在控制的試驗中可鑒定調(diào)節(jié)標記物和其結(jié)合體相互作用的受試物質(zhì)。
在另一個實施方案中，用一種方法鑒定標記物表達的調(diào)節(jié)分子，其中細胞與候選化合物接觸并測定細胞中mRNA或蛋白標記物的表達。將存在候選化合物的mRNA或蛋白標記物的表達水平與不存在候選化合物的mRNA或蛋白質(zhì)標記物的表達水平相比較。然后根據(jù)該比較結(jié)果，候選化合物可被鑒定為標記物表達的調(diào)節(jié)分子。例如，mRNA或蛋白標記物在存在候選化合物的條件下比不存在時表達得更多(統(tǒng)計上明顯更多)時，則所述候選化合物就被鑒定為mRNA或蛋白標記物表達的刺激因子。相反地，mRNA或蛋白標記物在存在候選化合物的條件下比不存在時表達得更少(統(tǒng)計上明顯更少)時，則所述候選化合物就被鑒定為mRNA或蛋白標記物表達的抑制因子。通過在本文中所述的檢測mRNA或蛋白標記物的方法可以確定細胞中mRNA或蛋白標記物的表達水平。
在另一方面，本發(fā)明涉及在本文中所述的兩個或更多試驗的組合。例如，利用基于細胞的或無細胞的試驗，可以鑒定調(diào)節(jié)試劑，并在體內(nèi)可進一步確證試劑調(diào)節(jié)蛋白標記物活性的能力，如在完整動物模型中的細胞轉(zhuǎn)化和/或腫瘤發(fā)生。
本發(fā)明進一步涉及由上述篩選試驗鑒定的新試劑。因此，在合適動物模型中進一步使用在本文中所鑒定的試劑包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。例如，在本文中所鑒定的試劑(如，標記物調(diào)節(jié)試劑、反義標記物核酸分子、標記物特異性抗體、或標記物結(jié)合配體)可用在動物模型中以測定用所述試劑治療的有效性、毒性、或副作用。可選地，本文中所鑒定的試劑可用在動物模型中以測定所述試劑的作用機理。另外，本發(fā)明涉及由上述篩選試驗鑒定的新試劑在本文所述的治療中的應用。
以普通醫(yī)生、獸醫(yī)或研究人員的知識可知道小分子試劑和蛋白或多肽試劑的合適劑量是依賴于許多因素的。例如，根據(jù)治療的患者或樣本的特性、大小、和情況，如果可行的話，進一步根據(jù)組合物施用的途徑以及醫(yī)師所希望本發(fā)明核酸或多肽所具有的效果來改變這些試劑的劑量。小分子劑量的例子包括每公斤患者或樣本體重的毫克或微克量(如約每公斤1微克至約每公斤500毫克、約每公斤100微克至約每公斤5毫克、或約每公斤1微克至約每公斤50微克)。蛋白或多肽劑量的例子包括每公斤患者或樣本體重的克、毫克或微克量(如約每公斤1微克至約每公斤5克、約每公斤100微克至約每公斤5毫克、或約每公斤1毫克至約每公斤50毫克)。進一步可知道這些試劑之一的合適劑量依賴于與調(diào)節(jié)表達或活性相關的試劑的效力。利用本文所述的試驗確定所述合適的劑量。例如，當一或多種這些試劑施用于動物(如人)從而調(diào)節(jié)本發(fā)明的多肽或核酸的表達或活性時，醫(yī)生、獸醫(yī)或研究人員可以首先給出較低劑量的處方，接著增加劑量直至獲得合適的反應。另外，可知道任何特定動物患者的特定劑量水平依賴于多種因素，包括所使用的特定試劑的活性、患者的年齡、體重、綜合健康狀況、性別、以及飲食、給藥時間、給藥途徑、排出率、任何藥物組合、和要調(diào)節(jié)的表達或活性程度。
將本發(fā)明的藥物組合物制備成與其預期的施用途徑相容。施用途徑的例子包括腸胃外途徑，如，靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、口腔(如吸入)、經(jīng)皮(外用)、經(jīng)黏膜、以及直腸施用。用于腸胃外、皮內(nèi)或皮下使用的溶液或懸浮液包括以下成分諸如注射用水的無菌稀釋劑、鹽溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗細菌劑，如芐醇或甲基對羥基苯甲酸酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸；緩沖液，如醋酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽和調(diào)節(jié)滲透壓的試劑，如氯化鈉或葡萄糖。pH可用如鹽酸或氫氧化鈉的酸或堿調(diào)節(jié)。腸胃外制劑可包裝在玻璃或塑料制的安瓿瓶、一次性注射器或多劑量管瓶中。
適合注射使用的藥物組合物包括無菌水溶液(其中是水溶性的)或分散液，和用于臨時制備無菌注射溶液或分散液的無菌粉末。為在靜脈內(nèi)施用，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩沖液(PBS)。在所有情況下，所述組合物必須是無菌的，并且其流動性應當達到容易注射的程度。在生產(chǎn)和儲存的條件下它必須是穩(wěn)定的，并且必須防止諸如細菌和真菌的微生物的污染作用。所述載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包括例如水、乙醇、多元醇(如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇，以及類似物)及其合適的混合物。例如，可通過包被諸如卵磷脂的包衣劑保持分散液所需的粒度以及通過使用表面活性劑保持合適的流動性?？赏ㄟ^各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞、及類似物實現(xiàn)抑制微生物的作用。在很多場合下，優(yōu)選在所述組合物中包括等滲劑，例如，糖、多元醇，如甘露糖醇、山梨醇、或氯化鈉?？赏ㄟ^在組合物中加入延長吸收的試劑，如單硬脂酸鋁和凝膠，延長可注射組合物的吸收時間。
可通過將所需數(shù)量的活性化合物(如多肽或抗體)與上面列舉的成分之一或其組合一起摻入合適的溶劑中制備無菌注射溶液，如果需要，接著通過過濾消毒。一般而言，通過將活性化合物摻入含有基礎分散介質(zhì)和上面所列舉的必需的其它成分的無菌賦形劑中可制備分散液。對于制備無菌注射溶液的無菌粉末而言，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，由此可產(chǎn)生活性成分和來自上述無菌過濾溶液的任何其它必需成分的粉末。
口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用載體。它們可裝在凝膠膠囊中或壓成片劑。為了口服治療施用，活性化合物可與賦形劑混合并制成片劑、錠劑或膠囊形式使用?？诜M合物也可用流體載體制備成漱口水，其中流體載體中的化合物可口服使用，洗漱并吐出或吞咽。
藥學上相容的結(jié)合劑和/或佐劑材料可添加作為所述組合物的一部分。所述片劑、丸劑、膠囊、錠劑、及類似物能包含以下成分中的任意一種或包含具有相似性質(zhì)的化合物諸如微晶纖維素的粘合劑、黃蓍膠或明膠；賦形劑，如淀粉或乳糖，分散劑，如藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤滑劑，如硬脂酸鎂或Sterotes；滑動劑，如膠狀二氧化硅；甜味劑，如蔗糖或糖精；或香味劑，如薄荷、水楊酸甲酯或檸檬香劑。
為了通過吸入施用，所述化合物以氣溶膠噴霧形式從壓力容器或分液器或霧化器中噴出，所述壓力容器或分液器包括合適的推進劑，例如，氣體，如二氧化碳。
也可通過黏膜或經(jīng)皮方式系統(tǒng)施用。為經(jīng)黏膜或經(jīng)皮施用，在該制劑中使用適合穿透屏障的滲透劑。所述滲透劑一般為本領域已知的，并包括，例如對于經(jīng)黏膜施用而言，洗滌劑、膽酸鹽、和梭鏈孢酸衍生物。通過使用鼻腔噴霧劑或栓劑可實現(xiàn)黏膜施用。對于經(jīng)皮施用而言，如本領域所普遍公知的，活性化合物可制備為軟膏、敷膏、凝膠或霜劑。
所述化合物也可以栓劑(如，使用常規(guī)的栓劑基料，如可可脂和其它甘油脂)或保留灌腸劑形式制備，用于直腸遞送。
在一個實施方案中，所述活性化合物是與載體一起制備的，所述載體能防止該化合物從體內(nèi)快速清除，如控制釋放制劑，包括植入和微膠囊化遞送系統(tǒng)?？梢允褂每缮锝到獾?、生物相容的聚合物，比如亞乙基乙烯乙酸酯、聚酐、聚甘油酸、膠原、聚原酸酯以及聚乳酸。制備所述試劑的方法對本領域技術(shù)人員來說是顯而易見的。也可從Alza公司和Nova制藥有限公司獲得商品化的原料。還可將脂質(zhì)體懸浮液(包括脂質(zhì)體，在其中或其上帶有單克隆抗體)也可用作藥學上可接受載體。根據(jù)本領域技術(shù)人員已知的方法，如美國專利第4,522,811號所述的，可以制備所述懸浮液。
為了便于施用以及劑量的統(tǒng)一性，以劑量單位形式制備口服或腸胃外組合物是特別有利的。本文所用的劑量單位指的是適合作為治療患者的單位劑量的、在物理上獨立的單位；每個單位包含預定數(shù)量的活性化合物，它是計算出的能與需要的藥物載體一起產(chǎn)生需要的治療效果的用量。有關本發(fā)明劑量單位形式的規(guī)定，是由活性化合物的特征和要獲得的特定治療效果，以及本領域中在將所述活性化合物用于治療個體所固有的制約所決定的，并且直接取決于這些因素。
對于抗體而言，優(yōu)選劑量為0.1mg/kg至100mg/kg體重(一般10mg/kg至20mg/kg)。如果抗體作用在大腦，則通常合適的劑量為50mg/kg至100mg/kg。一般而言，部分人抗體和全長人抗體在人體中比其它抗體具有更長的半衰期。因此，經(jīng)?？捎幂^低的劑量和較低的給藥頻率。諸如脂化修飾可用于穩(wěn)定抗體并增加吸收和組織滲透(如，進入子宮頸上皮)。Cruikshank等.(1997)J.Acquired ImmuneDeficiency Syndromes and Human Retrovirology 14193描述了脂化抗體的方法。
本發(fā)明也提供了預防和/或治療子宮頸癌的疫苗組合物。本發(fā)明提供了子宮頸癌疫苗組合物，其中為了刺激抗子宮頸癌免疫應答而向患者導入表1的標記物蛋白、或表1的標記物蛋白的組合。本發(fā)明也提供了子宮頸癌疫苗組合物，其中向患者導入表達表1鑒定的標記物或其片段的基因表達構(gòu)建體，從而使患者中轉(zhuǎn)染的細胞產(chǎn)生了高于正常水平的由表1標記物編碼的蛋白或蛋白片段并引發(fā)免疫應答。
在一個實施方案中，提供并使用子宮頸癌疫苗作為預防子宮頸癌的免疫治療劑。在另一個實施方案中，提供并使用在子宮頸癌疫苗作為治療子宮頸癌的免疫治療劑。
作為例子，通過各種途徑施用疫苗，如皮內(nèi)、皮下、或經(jīng)肌肉施用，包含表1標記物蛋白的子宮頸癌疫苗可以用于預防和/或治療患者的子宮頸癌。另外，子宮頸癌疫苗可與佐劑和/或免疫調(diào)節(jié)劑一起施用以提升疫苗的活性和患者的應答。在一個實施方案中，適于持續(xù)或間隔釋放的包含所述疫苗的裝置和/或組合物可以植入體內(nèi)或以所述具有相對較慢釋放的材料局部應用于體內(nèi)。子宮頸癌疫苗可以與免疫調(diào)節(jié)分子一起導入，其可改變產(chǎn)生的免疫應答的類型從而產(chǎn)生更有效去除癌的應答。
在另一個實施方案中，通過肌肉注射，或通過微拋射體包被并利用為高速拋射入皮膚而設計的裝置，可以導入包含表1標記物表達構(gòu)建體的子宮頸癌疫苗。然后患者細胞會表達表1的標記物蛋白或蛋白片段并誘導出免疫應答。另外，子宮頸癌疫苗可以與免疫調(diào)節(jié)分子的表達構(gòu)建體一起導入，如細胞因子，其可增加免疫應答或調(diào)節(jié)產(chǎn)生的免疫應答的類型從而產(chǎn)生更有效去除癌的應答。
標記物核酸分子可以插入載體中并用作基因治療載體。通過如靜脈注射、局部給藥(美國專利第5,328,470號)，或通過定向注射(參見如Chen等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913054-3057)，可把基因治療載體遞送到患者體中?；蛑委熭d體藥物的制備可包括在可接受稀釋劑中的基因治療載體，或者可包含包埋了基因遞送介質(zhì)物的緩釋基質(zhì)?？蛇x地，從重組細胞中可以完整產(chǎn)生完整的基因遞送載體，如反轉(zhuǎn)錄病毒載體，所述藥物制備則可以包括一或多個能產(chǎn)生基因遞送系統(tǒng)的細胞。
所述藥物組合物可以與指導施用說明書一起包裝在容器、包裝物或分液器中。
V.預測醫(yī)學本發(fā)明涉及預測醫(yī)學領域，其中診斷試驗、預后試驗、藥物基因組學以及監(jiān)測臨床試驗用于預后(預測)目的從而預防性地治療個體。因此，本發(fā)明的一個方面涉及診斷試驗以確定一或多個蛋白或核酸標記物的表達水平，這是為了確定個體是否有發(fā)展成為宮頸癌的危險。這些試驗用于預后(預測)目的從而在癌癥發(fā)生前預防性地治療個體。
而本發(fā)明的另一方面涉及在臨床試驗中監(jiān)測試劑對本發(fā)明標記物表達或活性的影響(例如，施用藥物或其它化合物以抑制子宮頸癌或者治療或預防其它病癥{即為了了解所述處理過程可能有的對子宮頸癌的任一效果})。它們以及其它試劑在以下章節(jié)中會有進一步詳細敘述。
A.診斷試驗用作監(jiān)測生物樣本中蛋白或核酸標記物存在或不存在的示例方法包括從測試者中獲得生物樣本(如與子宮頸相關的體液)并且使生物樣本接觸能檢測多肽或核酸(如mRNA、基因組DNA、或cDNA)的化合物或試劑。因而本發(fā)明的檢測方法能在諸如體外和體內(nèi)的生物樣本中用于檢測mRNA、蛋白質(zhì)、cDNA、或基因組DNA。例如，mRNA的體外檢測技術(shù)包括Northern雜交和原位雜交。蛋白質(zhì)標記物的體外檢測技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、Western印跡、免疫沉淀以及免疫熒光法。基因組DNA的體外檢測技術(shù)包括Southern雜交。另外，蛋白質(zhì)標記物的體內(nèi)檢測技術(shù)包括向患者導入直接抗蛋白或其片段的標記的抗體。例如，用放射性標記來標記抗體，通過標準成像技術(shù)就能檢測出其在患者中的存在與位置。
所述診斷和預后試驗的普遍原理包括在合適條件下制備包含標記物的樣本或反應混合物和探針，并經(jīng)過一段時間足以使標記物和探針相互作用并結(jié)合，從而在反應混合物中形成能被分離和/或檢測的復合物?？梢杂酶鞣N方式進行這些試驗。
例如，進行這種試驗的一個方法可以包括把標記物或探針錨定在固相支持物上，也被稱為基質(zhì)，并在反應后檢測錨定在固相支持物上的目標標記物/探針復合物。在這種方法的一個實施方案中，將要測試標記物存在和/或濃度的患者樣本，可以被錨定在載體或固相支持物上。在另一個實施方案中，也可能是相反的情況，其中把探針錨定在固相上并把患者樣本當作試驗中未錨定成分來進行反應。
已有許多現(xiàn)成的方法可將試驗成分錨定到固相上去。這包括，但不僅限于，通過生物素和抗生物素蛋白鏈菌素結(jié)合固定的標記物或探針分子。這種生物素化的試驗成分可以利用本領域已知的技術(shù)(如，生物素化試劑盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)從生物素-NHS(N-羥基-琥珀酰亞胺)中制備，并固定于抗生物素蛋白鏈菌素包被的96孔板(Pierce Chemical)的孔中。在某些實施方案中，可以預制備固定了試驗成分的表面并儲存起來。
其它適于所述試驗的載體或固相支持物包括任何能結(jié)合標記物或探針所屬種類的分子材料。眾所周知的支持物或載體包括，但不僅限于，玻璃、聚苯乙烯、尼龍、聚丙烯、尼龍、聚乙烯、葡聚糖、淀粉酶、天然和修飾的纖維素、聚丙烯酰胺，輝長石以及磁石。
為了用上述方法進行試驗，向其上錨定了第二成分的固相物中加入未固定的成分。反應完成后，在形成的復合物仍會固定在固相上的條件下去除(如，洗去)未復合上去的成分。可以用在本文中所述的眾多方法來進行錨定在固相上的標記物/探針復合物的檢測。
在優(yōu)選實施方案中，當探針為未錨定的試驗成分時，為了試驗的檢測和讀出之用，可以用本文所討論的和本領域技術(shù)人員的眾所周知的可檢測標記來直接或間接地標記探針。
不通過進一步操作或標記這兩種成分(標記物或探針)也可以直接檢測標記物/探針復合物的組成，如通過利用熒光能量轉(zhuǎn)換技術(shù)(參見如，Lakowicz等，美國專利第5,631,169號；Stavrianopoulos等，美國專利第4,868,103號)。例如，選用在第一“供體”分子上的熒光標記，用合適波長的入射光來激發(fā)，其釋放的熒光能量用在第二“受體”分子上的熒光標記來吸收，其接著根據(jù)吸收的能量發(fā)出熒光?？蛇x地，“供體”蛋白質(zhì)分子可利用色氨酸殘基的天然熒光能量。選擇釋放不同光波長的標記，從而“受體”分子標記可以從“供體”的波長中區(qū)分出來。由于標記間能量轉(zhuǎn)換的效率與分子分離距離相關，因此可以測定出分子間的空間關系。在結(jié)合發(fā)生在分子之間的情況下，試驗中“受體”分子標記的熒光發(fā)射會變得最大。通過已知標準的熒光測定檢測方法(如利用熒光計)可以方便地測出FET結(jié)合情況。
在另一個實施方案中，不標記這兩種成分(探針或標記物)而就利用諸如實時生物分子相互作用分析(BIA)(參見如，Sjolander，S.和Urbaniczky，C.，1991，Anal.Chem.632338-2345以及Szabo等，1995，Curr.Opin.Struct.Biol.5699-705)等技術(shù)就能進行探針識別標記物能力的測定。在本文中使用的“BIA”或“表面等離子共振”，指的是不通過標記任何相互作用物(如，BIA核)而實時研究生物特異性相互作用的技術(shù)。結(jié)合表面質(zhì)量的改變(指示結(jié)合情況)導致近表面光折射率的改變(表面等離子共振(SPR)的光學現(xiàn)象)，這導致產(chǎn)生了能用作指示生物分子間實時反應的檢測信號。
可選地，在另一個實施方案中，可用液相中用作溶質(zhì)的標記物和探針來進行相似的診斷和預后試驗。在所述試驗中，通過眾多標準技術(shù)把復合的標記物和探針從未復合成分中分離出來，包括但不見限于差速離心、層析、電泳和免疫沉淀法。在差速離心法中，根據(jù)基于復合物不同大小和密度而造成的不同的沉淀平衡性，通過一系列離心步驟可以從未復合試驗成分中分離出標記物/探針復合(參見如，Rivas，G.和Minton，A.P.，1993，Trends Biochem Sci.18(8)284-7)。標準層析技術(shù)也可以用于把復合分子從未復合成分中分離出來。例如，凝膠過濾層析基于大小并通過利用凝膠柱中合適的凝膠過濾樹脂來分離分子，例如，相對較大的復合物可以從相對較小的未復合成分中分離出來。相似地，可以利用相對于未復合成分不同的標記物/探針復合物的電荷性質(zhì)來從未復合成分中分離出復合物，例如通過利用離子交換層析樹脂。所述樹脂和層析技術(shù)對本領域技術(shù)人員來說是眾所周知的(參見如，Heegaard，N.H.，1998，J.Mol.Recognit.Winter11(1-6)141-8；Hage，D.S.和Tweed，S.A.J Chromatogr B BiomedSci Appl 1997 Oct 10；699(1-2)499-525)。凝膠電泳也可以用來從未結(jié)合成分中分離復合的試驗成分(參見如，Ausubel等編著的CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，1987-1999)。例如在該技術(shù)中，根據(jù)大小或電荷來分離蛋白或核酸復合物。為了在電泳過程中保持相互結(jié)合作用，通常優(yōu)選非變性膠基質(zhì)材料和不存在還原劑的條件。特定試驗及其成分的合適條件對于本領域技術(shù)人員來說是眾所周知的。
在一個特定的實施方案中，利用本領域已知方法通過原位和體外形式的方法都可以用來確定生物樣本中的mRNA標記物的水平。術(shù)語“生物樣本”其意包括分離自患者的組織、細胞、生物液體及其分離物，以及患者體內(nèi)的組織、細胞和液體。許多檢測方法利用了分離的RNA。對于體外方法，任何不阻止mRNA分離的RNA分離技術(shù)可以用于從子宮頸細胞中純化RNA(參見如，Ausubel等編的CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York 1987-1999)。另外，可以利用本領域技術(shù)人已知的技術(shù)，比如Chomczynski的單步RNA分離流程(1989，美國專利第4,843,155號)，來迅速處理大量組織樣本。
分離的mRNA可以用于雜交或擴增試驗，其包括但不僅限于，Southern或Northern分析、聚合酶鏈式反應分析和探針陣列。一個優(yōu)選的檢測mRNA水平的診斷方法包括把分離的mRNA同核酸分子(探針)接觸，所述核酸分子能同要檢測基因編碼的mRNA雜交。例如，核酸分子探針可以是全長cDNA或其部分，比如寡核苷酸，其長度至少為7、15、30、50、100、250或500個核苷酸并足以在嚴謹條件下與編碼本發(fā)明標記物的mRNA或基因組DNA特異雜交。其它用在本發(fā)明診斷試驗中的合適探針也在本文中描述。mRNA同探針的雜交表明所考慮的標記物正在被表達。
在一種方式中，例如通過在瓊脂糖凝膠上分離mRNA并從膠上把mRNA轉(zhuǎn)移到諸如硝酸纖維的膜上，使得mRNA固定在固體表面上并與探針接觸。在可選的方式中，例如在Affymetrix基因芯片陣列中，使探針固定在固體表面上并使探針與mRNA接觸。本領域技術(shù)人員能夠容易改變已知的mRNA檢測方法使之用于檢測本發(fā)明標記物編碼的mRNA的水平上。
確定樣本中mRNA標記物水平的可選的方法包括核酸擴增方法，如用rtPCR(Mullis所闡述的實驗實例，1987，美國專利第4,683,202號)、連接酶鏈式反應(Barany，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88189-193)、自持續(xù)序列復制(Guatelli等，1990，Proc.Natl.Acad Sci.USA 871874-1878)、轉(zhuǎn)錄擴增系統(tǒng)(Kwoh等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173-1177)、Q-Beta復制酶(Lizardi等，1988，Bio/Technology 61197)、滾動循環(huán)復制(Lizardi等，美國專利第5,854,033號)或任何其它核酸擴增方法，接著利用本領域技術(shù)人員已知的技術(shù)來檢測擴增的分子。如果所述分子存在數(shù)量非常低，則這些檢測方案對于檢測核酸分子尤其有用。在此所用的擴增引物定義為核酸分子對，其能向基因(分別是正鏈和負鏈，或反之亦然)的5′或3′區(qū)域退火并在引物對間包含了一個小區(qū)域。一般地，擴增引物長度約為10至30個核苷酸并且側(cè)接有長度約50至200個核苷酸的區(qū)域。在合適條件下并用合適的試劑，則這些引物使得包含了與引物側(cè)接的核苷酸序列的核酸分子擴增。
對于原位方法，mRNA不必在檢測前從子宮頸細胞中分離出來。在該方法中，用已知組織學方法制備/處理細胞或組織樣本。然后將樣本固定于支持物上，通常是玻片，然后同能與編碼標記物的mRNA雜交的探針接觸。
作為進行測定標記物絕對表達水平的替換，測定可以基于標記物標準化了的表達水平。通過比較其與不作為標記物的基因的表達情況，如，與持續(xù)表達的家務基因，來糾正標記物絕對表達水平，使得表達水平標準化。用來標準化的合適基因包括家務基因，如肌動蛋白基因或上皮細胞特異性基因。標準化使得可以比較一個樣本(如患者樣本)同另一個樣本(如非子宮頸癌樣本)的表達水平，或不同來源樣本之間的表達水平。
可選地，表達水平可以規(guī)定為相對表達水平。為了測定標記物的相對表達水平，在測定所考慮的樣本表達水平前，用正常細胞對癌細胞分離物的10個或更多樣本來測定標記物的表達水平，優(yōu)選50個或更多樣本。測定更大量樣本中每個測試基因的平均表達水平并將其用作標記物表達水平的基準。然后，測試樣本所測得的標記物表達水平(絕對表達水平)除以該標記物所得的平均表達值。這就規(guī)定了相對表達水平。
優(yōu)選地，用于基準測定的樣本來自子宮頸組織的子宮頸癌或非子宮頸癌細胞。依據(jù)相對表達水平的應用來選擇細胞來源。把普通細胞中發(fā)現(xiàn)的表達情況用作平均表達分值以幫助確認所測的標記物是否是子宮頸特異性的(相對于普通細胞)。另外，當積累了更多的數(shù)據(jù)后，可以修正平均表達值，基于累積的數(shù)據(jù)得出改進的相對表達值。子宮頸細胞的表達數(shù)據(jù)提供了一種將子宮頸癌嚴重程度分級的方法。
在本發(fā)明另一個實施方案中，檢測蛋白標記物。本發(fā)明優(yōu)選的檢測蛋白標記物的試劑是能與該蛋白或其片段結(jié)合的抗體，優(yōu)選具有可檢測標記的抗體?？贵w可以是多克隆的，或更優(yōu)選地，是單克隆的?？梢允褂猛暾目贵w、或其片段或衍生物(如Fab或F(ab′)2)。術(shù)語“標記的”，其涉及引物或抗體時，其意在包括通過把可檢測物質(zhì)與探針或抗體偶聯(lián)而直接標記探針或抗體，以及通過與直接標記的其它試劑反應而間接標記探針或抗體。間接標記的例子包括利用熒光標記的第二抗體檢測第一抗體和用生物素末端標記DNA探針從而使其可用熒光標記的抗生物素蛋白鏈菌素來檢測。
利用本領域技術(shù)人員已知的技術(shù)可以分離子宮頸細胞的蛋白質(zhì)。例如，所用的蛋白質(zhì)分離方法如Harlow和Lane文(Harlow和Lane，1988，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)中所述的那樣。
可以用多種方法來確定樣本是否包含與特定抗體結(jié)合的蛋白。所述方法的例子包括，但不僅限于，酶標免疫實驗(EIA)、放射免疫實驗(RIA)、Western印跡分析以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。本領域技術(shù)人員可以容易改變已知的蛋白質(zhì)/抗體檢測方法來用于測定子宮頸細胞是否表達本發(fā)明的標記物。
在一種方法中，抗體或抗體片段或衍生物可以用在諸如Western印跡或免疫熒光技術(shù)的方法中來檢測表達的蛋白質(zhì)。在所述應用中，一般優(yōu)選把抗體或蛋白質(zhì)固定在固體支持物上。合適的固相支持物或載體包括任何能結(jié)合抗原或抗體的支持物。眾所周知的支持物或載體包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然和修飾的纖維素、聚丙烯酰胺，輝長石以及磁石。
本領域技術(shù)人員會知道許多其它結(jié)合抗體或抗原的合適載體，并能改變這種支持物以應用于本發(fā)明。例如，子宮頸細胞中分離的蛋白質(zhì)可以在聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳并固定于諸如硝酸纖維的固相支持物上。然后可以用合適的緩沖液洗滌支持物，接著用可檢測標記的抗體處理。然后第二次用緩沖液洗滌支持物以去除未結(jié)合的抗體。然后通過常規(guī)的方法檢測固體支持物上結(jié)合的標記的量。
本發(fā)明也包括檢測生物樣本(如子宮頸涂片)中蛋白或核酸存在的試劑盒?？梢杂盟鲈噭┖袦y定患者是否正患有或有極大危險發(fā)展成為子宮頸癌。例如，所述試劑盒可包含一種能檢測生物樣本中蛋白或核酸標記物的化合物或試劑以及測定樣本中蛋白或mRNA數(shù)量的裝置(如，結(jié)合蛋白或其片段的抗體，或結(jié)合編碼蛋白質(zhì)的DNA或mRNA的寡核苷酸探針)。試劑盒也可包括用于解釋用試劑盒得到結(jié)果的說明書。
對于基于抗體的試劑盒，所述試劑盒可包含，如(1)結(jié)合蛋白標記物的第一抗體(如，附著在固體支持物上的)；和，可選地，(2)不同的第二抗體，其結(jié)合蛋白或第一抗體并與可檢測標記連接。
對于基于寡核苷酸的試劑盒，所述試劑盒可包含，如(1)寡核苷酸，如，可檢測標記的寡核苷酸，其與編碼蛋白標記物的核酸序列雜交，或(2)用于擴增核酸分子標記物的引物對。所述試劑盒也可包含，如，緩沖劑、防腐劑或蛋白穩(wěn)定劑。所述試劑盒可進一步包含對于檢測可檢測標記所必需的成分(如酶或底物)。所述試劑盒也可包含一個對照樣本或一系列對照樣本，其可被檢測并與測試樣本相比較。所述試劑盒的每個成分可以與用于解釋用試劑盒進行試驗所得的結(jié)果的說明書一起包裝在單個容器中，而且各種容器都可以裝置在一個包裝物中。
B.藥物基因組學本發(fā)明的標記物也可用作藥物基因組學的標記物。這里所用的“藥物基因組學的標記物”指客觀的生化標記物，其表達水平與患者的特異臨床藥物反應或易感性相關(如參見McLeod等.(1999)Eur.J.Cancer 35(12)1650-1652)。藥物基因組學的標記物表達的存在或數(shù)量與用特定藥物或藥物種類治療的患者的預測反應有關，更具體地是與患者的腫瘤的預測反應有關。通過評估患者中的一或多個藥物基因組學的標記物表達的存在或數(shù)量，可以選出最適合于患者的或預計有更大成功程度的藥物療法。例如，對于治療患者可能存在的特異腫瘤，根據(jù)患者中特異腫瘤標記物編碼的RNA或蛋白的存在或數(shù)量，可以選出最優(yōu)化的藥物或治療流程。因此應用藥物基因組學的標記物可以在不用嘗試不同藥物或療法的情況下，對每個癌癥患者選出或設計出最合適的療法。
藥物基因組學的另一方面涉及改變身體對藥物作用的遺傳狀況。這些藥物遺傳狀況可以以罕見的缺陷或多態(tài)性而出現(xiàn)。例如，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏是常見的遺傳性先天性代謝病，其中主要臨床并發(fā)癥是在攝取氧化藥物(抗瘧疾藥、磺胺藥、鎮(zhèn)痛藥、硝基呋喃)和食用蠶豆后出現(xiàn)溶血。
作為一種說明性實施方案，藥物代謝酶的活性是藥物作用強度和持久性的主要決定因素。藥物代謝酶(如，N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2(NAT 2)和細胞色素P450酶CYP2D6和CYP2C19)遺傳多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)給出了解釋，即為什么有些患者在服用藥物的標準和安全劑量后沒有獲得預期的藥效或者顯示出過大的藥物反應和嚴重的毒性。這些多態(tài)性在人群中表現(xiàn)為兩種表型，即充分代謝型(EM)和不良代謝型(PM)。不同群體中PM的傾向不同。例如，編碼CYP2D6的基因是高度多態(tài)性，而且已經(jīng)在PM中鑒定出數(shù)個突變，其均導致功能性CYP2D6缺失。CYP2D6和CYP2C19的不良代謝型在其接受標準劑量后通常會出現(xiàn)過大的藥物反應和副作用。假如代謝物是活性治療成分的話，則PM將不顯示治療反應，正如通過其CYP2D6形成的代謝物嗎啡介導的可待因的鎮(zhèn)痛效果所證實的。其它極端情況是所謂的超快代謝型，其對標準劑量沒有反應。近來，已確定出超快代謝的分子基礎是由于CYP2D6基因擴增。
因此，可以測定本發(fā)明標記物在個體中的表達水平從而選出治療或預防個體的合適試劑。另外，可以利用藥物基因組學研究運用編碼藥物代謝酶的多態(tài)性等位基因的基因型來鑒定個體的藥物反應表型。該知識，當應用于劑量或藥物選擇時，能夠避免不良反應或治療失敗，因而在用本發(fā)明標記物表達的調(diào)節(jié)劑治療患者時，可增強治療或預防功效。
C.監(jiān)測臨床試驗監(jiān)測試劑(如，藥物化合物)對本發(fā)明標記物表達水平的影響不僅可以用在基礎藥物篩選中，而且可用在臨床試驗中。例如，在接受子宮頸癌治療的患者的臨床試驗中能檢測試劑影響標記物表達的效力。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種用試劑(如，激動劑、拮抗劑、模擬肽、蛋白、肽、核酸、小分子、或其它候選藥物)監(jiān)測患者治療有效性的方法，包括如下步驟(i)在施用試劑前從患者中獲取用藥前的樣本；(ii)檢測用藥前樣本中一個或多個所選的本發(fā)明標記物的表達水平；(iii)從患者中獲取一個或多個用藥后樣本；(iv)檢測用藥后樣本中的標記物的表達水平；(v)把用藥前樣本中的標記物表達水平同用藥后樣本或樣本群中的標記物表達水平相比較；和(vi)據(jù)此改變向患者施用的試劑。例如，在治療過程中標記物的增加表達可以顯示出無效的劑量和增加劑量的需求。相反地，標記物的減少表達可以顯示出有效的治療并且不需要改變劑量。
D.電子設備可讀介質(zhì)和陣列這也提供了包括本發(fā)明標記物的電子設備可讀介質(zhì)。在本文中所用的“電子設備可讀介質(zhì)”是指任何用于儲存、保持或容納數(shù)據(jù)或信息的介質(zhì)，其可用電子設備直接讀出和訪問。這種介質(zhì)包括，但不僅限于磁儲存介質(zhì)，如軟盤、硬盤儲存介質(zhì)、和磁盤；光儲存介質(zhì)，如光盤；電儲存介質(zhì)，如RAM、ROM、EPROM、EEPROM以及類似物；一般的硬盤和這些種類的混合產(chǎn)品，如磁/光儲存介質(zhì)。改變或配置介質(zhì)使其上記錄本發(fā)明的標記物。
在本文中使用時，術(shù)語“電子設備”其意在包括為存儲數(shù)據(jù)或信息而配置或改變的任何合適的計算或處理設備或其它裝置。適合用于本發(fā)明的電子設備的例子包括獨立計算設備；網(wǎng)絡，包括局域網(wǎng)(LAN)、廣域網(wǎng)(WAN)因特網(wǎng)、企業(yè)內(nèi)部互聯(lián)網(wǎng)以及外部互聯(lián)網(wǎng)；電器，如個人數(shù)字助理(PDA)、手機、尋呼機及類似物；和本地或分布式處理系統(tǒng)。
在本文中使用時，“記錄”是指用于在電子設備可讀介質(zhì)上儲存或編碼信息的過程。本領域技術(shù)人員能夠容易地采用當前已知的任何方法在已知的介質(zhì)上記錄信息來生產(chǎn)包括本發(fā)明標記物的產(chǎn)品。
可用各種軟件和格式在電子設備可讀介質(zhì)上儲存本發(fā)明標記物信息。例如，核酸序列標記物可以用字處理文本文件來表示，其可用商業(yè)化軟件的格式，如WordPerfect和MicroSoft Word，或者用ASCII文件的形式來表示，其儲存于數(shù)據(jù)庫應用程序中，如DB2、Sybase、Oracle或類似程序，以及用其它形式。為了獲得或創(chuàng)建其上記錄有本發(fā)明標記物的介質(zhì)，可以用許多數(shù)據(jù)處理結(jié)構(gòu)格式(如文本文件或數(shù)據(jù)庫)。
通過以可讀形式提供本發(fā)明標記物，技術(shù)人員可以為各種目的定期地訪問標記物序列信息。例如，所屬領域技術(shù)人員可以用本發(fā)明可讀形式的核苷酸或氨基酸序列來把靶序列或靶結(jié)構(gòu)基序同儲存在數(shù)據(jù)儲存裝置中的序列信息相比較。利用檢索方法來鑒定本發(fā)明序列中符合特定靶序列或靶結(jié)構(gòu)基序的片段或區(qū)域。
因此本發(fā)明提供了一種為執(zhí)行確定患者是否患子宮頸癌或易患子宮頸癌的方法而保存指令的介質(zhì)，其中所述方法包括確定標記物存在或不存在的步驟，并基于標記物的存在或不存在，確定患者是否患子宮頸癌或易患子宮頸癌和/或推薦特定的治療子宮頸癌或子宮頸癌前狀態(tài)的方法。
本發(fā)明進一步在電子系統(tǒng)和/或網(wǎng)絡中提供一種確定患者是否患子宮頸癌或易患與標記物相關的子宮頸癌的方法，其中所述方法包括確定標記物存在或不存在的步驟，并基于標記物的存在或不存在，確定患者是否患子宮頸癌或易患子宮頸癌，和/或推薦特定的治療子宮頸癌或子宮頸癌前狀態(tài)的方法。該方法可以進一步包括接受同患者相關的表型信息和/或從網(wǎng)絡中獲得同患者相關的表型信息的步驟。
本發(fā)明也在網(wǎng)絡中提供了一種確定患者是否患子宮頸癌或易患與標記物相關的子宮頸癌的方法，所述方法包括接受同標記物相關信息、接受同患者相關的表型信息、從網(wǎng)絡中獲得相應的標記物和/或子宮頸癌信息的步驟，并基于一個或多個表型信息、標記物、和所獲得的信息，確定患者是否患子宮頸癌或易患子宮頸癌。該方法可以進一步包括推薦特定的治療子宮頸癌或子宮頸癌前狀態(tài)的的步驟。
本發(fā)明也提供了一種確定患者是否患子宮頸癌或易患子宮頸癌的商業(yè)方法，所述方法包括接受同患者相關的表型信息、從網(wǎng)絡中獲得相應的標記物和/或子宮頸癌信息的步驟，并基于一個或多個表型信息、標記物、和所獲得的信息，確定患者是否患子宮頸癌或易患子宮頸癌。該方法可以進一步包括推薦特定的治療子宮頸癌或子宮頸癌前狀態(tài)的的步驟。
本發(fā)明也包括一種包含本發(fā)明標記物的陣列。所述陣列可用于檢測陣列中一個或多個基因的表達。在一個實施方案中，陣列可用于檢測組織中的基因表達以確定陣列中基因的組織特異性。用這種方式，可同時測試多至7600個基因的表達。這可以開發(fā)特征圖譜以顯示在一個或多個組織中特異表達的一組基因。
除了這些定性測定方法，本發(fā)明可以定量基因表達的情況。因此，不僅是組織特異性的，而且組織中一組基因的表達水平也是能確定的。因此，基因可以基于其組織表達本身和該組織中表達水平來分組。例如，這可用在確定組織之間的基因表達的關系中。因此，可以干擾一個組織并且測定對第二個組織中的基因表達的影響。在本文中，可以測定一種細胞類型對另一種細胞類型響應生物刺激的影響。例如，這種測定方法可用于了解在基因表達水平上的細胞-細胞相互作用的影響。如果治療性地施用試劑以處理一種細胞類型，但其具有對另一種細胞類型的不良影響，則本發(fā)明提供了一種測試以確定不良影響的分子基礎并據(jù)此提供聯(lián)用中和試劑或其它處理不良影響的時機。相似地，即使在單一細胞類型中，也可以在分子水平上測定不良生物影響。因此，可以確定并抵消試劑對于除靶基因之外的基因表達的影響。
在另一個實施方案中，所述陣列可被用于監(jiān)測陣列中一個或多個基因表達的時間過程。如此所述，這可以發(fā)生在各種生物關系中，例如子宮頸癌的發(fā)展、子宮頸癌的進程、以及過程，如與子宮頸癌相關的細胞轉(zhuǎn)化。
所述陣列也可用于確定在相同細胞中或在不同細胞中一個基因表達對另外的基因表達的影響。這提供了，如在不能調(diào)節(jié)最終或下游靶位時，可以選擇用于介入治療的替代的分子靶位。
所述陣列也可用于確定在正?；虍惓５募毎幸粋€或多個基因不同的表達模式。這提供了一組基因，其能用作介入診斷或治療的分子靶位。
E.替代標記物本發(fā)明的標記物可以用作一種或多種失調(diào)或疾病狀態(tài)或者導致病態(tài)狀態(tài)的替代標記物，尤其是子宮頸癌的。這里所用的“替代標記物”是一個客觀的生化標記物，其與疾病或失調(diào)的缺失或存在、或與疾病或失調(diào)的進程相關(如，與腫瘤的存在或不存在)。所述標記物的存在或數(shù)量不依賴于疾病。因而，這些標記物用來顯示特定治療過程是否能有效減輕病態(tài)或失調(diào)。當病態(tài)或失調(diào)難以用標準方法來評估時(如早期階段的腫瘤)，或在達到潛在危險的臨床點前已需要評估疾病進程時(如，在心肌梗塞或完全發(fā)展成AIDS的不良臨床結(jié)果顯現(xiàn)前，用膽固醇水平作為替代標記物進行評估心血管疾病，和用HIV RNA水平作為替代標記物進行分析HIV感染)，替代標記物尤其有用。現(xiàn)有的替代標記物應用的例子包括Koomen等.(2000)J.Mass.Spectrom.35258-264；和James(1994)AIDS Treatment News Archive 209。
本發(fā)明的標記物也可用作藥效學標記物。這里所用的“藥效學標記物”是一個客觀的生化標記物，其特異地與藥物效果相關。藥效學標記物的存在或數(shù)量并不與藥物所施用的病態(tài)或失調(diào)相關；因此，藥效學標記物的存在或數(shù)量可作為患者的藥物存在或活性的指試標準。例如，藥效學標記物可作為生物組織中藥物濃度的指試標準，其中標記物在與藥物水平相關的組織中可以是被表達的或轉(zhuǎn)錄的，或是未被表達或轉(zhuǎn)錄的。以這種方式，用藥效學標記物監(jiān)測藥物的分布或吸收。相似地，藥效學標記物的存在或數(shù)量與藥物代謝產(chǎn)物的存在或數(shù)量相關，如藥效學標記物的存在或數(shù)量可作為體內(nèi)的藥物相對衰減率的指試標準。藥效學標記物尤其可應用于增加檢測藥物效果的靈敏度，尤其在以低劑量施用藥物的時候。由于即使是少量的藥物也足以活化大量標記物的轉(zhuǎn)錄或表達，因此擴增的標記物在量上比藥物本身更容易檢測。而且，由于標記物本身的性質(zhì)使得標記物更容易檢測；例如，利用在此所述的方法，在基于免疫的監(jiān)測系統(tǒng)中用抗體做蛋白標記物，或用標記物特異性放射性標記探針來檢測mRNA標記物。另外，對于可能超出直接觀察范圍之外的藥物治療，應用藥效學標記物可以提供以機理為基礎的風險預測。現(xiàn)有應用藥效學標記物的例子包括Matsuda等的US 6,033,862；Hattis等.(1991)Env.Health Perspect.90229-238；Schentag(1999)Am.J.Health-Syst.Pharm.56 Suppl.3S21-S24；和Nicolau(1999)Am，J.Health-Syst.Pharm.56 Suppl.3S16-S20。
實施例1用cDNA和組織微陣列鑒定子宮頸癌標記物I.材料和方法樣本收集和RNA制備收集子宮頸組織并速凍于液氮中。在進行提取RNA前先確認組織的組織結(jié)構(gòu)和細胞成分。利用Trizol試劑(Life Technologies)從冷凍的組織中提取總RNA，接著用Qiagen的Rneasy試劑盒進行二次洗滌步驟以增加RNA探針標記的效率(Qiagen，Valencia CA)。利用AgilentTechnologies 2100型生物分析儀計算28S/18S核糖體RNA比率，比率至少為1.0的RNA才應用于本研究中。
cDNA微陣列雜交包括得自Research Genetics(Hunstville，AL)的30,732個單基因克隆的cDNA微陣列點樣在尼龍濾膜上。通過反轉(zhuǎn)錄方法使用33P-dCTP、寡dT-30引物以及Superscript II反轉(zhuǎn)錄酶(Life Technologies)，把總共4-6μg的總RNA用作模板以制備放射性標記的cDNA。用cot-1DNA和聚dA 40-60(Pharmacia，Peapack，NJ)預退火33P標記的第一鏈cDNA以減少非特異性雜交。用約6×106個計數(shù)單位的標記的引物在緩沖液中在65℃下雜交每塊濾膜16小時，緩沖液包含7％十二烷基磺酸鈉(SDS)、250mM Na3PO4(pH 7.2)、1mM EDTA、0.5％酪蛋白-Hammerstein和0.1mg/ml鮭魚精子DNA。用4％和1％SDS洗滌緩沖液(20mM Na3PO4(pH 7.2)，1mM EDTA和4％或1％SDS)洗濾膜后，將其置于Fuji磷光成像儀屏幕下并用BAS 2500型掃描儀掃描。用由Millennium Pharmaceuticals公司開發(fā)的自動分析程序GridGuru v1.0定量這些點。
標記物得分算法和數(shù)據(jù)處理為糾正雜交效率的差異，用濾膜上所有點的中值強度來標準化每個陣列濾膜上的數(shù)字化數(shù)據(jù)。進行基于陣列和基于基因的分級分類并用Stanford的基因簇和樹可視軟件使之可視化。通過計算每個基因的標記物得分使差異表達的基因分級。
為計算標記物得分，把樣本分成對照和試驗組。標記物得分的起始點是試驗樣本高于對照樣本的平均變化倍(率)。設計得分使之反映出差異表達的變化程度(表達率)和試驗樣本數(shù)，而不被少部分有很高數(shù)值的測試樣本所支配。為減少該“逸出值”效應，把大于10的表達率故意當作表達率為10的來處理。在得出試驗樣本平均變化倍數(shù)前，用漸近壓縮函數(shù)通過改變試驗對照表達率來完成所需的標記物得分運算。當試驗組并不比對照更高表達時，標記物得分記為1，反之則值大于1。任何基因的標記物得分不會超過10。
因此，基因g的標記物得分Sg計算作為試驗對照的壓縮比率平均值Sg＝(∑Sgs)/N試驗Sgs＝C(xgs/(k+xgQ))，其中Sgs代表基因g和樣本s的標記物得分，C(r)是壓縮函數(shù)，當r≥1時C(r)＝A(1-e-r/A)，且當r＜1時C(r)＝1，A是變化倍數(shù)的上漸近數(shù)(我們用10)，xgs是樣本s中基因g的表達值，xgQ是樣本表達值的百分之Q；通常，Q＝50，k是反映數(shù)據(jù)中外加噪聲的常數(shù)，如，重復測量中變量的固定分量。該參數(shù)從用微陣列技術(shù)的校準試驗中得到0.25的值。
N試驗試驗樣本的數(shù)量。
組織微陣列的原位雜交這里提供一種福爾馬林固定的、石蠟包埋的子宮頸組織微陣列，其包含從正常、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)、高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)、鱗狀細胞癌(SCC)和腺癌(ACA)中獲得的中心組織。用自動組織-Tek DRS 2000型滑動染色儀(Sakura，Torrance，CA)根據(jù)前述方法(Duncan，L.M.，等，2001，J.Clin.Oncol.19(2)568-576)來進行預雜交處理。用含4％多聚甲醛的PBS對子宮頸組織脫蠟、再水化，之后固定15分鐘。用PBS洗后，用2μg/ml蛋白酶K于37℃消化組織微陣列15分鐘，再用4％多聚甲醛/PBS溫育10分鐘。接著用0.2N HCl溫育組織切片10分鐘，用0.25％醋酸酐/0.1mol/L三羥乙基胺溫育10分鐘，并用乙醇梯度脫水。利用源自IMAGE克隆的500ng線性化質(zhì)粒DNA，用體外轉(zhuǎn)錄反應中的35S-UTP(RiboprobeCombination System，Promega，Madison，WI)標記反義探針。利用含5×107cpm/ml的標記探針的10mM Tris-HCl(pH 7.6)緩沖液在50℃下雜交18小時，其中緩沖液包含50％甲酰胺、10％葡聚糖硫酸酯、1x Denhardt氏溶液、0.6M NaCl、10mM DTT、0.25％SDS和200μg/mltRNA。雜交后，用5x標準檸檬酸鹽液(SSC)在50℃下洗玻片10分鐘，用50％甲酰胺/2X SSC在50℃下洗30分鐘，用10mM Tris-HCl(pH 7.6)/500mM NaCl/1mM EDTA(TNE)在37℃下洗10分鐘，在含10μg/ml RNA酶的TNE中在37℃下溫育30分鐘，用TNE在37℃下洗板10分鐘，在2x SSC中在50℃下一次溫育20分鐘，在0.2xSSC中在50℃下二次溫育20分鐘，并用乙醇梯度脫水。在Kodak NTB2型照相乳膠(Eastman Kodak，Rochester，NY)中浸泡玻片并在4℃下曝光14-21天，以此測定mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的位置。玻片用Myers蘇木精和乙醇曙紅Y復染。
II.結(jié)果子宮頸組織cDNA微陣列的轉(zhuǎn)錄圖譜在包含30,732個克隆的cDNA微陣列(30K微陣列)上測定12個正常子宮頸組織(9個來自子宮頸陰道部，3個來自子宮頸內(nèi)膜)、5個LSIL、5個HSIL、9個SCC和3個ACA的圖譜。為評估數(shù)據(jù)集合區(qū)分疾病和正常組織的能力，基于基因表達模式的整體相似性來進行34個樣本數(shù)據(jù)集合的分級分組(圖1)。樹狀圖顯示12個正常子宮頸組織中的10個和所有的LSIL樣本集中在一組中(定為“對照組”)，而12個腫瘤樣本中的11個和5個HSIL樣本中的3個集中在另一組中(定為“疾病組”)。該分離顯示正常子宮頸陰道部上皮、正常子宮頸內(nèi)膜上皮和LSIL的總體基因表達圖譜非常相似，然而3/5HSIL樣本更像子宮頸癌。這些發(fā)現(xiàn)顯示盡管從不同年齡的患者和不同臨床位置取樣，但健全的數(shù)據(jù)集合能夠從疾病組織中區(qū)分出對照組織。
標記物篩選為了鑒定能區(qū)分對照組與疾病組的基因標記物，在30K cDNA微陣列上從三個標記物篩選示例中計算出每個克隆的標記物得分9個SCC比對照組(9個子宮頸陰道部，3個子宮頸內(nèi)膜和5個LSIL)、5個HSIL比對照組和3個ACA比對照組。為了揭示與子宮頸細胞轉(zhuǎn)化相關的新標記物，在標記物篩選中排除與免疫應答相關的上調(diào)基因(如免疫球蛋白、MHC)。SCC或ACA示例中標記物得分前50位的克隆和在50至100位之間的在SCC和ACA樣本中過表達的克隆選為頂級標記物。HSIL示例中的得分并不獨立于選擇標記物而使用，因為考慮到腫瘤中增加的表達對于好的標記物的表現(xiàn)來說是至關重要的。選擇標記物，它們在SCC、ACA和HSIL示例中的得分如表4所示。發(fā)現(xiàn)SCC樣本中的大多數(shù)上調(diào)基因也在ACA中提高。當許多從SCC和/或ACA示例中篩選出的標記物得分≥3.0時，而僅有一些HSIL標記物得分超過2.0，這顯示增加表達可看作從發(fā)育異常至擴散性腫瘤的損傷發(fā)展。圖2顯示表4的兩個基因，它們在正常、LSIL、HSIL、SCC和ACA組織中表現(xiàn)出典型而又明顯不同的表達模式類型。在HSIL、鱗狀細胞瘤和腺瘤中過表達了MCM 6，而僅有鱗狀細胞瘤過表達了Claudin 1。
為了解這些上調(diào)基因的特征，基于所有臨床樣本的表達圖譜進行分級分類。這些過表達的基因分成兩個主要的組別。一個組主要由編碼細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白(膠原蛋白、層蛋白、粘連蛋白)或者起著細胞-ECM相互作用或ECM降解和重塑作用的蛋白(如成骨蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶、尿激酶)的基因組成。另一組包括許多涉及細胞復制和增殖的基因。實例包括DNA復制許可因子(MCM 6)、拓撲異構(gòu)酶2A以及腫瘤基因B-Myb。
標記物的原位雜交(ISH)確認也可用ISH評估臨床組織樣本中的標記物。利用組織微陣列進行ISH實驗以確認轉(zhuǎn)錄圖譜結(jié)果并測定起著增加mRNA表達作用的細胞類型。根據(jù)石蠟切片的水平檢測26-87個正常子宮頸中心組織(來自子宮頸陰道部和子宮頸內(nèi)膜)、2-10個LSIL、5-33個HSIL和10-21個癌中心組織(包括SCC、ACA和低分化腫瘤)。一般的，檢測子宮頸上皮細胞中的ISH信號(表5)。上皮細胞中過表達的基因起著細胞生長和細胞-ECM相互作用。上皮細胞差異表達多種基因。該發(fā)現(xiàn)暗示了癌發(fā)展期間在子宮頸上皮和其微環(huán)境之間等價的基因調(diào)節(jié)。
對代表基因claudin 1進行顯微照相。正常的子宮頸和子宮頸內(nèi)/外膜組織和LSIL中只有很少的或沒有來自Claudin 1探針的信號。基因表達在HSIL中提高了并在子宮頸腫瘤中進一步提高。Claudin 1的表達僅限于上皮，而在cDNA微陣列上測定的5個HSIL和3個ACA樣本中沒有明顯的升高(圖2)。不受理論所限，該例中ISH增加的靈敏度可能是由于信號的焦點性質(zhì)造成的。通過ISH，這種焦點信號是很顯見的，但是其可能在RNA制備時的全組織勻漿中丟失。
由于子宮頸篩選評估了子宮頸上皮脫落的細胞的形態(tài)變化，因此基質(zhì)細胞不可能在Pap測試樣本中出現(xiàn)。因此標記物篩選集中于那些能在子宮頸發(fā)育異常和擴散性腫瘤的上皮細胞中差異表達的候選標記物。為了解不同類型的子宮頸損傷和腫瘤中每種標記物升高的頻率，用所有微陣列上的中心組織進行頻率計算。計算基于半定量隨機評分法。信號的計分范圍是從0至30-無信號；1-弱而模糊的信號；2-確定的弱至中等的信號；3-強至非常強的信號。表6顯示本發(fā)明標記物的評分結(jié)果。要認為是陽性的，則中心組織必須具有≥2的信號分值。在微陣列包含一個病人的超過一個中心組織的情況下，陽性認定必須是至少50％的中心組織≥2。為了更好地使結(jié)果可視化，以正常子宮頸組織陽性中心增加的頻率為順序來提供選出的標記物。發(fā)現(xiàn)標記物升高的頻率與臨床異常狀態(tài)高度相關，并在一個從標記物至特定臨床狀態(tài)標記物的大范圍內(nèi)變化。例如，IFI27具有相對較高(＞20％)的正常子宮頸組織的陽性中心，而諸如ITGB6和CLDN1的標記物在正常組織中相對較低并在LSIL和HSIL中開始升高。BST2陽性中心出現(xiàn)在腫瘤進程的較晚階段，在從高度癌變前病變至擴散性疾病的轉(zhuǎn)變之中。這些發(fā)現(xiàn)證實了在子宮頸癌發(fā)展期間存在能鑒別連續(xù)分子變化的標記物。
實施例2基因表達分析RNA制備按照廠商的說明書(Invitrogen)利用TRIZOL試劑，用單步法從各種人體組織中提取總RNA。用DNA酶I(Ambion)在37℃下處理每個要制備的RNA 1小時。利用β-2微小球蛋白作為內(nèi)部擴增對照，樣本如果需要至少38個PCR擴增循環(huán)以達到熒光閾值水平(或18s核糖體基因進行35個PCR擴增循環(huán))，則確定DNA酶I處理已完成。DNA酶I處理后，通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色來確認RNA樣本的完整性。用酚抽提后，根據(jù)廠商的說明書(Applied Biosytems)利用Taqman反轉(zhuǎn)錄試劑從樣本中制備cDNA。未加反轉(zhuǎn)錄酶的RNA負對照也模仿對每個RNA樣本進行反轉(zhuǎn)錄。
TAQMAN用TAQMAN定量PCR(Applied Biosytems)測定各種正常和疾病(如，癌的)人體組織或細胞系中制得的cDNA中的基因表達。
探針的制備基于特定基因及其相關轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物序列，用Primer Express軟件(Applied Biosystems)設計探針。每個靶基因探針用FAM(6-羧基熒光素)標記，而18s對照探針用不同的熒光染料VIC來標記。因此靶基因和內(nèi)部對照基因不一樣的標記能使測定在同一個孔中進行。檢測引物和探針對特定基因的每個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的靈敏度和特異性。把18s和靶基因的正向或反向引物和探針加入到TAQMAN通用PCR主要混合液(Applied Biosystems)中。盡管引物和探針的終濃度可能發(fā)生變化，但是每個在特定實驗中都是內(nèi)在一致的。典型的實驗包含18s的100nM正向和反向引物加上200nM探針和靶基因的900nM正向或反向引物加上250nM探針。在ABI PRISM 7700型序列檢測系統(tǒng)(AppliedBiosystems)上進行TAQMAN基質(zhì)實驗。熱循環(huán)條件如下50℃下維持2分鐘并在95℃下維持10分鐘，接著兩步95℃下15秒40個循環(huán)的PCR，接著60℃下1分鐘。
相對于相同組織中的18s表達，應用以下方法定量計算各種組織中的基因表達。閾循環(huán)(Ct)值定義為檢測到的統(tǒng)計上熒光明顯增加的循環(huán)。較低的Ct值指示了較高的mRNA濃度。應用以下公式ΔCt＝Ct(靶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)-Ct(18s)，扣除18s核糖體基因的Ct值使基因的Ct值標準化從而獲得ΔCt值。然后用2-ΔCt給出的算術(shù)公式計算相對表達。然后用數(shù)字表示每個所測的組織中的靶基因的表達(表9-13)。表9-13鑒定了樣本(樣本#)、組織病期和靶基因的表達。假如可行，被測試的標記物(列于表1)也可用變體、引物和探針(列于表7)來鑒定。例如在表12中，與M30A[1]相應的數(shù)據(jù)用表7中所鑒定的正向引物1(F1)、反向引物1(R1)和探針1(P1)鑒定出標記物M30A。
用末端PCR進行的基因表達分析集中不同組織的總RNA以用作產(chǎn)生第一鏈cDNA的模板。子宮頸欄由子宮頸腫瘤庫、子宮頸正常組織庫、“其它正常組織”庫和“其它腫瘤”庫組成。庫由等量的每個樣本組成。

應用ThermoScript RT-PCR系統(tǒng)(Invitrogen，San Diego，CA)獲取cDNA。按照廠商的說明書，1μgRNA和1μl 50μM寡(dT)20引物以10μl體積在65℃下變性5分鐘。在85℃下溫育5分鐘從而終止反應。最終產(chǎn)物用水稀釋成最終體積100μl。
就在開放閱讀框起始點或外面設計出基因特異性引物(表7)。根據(jù)引物和期望產(chǎn)物的大小優(yōu)化PCR的條件。通過降低的循環(huán)條件把2μl cDNA用于20μl反應體系中。在包含瓊脂糖凝膠的溴化乙啶中處理產(chǎn)物。然后對凝膠圖片進行半定量分析并評分。
對組織欄中的末端PCR的溴化乙啶瓊脂糖凝膠圖片在0-5的范圍內(nèi)進行評分(表8)。由3人獨立對每個圖片評分并匯編其結(jié)果。比較結(jié)果以證實在條帶的相對強度上是一致的并在需要的地方進行修飾。然后把3個得分的中值記為最終得分。
表中提供的數(shù)據(jù)概述表1鑒定了本發(fā)明的標記物(SEQ ID NO1-44)，它們表示成名稱(“標記物”)，如果可行的話，則表示成該基因所眾所周知的名稱(“基因名稱”)，由標記物編碼或相應于標記物的核苷酸轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA序列的序列表標識(“SEQ ID NO(nts)”)、由核苷酸轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物編碼的蛋白的氨基酸序列的序列表標識(“SEQ ID NO(AAs)”)、以及cDNA序列中的蛋白編碼序列的位置(“CDS”)。
表2和3列出了新鑒定的核苷酸和氨基酸序列，它們表示成名稱(“標記物”)，如果可行的話，則表示成該基因所眾所周知的名稱(“基因名稱”)、由標記物編碼或相應于標記物的核苷酸轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA序列的序列表標識(“SEQ ID NO(nts)”)、由核苷酸轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物編碼的蛋白的氨基酸序列的序列表標識(“SEQ ID NO(AAs)”)、以及cDNA序列中的蛋白編碼序列的位置(“CDS”)。
表4鑒定了本發(fā)明的標記物及其在SCC、ACA和HSIL中的標記物得分。表4的標記物表示成名稱(“標記物”)，如果可行的話，則表示成該基因所眾所周知的名稱(“基因名稱”)、鱗狀細胞癌范例的標記物得分(“SCC得分”)、腺癌示例的標記物得分(“ACA得分”)、以及高度鱗狀上皮內(nèi)病變范例的標記物得分(“HSIL得分”)。
表5列出了子宮頸癌中用原位雜交鑒定出過表達的標記物并指出了標記物表達的位置。表5的標記物表示成名稱(“標記物”)，如果可行的話，則表示成該基因所眾所周知的名稱(“基因名稱”)、子宮頸上皮細胞中檢測到的原位雜交信號(“信號定位”)。
表6列出了子宮頸發(fā)育異常的上皮細胞和擴散性腫瘤中的標記物的差異表達。表6的標記物表示成名稱(“標記物”)，如果可行的話，則表示成該基因所眾所周知的名稱(“基因名稱”)，并對每一個標記物，則列出表示為標記物升高頻率(“頻率”)和子宮頸陰道部和子宮頸內(nèi)膜細胞(“正常(EC+END)”)中的陽性數(shù)比患者數(shù)的比值(“#陽性/#患者”)、標記物升高頻率(“頻率”)和低度鱗狀上皮內(nèi)病變(“LSIL”)中的陽性數(shù)比患者數(shù)的比值(“#陽性/#患者”)、標記物升高頻率(“頻率”)和高度鱗狀上皮內(nèi)病變(“HSIL”)中的陽性數(shù)比患者數(shù)的比值(″#陽性/#患者″)、以及標記物升高頻率(“頻率”)和鱗狀細胞癌和腺癌(“腫瘤(SCC+ACA)”)中的陽性數(shù)比患者數(shù)的比值(“#陽性/#患者”)。
表7列出了基因特異性引物。表7鑒定了標記物，它們表示成名稱(“標記物”)、對應于Taqman引物1匹配位置的基因特異性引物(“匹配位置Taqman引物1”)、對應于Taqman引物2匹配位置的基因特異性引物(“匹配位置Taqman引物2”)、對應于Taqman探針匹配位置的基因特異性引物(“匹配位置Taqman探針”)、對應于末端PCR引物1匹配位置的基因特異性引物(“匹配位置末端PCR引物1”)、以及對應于末端PCR引物1匹配位置的基因特異性引物(“匹配位置末端PCR引物1”)。表7鑒定了正向1的(“F1”)；正向2的(“F2”)；反向1的(“R1”)；反向2的(“R2”)引物，以及探針(“P1”表示探針1；以及“P2”表示探針2)。
表8列出了組織欄的末端PCR溴化乙錠瓊脂糖凝膠圖片中范圍在0-5的得分。表8鑒定了標記物，它們表示成名稱(“標記物”)、以及所用的樣本(“正常子宮頸”和“子宮頸腫瘤”)。
表9-13鑒定了每個所測組織中靶基因的表達。表9-13鑒定了樣本，它們表示成數(shù)量(“樣本#”)、樣本的組織病期(“組織病期”)、和靶基因的表達(“基因名稱”)。表9-13也鑒定了與表1中所列的標記物名稱相對應的標記物名稱、引物和探針(列于表7)，如果可行的話，則是經(jīng)過檢測的。例如，在表12中，與“M30A[1]”相對應的數(shù)據(jù)利用表7所述的正向引物1(F1)、反向引物1(R1)和探針1(P1)鑒定了標記物。
利用前述方法獲得的標記物不應被解釋作為限制。本申請全文中引用的所有參考文獻、數(shù)據(jù)庫、專利和公開的專利申請都明確地并入作為參考。
其它實施方案在使用不超過常規(guī)實驗技術(shù)的條件下，本領域技術(shù)人員會知道或能確認本文中描述的本發(fā)明具體實施方案的許多等價實施方案。所述等價實施方案規(guī)定為被如下權(quán)利要求所涵蓋。
表1

表2

表3

表4

表5

表6 a中心組織陽性是那些具有ISH得分≥2的。
b正常子宮頸陰道部和子宮頸內(nèi)膜細胞。
c在某些受限于基底/旁基底(parabasal)細胞的正常鱗狀上皮中表達。
陰影格表示在至少20％患者中ISH得分≥2。
表7

表8

表9水通道蛋白5的表達

表10載脂蛋白L1的表達

表11載脂蛋白L2的表達

表12干擾素，α-誘導蛋白27的表達

表13整聯(lián)蛋白，β6的表達


序列表<110>Millennium Pharmaceuticals，Inc.et al.
<120>用于鑒定，評估，預防和治療宮頸癌的組合物，試劑盒和方法<130>MRI-062PC<150>60/404770<151>2002-08-20<160>44<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>2848<212>DNA<213>人<400>1actttccctt tcgaattcct cggtatatct tggggactgg aggacctgtc tggttattat 60acagacgcat aactggaggt gggatccaca cagctcagaa cagctggatc ttgctcagtc 120tctgccaggg gaagattcct tggaggaggc cctgcagcga catggaggga gctgctttgc 180tgagagtctc tgtcctctgc atctggatga gtgcactttt ccttggtgtg ggagtgaggg 240cagaggaagc tggagcgagg gtgcaacaaa acgttccaag tgggacagat actggagatc 300ctcaaagtaa gcccctcggt gactgggctg ctggcaccat ggacccagag agcagtatct 360ttattgagga tgccattaag tatttcaagg aaaaagtgag cacacagaat ctgctactcc 420tgctgactga taatgaggcc tggaacggat tcgtggctgc tgctgaactg cccaggaatg 480aggcagatga gctccgtaaa gctctggaca accttgcaag acaaatgatc atgaaagaca 540aaaactggca cgataaaggc cagcagtaca gaaactggtt tctgaaagag tttcctcggt 600tgaaaagtaa gcttgaggat aacataagaa ggctccgtgc ccttgcagat ggggttcaga 660aggtccacaa aggcaccacc atcgccaatg tggtgtctgg ctctctcagc atttcctctg 720gcatcctgac cctcgtcggc atgggtctgg cacccttcac agagggaggc agccttgtac 780tcttggaacc tgggatggag ttgggaatca cagcagcttt gaccgggatt accagcagta 840ccatagacta cggaaagaag tggtggacac aagcccaagc ccacgacctg gtcatcaaaa 900gccttgacaa attgaaggag gtgaaggagt ttttgggtga gaacatatcc aactttcttt 960ccttagctgg caatacttac caactcacac gaggcattgg gaaggacatc cgtgccctca 1020gacgagccag agccaatctt cagtcagtac cgcatgcctc agcctcacgc ccccgggtca 1080ctgagccaat ctcagctgaa agcggtgaac aggtggagag agttaatgaa cccagcatcc 1140tggaaatgag cagaggagtc aagctcacgg atgtggcccc tgtaagcttc tttcttgtgc 1200tggatgtagt ctacctcgtg tacgaatcaa agcacttaca tgagggggca aagtcagaga 1260cagctgagga gctgaagaag gtggctcagg agctggagga gaagctaaac attctcaaca 1320ataattataa gattctgcag gcggaccaag aactgtgacc acagggcagg gcagccacca 1380ggagagatat gcctggcagg ggccaggaca aaatgcaaac tttttttttt ttctgagaca 1440gagtcttgct ctgtcgccaa gttggagtgc aatggtgcga tctcagctca ctgcaagctc 1500tgcctcccgt gttcaagcga ttctcctgcc ttggcctccc aagtagctgg gactacaggc 1560gcctaccacc atgcccagct aatttttgta tttttaatag agatggggtt tcaccatgtt 1620ggccaggatg gtctcgatct cctgacctct tgatctgccc accttggcct cccaaagtgc 1680tgggattaca ggcgtgagcc atcgcttttg acccaaatgc aaacatttta ttagggggat 1740aaagagggtg aggtaaagtt tatggaactg agtgttaggg actttggcat ttccatagct 1800gagcacagca ggggaggggt taatgcagat ggcagtgcag caaggagaag gcaggaacat 1860tggagcctgc aataagggaa aaatgggaac tggagagtgt ggggaatggg aagaagcagt 1920ttactttaga ctaaagaata tattgggggg ccgggtgtag tggctcatgc ctgtaatccg 1980agcactttgg gaggccaagg cgggcggatc acgaggtcag gagatcaaga ccatcctggc 2040taacacagtg aaaccccgtc tctactaaaa atacaaaaaa ttagccgggc atggtggcgg 2100gcgcctgtag ttccagctaa ctgggcggct gaggcaggag aatggcgtga acctgggagg 2160tggagcttgc agtgagccga gatatcgcca ctgcactcca gcctgggtga cagagcgaga 2220ctccatctca aaaaaaaaaa aaaaaagaat atattgacgg aagaatagag aggaggcttg 2280aaggaaccag caatgagaag gccaggaaaa gaaagagctg aaaatggaga aagcccaaga 2340gttagaacag ttggatacag gagaagaaac agcggctcca ctacagaccc agccccaggt 2400
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Glu Glu Leu Lys Lys Val Ala Gln Glu Leu Glu Glu Lys Leu Asn Ile370 375 380Leu Asn Asn Asn Tyr Lys Ile Leu Gln Ala Asp Gln Glu Leu385 390 395<210>3<211>2545<212>DNA<213>人<400>3gtgctgggga gcagcgtgtt tactgtgctt ggtcatgagc tgctgggaag ttgtgacttt 60cactttccct ttcgaattcc agggtatatc tgggaggccg gaggacgtgt ctggttatta 120cacagatgca cagctggacg tgggatccac acagctcaga acagttggat cttgctcagt 180ctctgtcaga ggaagatccc ttggacaaga ggaccctgcc ttggtgtgag agtgagggaa 240gaggaagctg gaacgagggt taaggaaaac cttccagtct ggacagtgac tggagagctc 300caaggaaagc ccctcggtaa cccagccgct ggcaccatga acccagagag cagtatcttt 360attgaggatt accttaagta tttccaggac caagtgagca gagagaatct gctacaactg 420ctgactgatg atgaagcctg gaatggattc gtggctgctg ctgaactgcc cagggatgag 480gcagatgagc tccgtaaagc tctgaacaag cttgcaagtc acatggtcat gaaggacaaa 540aaccgccacg ataaagacca gcagcacagg cagtggtttt tgaaagagtt tcctcggttg 600aaaagggagc ttgaggatca cataaggaag ctccgtgccc ttgcagagga ggttgagcag 660gtccacagag gcaccaccat tgccaatgtg gtgtccaact ctgttggcac tacctctggc 720atcctgaccc tcctcggcct gggtctggca cccttcacag aaggaatcag ttttgtgctc 780ttggacactg gcatgggtct gggagcagca gctgctgtgg ctgggattac ctgcagtgtg 840gtagaactag taaacaaatt gcgggcacga gcccaagccc gcaacttgga ccaaagcggc 900accaatgtag caaaggtgat gaaggagttt gtgggtggga acacacccaa tgttcttacc 960ttagttgaca attggtacca agtcacacaa gggattggga ggaacatccg tgccatcaga 1020cgagccagag ccaaccctca gttaggagcg tatgccccac ccccgcatat cattgggcga 1080atctcagctg aaggcggtga acaggttgag agggttgttg aaggccccgc ccaggcaatg 1140agcagaggaa ccatgatcgt gggtgcagcc actggaggca tcttgcttct gctggatgtg 1200gtcagccttg catatgagtc aaagcacttg cttgaggggg caaagtcaga gtcagctgag 1260gagctgaaga agcgggctca ggagctggag gggaagctca actttctcac caagatccat 1320gagatgctgc agccaggcca agaccaatga ccccagagca gtgcagccac cagggcagaa 1380atgccgggca caggccagga caaaatgcag actttttttt tttttttttt ttttttttga 1440gatggagtct cgctctatcg cccaggatgg agtgcagtgg ctcaatctcg gctcactgca 1500aactccgcct cccgggttca caccattctc cggcctcagt ctcccgagta gctgggacta 1560caggcacctg ccaccacgcc cggctaattt ttttgtattt tcactggaga cggggtttca 1620ctgtgttagc cacgatggtc tccatctcct gacctcgtga tctgcccacc tcggcctccc 1680aaagtgctgg gattacaggc gtgagccacc gcgcctggcc aaaatgcaga cattttatta 1740gggggataag gagggcaagg taaagcttat ggaactgagt gttagtgact ttggcatttg 1800tgtagctgag cacagcaagg gaggggttaa tgcagatggc aagtgcacca aggagaaggc 1860aggaacactg gagcctgcaa taagggagga gagaggactg gagagtgtgg ggaatgggaa 1920gaagtagttt actttggact aaagaatata ttgggcgaag aatagagggg gagcttgcag 1980gaaccagcaa tgagaaggcc aggaaaagaa agagctgaaa atggagaaaa ccagagttag 2040aactgttgga tacaggagaa gaaacagcag ctccactacc gacccccccc caggtttgat 2100gtccttccaa gaataaagtc tttccctggt gatggtctct cgctctgtct ttccagcatc 2160cactctccct tgtccttctg ggggtgtatc acagtcagcc agtggcttct tcatgatggt 2220ggttggggtg gttgtcatgt gacgggtccc ctccaggtta ctaaagggtg catgtcccct 2280gcttgaaccc tgagaggcag gtggtaggcc atggccacaa tccccagctg aggagcaggt 2340gtccctgaga acccaaactt cccagagagt atctgagaac caaccaatga aaacagtccc 2400atcgctctta gccggtaagt aaacagtcag aagattagca tgaaagcagt ttagcattgg 2460gaggaagcac agatctctag agctgtcctg tcgctgccca ggattgacct gtgtgtaagt 2520cccaataaac tcacctactc accaa2545<210>4<211>337
<212>PRT<213>人<400>4Met Asn Pro Glu Ser Ser Ile Phe Ile Glu Asp Tyr Leu Lys Tyr Phe1 5 10 15Gln Asp Gln Val Ser Arg Glu Asn Leu Leu Gln Leu Leu Thr Asp Asp20 25 30Glu Ala Trp Asn Gly Phe Val Ala Ala Ala Glu Leu Pro Arg Asp Glu35 40 45Ala Asp Glu Leu Arg Lys Ala Leu Asn Lys Leu Ala Ser His Met Val50 55 60Met Lys Asp Lys Asn Arg His Asp Lys Asp Gln Gln His Arg Gln Trp65 70 75 80Phe Leu Lys Glu Phe Pro Arg Leu Lys Arg Glu Leu Glu Asp His Ile85 90 95Arg Lys Leu Arg Ala Leu Ala Glu Glu Val Glu Gln Val His Arg Gly100 105 110Thr Thr Ile Ala Asn Val Val Ser Asn Ser Val Gly Thr Thr Ser Gly115 120 125Ile Leu Thr Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ala Pro Phe Thr Glu Gly Ile130 135 140Ser Phe Val Leu Leu Asp Thr Gly Met Gly Leu Gly Ala Ala Ala Ala145 150 155 160Val Ala Gly Ile Thr Cys Ser Val Val Glu Leu Val Asn Lys Leu Arg165 170 175Ala Arg Ala Gln Ala Arg Asn Leu Asp Gln Ser Gly Thr Asn Val Ala180 185 190Lys Val Met Lys Glu Phe Val Gly Gly Asn Thr Pro Asn Val Leu Thr195 200 205Leu Val Asp Asn Trp Tyr Gln Val Thr Gln Gly Ile Gly Arg Asn Ile210 215 220Arg Ala Ile Arg Arg Ala Arg Ala Asn Pro Gln Leu Gly Ala Tyr Ala225 230 235 240Pro Pro Pro His Ile Ile Gly Arg Ile Ser Ala Glu Gly Gly Glu Gln245 250 255Val Glu Arg Val Val Glu Gly Pro Ala Gln Ala Met Ser Arg Gly Thr260 265 270Met Ile Val Gly Ala Ala Thr Gly Gly Ile Leu Leu Leu Leu Asp Val275 280 285Val Ser Leu Ala Tyr Glu Ser Lys His Leu Leu Glu Gly Ala Lys Ser290 295 300Glu Ser Ala Glu Glu Leu Lys Lys Arg Ala Gln Glu Leu Glu Gly Lys305 310 315 320Leu Asn Phe Leu Thr Lys Ile His Glu Met Leu Gln Pro Gly Gln Asp325 330 335Gln<210>5<211>2100<212>DNA<213>人<400>5agacgccccg aggtcggagt gaagcgccgg gaccgagccc cgtctcccag ggagtccggg 60gcgcacggca ccgaggagag cgcgggagcc aacctgggcg catcatgcgc agggcccggg 120acgctgggcc ggtctacacc gccgcctggg tcacgtggcc cggacgggcc ggcggctgcc 180ccggccgggg ggcgggggtc gcgccggggt tgcgctggac gacggagagc ggcgggcccg 240cagcggcctg gagcctccca acccgcgccg cgctggccct cgagcgtagg agccgccccc 300
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Ser Pro Lys Leu Ser Asn Lys Glu Leu Lys Pro Gln Lys Ser Val Val136513701375Ser Asp Leu Glu Ala Asp Asp Val Lys Gly Ser Val Pro Leu Ser Ser138013851390Ser Pro Pro Ala Thr His Phe Pro Asp Glu Thr Glu Ile Thr Asn Pro139514001405Val Pro Lys Lys Asn Val Thr Val Lys Lys Thr Ala Ala Lys Ser Gln141014151420Ser Ser Thr Ser Thr Thr Gly Ala Lys Lys Arg Ala Ala Pro Lys Gly1425143014351440Thr Lys Arg Asp Pro Ala Lau Asn Ser Gly Val Ser Gln Lys Pro Asp144514501455Pro Ala Lys Thr Lys Asn Arg Arg Lys Arg Lys Pro Ser Thr Ser Asp146014651470Asp Ser Asp Ser Asn Phe Glu Lys Ile Val Ser Lys Ala Val Thr Ser147514801485Lys Lys Ser Lys Gly Glu Ser Asp Asp Phe His Met Asp Phe Asp Ser149014951500Ala Val Ala Pro Arg Ala Lys Ser Val Arg Ala Lys Lys Pro Ile Lys1505151015151520Tyr Leu Glu Glu Ser Asp Glu Asp Asp Leu Phe15251530<210>43<211>4797<212>DNA<213>人<400>43gcagtgaaca caacctttcc cctgagccac tggaattgga cagaatgccc cattctcctc 60tgatctccat tcctcatgtg tggtgtcacc cagaagagga ggaaagaatg catgatgaac 120ttctacaagc agtatccaag gggccggtga tgttcaggga tgtttccata gacttctctc 180aagaggaatg ggaatgcctg gacgctgatc agatgaattt atacaaagaa gtgatgttgg 240agaatttcag caacctggtt tcagtgggac tttccaattc taagccagct gtgatctcct 300tattggaaca aggaaaagag ccctggatgg ttgatagaga gctgactaga ggcctgtgtt 360cagatctgga atcaatgtgt gagaccaaaa tattatctct aaagaagaga catttcagtc 420aagtaataat tacccgtgaa gacatgtcta cttttattca gcccacattt cttattccac 480ctcaaaaaac tatgagtgaa gagaaaccat gggaatgtaa gatatgtgga aagaccttta 540atcaaaactc acaatttatc caacatcaga gaattcattt tggtgaaaaa cactatgaat 600ctaaggagta tgggaagtcc tttagtcgtg gctcactcgt tactcgacat cagaggattc 660acactggtaa aaaaccctat gaatgtaagg aatgtggcaa ggcttttagt tgtagttcat 720atttttctca acatcagagg attcacactg gtgagaaacc ctatgaatgt aaggaatgtg 780gaaaagcctt taagtattgc tcaaacctta atgatcatca gagaattcac actggtgaga 840aaccctatga atgtaaagta tgtggaaaag cctttactaa aagttcacaa ctttttctac 900atctgagaat tcatactggt gagaaacctt atgaatgtaa agaatgtggg aaagccttta 960ctcaacactc aaggcttatt cagcatcaga gaatgcatac tggtgagaaa ccttatgaat 1020gtaagcagtg tgggaaggcc tttaatagtg cctcaacact tactaaccat cacagaattc 1080atgctggtga gaagctctat gaatgtgaag aatgtagaaa ggcctttatt cagagctcag 1140aacttattca acatcagaga atccatacag atgaaaaacc atatgaatgt aatgaatgtg 1200ggaaggcctt taataaaggc tcaaatctta ctcgacatca gagaattcac actggtgaga 1260aaccctatga ctgtaaggaa tgtggaaagg cttttggtag tcgctctgac ctcattcgcc 1320atgagggaat tcatactggt tgaatgacag taaagtaaga ccattttgtt aacctttata 1380ataatttttt taaaacaggt aaggagaaca aattaggata catattatca aaggttctcc 1440tatgtattcg tttttaaacg atacgataac aaagtaccaa gtaccaaaac cttggtggct 1500taaaacaaga gaaatttatt ctctcatagt ttagagcctg gaaatctaaa ctcaagggtg 1560ctgatcgttt tggttccttc tgaggactct gaggatctgt tctatgcctt tttcctaacc 1620tctgttaaca gctggcagtc cttggcattc catggctttt acatacacca ttccaatctc 1680tgcctccatc ttcacattgc attctcgctg tgtatctctg tgtatgtctt ttatttggac 1740accagtcagg ttagattggg gctacctggt gacctcatct taacttgatt atatctgcca 1800agaccctgtt tccaagtaag gtcacattta ccggtaccag gggttaggac ttcagcatat 1860
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權(quán)利要求
1.一種評估是否患者患子宮頸癌或具有癌變前狀態(tài)的方法，所述方法包含比較a)患者樣本中標記物的表達水平，其中所述標記物選自列于表1的標記物，和b)在正常對照組子宮頸癌樣本中所述標記物的表達水平，其中在患者樣本中所述標記物的表達水平和正常水平之間的明顯差異表明患者患子宮頸癌或具有癌變前狀態(tài)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述患者具有CIN或SIL。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述標記物相應于分泌蛋白。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述標記物相應于轉(zhuǎn)錄的多核苷酸或其部分，其中所述多核苷酸包含所述標記物。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣本包含獲得自患者的細胞。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述樣本是子宮頸涂片。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述細胞位于液體中，所述液體選自通過腹膜沖洗收集的液體，通過子宮沖洗收集的液體，子宮液，子宮滲出液，胸膜液，膽囊液和子宮頸滲出液(exudate)。
8.權(quán)利要求1的方法，其中通過檢測樣本中相應于標記物的蛋白的存在評估樣本中標記物的表達水平。
9.權(quán)利要求8的方法，其中使用與蛋白特異性結(jié)合的試劑檢測蛋白的存在。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述試劑選自抗體，抗體衍生物和抗體片段。
11.權(quán)利要求1的方法，其中通過檢測樣本中轉(zhuǎn)錄的多核苷酸或其部分的存在評估樣本中標記物的表達水平，其中所述轉(zhuǎn)錄多核苷酸包含所述標記物。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄的多核苷酸是mRNA。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄的多核苷酸是cDNA。
14.權(quán)利要求11的方法，其中檢測步驟進一步包含擴增轉(zhuǎn)錄的多核苷酸。
15.權(quán)利要求1的方法，其中通過檢測樣本中轉(zhuǎn)錄的多核苷酸的存在評估樣本中所述標記物的表達水平，在嚴謹雜交條件下，轉(zhuǎn)錄的多核苷酸與標記物或多核苷酸的部分退火，其中所述多核苷酸包含物標記物。
16.權(quán)利要求1的方法，其中樣本中所述標記物的表達水平與不患有子宮頸癌患者中所述標記物的正常表達水平相差至少約2倍。
17.權(quán)利要求1的方法，其中樣本中所述標記物的表達水平與不患有子宮頸癌患者中所述標記物的正常表達水平相差至少約5倍。
18.權(quán)利要求的方法1，包含比較a)樣本中多種(plurality)標記物的每一個標記物的表達水平，所述標記物獨立地選自列于表1的標記物，和b)獲得自正常對照組人子宮頸樣本的同類型多種標記物的每一個標記物的表達水平，其中相對于相應的標記物正常表達水平，超過一個標記物的表達水平明顯改變，表明患者患子宮頸癌或具癌變前狀態(tài)。
19.權(quán)利要求18的方法，其中相對于相應的標記物正常表達水平，每一個標記物的表達水平明顯改變，表明患者患子宮頸癌。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述多種標記物包含至少3個標記物。
21.權(quán)利要求18的方法，其中所述多種標記物包含至少5個標記物。
22.一種用于檢測患者中子宮頸癌或癌變前狀態(tài)的進展的方法，所述方法包含a)在第一時間點檢測患者樣本中標記物的表達，其中所述標記物選自列于表1的標記物；b)在隨后的時間點按時重復步驟a)；和c)比較步驟a)和b)中檢測到的表達水平，以及由此監(jiān)測患者中子宮頸癌或癌變前狀態(tài)的進展。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述標記物相應于分泌蛋白。
24.權(quán)利要求22的方法，其中所述標記物相應于轉(zhuǎn)錄的多核苷酸或其部分，其中所述多核苷酸包含所述標記物。
25.權(quán)利要求22的方法，其中所述樣本包含獲得自患者的細胞。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述患者樣本是子宮頸涂片。
27.權(quán)利要求22的方法，其中在第一時間點和隨后時間點之間，患者進行外科手術(shù)摘除腫瘤。
28.一種評估用于抑制患者子宮頸癌的受試化合物的效力的方法，所述方法包含比較a)獲得自患者并暴露于受試化合物的第一樣本中標記物的表達，其中所述標記物選自列于表1的標記物，和b)獲得自患者的第二樣本中所述標記物的表達，其中所述樣本不暴露于受試化合物，其中相對于第二樣本，第一樣本中標記物明顯更低的表達水平表明所述受試化合物對于抑制患者的子宮頸癌是有效的。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述第一和第二樣本是獲得自患者的一次抽樣樣本的部分。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述第一和第二樣本是獲得自患者的混合樣本的部分。
31.一種評估用于抑制患者子宮頸癌的治療的有效性的方法，所述方法包含比較a)在提供給患者至少部分治療前獲得自患者的第一樣本中標記物的表達，其中所述標記物選自列于表1的標記物，和b)在提供部分治療后獲得自患者的第二樣本中標記物的表達，其中相對于第一樣本，第二樣本中標記物明顯更低的表達水平表明所述用于抑制患者子宮頸癌的治療是有效的。
32.一種選擇用于抑制患者子宮頸癌的組合物的方法，所述方法包含a)從患者處獲得包含癌細胞的樣本；b)將樣本的等分試樣分別暴露于存在多種測試組合物的條件下；c)比較每個等分試樣中標記物的表達，其中所述標記物選自列于表1的標記物；和d)相對于其它測試組合物，選擇一種能導致含有所述測試組合物的等分試樣中標記物明顯更低的表達水平的測試組合物。
33.一種抑制患者子宮頸癌的方法，所述方法包含a)從患者處獲得包含癌細胞的樣本；b)將樣本的等分試樣分別保持在存在多種測試組合物的條件下；c)比較每個等分試樣中標記物的表達，其中所述標記物選自列于表1的標記物；和d)相對于其它測試組合物，給予患者至少一種能導致含有所述測試組合物的等分試樣中標記物明顯更低的表達水平的測試組合物。
34.一種用于評估是否患者患子宮頸癌或具癌變前狀態(tài)的試劑盒，所述試劑盒包含用于評估標記物表達的試劑，所述標記物選自列于表1的標記物。
35.一種用于評估子宮頸癌細胞或癌變前子宮頸細胞或病變存在的試劑盒，所述試劑盒包含核酸探針，其中所述探針與相應于標記物的轉(zhuǎn)錄的多核苷酸特異性結(jié)合，所述標記物選自列于表1的標記物。
36.一種用于評估用于抑制患者子宮頸癌的多種化合物的每一種化合物的適用性的試劑盒，所述試劑盒包含a)多種化合物；和b)用于評估標記物表達的試劑，所述標記物選自列于表1的標記物。
37.一種用于評估人子宮頸癌細胞或癌變前子宮頸細胞或病變存在的試劑盒，所述試劑盒包含抗體，其中所述抗體與相應于標記物的蛋白特異性結(jié)合，所述標記物選自列于表1的標記物。
38.一種評估受試化合物子宮頸細胞致癌潛力的方法，所述方法包含a)將子宮頸細胞的等分試樣分別保持在存在和不存在所述受試化合物的條件下；和b)比較每一個等分試樣中標記物的表達，其中所述標記物選自列于表1的標記物，其中相對于在不存在所述受試化合物的條件下所保持的等分試樣，在存在所述受試化合物的條件下所保持的等分試樣中的標記物明顯增加的表達水平表明所述受試化合物具有人子宮頸細胞致癌潛力。
39.一種用于評估受試化合物子宮頸細胞致癌潛力的試劑盒，所述試劑盒包含子宮頸細胞和用于評估標記物表達的試劑，其中所述標記物選自列于表1的標記物。
40.一種治療患有子宮頸癌的患者的方法，所述方法包含向患者細胞提供一種與相應于一種標記物的多核苷酸互補的反義寡核苷酸，所述標記物選自列于表1的標記物。
41.一種在處于子宮頸癌發(fā)展的危險中的患者中抑制子宮頸癌的方法，所述方法包含抑制基因的表達，所述基因相應于一種標記物，所述標記物選自列于表1的標記物。
42.一種分離的核酸分子，其包含一種核苷酸序列，所述核苷酸序列選自表2和3中所列的核苷酸序列。
43.一種載體，其含有權(quán)利要求42的核酸分子。
44.一種宿主細胞，其含有權(quán)利要求42的核酸分子。
45.一種分離的多肽，其由一種核酸分子編碼，所述核酸分子包含一種核苷酸序列，所述核苷酸序列選自SEQ ID NOs1，7，9，11，17，19，21，23，25，27，33和43的核苷酸序列。
46.一種抗體，其選擇性結(jié)合權(quán)利要求45的多肽。
47.一種分離的多肽，其包含一種氨基酸序列，所述氨基酸序列選自SEQ ID NOs2，8，10，20，22，26，28和44的氨基酸序列。
48.一種抗體，其選擇性結(jié)合權(quán)利要求47的多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及與子宮頸癌包括癌變前狀態(tài)如發(fā)育異常相關的核酸分子和蛋白。也提供了用于檢測，鑒定，預防和治療人子宮頸癌的組合物，試劑盒及方法。
文檔編號A61K39/395GK101044247SQ03824456
公開日2007年9月26日 申請日期2003年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月20日
發(fā)明者J·E·莫納漢, X·趙, Y·陳, K·格拉特, S·卡馬特卡 申請人:千年藥品公司