專利名稱：被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體的融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及被融合或插入到轉(zhuǎn)鐵蛋白分子上的治療性蛋白或肽，其血清穩(wěn)定性或體內(nèi)循環(huán)半衰期被提高，轉(zhuǎn)鐵蛋白分子被修飾以減少或抑制糖基化、和/或減少或抑制鐵結(jié)合和/或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合。特別地，本發(fā)明包括被融合到或插入到轉(zhuǎn)鐵蛋白分子或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子上的單鏈抗體。
背景技術(shù)：
天然狀態(tài)下的或者重組制備的治療性蛋白或肽通常是不穩(wěn)定的分子，具有短的血清穩(wěn)定性周期或者短的體內(nèi)循環(huán)半衰期。此外，當(dāng)這些分子被配制特別是在水溶液中用于診斷和治療目的時(shí)，通常是非常不穩(wěn)定的。
只有極少數(shù)實(shí)用辦法可以被用于延長(zhǎng)或提高治療性蛋白分子的體內(nèi)或體外穩(wěn)定性。聚乙二醇(PEG)是可以結(jié)合到蛋白質(zhì)上的物質(zhì)，從而使該蛋白質(zhì)具有長(zhǎng)期、持續(xù)的活性。如果蛋白質(zhì)活性通過結(jié)合到PEG上被延長(zhǎng)，那么就可以降低該蛋白質(zhì)的施用頻率。但是，PEG結(jié)合常常降低或破壞蛋白質(zhì)的治療活性。在有些情況下，PEG結(jié)合會(huì)降低蛋白質(zhì)的免疫原性，而在其它情況下可能提高其免疫原性。
還可以通過融合到能夠延長(zhǎng)治療性蛋白質(zhì)的體內(nèi)循環(huán)半衰期的蛋白質(zhì)上來穩(wěn)定治療性蛋白質(zhì)或肽。例如，與處于未被融合狀態(tài)下的治療性蛋白質(zhì)相比，被融合到白蛋白或抗體片段上的治療性蛋白質(zhì)的體內(nèi)循環(huán)半衰期被延長(zhǎng)，參見美國專利5,876,969和5,766,883。
另一種血清蛋白，糖基化的人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)也已經(jīng)被用于與治療性蛋白質(zhì)一起融合，靶向呈遞到細(xì)胞內(nèi)部，或用于攜帶試劑跨越血腦屏障。通過將全長(zhǎng)Tf融合到因子上，這些包含被糖基化的人Tf的融合蛋白已經(jīng)被用于靶向神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)或睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)跨越血腦屏障，參見美國專利5,672,683和5977,307。在這些融合蛋白中，該分子的Tf部分被糖基化并結(jié)合兩個(gè)鐵原子，鐵原子是Tf結(jié)合到細(xì)胞上的受體所需的，并且如這些專利的發(fā)明人所述，Tf引導(dǎo)呈遞NGF或CNTF部分跨越血腦屏障。已經(jīng)通過將HIV-1蛋白酶靶向序列插入到糖基化轉(zhuǎn)鐵蛋白的外露表面環(huán)上，研究制備通過Tf受體靶向呈遞到細(xì)胞內(nèi)部的另一種形式的Tf融合物的可能性，已經(jīng)制備了轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白(Ali等(1999)J.Biol.Chem.274(34)24066-24073)。
血清轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)是分子量為80,000道爾頓的單聚糖蛋白，其在循環(huán)中結(jié)合鐵，并通過轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)將鐵轉(zhuǎn)運(yùn)到各種組織中(Aisen等(1980)Ann.Rev.Biochem.49357-393；MacGillivray等(1981)J.Biol.Chem.2583543-3553，美國專利5,026,651)。Tf是最常見的血清分子之一，包含多達(dá)約5-10％的總血清蛋白。在酗酒個(gè)體的血液中，存在高水平的缺乏糖的轉(zhuǎn)鐵蛋白，并且這種轉(zhuǎn)鐵蛋白的半衰期(約14-17天)比被糖基化的轉(zhuǎn)鐵蛋白(約7-10天)更長(zhǎng)。參見van Eijk等(1983)Clin.Chim.Acta 132167-171，Stibler(1991)Clin.Chem.372029-2037(1991)，Arndt(2001)Clin.Chem.47(1)13-27和Stibler等″Carbohydrate-deficient consumption″，Advances in the Biosciences，(Nordmann等編輯)，Pergamon，1988，71，353-357)。
Tf的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被充分表征，受體結(jié)合、鐵結(jié)合及釋放以及碳酸鐵的結(jié)合的機(jī)制已經(jīng)被闡述(美國專利5,026,651、5,986,067和MacGillivray等(1983)J.Biol.Chem.258(6)3543-3546)。
轉(zhuǎn)鐵蛋白和結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的抗體也已經(jīng)被用于呈遞或攜帶毒性試劑到腫瘤細(xì)胞中，作為癌癥治療的方法(Baselga和Mendelsohn，1994)，而且轉(zhuǎn)鐵蛋白也被用作非病毒性基因治療載體，將DNA呈遞細(xì)胞中(Frank等1994；Wagner等1992)。使用轉(zhuǎn)鐵蛋白受體作為進(jìn)入點(diǎn)來將蛋白質(zhì)呈遞到中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的能力也已經(jīng)用數(shù)種蛋白質(zhì)和肽證明，包括CD4(Walus等1996)、腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Pardridge等，1994)、神經(jīng)膠質(zhì)來源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Albeck等)、腸道血管(vasointestinal)肽類似物(Bickel等，1993)、β-淀粉狀蛋白肽(Saito等，1995)，以及反義寡核苷酸(Pardridge等1995)。
但是，還沒有修飾或遺傳工程化轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白來延長(zhǎng)治療性蛋白或肽的體內(nèi)循環(huán)半衰期，或者通過減少或抑制Tf部分的糖基化或者減少或防止鐵和/或Tf受體的結(jié)合來提高生物利用度。
抗體及其結(jié)構(gòu)在血液或其它體液中循環(huán)的抗體被稱作體液抗體，區(qū)別于被結(jié)合到其親本淋巴細(xì)胞上的“膜抗體”。術(shù)語免疫球蛋白通常用于指所有抗體。在人體中，所有的免疫球蛋白被分成五種，稱作IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。每個(gè)免疫球蛋白分子由兩對(duì)相同的多肽鏈組成，稱作重鏈或輕鏈?！爸劓湣北幻麨間amma(γ)、alpha(α)、mu(μ)、delta(δ)和epsilon(ε)。“輕鏈”命名為lambda(λ)或kappa(κ)。
天然存在的抗體由四條多肽鏈組成兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈。每一條重鏈約50-70kDa，每一條輕鏈約25kDa。這些鏈通過二硫鍵連接在一起。抗體分子的基本結(jié)構(gòu)具有字母Y的形狀。Y的每一個(gè)臂由一條輕鏈和一條重鏈的部分組成，而Y莖部分由重鏈的剩余部分組成。Y的臂和莖通過鉸鏈區(qū)連接在一起，鉸鏈區(qū)使得臂能夠活動(dòng)。
抗體的莖和連接到莖的臂部分由免疫球蛋白的恒定區(qū)構(gòu)成。這些區(qū)域具有保守的氨基酸序列，可變性低。臂的相反端是輕鏈的可變區(qū)和由100-110個(gè)氨基酸組成的重鏈，其中為三個(gè)小的非保守氨基酸序列區(qū)域或超變區(qū)。這些區(qū)域負(fù)責(zé)抗原識(shí)別和結(jié)合。
無論相連的重鏈的類型，所有輕鏈的區(qū)域結(jié)構(gòu)是相同的。每條輕鏈具有兩個(gè)區(qū)域，VL區(qū)和稱作恒定輕鏈或CL的具有相對(duì)不變化的氨基酸序列的區(qū)域。相反，重鏈具有三個(gè)(IgG、IgA、IgD)或四個(gè)(IgM、IgE)恒定區(qū)或C區(qū)，稱作CH1，CH2，CH3和CH4，以及一個(gè)可變區(qū)，稱作VH。可替代地，C區(qū)可以按照重鏈類型來命名；因此，Cε4是指IgE(ε)重鏈的CH4區(qū)。
各個(gè)可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)區(qū)含有三個(gè)稱作互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的超變區(qū)。這些CDR組合在一起形成結(jié)合抗原的口袋。由于超變區(qū)中的氨基酸序列的可變性，結(jié)合位點(diǎn)的形狀和特性是變化的，該位點(diǎn)結(jié)合抗原的特異性也是變化的。
通常，當(dāng)抗原進(jìn)入機(jī)體時(shí)，抗原的不同部分被不同的幼稚(naive)B細(xì)胞識(shí)別。各種B細(xì)胞產(chǎn)生具有略微區(qū)別的結(jié)合位點(diǎn)的抗體。結(jié)果，生成抗體混合物。1977年，George Kohler和Cesar Milstein發(fā)現(xiàn)了一種獲得大量具有相同親合性的單一類型抗體的方法。Kohler和Milstein用以制備單克隆抗體的方法包括將來自被免疫的動(dòng)物的B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，制備了大量無限增殖的雜交瘤，并選擇生產(chǎn)期望抗體的雜交瘤。
單克隆抗體是重要的研究工具，被用作治療劑。但是，單克隆抗體是昂貴的，并且難以制備。此外，單克隆抗體比較大，限制其到達(dá)靶向位點(diǎn)。
單鏈抗體單鏈抗體(SCA)已經(jīng)成為基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究的對(duì)象，在診斷和治療應(yīng)用中作為替代單克隆抗體的手段。SCA是遺傳制備的蛋白質(zhì)，具有單克隆抗體的結(jié)合特異性和親合性，但是較小，使得具有更大的毛細(xì)血管滲透性。SCA優(yōu)越于單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)包括在診斷成像和治療中具有更大的組織滲透性，免疫原性問題更少，在機(jī)體中更特異地定位于靶向位點(diǎn)，以及更容易和低成本的大量制備。
通常采用短肽接頭連接抗體的VH和VL鏈的可變區(qū)來制備SCA。用于連接這些可變區(qū)的合適接頭是使VH和VL區(qū)折疊成具有三維結(jié)構(gòu)的單一多肽鏈的接頭，該三維結(jié)構(gòu)保持完整抗體的結(jié)合特異性。對(duì)于單鏈抗體結(jié)合蛋白的理論和制備方法的描述存在于Ladner等，美國專利4,946,778、5,260,203、5,455,030和5,518,889，以及Huston等，美國專利5,091,513(“生物合成抗體結(jié)合位點(diǎn)”″(BABS))，這些公開在此全部引入作為參考。根據(jù)上面的專利所采用的方法制備的單鏈抗原結(jié)合蛋白具有與相應(yīng)的Fab片段基本上相似的結(jié)合特異性和親合性。
Fc區(qū)當(dāng)抗體被暴露于蛋白質(zhì)水解酶時(shí)，例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶，生成多種主要片段。保留抗原結(jié)合能力的片段由抗體的Y構(gòu)象的兩個(gè)“臂”構(gòu)成，被稱作Fab(抗原結(jié)合片段)或者Fab′2，F(xiàn)ab′2表示兩個(gè)Fab臂通過二硫鍵連接。生成的其它主要片段組成Y的單個(gè)“尾部”或中心軸，由于其容易從溶液結(jié)晶，被稱作Fc(結(jié)晶片段)。IgG、IgA、IgM和IgD的Fc片段由各種抗體的兩個(gè)羧基末端區(qū)域的二聚體構(gòu)成(即，IgG、IgA和IgD的CH2和CH3，以及IgM的CH3和CH4)。相反，IgE的Fc由其三個(gè)羧基末端的重鏈區(qū)構(gòu)成(Cε2，Cε3和Cε4)。
Fc片段由抗體生物學(xué)“活性位點(diǎn)”構(gòu)成，該活性位點(diǎn)使得抗體能夠與其它的免疫系統(tǒng)分子或細(xì)胞聯(lián)系，從而激活或調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的防御功能。當(dāng)抗體區(qū)域中的活性位點(diǎn)結(jié)合到稱作Fc受體的分子上時(shí)，發(fā)生這種聯(lián)系。
Fc受體是與具有免疫球蛋白Fc區(qū)的分子活性位點(diǎn)高親合性和特異性結(jié)合的分子。Fc受體可能作為完整的膜蛋白存在于細(xì)胞外質(zhì)膜中，或者作為游離的“可溶的”分子存在，在血漿或其它體液中自由地循環(huán)。
五種抗體種類中的每一種具有多種類型的Fc受體，該受體結(jié)合到特定類型的Fc區(qū)上，具有獨(dú)特的功能。因此，IgE的Fc的受體僅與IgE Fc區(qū)或者分離的IgE Fc片段高親合性地結(jié)合。已知存在特異于Fc受體的不同類型的種類，其識(shí)別和結(jié)合Fc區(qū)中的不同部位。例如，一些IgG Fc受體專一結(jié)合IgG的第二恒定區(qū)(CH2)，而介導(dǎo)其它免疫功能的Fc受體專一地結(jié)合IgG的第三恒定區(qū)(CH3)。其它IgG Fc受體結(jié)合位于CH2和CH3區(qū)的活性位點(diǎn)，不能結(jié)合單一的隔離的區(qū)域。
一旦被抗體Fc區(qū)活性位點(diǎn)激活，F(xiàn)c受體介導(dǎo)各種主要的免疫殺傷和調(diào)節(jié)功能。某些IgG Fc受體，例如介導(dǎo)直接殺死抗體通過其Fab臂結(jié)合的細(xì)胞(抗體依賴的細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞毒性--(ADCC))。當(dāng)被IgG結(jié)合時(shí)，其它IgG Fc受體通過稱作吞噬作用的過程，刺激一些白細(xì)胞參與和破壞細(xì)菌、病毒、癌細(xì)胞或其它實(shí)體。位于某些稱作B淋巴細(xì)胞的白細(xì)胞上的Fc受體調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)，發(fā)育成分泌抗體的血漿細(xì)胞。當(dāng)被抗原連接的IgE結(jié)合時(shí)，位于一些稱作嗜堿細(xì)胞和肥大細(xì)胞的白細(xì)胞上的Fc受體起動(dòng)過敏反應(yīng)，表現(xiàn)為枯草熱和哮喘。
一些可溶的Fc受體作為血液補(bǔ)體系統(tǒng)的一部分，起動(dòng)能夠殺死細(xì)菌、病毒和癌癥細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。其它Fc受體刺激某些白血球細(xì)胞分泌強(qiáng)有力的調(diào)節(jié)的或細(xì)胞毒性的分子，在遺傳學(xué)上稱作淋巴因子，淋巴因子有助于免疫防御。這些僅僅是抗體Fc受體調(diào)節(jié)的免疫活動(dòng)的少數(shù)代表性例子。
組成抗體功能的氨基酸的大部分是決定抗體結(jié)構(gòu)的分子“支架”(scaffolding)，一種高度規(guī)則的三維形狀。正是該支架具有正確暴露和空間朝向的抗體活性位點(diǎn)的重要功能，該位點(diǎn)由多個(gè)氨基酸簇構(gòu)成。特定活性位點(diǎn)根據(jù)其功能，可能已經(jīng)被暴露，因而能夠結(jié)合分子受體?？商娲兀囟ǖ幕钚晕稽c(diǎn)可能被隱藏，直到抗體結(jié)合到抗原上，而后支架改變其方向，并隨即暴露抗體的活性位點(diǎn)。然后，被暴露的活性位點(diǎn)結(jié)合到細(xì)胞表面上或者作為可溶分子的部分(例如補(bǔ)體)的特異Fc受體上，接著起動(dòng)特定免疫反應(yīng)。
由于抗體支架的功能是保持和固定其活性位點(diǎn)，以結(jié)合到細(xì)胞或可溶分子上，當(dāng)抗體活性位點(diǎn)作為肽被分離和合成時(shí)，具有完整的抗體分子的免疫調(diào)節(jié)功能。
取決于活性位點(diǎn)肽所結(jié)合的特定類型的Fc受體，該肽可能激活或抑制免疫功能。如果Fc受體為被結(jié)合到Fc區(qū)的作用激活的類型時(shí)，可選擇地，如果Fc活性位點(diǎn)肽刺激受體時(shí)，發(fā)生激活。產(chǎn)生的刺激的類型包括，但是不限于，直接起作用或者間接地受抗體Fc區(qū)-Fc受體結(jié)合調(diào)節(jié)。這種功能的例子包括，但是不限于，由特定類型的白細(xì)胞(多核形嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)的吞噬作用激活；巨噬細(xì)胞活化；抗體依賴的細(xì)胞調(diào)節(jié)的細(xì)胞毒性(ADCC)；天然殺傷(NK)細(xì)胞作用；B細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育，以及淋巴細(xì)胞分泌淋巴因子(具有殺傷和免疫調(diào)節(jié)活性的分子)。
發(fā)明概述如下文的更加詳細(xì)的描述，本發(fā)明包括包含至少一種抗體或CDR片段，優(yōu)選抗體可變區(qū)的被修飾的Tf融合蛋白，其中Tf部分被遺傳工程改造來提高該分子的體內(nèi)循環(huán)半衰期或生物利用度。本發(fā)明還包括包含融合蛋白的藥物制劑和組合物，通過融合到被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白上，提高抗體或CDR片段的體內(nèi)循環(huán)半衰期和生物利用度的方法，編碼被修飾的Tf融合蛋白的核酸分子等。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用被修飾的Tf融合蛋白治療患者的方法。
優(yōu)選地，被修飾的Tf融合蛋白包含被修飾來減少或防止糖基化和/或鐵和受體結(jié)合的人轉(zhuǎn)鐵蛋白Tf部分。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含被連接到轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白上的SCA或CDR片段的“轉(zhuǎn)移體”(“trans-bodies”)。該轉(zhuǎn)移體可以采用不同的抗體可變區(qū)來構(gòu)建，用于各種制藥的和診斷的應(yīng)用。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含被融合到轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白上的一種或多種抗原性肽和抗體可變區(qū)的轉(zhuǎn)移體。這些轉(zhuǎn)移體不僅具有結(jié)合抗原的能力，而且能夠在宿主中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。本發(fā)明還提供包含一種或多種抗原結(jié)合肽的轉(zhuǎn)移體。
而且，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體包含被融合到轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子上的抗毒素的抗體。此外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體包含被融合到轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子上的CDR。毒素的例子包括但是不限于肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、難辨梭菌(Clostridium difficile)和炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)。
附圖簡(jiǎn)介附

圖1顯示人(Hu)轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)的N末端結(jié)構(gòu)域和C末端結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO3的氨基酸1-331和332-679)的比對(duì)，相似和相同部分用高亮顯示。
附圖2A-2B顯示來自不同物種的轉(zhuǎn)鐵蛋白序列之間的比對(duì)(SEQ IDNO81-87)。淡陰影相似；濃陰影相同。
附圖3顯示治療性蛋白、多肽或肽的大量Tf外露表面插入位點(diǎn)的位置。
附圖4A-4B顯示用于制備被修飾的融合蛋白的大量?jī)?yōu)選抗-TNFα的抗體的VH(SEQ ID NO88-93)和VL(SEQ ID NO94-44)。
附圖5顯示在存在50U/ml TNFα?xí)r，用N末端結(jié)構(gòu)域(N-domain)/TNFCDR以及僅N末端結(jié)構(gòu)域處理WEHI-164細(xì)胞的吸收值。各個(gè)柱表示各個(gè)條件下的三個(gè)重復(fù)孔的平均值。較高的吸收值表示較高的代謝活性。
詳細(xì)描述總體描述本發(fā)明部分地基于發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可以通過將SCA遺傳融合到轉(zhuǎn)鐵蛋白、被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白，或轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的足以延長(zhǎng)分子的體內(nèi)半衰期的部分上來穩(wěn)定抗體、抗體片段、CDR區(qū)和SCA，以提高它們的體內(nèi)血清半衰期和/或活性。被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白包括被共價(jià)連接到SCA抗體或抗體片段上的轉(zhuǎn)鐵蛋白或其結(jié)構(gòu)域，其中與野生型轉(zhuǎn)鐵蛋白序列相比，轉(zhuǎn)鐵蛋白被修飾以含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、插入或刪除。在一個(gè)實(shí)施方案中，Tf融合蛋白被工程化來減少或防止Tf或Tf結(jié)構(gòu)域中的糖基化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，Tf蛋白或Tf結(jié)構(gòu)域被修飾以顯示減少或不結(jié)合鐵或碳酸根離子，或者對(duì)Tf受體(TfR)的親合性降低或不結(jié)合Tf受體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含被融合或插入到轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白上的抗體可變區(qū)的融合蛋白。特別地，本發(fā)明部分地基于使用轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白來連接至少兩個(gè)抗體的可變區(qū)，形成被修飾形式的SCA。以這種方式形成的SCA融合蛋白能夠結(jié)合目標(biāo)抗原，并且具有轉(zhuǎn)鐵蛋白的長(zhǎng)的循環(huán)半衰期。
通常，用短肽連接兩個(gè)可變區(qū)來制備SCA。這種肽可以具有任何序列，通常主要是由于其三維結(jié)構(gòu)而被選擇，而不是其序列同源或生物學(xué)功能。但是，由于這種肽不是天然產(chǎn)物，會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)。與短肽不同，轉(zhuǎn)鐵蛋白是一種天然存在蛋白質(zhì)，不具有抗原性。采用轉(zhuǎn)鐵蛋白作為接頭形成的SCA是一種轉(zhuǎn)移體，即具有抗體活性的轉(zhuǎn)鐵蛋白。轉(zhuǎn)移體在藥學(xué)上是有用的，并且容易在微生物系統(tǒng)例如酵母中制備。此外，大而可溶的轉(zhuǎn)鐵蛋白主鏈有助于溶解和穩(wěn)定連接在其上的可變區(qū)。轉(zhuǎn)移體可以采用各種可變區(qū)來制備，被用于各種藥學(xué)和診斷的應(yīng)用。
因此，本發(fā)明包括轉(zhuǎn)移體，包含轉(zhuǎn)移體的治療性組合物，以及通過施用轉(zhuǎn)移體來治療、預(yù)防或緩解疾病或癥狀的方法。本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體包括至少一個(gè)抗體可變區(qū)和至少一個(gè)被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的片段或變體，它們相互結(jié)合在一起，優(yōu)選通過遺傳融合(即，通過核酸翻譯來生成轉(zhuǎn)移體，其中編碼抗體可變區(qū)的全部或部分的多核苷酸在讀框內(nèi)與編碼被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的全部或部分的多核苷酸相連接)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含抗體可變區(qū)的轉(zhuǎn)移體，抗體可變區(qū)選自VH、VL或者一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)。一旦抗體可變區(qū)和轉(zhuǎn)鐵蛋白是轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白的一部分時(shí)，可以被稱作轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白的“部分”、“區(qū)域”或“部分(moiety)”(例如“SCA或抗體可變區(qū)部分”或者“轉(zhuǎn)鐵蛋白部分”)在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)移體，其包含或者可替代地由抗體可變區(qū)和轉(zhuǎn)鐵蛋白或者被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白組成。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)移體，其包含或者可替代地由生物活性的抗體可變區(qū)和轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白組成。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)移體，其包含或者可替代地由抗體可變區(qū)例如人源化抗體可變區(qū)的生物活性和/或治療活性變體與轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含抗體可變區(qū)以及被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的生物活性和/或治療活性片段的轉(zhuǎn)移體。
此外，本發(fā)明公開包含至少一個(gè)抗原性肽或免疫調(diào)節(jié)肽的轉(zhuǎn)移體。這種轉(zhuǎn)移體不僅能夠結(jié)合其抗原，而且能夠在宿主中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。
除非另外定義，在此所用的所有科學(xué)技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的意義。雖然任何類似或等同于在此所描述的那些方法和材料的方法和材料可以被用于實(shí)施和驗(yàn)證本發(fā)明，優(yōu)選的方法和材料被描述。
定義如在此所用，術(shù)語“抗體可變區(qū)”包含一個(gè)或多個(gè)VH、VL或CDR區(qū)。
如在此所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)移體”是指具有抗體活性的轉(zhuǎn)鐵蛋白。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移體包含至少一個(gè)抗體可變區(qū)和轉(zhuǎn)鐵蛋白分子、被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白或其片段。轉(zhuǎn)移體還包含一種或多種能夠在宿主中引起免疫反應(yīng)的抗原性肽。
如在此所用，術(shù)語“抗體”是指由實(shí)質(zhì)上由一種或多種由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段編碼的多肽組成的蛋白質(zhì)。公認(rèn)的免疫球蛋白基因包括kappa、lambda、alpha、gamma、delta、epsilon和mu恒定區(qū)的基因，以及大量免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈被劃分為kappa或lambda。重鏈分為gamma、mu、alpha、delta或epsilon，它們反過來定義免疫球蛋白的分類，分別為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
抗體可能以完整的免疫球蛋白存在，或者以各種形式的修飾物存在，包括例如，僅含有輕鏈和重鏈可變區(qū)的Fv片段、含有可變區(qū)和部分恒定區(qū)的Fab或(Fab)′2片段、單鏈抗體(Bird等，Science 242424-426(1988)；Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883(1988)都在此引入作為參考)，等等?？贵w抗原可以是動(dòng)物(特別是小鼠或大鼠)或者人類來源的，或者是嵌合的(Morrison等，Proc Natl.Acad.Sci.USA81，6851-6855(1984)在此引入作為參考)或者人源化的(Jones等，Nature 321，522-525(1986)，和公開的英國專利申請(qǐng)#8707252，都在此引入作為參考)。如在此所用，術(shù)語“抗體”包括這些不同形式。
術(shù)語“抗體的單鏈可變片段”(scFv)或者“單鏈抗體”(SCA)用于此是指含有通過肽接頭(L)被連接到VH結(jié)構(gòu)域上的VL結(jié)構(gòu)域的多肽，用VL-L-VH表示?？梢灶嵉筕L結(jié)構(gòu)域和VH結(jié)構(gòu)域的順序來獲得稱作為VH-L-VL的多肽?！敖Y(jié)構(gòu)域”或者“區(qū)域”是推定具有分散功能的蛋白質(zhì)區(qū)段，例如具有抗原結(jié)合或抗原識(shí)別功能。
如在此所用，術(shù)語“多價(jià)單鏈抗體”是指通過肽接頭共價(jià)連接的兩個(gè)或多個(gè)單鏈抗體片段。可連接抗體片段來形成二價(jià)單鏈抗體，具有如下的VL和VH結(jié)構(gòu)域的順序VL-L-VH-L-VL-L-VH；VL-L-VH-L-VH-L-VL；VH-L-VL-L-VH-L-VL；或者VH-L-VL-L-VL-L-VH。單鏈多價(jià)抗體是三價(jià)或者更高價(jià)的，一個(gè)或多個(gè)抗體片段通過其它中間肽接頭被連接到二價(jià)單鏈抗體上。在優(yōu)選實(shí)施方案中，VL和VH結(jié)構(gòu)域的數(shù)量是相同的。
如在此所用，“Fv”區(qū)是指含有可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)的單鏈抗體Fv區(qū)。重鏈和輕鏈可以來源于相同的抗體，或者不同抗體從而產(chǎn)生嵌合的Fv區(qū)。
如在此所用，術(shù)語“超變區(qū)”是指抗體上負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。超變區(qū)包含來自“互補(bǔ)決定區(qū)”或者“CDR”的氨基酸殘基(即，輕鏈可變區(qū)中的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，和重鏈可變區(qū)的殘基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)(Kabat等，免疫學(xué)重要的蛋白質(zhì)的序列(Sequences ofProteins of Immunological Interest)，第5版.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1991))和/或那些來自“超變環(huán)”的殘基(即輕鏈可變區(qū)中的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，以及重鏈可變區(qū)中的殘基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196901-917(1987))?！凹軜?gòu)”(Framework)或“FR”殘基是那些不同于在此定義的超變區(qū)殘基的可變區(qū)的殘基。
本領(lǐng)域熟知，抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)是主要決定抗體特異性的抗體部分。CDR直接與抗原表位相互作用(參見，Clark，1986；Roitt，1991)。在IgG免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變區(qū)中，存在由三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1到CDR3)分開的四個(gè)架構(gòu)區(qū)(FR1到FR4)。架構(gòu)區(qū)(FRs)維持抗體結(jié)合部的三級(jí)結(jié)構(gòu)，抗體結(jié)合部是抗體的一部分，參與與抗原的作用。CDRs，特別是CDR3區(qū)，更特別為重鏈的CDR3，使抗體產(chǎn)生特異性。由于這些CDR區(qū)特別是CDR3區(qū)使抗體具有抗原特異性，這些區(qū)域被插入到轉(zhuǎn)移體上，使該單位具有相同的抗原特異性。
可以通過本領(lǐng)域已知的方法來確定用于合成本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體的CDR區(qū)的序列。重鏈可變區(qū)是通常長(zhǎng)度為100-150個(gè)氨基酸范圍的肽。輕鏈可變區(qū)是通常長(zhǎng)度為80-130個(gè)氨基酸范圍的肽。重鏈和輕鏈可變區(qū)中的CDR序列僅包括約3-25個(gè)氨基酸序列，容易由本領(lǐng)域技術(shù)人員測(cè)序確定。甚至可以通過商業(yè)來源合成這種肽，例如由Scripps Protein and Nucleic Acids CoreSequencing Facility合成(La Jolla Calif.)。
在其它實(shí)施方案中，CDR區(qū)或序列可以作為肽序列文庫隨機(jī)制備，用標(biāo)準(zhǔn)分析來篩選具有期望結(jié)合特性或功能特性的CDR區(qū)或序列。在一個(gè)物種中，不同輕鏈或重鏈的構(gòu)架區(qū)的序列相對(duì)保守。如在此所用，“人架構(gòu)區(qū)”是與天然的人免疫球蛋白的架構(gòu)區(qū)實(shí)質(zhì)上相同(約85％或更高，通常約90-95％或更高)的架構(gòu)區(qū)。抗體的架構(gòu)區(qū)是組成輕鏈和重鏈的組合架構(gòu)區(qū)，起安置(position)和排列CDR作用。
如在此所用，術(shù)語“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”是指如下的一種或組合(a)免疫球蛋白(IgG、IgM或其它免疫球蛋白)的VL區(qū)加VH區(qū)；(b)免疫球蛋白(IgG、IgM或其它免疫球蛋白)的VL區(qū)加VL區(qū)；(c)免疫球蛋白(IgG、IgM或其它免疫球蛋白)的VH區(qū)加VH區(qū)；(d)免疫球蛋白(IgG、IgM或其它免疫球蛋白)的單一VL區(qū)；(e)免疫球蛋白(IgG、IgM或其它免疫球蛋白)的單一VH區(qū)或者一個(gè)或多個(gè)CDR肽序列；或者(f)具有與CDR肽類似的抗原結(jié)合活性的肽。
如在此所用，術(shù)語“人源化的”是指非人的(例如鼠的)抗體的形式，是特異的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如抗體的Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或者其它抗原結(jié)合亞序列)，含有來源于非人的免疫球蛋白的最小序列。對(duì)于大部分，人源化的抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的超變區(qū)的殘基被具有期望特異性、親合性和性能的來自非人物種(供體抗體)的超變區(qū)的殘基取代，非人物質(zhì)例如小鼠、大鼠或兔子。在有些情形下，人免疫球蛋白的Fv架構(gòu)區(qū)(FR)的殘基被相應(yīng)的非人的殘基取代。而且，人源化的抗體可能包括存在于受體抗體或供體抗體的殘基。進(jìn)行這些修飾來進(jìn)一步改進(jìn)和優(yōu)化抗體性能。總之，人源化抗體將包含實(shí)質(zhì)上至少一個(gè)，和通常兩個(gè)可變區(qū)的全部，其中全部或?qū)嵸|(zhì)上全部超變區(qū)對(duì)應(yīng)于非人類的免疫球蛋白的那些超變區(qū)，全部或者實(shí)質(zhì)上全部FR區(qū)是人免疫球蛋白的一致序列的那些FR區(qū)。人源化的抗體最佳地還包含至少一部分免疫球蛋白的恒定區(qū)或者結(jié)構(gòu)域(Fc)，通常為人免疫球蛋白的Fc區(qū)。
如在此所用，術(shù)語“生物活性”是指治療性分子、蛋白或肽，優(yōu)選抗體可變片段或CDR區(qū)，在生物學(xué)范圍內(nèi)(context)(在生物體中或其體外模擬物中)執(zhí)行的功能或一整套的活性。生物活性可以包括但是不限于要求保護(hù)的融合蛋白的抗體部分的功能。如果本發(fā)明的融合蛋白或肽具有抗體的天然配對(duì)物(Counterpart)的一種或多種生物學(xué)活性，或者與被檢測(cè)的轉(zhuǎn)移體的體內(nèi)或體外分析中具有可辨別的反應(yīng)，則融合蛋白或肽被視為具有生物學(xué)活性。
如在此所用，轉(zhuǎn)鐵蛋白序列中的“相應(yīng)氨基酸”或“等價(jià)氨基酸”是通過比對(duì)來最大化第一條轉(zhuǎn)鐵蛋白序列和至少第二條轉(zhuǎn)鐵蛋白序列之間的相同性和相似性而確定的。用于在第二條序列中確定相當(dāng)?shù)陌被岬木幪?hào)是基于用于在第一條序列中確定相應(yīng)氨基酸的編號(hào)。在某些情況下，這些短語被用于描述與兔血清轉(zhuǎn)鐵蛋白或者來自其它物種的轉(zhuǎn)鐵蛋白的特定氨基酸相對(duì)的人轉(zhuǎn)鐵蛋白中的氨基酸殘基。
如在此所用，術(shù)語“Tf蛋白片段”或“Tf蛋白”或“Tf蛋白部分”是指包含天然Tf蛋白或其天然突變體的至少約5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的氨基酸序列。
如在此所用，術(shù)語“基因”是指與生物學(xué)功能相關(guān)的DNA的任何區(qū)段。因此，基因包括，但是不限于，編碼序列和/或其表達(dá)所需的調(diào)控序列?；蜻€可以包括未被表達(dá)的DNA片段，例如，構(gòu)成其它蛋白的識(shí)別序列的DNA片段?；蚩梢詮母鞣N來源中獲得，包括從目標(biāo)來源中克隆得到，或從已知的或預(yù)測(cè)的序列信息中合成，而且包括具有期望參數(shù)的被設(shè)計(jì)的序列。
如在此所用，“異源多核苷酸”或“異源核酸”或“異源基因”或“異源序列”或“外源的DNA區(qū)段”是指從特定宿主細(xì)胞之外的來源獲得的多核苷酸、核酸或DNA區(qū)段，或者，如果來自相同來源，則被修飾以區(qū)別于其原始形式。宿主細(xì)胞中的異源基因包括特定宿主細(xì)胞的內(nèi)在的、但是被修飾的基因。因此，該術(shù)語是指細(xì)胞的外源或異源的、或者與細(xì)胞同源但是存在于該宿主細(xì)胞的核酸中的該元件通常不存在的位置上的DNA區(qū)段。作為例子，被連接到人Tf序列上的酵母細(xì)胞天然信號(hào)序列是異源的。
如在此所用，“被分離的”核酸序列是指基本上不含有其它核酸序列的核酸序列，例如通過瓊脂糖凝膠電泳確定至少約20％純度，優(yōu)選至少約40％純度，更加優(yōu)選至少約60％純度，甚至更加優(yōu)選約80％純度，最優(yōu)選約90％純度，和甚至最優(yōu)選約95％純度。例如，可以通過在遺傳工程加工中將核酸序列從其天然位置重新定位到其將被復(fù)制的不同位置上的標(biāo)準(zhǔn)克隆操作來獲得被分離的核酸序列?？寺〔僮骺梢园ㄇ谐头蛛x包含編碼多肽的核酸序列的期望核酸片段，將該片段插入到載體分子上，和將重組載體插入到宿主細(xì)胞中，在宿主細(xì)胞中，核酸序列的多個(gè)拷貝或克隆被復(fù)制。核酸序列可以是基因組的、cDNA、RNA、半合成來源的或它們的任何組合。
如在此所用，當(dāng)DNA編碼序列被翻譯成多肽時(shí)，由于DNA編碼序列之間的讀框內(nèi)融合，兩條或多條編碼序列被認(rèn)為“被連接”或“被融合”。
如在此所用，當(dāng)涉及Tf融合時(shí)，術(shù)語“融合”包括，但是不限于，至少一種治療性蛋白、多肽或肽，優(yōu)選抗體可變區(qū)，被連接到Tf的N末端，被連接到Tf的C末端，被插入到Tf中的任何兩個(gè)氨基酸之間，和/或替換一部分Tf序列，例如Tf環(huán)。
如在此所用，“被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白”用于此來指與野生型轉(zhuǎn)鐵蛋白相比，氨基酸序列具有至少一種修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，“被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白”是指被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白，減少或無糖基化，降低或不結(jié)合鐵或碳酸鹽，以及降低或不結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。
如在此所用，“被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白”被用于此是指通過將至少一個(gè)被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子(或其片段或變體)融合到至少一個(gè)治療性蛋白分子(或其片段或變體)，優(yōu)選抗體可變片段或CDR上形成的蛋白質(zhì)。
如在此所用，術(shù)語“核酸”或“多核苷酸”是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸或核糖核酸及其聚合物。除非特別限定，該術(shù)語包括含有與參比核酸具有類似結(jié)合特性的天然核苷酸的類似物的核酸，并且以與天然核苷酸相似的方式被代謝。除非另外指出，特定核酸序列還含蓄地包括其保守性修飾的變體(例如，簡(jiǎn)并密碼子取代)和互補(bǔ)序列以及被明確指定的序列。特別地，簡(jiǎn)并密碼子取代可以通過生成其中一個(gè)或多個(gè)所選擇(或全部的)密碼子的第三個(gè)位置用混合堿基和/或脫氧次黃苷殘基取代的序列(Batzer等(1991)NucleicAcid Res.195081；Ohtsuka等(1985)J.Biol.Chem.2602605-2608；Cassol等(1992)；Rossolini等(1994)Mol.Cell.Probes 891-98)。術(shù)語核酸與基因、cDNA和由基因編碼的mRNA互換使用。
如在此所用，當(dāng)DNA區(qū)段與另一種DNA區(qū)段處于功能性關(guān)聯(lián)時(shí)，被稱作是“被可操作地連接的”。例如，信號(hào)序列的DNA以參與融合蛋白分泌的前蛋白(preprotein)被表達(dá)時(shí)，則其被可操作地連接到編碼本發(fā)明的融合蛋白的DNA上；如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子刺激序列的轉(zhuǎn)錄，則被可操作地連接到編碼序列上。一般地，被可操作地連接的DNA序列是相鄰的，并且在為信號(hào)序列或融合蛋白的情況下，為相鄰的并在讀框內(nèi)。但是，增強(qiáng)子與轉(zhuǎn)錄被其所控制的編碼序列可以不必是相鄰的。在本文中，連接是通過在便利的限制性位點(diǎn)連接或在被插入到該位置上的連接物或接頭上進(jìn)行連接來完成。
如在此所用，術(shù)語“啟動(dòng)子”是指參與結(jié)合RNA聚合酶來起始轉(zhuǎn)錄的DNA的區(qū)域。
如在此所用，術(shù)語“重組體”是指已經(jīng)用基因或DNA的新組合轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或生物體。
如在此所用，靶向單位、蛋白質(zhì)、多肽或肽是指特異地結(jié)合到特定細(xì)胞類型上[正常(例如，淋巴細(xì)胞)或異常例如(癌細(xì)胞)]的分子，因而可以被用于將轉(zhuǎn)移體或化合物(藥物或細(xì)胞毒性劑)特異地靶向該細(xì)胞。
如在此所用，“治療性蛋白質(zhì)”是指包括(induce)蛋白質(zhì)、多肽、SCA、抗體可變片段、CDR或肽或其片段或變體，具有一種或多種治療性和/或生物學(xué)活性。術(shù)語肽、蛋白質(zhì)和多肽在此被相互交換使用。此外，術(shù)語“治療性蛋白質(zhì)”是指治療性蛋白質(zhì)的內(nèi)在的或天然的相關(guān)物(correlate)?！爸委熁钚浴钡亩嚯幕蚓哂小爸委熁钚缘摹钡鞍踪|(zhì)是指具有一種或多種已知的與治療性蛋白質(zhì)相關(guān)的生物學(xué)的和/或治療性活性的多肽，治療性蛋白質(zhì)例如在此公開或本領(lǐng)域另外知曉的一種或多種治療性蛋白質(zhì)。作為非限制性例子，“治療性蛋白質(zhì)”是用于治療、預(yù)防或緩解疾病、癥狀或紊亂的蛋白質(zhì)。這種疾病、癥狀或紊亂可以是人或非人類動(dòng)物患有的，例如獸醫(yī)用途。
如在此所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”是指核酸(即核酸聚合物)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。如在此所用，術(shù)語“遺傳轉(zhuǎn)化”是指DNA特別是重組DNA轉(zhuǎn)移和結(jié)合到細(xì)胞中。
如在此所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)化體”是指已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或生物體。
如在此所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”是指以確保其功能的方式被插入到生物體、宿主細(xì)胞或載體中的核酸。
如在此所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因的”是指細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、生物體、細(xì)菌、真菌、動(dòng)物、植物，它們的任何一種的后代，通過各種轉(zhuǎn)化方法之一接受外源的或被修飾的基因，特別是編碼被修飾的Tf融合蛋白質(zhì)的基因，其中外源的或被修飾的基因來自與接受外源的或被修飾的基因的生物體種類相同或不同的種類。
“變體”(variants or variant)是指不同于參比核酸或多肽但保留其基本特性的多核苷酸或核酸。一般地，變體大體上是非常相似的，并且在許多區(qū)域與參比核酸或多肽相同。如在此所用，“變體”是指本發(fā)明的轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分，其序列區(qū)別于天然治療性蛋白質(zhì)，但是保留至少其一種本文別處或本領(lǐng)域另外知曉的功能的和/或治療的特性。
如在此所用，術(shù)語“載體”泛指任何編碼外源核酸的質(zhì)粒、噬菌粒或病毒。該術(shù)語還被解釋為包括非質(zhì)粒、非噬菌粒和非病毒的化合物，其方便將核酸轉(zhuǎn)移到病毒子或細(xì)胞中，例如，多溶素化合物等。載體可以是適合作為將核酸或其突變體呈遞給細(xì)胞的呈遞媒介的病毒載體，或者該載體可以是適用于相同目的的非病毒載體。用于將DNA呈遞給細(xì)胞和組織的病毒和非病毒載體的例子在本領(lǐng)域是熟知的，并且被描述在，例如Ma等(1997，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9412744-12746)中。病毒載體的例子包括，但是不限于，重組病毒載體、重組腺病毒、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、重組腺伴隨病毒、重組鳥痘病毒等(Cranage等1986，EMBO J.53057-3063；1994年8月18日公開的國際專利申請(qǐng)WO 94/17810；1994年10月27日公開的國際專利申請(qǐng)WO94/23744)。非病毒載體的例子包括，但是不限于，脂質(zhì)體、DNA的多胺衍生物等。
如在此所用，術(shù)語“野生型”是指天然存在的多核苷酸或多肽序列。
如在此所用，術(shù)語“毒素”是指生物學(xué)來源的有毒物質(zhì)。
如在此所用，術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)”是指在B細(xì)胞或T細(xì)胞水平上提高或降低抗原特異的免疫反應(yīng)的能力。可以例如在T細(xì)胞增殖分析中，通過測(cè)定抗體生成、淋巴因子生成或T細(xì)胞響應(yīng)來檢測(cè)免疫調(diào)節(jié)活性。特別地，除了影響T細(xì)胞反應(yīng)，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)多肽可能結(jié)合到B細(xì)胞表面的免疫球蛋白(即抗體)分子上，影響B(tài)細(xì)胞反應(yīng)。
如在此所用，術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)肽”是影響免疫反應(yīng)的肽。
如在此所用，術(shù)語“Fc區(qū)”是指由恒定區(qū)組成的抗體分子的莖部。Fc區(qū)也被稱作效應(yīng)區(qū)。Fc區(qū)與免疫系統(tǒng)的其它組分相互作用，將存在細(xì)菌的信號(hào)轉(zhuǎn)換為細(xì)胞反應(yīng)?？贵w的Fc區(qū)是在免疫反應(yīng)過程中產(chǎn)生不同讀出(readout)的重要區(qū)域。該區(qū)域由重鏈組成，在免疫反應(yīng)過程中改變讀出的方式將會(huì)改變抗體的Fc區(qū)的結(jié)構(gòu)。通過改變恒定區(qū)，將改變抗體的類型。該過程被稱作類別轉(zhuǎn)換(class switching)，發(fā)生在B淋巴細(xì)胞中。
單鏈抗體和轉(zhuǎn)移體與常規(guī)抗體相比，單鏈抗體較小，可以極低的成本制備。單鏈抗體小，可能降低機(jī)體的免疫反應(yīng)，從而提高治療應(yīng)用的安全性和效率。而且，單鏈抗體可以被加工成具有高度抗原性。
各種單鏈抗體(SCA)最初被發(fā)明來簡(jiǎn)化抗體篩選和生產(chǎn)。但是，由于個(gè)體小，會(huì)發(fā)生自凝聚，并且體內(nèi)半衰期短，單鏈抗體被證明具有有限的治療價(jià)值或者無治療價(jià)值。將轉(zhuǎn)鐵蛋白添加到SCA上，顯著地提高SCA的體內(nèi)半衰期、穩(wěn)定性，并且容易制備。
因此，來自SCA的組分可以被融合到轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的N末端、C末端或者N末端和C末端上(VL、VH和/或一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū))。還可以采用轉(zhuǎn)鐵蛋白的不同部分或結(jié)構(gòu)域來進(jìn)行這種融合，例如N末端結(jié)構(gòu)域或C末端結(jié)構(gòu)域。這些蛋白可以被直接融合或者采用各種長(zhǎng)度的接頭肽來融合。還可能將活性SCA的全部或部分融合在轉(zhuǎn)鐵蛋白的支架中。在這種情況下，通過將SCA的cDNA插入到轉(zhuǎn)鐵蛋白的cDNA中，在細(xì)胞中生產(chǎn)融合蛋白。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將兩個(gè)VH區(qū)或兩個(gè)VL區(qū)連接到轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的兩端，或者插入轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將一個(gè)VH區(qū)或一個(gè)VL區(qū)連接到轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的兩端，或者插入轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白中。通過接頭(L)將可變區(qū)相互連接，然后融合或插入到轉(zhuǎn)鐵蛋白中。接頭是被共價(jià)地連接到可變結(jié)構(gòu)域上的分子，使得容易連接或插入到Tf上。總的來說，接頭和Tf在兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間產(chǎn)生足夠大的空間和靈活性，使得結(jié)構(gòu)域能夠形成一種構(gòu)象，在該構(gòu)象中，結(jié)構(gòu)域能夠特異地結(jié)合其所定向的表位。此外，可以修飾轉(zhuǎn)鐵蛋白，使得連接到兩個(gè)末端的可變區(qū)緊貼在一起。這種修飾包括，但是不限于，去除C末端脯氨酸和/或接近Tf的C末端的半胱氨酸環(huán)，產(chǎn)生更大的靈活性。
本發(fā)明還包括多價(jià)轉(zhuǎn)移體。具有VH-L-VH順序的抗體可變區(qū)可以被融合到轉(zhuǎn)鐵蛋白的一端，而具有VL-L-VL順序的抗體可變區(qū)可以被融合到同一個(gè)轉(zhuǎn)鐵蛋白的另一端。本發(fā)明還包括形成多價(jià)SCA的可變區(qū)的其它序列。例子包括，但是不限于，VH-L-VL和VL-L-VH，以及具有更多可變區(qū)相互連接的那些序列。還可以將可變區(qū)和接頭插入到轉(zhuǎn)鐵蛋白分子中。
可替代地，多價(jià)抗體的可變區(qū)可以通過將可變結(jié)構(gòu)域插入到轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子中來形成，而不使用任何非自然的肽接頭。通過這種方式，轉(zhuǎn)鐵蛋白分子中作為接頭的部分在可變結(jié)構(gòu)域之間形成空間和靈活性。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，可以將結(jié)合相同抗原的可變區(qū)融合到相同轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的不同末端。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，結(jié)合不同抗原的可變區(qū)被融合到相同的轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的不同末端。這種轉(zhuǎn)移體能夠連接兩種不同抗原或者結(jié)合和/或激活兩種不同的細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供被融合到轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白上的嵌合抗體可變區(qū)。此外，該可變區(qū)可以被插入到轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子中。
本發(fā)明包括特異地結(jié)合期望多肽、肽或表位的轉(zhuǎn)移體。如果1)轉(zhuǎn)移體具有結(jié)合活性的閾值，和/或2)不會(huì)顯著地與無關(guān)的多肽分子發(fā)生交叉反應(yīng)，則轉(zhuǎn)移體被確定是特異地結(jié)合。在某些情況下，如果轉(zhuǎn)移體結(jié)合期望多肽、肽或表位的親合性超過結(jié)合對(duì)照多肽的親合性至少10倍，則轉(zhuǎn)移體發(fā)生特異性結(jié)合。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移體具有106M-1或更高的結(jié)合親合性(Ka)，優(yōu)選為107M-1或更高，更加優(yōu)選為108M-1或更高，最優(yōu)選為109M-1或更高。本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體的結(jié)合親合性容易由本領(lǐng)域技術(shù)人員采用標(biāo)準(zhǔn)的抗體親合性分析方法來確定，例如Scatchard分析(Scatchard，G.，Ann.NY Acad.Sci.51660-672，1949)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，如果轉(zhuǎn)移體未顯著地與無關(guān)多肽發(fā)生交叉反應(yīng)，則被確定發(fā)生特異性結(jié)合。如果采用標(biāo)準(zhǔn)的Western印跡分析檢測(cè)到期望的多肽、肽或表位，但是未檢測(cè)到無關(guān)多肽，則轉(zhuǎn)移體未顯著地與無關(guān)多肽分子發(fā)生交叉反應(yīng)。在有些情況下，無關(guān)多肽是orthologs，來自相同物種的蛋白質(zhì)，是蛋白質(zhì)家族的成員。
制備轉(zhuǎn)移體的抗體可變區(qū)將來自許多抗體的可變區(qū)轉(zhuǎn)化成適合插入轉(zhuǎn)鐵蛋白來制備轉(zhuǎn)移體的形式。包括抗erbB2、B3、BR96、OVB3、抗轉(zhuǎn)鐵蛋白、Mik-β1和PR1(分別參見Batra等，Mol.Cell.Biol.，112200-2205(1991)；Batra等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895867-5871(1992)；Brinkmann等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，888616-8620(1991)；Brinkmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90547-551(1993)；Chaudhary等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，871066-1070(1990)；Friedman等，Cancer Res.53334-339(1993)；Kreitman等，J.Immunol.，1492810-2815(1992)；Nicholls等，J.Biol.Chem.，2685302-5308(1993)；和Wells等，CancerRes.，526310-6317(1992))。
典型地，F(xiàn)v結(jié)構(gòu)域選自本領(lǐng)域知曉的縮寫為26-10、MOPC 315、741F8、520C9、McPC 603、D1.3、鼠phOx、人phOx、RFL3.8sTCR、1A6、Sel55-4、18-2-3、4-4-20、7A4-1、B6.2、CC49、3C2、2c、MA-15C5/K12Go、Ox等的單克隆抗體(參見，Huston，J.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883(1988)；Huston，J.S.等，SIM News 38(4)(副刊)11(1988)；McCartney，J.等，ICSU Short Reports 10114(1990)；Nedelman，M.A.等，J.Nuclear Med.32(副刊)1005(1991)；Huston，J.S.等，分子設(shè)計(jì)與建模概念和應(yīng)用(Molecular Design and ModelingConcepts and Applications)，B部，J.J.Langone編輯，Methods in Enzymology 20346-88(1991)；Huston，J.S.等，單克隆抗體在臨床腫瘤學(xué)中的應(yīng)用的進(jìn)展(Advances in the Applications ofMonoclonal Antibodies in Clinical Oncology)，Epenetos，A.A.(編輯)，倫敦，Chapman & Hall(1993)；Bird，R.E.等，Science 242423-426(1988)；Bedzyk，W.D.等，J.Biol.Chem.26518615-18620(1990)；Colcher，D.etal.，J.Nat.Cancer Inst.821191-1197(1990)；Gibbs，R.A.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 884001-4004(1991)；Milenic，D.E.et al.，Cancer Research 516363-6371(1991)；Pantoliano，M.W.et al.，Biochemistry 3010117-10125(1991)；Chaudhary，V.K.etal.，Nature 339394-397(1989)；Chaudhary，V.K.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871066-1070(1990)；Batra，J.K.etal.，B iochem.Biophys.Res.Comm.1711-6(1990)；Batra，J.K.etal.，J.Biol.Chem.26515198-15202(1990)；Chaudhary，V.K.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA879491-9494(1990)；Batra，J.K.等，Mol.Cell.Biol.112200-2205(1991)；Brinkmann，U.等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 888616-8620(1991)；Seetharam，S.等，J.Biol.Chem.26617376-17381(1991)；Brinkmann，U.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 893075-3079(1992)；Glockshuber，R.等，Biochemistry 291362-1367(1990)；Skerra，A.等，Bio/Technol.9273-278(1991)；Pack，P.等，Biochemistry 311579-1534(1992)；Clackson，T.等，Nature 352624-628(1991)；Marks，J.D.等，J.Mol.Biol.222581-597(1991)；Iverson，B.L.等，Science 249659-662(1990)；Roberts，V.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 876654-6658(1990)；Condra，J.H.等，J.Biol.Chem.2652292-2295(1990)； Laroche，Y.等，J.Biol.Chem.26616343-16349(1991)；Holvoet，P.等，J.Biol.Chem.26619717-19724(1991)；Anand，N.N.等，J.Biol.Chem.26621874-21879(1991)；Fuchs，P.等，Bio/Technol.91369-1372(1991)；Breitling，F(xiàn).等，Gene 104104-153(1991)；Seehaus，T.等，Gene 114235-237(1992)；Takkinen，K.等，Protein Engng.4837-841(1991)；Dreher，M.L.等，J.Immunol.Methods 139197-205(1991)；Mottez，E.等，Eur.J.Immunol.21467-471(1991)；Traunecker，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA888646-8650(1991)；Traunecker，A.等，EMBO J.103655-3659(1991)；Hoo，W.F.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA894759-4763(1993))。
表1提供各種單克隆抗體，其可變區(qū)和CDR可以用于制備轉(zhuǎn)移體。
表1單克隆抗體















人源化的抗體可變區(qū)本發(fā)明還包括用于制備轉(zhuǎn)移體的人源化可變結(jié)構(gòu)域的生產(chǎn)和用途。人源化抗體是非人類抗體，其中一些或全部氨基酸殘基被存在于相似的人抗體中的相應(yīng)氨基酸殘基取代。例如，從人抗體開始，超變區(qū)以及可能FR中的殘基被來自嚙齒類抗體中的類似位點(diǎn)上的殘基取代。人源化降低抗體的抗原性。
已經(jīng)用各種方法人源化抗體的可變結(jié)構(gòu)域，例如CDR移植(Riechmann等，Nature，332323-327(1988))，替換被暴露的殘基(Padlan，Mol.Immunol.28489-498(1991))以及再現(xiàn)可變結(jié)構(gòu)域(Roguska等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91969-973(1994)。最低要求的再現(xiàn)方法特別適合抗體可變結(jié)構(gòu)域，該可變結(jié)構(gòu)域需要保留一些小鼠或其它物種的架構(gòu)殘基來保持最大的抗原結(jié)合親合性。但是，CDR移植方法也已經(jīng)被成功地用于一些抗體的人源化，其不需要保留任何小鼠的架構(gòu)殘基(Jones等Nature，321522-525(1986)和Verhoeyen等，Science，2391534-1536(1988))或者僅保留一個(gè)和兩個(gè)小鼠的殘基(Riechmann等，Nature，332323-327(1988)；Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8610029-10033(1989)。
還可以通過排列重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域與最佳的人同系物來實(shí)現(xiàn)人源化，該同系物在序列數(shù)據(jù)庫例如GENBANK或SWISS-PROT中采用標(biāo)準(zhǔn)的序列比較軟件確定。序列分析以及與基于單克隆抗體McPC603的可變結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)模型比較(Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8610029-10033(1989)和Satow等，J.Mol.Biol.190593-604(1986))；蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫登錄IMCP)，使得可以確定在小鼠抗體與其人類配偶體之間相互區(qū)別的架構(gòu)殘基。
選擇用于制備人源化的抗體的人可變結(jié)構(gòu)域，包括輕鏈和重鏈，對(duì)于降低抗原性是重要的。根據(jù)所謂的“最適”(“best-fit”)方法，在已知的人可變結(jié)構(gòu)域序列的完整文庫中，對(duì)嚙齒類抗體的可變結(jié)構(gòu)域的序列進(jìn)行檢索。然后，與嚙齒類的序列最接近的人序列作為人源化抗體的人架構(gòu)區(qū)(FR)(Sims等，J.Immunol.，1512296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.，196901(1987))。另一種方法采用來源于所有特定亞組的輕鏈或重鏈的人抗體的一致序列的特定架構(gòu)區(qū)。相同的架構(gòu)區(qū)可以被用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta等，J.Immnol.，1512623(1993))。
制備抗原結(jié)合片段和CDRs可以通過幾種方法制備被融合或連接到轉(zhuǎn)鐵蛋白上的抗原結(jié)合片段和CDRs，包括但是不限于從噬菌體文庫中篩選，通過克隆抗體cDNA來克隆特定抗體的可變區(qū)，使用側(cè)翼恒定區(qū)作為引物來克隆可變區(qū)，或者合成對(duì)應(yīng)于任何特異性抗體的可變區(qū)的寡核苷酸。在5′和3′末端剪切cDNA，產(chǎn)生限制性位點(diǎn)，使得可以使用寡核苷酸接頭，將該cDNA克隆到含有轉(zhuǎn)鐵蛋白的cDNA的載體中。這可以在N末端或C末端或者N末端和C末端，使用或不使用間隔序列。可以將融合分子cDNA克隆到載體中，然后從載體中切出完整的表達(dá)盒，并插入到表達(dá)載體中，在酵母中表達(dá)融合蛋白。然后從培養(yǎng)基中收集和純化由酵母分泌的融合蛋白，并檢測(cè)其活性。對(duì)于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)，可以采用類似的操作，但是，所用的表達(dá)盒使用哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列和終止子。然后切出該表達(dá)盒，并插入到適合轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的質(zhì)粒中?？梢詮呐囵B(yǎng)基中純化以這種方式制備的轉(zhuǎn)移體，并采用標(biāo)準(zhǔn)的免疫化學(xué)方法檢測(cè)其結(jié)合到抗原上。
特別地，可以采用噬菌體展示技術(shù)來制備大的抗原結(jié)合肽文庫，通過噬菌體在其表面表達(dá)和展示生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)分子。在其它實(shí)施方案中，可以在被修飾的Tf中直接制備抗原結(jié)合肽文庫，建立轉(zhuǎn)移體文庫。已經(jīng)在噬菌體λ表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生抗原結(jié)合肽的組合文庫，作為噬菌斑或作為溶原菌菌落被篩選(Huse等(1989)Science 2461275；Caton和Koprowski(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)876450；Mullinax等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)878095；Persson等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)882432)。各種噬菌體抗原結(jié)合肽展示文庫和噬菌體表達(dá)文庫的實(shí)施方案已經(jīng)被描述(Kang等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)884363；Clackson等(1991)Nature352624；McCafferty等(1990)Nature 348552；Burton等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)8810134；Hoogenboom等(1991)Nucleic Acids Res.194133；Chang等(1991)J.Immunol.1473610；Breitling等(1991)Gene 104147；Marks等(1991)J.Mol.Biol.222581；Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)894457；Hawkins和Winter(1992)J.Immunol.22867；Marks等(1992)Biotechnology 10779；Marks等(1992)J.Biol.Chem.26716007；Lowman等(1991)Biochemistry 3010832；Lerner等(1992)Science 2581313)。還可以參見Rader，C.和Barbas，C.F.(1997)“組合抗體文庫的噬菌體展示”(“Phage displayofcombinatorial antibody libraries”)Curr.Opin.Biotechnol.8503-508。展示在噬菌體外殼蛋白上的各種scFV文庫已經(jīng)被描述(Marks等(1992)Biotechnology10779；Winter G and Milstein C(1991)Nature 349293；Clackson等(1991)op.cit.；Marks等(1991)J.Mol.Biol.222581；Chaudhary等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)871066；Chiswell等(1992)TIBTECH 1080；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)855879)。
通常，將隨機(jī)寡核苷酸文庫或者編碼抗體片段或肽例如VL和VH的cDNA文庫插入到M13或fd噬菌體的基因3中來制備噬菌體文庫。各個(gè)插入基因被表達(dá)在基因產(chǎn)物噬菌體的最小外殼蛋白的N末端。結(jié)果，構(gòu)建了含有不同肽的肽文庫。然后使用被固定的目標(biāo)靶向分子，例如抗原，對(duì)噬菌體文庫進(jìn)行親合篩選，回收被特異結(jié)合的噬菌體，并通過感染大腸桿菌宿主細(xì)胞來進(jìn)行擴(kuò)增。典型地，目標(biāo)靶向分子例如受體(例如多肽、糖類、糖蛋白、核酸)通過共價(jià)連接到層析樹脂上來固定，通過親合層析來富集反應(yīng)的噬菌體)和/或標(biāo)記篩選空斑或菌落增加。最后，對(duì)被擴(kuò)增的噬菌體進(jìn)行測(cè)序，推定特異性肽序列。由于噬菌體展示的固有特性，展示在噬菌體表面上的抗體或肽在體外篩選條件下未呈現(xiàn)其在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中的天然構(gòu)象。此外，細(xì)菌不容易加工、組裝、或表達(dá)/分泌功能性抗體。
作為本發(fā)明的一部分，可以將含有隨機(jī)肽的轉(zhuǎn)鐵蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白部分插入到噬菌體基因3中，替代VL和VH片段。在這種方式中，在文庫中篩選含有抗原性肽的轉(zhuǎn)鐵蛋白。
采用由例如Abgenix，Inc.，F(xiàn)remont，Calif.和Medarex，Inc.Annandale，N.J公司開發(fā)的XENOMOUSETM技術(shù)，使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，例如小鼠，來生產(chǎn)全長(zhǎng)的人抗體。通過抑制小鼠抗體基因表達(dá)，并功能性地替換為用人抗體基因進(jìn)行表達(dá)，遺傳加工小鼠。這種技術(shù)利用了小鼠免疫系統(tǒng)在監(jiān)控和親合成熟中的天然力量，制備高親合性抗體的大量組成成分。
在本發(fā)明的還有一個(gè)方面，用于制備單鏈抗體文庫的方法包括在酵母細(xì)胞中表達(dá)酵母表達(dá)載體文庫。各個(gè)酵母表達(dá)載體包括編碼抗體重鏈可變區(qū)的第一核酸序列，編碼抗體輕鏈可變區(qū)的第二核酸序列，連接抗體重鏈可變區(qū)和抗體輕鏈可變區(qū)的轉(zhuǎn)鐵蛋白序列。抗體重鏈可變區(qū)，抗體輕鏈可變區(qū)，以及轉(zhuǎn)鐵蛋白接頭被表達(dá)成為單一的轉(zhuǎn)移體融合蛋白。此外，第一和第二核苷酸序列在表達(dá)載體文庫中各自獨(dú)立地變化，產(chǎn)生基因至少約106多樣性的轉(zhuǎn)移體文庫。
以相似的方式，文庫能夠表達(dá)含有用各種插入肽替代抗體片段的轉(zhuǎn)鐵蛋白。然后在該文庫中篩選對(duì)特定抗原具有最佳結(jié)合活性的轉(zhuǎn)移體。
根據(jù)實(shí)施方案，轉(zhuǎn)移體文庫的多樣性優(yōu)選在約106-1016之間，更加優(yōu)選在約108-1016之間，最優(yōu)選在約1010-1016之間。
治療性轉(zhuǎn)移體本發(fā)明還包括制備和使用包含抗體可變區(qū)的轉(zhuǎn)移體來治療或預(yù)防疾病，該抗體可變區(qū)來自定向抵抗一種或多種不同抗原的抗體。優(yōu)選地，至少一種抗原(和優(yōu)選所有抗原)是生物學(xué)上重要的分子，給患有疾病或癥狀的哺乳動(dòng)物施用抵抗抗原的轉(zhuǎn)移體，能夠在該哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生治療益處。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，抗原是蛋白質(zhì)，但是，也可以使用其它的非多肽抗原(例如腫瘤相關(guān)的糖脂，參見美國專利5,091,178)。
示例性蛋白質(zhì)抗原包括分子例如腎素；生長(zhǎng)激素，包括人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；生長(zhǎng)激素釋放因子；甲狀旁腺素；促甲狀腺素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；促黃體素(luteinizing hormone)；胰高血糖素；凝血因子例如因子VIIIC、因子IX、組織因子和von Willebrand因子；抗凝血因子例如蛋白C；心鈉素因子；肺表面活性劑；血漿酶原激活物，例如尿激酶或人尿或組織性血漿酶原激活物(t-PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生長(zhǎng)因子；腫瘤壞死因子-α和-β；腦啡肽酶；RANTES(調(diào)節(jié)激活正常的T細(xì)胞表達(dá)和分泌)；人巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白例如人血清白蛋白；Muellerian抑制物； 松弛素A鏈；松弛素B鏈；松弛素原；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；微生物蛋白，例如β內(nèi)酰胺酶；Dnase；IgE；細(xì)胞毒素T-淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA)，例如CTLA-4；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)；激素或生長(zhǎng)因子受體；蛋白A或D；類風(fēng)濕性因子；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子例如骨來源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或者神經(jīng)生長(zhǎng)因子例如NGF-β；血小板來源的生長(zhǎng)因子(PDGF)；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子例如aFGF和bFGF；表皮生長(zhǎng)因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白；CD蛋白例如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；促紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)因子(osteoinductive factor)；免疫毒素；骨形成蛋白(BMP)；干擾素例如干擾素-α、-β和-γ；菌落刺激因子(CSFs)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白細(xì)胞介素(ILs)，例如IL-1到IL-10；過氧化物歧化酶；T-細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子、病毒抗原例如AIDS衣殼的一部分；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；歸巢(homing)受體；地址素；調(diào)控蛋白；RSV衣殼(envelop)蛋白；HSV衣殼和外殼蛋白；流感病毒外殼蛋白；整聯(lián)蛋白例如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；腫瘤相關(guān)抗原例如HER2、HER3或HER4受體；細(xì)菌及其毒素例如肉毒桿菌(botulinum)毒素、霍亂(cholera)毒素和炭疽熱(anthrax)毒素；真菌，特別是病原性真菌；和任何上面所列的多肽的變體和/或片段。本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體結(jié)合的其它分子被列舉在PCT/US02/27637中，其在此完全引入作為參考。
轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾本發(fā)明提供包含一個(gè)或多個(gè)抗體可變區(qū)以及轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)移體。任何轉(zhuǎn)鐵蛋白可以被用于制備本發(fā)明的被修飾Tf融合蛋白。作為例子，野生型人Tf(Tf)是約75kDa的679個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)(未考慮糖基化)，具有兩個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域，N(約330個(gè)氨基酸)和C(約340個(gè)氨基酸)，其似乎來源于基因復(fù)制。參見GenBank登錄號(hào)NM 001063、XM 002793、M12530、XM 039845、XM 039847和S95936(www.ncbi.nlm.nih.gov/)，所有這些以及SEQ ID NO1、2和3在此完全引入作為參考。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域持續(xù)偏離，但是保持較高程度的同一性/相似性(附圖1)。
各個(gè)N末端結(jié)構(gòu)域和C末端結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步被分成兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，N1和N2，C1和C2。Tf的功能是將鐵轉(zhuǎn)運(yùn)到機(jī)體細(xì)胞內(nèi)。該過程受Tf受體(TfR)的調(diào)節(jié)，Tf受體在所有細(xì)胞上被表達(dá)，特別是在活躍生長(zhǎng)的細(xì)胞上。TfR識(shí)別鐵結(jié)合形式的Tf(每個(gè)受體結(jié)合兩分子Tf)，當(dāng)TfR/Tf復(fù)合物被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)涵體中時(shí)，發(fā)生內(nèi)吞作用，此時(shí)局部的pH下降導(dǎo)致被結(jié)合的鐵的釋放，以及TfR/Tf復(fù)合物再循環(huán)到細(xì)胞表面并釋放Tf(未結(jié)合鐵的形式稱作為apoTf)。受體結(jié)合是通過Tf的C末端結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)。由于未糖基化的鐵結(jié)合Tf也結(jié)合受體，C末端結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)糖基化位點(diǎn)似乎不參與受體結(jié)合。
每個(gè)Tf分子能夠攜帶兩個(gè)鐵離子(Fe3+)。它們?cè)贜1和N2，C1和C2亞結(jié)構(gòu)域之間的空間內(nèi)發(fā)生復(fù)合，導(dǎo)致分子的構(gòu)象發(fā)生變化。Tf通過Tf受體跨越血腦屏障(BBB)。
在人的轉(zhuǎn)鐵蛋白中，鐵結(jié)合位點(diǎn)包含至少SEQ ID NO3的氨基酸Asp63(包括天然Tf信號(hào)序列的SEQ ID NO2中的Asp 82)，Asp 392(SEQ ID NO2的Asp 411)，Tyr 95(SEQ ID NO2的Tyr 114)，Tyr 426(SEQ ID NO2的Tyr445)，Tyr 188(SEQ ID NO2的Tyr 207)，Tyr514或517(SEQ ID NO2的Tyr533或Tyr 536)，His 249(SEQ ID NO2的His 268)和His 585(SEQ ID NO2的His 604)。鉸鏈區(qū)包含至少SEQ ID NO3的N結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基94-96，245-247和/或316-318以及C結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基425-427，581-582和/或652-658。碳酸鹽結(jié)合位點(diǎn)包含至少SEQ ID NO3的氨基酸Thr 120(SEQID NO2的Thr 139)，Thr 452(SEQ ID NO2的Thr)，Arg 124(SEQ ID NO2的Arg 143)，Arg 456(SEQ ID NO2的Arg 475)，Ala 126(SEQ ID NO2的Ala145)，Ala 458(SEQ ID NO2的Ala 477)，Gly 127(SEQ ID NO2的Gly 146)和Gly 459(SEQ ID NO2的Gly 478)。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體包括被修飾的人轉(zhuǎn)鐵蛋白，而任何動(dòng)物的Tf分子可能被用于制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體，包括人Tf變體，奶牛、豬、綿羊、狗、兔、大鼠、小鼠、倉鼠、echnida、鴨嘴獸、雞、青蛙、天蛾幼蟲、猴以及其它種類的牛、犬和鳥類(參見附圖2中的一組示例性Tf序列)。所有這些Tf序列很容易從GenBank和其它公共數(shù)據(jù)庫中獲得。人Tf核苷酸序列是可獲得的(參見SEQ ID NO1，2和3以及上面描述的登錄號(hào)，并且可以從www.ncbi.nlm.nih.gov/獲得)，并用于制備Tf或Tf結(jié)構(gòu)域與所選的治療性分子的遺傳融合物。還可以從相關(guān)分子例如乳鐵傳遞蛋白(乳鐵蛋白)GenBankAccNM002343)。
乳鐵蛋白(Lf)是天然防御的鐵結(jié)合蛋白，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具有抗菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤和抗炎癥的活性。這些蛋白質(zhì)以通常暴露于正常菌群中的外分泌物存在乳汁、眼淚、鼻腔分泌物、唾液、支氣管粘液、胃腸道液、子宮頸-陰道粘液和精液。此外，Lf是循環(huán)多形核粒細(xì)胞(PMNs)的次級(jí)特定顆粒的主要成分。脫輔基蛋白在腐爛(septic)區(qū)被釋放到PMNs的脫粒上。Lf的基本功能是清除液體和發(fā)炎區(qū)域的游離鐵，抑制游離自由基介導(dǎo)的破壞，并降低金屬侵入微生物和贅生性細(xì)胞的效率。在成人中的檢測(cè)125I Lf的轉(zhuǎn)化率的試驗(yàn)中，結(jié)果表明Lf迅速被肝臟和脾臟吸收，肝臟和脾臟中持續(xù)存在數(shù)周放射性(Bennett等(1979)，Clin.Sci.(Lond.)57453-460)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括轉(zhuǎn)鐵蛋白剪切變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)鐵蛋白剪切變體可以是人轉(zhuǎn)鐵蛋白的剪切變體。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，人轉(zhuǎn)鐵蛋白剪切變體可以是Genbank登錄號(hào)AAA61140的蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括乳鐵蛋白的剪切變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，人血清乳鐵蛋白剪切變體可以是嗜中性粒細(xì)胞乳鐵蛋白的新剪切變體。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，嗜中性粒細(xì)胞乳鐵蛋白剪切變體可以是Genbank登錄號(hào)AAA59479的蛋白。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，嗜中性粒細(xì)胞乳鐵蛋白剪切變體可以包含如下氨基酸序列EDCIALKGEADA(SEQ ID NO4)，其包括新的剪切變異區(qū)域。
還可以用黑素轉(zhuǎn)鐵蛋白(melanotransferrin)(GenBank Acc.NM 013900，鼠黑素轉(zhuǎn)鐵蛋白)來制備融合物。黑素轉(zhuǎn)鐵蛋白是以高含量存在于惡性黑素瘤細(xì)胞中的糖基化蛋白質(zhì)，最早被命名為人黑素瘤抗體p97(Brown等1982，Nature，296171-173)。其與人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、人乳鐵蛋白和雞轉(zhuǎn)鐵蛋白具有很高的序列同一性(Brown等1982，Nature，296171-173；Rose等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1986，831261-1265)。但是，與這些蛋白不同，還沒有確定黑素轉(zhuǎn)鐵蛋白的細(xì)胞受體。黑素轉(zhuǎn)鐵蛋白可逆地(reversibly)結(jié)合鐵，并且以兩種形式存在，其中之一是通過糖基磷脂酰肌糖錨結(jié)合到細(xì)胞表面上，而另一種形式是可溶的，并且被活躍地分泌(Baker等，1992，F(xiàn)EBS Lett，298215-218；Alemany等，1993，J.Cell Sci.，1041155-1162；Food等，1994，J.Biol.Chem.2747011-7017)。
被修飾的Tf融合物可以用任何Tf蛋白、片段、結(jié)構(gòu)域或遺傳工程化結(jié)構(gòu)域來制備。例如，融合蛋白可以用全長(zhǎng)Tf序列來制備，含有或不含天然Tf信號(hào)序列。轉(zhuǎn)移體還可以用單一的Tf結(jié)構(gòu)域來制備，例如各個(gè)N或C結(jié)構(gòu)域。還可以用雙Tf結(jié)構(gòu)域，例如雙N末端結(jié)構(gòu)域或雙C末端結(jié)構(gòu)域來制備轉(zhuǎn)移體。在一些實(shí)施方案中，可以制備治療性蛋白質(zhì)融合到單一的C末端結(jié)構(gòu)域上的融合物，其中C末端結(jié)構(gòu)域被改變來減少、抑制或防止糖基化。在其它實(shí)施方案中，由于Tf糖基化位點(diǎn)存在于其本身的C末端結(jié)構(gòu)域和N末端結(jié)構(gòu)域上，采用單一的N末端結(jié)構(gòu)域是有利的。優(yōu)選實(shí)施方案是具有單一N末端結(jié)構(gòu)域的Tf融合蛋白，以高水平被表達(dá)。
如在此所用，C末端結(jié)構(gòu)域或被修飾來作為N末端樣結(jié)構(gòu)域的圓形突出部分被修飾，具有實(shí)質(zhì)上類似于天然的或野生型的N末端結(jié)構(gòu)域或圓形突出部分的糖基化模式或鐵結(jié)合特性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，C末端結(jié)構(gòu)域或圓形突出部分被修飾，使得其未被糖基化，并且通過相關(guān)C末端結(jié)構(gòu)域或氨基酸取代存在于天然的或野生型的N末端結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)區(qū)域或位點(diǎn)上的那些氨基酸，而不結(jié)合鐵。
如在此所用，包含“兩個(gè)N末端結(jié)構(gòu)域或圓形突出部分的Tf部分包括Tf分子，Tf分子被修飾來用天然或野生型的N末端結(jié)構(gòu)域或圓形突出部分或被修飾的N結(jié)構(gòu)域或圓形突出部分來替換天然的C末端結(jié)構(gòu)域或圓形突出部分，或者含有被修飾來實(shí)質(zhì)上類似于野生型或被修飾的N結(jié)構(gòu)域起作用的C末端結(jié)構(gòu)域。參見美國在先專利申請(qǐng)60/406,977，在此完全引入作為參考。
通過重疊兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(Swiss PDB Viewer 3.7b2，Iterative Magic Fit)或者通過直接氨基酸比對(duì)(ClustalW multiple alignment)來分析兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域相互偏離。氨基酸比對(duì)表明兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間具有42％同一性和59％相似性。但是，由于結(jié)構(gòu)相當(dāng)，約80％的N末端結(jié)構(gòu)域與C末端結(jié)構(gòu)域匹配。與N末端結(jié)構(gòu)域相比，C末端結(jié)構(gòu)域還具有幾個(gè)額外的二硫堿。
N末端和C末端結(jié)構(gòu)域的分子模型比對(duì)顯示如下結(jié)構(gòu)等同物。

兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的二硫鍵的排列如下


在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括至少兩個(gè)轉(zhuǎn)鐵蛋白的N末端圓形突出部分。在還有一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括至少兩個(gè)轉(zhuǎn)鐵蛋白的N末端圓形突出部分，該轉(zhuǎn)鐵蛋白來源于人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括、包含或由至少兩個(gè)轉(zhuǎn)鐵蛋白的N末端圓形突出部分組成，該轉(zhuǎn)鐵蛋白在至少一個(gè)選自SEQ IDNO3上的Asp63、Gly65、Tyr95、Tyr188和His249的氨基酸殘基上具有突變。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，被修飾的轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括在SEQ IDNO3的Lys206或His207上具有突變的重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白N末端圓形突出部分突變體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括、包含或由至少兩個(gè)轉(zhuǎn)鐵蛋白的C末端圓形突出部分組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括至少兩個(gè)來源于人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的C末端圓形突出部分。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，C末端圓形突出部分在至少SEQ ID NO3的Asn413和Asn611之一上還包括一個(gè)突變，使得不能糖基化。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括至少兩個(gè)轉(zhuǎn)鐵蛋白的C末端圓形突出部分，該轉(zhuǎn)鐵蛋白在至少一個(gè)選自SEQ ID NO3上的Asp392、Tyr426、Tyr514、Tyr517和His585的氨基酸殘基上具有突變，其中該突變體保留結(jié)合金屬的能力。在一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括至少兩個(gè)轉(zhuǎn)鐵蛋白的C末端圓形突出部分，該轉(zhuǎn)鐵蛋白在至少一個(gè)選自SEQ ID NO3上的Tyr426、Tyr514、Tyr517和His585的氨基酸殘基上具有突變，其中該突變體保留結(jié)合金屬的能力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括至少兩個(gè)轉(zhuǎn)鐵蛋白的C末端圓形突出部分，該轉(zhuǎn)鐵蛋白在至少一個(gè)選自SEQ ID NO3上的Asp392、Tyr426、Tyr517和His585的氨基酸殘基上具有突變，其中該突變體不具有結(jié)合金屬離子的能力，并且實(shí)質(zhì)上如同N末端結(jié)構(gòu)域那樣起作用。
在一些實(shí)施方案中，Tf或Tf部分將具有足夠的長(zhǎng)度，以相對(duì)于處于未被融合狀態(tài)下的抗體可變區(qū)的體內(nèi)循環(huán)半衰期、血清穩(wěn)定性、體外溶解穩(wěn)定性或生物利用度，提高抗體可變區(qū)的體內(nèi)循環(huán)半衰期、血清穩(wěn)定性、體外溶解穩(wěn)定性或生物利用度。穩(wěn)定性、血清半衰期或生物利用度方面的提高可以比未被融合的抗體可變區(qū)約高30％、50％、70％、80％、90％或更高。在某些情況下，包含被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的轉(zhuǎn)移體具有約10-20天或更長(zhǎng)，約12-18天或約14-17天的血清半衰期。
當(dāng)Tf的C末端結(jié)構(gòu)域是轉(zhuǎn)移體的一部分時(shí)，兩個(gè)對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO3的N413和N611的氨基酸殘基的N聯(lián)糖基化位點(diǎn)被突變，在酵母系統(tǒng)中表達(dá)，以防止糖基化或超甘露糖基化，并延長(zhǎng)融合蛋白和/或抗體可變區(qū)(用于制備唾液酸(asialo)-或有時(shí)為單唾液酸(monosialo)-Tf或雙唾液酸(disialo)-Tf)的血清半衰期。除了對(duì)應(yīng)于N413和N611的Tf氨基酸，突變可以在N-X-S/T糖基化位點(diǎn)內(nèi)的鄰近殘基上，以防止或?qū)嵸|(zhì)上減少糖基化。參見Funk等的美國專利5,986,067。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)，在Pichia pastoris中表達(dá)的Tf的N末端結(jié)構(gòu)域與單一的己糖在S32上發(fā)生O-聯(lián)糖基化，也在S32上進(jìn)行突變或修飾來防止這種糖基化。此外，抗原采用在PMT基因在進(jìn)行突變來降低或消除酵母宿主細(xì)胞中的O聯(lián)糖基化。
因而，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體包括被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子，其中該轉(zhuǎn)鐵蛋白的糖基化減少，包括但是不限于唾液酸-單唾液酸-和雙唾液酸-形式的Tf。在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括重組的轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體，其被突變來防止糖基化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括完全被糖基化的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括被突變來防止糖基化的重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白，其中至少SEQ ID NO3的Asn413和Asn611之一被突變成不能進(jìn)行糖基化的氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括被突變來防止或?qū)嵸|(zhì)上減少糖基化的重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白，其中在N-X-S/T糖基化位點(diǎn)中的鄰近殘基進(jìn)行突變。而且，可以通過突變絲氨酸或蘇氨酸殘基來減少或防止糖基化。此外，已知將X改變?yōu)楦彼峥梢砸种铺腔?br> 如下文更加詳細(xì)的討論，本發(fā)明的被修飾的Tf融合蛋白，優(yōu)選轉(zhuǎn)移體還可以被改造，以不結(jié)合鐵和/或不結(jié)合Tf受體。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，保留鐵結(jié)合的能力，并且Tf結(jié)合鐵的能力被用于將治療性蛋白質(zhì)或肽呈遞到細(xì)胞的內(nèi)部，跨越上皮或內(nèi)皮細(xì)胞膜和/或跨越BBB。這些結(jié)合鐵和/或Tf受體的轉(zhuǎn)移體通常被改造來減少或防止糖基化，以延長(zhǎng)治療性蛋白質(zhì)的血清半衰期。當(dāng)攜帶鐵時(shí)，單獨(dú)的N末端結(jié)構(gòu)域不會(huì)結(jié)合到TfR上，并且結(jié)合鐵的C末端結(jié)構(gòu)域?qū)⒔Y(jié)合TfR，但是不與完整分子具有相同的親合性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白優(yōu)選轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括具有突變的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體，其中該突變體未保留結(jié)合金屬離子的能力。在一個(gè)可替代實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括具有突變的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體，其中該突變體對(duì)金屬離子的結(jié)合親合力比野生型血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的低。在一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括具有突變的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體，其中該突變體具有比野生型血清轉(zhuǎn)鐵蛋白更強(qiáng)的對(duì)金屬離子的結(jié)合親合力。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括具有突變的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體，其中該突變體未保留結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的能力。在一個(gè)可替代實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括具有突變的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體，其中該突變體對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的結(jié)合親合力比野生型血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的低。在一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括具有突變的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體，其中該突變體具有比野生型血清轉(zhuǎn)鐵蛋白更強(qiáng)的對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的結(jié)合親合力。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括具有突變的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體，其中該突變體未保留結(jié)合碳酸鹽離子的能力。在一個(gè)可替代實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括具有突變的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體，其中該突變體對(duì)碳酸鹽離子的結(jié)合親合力比野生型血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的低。在一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括具有突變的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體，其中該突變體具有比野生型血清轉(zhuǎn)鐵蛋白更強(qiáng)的對(duì)碳酸鹽離子的結(jié)合親合力。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體，該突變體在選自SEQ ID NO3的Asp63、Gly65、Tyr95、Tyr188、His249、Asp392、Tyr426、Tyr514、Tyr517和His585的至少一個(gè)氨基酸殘基上具有突變，其中該突變體保留結(jié)合金屬離子的能力。在一個(gè)可替代實(shí)施方案中，重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體在選自SEQ ID NO3的Asp63、Gly65、Tyr95、Tyr188、His249、Asp392、Tyr426、Tyr514、Tyr517和His585的至少一個(gè)氨基酸殘基上具有突變，其中該突變體結(jié)合金屬離子的能力降低。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體在選自SEQ ID NO3的Asp63、Gly65、Tyr95、Tyr188、His249、Asp392、Tyr426、Tyr517和His585的至少一個(gè)氨基酸殘基上具有突變，其中該突變體未保留結(jié)合金屬離子的能力。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括在SEQ ID NO3的Lys206或His207上具有突變的重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體，其中該突變體對(duì)金屬離子具有比野生型人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白(參見美國專利5,986,067，其在此被全文引入作為參考)更強(qiáng)的結(jié)合親合性。在可選擇的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括在SEQ ID NO3的Lys206或His207上具有突變的重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體，其中該突變體對(duì)金屬離子具有比野生型人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白更弱的結(jié)合親合性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分包括在SEQ ID NO3的Lys206或His207上具有突變的重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體，其中該突變體不結(jié)合金屬離子。
任何可獲得的技術(shù)被用于制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體，包括但是不限于通常可以獲得的分子技術(shù)，例如，那些公開在Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版，冷泉巷實(shí)驗(yàn)室出版社，1989中的技術(shù)。當(dāng)采用本領(lǐng)域熟知的用于位點(diǎn)特異性誘變的技術(shù)進(jìn)行核苷酸取代時(shí)，所編碼的氨基酸的變化優(yōu)選為次要性質(zhì)(minor nature)，也就是說，保守性氨基酸取代，雖然也包括非保守性取代，特別是在轉(zhuǎn)移體的被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分時(shí)，例如具有糖基化減少、鐵結(jié)合下降等的被修飾轉(zhuǎn)移體。特別可以預(yù)期的是氨基酸取代、小片段缺失或插入，通常為1-約30個(gè)氨基酸；轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)構(gòu)域之間的插入；小的氨基或羧基末端的突出端(extension)，例如氨基末端的甲硫氨酸殘基，或者在轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)構(gòu)域之間的或者連接轉(zhuǎn)鐵蛋白與治療性蛋白或肽優(yōu)選抗體可變區(qū)的少于50，40，30，20或10個(gè)殘基的小接頭肽；或者便于純化的小突出端，例如多聚組氨酸序列、抗原性表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
保守性氨基酸取代的例子為在相同組內(nèi)進(jìn)行的取代，例如在堿性氨基酸(例如精氨酸、賴氨酸、組氨酸)，酸性氨基酸(例如谷氨酸和天冬氨酸)，極性氨基酸(例如谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水性氨基酸(例如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)，芳香氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)的組內(nèi)。
非保守性取代包括用一組氨基酸取代另一組氨基酸。例如，非保守性氨基酸取代將包括用極性氨基酸取代疏水性氨基酸。對(duì)于核苷酸取代的一般描述參見，例如Ford等(1991)，Prot.Exp.Pur.295-107。非保守性取代、缺失和插入對(duì)于制備本發(fā)明的Tf融合蛋白優(yōu)選為轉(zhuǎn)移體是特別有用的，該Tf融合蛋白不或減少與鐵的結(jié)合，不或減少與Tf受體的結(jié)合和/或不或減少糖基化。
在本發(fā)明的多肽和蛋白質(zhì)中，如下體系被用于命名按照如下的常規(guī)列表的氨基酸氨基酸列表

可以通過突變來減少或破壞鐵結(jié)合和/或受體結(jié)合，包括缺失、取代或插入對(duì)應(yīng)于Tf的N末端結(jié)構(gòu)域殘基Asp63、Tyr95、Tyr 188、His249和/或C末端結(jié)構(gòu)域殘基Asp 392、Tyr 426、Tyr 514和/或SEQ ID NO3的His 585的一個(gè)或多個(gè)的氨基酸殘基。鐵結(jié)合還受到對(duì)氨基酸SEQ ID NO3的Lys206、His207或Arg632進(jìn)行突變的影響。碳酸鹽結(jié)合可能通過突變而被減少或破壞，包括刪除、取代或插入對(duì)應(yīng)于Tf的N末端結(jié)構(gòu)域殘基Thr120、Arg 124、Ala 126、Gly 127和/或C末端結(jié)構(gòu)域殘基Thr 452、Arg 456、Ala 458和/或SEQ ID NO3的Gly 459的一個(gè)或多個(gè)的氨基酸殘基。碳酸鹽結(jié)合的減少或破壞會(huì)對(duì)鐵和/或受體的結(jié)合產(chǎn)生不利影響。
與Tf受體的結(jié)合可能通過突變被降低或破壞，包括刪除、取代或插入對(duì)應(yīng)于上述對(duì)于鐵結(jié)合的Tf的N末端結(jié)構(gòu)域殘基的一個(gè)或多個(gè)的氨基酸殘基。
如上所討論，可以通過突變來減少或防止糖基化，包括對(duì)對(duì)應(yīng)于圍繞對(duì)應(yīng)于C末端結(jié)構(gòu)域殘基N413和/或N611的N-X-S/T位點(diǎn)的Tf的C末端結(jié)構(gòu)域殘基的一個(gè)或多個(gè)的氨基酸殘基(參見美國專利5,986,067)進(jìn)行刪除、取代或插入。例如，N413和/或N611被突變?yōu)镚lu殘基。
在未對(duì)本發(fā)明的Tf融合蛋白優(yōu)選轉(zhuǎn)移體進(jìn)行被修飾來防止糖基化、鐵結(jié)合、碳酸鹽結(jié)合和/或受體結(jié)合的情況下，糖基化、鐵和/或碳酸鹽離子可能從融合蛋白上被剝離或裂解。例如，可獲得的去糖基化酶被用于從融合蛋白上斷裂糖基化殘基，特別是附著到Tf部分上的糖殘基，缺乏糖基化酶的酵母可以被用于防止糖基化和/或在存在能夠防止糖基化的試劑例如衣霉素下培養(yǎng)重組細(xì)胞。
通過使用去糖基化酶處理融合蛋白，酶促減少或完全去除融合蛋白上的糖類。去糖基化酶在本領(lǐng)域是熟知的。去糖基化酶的例子包括但是不限于半乳糖苷酶、PNGase A、PNGase F、葡萄糖苷酶、甘露糖苷酶、巖藻糖苷酶和Endo H去糖基化酶。
可以對(duì)Tf進(jìn)行其它突變來改變Tf的三維結(jié)構(gòu)，例如修飾鉸鏈區(qū)以防止鐵結(jié)合和Tf受體識(shí)別所需的構(gòu)象發(fā)生變化。例如，可以在N末端結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基94-96、245-247和/或316-318以及C末端結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基425-427、581-582和/或652-658上或者其周圍進(jìn)行突變。此外，可以在這些位點(diǎn)的側(cè)翼區(qū)或其周圍進(jìn)行突變來改變Tf結(jié)構(gòu)和功能。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，轉(zhuǎn)移體可以作為載體蛋白，以延長(zhǎng)治療性蛋白質(zhì)的半衰期或生物利用度，以及在有些情況下，將抗體可變區(qū)呈遞到細(xì)胞內(nèi)部和/或跨過血腦屏障。在一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體包括被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子，其中轉(zhuǎn)鐵蛋白未保留跨過血腦屏障的能力。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體包括被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子，其中轉(zhuǎn)鐵蛋白分子保留結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和將抗體可變區(qū)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)部的能力。在可替代的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體包括被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子，其中轉(zhuǎn)鐵蛋白分子未保留結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和將抗體可變區(qū)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)部的能力。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體包括被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子，其中該轉(zhuǎn)鐵蛋白分子保留結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和將抗體可變區(qū)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)部的能力，但不保留跨過血腦屏障的能力。在可替代的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體包括被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子，其中該轉(zhuǎn)鐵蛋白分子保留跨過血腦屏障的能力，但是未保留結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和將抗體可變區(qū)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)部的能力。
被修飾的基于轉(zhuǎn)鐵蛋白的轉(zhuǎn)移體本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體融合蛋白含有被連接到Tf蛋白質(zhì)的N末端和/或C末端的一個(gè)或多個(gè)拷貝的抗體可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，抗體可變區(qū)被連接到Tf蛋白質(zhì)的N末端和C末端，而且該融合蛋白可以在Tf的一端或兩端含有抗體可變區(qū)的一個(gè)或多個(gè)等價(jià)物。在其它實(shí)施方案中，抗體可變區(qū)被插入到已知的Tf蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中，例如，插入到Tf的一個(gè)或多個(gè)環(huán)中(參見Ali等(1999)J.Biol.Chem.274(34)24066-24073)。在其它實(shí)施方案中，抗體可變區(qū)被插入到Tf的N末端和C末端結(jié)構(gòu)域之間。
一般地，本發(fā)明的轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白優(yōu)選轉(zhuǎn)移體，可以具有一個(gè)被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白來源的區(qū)域和一個(gè)抗體可變區(qū)。但是，各個(gè)蛋白的多個(gè)區(qū)域可以被用于制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白。類似地，不只一種抗體可變區(qū)被用于制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白，從而生成多功能的被修飾Tf融合蛋白。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體含有被融合到轉(zhuǎn)鐵蛋白分子或其部分上的抗體可變區(qū)或其部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體含有被融合到轉(zhuǎn)鐵蛋白分子的N末端上的抗體可變區(qū)。在可替代的實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體含有被融合到轉(zhuǎn)鐵蛋白分子C末端上的抗體可變區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體含有被融合到抗體可變區(qū)的N末端上的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子。在可替代的實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體含有被融合到抗體可變區(qū)的C末端上的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子。
本發(fā)明還提供含有被融合到被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子或其部分上的抗體可變區(qū)或其部分的轉(zhuǎn)移體。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體含有被融合到被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的N末端和C末端上的抗體可變區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，被融合在N末端和C末端上的抗體可變區(qū)結(jié)合相同的抗原。此外，結(jié)合相同抗原的抗體可變區(qū)可以來源于不同抗體，從而結(jié)合相同靶點(diǎn)上的不同表位。在可替代實(shí)施方案中，被融合在N末端和C末端上的抗體可變區(qū)結(jié)合不同抗原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，被融合在N和C末端上的抗體可變區(qū)結(jié)合不同抗原，被用于激活兩種不同細(xì)胞，治療或預(yù)防疾病、紊亂或癥狀。在另一個(gè)實(shí)施方案中，被融合到N末端和C末端上的抗體可變區(qū)結(jié)合不同抗原，用于連接兩種不同抗原，治療或預(yù)防本領(lǐng)域已知的通常在患者中共同發(fā)生的疾病、紊亂或癥狀。
此外，還可以通過將目標(biāo)抗體可變區(qū)(例如結(jié)合治療性蛋白質(zhì)或肽，或其片段或變體的單鏈抗體)插入到被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的內(nèi)部區(qū)域中來制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白。被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的內(nèi)部區(qū)域包括，但是不限于，環(huán)區(qū)域鐵結(jié)合位點(diǎn)、鉸鏈區(qū)、碳酸氫鹽結(jié)合位點(diǎn)或受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
在被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子的蛋白質(zhì)序列中，存在大量環(huán)或轉(zhuǎn)角(turns)，它們通過二硫鍵來固定。這些環(huán)可用于插入或內(nèi)部融合特別是那些需要二級(jí)結(jié)構(gòu)來起作用的治療活性肽優(yōu)選為抗體可變區(qū)，或者治療性蛋白質(zhì)優(yōu)選抗體可變區(qū)，生成具有特定生物學(xué)活性的被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子。
當(dāng)抗體可變區(qū)，優(yōu)選CDRs被插入或置換Tf分子的至少一個(gè)環(huán)時(shí)，除了Tf的其它區(qū)域，可以在任何一個(gè)外露表面環(huán)區(qū)域內(nèi)進(jìn)行插入。例如，可以在包含Tf氨基酸32-33、74-75、 256-257、279-280和288-289的環(huán)內(nèi)進(jìn)行插入(Ali等，同上文)(參見附圖3)。如先前所描述，還可以在Tf的其它區(qū)域進(jìn)行插入，例如鐵和碳酸鹽結(jié)合的位點(diǎn)、鉸鏈區(qū)和下文更詳細(xì)描述的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。適合于修飾/替換來插入蛋白質(zhì)或肽的Tf蛋白質(zhì)序列中的環(huán)還可以被用于開發(fā)隨機(jī)肽插入物的篩選庫。在被克隆到Tf結(jié)構(gòu)域和/或融合到Tf末端之前，任何方法可以被用于制備生成肽文庫的核酸插入物，包括可以獲得的噬菌體和細(xì)菌展示系統(tǒng)(display systems)。
Tf的N-末端是游離的，并且朝向分子本體的外方(away from)。因此，蛋白質(zhì)或肽在N末端融合是優(yōu)選的實(shí)施方案。這種融合可能包括接頭區(qū)，例如但是不限于多聚甘氨酸序列，將Tf與抗體可變區(qū)分開。注意接頭序列之間的連接、選擇先導(dǎo)序列以及通過密碼子加工/優(yōu)化mRNA結(jié)構(gòu)(主要的莖環(huán)不會(huì)抑制核糖體前進(jìn))，將會(huì)提高分泌，并且容易采用標(biāo)準(zhǔn)的重組蛋白質(zhì)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。
Tf的C末端似乎被C末端的6個(gè)氨基酸的二硫鍵隱藏和保護(hù)。在人Tf中，C末端氨基酸是脯氨酸，按照其朝向方式，可以是朝向融合物之外或者朝向分子本體內(nèi)。C末端的接頭或間隔部分可以被用于本發(fā)明的一些實(shí)施方案中。N末端附近也有脯氨酸。在本發(fā)明的一個(gè)方面，N和/或C末端的脯氨酸可以被替換掉。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，C末端的二硫鍵可以被去除來解放(untether)C末端。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，具有抗原結(jié)合特性的肽被插入到轉(zhuǎn)鐵蛋白中，生成轉(zhuǎn)移體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，任何轉(zhuǎn)移體可以含有一種使轉(zhuǎn)移體成為免疫反應(yīng)靶的免疫原性肽。這種轉(zhuǎn)移體與在結(jié)合抗原后起動(dòng)免疫反應(yīng)的常規(guī)抗體類似地起作用。
在還有其它的實(shí)施方案中，小分子的治療劑與鐵復(fù)合，并裝載到被修飾的Tf蛋白質(zhì)融合物，被呈遞到細(xì)胞內(nèi)以及跨過BBB。添加引導(dǎo)肽或者例如單鏈抗體(SCA)，用于將有效負(fù)載(payload)靶向特定細(xì)胞類型，例如癌細(xì)胞。
核酸本發(fā)明還提供編碼包含被共價(jià)地連接或結(jié)合到治療性蛋白質(zhì)，優(yōu)選抗體可變區(qū)上的轉(zhuǎn)鐵蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白部分的轉(zhuǎn)移體的核酸分子。如下文更加詳細(xì)的討論，任何抗體可變區(qū)可以被使用。融合蛋白還可以包含接頭區(qū)，例如少于約50個(gè)、40個(gè)、30個(gè)、20個(gè)或10個(gè)氨基酸殘基的接頭。該接頭被共價(jià)地連接到轉(zhuǎn)鐵蛋白或其部分與治療性蛋白質(zhì)，優(yōu)選抗體可變區(qū)之間。本發(fā)明的核酸分子被純化或未被純化。
用于復(fù)制核酸分子和表達(dá)被編碼的轉(zhuǎn)移體的宿主細(xì)胞和載體也被提供。任何載體或宿主細(xì)胞可以被使用，無論是原核或真核的細(xì)胞，但是真核表達(dá)系統(tǒng)，特別是酵母表達(dá)系統(tǒng)是優(yōu)選的。許多用于該目的載體和宿主細(xì)胞在本領(lǐng)域是已知的。選擇用于期望應(yīng)用的恰當(dāng)表達(dá)系統(tǒng)完全在本領(lǐng)域的能力內(nèi)。
編碼轉(zhuǎn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白部分和目標(biāo)抗體可變區(qū)的DNA序列，可以從本領(lǐng)域知曉的各種基因組或cDNA文庫中克隆得到。采用探針方法分離這種DNA序列的技術(shù)是常規(guī)技術(shù)，是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。用于分離這種DNA序列的探針可以基于公開的DNA或蛋白質(zhì)序列(參見，例如，Baldwin，G.S.(1993)來自不同物種的轉(zhuǎn)鐵蛋白的比較.Comp.Biochem.Physiol.106B/1203-218及其所引用的全部參考文獻(xiàn)，在此全部引入作為參考)?？商娲?，可以采用Mullis等(美國專利4,683,195)和Mullis(美國專利4,683,202)描述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法，在此引入作為參考。用于分離這種DNA序列的文庫的選擇和探針的選擇在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員水平內(nèi)。
如本領(lǐng)域所知，兩條多核苷酸或多肽之間的“相似性”，是通過將一條多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列及其保守性核苷酸或氨基酸取代物與第二條多核苷酸或多肽的序列比較來確定。如本領(lǐng)域所知，“同一性”是指兩條多肽或兩條多核苷酸序列之間的序列相關(guān)程度，通過鑒定這種序列兩條鏈之間的匹配程度來確定。同一性和相似性都很容易計(jì)算(ComputationalMolecular Biology，Lesk，A.M.，編輯，Oxford University Press，New York，1988；BiocomputingInformatics and Genome Projects，Smith，D.W.，編輯，AcademicPress，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，PartI，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，編輯，Humana Press，New Jersey，1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，編輯，M Stockton Press，New York，1991)。
雖然存在大量測(cè)定兩條多肽或多核苷酸序列之間的同一性和相似性的方法，術(shù)語“同一性”和“相似性”對(duì)于技術(shù)人員來說是熟知的(SequenceAnalysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，等，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，481073(1988)。通常用于確定兩條序列之間的同一性或相似性的方法包括，但是不限于那些被公開在Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop，編輯，Academic Press，San Diego，1994，和Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.481073(1988)的方法。
確定同一性的優(yōu)選方法被設(shè)計(jì)來在兩條被檢測(cè)的序列之間產(chǎn)生最大匹配。確定同一性和相似性的方法被編寫在計(jì)算機(jī)程序中。確定兩條序列之間的同一性和相似性的優(yōu)選的計(jì)算機(jī)程序方法包括，但是不限于，GCG程序軟件包(Devereux，等，Nucl.Acid Res.12(1)387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，等，J.Mol.Biol.215403(1990))。上面所提及的相似性或同一性的大小被確定為兩條序列之間的相同程度，通常表示第一條序列衍生于第二條序列。兩條核酸序列之間的相同程度可以通過本領(lǐng)域知曉的計(jì)算機(jī)程序來確定，例如在GCG程序軟件包中提供的GAP(Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48443-453(1970))。為了確定本發(fā)明的兩條核酸序列之間的相同程度，使用GAP，具有如下設(shè)定5.0的GAP產(chǎn)生(creation)罰分和0.3的GAP延長(zhǎng)(extension)罰分。
密碼子優(yōu)化遺傳密碼的簡(jiǎn)并性使得可以改變轉(zhuǎn)鐵蛋白和/或目標(biāo)的治療性蛋白質(zhì)優(yōu)選抗體可變區(qū)的核苷酸序列，而仍然生成具有與天然DNA序列編碼的多肽相同的氨基酸序列的多肽。該操作稱作“密碼子優(yōu)化”(被描述在美國專利5,547,871中，在此全文引入作為參考)，提供設(shè)計(jì)這種被改變的DNA序列的方法。密碼子優(yōu)化的基因的設(shè)計(jì)應(yīng)當(dāng)考慮各種因素，包括生物體中密碼子利用的頻率、最接近的鄰近頻率、RNA穩(wěn)定性、二級(jí)結(jié)構(gòu)形成的可能性、合成路徑以及確定的將會(huì)對(duì)該基因進(jìn)行的DNA操作。特別地，當(dāng)采用酵母表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，采用可獲得的方法來用那些最容易被酵母識(shí)別的密碼子替換編碼特定融合蛋白的密碼子。
遺傳密碼的簡(jiǎn)并性使得相同的氨基酸序列可以用多種不同方式來編碼和翻譯。例如，亮氨酸、絲氨酸和精氨酸分別由六種不同的密碼子編碼，而纈氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和甘氨酸分別由四種不同密碼子編碼。但是，在真核細(xì)胞和原核細(xì)胞中，這種同義密碼子的使用頻率在基因組之間是不同的。例如，同義密碼子的選擇模式在哺乳動(dòng)物中十分類似，而在進(jìn)化距離遠(yuǎn)的生物體例如酵母(例如釀酒酵母)、細(xì)菌(例如E.coli)和昆蟲(例如D.Melanogaster)中，則表現(xiàn)出明顯不同的遺傳密碼利用頻率模式(Grantham，R.，等，Nucl.Acid Res.，8，49-62(1980)；Grantham，R.，等，Nucl.Acid Res.，9，43-74(1981)；Maroyama，T.，等，Nucl.Acid Res.，14，151-197(1986)；Aota，S.等，Nucl.Acid Res.，16，315-402(1988)；Wada，K.等，Nucl.Acid Res.，19Supp.，1981-1985(1991)；Kurland，C.G.，F(xiàn)EBS Lett.，285，165-169(1991))。密碼子選擇模式的這些差別似乎通過調(diào)節(jié)肽伸長(zhǎng)比例來影響各個(gè)基因的整體表達(dá)水平。(Kurland，C.G.，F(xiàn)EBS Lett.，285，165-169(1991)；Pedersen，S.，EMBO J.，3，2895-2898(1984)；Sorensen，M.A.，J.Mol.Biol.，207，365-377(1989)；Randall，L.L.等，Eur.J.Biochem.，107，375-379(1980)；Curran，J.F.和Yarus，M.，J.Mol.Biol.，209，65-77(1989)；Varenne，S.等，J.Mol.Biol.，180，549-576(1984)，Varenne，S.等，J.Mol，Biol.，180，549-576(1984)；Garel，J.-P.，J.Theor.Biol.，43，211-225(1974)；Ikemura，T.，J.Mol.Biol.，146，1-21(1981)；Ikemura，T.，J.Mol.Biol.，151，389-409(1981))。
合成基因的優(yōu)選密碼子利用頻率應(yīng)當(dāng)反映來源于精確的(或者盡可能密切相關(guān))細(xì)胞/生物體的基因組的核基因的密碼子利用，該細(xì)胞/生物體將被用于重組蛋白的表達(dá)，特別是酵母屬的細(xì)胞/生物體。如上所討論，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在在此所描述的修飾之前或之后，人Tf序列被密碼子優(yōu)化以用于酵母表達(dá)，該序列可以是抗體可變區(qū)的核苷酸序列。
載體用于本發(fā)明的表達(dá)單位通常包含如下元件，以5′到3′方向被可操作地連接轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、分泌信號(hào)序列、被連接到編碼目標(biāo)的治療性蛋白質(zhì)或肽優(yōu)選抗體可變區(qū)的DNA序列上的編碼包含轉(zhuǎn)鐵蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白的部分的被修飾的Tf融合蛋白的DNA序列，以及轉(zhuǎn)錄終止子。如上所討論，被融合到Tf部分上或者被融合在Tf部分中的治療性蛋白質(zhì)或肽的任何排列可以被用于本發(fā)明的載體中。合適的啟動(dòng)子、信號(hào)序列和終止子的選擇，將通過所選擇的宿主細(xì)胞來確定，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯然的，將在下文中被更加清楚地討論。
用于本發(fā)明中的合適酵母載體被描述在美國專利6,291,212中，包括YRp7(Struhl等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 761035-1039，1978)、YEp13(Broach等，Gene 8121-133，1979)、pJDB249和pJDB219(Beggs，Nature 275104-108，1978)、pPPC0005、pSeCHSA、pScNHSA、pC4及其衍生物。有用的酵母質(zhì)粒載體還包括pRS403-406、pRS413-416和得自Stratagene CloningSystems，La Jolla，CA 92037，USA的畢赤氏酵母(Pichia)載體。質(zhì)粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406都是酵母整合型質(zhì)粒(YIps)并且結(jié)合了酵母可選擇標(biāo)記HIS3、TRPI、LEU2和URA3。質(zhì)粒pRS413-41.6是酵母中心粒質(zhì)粒(YCps)。
這種載體通常包括可選擇的標(biāo)記，可以是任意大量具有顯性表型的基因之一，由此，可以進(jìn)行表型分析來選擇轉(zhuǎn)化體。優(yōu)選的可選擇標(biāo)記是那些彌補(bǔ)宿主細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺陷的標(biāo)記，產(chǎn)生抗生素抗性或使細(xì)胞能夠利用特定的碳源，包括LEU2(Broach等ibid.)、URA3(Botstein等，Gene 817，1979)、HIS3(Struhl等，ibid.)或POTl(Kawasaki和Bell，EP171，142)。其它合適的選擇性標(biāo)記包括CAT基因，其賦予酵母細(xì)胞氯霉素抗性。用于酵母中的優(yōu)選啟動(dòng)子包括來自酵母糖分解基因的啟動(dòng)子(Hitzeman等，J Biol.Chem.22512073-12080，1980；Alber和Kawasaki，J.Mol.Appl.Genet.1419-434，1982；Kawasaki，美國專利4,599,311)或乙醇脫氫酶基因的啟動(dòng)子(Young等，載于Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals，Hollaender等，(編輯)，355，Plenum，紐約，1982；Ammerer，Meth.Enzymol.101192-201，1983)。從這一點(diǎn)看，特別優(yōu)選的啟動(dòng)子是TPI1啟動(dòng)子(Kawasaki，美國專利4,599,311)和ADH2-4C(美國專利6,291,212啟動(dòng)子(Russell等，Nature 304652-654，1983)。表達(dá)單位可能還包括轉(zhuǎn)錄終止子。優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄終止子為TPI1終止子(Alber和Kawasaki，ibid.)。其它優(yōu)選載體和優(yōu)選組分例如酵母表達(dá)系統(tǒng)中的啟動(dòng)子和終止子被公開在歐洲專利EP 0258067、EP 0286424、EP0317254、EP0387319、EP 0386222、EP 0424117、EP 0431880和EP 1002095；歐洲專利申請(qǐng)公開EP 0828759、EP 0764209、EP 0749478和EP 0889949；PCT公開WO 00/44772和WO 94/04687；和美國專利5,739,007；5,637,504；5,302,697；5,260,202；5,667,986；5,728,553；5,783,423；5,965,386；6150,133；6,379,924和5,714,377中，在此完全引入作為參考。
除了酵母，本發(fā)明的被修飾的融合蛋白可以在絲狀真菌中表達(dá)，例如，在曲霉菌菌株中。有用的啟動(dòng)子的例子包括那些來源于Aspergillus nidulans糖分解基因的啟動(dòng)子，例如adh3啟動(dòng)子(McKnight等，EMBO J.42093-2099，1985)和tpiA啟動(dòng)子。合適的終止子的例子為adh3終止子(McKnight等，ibid.)。利用這種元件的表達(dá)單位可以被克隆到能夠插入到例如曲霉菌的染色體DNA中的載體中。
用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體將包括能夠引導(dǎo)被修飾的Tf融合蛋白，優(yōu)選包含被修飾的Tf的轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。優(yōu)選啟動(dòng)子包括病毒啟動(dòng)子和細(xì)胞啟動(dòng)子。優(yōu)選的病毒啟動(dòng)子包括來自腺病毒2的主要晚期啟動(dòng)子(Kaufman和Sharp，Mol.Cell.Biol.21304-13199，1982)和SV40啟動(dòng)子(Subramani等，Mol.Cell.Biol.1854-864，1981)。優(yōu)選的細(xì)胞啟動(dòng)子包括小鼠金屬硫蛋白-1啟動(dòng)子(Palmiter等，Science 222809-814，1983)和小鼠Vκ(參見美國專利6,291,212)啟動(dòng)子(Grant等，Nuc.Acids Res.155496，1987)。特別優(yōu)選的啟動(dòng)子是小鼠VH(參見美國專利6,291,212)啟動(dòng)子(Loh等，ibid.)。這種表達(dá)載體還可以含有位于啟動(dòng)子下游和編碼轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白的DNA序列上游的一套R(shí)NA剪切位點(diǎn)。優(yōu)選的RNA剪切位點(diǎn)可以從腺病毒和/或免疫球蛋白基因中獲得。
在表達(dá)載體中還含有位于目標(biāo)編碼序列下游的聚腺苷酸信號(hào)。聚腺苷酸信號(hào)包括來自SV40的早期或晚期聚腺苷酸信號(hào)(Kaufman和Sharp，ibid.)，來自腺病毒5E1B區(qū)以及人生長(zhǎng)基因終止子的聚腺苷酸信號(hào)(DeNoto等，Nucl.Acid Res.93719-3730，1981)。特別優(yōu)選的聚腺苷酸信號(hào)為VH(參見美國專利6,291,212)基因終止子(Loh等，ibid.)。表達(dá)載體可以包括非編碼的病毒前導(dǎo)序列，例如腺病毒2的三聯(lián)前導(dǎo)序列，位于啟動(dòng)子和RNA剪切位點(diǎn)之間。優(yōu)選的載體還可以包括增強(qiáng)子序列，例如SV40增強(qiáng)子和小鼠μ(參見美國專利6,291,212)增強(qiáng)子(Gillies，Cell 33717-728，1983)。表達(dá)載體還可以包括編碼腺病毒VA RNA的序列。
轉(zhuǎn)化體用于轉(zhuǎn)化真菌的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，被描述在例如Beggs(ibid.)、Hinnen等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 751929-1933，1978)、Yelton等，(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 811740-1747，1984)和Russell(Nature 301167-169，1983)中。還可以使用將克隆DNA序列導(dǎo)入真菌細(xì)胞中的其它技術(shù)，例如電穿孔(Becker和Guarente，Methods in Enzymol.194182-187，1991)。宿主細(xì)胞的基因型通常具有遺傳缺陷，該缺陷由存在表達(dá)載體上的選擇標(biāo)記來彌補(bǔ)。選擇特定宿主和可選擇的標(biāo)記在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力之內(nèi)。
可以通過例如磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，將包含本發(fā)明的被修飾的Tf融合蛋白的克隆DNA序列導(dǎo)入到被培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中(Wigler等，Cell 14725，1978；Corsaro和Pearson，Somatic Cell Genetics 7603，1981；Graham和Van der Eb，Virology 52456，1973)。還可以采用將克隆DNA序列導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的其它技術(shù)，例如電穿孔(Neumann等，EMBO J.1841-845，1982)或脂轉(zhuǎn)染。為了鑒定已經(jīng)整合了克隆DNA的細(xì)胞，通常將可選擇標(biāo)記以及目標(biāo)基因或cDNA插入到細(xì)胞中。培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的優(yōu)選可選擇標(biāo)記包括賦予對(duì)藥物的抗性的基因，這些藥物例如新霉素、潮霉素和氨甲蝶呤。可選擇標(biāo)記可以是可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記。優(yōu)選的可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記為DHFR基因。特別優(yōu)選的可擴(kuò)增標(biāo)記為DHFRr(參見美國專利6,291,212)cDNA(Simonsen和Levinson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 802495-2499，1983)?？蛇x擇標(biāo)記在Thilly(Mammalian Cell Technology，Butterworth Publishers，Stoneham，Mass.)中被評(píng)述，并且選擇可選擇的標(biāo)記在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力內(nèi)。
宿主細(xì)胞本發(fā)明還包括被轉(zhuǎn)化來表達(dá)本發(fā)明的被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白的細(xì)胞，優(yōu)選為酵母細(xì)胞。除了被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞本身，本發(fā)明還包括這些細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)液中的培養(yǎng)物，優(yōu)選單克隆(純系同源的)培養(yǎng)物或者來源于單克隆培養(yǎng)物的培養(yǎng)物。如果多肽被分泌，則培養(yǎng)基中含有該多肽和細(xì)胞，或者細(xì)胞被過濾或離心掉，則不含細(xì)胞。
用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的宿主細(xì)胞包括真核細(xì)胞，有時(shí)為原核細(xì)胞，能夠用外源DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，并在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，例如被培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物、昆蟲、真菌、植物和細(xì)菌細(xì)胞。
真菌細(xì)胞，包括酵母類(例如酵母屬(Saccharomyces spp.)，裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces spp.)，畢赤氏酵母屬(Pichia spp.)可以被用作本發(fā)明中的宿主細(xì)胞。包括被期望用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明、作為表達(dá)本發(fā)明的轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白優(yōu)選轉(zhuǎn)移體的酵母的真菌的例子是畢氏酵母屬(其中的某些種類以前被分類為漢遜酵母屬(Hansenula))，酵母屬，克魯維酵母菌屬(Kluyvercmyces)，曲霉菌屬(Aspergillus)，念珠菌屬(Candida)，球擬酵母屬(Torulopsis)，孢圓酵母屬(Torulaspora)，裂殖酵母，固囊酵母屬(Citeromyces)，Pachysolen，接合酵母屬(Zygosaccharomyces)，德巴利酵母屬(Debaryomyces)，木霉屬(Trichoderma)，頭孢霉屬(Cephalosporium)，腐質(zhì)霉屬(Humicola)，毛霉菌屬(Mucor)，脈孢菌屬(Neurospora)，耶氏酵母屬(Yarrowia)，Metschunikowia，Rhodosporidium，擔(dān)子菌白冬孢酵母屬(Leucosporidium)，Botryoascus，鎖擲孢酵母屬(Sporidiobolus)，擬內(nèi)孢霉(Endomycopsis)等。酵母菌屬的例子為釀酒酵母、S.italicus和S.Rouxii?？唆斁S酵母菌屬的例子為K.fragilis、K.lactis和K.marxianus。合適的孢圓酵母屬種類為T.delbrueckii。畢赤氏酵母菌屬的例子為P.angusta(以前稱作H.polymorpha)、P.anomala(以前稱作H.anomala)和P.pastoris。
用于制備本發(fā)明的Tf融合蛋白優(yōu)選轉(zhuǎn)移體的特別有用的宿主細(xì)胞為甲基營(yíng)養(yǎng)Pichiapastoris(Steinlein等(1995)Protein Express.Purif6619-624)。自從Pichia pastoris的乙醇氧化酶啟動(dòng)子被分離和克隆以來，Pichia pastoris已經(jīng)被開發(fā)作為制備外源蛋白的重要宿主；其轉(zhuǎn)化體首次在1985年被報(bào)導(dǎo)。在缺乏葡萄糖時(shí)，P.pastoris能夠利用甲醇作為碳源。P.pastoris表達(dá)系統(tǒng)能夠利用甲醇誘導(dǎo)的乙醇氧化酶(AOX1)啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子控制編碼用于乙醇氧化酶的表達(dá)的基因，乙醇氧化酶催化甲醇代謝的第一個(gè)步驟。該啟動(dòng)子被表征，并且被插入到一系列P.pastoris表達(dá)載體中。由于在P.pastoris中生成的蛋白質(zhì)通常能夠正確地折疊，并被分泌到培養(yǎng)基中，遺傳工程改造的P.pastoris的發(fā)酵提供一種作為大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)良替代。大量蛋白質(zhì)已經(jīng)采用這種系統(tǒng)進(jìn)行制備，包括破傷風(fēng)毒素片段、Bordatella pertussis粘著素(pertactin)、人血清白蛋白、溶菌酶、干擾素α，以及糖基化和未糖基化的轉(zhuǎn)鐵蛋白。
釀酒酵母菌株是另一種優(yōu)選宿主。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用酵母細(xì)胞，或者特別是在糖蛋白的天冬酰胺偶聯(lián)的糖基化所需的基因中具有遺傳缺陷的釀酒酵母宿主細(xì)胞。具有這種缺陷的釀酒酵母宿主細(xì)胞通過常規(guī)的突變和選擇技術(shù)來制備，盡管許多可以獲得的酵母菌株已經(jīng)被修飾來防止或減少糖基化或超甘露糖基化。Ballou等(J.Biol.Chem.2555986-5991，1980)已經(jīng)描述了缺乏影響天冬酰胺偶聯(lián)糖基化的基因的甘露糖蛋白生物合成突變體的分離。Gentzsch和Tanner(Glycobiology 7481-486，1997)已經(jīng)描述了一個(gè)至少6個(gè)基因(PMT1-6)的家族，這些基因編碼負(fù)責(zé)酵母中的O-連糖基化的第一步的酶。缺乏這些基因中的一個(gè)或多個(gè)的突變體表現(xiàn)出O-連糖基化下降和/或O-連糖基化的特異性改變。
為了優(yōu)化異源蛋白的制備，優(yōu)選宿主菌株具有突變，例如釀酒酵母的pep4突變(Jones，Genetics 8523-33，1977)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解活性下降。對(duì)于制備大量本發(fā)明的Tf融合蛋白來說，在其它蛋白酶編碼區(qū)中具有突變的宿主菌株是特別有用的。
含有本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的宿主細(xì)胞在適當(dāng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。如在此所用，術(shù)語“適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)培養(yǎng)基”是指含有細(xì)胞生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基。細(xì)胞生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)包括碳源、氮源、必需氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和生長(zhǎng)因子。生長(zhǎng)培養(yǎng)基通常用于篩選含有DNA構(gòu)建體的細(xì)胞，通過例如藥物選擇或缺乏關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)缺乏通過DNA構(gòu)建體上的可選擇標(biāo)記來彌補(bǔ)，或者用DNA構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染。酵母細(xì)胞，例如，優(yōu)選在化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中含有碳源，例如蔗糖，非氨基酸的氮源，無機(jī)鹽，維生素和必需氨基酸添加劑。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選維持在大于2并小于8的pH下，優(yōu)選為pH5.5-6.5。維持穩(wěn)定的pH的方法包括進(jìn)行緩沖和持續(xù)的pH控制。優(yōu)選的緩沖試劑包括琥珀酸和Bis-Tris(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)。缺失天冬酰胺偶聯(lián)糖基化所需基因的酵母細(xì)胞優(yōu)選在含有滲透穩(wěn)定劑的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。優(yōu)選的滲透穩(wěn)定劑是被添加到培養(yǎng)基中的山梨醇，其濃度在0.1M和1.5M之間，優(yōu)選為0.5M或1.0M。
被培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞一般在可以購買得到的含血清或無血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。選擇適合于特定細(xì)胞系的培養(yǎng)基在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力內(nèi)。被轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間，通常為1-2天，并開始表達(dá)目標(biāo)DNA序列。然后進(jìn)行藥物選擇，選擇以穩(wěn)定的方式表達(dá)可選擇標(biāo)記的細(xì)胞的生長(zhǎng)。對(duì)于已經(jīng)用可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)染的細(xì)胞來說，可以逐步提高藥物濃度來選擇拷貝數(shù)增加的克隆序列，從而提高表達(dá)水平。
桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)也可以被用于制備本發(fā)明的被修飾Tf融合蛋白。BacPAKTM桿狀表達(dá)表達(dá)系統(tǒng)(BD Biosciences(Clontech))在昆蟲宿主細(xì)胞中高水平地表達(dá)重組蛋白。目標(biāo)基因被插入到轉(zhuǎn)化載體中，該載體與線性化的BacPAK6病毒DNA一起被共轉(zhuǎn)染到昆蟲宿主細(xì)胞中。BacPAK6DNA缺乏桿狀病毒基因組的關(guān)鍵部分。當(dāng)DNA與載體結(jié)合時(shí)，該關(guān)鍵元件被恢復(fù)，而目標(biāo)基因被轉(zhuǎn)移到桿狀病毒的基因組中。重組后，少數(shù)病毒斑被挑取和純化，驗(yàn)證重組表型。然后，新分離的重組病毒被擴(kuò)增，并用于感染昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物來制備大量的期望蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的Tf融合蛋白還可以用轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物來制備。例如，綿羊和山羊在其乳汁中生成治療性蛋白質(zhì)。煙草植物在其葉片中包括該蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物生產(chǎn)蛋白質(zhì)，都包括將編碼融合蛋白的新基因添加到生物體的基因組中。轉(zhuǎn)基因生物體不僅能夠生成新的蛋白質(zhì)，而且能夠?qū)⑦@種能力傳遞給其后代。
分泌信號(hào)序列術(shù)語“分泌信號(hào)序列”或者“信號(hào)序列”或者“分泌前導(dǎo)序列”可以被相互交換使用，被描述在美國專利6,291,212和美國專利5,547,871中，這兩個(gè)專利在此完全引入作為參考。分泌信號(hào)序列或信號(hào)序列或分泌前導(dǎo)序列編碼分泌肽。分泌肽是引導(dǎo)成熟多肽或蛋白質(zhì)從細(xì)胞中分泌出來的氨基酸序列。通常，分泌肽的特征在于疏水氨基酸核心，并且典型地(但是不是唯一地)存在于新合成的蛋白質(zhì)的氨基末端。在分泌過程中，分泌肽通常從成熟蛋白質(zhì)上被裂解下來。分泌肽可能含有加工位點(diǎn)，使得在經(jīng)過分泌路徑時(shí)，信號(hào)肽從產(chǎn)生蛋白質(zhì)上裂解下來。加工位點(diǎn)被編碼在信號(hào)肽中，或者例如通過誘變被添加到信號(hào)肽中。
分泌肽可以被用于引導(dǎo)本發(fā)明的被修飾Tf融合蛋白的分泌?？捎糜谂c其它分泌肽結(jié)合的一種這種分泌肽為α交配因子前導(dǎo)序列。分泌信號(hào)序列或信號(hào)序列或分泌前導(dǎo)序列是一系列復(fù)雜的翻譯后加工步驟所需的，這些步驟導(dǎo)致蛋白質(zhì)的分泌。如果存在完整的信號(hào)序列，被表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)入粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)腔，然后通過高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)到分泌小泡中，最后被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外。通常，信號(hào)序列緊跟在起始密碼子后面，并且編碼被分泌的蛋白質(zhì)的氨基末端的信號(hào)肽。在大多數(shù)情況下，信號(hào)序列被稱作信號(hào)肽酶的特定蛋白酶裂解掉。優(yōu)選的信號(hào)序列提高由病毒、哺乳動(dòng)物或酵母病毒載體表達(dá)的重組蛋白質(zhì)的加工和外排效率。在有些情況下，天然的Tf信號(hào)序列被用于表達(dá)和分泌本發(fā)明的融合蛋白。
接頭本發(fā)明的被修飾轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白的Tf部分和抗體可變區(qū)可以直接融合或者采用各種長(zhǎng)度的接頭肽來融合，以在被融合的蛋白質(zhì)之間產(chǎn)生更大的物理分離和更大的空間靈活性，從而最大化抗體可變區(qū)例如結(jié)合其關(guān)聯(lián)受體的可達(dá)性。接頭肽由柔韌的或剛性更大的氨基酸組成。例如，接頭例如但是不限于多聚甘氨酸序列。接頭可以少于約50個(gè)，40個(gè)，30個(gè)，20個(gè)或10個(gè)氨基酸殘基。接頭可以被共價(jià)地連接到轉(zhuǎn)鐵蛋白或其部分與抗體可變區(qū)之間。
接頭還可以用于連接抗體可變區(qū)。用于連接抗體可變區(qū)的合適的接頭是那些使抗體可變區(qū)折疊成三維結(jié)構(gòu)的接頭，使抗體可變區(qū)保持完整抗體的結(jié)合特異性。
轉(zhuǎn)移體的檢測(cè)生物活性的被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)移體的檢測(cè)分析包括Western轉(zhuǎn)移、蛋白質(zhì)印跡或菌落濾膜(colony filter)，以及檢測(cè)包含轉(zhuǎn)鐵蛋白和抗體可變區(qū)的融合蛋白的活性分析。Western轉(zhuǎn)移濾膜可以采用Towbin等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 764350-4354，1979)描述的方法來制備。簡(jiǎn)而言之，樣本在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。將凝膠中的蛋白質(zhì)通過電泳轉(zhuǎn)移到硝化纖維紙上。蛋白質(zhì)印跡濾膜通過用例如Minifold(Schleicher & Schuell，Keene，N.H.)將上清液樣本或濃縮物過濾在硝化纖維濾紙上來制備。菌落濾膜通過在硝化纖維素濾膜培養(yǎng)菌落來制備，該濾膜被鋪展在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)培養(yǎng)基上。在這種方法中，固體培養(yǎng)基是優(yōu)選的。細(xì)胞在濾膜上生長(zhǎng)至少12小時(shí)。用不會(huì)去除結(jié)合到濾膜上的蛋白質(zhì)的恰當(dāng)緩沖液來沖洗濾膜，去除細(xì)胞。優(yōu)選的緩沖液包含25mM Tris-堿，19mM甘氨酸，pH 8.3，20％甲醇。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白，優(yōu)選轉(zhuǎn)移體，用放射性同位素或者其它顯像劑標(biāo)記，用于體內(nèi)診斷目的。優(yōu)選的放射性同位素顯像劑包括碘-125和锝-99，锝-99是特別優(yōu)選的。用于制備蛋白質(zhì)表位偶聯(lián)物的方法在本領(lǐng)域是已知的，被描述在例如Eckelman等(美國專利4,652,440)，Parker等(WO 87/05030)和Wilber等(EP 203,764)中?？商娲?，轉(zhuǎn)移體被結(jié)合到自旋標(biāo)記物增強(qiáng)劑上，用于磁共振(MR)顯像。合適的自旋標(biāo)記物增強(qiáng)劑包括穩(wěn)定的、空間障礙的、自由基化合物，例如硝基氧。用于MR顯像標(biāo)記配體的方法被公開在，例如Coffman等(美國專利4,656,026)中。對(duì)于施用，被標(biāo)記的轉(zhuǎn)移體結(jié)合藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，例如無菌生理鹽水或無菌水。施用優(yōu)選通過快速注射方式(blolus injection)，優(yōu)選靜脈注射。
通過偶聯(lián)(即物理上連接)到可檢測(cè)的物質(zhì)上來方便本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體的檢測(cè)?？蓹z測(cè)的物質(zhì)的例子包括各種酶，輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性材料。合適的酶的例子包括辣根過氧化酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或者乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合物的例子包括鏈霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適的熒光材料的例子包括傘形酮(umbelliferone)、熒光素、熒光素異硫氰酸鹽、若丹明、二氯三連氮基胺(dichlorotriazinylamine)熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白(phycoerythrin)；發(fā)光材料的例子包括發(fā)光氨；生物發(fā)光材料的例子包括熒光素酶、蟲熒光素和發(fā)光蛋白質(zhì)，合適的放射性材料的例子包括125I、131I、35S或3H。
在一個(gè)實(shí)施方案中，分析本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體結(jié)合或與抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗原的能力，可以采用本領(lǐng)域知曉的各種免疫測(cè)定方法，包括但是不限于，采用例如放射性免疫測(cè)定、ELISA(酶鏈?zhǔn)矫庖呶辗治?、夾心式免疫測(cè)定、免疫放射分析、凝膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散分析、原位免疫分析(例如采用膠體金、酶或放射性同位素標(biāo)記)、western印跡、沉淀反應(yīng)、凝集分析(例如凝膠凝集分析)、補(bǔ)體結(jié)合分析、熒光免疫分析、蛋白A分析和免疫電泳分析等的競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性的分析體系。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過檢測(cè)轉(zhuǎn)移體上的標(biāo)記來檢測(cè)轉(zhuǎn)移體的結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過檢測(cè)與轉(zhuǎn)移體相互作用的第二抗體或試劑的結(jié)合來檢測(cè)轉(zhuǎn)移體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二抗體或試劑被標(biāo)記。已知在本領(lǐng)域有許多方法被用于檢測(cè)免疫測(cè)定中的結(jié)合，這些方法在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
轉(zhuǎn)移體的制備本發(fā)明還提供采用在此公開的核酸分子制備被修飾的融合蛋白，優(yōu)選包含被修飾的Tf的轉(zhuǎn)移體的方法?？偟膩碚f，重組形式的蛋白質(zhì)的制備通常包括如下步驟。
首先獲得編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體的核酸分子。然后優(yōu)選將核酸分子以可操作的連接與合適的控制序列連接在一起，如上所述，形成含有蛋白質(zhì)開放閱讀框的表達(dá)單位。用表達(dá)單位來轉(zhuǎn)化合適的宿主，在允許重組蛋白生成的條件下培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主?？蛇x擇地，從培養(yǎng)基或從細(xì)胞中分離重組蛋白質(zhì)；在某些允許存在一些雜質(zhì)的情況下，蛋白質(zhì)的回收和純化不是必需的。
前述的各個(gè)步驟可以各種方式來完成。例如，在各種宿主中，可操作的表達(dá)載體的構(gòu)建采用如上列舉的適當(dāng)復(fù)制子和控制序列來實(shí)現(xiàn)?？刂菩蛄?、表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化方法取決于表達(dá)基因的宿主細(xì)胞類型，先前已經(jīng)被詳細(xì)討論過，同樣是本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的。如果在正常情況下不能獲得合適的限制性位點(diǎn)，可以被添加到編碼序列的末端，產(chǎn)生可以被插入到這些載體中的可切割基因。技術(shù)人員能夠容易地改進(jìn)本領(lǐng)域熟知的任何宿主/表達(dá)系統(tǒng)，與本發(fā)明的核酸分子一起使用來制備期望的重組蛋白質(zhì)。
如上所討論，可以采用任何表達(dá)系統(tǒng)，包括酵母、細(xì)菌、動(dòng)物、植物、真核和原核系統(tǒng)。在某些實(shí)施方案中，酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物生產(chǎn)系統(tǒng)是優(yōu)選的。在其它實(shí)施方案中，采用被改進(jìn)來降低天然酵母糖基化、超糖基化或蛋白質(zhì)水解活性的酵母系統(tǒng)。
轉(zhuǎn)移體的分離/純化宿主細(xì)胞在允許生物活性融合蛋白分泌的條件下生長(zhǎng)，從宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中分離被分泌的具有生物活性的被修飾轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白，優(yōu)選包含被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的轉(zhuǎn)移體。從培養(yǎng)基中去除細(xì)胞物質(zhì)，采用本領(lǐng)域知曉的分離技術(shù)分離生物活性融合蛋白。合適的技術(shù)包括通過各種層析方法來進(jìn)行沉淀和分餾，包括凝膠過濾、離子交換層析和親合層析。
特別優(yōu)選的純化方法是在離子結(jié)合或金屬螯合柱上進(jìn)行親合層析，或采用定向抗多肽融合物的抗體可變區(qū)的抗原進(jìn)行免疫親合層析。這些抗原優(yōu)選被固定在或結(jié)合到固體支持物或基底上。特別優(yōu)選的基底是CNBr-活化的瓊脂糖(Pharmacia LKB Technologies，Inc.，Piscataway，N.J.)。通過這種方法，在允許結(jié)合發(fā)生的條件下，培養(yǎng)基與抗原/基底結(jié)合。洗滌復(fù)合物來去除未被結(jié)合的物質(zhì)，采用不利復(fù)合物形成的條件來釋放或洗脫轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白。特別有用的洗脫方法包括改變pH，其中在第一個(gè)pH下，被固定的抗原對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白具有很高的親合性，而在第二個(gè)(更高或更低)pH下，親合性下降；改變某種離液劑的濃度；或者使用去垢劑。
將轉(zhuǎn)移體呈遞到細(xì)胞內(nèi)部和/或跨越血腦屏障(BBB)在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，被修飾的轉(zhuǎn)移體可以被用作載體來將復(fù)合到轉(zhuǎn)鐵蛋白的鐵離子上的分子或小分子治療劑呈遞到細(xì)胞的內(nèi)部或者跨越血腦屏障。在這些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)鐵蛋白通常被改造或者被修飾來抑制、防止或去除糖基化，延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移體和/或抗體可變區(qū)的血清半衰期。特別包括添加目標(biāo)肽或者如單鏈抗體來進(jìn)一步將轉(zhuǎn)移體定向到特定細(xì)胞類型上，例如癌細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，含鐵的抗貧血藥物，鐵-山梨糖醇-檸檬酸鹽復(fù)合物被添加到被本發(fā)明的修飾的Tf融合蛋白中。已經(jīng)證明，鐵-山梨糖醇-檸檬酸鹽(FSC)在體外抑制各種鼠癌細(xì)胞的增殖，在體內(nèi)致使腫瘤衰退，但是對(duì)非惡性細(xì)胞的增殖不產(chǎn)生任何作用(Poljak-Blazi等(June 2000)CancerBiotherapy and Radiopharmaceuticals(美國)，15/3285-293)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，與鐵離子都形成復(fù)合物的抗腫瘤藥物阿霉素(doxorabicin)和/或化療藥物博來霉素(bleomycin)，被添加到本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體上。在其它實(shí)施方案中，制備藥物的鹽，例如，檸檬酸鹽或碳酸鹽，并與鐵離子復(fù)合，然后結(jié)合到Tf上。由于腫瘤細(xì)胞常常具有較高的鐵周轉(zhuǎn)率(turnover rate)；轉(zhuǎn)鐵蛋白被修飾來攜帶至少一種抗腫瘤劑，提供一種提高試劑暴露于或加載到腫瘤細(xì)胞上的方法(Demant，E.J.，(1983)Eur.J.Biochem.137/(1-2)113-118；Padbury等(1985)J.Biol.Chem.260/137820-7823)。
藥物制劑與治療方法采用標(biāo)準(zhǔn)的施用操作，將本發(fā)明的被修飾的融合蛋白，優(yōu)選包含被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的轉(zhuǎn)移體施用給需要的患者。例如，本發(fā)明的被修飾的Tf轉(zhuǎn)鐵蛋白可以單獨(dú)或結(jié)合或順序結(jié)合其它調(diào)節(jié)特定病理過程的試劑來被提供。如在此所用，當(dāng)兩種試劑同時(shí)被施用或者以使得兩種試劑同時(shí)或接近同時(shí)起作用的方式被獨(dú)自施用時(shí)，這兩種試劑被認(rèn)為是被組合地施用。
本發(fā)明的融合蛋白可以通過胃腸外、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)皮和口腔的路徑被施用。例如，一種試劑通過微灌注(microinfusion)被局部地施用到損傷部位?？商娲?，或者同時(shí)地，施用可以是非侵入性的，通過口服、吸入、鼻腔或肺部路徑。被施用的劑量將取決于受體的年齡、健康狀況和體重，并行治療法的類型，如果存在，治療頻率和期望的作用特點(diǎn)。
本發(fā)明還提供含有一種或多種本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體的組合物。雖然個(gè)體需要是不同的，確定各種組分的有效量的最佳范圍屬于本領(lǐng)域的技術(shù)。典型的劑量包含約1pg/kg到約100mg/kg體重。用于系統(tǒng)施用的優(yōu)選劑量包含約100ng/kg到約100mg/kg體重。通過微灌注直接施用到部位的優(yōu)選劑量包含約1ng/kg到約1mg/kg體重。當(dāng)通過直接注射或微灌注施用時(shí)，本發(fā)明的被修飾融合蛋白可以被工程化來減少或不與鐵結(jié)合，以部分地防止局部的鐵毒性。
除了藥學(xué)活性的轉(zhuǎn)移體，本發(fā)明的組合物含有合適的藥學(xué)上可接受的載體，包括方便將活性化合物加工成制備物的賦形劑和輔料，可以在藥學(xué)上使用制備物來呈遞到作用部位。用于胃腸外施用的合適制劑包括可溶于水形式的活性化合物的水溶液，例如，可溶于水的鹽。此外，可以施用作為適當(dāng)?shù)挠托宰⑸鋺腋∫旱幕钚曰衔锏膽腋∫骸：线m的親脂性溶劑或媒介物包括油脂，例如，芝麻油或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酸酯。水溶性注射懸浮液可以含有提高懸浮液的粘性的物質(zhì)，包括，例如，羧甲基纖維素鈉、山梨醇和葡聚糖?？蛇x擇地，該懸浮液還可以含有穩(wěn)定劑。脂質(zhì)體也可以被用于包囊被呈遞到細(xì)胞中的試劑。
按照本發(fā)明的用于系統(tǒng)施用的藥物制劑可以被配制成用于腸道的、胃腸外的或局部的施用。實(shí)際上，可以同時(shí)使用所有三種類型的制劑，達(dá)到系統(tǒng)施用活性成分的效果。用于口服施用的合適制劑包括硬的或軟的明膠膠囊，藥丸，片劑，包括糖衣片劑，藥丹，懸浮液，糖漿或吸入劑及其控制釋放形式。
在實(shí)施本發(fā)明的方法中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體可以單獨(dú)地或組合地，或結(jié)合其它治療性或診斷性試劑地被使用。在特定優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體可以與其它化合物共同施用，這些化合物按照通?？山邮艿尼t(yī)療實(shí)踐被開成處方用于這些癥狀。本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體可以在體內(nèi)使用，通常在哺乳動(dòng)物中，例如人、綿羊、馬、牛、豬、狗、貓、大鼠和小鼠，離體或體外使用。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，包括制備轉(zhuǎn)基因的非人類動(dòng)物，該動(dòng)物含有血清半衰期、血清穩(wěn)定性或生物利用度升高的本發(fā)明的被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白融合構(gòu)建體，優(yōu)選轉(zhuǎn)移體。在一些實(shí)施方案中，乳鐵蛋白可以被用作融合蛋白的Tf部分，使得在乳汁中產(chǎn)生和分泌融合蛋白。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在乳汁中制備Tf融合蛋白。
在大量專利和出版物中描述了成功制備轉(zhuǎn)基因的非人類動(dòng)物，例如美國專利6,291,740(2001年9月18日授權(quán))；美國專利6,281,408(2001年8月28日授權(quán))；和美國專利6,271,436(2001年8月7日授權(quán))，其內(nèi)容在此完全引入作為參考。
改變動(dòng)物的遺傳組成，可以進(jìn)行廣泛的商業(yè)應(yīng)用，這些動(dòng)物例如家養(yǎng)動(dòng)物，包括奶牛、豬、山羊、馬、肉牛和綿羊。這些應(yīng)用包括動(dòng)物生產(chǎn)，這些動(dòng)物表達(dá)大量容易回收形式的外源蛋白(例如，表達(dá)到乳汁或血液中)，體重增加、飼養(yǎng)效率、胴體組成、乳汁產(chǎn)量或含量升高、抗病性和對(duì)特定微生物感染的抵抗的動(dòng)物生產(chǎn)，提高生長(zhǎng)率或繁殖特性的動(dòng)物生產(chǎn)。在其基因組中含有外源DNA序列的動(dòng)物被稱作為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
最廣泛用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法是將DNA顯微注射到受精胚的原核中(Wall等，J.Cell.Biochem.49113 )。其它用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法包括用逆轉(zhuǎn)錄病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染胚胎。用野生型或重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染移植前或移植后的小鼠胚胎已經(jīng)被報(bào)導(dǎo)(Janenich，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 731260 ；Janenich等，Cell 24519 ；Stuhlmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 817151 ；Jahner等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 826927 ；Van der Putten等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 826148-6152 ；Stewart等，EMBO J.6383-388 )。
用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染胚胎的可替代方法是將病毒或生產(chǎn)病毒的細(xì)胞注射到小鼠胚胎的囊胚腔中(Jahner，D.等，Nature 298623 )。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)，采用子宮內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染妊娠中期的小鼠胚胎，將轉(zhuǎn)基因?qū)胄∈蟮挠字丑w中(Jahner等，同上文 )。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)用逆轉(zhuǎn)錄病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染牛和綿羊的胚胎，來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。這些方案包括將逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒或者釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的生長(zhǎng)停滯(即，絲裂菌素C處理的)細(xì)胞微注射到受精卵或早期胚胎的卵周隙中(PCT國際專利申請(qǐng)WO 90/08832 ；和Haskell和Bowen，Mol.Reprod.Dev.，40386 。PCT國際專利申請(qǐng)WO 90/08832描述將野生型貓科(feline)白血病病毒B注射到2-8細(xì)胞階段的綿羊胚胎的卵周隙中。由被注射胚胎發(fā)育得到胎兒被證明含有多個(gè)整合位點(diǎn)。
美國專利6,291,740(2001年9月18日授權(quán))描述采用轉(zhuǎn)導(dǎo)分化細(xì)胞(例如來源于鼠白血病病毒[MLV]的載體)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將外源DNA導(dǎo)入成熟前卵母細(xì)胞和成熟的未受精的卵母細(xì)胞(即，受精前的卵母細(xì)胞)中來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。該專利還描述了通過細(xì)胞巨化病毒啟動(dòng)子起始以及小鼠乳腺癌LTR來表達(dá)各種重組蛋白的方法和組合物。
美國專利6,281,408(2001年8月28日授權(quán))描述采用胚胎干細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。簡(jiǎn)而言之，胚胎干細(xì)胞與桑椹胚混合共培養(yǎng)來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在共培養(yǎng)之前，通過例如電穿孔、微注射或逆轉(zhuǎn)錄呈遞，將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入導(dǎo)胚胎干細(xì)胞中。通過選擇標(biāo)記例如新霉素，選擇以這種方式轉(zhuǎn)染的ES細(xì)胞，其中發(fā)生基因整合。
美國專利6,271,436(2001年8月7日)描述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)，采用的方法包括分離原始生殖細(xì)胞，培養(yǎng)這些細(xì)胞以產(chǎn)生原始生殖細(xì)胞來源細(xì)胞系，轉(zhuǎn)化原始生殖細(xì)胞和被培養(yǎng)的細(xì)胞系，使用這些被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和細(xì)胞系來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的效率被極大地提高，因而，在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的非嚙齒類動(dòng)物物種中可以采用同源重組方法。
基因治療在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，包括被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白融合構(gòu)建體用于基因治療的用途，其中被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)構(gòu)域被連接到抗體可變區(qū)上。血清半衰期或血清穩(wěn)定性提高的本發(fā)明的被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白融合構(gòu)建體特別適合于基因治療。
成功使用基因治療來表達(dá)可溶的融合蛋白已經(jīng)被描述。簡(jiǎn)而言之，最近在Ijima等(June 10，2001)Human Gene Therapy(美國)12/91063-77中說明，通過注射含有編碼可溶的融合蛋白的基因的腺病毒載體進(jìn)行基因治療，可溶的融合蛋白由細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞抗原4(CTLA4)和人免疫球蛋白G1的Fc部分組成。在該基因治療應(yīng)用中，通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射載體成功地治療了II型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的鼠模型。
基因治療還在大量美國專利中被描述，包括美國專利6,225,290(2001年5月1日授權(quán))；美國專利6,187,305(2001年2月13日授權(quán))和美國專利6,140,111(2000年10月31日)。
美國專利6,225,290提供方法和構(gòu)建體，其中哺乳動(dòng)物個(gè)體的腸上皮細(xì)胞被遺傳改進(jìn)，可操作地插入表達(dá)具有期望治療作用的蛋白質(zhì)的基因。通過施用主要由裸DNA組成的制劑，實(shí)現(xiàn)腸道細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，該DNA被口服施用。口服的或其它胃腸道內(nèi)的施用路徑提供了一種簡(jiǎn)單的施用方法，而采用裸核酸避免與使用病毒載體進(jìn)行基因治療相關(guān)的并發(fā)癥。表達(dá)的蛋白質(zhì)被直接分泌到胃腸道和/或血流中，獲得治療性血液水平的蛋白質(zhì)，從而治療需要該蛋白質(zhì)的患者。被轉(zhuǎn)化的腸道上皮細(xì)胞短期或長(zhǎng)期地治療與缺乏特定蛋白質(zhì)相關(guān)的疾病，或者通過過度表達(dá)一種蛋白質(zhì)進(jìn)行治療。
美國專利6,187,305提供在脊椎動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物來源的細(xì)胞中進(jìn)行基因或DNA靶向的方法。簡(jiǎn)而言之，通過DNA的同源重組或靶向，將DNA導(dǎo)入到脊椎動(dòng)物來源的初級(jí)或次級(jí)細(xì)胞中，DNA被導(dǎo)入到初級(jí)或次級(jí)細(xì)胞的基因組DNA的預(yù)先選擇的位點(diǎn)上。
美國專利6,140,111(2000年10月31日授權(quán))描述逆轉(zhuǎn)錄病毒基因治療的載體。所公開的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括目標(biāo)基因的插入位點(diǎn)，能夠在廣泛的各種轉(zhuǎn)染細(xì)胞類型中表達(dá)高水平的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)來源于目標(biāo)基因。還公開了缺乏可選擇標(biāo)記的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，從而使得它們適合于在各種疾病狀態(tài)的治療中進(jìn)行人的基因治療，而不會(huì)共表達(dá)標(biāo)記產(chǎn)物，例如抗生素。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體特別適合用于特定包裝細(xì)胞系中。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠插入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組中，使得它們成為人類和動(dòng)物的遺傳疾病的基因治療中的特別有前景的候選?；蛑委煹湫偷匕?1)在體內(nèi)將新的遺傳物質(zhì)增加到患者細(xì)胞中，或者(2)從機(jī)體中取出患者細(xì)胞，將新的遺傳物質(zhì)添加到細(xì)胞中，并將細(xì)胞重新導(dǎo)入機(jī)體中，即，體外基因治療。對(duì)于如何使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在各種細(xì)胞中進(jìn)行基因治療的討論，存在于例如1989年9月19日授權(quán)的美國專利4,868,116和1990年12月25日授權(quán)的美國專利4,980,286(上皮細(xì)胞)，1989年8月10日公開的WO 89/07136(肝細(xì)胞)，1990年7月25日公開的EP 378,576(成纖維細(xì)胞)和1989年6月15日公開的WO 89/05345和1990年6月28日公開的WO/90/06997(內(nèi)皮細(xì)胞)中，這些專利的公開內(nèi)容在此引入作為參考。
包含抗毒素的抗體可變區(qū)的轉(zhuǎn)移體本發(fā)明提供包含轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白以及抗毒素的抗體可變區(qū)的轉(zhuǎn)移體。如在此所用術(shù)語“毒素”是指生物學(xué)來源的毒性物質(zhì)?？梢匀缟纤懻搧慝@得包含期望毒素抗體的一個(gè)或多個(gè)抗體可變區(qū)以及轉(zhuǎn)鐵蛋白的轉(zhuǎn)移體。包含抗毒素的抗體可變區(qū)的轉(zhuǎn)移體可以被用于治療患有與毒素相關(guān)的疾病的患者。包含抗毒素的抗體可變區(qū)以及轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子的轉(zhuǎn)移體可以被用于診斷目的。
可以通過各種微生物和植物來制備毒素。這種微生物的例子包括但是不限于白喉?xiàng)U菌(Corynebacterium diphtheriae)、葡萄球菌(Staphylococci)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimruium)、志賀氏菌(Shigellae)、銅綠甲單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、霍亂弧菌(Vibrio cholera)、肉毒桿菌(Clostridiumbotulinum)、破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)、艱難梭菌(Clostridium difficile)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、韋氏梭菌(Clostridium welchii)、鼠疫桿菌(Yersinia pestis)、大腸桿菌(Escherichia coli)和炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)。由這些微生物和植物產(chǎn)生的毒素包括，但是不限于，假單胞菌外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、蓖麻(ricin)毒素、紅豆(abrin)毒素、炭疽熱毒素、志賀菌(shigol)毒素、肉毒桿菌(botulism)毒素、破傷風(fēng)毒素、霍亂毒素、maitotoxin、巖沙?？?palytoxin)毒素、ciguatoxin、textilotoxin、蟾毒素(batrachotoxin)、α芋螺毒素(conotoxin)、泰攀蛇毒素(taipoxin)、河豚毒素(tetrodo toxin)、αtityustoxin、蛤蚌毒素(saxitoxin)、類毒素(anatoxin)、微囊藻素(microcystin)、烏頭堿(aconitine)、exfoliatin毒素A和B、腸毒素(enterotoxin)、毒性休克綜合癥毒素(TSST-1)、鼠疫桿菌(ripestis)毒素、氣體壞疽(gas gangrene)毒素等。
毒素可以被分成各種組別，例如，但是不限于，ADP-核糖基化毒素、exfoliatin毒素、葡萄球菌腸毒素和金屬蛋白酶。ADP-核糖基化毒素的例子包括假單胞菌毒素A、白喉毒素、百日咳(pertussis)毒素和霍亂毒素(choleratoxin)。
Exfoliatin毒素A和B、葡萄球菌腸毒素和毒性休克綜合癥毒素、TSST-1屬于逐漸擴(kuò)增的微生物超抗原家族，激活T細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致生成細(xì)胞因子，根據(jù)形成毒素的含量、宿主的免疫狀態(tài)和毒素進(jìn)入循環(huán)的路徑，細(xì)胞因子介導(dǎo)局部或系統(tǒng)性的作用。Exfoliatin毒素介導(dǎo)葡萄球菌感染皮膚綜合癥和大皰性膿皰病(bullous impetigo)的皮膚癥狀。這些毒素導(dǎo)致皮膚在顆粒層發(fā)生表皮層內(nèi)斷裂，形成大皰并脫落。由于金黃色葡萄球菌(S.aureus)，七種不同的腸毒素(A、B、C1、C2、C3、D和E)參與食物中毒。這些毒素增強(qiáng)腸道蠕動(dòng)，通過直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起嘔吐。毒素休克綜合癥(TTS)最常見是受TSST-1調(diào)節(jié)，TSST-1以5-25％的概率存在于金黃色葡萄球菌的臨床分離物中。在更少的情況下，TSS受腸毒素B調(diào)節(jié)，幾乎不受腸毒素C1調(diào)節(jié)。
金屬蛋白酶的例子包括來源于梭菌屬(clostridial)(肉毒桿菌(c.botulinum)和破傷風(fēng)梭菌(c.tetani))和炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)(Herreros等，載于細(xì)菌蛋白毒素綜合資料(The Comprehensive Sourcebook of Bacterial ProteinToxins).J.E.Alouf和J.H.Freer，編輯.第2版，San Diego，Academic Press，1999；202-228)的生物毒素。這些細(xì)菌表達(dá)和分泌鋅金屬蛋白酶，該酶進(jìn)入真核細(xì)胞，并特異地?cái)嗔巡煌哪繕?biāo)蛋白。
梭菌屬是由革蘭氏陽性、厭氧的產(chǎn)生孢子的桿菌組成。這些生物體的天然生境是周圍環(huán)境和人和其它動(dòng)物的腸道。事實(shí)上，梭菌屬是普遍存在的；它們通常存在于土壤、塵埃、污水、船舶沉積物、腐爛植物和泥漿中(參見，例如Sneath等，“梭菌屬”，Bergey′s Manual.RTM.of SystematicBacteriology，2，1141-1200，Williams & Wilkins )。盡管已經(jīng)鑒定了將近100種梭菌，僅少數(shù)梭菌被認(rèn)為是具有醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)意義的病原菌。盡管如此，這些菌種與非常嚴(yán)重的疾病相關(guān)，包括肉毒中毒(botulism)、破傷風(fēng)(tetanus)、厭氧蜂窩織炎(awaerobic cellulitis)、氣性壞疽(gangrene)、菌血癥(bacteremia)、偽膜狀結(jié)腸炎(psedomembranous colitis)和梭菌胃腸炎(gastroenteritis)。表2列舉一些具有醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)意義的種類，以及與之相關(guān)的疾病。
如在表2中所顯示，這些微生物的大部分與嚴(yán)重和/或致弱的疾病相關(guān)。在大多數(shù)情況下，這些微生物的致病性與釋放強(qiáng)大的外毒素或高度破壞性的酶相關(guān)。實(shí)際上，多個(gè)梭菌屬的種類產(chǎn)生具有重大的醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)意義的毒素和其它酶(C.L.Hatheway，Clin.Microbiol.Rev.366-98(1990))。
表2具有醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)意義的梭菌


*根據(jù)Engelkirk等“分類”(Classification)，Principles and Practice ofClinical Anaerobic Bacteriology，22-23，Star Publishing Co.，Belmont，CA(1992)；Stephen和Petrowski，“跨膜和去除對(duì)細(xì)胞的調(diào)控的毒素”(Toxins WhichTraverse Membranes and Deregulate Cells)，記載在Bacterial Toxins中，第2版，66-67，American Society for Microbiology(1986)；Berkow和Fletcher(編輯)，“細(xì)菌性疾病”(Bacterial Diseases)，Merck Manual ofDiagnosis and Therapy，第16版，116-126，Merck Research Laboratories，Rahway，N.J.(1992)；以及Siegmond和Fraser(編輯)，“梭菌感染”(Clostridial Infections)，Merck VeterinaryManual，第5版，396-409，Merck & Co.，Rahway，N.J.(1979)匯集。
由于這些毒素在人類醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)上具有重要意義，已經(jīng)對(duì)它們進(jìn)行了大量研究，特別是對(duì)肉毒桿菌(C.botulinum)、破傷風(fēng)梭菌(C.tetani)和產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfingens)以及艱難梭菌(C.difficile)的毒素進(jìn)行研究。
在神經(jīng)元細(xì)胞中，梭菌神經(jīng)毒素是鈣依賴的神經(jīng)傳遞素分泌的潛在抑制劑。目前，一般認(rèn)為，梭菌神經(jīng)毒素通過特異地內(nèi)切蛋白酶解裂解至少三種囊泡或突觸前膜相關(guān)蛋白VAMP、突觸融合蛋白或SNAP-25之一來介導(dǎo)這種活性，這三種蛋白對(duì)于神經(jīng)傳遞素分泌的囊泡停泊和膜融合事件來說是重要的。破傷風(fēng)和肉毒桿菌神經(jīng)毒素的神經(jīng)元細(xì)胞靶向被認(rèn)為是受體介導(dǎo)的事件，之后，毒素被內(nèi)化并隨即轉(zhuǎn)運(yùn)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞內(nèi)腔中，毒素在此影響肽鏈內(nèi)切酶的活性。
肉毒桿菌(Clostridium Botulinum)毒素厭氧的、革蘭氏陽性細(xì)菌肉毒桿菌生成最毒的生物神經(jīng)毒素，已知人類致死劑量為毫微克。毒素作用的范圍從導(dǎo)致腸道破壞的腹瀉疾病到能夠?qū)е滤劳龅陌c瘓作用。肉毒梭桿菌的孢子存在于土壤中，在未被正確滅菌和密封的家用罐裝的食物容器中生長(zhǎng)，這就是許多肉毒桿菌中毒案例的病因。肉毒桿菌中毒的癥狀通常出現(xiàn)在食用被肉毒梭桿菌培養(yǎng)物或孢子感染的食物后的18-36小時(shí)。肉毒桿菌毒素顯然能夠穿過腸道的內(nèi)膜而不被滅活，并攻擊外周的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。肉毒桿菌毒素中毒的癥狀可以從行走、吞咽和言語困難到呼吸肌癱瘓和死亡。
根據(jù)毒素進(jìn)入血流的方法，肉毒桿菌中毒疾病可以分為4類。由于攝食未正確保存和不完全加熱的含有肉毒桿菌毒素的食物造成的食物攜帶肉毒桿菌中毒(即在攝食之前該毒素已經(jīng)形成)。由于肉毒梭桿菌穿過受損組織并產(chǎn)生毒性，該毒素被吸收到血流中而造成的創(chuàng)傷誘導(dǎo)的肉毒桿菌中毒。自從1950年以來，有30個(gè)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的肉毒桿菌中毒被報(bào)道(Swartz，“厭氧孢子形成桿菌梭菌”(Anaerobic Spore-Forming BacilliThe Clostridia)，633-646，載于Davis等，(編輯)，Microbiology，第4版，J.B.Lippincott Co.(1990))。當(dāng)毒素被吸入時(shí)引起的吸入性肉毒桿菌中毒。已經(jīng)報(bào)道，吸入性肉毒桿菌中毒是由于意外暴露于實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果(Holzer，Med.Klin.，411735 )，并且如果該毒素被用作生物戰(zhàn)爭(zhēng)的試劑，是一種潛在危險(xiǎn)(Franz等，載于肉毒桿菌和破傷風(fēng)神經(jīng)毒素(Botulinum and Tetanus Neurotoxins)，DasGupta(編輯)，PlenumPress，New York ，473-476)。由于肉毒梭桿菌定居?jì)雰旱哪c道并產(chǎn)生毒素和吸收到血流中而引起的傳染性嬰兒肉毒桿菌中毒。
不同的肉毒梭桿菌菌株產(chǎn)生用字母A-G命名的抗原性上相互區(qū)別的毒素。血清型A毒素涉及26％食物肉毒桿菌中毒的病例，類型B、E和F也涉及較小比例的食物肉毒桿菌中毒的病例(Sugiyama，Microbiol.Rev.，44419(1980))。已經(jīng)報(bào)道，創(chuàng)傷性肉毒桿菌中毒僅由A或B型毒素引起(Sugiyama，同上文)。幾乎所有的嬰兒肉毒桿菌中毒的病例都是由產(chǎn)生類型A或類型B的毒素細(xì)菌引起(例外地，一個(gè)新墨西哥州的病例是由產(chǎn)生類型F的毒素的肉毒梭桿菌引起，另一個(gè)是由產(chǎn)生類型B型F雜合體的肉毒梭桿菌引起)(Arnon，Epidemiol.Rev.，345(1981))。類型C毒素作用水禽、牛、馬和貂。類型D毒素作用于牛，而類型E毒素作用于人和鳥類。
各種抗肉毒桿菌毒素的抗毒素已經(jīng)被使用。來源于馬血清的三價(jià)抗毒素可以從Connaught Industries Ltd.購買得到，作為A、B和E毒素類型的治療劑。七價(jià)的馬肉毒桿菌抗毒素僅采用抗體分子的F(ab′)2部分，已經(jīng)由美國軍方進(jìn)行試驗(yàn)(Balady，USAMRDC Newsletter，6(1991))。其生成來抵抗這種大型動(dòng)物體內(nèi)的類毒素，不是一種高滴度的制備物。從被免疫接種的個(gè)體中收集了五價(jià)的人抗毒素，用于治療嬰兒肉毒中毒。已經(jīng)用毒素制備物免疫個(gè)體，來產(chǎn)生抵抗肉毒桿菌毒素的免疫性。含有化學(xué)滅活(即甲醛處理)的A、B、C、D和E型毒素的肉毒桿菌疫苗可以購買得到，應(yīng)用于人。但是，這些抗毒素對(duì)于治療肉毒中毒疾病來說是不安全和無效的。
破傷風(fēng)梭菌毒素雖然在遠(yuǎn)古時(shí)期就確定了破傷風(fēng)(例如希波克拉底描述了這種疾病)，直到1867年，才確定其是由傳染物引起的(參見，例如Hatheway，同上文，75)。由破傷風(fēng)梭菌引起的嚴(yán)格的產(chǎn)生毒素的疾病通常是與似乎不嚴(yán)重的劃破創(chuàng)傷相關(guān)的。可以很容易從各種來源分離到這種生物體，包括土壤和任何動(dòng)物種屬的腸道內(nèi)容物(例如人、馬等)。
疾病由損傷部位的生物體產(chǎn)生的毒素引起。毒素迅速結(jié)合到神經(jīng)組織上，導(dǎo)致癱瘓和破傷風(fēng)的痙攣特征。這主要是由于產(chǎn)生有效類毒素，目前，破傷風(fēng)主要是未被免疫的動(dòng)物，包括人的疾病。例如，由于截?cái)嗄殠У奈廴疽鸬男律鷥浩苽L(fēng)在全世界的某些地區(qū)非常盛行。新生兒破傷風(fēng)幾乎總是嚴(yán)重的，并且是高度致命的。全世界大約一半所報(bào)道的病例為新生兒破傷風(fēng)。
破傷風(fēng)是由潛在的神經(jīng)毒素(破傷風(fēng)痙攣毒素)作用產(chǎn)生的非常嚴(yán)重的疾病。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，該毒素結(jié)合到神經(jīng)節(jié)苷脂上，阻斷對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的抑制脈沖，導(dǎo)致屈肌和伸肌的肌肉痙攣延長(zhǎng)。破傷風(fēng)梭菌還產(chǎn)生“破傷風(fēng)菌溶血素”，一種對(duì)氧敏感的溶血素，在功能上和血清學(xué)上與鏈球菌溶血素O相關(guān)，各種其它生物體的氧敏感的溶血素，包括至少六種梭菌屬種羊(clostridium species)(參見，例如Hatheway，76)。這種毒素溶解各種細(xì)胞，包括紅細(xì)胞、多形核白血胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腹水腫瘤細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和血小板。對(duì)膽固醇及相關(guān)固醇類具有親合性。雖然在試驗(yàn)研究中，這種毒素被證明會(huì)導(dǎo)致小鼠肺水腫和死亡，導(dǎo)致兔子和猴子血管溶血，導(dǎo)致猴子心臟中毒，其在破傷風(fēng)梭菌感染中的作用仍不清楚(參見，Hatheway，77)。
雖然在高級(jí)階段(advanced case)診斷破傷風(fēng)是相對(duì)容易的，但是成功治療依賴于致死量的毒素固定到神經(jīng)組織之前的早期診斷。因此，在得到實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)之前，通常根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來治療患者。破傷風(fēng)毒素被預(yù)防性地使用來防止這種疾病。由于免疫抑制的患者對(duì)毒素的預(yù)防注射不產(chǎn)生反應(yīng)，采用肌肉內(nèi)給予人破傷風(fēng)免疫球蛋白。
被診斷為破傷風(fēng)的治療包括清除傷口以從創(chuàng)傷部位除去生物體。在用苯并二氮控制患者的痙攣后，再進(jìn)行清除傷口。通常使用青霉素或滅滴靈(metronida zolel)來治療患者。還肌肉內(nèi)給予人破傷風(fēng)免疫球蛋白。輔助治療(例如幫助呼吸、供給營(yíng)養(yǎng)和靜脈內(nèi)流動(dòng))對(duì)于患者存活是關(guān)鍵的。在傷口干凈而且小的情況下，如果患者在過去10年中沒有接受過加強(qiáng)劑量，則給患者施用破傷風(fēng)類毒素，盡管創(chuàng)傷嚴(yán)重，如果患者在過去5年中沒有接受過加強(qiáng)劑量，也施用類毒素。
產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素(Clostridium Perfringens Toxin)產(chǎn)氣莢膜梭菌被認(rèn)為是最廣泛存在的病原性細(xì)菌(參見Hatheway，同上文，77)。最早在1892年，Welch和Nuttall描述了這種生物體，稱作莢膜產(chǎn)氣芽孢桿菌，還通常被稱作為魏氏梭狀芽孢桿菌(C.welchii)。產(chǎn)氣莢膜梭菌通常從土壤樣本以及人和其它動(dòng)物的腸道內(nèi)容物中分離。雖然其它梭菌屬也與氣性壞疽相關(guān)(例如，諾氏梭菌(C.novyi)、敗毒梭菌(C.septicum)、溶組織梭菌(C.histolyticum)、第三梭菌(C.tertium)、雙酶梭菌(C.bifermentans)和生孢梭菌(C.sporogenes)，產(chǎn)氣莢膜梭菌是最相關(guān)的種屬。當(dāng)被引入健康組織中時(shí)，這些生物體不是高度致病性的，但是當(dāng)存在組織損傷(例如被損壞的肌肉組織)時(shí)導(dǎo)入，與迅速漸進(jìn)性的破壞性感染相關(guān)，這種感染表現(xiàn)為氣體積聚，大范圍的肌肉和組織壞死。在活躍增殖時(shí)，侵入的梭菌菌株產(chǎn)生具有引起壞死(即溶解細(xì)胞)、溶血和/或致死特性的外毒素。此外，由該生物體產(chǎn)生的酶如膠原酶蛋白酶、脫氧核糖核酸酶以及透明質(zhì)酸酶，導(dǎo)致在組織中積聚毒性降解產(chǎn)物。
產(chǎn)氣莢膜梭菌生成四種主要的致死毒素(α、β、ε和iota)，物種的毒素類型基于此，以及九種小毒素(或可溶抗原)，它們可能參與或不參與與生物體相關(guān)的致病性(參見Hatheway，同上文，77)。這些小毒素是λ、θ、κ、μ、ν、γ、η和神經(jīng)氨酸苷酶。此外，一些菌株產(chǎn)生導(dǎo)致產(chǎn)氣莢膜梭菌食物引起的疾病的腸毒素。根據(jù)所產(chǎn)生的毒素，產(chǎn)氣莢膜梭菌可以被分成稱作為A、B、C、D和E的“毒素類型”。例如，大部分毒素類型A的菌株產(chǎn)生α毒素，而不產(chǎn)生其它主要的致死毒素(即β、ε和ι)；毒素類型B的生物體產(chǎn)生除了ι毒素之外的所有的主要致死毒素；毒素類型生物體產(chǎn)生α和β主要致死毒素，但是不生成ε和ι毒素；毒素類型D生物體生成α和ε毒素，但是不生成β和ι毒素；毒素類型E生物體生成α和ι毒素，但是不生成β和ε毒素。
α毒素是卵磷脂酶(磷脂酶C)，而β毒素是壞死性胰蛋白酶不穩(wěn)定毒素；ε毒素是一種透性酶、胰蛋白酶活化毒素；ι毒素是一種引起皮膚壞死的、二元的、ADP-核糖基化、胰蛋白酶活化毒素。δ毒素是一種溶血素；θ毒素是一種氧不穩(wěn)定溶血素，和溶細(xì)胞素；κ毒素是一種膠原酶和白明膠酶；λ毒素是一種蛋白酶；μ毒素是一種透明質(zhì)酸酶；而ν毒素是一種DNA酶。γ和η毒素還未被充分地表征，是否存在仍值得懷疑(參見Hatheway，同上文，77)。神經(jīng)氨酸苷酶是N-乙酰神經(jīng)氨酸糖基水解酶，而腸毒素具有腸道內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)毒性。
本發(fā)明的毒素通常與特定疾病相關(guān)。例如，毒素類型A的生物體與人的肌肉壞死(氣性壞疽)、食物引起的疾病和感染性腹瀉，羔羊、牛、山羊、馬、狗、羊駝等動(dòng)物的腸毒血癥；禽類的壞死性腸炎；馬的梭菌性疾病(clostridiosis)；非人類的靈長(zhǎng)類和各種其它動(dòng)物包括人中的急性胃擴(kuò)張相關(guān)。毒素類型B的生物體與羔羊痢疾、綿羊和公山羊的腸毒血癥(特別是在歐洲和中東)，豚鼠腸毒血癥相關(guān)。毒素類型C的生物體與Darmbrand(德國)和壞死性腸炎(新幾內(nèi)亞)、綿羊猝疽(struck)、羔羊和豬的腸毒血癥以及禽類的壞死性腸炎相關(guān)。毒素類型D的生物體與綿羊的腸毒血癥、羔羊的肉質(zhì)腎(pulpykidney)相關(guān)。毒素類型E的生物體與小牛腸毒血癥、羔羊痢疾、豚鼠腸毒血癥和兔子“ι”腸毒血癥相關(guān)。產(chǎn)氣莢膜梭菌類型A的菌株通常從土壤樣本中分離，還常常存在于未患病的個(gè)體的腸道內(nèi)容物中，類型B、C、D和E的菌株不能在土壤中存活(即這些菌株是專性寄生物)。
目前，對(duì)污染的創(chuàng)傷的處理包括及時(shí)對(duì)被污染的創(chuàng)傷進(jìn)行手術(shù)清創(chuàng)，防止厭氧性蜂窩織炎。對(duì)于氣性壞疽，僅采用抗菌劑治療是不夠的。一旦造成梭菌性創(chuàng)傷感染，及時(shí)進(jìn)行手術(shù)清創(chuàng)是必需的。在發(fā)生厭氧性蜂窩織炎的情況下，需要大范圍切除感染部位并清除創(chuàng)傷，而氣性壞疽常常需要完全切除相關(guān)肌肉(即常常需要截肢)。
雖然出現(xiàn)青霉素抗性菌株，導(dǎo)致使用氯潔霉素(clindamycin)、氯霉素和滅滴靈(metronidazole)，但是大劑量的青霉素常常被使用。然而，出現(xiàn)了抗四環(huán)素、氯霉素、紅霉素和氯潔霉素抗性的細(xì)菌。已經(jīng)將制備來抵抗四種菌株(產(chǎn)氣莢膜梭菌、諾氏梭菌、敗毒梭菌和溶組織梭菌)的毒性濾過物的多價(jià)馬抗毒素用于預(yù)防和治療氣性壞疽。但是，還沒有確定其功效，并且不再被用于臨床應(yīng)用(Swartz，645，記載于Davis等(編輯)，Microbiology，第4版，J.B.Lippincott Co.(1990))。
艱難梭菌毒素艱難梭菌(clostridium difficile)因?yàn)槠潆y于分離而得名，最近被證實(shí)是引起腹瀉的病原體(Sneath等，1165)。艱難梭菌是人和動(dòng)物中的偽膜性大腸炎的病原體。艱難梭菌與各種腹瀉疾病相關(guān)，從僅僅是腹瀉到嚴(yán)重腹瀉和集聚炎癥性細(xì)胞和纖維蛋白的胃腸道粘膜壞死，在感染部位形成偽膜。
艱難梭菌的腸道毒素主要是由兩種毒素作用產(chǎn)生，稱作A和B，各自分子量約300,000。兩者都是潛在的細(xì)胞毒素，毒素A具有直接的腸道毒性作用(Lyerly等，Infect.Immun.604633(1992))。產(chǎn)氣莢膜梭菌與抗菌劑相關(guān)腹瀉幾乎不相關(guān)，不同于產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒素A，艱難梭菌的毒素不是孢子包被組成，不是在孢子形成過程中產(chǎn)生(Swartz，644)。艱難梭菌的毒素A在兔子回腸環(huán)中引起出血，體液集聚和粘膜損傷，可能提高腸道粘膜對(duì)毒素B的攝取。毒素B不會(huì)引起腸道液體集聚，但是對(duì)組織培養(yǎng)細(xì)胞的毒性比毒素A大1000倍，導(dǎo)致膜損傷。雖然這兩種毒素產(chǎn)生相似的細(xì)胞作用，例如肌動(dòng)蛋白分解，但是存在不同的細(xì)胞特異性。
這兩種毒素在疾病中是重要的(Borriello等，Rev.Infect.Dis.，12(副刊2)S185(1990)；Lyerly等，Infect.Immun.，47349(1985)；以及Rolfe，Infect.Immun.，591223(1990))。一般認(rèn)為，毒素A首先通過結(jié)合到刷狀緣受體上來起作用，破壞外層粘膜層，然后使毒素B進(jìn)入下面的組織。發(fā)病機(jī)理中的這些步驟表明，產(chǎn)生抗毒素A的中和抗體足以預(yù)防性地治療CDAD。但是，抗毒素B的抗體是抗晚期腸道疾病的有效治療劑的必要的額外補(bǔ)充。實(shí)際上，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)，動(dòng)物需要這兩種毒素的抗體，以徹底地防止該疾病(Kim和Rolfe，Abstr.Ann.Meet.Am.Soc.Microbiol.，6962(1987))。美國專利5,071,759公開一種免疫性地結(jié)合艱難梭菌的毒素A和毒素B的單克隆抗體。美國專利6,365,158公開制備定向抵抗艱難梭菌的毒素B的中和抗體的方法。特別地，使用可溶的重組艱難梭菌的毒素B，在鳥類中制備定向抵抗這些毒素的抗體。這種鳥類抗毒素被設(shè)計(jì)成以治療量用于口服施用，以及任何形式(即，作為一種固體或水溶液)。
炭疽桿菌(Bacillus Anthtracis)毒素炭疽熱毒素是熟知的來自炭疽桿菌的生物戰(zhàn)爭(zhēng)試劑。炭疽桿菌生成三種蛋白質(zhì)，當(dāng)被恰當(dāng)?shù)亟Y(jié)合時(shí)形成兩種可能的毒素，共同稱作炭疽熱毒素。保護(hù)性抗原(PA，82，684Da(道爾頓))和水腫因子(EF，89，840Da)結(jié)合形成水腫毒素(ET)，而PA和致死因子(LF，90，237Da)結(jié)合形成致死毒素(LT)(Leppla，S.H.Alouf，J.E.和Freer，J.H.，編輯Academic Press，London 277-302，1991)。ET和LT都遵照AB毒素模式，PA具有目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合(B)功能，EF或LF作為效應(yīng)子或催化(A)部分。這些毒素的獨(dú)特特征是在缺乏PA時(shí)，LF和EF無毒性，這顯然是由于它們無法進(jìn)入真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。
PA能夠結(jié)合到許多類型的細(xì)胞的表面上。在PA結(jié)合到易感細(xì)胞表面的特定受體上后(Leppla，同上文，1991)，其在單個(gè)位點(diǎn)上被細(xì)胞表面蛋白酶裂解，可能是費(fèi)林蛋白酶(furin)，生成氨基末端的19-kDa的片段，該片段從受體/PA復(fù)合物上釋放(Singh等，J.Biol.Chem.26419103-19107，1989)。從PA上去除該片段，在結(jié)合受體的63-kDa的羧基末端片段(PA63)上暴露LF和EF的高親合性結(jié)合位點(diǎn)。PA63和LF或EF的復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞，并可能經(jīng)過酸化的內(nèi)涵體到達(dá)細(xì)胞溶膠。
最近，在細(xì)胞中確定致死因子(LF)的靶點(diǎn)中的兩個(gè)。LF是一種金屬蛋白酶，其特異性地裂解Mek1和Mek2蛋白激酶，它們是MAP-激酶信號(hào)路徑中的組成。LF的蛋白質(zhì)水解活性通過裂解激活促有絲分裂原的蛋白激酶激酶1或2(MEK1或MEK2)來滅活MAP-激酶信號(hào)級(jí)聯(lián)。(Leppla，S.A.記載于細(xì)菌蛋白毒素的綜合資料(The Comprehensive Sourcebook of Bacterial ProteinToxins).J.E.Alouf和J.H.Freer，編輯，第二版，San Diego，Academic Press，1999；243-263)。
PA是該毒素的無毒的、結(jié)合細(xì)胞組分，是目前可以獲得的人疫苗的重要組成。該疫苗通常從炭疽桿菌的Sterne菌株的批量培養(yǎng)中制備，雖然是無毒性的，但是仍然被要求作為III級(jí)病原體來處理。除了PA，該疫苗含有少量炭疽熱毒素部分、水腫因子和致死因子和一定范圍的培養(yǎng)來源蛋白。所有這些因子在一些個(gè)體中產(chǎn)生所記載的該疫苗的反應(yīng)遺傳性(reactogenicity)。該疫苗是昂貴的，并且需要六個(gè)月進(jìn)行四次接種。此外，目前的證據(jù)表明，這種疫苗對(duì)于抵抗某些菌株的吸入性攻擊是無效的(M.G.Broster等，Proceedings of the International Workshop on Anthrax，11-13，1989年4月，Winchester UK.Salisbury med Bull Suppl No 68，(1990)91-92)。
美國專利6,267,966提供一種重組微生物，其能夠表達(dá)炭疽桿菌保護(hù)性抗原及其能夠在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的變體或片段，所述微生物包括編碼PA或其所述片段或片段的序列，其中(i)所述微生物中的一種編碼分解代謝受體蛋白和/或AbrB的基因被滅活；和/或(ii)所述PA序列的一個(gè)能夠作為分解代謝受體結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)域被滅活；和/或(iii)所述PA序列的一個(gè)能夠作為AbrB結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)域被滅活。
抗毒素抗體美國專利6,440,408提供與特異于活生物體(細(xì)菌或原生動(dòng)物)的中和抗體復(fù)合的生物體的疫苗制備物。被復(fù)合的中和抗體的含量使得生物體仍能夠誘導(dǎo)活性免疫反應(yīng)，同時(shí)對(duì)病原體的有害作用產(chǎn)生一定程度的預(yù)防作用。
細(xì)菌或原生動(dòng)物中和抗體是在體內(nèi)抵抗細(xì)菌或原生動(dòng)物的傳染性的那些抗體，細(xì)菌或原生動(dòng)物與這些抗體相互作用足夠時(shí)間。細(xì)菌或原生動(dòng)物中和抗體的來源是不重要的?？梢詠碜匀魏蝿?dòng)物，包括鳥類(例如，小雞、火雞)和哺乳動(dòng)物(例如大鼠、兔子、山羊、馬)。細(xì)菌或原生動(dòng)物中和抗體實(shí)質(zhì)上可以是多克隆的或單克隆的。參見，例如，D.Yelton和M.Scharff，68 AmericanScientist 510(1980)。該抗體可以是嵌合的。參見，例如，M.Walker等，26Molecular Immunology 403(1989)。
可用于制備抗體的細(xì)菌包括，但是不限于，李氏放線桿菌(Actinobacillosis lignieresi)、牛型放線菌(Actinomyces bovis)、產(chǎn)氣氣桿菌(Aerobacter aerogenes)、邊緣無形體(Anaplasma marginale)、炭疽桿菌(Bacillusanthracis)、鵝疏螺旋體(Borrelia anserina)、狗布魯氏菌(Brucella canis)、肖氏梭菌(Clostridium chauvoei)、溶組織梭菌(C.hemolyticium)、諾氏梭菌(C.novyi)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)、敗毒梭菌(C.Septicum)、破傷風(fēng)梭菌(C.tetani)、馬棒桿菌(Corynebacterium equi)、化膿棒桿菌(C.pyogenes)、兔腎棒桿菌(C.renale)、反芻類考德里氏體(Cowdria ruminantium)、剛果嗜皮菌(Dermatophilus congolensis)、豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix insidiosa)、大腸桿菌(Escherichia coli)、壞死梭形菌(Fusiformis necrophorus)、犬血巴通氏體(Haemobartonella canis)、Hemophilus spp.H.suis、鉤端螺旋體(Leptospria spp.)、牛莫拉氏菌(Moraxella bovis)、Mycoplasma spp.M.hyopneumoniae、Nanophyetus salmincola、鴨瘟巴斯德氏菌(Pasteurella anatipestifer)、溶血巴斯德氏菌(P.hemolytica)、多殺巴斯德氏菌(P.multocida)、綿羊流產(chǎn)沙門氏菌(Salmonella abortus-ovis)、馬腎志賀氏菌(Shigella equirulis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、豬葡萄球菌Hyos亞種(S.Hyicus.S.Hyos)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、停乳鏈球菌(S.dysgalactiae)、馬鏈球菌(S.equi)、乳房鏈球菌(S.uberis)和胎兒弧菌(Vibrio fetus)(對(duì)于相應(yīng)疾病，參見VeterinaryPharmacology and Therapeutic第5版，746表50.2(N.Booth和L.McDonald編輯，1982)(Iowa State University Press)；和白喉?xiàng)U菌(Corynebacteriumdiptheriae)、牛分枝桿菌(Mycobacteriufn bovis)、麻風(fēng)分枝桿菌(M.leprae)、結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)、星狀諾卡氏菌(Nocardia asteroides)、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)、肉毒桿菌(Clostridium botulinum)、艱難梭菌(C.difficile)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)、破傷風(fēng)梭菌(C.tetani)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、釀膿鏈球菌(S.pyogenes)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertusiss)、銅綠假單胞菌(Pseudomoyaas aeruginosa)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、布魯氏菌屬(Brucella spp.)、土拉熱弗朗西絲氏菌(Francisella tularenssis)、侵肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)、鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci)、砂眼衣原體(C.trachomatis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶爾森氏菌(Y.pestis)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenza)、肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈瑟氏球菌(Neiseseriagonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meninigitidis)、伯氏考克斯氏體(Coxiellaburneti)、穆氏立克次氏體(Rickettsia mooseria)、普氏立克次氏體(R.prowazekii)、立氏立克次氏體(R.rickettsii)、恙蟲熱立克次氏體(R.tsutsugamushi)、疏螺旋體屬(Borrelia spp.)、問號(hào)鉤端螺旋體(Leptospirainterrogans)、徹白密螺旋體(Treponema pallidum)和單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)(對(duì)于相應(yīng)疾病，參見R.Stanier等，The MicrobialWorld，637-38表32.3(第5版1986)。
美國專利4,689,299教導(dǎo)將免疫后的人外周血淋巴細(xì)胞與非分泌性小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，制備分泌抵抗細(xì)菌毒素的人單克隆抗體的穩(wěn)定雜交瘤細(xì)胞系。本專利公開制備抵抗破傷風(fēng)毒素和白喉毒素的保護(hù)性單克隆抗體的方法，這些抗體分別在體外結(jié)合破傷風(fēng)毒素和白喉毒素，分別在動(dòng)物體內(nèi)預(yù)防破傷風(fēng)和白喉。本發(fā)明的抗破傷風(fēng)毒素和抗白喉毒素的人單克隆抗體，能夠分別中和破傷風(fēng)毒素和白喉毒素。能夠預(yù)防破傷風(fēng)和白喉疾病，從而提供用于預(yù)防和/或治療毒素誘導(dǎo)的疾病的新化學(xué)治療劑。
本發(fā)明提供包含被融合到Tf或mTf上的抗毒素的轉(zhuǎn)移體。優(yōu)選地，該轉(zhuǎn)移體包含被融合到Tf或mTf上的抗肉毒桿菌神經(jīng)毒素(BoNT)的抗毒素。該轉(zhuǎn)移體可以被呈遞給軍隊(duì)和重要的接受者以及在潛在的生物恐怖襲擊之前呈遞給普通群體，并以容易施用的形式保存?zhèn)溆谩７乐管娛氯藛T和廣大民眾受生物恐怖發(fā)生后的大量暴露的威脅，需要抗毒素在惡劣環(huán)境條件下保持穩(wěn)定，每次施用后具有至少兩個(gè)月保護(hù)期，單位成本低，廣譜抵抗所有血清性A、B和E(可能C和D)，基于肉毒中毒的流行病學(xué)A、B和E是最優(yōu)先的(作為導(dǎo)致肉毒中毒的食物中毒試劑，A、B和E是最流行的血清類型)。
在本發(fā)明中，可以通過噬菌體展示方法來確定對(duì)BoNTA的重鏈具有結(jié)合親合性的肽，而將候選的肽工程化或者融合到未被糖基化形式的轉(zhuǎn)鐵蛋白(mTf)中?？梢栽诿姘湍?bake’yeast)，釀酒酵母中表達(dá)和分泌生成的轉(zhuǎn)移體。目的在于保留肽的毒素結(jié)合特性，顯現(xiàn)長(zhǎng)的mTf的循環(huán)半衰期。評(píng)價(jià)每個(gè)轉(zhuǎn)移體對(duì)神經(jīng)毒素A、B和E的非毒性重鏈部分的結(jié)合親合性。
本發(fā)明提供針對(duì)所有血清型的廣譜作用抗BoNT，由于生物利用度高、生物分布廣，作用起始迅速，載體蛋白mTf賦予長(zhǎng)的循環(huán)半衰期?？梢圆捎霉I(yè)上最廉價(jià)的生產(chǎn)體系酵母發(fā)酵來生產(chǎn)轉(zhuǎn)移體。酵母能夠生產(chǎn)g/l的產(chǎn)物，該產(chǎn)物被分泌到十分清楚的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基主要由水、鹽和碳源通常為糖組成。容易從培養(yǎng)基中純化高純度的轉(zhuǎn)移體。一般認(rèn)為，與哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)體系不同，酵母細(xì)胞對(duì)人是不致病的，不需要進(jìn)行病毒滅活，相對(duì)地簡(jiǎn)化純化操作，通過減少確認(rèn)需求縮短開發(fā)時(shí)間。由于轉(zhuǎn)移體本身無毒性，生產(chǎn)是安全的。這種中和毒素活性的可替代方法將會(huì)生成一種循環(huán)毒素結(jié)合物質(zhì)，在毒素結(jié)合到靶點(diǎn)受體并產(chǎn)生神經(jīng)毒性之前捕獲毒素。
在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移體是被工程改造形式的mTf，其中結(jié)合到毒素的重鏈上的肽序列被工程改造到mTf表面環(huán)中。以這種方式，插入多種肽來生成能夠結(jié)合A到G的所有血清型的多價(jià)結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，采用親合成熟來提高通過噬菌體展示建立的隨機(jī)肽序列的特異性結(jié)合親合性。
包含抗原免疫調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)移體在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)一步修飾轉(zhuǎn)移體來包括至少一種免疫原性的或免疫調(diào)節(jié)的肽。一種或多種這種肽被結(jié)合到轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白中。包含一種或多種抗原性區(qū)域的轉(zhuǎn)移體不僅能夠結(jié)合其抗原，而且能夠在宿主中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。由于大部分宿主已經(jīng)用被插入到轉(zhuǎn)移體中的抗原決定區(qū)免疫并且對(duì)此具有記憶，由這些轉(zhuǎn)移體誘導(dǎo)的細(xì)胞的和激素的反應(yīng)比標(biāo)準(zhǔn)抗體強(qiáng)烈。
抗原性肽具有至少6個(gè)氨基酸的鏈長(zhǎng)度，優(yōu)選12個(gè)氨酸(假設(shè)在兩端具有3個(gè)氨基酸)，可以含有無限長(zhǎng)的氨基酸鏈或其補(bǔ)體，其特征在于存在相同或不同抗原或變態(tài)反應(yīng)原的其它表位。當(dāng)其不含有具有或不具有這種其它表位的額外鏈時(shí)，通常具有不超過50個(gè)氨基酸的氨基酸鏈。期望短鏈含有期望表位，優(yōu)選其氨基酸鏈長(zhǎng)度不超過40個(gè)，更加特別地不超過30個(gè)和更加特別地不超過20個(gè)氨基酸。最優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移體具有15-30個(gè)氨基酸的肽。
優(yōu)選地，往轉(zhuǎn)移體中插入誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的抗原性區(qū)域。更加優(yōu)選地，抗原性區(qū)是高度抗原性的肽，包括從被用作疫苗的蛋白質(zhì)中選擇的抗原性區(qū)域。在其它實(shí)施方案中，被插入到轉(zhuǎn)移體上或中的肽能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。例如，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體中包括抗體Fc區(qū)。
多肽的免疫原性可以被稱作定向抵抗少數(shù)免疫原性決定區(qū)的免疫反應(yīng)，僅限于多肽分子上的少數(shù)位點(diǎn)，(參見Crumpton，M.J.，記載于TheAntigens(Sela，M.編輯，Academic Press，New York，1974)中；Benjamini，E.等，Curr.Topics Microbiol.Immunol.5885-135(1972)；Atassi，M.Z.，Immunochemistry 12，423-438(1975))。制備抵抗對(duì)應(yīng)于多肽序列的短線性序列的化學(xué)合成肽的抗血清，已經(jīng)證明該血清能夠很好地與完整的多肽反應(yīng)，(參見Green，N.等，Cell 28，477-487(1982)；Bittle，J.L.等，Nature298，30-33(1982)；Dreesman等，Nature 295，158-160(1982)；Prince，A.M.，Ikram，H.，Hopp，T.P.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 79，579-582(1982)；Lerner，R.A.等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 78，3403-3407(1981)；Neurath，A.R.，Kent，S.B.H.，Strick，N.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 79，7871-7875(1982))。但是，甚至當(dāng)相互作用位點(diǎn)與天然蛋白質(zhì)的免疫原性決定區(qū)無關(guān)時(shí)，也會(huì)發(fā)生相互作用，(參見Green，N.，等，同上文)。相反，由于制備來抵抗天然蛋白質(zhì)的抗體清楚地定向于免疫原性決定區(qū)，因此，與這些抗體相互作用的肽必需含有至少一部分免疫原性決定區(qū)。
在免疫原性決定區(qū)已經(jīng)被清楚地作圖的少數(shù)蛋白質(zhì)的研究中，清楚表明決定區(qū)可以由單一序列構(gòu)成，(連續(xù)的)，或者由多個(gè)序列構(gòu)成，(不連續(xù)的)，通過如同多肽鏈的天然狀態(tài)折疊多肽鏈來將多肽鏈的線性上有距離的區(qū)域結(jié)合在一起，(參見Atassi，M.Z.，Immunochemistry 15，909-936(1978))。在為溶解酶的情況下，數(shù)個(gè)元件由僅一個(gè)氨基酸組成，而起作用的元件的大小在一個(gè)到與抗體結(jié)合位點(diǎn)的維度一致氨基酸的最大數(shù)目之間變化，可能達(dá)到5-6個(gè)(參見Atassi，M.Z.，同上文)。
通過如下的一種或多種方法，已經(jīng)在少數(shù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列中精確定位免疫原性決定區(qū)(1)在特定位點(diǎn)上進(jìn)行化學(xué)修飾之前和之后，對(duì)整個(gè)多肽或從中分離的肽片段進(jìn)行抗原性測(cè)定；(2)定位取代物的多肽氨基酸序列中的位置，通過在存在單克隆抗體時(shí)培養(yǎng)表達(dá)蛋白質(zhì)的病毒來選擇；和(3)合成和檢測(cè)與氨基酸序列同源的肽，懷疑具有免疫原性活性的區(qū)域。
美國專利4,554,101公開根據(jù)蛋白質(zhì)抗原或變態(tài)反應(yīng)原的最大局部平均親水性的位置，來確定蛋白質(zhì)抗原或變態(tài)反應(yīng)原的抗原性或變態(tài)反應(yīng)原性的決定區(qū)。此外，本專利教導(dǎo)制備對(duì)應(yīng)于最大局部平均親水性的位置的6個(gè)或更多個(gè)氨基酸的特定序列的合成肽。
采用技術(shù)人員已知的方法，例如在美國專利4,554,101中描述的那些方法，能夠獲得各種蛋白質(zhì)抗原或變態(tài)反應(yīng)原的抗原性肽，并插入到轉(zhuǎn)移體中。例如，抗原肽可以得自乙肝表面抗原、組織相容性抗原、流感血凝素、雞瘟病毒血凝素、rag weed變態(tài)反應(yīng)原Ra3和Ra5，以及如下病毒的抗原牛痘、EB病毒、polio、風(fēng)疹病毒(rubella)、細(xì)胞巨化病毒(cytomegalovirus)、天花病毒(small pox)、皰疹病毒(herpes)、單純I型和II型、黃熱病病毒(yellow fever)和其它病毒。
另外，可從如下寄生物中獲得抗原性肽攜帶瘧疾的生物體(P.Falciporum，P.Ovace，等)。血吸蟲(schistosomiasis)、盤尾絲蟲(Onchocerca Volvulus)以及其它線蟲寄生蟲，Tyrpanosomes、利什曼蟲(leishmania)、Chagas病蟲、阿米巴病蟲(amoebiasis)、十二指腸蟲(hookworm)等。此外，抗原性肽可以從如下細(xì)菌中獲得麻風(fēng)病菌(leprosy)、肺結(jié)核菌、梅毒細(xì)菌(syphilis)和淋病細(xì)菌(gonorrhea)等。
此外，采用已知方法，可以從如下病毒中獲得抗原性肽感染性缺肢(ectromelia)病毒、牛痘病毒、單純皰疹病毒、傳染性牛鼻氣管炎(rhinotracheitis)病毒、馬病毒性流產(chǎn)(馬流產(chǎn))病毒、牛惡性卡他(catarrh)病毒、貓科鼻氣管炎(rhinotracheitis)病毒、犬皰疹病毒、EB(Epstein Barr)病毒(伴隨傳染性單核細(xì)胞增多癥和Burkitt淋巴瘤)、Marek病病毒、綿羊肺腺瘤病(Jaagziekle)病毒、細(xì)胞巨化病毒、腺病毒類、人乳頭瘤(papilloma virus)、貓科panleucopaenia病毒、貂腸炎(Mink enteritis)病毒、非洲馬瘟病毒(血清型9)、藍(lán)舌病(Bluetongue)病毒(血清型12)、鮭魚的傳染性胰腺壞死病毒、禽肉瘤病毒(各種菌株)、禽類白血病病毒，visceral，鳥類內(nèi)臟的白血球組織增生病毒、鳥類成紅血球的白血球組織增生病毒，禽類白血病病毒erythroblastic，禽類白血病病毒，myeloblastic，成髓細(xì)胞骨骼石化癥(Osteopetrosis)病毒、新城疫病毒、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒(Parainfluenza)3、副流感病毒4、腮腺炎(Mumps)病毒、火雞(Turkey)病毒、CANADA/58、犬瘟熱(canine distemper)病毒、麻疹(measle virus)病毒、呼吸道合胞(Respiratory syncytial)病毒、黏(myxouirus)病毒、A型病毒例如人流感病毒、例如Ao/PR8/34、Al/CAM/46和A2/Singapore/1/57；雞瘟(Fowl plague)病毒；B型病毒例如B/Lee/40；狂犬病(Rabie)病毒；東方奎寧腦炎病毒(Eastern equinine encephalitis virus)；委內(nèi)瑞拉奎寧腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)；西方奎寧腦炎病毒(Western equine encephalitis virus)；黃熱病病毒；登革熱1型病毒(類型6)；登革熱2型病毒(類型5)；登革熱3型病毒；登革熱4型病毒；日本腦炎(encephalitis)病毒、科薩努爾森林(Kyasanur Forest)病毒；跳躍病病毒(Loupingill)、河谷(Murray Valley)腦炎病毒；鄂木斯克出血熱(omsk haemorrhagic fevor)病毒(類型1和11)；圣路易斯(St.Louis)腦炎病毒；人鼻(rhinoviruses)病毒、口蹄疫(Foot-and-mouth)病毒；脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus)1型；腸道病毒(Enterovirus)Polio 2；腸道病毒Polio 3；禽傳染性支氣管炎病毒；人呼吸道病毒；豬(swine)傳染性胃腸炎病毒；淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎(Choriomeningitis)病毒、拉沙熱(Lassa)病毒；Machupo病毒；Pichinde病毒；Tacaribe病毒；乳頭狀瘤病毒(Papillomavirus)。
一方面，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體包含選自已經(jīng)被用作疫苗的蛋白質(zhì)的抗原性肽，該蛋白質(zhì)例如來自polio和風(fēng)疹病毒。另一個(gè)方面，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體包含已知適合用于免疫接種的抗原性肽。
美國專利4,694,071和4,857,634描述適合用于免疫接著來抵抗由腸道病毒引起的疾病的合成肽。這些肽來源于脊髓灰質(zhì)炎病毒3型Sabin菌株的結(jié)構(gòu)性衣殼蛋白VP1。
美國專利4,708,871公開具有口蹄疫病毒的VP1蛋白的抗原性的合成肽，特征在于至少該肽的一部分選自VP1蛋白的5個(gè)、6個(gè)或7個(gè)抗原活性氨基酸的序列。
美國專利4,769,237提供用于制備保護(hù)動(dòng)物宿主免受小核糖核酸病毒的抗體的合成肽。特別地，該專利教導(dǎo)含有約20個(gè)氨基酸殘基的抗原性肽，這些氨基酸對(duì)應(yīng)于抗原性小核糖核酸病毒衣殼蛋白的特定區(qū)域，例如口蹄疫和脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliomyelitis)的VP1衣殼。
美國專利4,474,757教導(dǎo)用于制備抗各種流感病毒的疫苗的合成肽?？乖云蝸碓从诙喾N流感病毒的特異性決定區(qū)，在多種流感病毒的血凝素上。
美國專利5,427,792公開了風(fēng)疹病毒的E1和E2糖蛋白的線性和環(huán)狀肽，而美國專利5,164,481公開風(fēng)疹病毒的E1和C蛋白的線性和環(huán)狀肽。這些肽還可以用于生產(chǎn)抗風(fēng)疹病毒感染的疫苗。美國專利6,180,758和6,037,44公開具有對(duì)應(yīng)于風(fēng)疹病毒(RV)的結(jié)構(gòu)性蛋白特別是E1、E2或C蛋白的至少一個(gè)抗原決定區(qū)的氨基酸序列的合成肽，在抗風(fēng)疹的疫苗中的用途。
美國專利5,866,694提供誘導(dǎo)抗體的肽，該抗體中和遺傳分化的HIV-1分離物。這些肽的長(zhǎng)度為6個(gè)氨基酸，來源于gp160。
美國專利4,777,239公開17種合成肽，能夠誘導(dǎo)對(duì)某些期望的人乳頭狀瘤病毒(HPV)的抗體。這些肽是基于預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及由所選擇的開放閱讀框編碼的蛋白質(zhì)或肽的親水性來選擇的。二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性是根據(jù)Hopp，T.，等，Proc Natl Acad Sci(USA)(1981)783824；Levitt，M.，J MolBiol(1976)10459；和Chou，P.，等，Biochem(1974)13211公開的方法，從這些蛋白質(zhì)的氨基酸序列推導(dǎo)得出的。這些推導(dǎo)結(jié)果使得可以構(gòu)建誘導(dǎo)與完整蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體的肽。制備兩種類型的這種抗原性肽。被確定為對(duì)HPV-16或者其它HPV類型特異的肽區(qū)域-特異決定區(qū)，通過缺乏與其它HPV類型的同源性來獲得該肽，可以用于實(shí)質(zhì)上產(chǎn)生抗HPV-16或者其它HPV類型病毒的抗體，用于診斷、預(yù)防和治療目的。在目標(biāo)的各種類型的HPV中同源的肽區(qū)域可以被用作廣譜診斷劑和疫苗，產(chǎn)生作為廣譜診斷劑的抗體。
美國專利6,410,720公開來源于Mycobacterium vaccae的肽抗原，用于治療分枝桿菌感染，包括肺結(jié)核分枝桿菌和鳥分枝桿菌?？扇苄钥乖陬A(yù)先暴露于分枝桿菌的患者中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。
美國專利6,488,931提供包含含有卵巢癌蛋白的免疫性部分及其肽變體的多肽的疫苗，變體與免疫性部分區(qū)別在于一個(gè)或多個(gè)取代、刪除、添加和/或插入，使得實(shí)質(zhì)上沒有降低變體與卵巢癌蛋白特異性抗血清的反應(yīng)能力。
美國專利6,489,101公開具有免疫原性的包含至少乳腺癌蛋白的一部分多肽或其變體的多肽，制備用于治療和預(yù)防乳腺癌的疫苗。
美國專利6,447,778教導(dǎo)用于制備疫苗的肽偶聯(lián)物，該疫苗通過刺激細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的生成和增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。肽偶聯(lián)物包含與HIV的gp120主要中和結(jié)構(gòu)域(PND)gp41類似的氨基酸序列，和HIV的Nef(p27)以及增強(qiáng)免疫原性的載體。
美國專利6,419,931提供用于在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)對(duì)目標(biāo)抗原的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)的肽。典型地，CTL-誘導(dǎo)肽為7-15個(gè)殘基，更通常為9-11個(gè)殘基。CTL-誘導(dǎo)肽可用于本發(fā)明的組合物和方法中，從各種來源篩選，取決于被靶向的目標(biāo)抗原。CTL-誘導(dǎo)肽通常是小肽，來源于對(duì)目標(biāo)疾病的有效CTL反應(yīng)相應(yīng)的靶向抗原的所選擇的表位區(qū)。
美國專利6,419,931還涉及包含CTL-誘導(dǎo)肽以及能夠產(chǎn)生輔助T淋巴細(xì)胞(HTL)反應(yīng)的肽的組合物。HTL-誘導(dǎo)表位可以通過肽提供，該肽實(shí)質(zhì)上對(duì)應(yīng)于由CTL-誘導(dǎo)肽靶向的抗原，或者為對(duì)應(yīng)于被更廣泛識(shí)別的抗原的肽，誘導(dǎo)HTL的表位對(duì)組織相容性抗原的限制不特異。無論個(gè)體的表型是否為MHC II型，被大部分個(gè)體識(shí)別的肽(“混雜的”)是特別優(yōu)選的。HTL肽通常包含6-13個(gè)氨基酸，并且含有一個(gè)HTL-誘導(dǎo)表位。
CTL反應(yīng)是大部分哺乳動(dòng)物對(duì)大量各種病毒的免疫反應(yīng)的重要組成。美國專利6,419,931專利提供有效刺激對(duì)病毒感染細(xì)胞的CTL反應(yīng)的方法，以及在宿主哺乳動(dòng)物中治療或預(yù)防這種感染的方法。因此，本發(fā)明的組合物和方法可應(yīng)用于任何呈遞蛋白和/或肽抗原的病毒。這種病毒包括但是不限于如下，致病性病毒例如流感A和B病毒(FLU-A、FLU-B)、人免疫缺陷I型和II型病毒(HIV-I、HIV-II)、EB病毒(EBV)、嗜人T淋巴細(xì)胞的(或T-細(xì)胞白血病)病毒I型和II型病毒(HTLV-I、HTLV-II)、人乳頭狀瘤病毒1-18型(HPV-1到HPV-18)、風(fēng)疹病毒(RV)、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、腺病毒(AV)和單純皰疹病毒(HV)。此外，本專利可應(yīng)用于細(xì)胞巨化病毒(CMV)、脊髓灰質(zhì)炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、狂犬病病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒(rotavirus)和麻疹病毒的肽抗原。
以類似方式，美國專利6,419,931的組合物和方法可以被應(yīng)用于腫瘤相關(guān)蛋白，腫瘤相關(guān)蛋白是CTL表位的來源。這種腫瘤蛋白和/或肽，包括但是不限于，MAGE-1、-2和-3基因的產(chǎn)物、c-ErbB2(HER-2/neu)原癌基因的產(chǎn)物、可以被突變或者過度表達(dá)的腫瘤抑制和調(diào)控基因的產(chǎn)物例如p53、ras、myc和RB 1。將CTL反應(yīng)靶向腫瘤的組織特異性蛋白例如用于靶向前列腺癌的前列腺特異性抗原(PSA)和前列腺烷酸磷酸化酶(PAP)，以及靶向黑素瘤的酪氨酸酶。除了與細(xì)胞轉(zhuǎn)化到腫瘤細(xì)胞中相關(guān)的病毒相關(guān)蛋白例如EBNA-1外，HPV E6和E7也是可應(yīng)用的。已經(jīng)確定在來自一些上述蛋白質(zhì)的大量肽中存在MHC-結(jié)合基序，能夠高效地與被純化的MHC分子結(jié)合。
US6,407,063公開MAGE-1和MAGE-4的特異性抗原性肽，可以被用于制備疫苗來誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，以治療疾病。
美國專利5,462,871；5,558,995；5,554,724；5,585,461；5,591,430；5,554,506；5,487,974；5,530,096和5,519,117公開引起特異的T細(xì)胞反應(yīng)(CD4+或CD8+T細(xì)胞)的肽，例如腫瘤相關(guān)抗原性肽(TAA，也稱作腫瘤排斥抗原TRAS)。還可參見Van den Eynde和van der Bruggen(1997)以及Shawler等(1997)的評(píng)述。
美國專利6,368,852公開能夠在體內(nèi)或體外誘導(dǎo)CTL(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)為人胃細(xì)胞的肽。更加特別地，該肽能夠通過結(jié)合到HLA-A31抗原(人白細(xì)胞抗原)上將CTL呈遞到人胃細(xì)胞中。該肽可以用于制備用于治療和預(yù)防胃癌的疫苗。
來自Fc區(qū)的肽免疫球蛋白(Igs)由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，并分泌到血漿中。單體形式的Ig分子是基因約150kDa的糖蛋白，其多少有點(diǎn)象個(gè)Y。如較前面的討論，Y形由兩條重鏈和兩條輕鏈組成。重鏈分成羧基末端的Fc部分(Y的基部)，和氨基末端的Fab部分(Y的臂)。糖鏈被連接到分子的Fc部分。Ig分子的Fc部分僅由重鏈組成。IgG和IgM的Fc部分能夠結(jié)合到免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞的表面上的受體上，并刺激細(xì)胞因子釋放，該因子調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。Fc區(qū)含有與所有Igs相同的蛋白質(zhì)序列以及各個(gè)類別的獨(dú)特決定區(qū)。在相同種類中，這些區(qū)域在不同Ig分子中不會(huì)顯著地變化，被稱作恒定區(qū)。Fc片段的恒定區(qū)使分子具有生物學(xué)特性，例如結(jié)合受體和活化補(bǔ)體。
通過結(jié)合Fc區(qū)中的活性位點(diǎn)來活化Fc受體。因此，F(xiàn)c受體是抗體之間的重要連接，是免疫系統(tǒng)的保留部分。因此，結(jié)合到抗體的Fc區(qū)的活性位點(diǎn)上的Fc受體被稱作為“最后的共同路徑”，通過此調(diào)節(jié)抗體功能。如果被抗原結(jié)合的抗體不結(jié)合到Fc受體上，抗體不能夠激活免疫系統(tǒng)的其它部分，因此，仍然是無功能活性的。
任何能夠具有結(jié)合免疫球蛋白Fc受體的肽具有作為免疫調(diào)節(jié)劑的治療性用途，借助肽調(diào)節(jié)結(jié)合受體的能力。這種Fc受體“阻斷劑(blocker)”占據(jù)Fc受體的免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn)，從而“短路(short circuits)”免疫球蛋白的活化能力。
本發(fā)明提供包含來源于免疫球蛋白的Fc區(qū)的肽的轉(zhuǎn)移體，用于調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。本發(fā)明包括這種轉(zhuǎn)移體用于與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)相關(guān)的治療和診斷目的的用途。被插入到轉(zhuǎn)移體中的肽能夠通過結(jié)合到Fc受體上來刺激免疫反應(yīng)或者通過阻斷結(jié)合到Fc受體上來抑制免疫反應(yīng)。
美國專利4,816,449公開新的有用肽的序列，該肽能夠降低與自體免疫疾病、過敏和其它炎癥癥狀例如那些受哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的癥狀相關(guān)的炎癥反應(yīng)。特別地，要求保護(hù)的五肽可用于阻斷受花生四烯酸/白三烯-前列腺素路徑調(diào)節(jié)的炎癥。因此，該肽可以有效用于替換已知的抗炎制劑，例如類固醇，大部分類固醇具有有害的或有毒的副作用。雖然這些肽具有與人IgE的Ce3氨基酸320-324部分相似的結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為與IgE Fc受體結(jié)合相關(guān)，一般認(rèn)為，該抗炎癥活性的機(jī)制令人驚奇地不必包括阻斷Fc受體結(jié)合。相反，本發(fā)明的肽被證明直接地作用于花生四烯酸介導(dǎo)的炎癥路徑，從而降低炎癥。但是一般認(rèn)為，本發(fā)明的肽與IgE分子之間的形態(tài)相似性使得要求保護(hù)的肽可用于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的反應(yīng)，例如通過作為Fc受體位點(diǎn)阻斷劑起作用。要求保護(hù)的肽具有氨基酸序列A-B-C-D-E(SEQ ID NO5)，其中A為Asp或Glu；B為Ser、D-Ser、Thr、Ala、Gly或肌氨酸；C為Asp、Glu、Asn或Gln；D為Pro、Val、Ala、Leu或Ile；和E為Arg、Lys或Orn。
美國專利4,753,927描述新的有用的肽的序列，肽阻斷人IgG免疫復(fù)合物結(jié)合到人多形核嗜中性粒細(xì)胞(PMNs)上的IgG Fc受體上，阻斷IgG和IgE免疫復(fù)合物結(jié)合到單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(MMs)和其它白細(xì)胞上的IgG和IgEFc受體上。本專利提供通過阻斷免疫復(fù)合物結(jié)合到免疫球蛋白Fc受體上，調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物中的免疫反應(yīng)的方法，包括施用包含選自氨基酸序列-Pro-Asp-Ala-Arg-His-Ser-Thr-Thr-Gln-Pro-Arg-(SEQ ID NO6)部分的肽。本專利還教導(dǎo)這種肽用于降低人的過敏反應(yīng)來減少免疫復(fù)合物介導(dǎo)的炎癥和組織破壞的用途。
根據(jù)活性位點(diǎn)肽所結(jié)合的特定類型的Fc受體，該肽可能刺激或抑制免疫功能。如果Fc受體屬于被結(jié)合到Fc區(qū)激活的類型，或者，可替代地，如果Fc活性位點(diǎn)肽刺激受體，則發(fā)生刺激。所產(chǎn)生的刺激的類型包括，但是不限于，由抗體Fc區(qū)-Fc受體結(jié)合直接或間接調(diào)節(jié)的功能。這種功能的例子包括，但是不限于，由某些類型的白細(xì)胞(多核形噬中性粒細(xì)胞)、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的噬菌作用的刺激；巨噬細(xì)胞活化、抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)；天然殺傷(NK)細(xì)胞活性；B和T淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育，淋巴細(xì)胞分泌淋巴細(xì)胞因子(具有殺死或免疫調(diào)節(jié)活性的分子)。
本發(fā)明包括包含與Fc受體相互作用并刺激免疫系統(tǒng)功能的肽的轉(zhuǎn)移體的用途，包括上面所列舉的那些肽。這些轉(zhuǎn)移體在治療疾病中具有治療用途，疾病例如由細(xì)菌、病毒或真菌引起的傳染性疾病，由于先天的或后天的條件導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)缺陷的癥狀，癌癥和人或動(dòng)物的許多其它病痛。這種免疫刺激還可以用于加強(qiáng)機(jī)體對(duì)作為疫苗施用的特定注射的或口服施用的物質(zhì)的保護(hù)性細(xì)胞的或抗體的反應(yīng)。該列舉僅僅提供免疫刺激具有確定的治療有效性的疾病或癥狀的代表性例子。
如果活性位點(diǎn)肽結(jié)合到特定的Fc受體上，該受體不能夠僅通過結(jié)合到Fc區(qū)上來激活，則可能發(fā)生抑制免疫系統(tǒng)功能。通常僅當(dāng)抗原-抗體凝集物或免疫復(fù)合物的幾個(gè)Fc區(qū)同時(shí)結(jié)合到幾個(gè)Fc受體上使它們被“交聯(lián)”時(shí)，這種Fc區(qū)被激活。這種通過幾個(gè)Fc區(qū)交聯(lián)的Fc受體似乎是激活特定類型Fc受體所需的重要信號(hào)。通過結(jié)合和阻斷這種Fc受體，活性位點(diǎn)肽阻止免疫復(fù)合物或抗原-抗體凝集物中的Fc受體結(jié)合到受體上，從而阻斷Fc受體活化。
本發(fā)明包括包含與Fc受體相互作用來抑制免疫系統(tǒng)功能的肽的轉(zhuǎn)移體。這些轉(zhuǎn)移體在治療疾病中具有治療用途，疾病例如過敏、包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性狼瘡紅斑的自體免疫疾病、特定類型的腎病、免疫性腸道疾病例如潰瘍性大腸炎和局部腸炎(Crohn病)、特定類型炎癥性肺部疾病例如先天性肺纖維化和超敏性肺炎、特定類型脫髓鞘神經(jīng)病例如多發(fā)性硬化、自體免疫溶血性貧血、后天(自體免疫)血小板生成紫癜、特定類型內(nèi)分泌疾病例如Grave病或Hashimoto甲狀腺炎和特定類型心臟病例如風(fēng)濕熱。免疫抑制在預(yù)防有害的免疫“排斥”反應(yīng)中還具有治療作用，在器官抑制或在用于治療特定白血病或再生障礙性貧血的骨髓細(xì)胞移植中發(fā)生免疫“排斥”反應(yīng)。該列舉的僅僅提供已知免疫抑制具有治療用途的疾病或癥狀的代表性例子。
Johnson和Thames(J.Immunol.，117，1491(1975))以及Boackle，Johnson和Caughman(Nature，282，742(1979))發(fā)現(xiàn)，當(dāng)來源于人IgGl的aa(氨基酸)274-281(Lys-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly，SEQ ID NO7)上的CH2的序列的肽被吸附到紅血球上時(shí)，具有實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)的激活活性。特別地，具有aa(氨基酸)序列(Lys-Ala-Asp-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly，SEQ ID NO8)的肽在激活Clq-介導(dǎo)的細(xì)胞溶解中，與由熱聚集IgG形成的免疫復(fù)合物一樣有效。前面提及的研究人員將這種活性歸結(jié)為肽能夠作為Clq Fc受體的活性結(jié)合位點(diǎn)。其它合成肽具有來源于IgG的該區(qū)域或IgM的CH4的aa487-491區(qū)(Glu-Trp-Met-Gln-Arg，SEQ ID NO9)。
后來，Prystowsky，等(Biochemistry，20，6349(1981))以及Lukas，等(J.Immunol.，127，2555(1981))證明，來自aa281-292的緊鄰CH2區(qū)的肽是C1-介導(dǎo)的溶血的抑制劑。特別地，與 IgG，CH2殘基281-290(Gly-Val-Gln-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys，SEQ ID NO10)和aa282-292(Val-Gln-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-OH，SEQ ID NO11)相同的肽作為抑制劑與完整的單體IgG一樣有活性。其它肽，例如aa275-290(Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Gln-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys，SEQ IDNO12)，以及aa275-279(Ac-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val，SEQ ID NO13)、aa289-292(Thr-Lys-Pro-Arg，SEQ ID NO14)的活性較低。
吞噬作用激素(Tuftsin)是一種四肽，具有序列Thr-Lys-Pro-Arg(SEQ IDNO14)，存在于所有人IgG亞類的第二恒定區(qū)中，在豚鼠IgG的aa289-292中。美國專利3,778,426證明，吞噬作用激素通過粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞體外刺激噬菌作用。此外，吞噬作用激素被證明能夠刺激ADCC、天然殺傷(NK)細(xì)胞活性、巨噬細(xì)胞依賴的T細(xì)胞訓(xùn)導(dǎo)、體外和體內(nèi)的T細(xì)胞依賴和獨(dú)立的抗原的抗體合成。Ratcliffe和Stanworth(Immunol.Lett.，4，215(1982))的研究表明，吞噬作用激素競(jìng)爭(zhēng)性地抑制人IgG結(jié)合到人單核細(xì)胞的IgG Fc受體上，吞噬作用激素結(jié)合到IgG Fc受體上。
Morgan等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，5388(1982))公開了與IgG aa335-358相同的24個(gè)殘基的肽，能夠非特異性地激活淋巴細(xì)胞。該肽被證明能夠誘導(dǎo)多克隆B細(xì)胞增殖、抗原特異性抗體反應(yīng)和天然殺傷(NK)細(xì)胞介導(dǎo)的溶解作用。該肽(Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Ser-Arg-Glu-Glu-Met，SEQ ID NO15)和缺乏羧基端甲硫氨酸的23個(gè)殘基的肽可能通過結(jié)合到IgG的淋巴細(xì)胞的Fc受體上來起作用。
Ciccimarra，等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72，2081(1975))報(bào)導(dǎo)來自人IgG的十肽的序列，其能夠阻斷IgG結(jié)合到人單核細(xì)胞IgG Fc受體上。該肽與IgGaa407-416(Tyr-Ser-Lys-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Arg，SEQ ID NO16)相同。
Ratcliffe和Stanworth(Immunol.Lett.，4，215(1982))證明，與IgG aa295-301(Gln-Tyr-Asp-Ser-Thr-Tyr-Arg，SEQ ID NO17)相同的肽能夠微弱地阻斷IgG結(jié)合到人單核細(xì)胞IgG Fc受體上。相反，IgG，CH2的相關(guān)肽，殘基aa289-301不具有單核細(xì)胞IgG阻斷活性。
Hamburger描述一種具有來源于人IgE C亞基ε3的320-324的五肽(Asp-Ser-Asp-Pro-Arg，SEQ ID NO18)能夠抑制約90％的局部皮膚過敏反應(yīng)(Prausnitz-Kustner)(Hamburger，Science，189，389(1975)以及美國專利4,171,299和4,161,322)。后來證明，通過皮下路徑注射這種肽后，抑制人中的系統(tǒng)性過敏疾病。研究表明，該肽對(duì)人嗜堿細(xì)胞的IgE Fc受體具有極高的親合性，能夠阻斷人多達(dá)70％的IgE結(jié)合到嗜堿細(xì)胞的IgE Fc受體上(Plummer，等，F(xiàn)ed.Proc.，42，713(1983))。所觀察到的這種肽在人體中阻斷系統(tǒng)性過敏疾病的能力是由于該肽能夠結(jié)合到細(xì)胞IgE Fc受體上(Hamburgr，AdV.Allergology Immunol.(Pergamon PressNew York，1980)，591-593)。
Hamburger報(bào)導(dǎo)，來源于C∈4的aa476-481的六肽(Pro-Asp-Ala-Arg-His-Ser，SEQ ID NO19)能夠阻斷IgE結(jié)合到人類淋巴母細(xì)胞系(wil-2wt)上(Hamburger，Immunology，38，781(1979))。先前，這種肽被暗示用作用于阻斷IgE結(jié)合到人嗜堿性細(xì)胞IgE Fc受體的試劑(美國專利4,161,522)。
Stanworth(Mol.Immunol.，19，1245(1982))描述一種具有與人IgE的Ce4的aa505-515上一部分相同的序列的十肽(Val-Phe-Ser-Arg-Leu-Glu-Val-Thr-Arg-Ala-Glu，SEQ ID NO20)，導(dǎo)致125I-人IgG顯著地結(jié)合到小鼠巨噬細(xì)胞上。
Stanworth，等證明，一些與人IgE的C∈4的部分相同的序列的肽，aa495-506(Pro-Arg-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe，SEQ ID NO21)及其小的衍生物能夠引起人和嚙齒類肥大細(xì)胞發(fā)生脫粒，從而可以用于變應(yīng)性脫敏治療。(Biochem，J.，180，665(1979)；Biochem，J.，181，623(1979)；以及歐洲專利公開EP0000252)。
Sarmay等(Mol.Immunol.，1988，25(11)1183-8)總結(jié)了由Cγ2或Cγ3結(jié)構(gòu)域的表面暴露殘基組成的合成肽對(duì)人B淋巴細(xì)胞活化周期的不同階段作用的結(jié)果。CH2(289Thr-301Arg)和CH3(407Tyr-416Arg)肽以及完整的Fc片段增強(qiáng)PWM或PMA+CaI激活的淋巴細(xì)胞合成IgM。這種影響作用于早期階段的B細(xì)胞活化。用Fc片段或CH2肽培養(yǎng)分離的靜止B細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞體積變大和HLA-DR抗原的表達(dá)。另一方面，LIF生成受CH2和CH3肽的誘導(dǎo)。已經(jīng)證明Fc肽誘導(dǎo)從單核細(xì)胞釋放IL-1。這種結(jié)果表明，CH2和CH3結(jié)構(gòu)域肽通過激活靜止B細(xì)胞，使細(xì)胞對(duì)其它刺激更加敏感；此外，通過促使釋放IL-1提高體液反應(yīng)來部分地直接起作用。
Sheridan等(J Pept Sci1999，5(12)555-62)教導(dǎo)固相合成大量來自IgG Fc的分支二硫基肽，Ac-F-C*-A-K-V-N-N-K-D-L-P-A-P-I-E-K(Ac-E-L-L-G-G-P-S-V-F)-C*-I-NH2。這些肽結(jié)合IgG的后端鉸鏈區(qū)和最接近的β-發(fā)卡環(huán)，都可能結(jié)合到FcγRI上。環(huán)狀鉸鏈-環(huán)肽可用于從單核細(xì)胞系上表達(dá)的FcγRI上去除IgG2a，IC50為40mM，而線性形式的這種肽是無活性的。Fc鉸鏈-環(huán)肽可能具有非mAb高親合性，是FcγRI的免疫調(diào)節(jié)配基。
使用轉(zhuǎn)鐵蛋白/TNF-SCA轉(zhuǎn)移體的方法一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的一個(gè)或多個(gè)抗體可變區(qū)或CDRs以及轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的轉(zhuǎn)移體。本發(fā)明包括這種轉(zhuǎn)移體用于治療和診斷目的的用途。與產(chǎn)生TNF-α相關(guān)的嚴(yán)重疾病狀態(tài)的例子包括，但是不限于，如下膿毒性休克；內(nèi)毒性休克；與細(xì)菌感染相關(guān)的惡病質(zhì)綜合癥(例如肺結(jié)核、腦膜炎)、病毒性感染(例如AIDS)、寄生蟲感染(例如瘧疾)以及瘤形成疾病(neoplasmtic disease)；自體免疫性疾病，包括一些形式的關(guān)節(jié)炎(特別是類風(fēng)濕和退行性的)；以及與用于防止移植排斥的處理相關(guān)的副作用。如下文所討論，TNF-α與各種疾病狀態(tài)或癥狀相關(guān)。本發(fā)明包括抗-TNF的轉(zhuǎn)移體在治療和診斷各種疾病中的用途。
TNF-αTNF-α是一種多效的炎癥細(xì)胞因子。機(jī)體中的大部分器官似乎都受TNF-α影響。該細(xì)胞因子具有生長(zhǎng)刺激以及生長(zhǎng)抑制的特性。該細(xì)胞因子似乎還具有自調(diào)控的特性。例如，在炎癥過程中，TNF-α誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞增殖，但是還可能結(jié)合到TNF-R55受體上來誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞凋亡(Murray等，1997，Blood，90(7)2772-2783)。這種細(xì)胞因子由多種類型的細(xì)胞產(chǎn)生，特別是巨噬細(xì)胞。雖然該細(xì)胞因子在病理狀態(tài)下的作用還未被徹底闡明，TNF-α似乎是損傷和病態(tài)級(jí)聯(lián)中的主要調(diào)節(jié)物。
雖然許多因子引起炎癥反應(yīng)，但是TNF-α在調(diào)節(jié)該過程中起主要作用。TNF-α的細(xì)胞作用包括生理的、細(xì)胞毒性的和炎癥性的作用。在動(dòng)態(tài)平衡中，TNF-α影響有絲分裂發(fā)生、分化和免疫調(diào)節(jié)，而在贅生性細(xì)胞系中引起凋亡性細(xì)胞死亡。TNF-α的細(xì)胞毒性獨(dú)立于重新的轉(zhuǎn)錄和翻譯而發(fā)生，并且包括由線粒體產(chǎn)生氧自由基，氧自由基主要在半泛醌部位上產(chǎn)生。
TNF-α的生物學(xué)作用取決于其濃度和產(chǎn)生部位在低濃度下，TNF-α可能產(chǎn)生期望的穩(wěn)定和預(yù)防性功能，而在高濃度下，系統(tǒng)性或在特定組織中，TNF-α與其它細(xì)胞因子，特別是白細(xì)胞介素-1(IL-1)產(chǎn)生增效作用，使多種炎癥反應(yīng)惡化。
已經(jīng)證明，如下行為由TNF-α(以及IL-1)引起發(fā)燒、深度睡眠、血液動(dòng)力學(xué)的休克、急性期蛋白生成升高、白蛋白生成下降、血管內(nèi)皮細(xì)胞活化、主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子表達(dá)增加、脂蛋白脂酶減少、細(xì)胞色素P450減少、血漿鋅和鐵減少、成纖維細(xì)胞增殖、滑液細(xì)胞膠原酶增加、環(huán)狀加氧酶增加、T細(xì)胞和B細(xì)胞活化，誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌、TNF-α本身、IL-1、IL-6和IL-8。實(shí)際上，研究表明，這些細(xì)胞因子的生理學(xué)作用是相關(guān)聯(lián)的(Philip等，Nature(1986)323(6083)86-89；Wallach.，D.等，J.Immunol.(1988)140(9)2994-2999)。雖然關(guān)于TNF-α如何產(chǎn)生作用的詳細(xì)內(nèi)容是未知的，一般認(rèn)為多種作用與TNF-α能夠刺激細(xì)胞由細(xì)胞膜的花生四烯酸生成前列腺素和白三烯相關(guān)。
作為多效作用的結(jié)果，TNF-α被暗示在機(jī)體的多個(gè)不同器官中參與各種病理狀態(tài)。在血管中，TNF-α造成出血性休克、下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞凝血調(diào)節(jié)蛋白并增強(qiáng)促凝血活性。導(dǎo)致白細(xì)胞以及可能血小板附著到血管壁上，從而促進(jìn)導(dǎo)致動(dòng)脈硬化癥以及脈管炎的作用。
TNF-α激活血液細(xì)胞，引起嗜中性粒細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞以及T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的粘附。通過誘導(dǎo)IL-6和IL-8，TNF-α提高炎癥性細(xì)胞的化學(xué)趨向性，并增強(qiáng)它們滲透到組織中。因此，TNF-α在自體免疫性疾病、變應(yīng)性反應(yīng)和移植排斥中起組織破壞的作用。
TNF-α調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的新陳代謝活性，并且引起消瘦和惡病質(zhì)伴隨的癌癥、慢性感染、慢性心力衰竭和慢性炎癥，也被稱作惡液質(zhì)素。惡病質(zhì)是嚴(yán)重消瘦，與癌癥和其它疾病相關(guān)(Kern，等J.Parent.Enter.Nutr.12286-298(1988))。惡病質(zhì)包括漸進(jìn)性體重下降、食欲減退和對(duì)惡性腫瘤生長(zhǎng)相應(yīng)而持續(xù)體質(zhì)受損。主要的生理紊亂與相對(duì)于能力消化的食物攝取下降相關(guān)。惡病質(zhì)狀態(tài)引起大部分的發(fā)病率和死亡率。TNF-α能夠調(diào)節(jié)癌癥、傳染性病理和其它代謝分解狀態(tài)中的惡病質(zhì)。TNF-α還在神經(jīng)性食欲缺乏中起作用，通過抑制食欲而提高脂肪組織的消耗。
TNF-α對(duì)骨骼肌和心肌產(chǎn)生代謝作用。還對(duì)肝臟產(chǎn)生顯著作用抑制白蛋白和細(xì)胞色素P450的代謝，提高纖維蛋白原、1-酸糖蛋白和其它急性期蛋白的生成。還會(huì)導(dǎo)致腸道壞死。
在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，TNF-α跨越血腦屏障，引起發(fā)燒，延長(zhǎng)睡眠和食欲減退。TNF-α濃度升高與多發(fā)性硬化相關(guān)。還會(huì)導(dǎo)致腎上腺出血，影響類固醇激素生成，增加皮膚中的膠原酶和PGE-2，并且通過激活破骨細(xì)胞而破壞骨和軟骨。
已經(jīng)證明，TNF-α在體外促進(jìn)和增加人免疫缺陷病毒(HIV)的復(fù)制(Matsuyama，T.等，J.Virol.(1989)63(6)2504-2509；Michihiko，S.等，Lancet(1989)1(8648)1206-1207)，并刺激HIV-1基因表達(dá)，因而可能引起臨床AIDS在后期感染HIV-1的個(gè)體中發(fā)展(Okamoto，T.等，AIDS Res.Hum.Retroviruses(1989)5(2)131-138)。
還已經(jīng)證明，TNF-α還參與對(duì)各種寄生蟲的生長(zhǎng)和分化的控制。感染宿主后，寄生蟲能夠誘導(dǎo)分泌不同細(xì)胞因子，例如TNF，可能影響疾病過程。例如，在為瘧疾的情況下，TNF-α在某些情況下可以是具有保護(hù)性的，例如在嚙齒類瘧疾中抑制寄生蟲存活(Clark等，1987，J Immunol 1393493-3496.；Taverne等，1987，Clin Exp Immunol 671-4)。
TNF-α抗體任何來自結(jié)合TNF抗體的CDR、VH或VL區(qū)可以被用于制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體。TNF的多克隆鼠抗體被公開在Cerami等(EPO專利申請(qǐng)公開0212489，1987年3月4日)中。這種抗體被認(rèn)為可用于診斷免疫分析，以及用于治療細(xì)菌感染中的休克。Rubin等(EPO專利申請(qǐng)公開0218868，1987年4月22日)公開人TNF的鼠單克隆抗體，分泌這種抗體的雜交瘤，制備這種鼠抗體的方法，以及這種鼠抗體在TNF免疫分析中的用途。
Yone等(EPO專利申請(qǐng)公開0288088，1988年10月26日)公開抗TNF的鼠抗體，包括mAbs，以及它們?cè)诓±韺W(xué)的免疫分析中的用途，特別是在Kawasaki病理學(xué)和細(xì)菌感染中。患有Kawasaki病理的患者的體液(嬰兒急性發(fā)熱粘膜與皮膚淋巴結(jié)綜合癥；Kawasaki，Allergy 16178(1967)；Kawasaki，Shonica(Pediatrics)26935(1985))被認(rèn)為具有高水平的TNF，與病理學(xué)進(jìn)展相關(guān)(Yone等，如下文)。
其它研究人員已經(jīng)描述特異于重組人TNF的嚙齒類或鼠的mAbs，在體外具有中和活性(Liang等，Biochem.Biophys.Res.Comm.137847-854(1986)；Meager等，Hybridoma 6305-311(1987)；Fendly等，Hybridoma 6359-369(1987)；Bringman等，Hybridoma 6489-507(1987)；Hirai等，J.Immunol.Meth.9657-62(1987)；Moller等Cytokine 2162-169(1990))。這些mAbs中部分被用于對(duì)人TNF的表位進(jìn)行作圖，開發(fā)酶免疫分析(Fendly等，見下文；Hirai等，見下文；Moller等，見下文)并用于輔助重組TNF的純化(Bringman等，見下文)。
已經(jīng)證明在非人的哺乳動(dòng)物中，TNF的中和抗血清或mAbs消除不利的生理變化，并在實(shí)驗(yàn)性內(nèi)毒血癥和細(xì)菌尿中防止致死性攻擊后的死亡。這種作用已經(jīng)例如在嚙齒類的致死性分析和在靈長(zhǎng)類病理模型系統(tǒng)中被證明(Mathison等，J.Clin.Invest.811925-1937(1988)；Beutler等，Science 229869-871(1985)；Tracey等，Nature 330662-664(1987)；Shimamoto等，Immunol.Lett.17311-318(1988)；Silva，等，J.Infect.Dis.162421-427(1990)；Opal等，J.Infect.Dis.1611148-1152(1990)；Hinshaw等，Circ.Shock 30279-292(1990))。
Eck和Sprang公開可hTNF的假定受體結(jié)合座位(J.Biol.Chem.264(29)，17595-17605(1989)，他們確定TNF-α的受體結(jié)合座位由氨基酸11-13、37-42、49-57和155-157組成。
還報(bào)道了給患有嚴(yán)重的移植物抗宿主病理的患者施用鼠TNFmAb(Herve等，Lymphoma Res.9591(1990))。
美國專利5,656,272公開了對(duì)人TNF-α特異的抗-TNF抗體及其片段和區(qū)域，可用于體內(nèi)診斷和治療大量TNF-α介導(dǎo)的病理和癥狀例如Crohn病。
美國專利6,420,346公開治療個(gè)體的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的方法，該方法包括肌肉內(nèi)施用被可操作地連接到啟動(dòng)子上的編碼細(xì)胞因子例如TNF-α的免疫原性部分的外源多核苷酸，其中免疫原性部分的表達(dá)誘導(dǎo)產(chǎn)生所述免疫原性部分的抗體，其中所述抗體降低所述細(xì)胞因子的內(nèi)源細(xì)胞因子的體內(nèi)活性，來治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
Maini等描述了一種嵌合的TNF-α單克隆抗體infliximab在治療患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的患者的用途(Lancet，354(9194)1932-9(1999))。
含有轉(zhuǎn)移體的試劑盒在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供含有轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白，特別是轉(zhuǎn)移體的試劑盒，被修飾的轉(zhuǎn)移體包括免疫調(diào)節(jié)肽，這些肽可以被用于例如治療性、非治療性或診斷性的應(yīng)用。試劑盒包含具有標(biāo)簽的容器。合適的容器包括，例如瓶子、小瓶和試管。該容器可以用各種材料制備，例如玻璃或塑料。容器中裝有組合物，組合物包括轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白，優(yōu)選為轉(zhuǎn)移體，可有效用于治療性或非治療性的應(yīng)用，如上所述。組合物中的活性劑為抗體。容器上的標(biāo)簽指示該組合物用于特定的治療或者非治療性應(yīng)用，可能還指示體內(nèi)或體外使用的用法，如上所述的那些。
本發(fā)明的試劑盒通常包含上述的容器，以及一種或多種包含商業(yè)和使用者期望的物質(zhì)的容器，包括緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭、注射器和具有使用說明的包裝插入物。
無需進(jìn)一步描述，通過利用前面的描述和如下的說明性實(shí)施例，相信本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠執(zhí)行和利用本發(fā)明并實(shí)施要求保護(hù)的方法。例如，當(dāng)與未被融合狀態(tài)的治療性部分的可比較的活性相比時(shí)，技術(shù)人員能夠容易地確定本發(fā)明的融合蛋白構(gòu)建體的體外和體內(nèi)的生物活性。類似地，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定按照本發(fā)明的構(gòu)建體的血清半衰期和血清穩(wěn)定性。因此，如下的工作實(shí)施例特別地指示本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，不被解釋為以任何方式限制公開的其它權(quán)利。
實(shí)施例如下實(shí)施例描述用于制備包含結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì)的肽和轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白(mTf)的轉(zhuǎn)移體的方法。在轉(zhuǎn)鐵蛋白的N末端或C末端融合治療性肽(X或Y)例如單鏈抗體或抗體結(jié)合肽(X-Tf-Y)，使用或不使用接頭(L)(X-Tf-L-X、X-L-Tf-X、X-L-Tf-L-X)，使得可以開發(fā)二價(jià)藥物。可替代地，轉(zhuǎn)鐵蛋白的N末端或C末端的肽可以是不同的(X-Tf-L-Y、X-L-Tf-Y、X-L-Tf-L-Y)。
這方便了構(gòu)建被靶向的分子，例如在轉(zhuǎn)鐵蛋白分子的任何一端融合單鏈抗體和毒性肽。典型的應(yīng)用是靶向殺死癌癥細(xì)胞。此外，在N末端和C末端的SCA提供雙功能抗體，而轉(zhuǎn)鐵蛋白作為Fc鉸鏈。這提供了一種用于替代(人源化)單克隆抗體技術(shù)的成本效益技術(shù)。
如較早時(shí)所討論，在轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)構(gòu)中具有大量環(huán)，容易被修飾/替換來插入蛋白質(zhì)或肽，開發(fā)隨機(jī)肽插入物的可篩選文庫。
實(shí)施例1可以制備包含轉(zhuǎn)鐵蛋白分子和單鏈抗體的轉(zhuǎn)移體?？梢员蝗诤系睫D(zhuǎn)鐵蛋白的SCA的特別例子是抗TNF(腫瘤壞死因子)?？筎NF可以被用于治療各種炎癥性和自體免疫性疾病例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎?？梢詫NF-SCA融合到被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的N末端或C末端，通過這種方式，所編碼的TNF-SCA的N末端直接連接到轉(zhuǎn)鐵蛋白的C末端氨基酸上，或者TNF-SCA的C末端直接連接到轉(zhuǎn)鐵蛋白的N末端氨基酸上?？商娲?，可以插入肽接頭來使轉(zhuǎn)鐵蛋白和TNF-SCA之間更加分離，使兩個(gè)融合蛋白更具有空間靈活性。多個(gè)TNF-SCA例子被顯示在附圖4A-4B中。
通過將一個(gè)或多個(gè)拷貝的編碼SCA的核苷酸序列融合到Tf核苷酸序列上，制備SCA融合到Tf的N末端或C末端的融合蛋白，來制備被修飾的Tf(mTf)和TNF-SCA之間的融合蛋白。含有編碼mTf的載體，例如pREX0052被特別地設(shè)計(jì)來制備具有VH、VL或CDRs的mTf融合蛋白。特別地設(shè)計(jì)接頭和引物來將編碼VH、VL或CDRs的序列連接到含有mTf的載體上。
構(gòu)建抗TNFαSCA的mTfN末端和C末端融合物該方法的第一個(gè)步驟是在pREX0052的mTf的5′段或N末端的XbaI和KpnI位點(diǎn)之間插入接頭，隨后往載體中克隆VH和VL，生成pREX0066。在DNA接頭的兩端含有插入VH和VL的位點(diǎn)，DNA接頭在本實(shí)施例中編碼S(SGGG)3S(SEQ ID NO32)接頭肽。
XbaI/SacI-接頭-EcoRV/KpnI插入SacI-----+ctagataaaa gggaagtgaa actggagctc tggtggtggt tctggtggtg gttctggtggtatttt cccttcactt tgacctcgag accaccacca agaccaccac caagaccacc>>...............SG 接頭 .........
. . . . . . . . s s g g g s g g g s gEcoRV----+--tggttctgat atcaacctgg aagtgaaggt acaccaagacta tagttggacc ttcacttc.....>>
g g s d i n l e v k v上一條鏈SEQ ID NO22下一條鏈SEQ ID NO23氨基酸序列SEQ ID NO24然后，采用一系列重疊的合成寡核苷酸，分別生成VH和VL的DNA。VH被設(shè)計(jì)成具有5′XbaI位點(diǎn)和3′SacI位點(diǎn)，插入用XbaI/SacI剪切的pREX0066。確認(rèn)正確插入以及目標(biāo)DNA序列，生成的質(zhì)粒命名為pREX0067。將VL設(shè)計(jì)成具有5′EcoRV位點(diǎn)和3′KpnI位點(diǎn)，并插入到用EcoRV/KpnI剪切的pREX0067。確認(rèn)正確插入以及目標(biāo)DNA序列，生成的質(zhì)粒命名為pREX0068。
采用一對(duì)誘變PCR引物，然后修飾pREX0067中的完整SCA的5′和3′末端，使得生成的PCR產(chǎn)物可以通過SalI和HindIII位點(diǎn)被插入到mTf的C末端(pREX0052)中。確認(rèn)正確插入以及目標(biāo)DNA序列，生成的質(zhì)粒命名為pREX0069。
正向AGCCTGCACTTTCCGTCGACCTGAAGTGAAACTGGAAG(5′-3′)反向CAGTCATGTCTAAGCTTATTACTTCACTTCCAGGTTGG(5′-3′)SEQ ID NO25SEQ ID NO26用NotI消化，從pREX0068和pREX0069回收表達(dá)盒，并被插入到用NotI剪切的酵母載體pSAC35中，制備REX0070和pREX0071。它們用于在酵母中轉(zhuǎn)化和表達(dá)。
為了制備VH-mTf-VL融合構(gòu)建體，在3′端對(duì)pREX0067中的VH進(jìn)行修飾來插入KpnI位點(diǎn)。在5′端對(duì)pREX0068中的VL進(jìn)行修飾來插入SalI位點(diǎn)。然后順序?qū)⒈恍揎椀腣H和VL插入mTf(pREX0052)的5′和3′端，通過XbaI和KpnI位點(diǎn)在N末端插入VH(pREX0072)，通過SalI和HindIII在C末端插入VL(pREX0074)。然后通過NotI位點(diǎn)，將來自該載體的表達(dá)盒亞克隆到酵母載體中，例如pSAC35，生成pREX0077。
可替代地，VL可以在N末端而VH在C末端?？商娲兀瑔我坏腣H或VL可以在N末端或者單一VH或VL的可以在C末端。對(duì)該方案的改變，包括在VH或VL以及N末端或C末端之間使用S(SGGG)3S(SEQ ID NO24)接頭。可以構(gòu)建N末端和C末端都具有VH/VL的構(gòu)建體，其中VH/VL可以是相同的或抵抗不同靶點(diǎn)。類似地，N末端和C末端的單一的VH或VL能夠抵抗不同靶點(diǎn)。
抗TNFαVH翻譯產(chǎn)物 240個(gè)氨基酸分子量 25964.1等電點(diǎn)(pI) 5.77EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFIFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRFTISRDDSKSAVYLQMTDLRTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTLTVSSSGGGSGGGSGGGSDILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESMSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINTVESEDIADYYCQQSHSWPFTFGSGTNLEVK(SEQ ID NO27)
VHDNA序列1gaagtgaaac tggaagaaag cggcggcggc ctggtgcagc cgggcggcag catgaaactgcttcactttg accttctttc gccgccgccg gaccacgtcg gcccgccgtc gtactttgac>>...................... 抗 TNFalpha VH........................>
e v k l e e s g g g l v q p g g s m k l61 agctgcgtgg cgagcggctt tatttttagc aaccattgga tgaactgggt gcgtcagagctcgacgcacc gctcgccgaa ataaaaatcg ttggtaacct acttgaccca cgcagtctcg>....................... 抗 TNFalpha VH........................>
s c v a s g f i f s n h w m n w v r q s>>....CDR1....>>
121 ccggaaaaag gcctggaatg ggtggcggaa attcgtagca aaagcattaa cagcgcgaccggcctttttc cggaccttac ccaccgcctt taagcatcgt tttcgtaatt gtcgcgctgg>....................... 抗 TNFalpha VH........................>
p e k g l e w v a e i r s k s i n s a t>>..............CDR2...............>
181 cattatgcgg aaagcgtgaa aggccgtttt accattagcc gtgatgatag caaaagcgcggtaatacgcc tttcgcactt tccggcaaaa tggtaatcgg cactactatc gttttcgcgc>....................... 抗 TNFalpha VH........................>
h y a e s v k g r f t i sr d d s k s a>..........CDR2.........>>
PstI------+241 gtgtatctgc agatgaccga tctgcgtacc gaagataccg gcgtgtatta ttgcagccgtcacatagacg tctactggct agacgcatgg cttctatggc cgcacataat aacgtcggca>....................... 抗 TNFalpha VH........................>
v y l q m t d l r t e d t g v y y c s r301 aactattatg gcagcaccta tgattattgg ggccagggca ccaccctgac cgtgagcttgataatac cgtcgtggat actaataacc ccggtcccgt ggtgggactg gcactcg>...................... 抗 TNFalpha VH.....................>>
n y y g s t y d y w g q gt t l t v s>>..........CDR3...........>>
VHDNA序列＝SEQ ID NO28抗TNFαVH序列＝SEQ ID NO29
VLDNA序列1gatattctgc tgacccagag cccggcgatt ctgagcgtga gcccgggcga acgtgtgagcctataagacg actgggtctc gggccgctaa gactcgcact cgggcccgct tgcacactcg>>....................... 抗 TNFalpha.........................>
d i l l t q s p a i l s v s p g e r v s61 tttagctgcc gtgcgagcca gtttgtgggc agcagcattc attggtatca gcagcgtaccaaatcgacgg cacgctcggt caaacacccg tcgtcgtaag taaccatagt cgtcgcatgg>........................ 抗 TNFalpha.........................>
f s c r a s q f v g s s ih w y q q r t>>..............CDR1...............>>
121 aacggcagcc cgcgtctgct gattaaatat gcgagcgaaa gcatgagcgg cattccgagcttgccgtcgg gcgcagacga ctaatttata cgctcgcttt cgtactcgcc gtaaggctcg>........................ 抗 TNFalpha.........................>
n g s p r l l i k y a s e s m s g i p s>>.........CDR2.........>>
181 cgttttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga gcattaacac cgtggaaagcgcaaaatcgc cgtcgccgtc gccgtggcta aaatgggact cgtaattgtg gcacctttcg>........................ 抗 TNFalpha.........................>
r f s g s g s g t d f t l s i n t v e s241 gaagatattg cggattatta ttgccagcag agccatagct ggccgtttac ctttggcagccttctataac gcctaataat aacggtcgtc tcggtatcga ccggcaaatg gaaaccgtcg>........................ 抗 TNFalpha.........................>
e d i a d y y c q q s h s w p f t f g s>>...........CDR3...........>>
301 ggcaccaacc tggaagtgaa accgtggttgg accttcactt t>.... 抗 TNFalpha...>>
g t n l e v kV1DNA序列＝SEQ ID NO30抗TNFαV1序列＝SEQ ID NO31肽接頭Ser (Ser Gly Gly Gly)3Ser (SEQ ID NO32)tct (tct ggt ggt ggt)3tct (SEQ ID NO33)tcttctg gtggtgcttc tggtggtggt tctggtggtg gttct(SEQ ID NO33)agaagac caccaccaag accaccacca agaccaccac caaga(SEQ ID NO34)s s g g g s g g g s g g g s(SEQ ID NO32)實(shí)施例2制備包含轉(zhuǎn)鐵蛋白和CDRs的轉(zhuǎn)移體。這些轉(zhuǎn)移體由相對(duì)短的肽鏈組成?？贵w在其重鏈中通常具有3個(gè)CDRs，在輕鏈中有3個(gè)CDRs。將一個(gè)或多個(gè)能夠與抗原相互作用的抗體的CDRs融合到被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白中，使轉(zhuǎn)鐵蛋白分子具有抗原結(jié)合活性。CDRs可以被融合到N末端、C末端、N末端和C末端上，或者被遺傳改造到轉(zhuǎn)鐵蛋白的內(nèi)部支架中。來自抗TNF抗體的CDR序列的例子顯示在TNF-SCA中附圖4A-4B。可以將對(duì)應(yīng)于一個(gè)或多個(gè)CDRs的cDNA與被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白融合，使轉(zhuǎn)鐵蛋白具有TNF結(jié)合活性。
CDR(s)的插入檢測(cè)人Tf的N末端結(jié)構(gòu)域(PDB標(biāo)識(shí)為1A8E)和全長(zhǎng)Tf模型AAAaoTfwo，采用ExPasy Swiss Model Server以兔子模型1JNF作為模板來制備，顯示存在大量用于插入肽的潛在位點(diǎn)，直接插入或者通過替換大量殘基。這些位點(diǎn)重復(fù)在C末端結(jié)構(gòu)域的相當(dāng)位置上。

這些環(huán)中的兩個(gè)是插入CDR肽特別是CDR，H3的位點(diǎn)，N1His289(286-292)或N2Asp166(162-170)。由于N末端結(jié)構(gòu)域和C末端結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)相似性，C末端結(jié)構(gòu)域上的等價(jià)插入位點(diǎn)(C1489-495，C2623-628)可以被用于制備多價(jià)化合分子。這采用上面指出的N末端結(jié)構(gòu)域或C末端結(jié)構(gòu)域上的潛在插入位點(diǎn)或者這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域上的位點(diǎn)的組合來實(shí)現(xiàn)。
N2140 PEPRKPLEKA VANFFSGSCA PC CQLCP---- -GCGCSTLNQC1472 NH------CR FDEFFSEGCA PG CKLCMGSGL NLCEPNNKEGN2140 PEP KPLEKA VAN GS C Q P C - -- STL --QC1472 NHC ------ FDE EG G E M S L NL EPN KEGN1277 D-KSKE--FQ LF L LFKDSAHGFL KVPPRMDAKM YLGYEYVTAIC2611 NVTDCSGNFC LF L LFRDDTVCLA KLHDRNTYEK YLGEEYVKAVN1277 --- K KE Q K SAHGFL VPP MDAKM Y T IC2611 NVT C GN C R DTVCLA LHD NTYEK E K VN2SEQ ID NO35C1SEQ ID NO36N1SEQ ID NO37C2SEQ ID NO38檢測(cè)得自Genbank的抗TNFα的多個(gè)SCA的序列，得到如下CDRs(表3)。這些肽中的任何一個(gè)可以被用作結(jié)合肽(參見例如，Misawa等，2002，F(xiàn)EBSLett.52577；Steinbergs等，1996，Hum.Antibodies Hybridomas，7(3)106；Jarrin等，1994，F(xiàn)EBS Lett.354169)。但是，作為線性肽，結(jié)合親合性通常低于產(chǎn)生它們的抗體。通過將肽插入到另一個(gè)蛋白質(zhì)的支架中，能夠恢復(fù)部分或全部的這種親合性。以mTf作為支架，可能結(jié)合來自相同或其它來源的其它CDRs，存在在多個(gè)位點(diǎn)插入的可能性。
在缺乏任何其它數(shù)據(jù)時(shí)，對(duì)CDRs與遺傳系序列(germline sequence)的分化程度的檢測(cè)可以作為所結(jié)合的各個(gè)CDRs的相對(duì)重要性或作用的指示。
表3 關(guān)鍵詞VH來自合成的ScFv登錄號(hào)AF288521的VHPVH來自美國專利5,698,195的VH33來自登錄號(hào)AB027433的VH35來自登錄號(hào)AB027435的VH37來自登錄號(hào)AB027437的VH39來自登錄號(hào)AB027439的VH深色陰影＝相同淺色陰影＝相似作為例子，將上述來自P VH的CDR3插入到mTF的N末端結(jié)構(gòu)域的Thr165和Asp 166之間。采用優(yōu)化為酵母表達(dá)的密碼子，將序列反譯為DNA。
aat tat tat ggt tct act tat gat tat(SEQ ID NO80)NYYGSTYDY(SEQ ID NO44)以pREX0056作為模板，誘變引物P0109和引物P0025，誘變引物P0110和引物P0012，生成兩種PCR產(chǎn)物。隨后用外引物P0025和P0012將它們連接在一起。使得在Thr165和Asp166之間插入CDR H3。然后用BamHI和EcoRI消化來自該連接反應(yīng)的PCR產(chǎn)物，再插入到也用BamHI和EcoRI消化的pREX0056中。然后通過NotI消化，取出來自生成的質(zhì)粒pREX0079的表達(dá)盒，插入用NotI消化的酵母載體中，例如pSAC35，制備pREX0080，轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中來進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)。
BamHI-+----541 agcctgtggt ggcagagttc tatgggtcaa aagaggatcc acagactttc tattatgctgtcggacacca ccgtctcaag atacccagtt ttctcctagg tgtctgaaag ataatacgac>..............................mTf..............................>
k p v v a e f y g s k e d p q t f y y a601 ttgctgtggt gaagaaggat agtggcttcc agatgaacca gcttcgaggc aagaagtcctaacgacacca cttcttccta tcaccgaagg tctacttggt cgaagctccg ttcttcagga>..............................mTf..............................>
v a v v k k d s g f q m n q l r g k k s661 gccacacggg tctaggcagg tccgctgggt ggaacatccc cataggctta ctttactgtgcggtgtgccc agatccgtcc aggcgaccca ccttgtaggg gtatccgaat gaaatgacac>..............................mTf..............................>
c h t g l g r s a g w n i p i g l l y c721 acttacctga gccacgtaaa cctcttgaga aagcagtggc caatttcttc tcgggcagcttgaatggact cggtgcattt ggagaactct ttcgtcaccg gttaaagaag agcccgtcga>..............................mTf..............................>
d l p e p r k p l e k a v a n f f s g s
P0110781 gtgccccttg tgcggatggg acgaattatt atggttctac ttatgattat gacttccccccacggggaac acgcctaccc tgcttaataa taccaagatg aatactaata ctgaagggggP0109>..............................mTf..............................>
c a p c a d g t n y y g s t y d y d f p>>.....................162-170......................>
a d g t n y y g s t y d y d f p>>.........CDR H3..........>>
n y y g s t y d y841 agctgtgtca actgtgtcca gggtgtggct gctccaccct taaccaatac ttcggctacttcgacacagt tgacacaggt cccacaccga cgaggtggga attggttatg aagccgatga>..............................mTf..............................>
q l c q l c p g c g c s t l n q y f g y>..>>162-170q l901 cgggagcctt caagtgtctg aaggatggtg ctggggatgt ggcctttgtc aagcactcgagccctcggaa gttcacagac ttcctaccac gacccctaca ccggaaacag ttcgtgagct>..............................mTf..............................>
s g a f k c l k d g a g d v a f v k h s961 ctatatttga gaacttggca aacaaggctg acagggacca gtatgagctg ctttgcctgggatataaact cttgaaccgt ttgttccgac tgtccctggt catactcgac gaaacggacc>..............................mTf..............................>
t i f e n l a n k a d r d q y e l l c l1021 acaacacccg gaagccggta gatgaataca aggactgcca cttgccccag gtcccttctctgttgtgggc cttcggccat ctacttatgt tcctgacggt gaaccgggtc cagggaagag>..............................mTf..............................>
d n t r k p v d e y k d c h l a q v p s1081 ataccgtcgt ggcccgaagt atgggcggca aggaggactt gatctgggag cttctcaacctatggcagca ccgggcttca tacccgccgt tcctcctgaa ctagaccctc gaagagttgg>..............................mTf..............................>
h t v v a r s m g g k e d l i w e l l nEcoRI-+-----1141 aggcccagga acattttggc aaagacaaat caaaagaatt ccaactattc agctctcctctccgggtcct tgtaaaaccg tttctgttta gttttcttaa ggttgataag tcgagaggag>..............................mTf..............................>
q a qe h f g k d k s k e f q l f s s p上一條鏈SEQ ID NO75肽鏈SEQ ID NO76氨基酸162-170SEQ ID NO77CDR H3SEQ ID NO44P0109(SEQ ID NO78)ATAATCATAAGTAGAACCATAATAATTCGTCCCATCCGCACAAGGGGCACAGCT GCP0110(SEQ ID NO79)GAATTATTATGGTTCTACTTATGATTATGACTTCCCCCAGCTGTGTCAACTG為了產(chǎn)生具有CDR H3的全長(zhǎng)mTf，將來自pREX0079的KpnI/EcoRI片段連接到用KpnI/EcoRI剪切的pREX0052中。然后通過NotI消化，取出來自生成質(zhì)粒pREX0263的表達(dá)盒，并連接到用NotI剪切的酵母載體pSAC35中，生成pREX0268，轉(zhuǎn)化到酵母中來進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)。
實(shí)施例3還可以進(jìn)一步修飾實(shí)施例1和2中的轉(zhuǎn)移體來包括抗原性肽或免疫調(diào)節(jié)肽。期望的肽可被插入到轉(zhuǎn)移體的轉(zhuǎn)鐵蛋白部分中。通過這種方式，被修飾的轉(zhuǎn)移體不僅能夠結(jié)合其抗原，而且能夠在宿主中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。
實(shí)施例4本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體技術(shù)給常規(guī)的單克隆抗體方法提供一種有吸引力的替代。在該實(shí)施例中，生成了包含Tf和來源于抗TNFα單克隆抗體的九個(gè)氨基酸的CDR肽(SEQ ID NO44)的轉(zhuǎn)移體。CDR肽使Tf具有阻斷TNFα的細(xì)胞毒性活性的能力。
aat tat tat ggt tct act tat gat tat(SEQ ID NO80)NYYGSTYDY(SEQ ID NO44)材料與方法細(xì)胞在處理的前一天，在96孔的組織培養(yǎng)平板的DMEM/10％FBS/10mM HEPES培養(yǎng)基中植入密度為3×104細(xì)胞/孔的WEHI-164細(xì)胞。次日，細(xì)胞以約70-80％的匯合度均勻地分布。
樣本N末端結(jié)構(gòu)域(TNF-CDR3)·pREX0080構(gòu)建體-TNF CDR3被插入在Tf的N末端結(jié)構(gòu)域的D166中·在BXP10菌株中(YO150)·樣本以1/10稀釋在RPMI/10％FBS培養(yǎng)基中，最終濃度為350μg/ml，用0.22μm的濾器過濾滅菌。
N末端結(jié)構(gòu)域Tf·pREX0128構(gòu)建體
·在BXP10菌株中培養(yǎng)(YO051)·樣本以1/10稀釋在RPMI/10％FBS培養(yǎng)基中，最終濃度為350μg/ml，用0.22μm的濾器過濾滅菌。
TNFα母液·重組的人TNFα(Cell Sciences，產(chǎn)品目錄號(hào)CRT100，lot121CY25)以25,000單位/ml溶解在dH20中。用0.22μm的濾器過濾滅菌。
制備稀釋平板，使得可以用恒量TNFα滴定各個(gè)樣本。在三個(gè)重復(fù)孔中放置各種樣本，用DMEM/10％FBS/10mM HEPES進(jìn)行稀釋。
小心地從各個(gè)孔中取出種培養(yǎng)基(seed calture)，不弄亂附著的細(xì)胞層，將100μl檢測(cè)樣本轉(zhuǎn)移到各個(gè)孔中。所有情形進(jìn)行3個(gè)重復(fù)。在37℃、5％CO2下培養(yǎng)平板24-48小時(shí)。
在培養(yǎng)階段之后，通過加入10μL MTS試劑(CellTiter960AQueous OneSolution Proliferation Assay，Promega，產(chǎn)品號(hào)G3582)來檢測(cè)各個(gè)孔中的細(xì)胞的代謝活性。在具有代謝活性的細(xì)胞中，這種四唑化合物被脫氫酶還原成有色的水溶性formazan產(chǎn)物，可以通過分光光度方法量化該產(chǎn)物。在37℃下培養(yǎng)1-4小時(shí)后，在490nm下檢測(cè)顏色變化量。
轉(zhuǎn)移體制備與治療性TNFα的CDR3相當(dāng)?shù)?個(gè)氨基酸序列(SEQ IDNO44)被工程改造到轉(zhuǎn)鐵蛋白的N末端結(jié)構(gòu)域中，在酵母表達(dá)系統(tǒng)中制備，然后從5L發(fā)酵液中純化。作為對(duì)照，在酵母中制備和純化轉(zhuǎn)鐵蛋白的N末端結(jié)構(gòu)域。
分析方法簡(jiǎn)而言之，在用TNFα(50IU/ml)混合物處理和滴定純化的N末端結(jié)構(gòu)域(TNF-CDR3)(25-1.6μg/ml)后，所用方法測(cè)定細(xì)胞的代謝活性。功能性的TNF CDR轉(zhuǎn)移體將結(jié)合到溶液中的游離TNFα上，并在WEHI-164細(xì)胞(粘附的鼠纖維肉瘤細(xì)胞系)中防止TNF-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。N末端結(jié)構(gòu)域(TNF-CDR3)的細(xì)胞保護(hù)特異性通過用N末端結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)的平行處理來控制。參見上面的材料與方法。
結(jié)果附圖5顯示來自兩個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的結(jié)果，表明25μg/ml劑量的N末端結(jié)構(gòu)域(TNF-CDR3)阻斷WEHI-164細(xì)胞中的TNF介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。相同劑量的N末端結(jié)構(gòu)域Tf不起保護(hù)作用，表明該活性受抗TNF CDR3調(diào)節(jié)。
以25μg/ml劑量使用N末端結(jié)構(gòu)域(TNF-CDR3)使WEHI-164細(xì)胞具有抵抗TNFα介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的保護(hù)作用。該活性似乎對(duì)該分子的TNF CDR部分是特異的，因?yàn)樵谌魏卧囼?yàn)中，單獨(dú)的相同濃度的N末端結(jié)構(gòu)域未顯示具有任何保護(hù)作用。
第二個(gè)分析，使用中性紅染料攝取作為確定細(xì)胞活性的方法，同樣表明12.5μg/mL和25μg/mL的N末端結(jié)構(gòu)域(TNF-CDR3)具有抵抗TNFα介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的保護(hù)作用(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，單一的N末端結(jié)構(gòu)域不具有保護(hù)作用。
雖然，參照上面的實(shí)施例詳細(xì)地描述了本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，在不偏離本發(fā)明的精神的前提下，可以進(jìn)行各種改進(jìn)。因此，本發(fā)明僅由如下的權(quán)利要求書來限定。在該說明書中提及的所有被引用的專利、專利申請(qǐng)和公開物在此完全引入作為參考。
序列表<110>SADEGHI，HomayounPRIOR，Christopher P.
TURNER，Andrew<120>被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體的融合蛋白<130>54710-5004-WO<150>US 60/406,977<151>2002-08-30<150>US 10/384,060<151>2003-03-10<160>99<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>2318<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(51)..(2147)<223>GenBank登錄號(hào)NM_001063，轉(zhuǎn)鐵蛋白基因和蛋白<220>
<221>sig_peptide<222>(51)..(107)<400>1gcacagaagc gagtccgact gtgctcgctg ctcagcgccg cacccggaag atg agg56Met Arg1ctc gcc gtg gga gcc ctg ctg gtc tgc gcc gtc ctg ggg ctg tgt ctg104Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu Cys Leu5 10 15gct gtc cct gat aaa act gtg aga tgg tgt gca gtg tcg gag cat gag152Ala Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu20 25 30gcc act aag tgc cag agt ttc cgc gac cat atg aaa agc gtc att cca200Ala Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val Ile Pro35 40 45 50tcc gat ggt ccc agt gtt gct tgt gtg aag aaa gcc tcc tac ctt gat248Ser Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp55 60 65tgc atc agg gcc att gcg gca aac gaa gcg gat gct gtg aca ctg gat296Cys Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp70 75 80gca ggt ttg gtg tat gat gct tac ctg gct ccc aat aac ctg aag cct344Ala Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu Lys Pro
85 90 95gtg gtg gca gag ttc tat ggg tca aaa gag gat cca cag act ttc tat392Val Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr100 105 110tat gct gtt gct gtg gtg aag aag gat agt ggc ttc cag atg aac cag440Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln115 120 125 130ctt cga ggc aag aag tcc tgc cac acg ggt cta ggc agg tcc gct ggg488Leu Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly135 140 145tgg aac atc ccc ata ggc tta ctt tac tgt gac tta cct gag cca cgt536Trp Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg150 155 160aaa cct ctt gag aaa gca gtg gcc aat ttc ttc tcg ggc agc tgt gcc584Lys Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser Cys Ala165 170 175cct tgt gcg gat ggg acg gac ttc ccc cag ctg tgt caa ctg tgt cca632Pro Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro180 185 190ggg tgt ggc tgc tcc acc ctt aac caa tac ttc ggc tac tcg gga gcc680Gly Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala195 200 205 210ttc aag tgt ctg aag gat ggt gct ggg gat gtg gcc ttt gtc aag cac728Phe Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His215 220 225tcg act ata ttt gag aac ttg gca aac aag gct gac agg gac cag tat776Ser Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr230 235 240gag ctg ctt tgc ctg gac aac acc cgg aag ccg gta gat gaa tac aag824Glu Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys245 250 255gac tgc cac ttg gcc cag gtc cct tct cat acc gtc gtg gcc cga agt872Asp Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser260 265 270atg ggc ggc aag gag gac ttg atc tgg gag ctt ctc aac cag gcc cag920Met Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln275 280 285 290gaa cat ttt ggc aaa gac aaa tca aaa gaa ttc caa cta ttc agc tct968Glu His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser295 300 305cct cat ggg aag gac ctg ctg ttt aag gac tct gcc cac ggg ttt tta1016Pro His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu310 315 320aaa gtc ccc ccc agg atg gat gcc aag atg tac ctg ggc tat gag tat1064Lys Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr325 330 335
gtc act gcc atc cgg aat cta cgg gaa ggc aca tgc cca gaa gcc cca1112Val Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu Ala Pro340 345 350aca gat gaa tgc aag cct gtg aag tgg tgt gcg ctg agc cac cac gag1160Thr Asp Glu Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu355 360 365 370agg ctc aag tgt gat gag tgg agt gtt aac agt gta ggg aaa ata gag1208Arg Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys Ile Glu375 380 385tgt gta tca gca gag acc acc gaa gac tgc atc gcc aag atc atg aat1256Cys Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn390 395 400gga gaa gct gat gcc atg agc ttg gat gga ggg ttt gtc tac ata gcg1304Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr Ile Ala405 410 415ggc aag tgt ggt ctg gtg cct gtc ttg gca gaa aac tac aat aag agc1352Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn Lys Ser420 425 430gat aat tgt gag gat aca cca gag gca ggg tat ttt gct gta gca gtg1400Asp Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val Ala Val435 440 445 450gtg aag aaa tca gct tct gac ctc acc tgg gac aat ctg aaa ggc aag1448Val Lys Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys Gly Lys455 460 465aag tcc tgc cat acg gca gtt ggc aga acc gct ggc tgg aac atc ccc1496Lys Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro470 475 480atg ggc ctg ctc tac aat aag atc aac cac tgc aga ttt gat gaa ttt1544Met Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe485 490 495ttc agt gaa ggt tgt gcc cct ggg tct aag aaa gac tcc agt ctc tgt1592Phe Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser Leu Cys500 505 510aag ctg tgt atg ggc tca ggc cta aac ctg tgt gaa ccc aac aac aaa1640Lys Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn Asn Lys515 520 525 530gag gga tac tac ggc tac aca ggc gct ttc agg tgt ctg gtt gag aag1688Glu Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys535 540 545gga gat gtg gcc ttt gtg aaa cac cag act gtc cca cag aac act ggg1736Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Pro Gln Asn Thr Gly550 555 560gga aaa aac cct gat cca tgg gct aag aat ctg aat gaa aaa gac tat1784Gly Lys Asn Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys Asp Tyr565 570 575gag ttg ctg tgc ctt gat ggt acc agg aaa cct gtg gag gag tat gcg1832Glu Leu Leu Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu Tyr Ala
580 585 590aac tgc cac ctg gcc aga gcc ccg aat cac gct gtg gtc aca cgg aaa1880Asn Cys His Leu Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr Arg Lys595 600 605 610gat aag gaa gct tgc gtc cac aag ata tta cgt caa cag cag cac cta1928Asp Lys Glu Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln His Leu615 620 625ttt gga agc aac gta act gac tgc tcg ggc aac ttt tgt ttg ttc cgg1976Phe Gly Ser Asn Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg630 635 640tcg gaa acc aag gac ctt ctg ttc aga gat gac aca gta tgt ttg gcc2024Ser Glu Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys Leu Ala645 650 655aaa ctt cat gac aga aac aca tat gaa aaa tac tta gga gaa gaa tat2072Lys Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr660 665 670gtc aag gct gtt ggt aac ctg aga aaa tgc tcc acc tca tca ctc ctg2120Val Lys Ala Val Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser Leu Leu675 680 685 690gaa gcc tgc act ttc cgt aga cct taa aatctcagag g tagggctgc 2167Glu Ala Cys Thr Phe Arg Arg Pro695caccaaggtg aagatgggaa cgcagatgat ccatgagttt gccctggttt cactggccca 2227agtggtttgt gctaaccacg tctgtcttca cagctctgtg ttgccatgtg tgctgaacaa 2287aaaataaaaa ttattattga ttttatattt c 2318<210>2<211>698<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Arg Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu1 5 10 15Cys Leu Ala Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu20 25 30His Glu Ala Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val35 40 45Ile Pro Ser Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr50 55 60Leu Asp Cys Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr65 70 75 80
Leu Asp Ala Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu85 90 95Lys Pro Val Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr100 105 110Phe Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met115 120 125Asn Gln Leu Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser130 135 140Ala Gly Trp Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu145 150 155 160Pro Arg Lys Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser165 170 175Cys Ala Pro Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu180 185 190Cys Pro Gly Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser195 200 205Gly Ala Phe Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val210 215 220Lys His Ser Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp225 230 235 240Gln Tyr Glu Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu245 250 255Tyr Lys Asp Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala260 265 270Arg Ser Met Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln275 280 285Ala Gln Glu His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe290 295 300Ser Ser Pro His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly305 310 315 320
Phe Leu Lys Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr325 330 335Glu Tyr Val Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu340 345 350Ala Pro Thr Asp Glu Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His355 360 365His Glu Arg Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys370 375 380Ile Glu Cys Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile385 390 395 400Met Asn Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr405 410 415Ile Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn420 425 430Lys Ser Asp Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val435 440 445Ala Val Val Lys Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys450 455 460Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn465 470 475 480Ile Pro Met Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp485 490 495Glu Phe Phe Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser500 505 510Leu Cys Lys Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn515 520 525Asn Lys Glu Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val530 535 540Glu Lys Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Pro Gln Asn545 550 555 560Thr Gly Gly Lys Asn Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys565 570 575
Asp Tyr Glu Leu Leu Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu580 585 590Tyr Ala Asn Cys His Leu Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr595 600 605Arg Lys Asp Lys Glu Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln610 615 620His Leu Phe Gly Ser Asn Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu625 630 635 640Phe Arg Ser Glu Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys645 650 655Leu Ala Lys Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu660 665 670Glu Tyr Val Lys Ala Val Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser675 680 685Leu Leu Glu Ala Cys Thr Phe Arg Arg Pro690 695<210>3<211>679<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>MISC_FEATURE<223>成熟的轉(zhuǎn)鐵蛋白<400>3Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Ala1 5 10 15Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val Ile Pro Ser20 25 30Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp Cys35 40 45Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala50 55 60
Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val65 70 75 80Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr Tyr85 90 95Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln Leu100 105 110Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp115 120 125Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg Lys130 135 140Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser Cys Ala Pro145 150 155 160Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly165 170 175Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe180 185 190Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Ser195 200 205Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu210 215 220Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys Asp225 230 235 240Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser Met245 250 255Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln Glu260 265 270His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro275 280 285His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu Lys290 295 300Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val305 310 315 320
Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu Ala Pro Thr325 330 335Asp Glu Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu Arg340 345 350Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys Ile Glu Cys355 360 365Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn Gly370 375 380Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr Ile Ala Gly385 390 395 400Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn Lys Ser Asp405 410 415Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val Ala Val Val420 425 430Lys Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys Gly Lys Lys435 440 445Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met450 455 460Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe465 470 475 480Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser Leu Cys Lys485 490 495Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn Asn Lys Glu500 505 510Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly515 520 525Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Pro Gln Asn Thr Gly Gly530 535 540Lys Asn Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys Asp Tyr Glu545 550 555 560
Leu Leu Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu Tyr Ala Asn565 570 575Cys His Leu Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr Arg Lys Asp580 585 590Lys Glu Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln His Leu Phe595 600 605Gly Ser Asn Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg Ser610 615 620Glu Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys Leu Ala Lys625 630 635 640Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Val645 650 655Lys Ala Val Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser Leu Leu Glu660 665 670Ala Cys Thr Phe Arg Arg Pro675<210>4<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嗜中性粒細(xì)胞剪切變體序列<400>4Glu Asp Cys Ile Ala Leu Lys Gly Glu Ala Asp Ala1 5 10<210>5<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>能夠降低炎癥反應(yīng)的五肽<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>Xaa可以是Asp或Glu<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)<223>Xaa可以是Ser，D-Ser，Thr，Ala，Gly或肌氨酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>Xaa可以是Asp，Glu，Asn或Gln<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>Xaa可以是Pro，Val，Ala，Leu或Ile<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>Xaa可以是Arg，Lys或Orn<400>5Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5<210>6<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>能夠阻斷免疫復(fù)合物結(jié)合的肽<400>6Pro Asp Ala Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg1 5 10<210>7<211>8<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>MISC_FEATURE<223>來源于IgG1的肽<400>7Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly1 5<210>8<211>8<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>來源于IgG1的肽<400>8Lys Ala Asp Trp Tyr Val Asp Gly1 5<210>9<211>5<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>MISC_FEATURE<223>來源于IgM的肽<400>9Glu Trp Met Gln Arg1 5<210>10<211>10<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>MISC_FEATURE<223>來源于IgG的肽<400>10Gly Val Gln Val His Asn Ala Lys Thr Lys1 5 10<210>11<211>11<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>MISC_FEATURE<223>來源于IgG的肽<400>11Val Gln Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg1 5 10<210>12<211>16<212>PRT<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE<223>來源于IgG的肽<400>12Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Gln Val His Asn Ala Lys Thr Lys1 5 10 15<210>13<211>5<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>MISC_FEATURE<223>來源于IgG的肽<400>13Phe Asn Trp Tyr Val1 5<210>14<211>4<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>MISC_FEATURE<223>來源于IgG的肽<400>14Thr Lys Pro Arg1<210>15<211>23<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>能夠非特異性地激活淋巴細(xì)胞的肽<400>15Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr1 5 10 15Leu Pro Ser Arg Glu Glu Met20<210>16
<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>來源于IgG的肽<400>16Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg1 5 10<210>17<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>來源于IgG的肽<400>17Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg1 5<210>18<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>來源于IgE的肽<400>18Asp Ser Asp Pro Arg1 5<210>19<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>能夠阻斷IgE結(jié)合到IgE Fc受體的肽<400>19Pro Asp Ala Arg His Ser1 5<210>20<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>與人IgE部分相同的序列
<400>20Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu1 5 10<210>21<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>與人IgE部分相同的肽<400>21Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe1 5 10<210>22<211>92<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pREX0004中含有接頭的序列<400>22ctagataaaa gggaagtgaa actggagctc tggtggtggt tctggtggtg gttctggtgg60tggttctgat atcaacctgg aagtgaaggt ac 92<210>23<211>84<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pREX0004中含有接頭的序列<400>23cttcacttcc aggttgatat cagaaccacc accagaacca ccaccagaac caccaccaga60gctccagttt cacttccctt ttat 84<210>24<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>接頭肽<400>24Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asp Ile Asn1 5 10 15
Leu Glu Val Lys Val20<210>25<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>誘變PCR引物<400>25agcctgcact ttccgtcgac ctgaagtgaa actggaag38<210>26<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>誘變PCR引物<400>26cagtcatgtc taagcttatt acttcacttc caggttgg38<210>27<211>240<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>抗-TNFα多肽<400>27Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn His20 25 30Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu50 55 60Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala65 70 75 80Val Tyr Leu Gln Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr85 90 95
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly115 120 125Ser Gly Gly Gly Ser Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu130 135 140Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln145 150 155 160Phe Val Gly Ser Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser165 170 175Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile Pro180 185 190Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile195 200 205Asn Thr Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser210 215 220His Ser Trp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys225 230 235 240<210>28<211>357<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Vh DNA序列<400>28gaagtgaaac tggaagaaag cggcggcggc ctggtgcagc cgggcggcag catgaaactg60agctgcgtgg cgagcggctt tatttttagc aaccattgga tgaactgggt gcgtcagagc120ccggaaaaag gcctggaatg ggtggcggaa attcgtagca aaagcattaa cagcgcgacc180cattatgcgg aaagcgtgaa aggccgtttt accattagcc gtgatgatag caaaagcgcg240gtgtatctgc agatgaccga tctgcgtacc gaagataccg gcgtgtatta ttgcagccgt300aactattatg gcagcaccta tgattattgg ggccagggca ccaccctgac cgtgagc 357<210>29<211>119<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>抗TNF-αVH<400>29Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn His20 25 30Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu50 55 60Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala65 70 75 80Val Tyr Leu Gln Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr85 90 95Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser115<210>30<211>321<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Vh DNA序列<400>30gatattctgc tgacccagag cccggcgatt ctgagcgtga gcccgggcga acgtgtgagc 60tttagctgcc gtgcgagcca gtttgtgggc agcagcattc attggtatca gcagcgtacc 120aacggcagcc cgcgtctgct gattaaatat gcgagcgaaa gcatgagcgg cattccgagc 180cgttttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga gcattaacac cgtggaaagc 240gaagatattg cggattatta ttgccagcag agccatagct ggccgtttac ctttggcagc 300ggcaccaacc tggaagtgaa a321<210>31
<211>107<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>抗TNFα序列<400>31Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Phe Val Gly Ser Ser20 25 30Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Thr Val Glu Ser65 70 75 80Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe85 90 95Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys100 105<210>32<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽接頭<400>32Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser1 5 10<210>33<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>肽接頭<400>33tcttctggtg gtggttctgg tggtggttct ggtggtggtt ct42
<210>34<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>肽接頭(反義)<400>34agaaccacca ccagaaccac caccagaacc accaccagaa ga42<210>35<211>45<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人Tf的N2結(jié)構(gòu)域<400>35Pro Glu Pro Arg Lys Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser1 5 10 15Gly Ser Cys Ala Pro Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys20 25 30Gln Leu Cys Pro Gly Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln35 40 45<210>36<211>42<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人Tf的C1結(jié)構(gòu)域<400>36Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly1 5 10 15Ser Lys Lys Asp Ser Ser Leu Cys Lys Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu20 25 30Asn Leu Cys Glu Pro Asn Asn Lys Glu Gly35 40<210>37<211>47<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人Tf的N1結(jié)構(gòu)域<400>37Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro His Gly Lys Asp1 5 10 15Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu Lys Val Pro Pro Arg20 25 30Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val Thr Ala Ile35 40 45<210>38<211>49<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人Tf的C2結(jié)構(gòu)域<400>38Asn Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg Ser Glu Thr1 5 10 15Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys Leu Ala Lys Leu His20 25 30Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Val Lys Ala35 40 45Val<210>39<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>VH CDR1序列<400>39Ser Tyr Trp Ile Gly1 5<210>40<211>17<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>VH CDR2序列<400>40Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln1 5 10 15Gly<210>41<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>VH CDR3序列<400>41His Gly Trp Gly Met Asp Val1 5<210>42<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>P VH CDR1序列<400>42Asn His Trp Met Asn1 5<210>43<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>P VH CDR2序列<400>43Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser1 5 10 15Val Lys Gly<210>44<211>9<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>P VH CDR3序列<400>44Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr1 5<210>45<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>33 CDR1序列<400>45Ser Tyr Gly Met His1 5<210>46<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>33 CDR2序列<400>46Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15Gly<210>47<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>33 CDR3序列<400>47Asp Ser Gly Asp Leu Ala Phe Asp Ile1 5<210>48<211>5<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>35 CDR1序列<400>48Ser Phe Pro Ile Asn1 5<210>49<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>35 CDR2序列<400>49Arg Ile Ile Pro Ile Ile Gly Ile Ala Asp Tyr Ala Gln Glu Phe Gln1 5 10 15Gly<210>50<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>35 CDR3序列<400>50Pro Glu Ala Val Thr Val Pro Ala Pro Leu Asp Tyr1 5 10<210>51<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>37 CDR1序列<400>51Ser Tyr Ala Ile Ser1 5<210>52<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>37 CDR2序列
<400>52Gly Thr Ser Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly1 5 10<210>53<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>37 CDR3序列<400>53Glu Val Gln Phe Tyr His Asp Ser Ser Gly Tyr Leu Asp Ala Leu Asp1 5 10 15Ile<210>54<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>39 CDR1序列<400>54Thr Tyr Val Met Asn1 5<210>55<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>39 CDR2序列<400>55Gly Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15Gly<210>56<211>14<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>39 CDR3序列<400>56Asp Leu Ser Asn Arg Leu Ser Gly Gly Gly Thr Phe Asp Ile1 5 10<210>57<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>VL CDR1序列<400>57Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His1 5 10<210>58<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>VL CDR2序列<400>58Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro1 5<210>59<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>VL CDR3序列<400>59Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Val1 5 10<210>60<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>P VL CDR1序列<400>60
Arg Ala Ser Gln Phe Val Gly Ser Ser Ile His1 5 10<210>61<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>P VL CDR3序列<400>61Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met1 5<210>62<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>P VL CDR3序列<400>62Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe Thr1 5<210>63<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>33 CDR1序列<400>63Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala1 5 10<210>64<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>33 CDR2序列<400>64Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala1 5<210>65
<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>33 CDR3序列<400>65Leu Gln Arg Asp Asn Trp Pro Trp Thr1 5<210>66<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>35 CDR1序列<400>66Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala1 5 10<210>67<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>35 CDR2序列<400>67Tyr Lys Ala Ser Gly Leu Glu1 5<210>68<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>35 CDR3序列<400>68Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Trp Thr1 5<210>69<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>37 CDR1序列
<400>69Arg Ala Ser Gln Ser Leu Asn Asn Trp Leu Ala1 5 10<210>70<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>37 CDR2序列<400>70Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu1 5<210>71<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>37 CDR3序列<400>71Gln Gln Tyr Asn Ser Pro Trp Thr1 5<210>72<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>39 CDR1序列<400>72Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala1 510<210>73<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>39 CDR2序列<400>73Asn Asp Ala Ser Asn Arg Ala1 5
<210>74<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>39 CDR3序列<400>74Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr1 5<210>75<211>660<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pREX0080中的mTf序列<400>75agcctgtggt ggcagagttc tatgggtcaa aagaggatcc acagactttc tattatgctg60ttgctgtggt gaagaaggat agtggcttcc agatgaacca gcttcgaggc aagaagtcct120gccacacggg tctaggcagg tccgctgggt ggaacatccc cataggctta ctttactgtg180acttacctga gccacgtaaa cctcttgaga aagcagtggc caatttcttc tcgggcagct240gtgccccttg tgcggatggg acgaattatt atggttctac ttatgattat gacttccccc300agctgtgtca actgtgtcca gggtgtggct gctccaccct taaccaatac ttcggctact360cgggagcctt caagtgtctg aaggatggtg ctggggatgt ggcctttgtc aagcactcga420ctatatttga gaacttggca aacaaggctg acagggacca gtatgagctg ctttgcctgg480acaacacccg gaagccggta gatgaataca aggactgcca cttggcccag gtcccttctc540ataccgtcgt ggcccgaagt atgggcggca aggaggactt gatctgggag cttctcaacc600aggcccagga acattttggc aaagacaaat caaaagaatt ccaactattc agctctcctc660<210>76<211>220<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>pREX0080中的mTf序列<400>76Lys Pro Val Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr1 5 10 15
Phe Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met20 25 30Asn Gln Leu Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser35 40 45Ala Gly Trp Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu50 55 60Pro Arg Lys Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser65 70 75 80Cys Ala Pro Cys Ala Asp Gly Thr Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp85 90 95Tyr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly Cys Gly Cys Ser100 105 110Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Lys115 120 125Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Ser Thr Ile Phe Glu130 135 140Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu Leu Leu Cys Leu145 150 155 160Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys Asp Cys His Leu Ala165 170 175Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser Met Gly Gly Lys Glu180 185 190Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln Glu His Phe Gly Lys195 200 205Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro210 215 220<210>77<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>mTf的氨基酸162-170<400>77
Ala Asp Gly Thr Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Asp Phe Pro1 5 10 15Gln Leu<210>78<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物P0109<400>78ataatcataa gtagaaccat aataattcgt cccatccgca caaggggcac agctgc 56<210>79<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物P0110<400>79gaattattat ggttctactt atgattatga cttcccccag ctgtgtcaac tg 52<210>80<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>P VH中的CDR3<400>80aattattatg gttctactta tgattat 27<210>81<211>676<212>PRT<213>Oryctolagus cuniculus<400>81Val Thr Glu Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Asn Asp His Glu Ala1 5 10 15Ser Lys Cys Ala Asn Phe Arg Asp Ser Met Lys Lys Val Leu Pro Glu20 25 30Asp Gly Pro Arg Ile Ile Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp Cys35 40 45Ile Lys Ala Ile Ala Ala His Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala50 55 60
Gly Leu Val His Glu Ala Gly Leu Thr Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val65 70 75 80Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asn Pro Lys Thr Phe Tyr Tyr85 90 95Ala Val Ala Leu Val Lys Lys Gly Ser Asn Phe Gln Leu Asn Glu Leu100 105 110Gln Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp115 120 125Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg Lys130 135 140Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Ser Phe Phe Ser Gly Ser Cys Val Pro145 150 155 160Cys Ala Asp Gly Ala Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly165 170 175Cys Gly Cys Ser Ser Val Gln Pro Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe180 185 190Lys Cys Leu Lys Asp Gly Leu Gly Asp Val Ala Phe Val Lys Gln Glu195 200 205Thr Ile Phe Glu Asn Leu Pro Ser Lys Asp Glu Arg Asp Gln Tyr Glu210 215 220Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Glu Gln225 230 235 240Cys His Leu Ala Arg Val Pro Ser His Ala Val Val Ala Arg Ser Val245 250 255Asp Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln Glu260 265 270His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Gly Asp Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro275 280 285His Gly Lys Asn Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala Tyr Gly Phe Phe Lys290 295 300Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Asn Leu Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val305 310 315 320Thr Ala Val Arg Asn Leu Arg Glu Gly Ile Cys Pro Asp Pro Leu Gln325 330 335Asp Glu Cys Lys Ala Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu Arg340 345 350Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Thr Ser Gly Gly Leu Ile Glu Cys355 360 365Glu Ser Ala Glu Thr Pro Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn Gly370 375 380Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Tyr Val Tyr Ile Ala Gly
385 390 395 400Gln Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Glu Ser Thr Asp405 410 415Cys Lys Lys Ala Pro Glu Glu Gly Tyr Leu Ser Val Ala Val Val Lys420 425 430Lys Ser Asn Pro Asp Ile Asn Trp Asn Asn Leu Glu Gly Lys Lys Ser435 440 445Cys His Thr Ala Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly450 455 460Leu Leu Tyr Asn Arg Ile Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe Arg465 470 475 480Gln Gly Cys Ala Pro Gly Ser Gln Lys Asn Ser Ser Leu Cys Glu Leu485 490 495Cys Ile Gly Pro Ser Val Cys Ala Pro Asn Asn Arg Glu Gly Tyr Tyr500 505 510Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp Val Ala515 520 525Phe Val Lys Ser Gln Thr Val Leu Gln Asn Thr Gly Gly Arg Asn Ser530 535 540Glu Pro Trp Ala Lys Asp Leu Lys Glu Glu Asp Phe Glu Leu Leu Cys545 550 555 560Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Ser Glu Ala His Asn Cys His Leu565 570 575Ala Lys Ala Pro Asn His Ala Val Val Ser Arg Lys Asp Lys Ala Ala580 585 590Cys Val Lys Gln Lys Leu Leu Asp Leu Gln Val Glu Tyr Gly Asn Thr595 600 605Val Ala Asp Cys Ser Ser Lys Phe Cys Met Phe His Ser Lys Thr Lys610 615 620Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Lys Cys Leu Val Asp Leu Arg Gly625 630 635 640Lys Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Asp Tyr Ile Lys Ala Val645 650 655Ser Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Arg Leu Leu Glu Ala Cys Thr660 665 670Phe His Lys His675<210>82<211>676<212>PRT<213>Rattus norvegicus
<400>82Val Pro Asp Lys Thr Val Lys Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Asn1 5 10 15Thr Lys Cys Ile Ser Phe Arg Asp His Met Lys Thr Val Leu Pro Ala20 25 30Asp Gly Pro Arg Leu Pro Cys Val Lys Lys Thr Ser Tyr Gln Asp Cys35 40 45Ile Lys Ala Ile Ser Gly Gly Glu Ala Asp Ala Ile Thr Leu Asp Gly50 55 60Gly Trp Val Tyr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val65 70 75 80Ala Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Leu Glu His Arg Gln Thr His Tyr Leu85 90 95Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Thr Asp Phe Gln Leu Asn Gln Leu100 105 110Gln Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp115 120 125Ile Ile Pro Ile Gly Leu Leu Phe Cys Asn Leu Pro Glu Pro Arg Lys130 135 140Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Ser Phe Phe Ser Gly Ser Cys Val Pro145 150 155 160Cys Ala Asp Pro Val Ala Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly165 170 175Cys Gly Cys Ser Pro Thr Gln Pro Phe Phe Gly Tyr Val Gly Ala Phe180 185 190Lys Cys Leu Arg Asp Gly Gly Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Thr195 200 205Thr Ile Phe Glu Val Leu Pro Gln Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu210 215 220Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Gln Tyr Glu Asp225 230 235 240Cys Tyr Leu Ala Arg Ile Pro Ser His Ala Val Val Ala Arg Asn Gly245 250 255Asp Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Ile Leu Lys Val Ala Gln Glu260 265 270His Phe Gly Lys Gly Lys Ser Lys Asp Phe Gln Leu Phe Gly Ser Pro275 280 285Leu Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Arg Phe Gly Leu Leu Arg290 295 300Ala Pro Lys Asp Gly Leu Gln Ala Val Pro Arg Pro Gln Leu Cys His305 310 315 320
Cys His Ser Lys Ser Ala Gly Ser Cys Pro Asp Ala Ile Asp Ser Ala325 330 335Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His Gln Glu Arg Ala Lys Cys Asp340 345 350Glu Trp Ser Val Thr Gly Asn Gly Gln Ile Glu Cys Glu Ser Ala Glu355 360 365Ser Thr Glu Asp Cys Ile Asp Lys Ile Val Asn Gly Glu Ala Asp Ala370 375 380Met Ser Leu Asp Gly Gly His Ala Tyr Ile Ala Gly Gln Cys Gly Leu385 390 395 400Val Pro Val Met Ala Glu Asn Tyr Asp Ile Ser Ser Cys Thr Asn Pro405 410 415Gln Ser Asp Val Phe Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Lys420 425 430Ala Ser Asp Ser Ser Ile Asn Trp Asn Asn Leu Lys Gly Lys Lys Ser435 440 445Cys His Thr Gly Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly450 455 460Leu Leu Phe Ser Arg Ile Asn His Cys Lys Phe Asp Glu Phe Phe Ser465 470 475 480Gln Gly Cys Ala Pro Gly Tyr Lys Lys Asn Ser Thr Leu Cys Asp Leu485 490 495Cys Ile Gly Pro Ala Lys Cys Ala Pro Asn Asn Arg Glu Gly Tyr Asn500 505 510Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Gln Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp Val Ala515 520 525Phe Val Lys His Gln Thr Val Leu Glu Asn Thr Asn Gly Lys Asn Thr530 535 540Ala Ala Trp Ala Lys Asp Leu Lys Gln Glu Asp Phe Gln Leu Leu Cys545 550 555 560Pro Asp Gly Thr Lys Lys Pro Val Thr Glu Phe Ala Thr Cys His Leu565 570 575Ala Gln Ala Pro Asn His Val Val Val Ser Arg Lys Glu Lys Ala Ala580 585 590Arg Val Ser Thr Val Leu Thr Ala Gln Lys Asp Leu Phe Trp Lys Gly595 600 605Asp Lys Asp Cys Thr Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg Ser Ser Thr Lys610 615 620Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Lys Cys Leu Thr Lys Leu Pro Glu625 630 635 640Gly Thr Thr Tyr Glu Glu Tyr Leu Gly Ala Glu Tyr Leu Gln Ala Val645 650 655
Gly Asn Ile Arg Lys Cys Ser Thr Ser Arg Leu Leu Glu Ala Cys Thr660 665 670Phe His Lys Ser675<210>83<211>677<212>PRT<213>Mus musculus<400>83Val Pro Asp Lys Thr Val Lys Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Asn1 5 10 15Thr Lys Cys Ile Ser Phe Arg Asp His Met Lys Thr Val Leu Pro Pro20 25 30Asp Gly Pro Arg Leu Ala Cys Val Lys Lys Thr Ser Tyr Pro Asp Cys35 40 45Ile Lys Ala Ile Ser Ala Ser Glu Ala Asp Ala Met Thr Leu Asp Gly50 55 60Gly Trp Val Tyr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val65 70 75 80Ala Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Val Glu His Pro Gln Thr Tyr Tyr Tyr85 90 95Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Thr Asp Phe Gln Leu Asn Gln Leu100 105 110Glu Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp115 120 125Val Ile Pro Ile Gly Leu Leu Phe Cys Lys Leu Ser Glu Pro Arg Ser130 135 140Pro Leu Glu Lys Ala Val Ser Ser Phe Phe Ser Gly Ser Cys Val Pro145 150 155 160Cys Ala Asp Pro Val Ala Phe Pro Lys Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly165 170 175Cys Gly Cys Ser Ser Thr Gln Pro Phe Phe Gly Tyr Val Gly Ala Phe180 185 190Lys Cys Leu Lys Asp Gly Gly Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Thr195 200 205Thr Ile Phe Glu Val Leu Pro Glu Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu210 215 220Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Gln Tyr Glu Asp225 230 235 240Cys Tyr Leu Ala Arg Ile Pro Ser His Ala Val Val Ala Arg Lys Asn245 250 255
Asn Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Ile Leu Lys Val Ala Gln Glu260 265 270His Phe Gly Lys Gly Lys Ser Lys Asp Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro275 280 285Leu Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala Phe Gly Leu Leu Arg290 295 300Val Pro Pro Arg Met Asp Tyr Arg Leu Tyr Leu Gly His Asn Tyr Val305 310 315 320Thr Ala Ile Arg Asn Gln Gln Glu Gly Val Cys Pro Glu Gly Ser Ile325 330 335Asp Asn Ser Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His Leu Glu Arg Thr340 345 350Lys Cys Asp Glu Trp Ser Ile Ile Ser Glu Gly Lys Ile Glu Cys Glu355 360 365Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Glu Lys Ile Val Asn Gly Glu370 375 380Ala Asp Ala Met Thr Leu Asp Gly Gly His Ala Tyr Ile Ala Gly Gln385 390 395 400Cys Gly Leu Val Pro Val Met Ala Glu Tyr Tyr Glu Ser Ser Asn Cys405 410 415Ala Ile Pro Ser Gln Gln Gly Ile Phe Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Val420 425 430Ala Val Val Lys Ala Ser Asp Thr Ser Ile Thr Trp Asn Asn Leu Lys435 440 445Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn450 455 460Ile Pro Met Gly Met Leu Tyr Asn Arg Ile Asn His Cys Lys Phe Asp465 470 475 480Glu Phe Phe Ser Gln Gly Cys Ala Pro Gly Tyr Glu Lys Asn Ser Thr485 490 495Leu Cys Asp Leu Cys Ile Gly Pro Leu Lys Cys Ala Pro Asn Asn Lys500 505 510Glu Glu Tyr Asn Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys515 520 525Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Leu Asp Asn Thr Glu530 535 540Gly Lys Asn Pro Ala Glu Trp Ala Lys Asn Leu Lys Gln Glu Asp Phe545 550 555 560Glu Leu Leu Cys Pro Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Lys Asp Phe Ala565 570 575
Ser Cys His Leu Ala Gln Ala Pro Asn His Val Val Val Ser Arg Lys580 585 590Glu Lys Ala Ala Arg Val Lys Ala Val Leu Thr Ser Gln Glu Thr Leu595 600 605Phe Gly Gly Ser Asp Cys Thr Gly Asn Phe Cys Leu Phe Lys Ser Thr610 615 620Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Lys Cys Phe Val Lys Leu625 630 635 640Pro Glu Gly Thr Thr Pro Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Glu Tyr Met Gln645 650 655Ser Val Gly Asn Met Arg Lys Cys Ser Thr Ser Arg Leu Leu Glu Ala660 665 670Cys Thr Phe His Lys675<210>84<211>688<212>PRT<213>Equus caballus<400>84Ala Glu Gln Thr Val Arg Trp Cys Thr Val Ser Asn His Glu Val Ser1 5 10 15Lys Cys Ala Ser Phe Arg Asp Ser Met Lys Ser Ile Val Pro Ala Pro20 25 30Pro Leu Val Ala Cys Val Lys Arg Thr Ser Tyr Leu Glu Cys Ile Lys35 40 45Ala Ile Ala Asp Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala Gly Leu50 55 60Val Phe Glu Ala Gly Leu Ser Pro Tyr Asn Leu Lys Pro Val Val Ala65 70 75 80Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Thr Glu Pro Gln Thr His Tyr Tyr Ala Val85 90 95Ala Val Val Lys Lys Asn Ser Asn Phe Gln Leu Asn Gln Leu Gln Gly100 105 110Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp Asn Ile115 120 125Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Trp Gln Leu Pro Glu Pro Arg Glu Ser Leu130 135 140Gln Lys Ala Val Ser Asn Phe Phe Ala Gly Ser Cys Val Pro Cys Ala145 150 155 160
Asp Arg Thr Ala Val Pro Asn Leu Cys Gln Leu Cys Val Gly Lys Gly165 170 175Thr Asp Lys Cys Ala Cys Ser Asn His Glu Pro Tyr Phe Gly Tyr Ser180 185 190Gly Ala Phe Lys Cys Leu Ala Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val195 200 205Lys His Ser Thr Val Leu Glu Asn Leu Pro Gln Glu Ala Asp Arg Asp210 215 220Glu Tyr Gln Leu Leu Cys Arg Asp Asn Thr Arg Lys Ser Val Asp Glu225 230 235 240Tyr Lys Asp Cys Tyr Leu Ala Ser Ile Pro Ser His Ala Val Val Ala245 250 255Arg Ser Val Asp Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Gly Leu Leu Asn Gln260 265 270Ala Gln Glu His Phe Gly Thr Glu Lys Ser Lys Asp Phe His Leu Phe275 280 285Ser Ser Pro His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala Leu Gly290 295 300Phe Leu Arg Ile Pro Pro Ala Met Asp Thr Trp Leu Tyr Leu Gly Tyr305 310 315 320Glu Tyr Val Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Asp Ile Arg Pro Glu325 330 335Val Pro Lys Asp Glu Cys Lys Lys Val Lys Trp Cys Ala Ile Gly His340 345 350His Glu Lys Val Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Gly Gly Asn355 360 365Ile Glu Cys Glu Ser Ala Gln Ser Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile370 375 380Val Lys Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Ile Tyr385 390 395 400Ile Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Glu405 410 415Thr Arg Ser Gly Ser Ala Cys Val Asp Thr Pro Glu Glu Gly Tyr His420 425 430Ala Val Ala Val Val Lys Ser Ser Ser Asp Pro Asp Leu Thr Trp Asn435 440 445Ser Leu Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Val Asp Arg Thr Ala450 455 460Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu Tyr Ser Glu Ile Lys His Cys465 470 475 480Glu Phe Asp Lys Phe Phe Arg Glu Gly Cys Ala Pro Gly Tyr Arg Arg485 490 495
Asn Ser Thr Leu Cys Asn Leu Cys Ile Gly Ser Ala Ser Gly Pro Gly500 505 510Arg Glu Cys Glu Pro Asn Asn His Glu Arg Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly515 520 525Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His530 535 540Gln Thr Val Glu Gln Asn Thr Asp Gly Arg Asn Pro Asp Asp Trp Ala545 550 555 560Lys Asp Leu Lys Ser Glu Asn Phe Lys Leu Leu Cys Pro Asp Gly Thr565 570 575Arg Lys Ser Val Thr Glu Phe Lys Ser Cys Tyr Leu Ala Arg Ala Pro580 585 590Asn His Ala Val Val Ser Arg Lys Glu Lys Ala Ala Cys Val Cys Gln595 600 605Glu Leu His Asn Gln Gln Ala Ser Tyr Gly Lys Asn Gly Ser His Cys610 615 620Pro Asp Lys Phe Cys Leu Phe Gln Ser Ala Thr Lys Asp Leu Leu Phe625 630 635 640Arg Asp Asp Thr Gln Cys Leu Ala Asn Leu Gln Pro Thr Thr Thr Tyr645 650 655Lys Thr Tyr Leu Gly Glu Lys Tyr Leu Thr Ala Val Ala Asn Leu Arg660 665 670Gln Cys Ser Thr Ser Arg Leu Leu Glu Ala Cys Thr Phe His Arg Val675 680 685<210>85<211>685<212>PRT<213>Bos taurus<400>85Asp Pro Glu Arg Thr Val Arg Trp Cys Thr Ile Ser Thr His Glu Ala1 5 10 15Asn Lys Cys Ala Ser Phe Arg Glu Asn Val Leu Arg Ile Leu Glu Ser20 25 30Gly Pro Phe Val Ser Cys Val Lys Lys Thr Ser His Met Asp Cys Ile35 40 45Lys Ala Ile Ser Asn Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Gly Gly50 55 60Leu Val Tyr Glu Ala Gly Leu Lys Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val Val65 70 75 80Ala Glu Phe His Gly Thr Lys Asp Asn Pro Gln Thr His Tyr Tyr Ala85 90 95
Val Ala Val Val Lys Lys Asp Thr Asp Phe Lys Leu Asn Glu Leu Arg100 105 110Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp Asn115 120 125Ile Pro Met Ala Lys Leu Tyr Lys Glu Leu Pro Asp Pro Gln Glu Ser130 135 140Ile Gln Arg Ala Ala Ala Asn Phe Phe Ser Ala Ser Cys Val Pro Cys145 150 155 160Ala Asp Gln Ser Ser Phe Pro Lys Leu Cys Gln Leu Cys Ala Gly Lys165 170 175Gly Thr Asp Lys Cys Ala Cys Ser Asn His Glu Pro Tyr Phe Gly Tyr180 185 190Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Met Glu Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe195 200 205Val Lys His Ser Thr Val Phe Asp Asn Leu Pro Asn Pro Glu Asp Arg210 215 220Lys Asn Tyr Glu Leu Leu Cys Gly Asp Asn Thr Arg Lys Ser Val Asp225 230 235 240Asp Tyr Gln Glu Cys Tyr Leu Ala Met Val Pro Ser His Ala Val Val245 250 255Ala Arg Thr Val Gly Gly Lys Glu Asp Val Ile Trp Glu Leu Leu Asn260 265 270His Ala Gln Glu His Phe Gly Lys Asp Lys Pro Asp Asn Phe Gln Leu275 280 285Phe Gln Ser Pro His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala Asp290 295 300Gly Phe Leu Lys Ile Pro Ser Lys Met Asp Phe Glu Leu Tyr Leu Gly305 310 315 320Tyr Glu Tyr Val Thr Ala Leu Gln Asn Leu Arg Glu Ser Lys Pro Pro325 330 335Asp Ser Ser Lys Asp Glu Cys Met Val Lys Trp Cys Ala Ile Gly His340 345 350Gln Glu Arg Thr Lys Cys Asp Arg Trp Ser Gly Phe Ser Gly Gly Ala355 360 365Ile Glu Cys Glu Thr Ala Glu Asn Thr Glu Glu Cys Ile Ala Lys Ile370 375 380Met Lys Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Tyr Leu Tyr385 390 395 400Ile Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Lys405 410 415Thr Glu Gly Glu Ser Cys Lys Asn Thr Pro Glu Lys Gly Tyr Leu Ala
420 425 430Val Ala Val Val Lys Thr Ser Asp Ala Asn Ile Asn Trp Asn Asn Leu435 440 445Lys Asp Lys Lys Ser Cys His Thr Ala Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp450 455 460Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu Tyr Ser Lys Ile Asn Asn Cys Lys Phe465 470 475 480Asp Glu Phe Phe Ser Ala Gly Cys Ala Pro Gly Ser Pro Arg Asn Ser485 490 495Ser Leu Cys Ala Leu Cys Ile Gly Ser Glu Lys Gly Thr Gly Lys Glu500 505 510Cys Val Pro Asn Ser Asn Glu Arg Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe515 520 525Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp Val Ala Phe Val Lys Asp Gln Thr530 535 540Val Ile Gln Asn Thr Asp Gly Asn Asn Asn Glu Ala Trp Ala Lys Asn545 550 555 560Leu Lys Lys Glu Asn Phe Glu Val Leu Cys Lys Asp Gly Thr Arg Lys565 570 575Pro Val Thr Asp Ala Glu Asn Cys His Leu Ala Arg Gly Pro Asn His580 585 590Ala Val Val Ser Arg Lys Asp Lys Ala Thr Cys Val Glu Lys Ile Leu595 600 605Asn Lys Gln Gln Asp Asp Phe Gly Lys Ser Val Thr Asp Cys Thr Ser610 615 620Asn Phe Cys Leu Phe Gln Ser Asn Ser Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp625 630 635 640Asp Thr Lys Cys Leu Ala Ser Ile Ala Lys Lys Thr Tyr Asp Ser Tyr645 650 655Leu Gly Asp Asp Tyr Val Arg Ala Met Thr Asn Leu Arg Gln Cys Ser660 665 670Thr Ser Lys Leu Leu Glu Ala Cys Thr Phe His Lys Pro675 680 685<210>86<211>696<212>PRT<213>Sus scrofa<220>
<221>MISC FEATURE<222>(308)..(308)<223>Xaa可以是任何天然氨基酸<400>86
Val Ala Gln Lys Thr Val Arg Trp Cys Thr Ile Ser Asn Gln Glu Ala1 5 10 15Asn Lys Cys Ser Ser Phe Arg Glu Asn Met Ser Lys Ala Val Lys Asn20 25 30Gly Pro Leu Val Ser Cys Val Lys Lys Ser Ser Tyr Leu Asp Cys Ile35 40 45Lys Ala Ile Arg Asp Lys Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala Gly50 55 60Leu Val Phe Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Asn Leu Lys Pro Val Val65 70 75 80Ala Glu Phe Tyr Gly Gln Lys Asp Asn Pro Gln Thr His Tyr Tyr Ala85 90 95Val Ala Val Val Lys Lys Gly Ser Asn Phe Gln Trp Asn Gln Leu Gln100 105 110Gly Lys Arg Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp Ile115 120 125Ile Pro Met Gly Leu Leu Tyr Asp Gln Leu Pro Glu Pro Arg Lys Pro130 135 140Ile Glu Lys Ala Val Ala Ser Phe Phe Ser Ser Ser Cys Val Pro Cys145 150 155 160Ala Asp Pro Val Asn Phe Pro Lys Leu Cys Gln Gln Cys Ala Gly Lys165 170 175Gly Ala Glu Lys Cys Ala Cys Ser Asn His Glu Pro Tyr Phe Gly Tyr180 185 190Ala Gly Ala Phe Asn Cys Leu Lys Glu Asp Ala Gly Asp Val Ala Phe195 200 205Val Lys His Ser Thr Val Leu Glu Asn Leu Pro Asp Lys Ala Asp Arg210 215 220Asp Gln Tyr Glu Leu Leu Cys Arg Asp Asn Thr Arg Arg Pro Val Asp225 230 235 240Asp Tyr Glu Asn Cys Tyr Leu Ala Gln Val Pro Ser His Ala Val Val245 250 255Ala Arg Ser Val Asp Gly Gln Glu Asp Ser Ile Trp Glu Leu Leu Asn260 265 270Gln Ala Gln Glu His Phe Gly Arg Asp Lys Ser Pro Asp Phe Gln Leu275 280 285Phe Ser Ser Ser His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala Asn290 295 300Gly Phe Leu Xaa Ile Pro Ser Lys Met Asp Ser Ser Leu Tyr Leu Gly305 310 315 320
Tyr Gln Tyr Val Thr Ala Leu Arg Asn Leu Arg Glu Glu Ile Ser Pro325 330 335Asp Ser Ser Lys Asn Glu Cys Lys Lys Val Arg Trp Cys Ala Ile Gly340 345 350His Glu Glu Thr Gln Lys Cys Asp Ala Trp Ser Ile Asn Ser Gly Gly355 360 365Lys Ile Glu Cys Val Ser Ala Glu Asn Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys370 375 380Ile Val Lys Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Tyr Ile385 390 395 400Tyr Ile Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr405 410 415Lys Thr Glu Gly Glu Asn Cys Val Asn Thr Pro Glu Lys Gly Tyr Leu420 425 430Ala Val Ala Val Val Lys Lys Ser Ser Gly Pro Asp Leu Asn Trp Asn435 440 445Asn Leu Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Ala Val Asp Arg Thr Ala450 455 460Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn Ser Cys465 470 475 480Lys Phe Asp Gln Phe Phe Gly Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Gln Arg485 490 495Asn Ser Ser Leu Cys Ala Leu Cys Ile Gly Ser Glu Arg Ala Pro Gly500 505 510Arg Glu Cys Leu Ala Asn Asn His Glu Arg Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly515 520 525Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp Val Ala Phe Val Lys Asp530 535 540Gln Val Val Gln Gln Asn Thr Asp Gly Lys Asn Lys Asp Asp Trp Ala545 550 555 560Lys Asp Leu Lys Gln Met Asp Phe Glu Leu Leu Cys Gln Asn Gly Ala565 570 575Arg Glu Pro Val Asp Asn Ala Glu Asn Cys His Leu Ala Arg Ala Pro580 585 590Asn His Ala Val Val Ala Arg Asp Asp Lys Val Thr Cys Val Ala Glu595 600 605Glu Leu Leu Lys Gln Gln Ala Gln Phe Gly Arg His Val Thr Asp Cys610 615 620Ser Ser Ser Phe Cys Met Phe Lys Ser Asn Thr Lys Asp Leu Leu Phe625 630 635 640Arg Asp Asp Thr Gln Cys Leu Ala Arg Val Gly Lys Thr Thr Tyr Glu645 650 655
Ser Tyr Leu Gly Ala Asp Tyr Ile Thr Ala Val Ala Asn Leu Arg Lys660 665 670Cys Ser Thr Ser Lys Leu Leu Glu Ala Cys Thr Phe His Ser Ala Lys675 680 685Asn Pro Arg Val Glu Thr Thr Thr690 695<210>87<211>686<212>PRT<213>Gallus gallus<400>87Ala Pro Pro Lys Ser Val Ile Arg Trp Cys Thr Ile Ser Ser Pro Glu1 5 10 15Glu Lys Lys Cys Asn Asn Leu Arg Asp Leu Thr Gln Gln Glu Arg Ile20 25 30Ser Leu Thr Cys Val Gln Lys Ala Thr Tyr Leu Asp Cys Ile Lys Ala35 40 45Ile Ala Asn Asn Glu Ala Asp Ala Ile Ser Leu Asp Gly Gly Gln Ala50 55 60Phe Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Lys Leu Lys Pro Ile Ala Ala Glu65 70 75 80Val Tyr Glu His Thr Glu Gly Ser Thr Thr Ser Tyr Tyr Ala Val Ala85 90 95Val Val Lys Lys Gly Thr Glu Phe Thr Val Asn Asp Leu Gln Gly Lys100 105 110Thr Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp Asn Ile Pro115 120 125Ile Gly Thr Leu Leu His Arg Gly Ala Ile Glu Trp Glu Gly Ile Glu130 135 140Ser Gly Ser Val Glu Gln Ala Val Ala Lys Phe Phe Ser Ala Ser Cys145 150 155 160Val Pro Gly Ala Thr Ile Glu Gln Lys Leu Cys Arg Gln Cys Lys Gly165 170 175Asp Pro Lys Thr Lys Cys Ala Arg Asn Ala Pro Tyr Ser Gly Tyr Ser180 185 190Gly Ala Phe His Cys Leu Lys Asp Gly Lys Gly Asp Val Ala Phe Val195 200 205Lys His Thr Thr Val Asn Glu Asn Ala Pro Asp Gln Lys Asp Glu Tyr210 215 220Glu Leu Leu Cys Leu Asp Gly Ser Arg Gln Pro Val Asp Asn Tyr Lys
225 230 235 240Thr Cys Asn Trp Ala Arg Val Ala Ala His Ala Val Val Ala Arg Asp245 250 255Asp Asn Lys Val Glu Asp Ile Trp Ser Phe Leu Ser Lys Ala Gln Ser260 265 270Asp Phe Gly Val Asp Thr Lys Ser Asp Phe His Leu Phe Gly Pro Pro275 280 285Gly Lys Lys Asp Pro Val Leu Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala290 295 300Ile Met Leu Lys Arg Val Pro Ser Leu Met Asp Ser Gln Leu Tyr Leu305 310 315 320Gly Phe Glu Tyr Tyr Ser Ala Ile Gln Ser Met Arg Lys Asp Gln Leu325 330 335Thr Pro Ser Pro Arg Glu Asn Arg Ile Gln Trp Cys Ala Val Gly Lys340 345 350Asp Glu Lys Ser Lys Cys Asp Arg Trp Ser Val Val Ser Asn Gly Asp355 360 365Val Glu Cys Thr Val Val Asp Glu Thr Lys Asp Cys Ile Ile Lys Ile370 375 380Met Lys Gly Glu Ala Asp Ala Val Ala Leu Asp Gly Gly Leu Val Tyr385 390 395 400Thr Ala Gly Val Cys Gly Leu Val Pro Val Met Ala Glu Arg Tyr Asp405 410 415Asp Glu Ser Gln Cys Ser Lys Thr Asp Glu Arg Pro Ala Ser Tyr Phe420 425 430Ala Val Ala Val Ala Arg Lys Asp Ser Asn Val Asn Trp Asn Asn Leu435 440 445Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp450 455 460Val Ile Pro Met Gly Leu Ile His Asn Arg Thr Gly Thr Cys Asn Phe465 470 475 480Asp Glu Tyr Phe Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Pro Pro Asn Ser485 490 495Arg Leu Cys Gln Leu Cys Gln Gly Ser Gly Gly Ile Pro Pro Glu Lys500 505 510Cys Val Ala Ser Ser His Glu Lys Tyr Phe Gly Tyr Thr Gly Ala Leu515 520 525Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp Val Ala Phe Ile Gln His Ser Thr530 535 540Val Glu Glu Asn Thr Gly Gly Lys Asn Lys Ala Asp Trp Ala Lys Asn
545 550 555 560Leu Gln Met Asp Asp Phe Glu Leu Leu Cys Thr Asp Gly Arg Arg Ala565 570 575Asn Val Met Asp Tyr Arg Glu Cys Asn Leu Ala Glu Val Pro Thr His580 585 590Ala Val Val Val Arg Pro Glu Lys Ala Asn Lys Ile Arg Asp Leu Leu595 600 605Glu Arg Gln Glu Lys Arg Phe Gly Val Asn Gly Ser Glu Lys Ser Lys610 615 620Phe Met Met Phe Glu Ser Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Leu625 630 635 640Thr Lys Cys Leu Phe Lys Val Arg Glu Gly Thr Thr Tyr Lys Glu Phe645 650 655Leu Gly Asp Lys Phe Tyr Thr Val Ile Ser Ser Leu Lys Thr Cys Asn660 665 670Pro Ser Asp Ile Leu Gln Met Cys Ser Phe Leu Glu Gly Lys675 680 685<210>88<211>117<212>PRT<213>人工的<220>
<223>抗-TNF-α/ScFv抗體的VH區(qū)<400>88Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr20 25 30Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50 55 60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg His Gly Trp Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Phe Ile Gly115
<210>89<211>119<212>PRT<213>人工的<220>
<223>SEQ ID NO5的VH區(qū)，US 5,698,195<400>89Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn His20 25 30Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu50 55 60Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala65 70 75 80Val Tyr Leu Gln Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr85 90 95Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser115<210>90<211>223<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>MISC_FEATURE<223>抗-TNF-α抗體的VH區(qū)，Gen Bank No.BAB18250<400>90Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Asp Ser Gly Asp Leu Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro115 120 125Leu Val Ser Cys Glu Asn Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val130 135 140Gly Cys Leu Ala Gln Asp Phe Leu Pro Asp Ser Ile Ile Phe Ser Trp145 150 155 160Lys Tyr Lys Asn Asn Ser Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser165 170 175Val Leu Arg Gly Gly Lys Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro180 185 190Ser Lys Asp Val Met Gln Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val195 200 205Gln His Pro Asn Gly Asn Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val210 215 220<210>91<211>222<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>MISC_FEATURE<223>抗-TNF-α抗體的VH區(qū)，Gen Bank No.BAB18252<400>91Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Ser Phe20 25 30Pro Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Arg Ile Ile Pro Ile Ile Gly Ile Ala Asp Tyr Ala Gln Glu Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Arg Ser Leu Ile Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Pro Glu Ala Val Thr Val Pro Ala Pro Leu Asp Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala130 135 140Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val145 150 155 160Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala165 170 175Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val180 185 190Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His195 200 205Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys210 215 220<210>92<211>221<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>MISC_FEATURE<223>抗-TNF-α抗體的VH區(qū)，Gen Bank No.BAB18254<400>92Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Met Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Gly Thr Ser Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile50 55 60Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu65 70 75 80Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Gln Phe85 90 95Tyr His Asp Ser Ser Gly Tyr Leu Asp Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val115 120 125Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala130 135 140Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser145 150 155 160Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro180 185 190Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys195 200 205Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys210 215 220<210>93<211>228<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>MISC FEATURE<223>抗-TNF-α抗體的VH區(qū)，Gen Bank No.BAB18256<400>93Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr20 25 30Val Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Gly Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Met Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Asp Leu Ser Asn Arg Leu Ser Gly Gly Gly Thr Phe Asp Ile100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala115 120 125Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn Ser Pro Ser Asp Thr130 135 140Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp Phe Leu Pro Asp Ser145 150 155 160Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser Asp Ile Ser Ser Thr165 170 175Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys Tyr Ala Ala Thr Ser180 185 190Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln Gly Thr Asp Glu His195 200 205
Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn Lys Glu Lys Asn Val210 215 220Pro Leu Pro Val225<210>94<211>111<212>PRT<213>人工的<220>
<223>抗-TNF-α/ScFv抗體的VL區(qū)<400>94Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln1 5 10 15Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly20 25 30Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu35 40 45Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser85 90 95Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105 110<210>95<211>107<212>PRT<213>人工的<220>
<223>VL區(qū)，US 5,698,195的SEQ ID NO3<400>95Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Phe Val Gly Ser Ser20 25 30Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Thr Val Glu Ser65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe85 90 95Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys100 105<210>96<211>214<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>MISC FEATURE<223>抗-TNF-α抗體的VL區(qū)，Gen Bank No.BAB18251<400>96Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Pro Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Val Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Arg Asp Asn Trp Pro Trp85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105 110Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala130 135 140Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln145 150 155 160Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser165 170 175Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr180 185 190Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser195 200 205Phe Asn Arg Gly Glu Cys210<210>97
<211>213<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>MISC FEATURE<223>抗-TNF-α抗體的VL區(qū)，Gen Bank No.BAB18253<400>97Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Lys Ala Ser Gly Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Trp Thr85 90 95Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro100 105 110Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr115 120 125Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys130 135 140Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu145 150 155 160Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser165 170 175Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu Tyr Ala180 185 190Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe195 200 205Asn Arg Gly Glu Cys210<210>98<211>213<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>MISC FEATURE<223>抗-TNF-α抗體的VL區(qū)，Gen Bank No.BAB18255<400>98
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Asn Asn Trp20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Ala Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Pro Trp Thr85 90 95Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro100 105 110Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr115 120 125Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys130 135 140Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu145 150 155 160Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser165 170 175Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu Tyr Ala180 185 190Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe195 200 205Asn Arg Gly Glu Cys210<210>99<211>214<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>MISC FEATURE<223>抗-TNF-α抗體的VL區(qū)，Gen Bank No.BAB18257<400>99Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45
Asn Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Val Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105 110Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala130 135 140Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln145 150 155 160Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser165 170 175Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr180 185 190Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser195 200 205Phe Asn Arg Gly Glu Cys210
權(quán)利要求
1.包含被融合到至少一個(gè)抗體可變區(qū)上的轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)的融合蛋白，其中相對(duì)于野生型Tf蛋白，該Tf蛋白的糖基化減少。
2.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)包含VH、VL或CDR區(qū)。
3.權(quán)利要求1的融合蛋白，包含至少兩個(gè)抗體可變區(qū)。
4.權(quán)利要求3的融合蛋白，包含至少VH和VL區(qū)域、VH和VH區(qū)或VL和VL區(qū)。
5.權(quán)利要求1的融合蛋白，包含至少兩個(gè)不同的抗體可變區(qū)。
6.權(quán)利要求5的融合蛋白，其中不同的抗體可變區(qū)特異地結(jié)合不同抗原。
7.權(quán)利要求3的融合蛋白，其中融合蛋白被改造，使得抗體可變區(qū)非常接近。
8.權(quán)利要求7的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)被插入到兩個(gè)鄰近Tf環(huán)中。
9.權(quán)利要求8的融合蛋白，其中一個(gè)抗體可變區(qū)被融合到Tf的C末端，而一個(gè)抗體可變區(qū)被插入到鄰近的Tf環(huán)中。
10.權(quán)利要求8的融合蛋白，其中一個(gè)抗體可變區(qū)被融合到Tf的N末端，而一個(gè)抗體可變區(qū)被插入到鄰近的Tf環(huán)中。
11.權(quán)利要求9的融合蛋白，其中Tf的C末端的脯氨酸殘基被缺失或者用其它氨基酸取代。
12.權(quán)利要求9的融合蛋白，其中Tf的C末端的半胱氨酸環(huán)被刪除。
13.權(quán)利要求8的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)被融合到Tf的N末端和C末端。
14.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)包含至少一個(gè)CDR肽。
15.權(quán)利要求14的融合蛋白，其中CDR肽特異地結(jié)合抗原。
16.權(quán)利要求14的融合蛋白，其中CDR肽來源于抗體。
17.權(quán)利要求14的融合蛋白，其中CDR肽來源于肽文庫。
18.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)特異地結(jié)合腫瘤壞死因子α(TNFα)。
19.權(quán)利要求14的融合蛋白，其中CDR特異地結(jié)合TNF。
20.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中至少一個(gè)抗體可變區(qū)包含抗體的VH或VL區(qū)的氨基末端結(jié)構(gòu)域。
21.權(quán)利要求20的融合蛋白，其中氨基末端結(jié)構(gòu)域包含至少一個(gè)CDR。
22.權(quán)利要求21的融合蛋白，其中氨基末端結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)CDRs。
23.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)被融合到Tf的C末端。
24.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)被融合到Tf的N末端。
25.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)被插入到Tf的至少一個(gè)環(huán)中。
26.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)的親合性降低。
27.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白是乳運(yùn)鐵蛋白(乳鐵蛋白)。
28.權(quán)利要求26的融合蛋白，其中Tf蛋白不結(jié)合TfR。
29.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白對(duì)鐵離子的親合性降低。
30.權(quán)利要求29的融合蛋白，其中Tf蛋白不結(jié)合鐵離子。
31.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白包含至少一個(gè)防止糖基化的突變。
32.權(quán)利要求31的融合蛋白，其中Tf蛋白是乳運(yùn)鐵蛋白(乳鐵蛋白)。
33.權(quán)利要求1的融合蛋白，在存在抑制糖基化的化合物時(shí)被表達(dá)。
34.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白包含Tf蛋白的N末端結(jié)構(gòu)域的一部分、橋連肽和Tf蛋白的C末端結(jié)構(gòu)域的一部分。
35.權(quán)利要求34的融合蛋白，其中橋連肽將抗體可變區(qū)連接到Tf上。
36.權(quán)利要求34的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)被插入到Tf蛋白的N和C結(jié)構(gòu)域之間。
37.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白在Tf鉸鏈區(qū)包含至少一個(gè)氨基酸取代、缺失或添加。
38.權(quán)利要求37的融合蛋白，其中所述鉸鏈區(qū)選自SEQ ID NO3的約殘基94到約殘基96、SEQ ID NO3的約殘基245到約殘基247、SEQ IDNO3的約殘基316到約殘基318、SEQ ID NO3的約殘基425到約殘基427、SEQ ID NO3的約殘基581到約殘基582，以及SEQ ID NO3的約殘基652到約殘基658。
39.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白基因在SEQ ID NO3中的選自Asp 63、Gly 65、Tyr 95、Tyr 188、Lys 206、His 207、His 249、Asp392、Tyr 426、Tyr 514、Tyr 517、His 585、Thr 120、Arg 124、Ala 126、Gly127、Thr 452、Arg 456、Ala 458和Gly 459的位置上具有至少一個(gè)氨基酸取代、缺失或添加。
40.權(quán)利要求25的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)取代至少一個(gè)Tf環(huán)。
41.權(quán)利要求31的融合蛋白，其中糖基化位點(diǎn)選自對(duì)應(yīng)于氨基酸N413、N611的氨基酸殘基。
42.權(quán)利要求26或28的融合蛋白，其中Tf在SEQ ID NO3中的對(duì)應(yīng)于Asp 63、Gly 65、Tyr 95、Tyr188、Lys 206、His 207、His 249、Asp 392、Tyr 426、Tyr 514、Tyr 517、His 585、Thr 120、Arg 124、Ala 126、Gly 127、Thr 452、Arg 456、Ala 458和Gly 459的氨基酸殘基上包含至少一個(gè)氨基酸取代、刪除或添加。
43.包含被融合到至少一個(gè)抗體可變區(qū)上的對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)的親合性降低的轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)的融合蛋白。
44.權(quán)利要求43的融合蛋白，包含至少兩個(gè)抗體可變區(qū)。
45.權(quán)利要求44的融合蛋白，包含至少VH和VL區(qū)域、VH和VH區(qū)或VL和VL區(qū)。
46.權(quán)利要求43的融合蛋白，包含至少兩個(gè)不同的抗體可變區(qū)。
47.權(quán)利要求46的融合蛋白，其中不同的抗體可變區(qū)特異地結(jié)合不同抗原。
48.權(quán)利要求44的融合蛋白，其中融合蛋白被改造，使得抗體可變區(qū)十分接近。
49.權(quán)利要求48的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)被插入到兩個(gè)鄰近的Tf環(huán)中。
50.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中一個(gè)抗體可變區(qū)被融合到Tf的C末端，而一個(gè)抗體可變區(qū)被插入到鄰近的Tf環(huán)中。
51.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中一個(gè)抗體可變區(qū)被融合到Tf的N末端，而一個(gè)抗體可變區(qū)被插入到鄰近的Tf環(huán)中。
52.權(quán)利要求50的融合蛋白，其中TfC末端的脯氨酸殘基被缺失。
53.權(quán)利要求50的融合蛋白，其中TfC末端的半胱氨酸環(huán)被缺失。
54.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)被融合到Tf的N末端和C末端。
55.權(quán)利要求43的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)包含至少一個(gè)CDR肽。
56.權(quán)利要求55的融合蛋白，其中CDR肽特異地結(jié)合抗原。
57.權(quán)利要求55的融合蛋白，其中CDR肽來源于抗體。
58.權(quán)利要求55的融合蛋白，其中CDR肽來源于肽文庫。
59.權(quán)利要求43的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)特異地結(jié)合腫瘤壞死因子(TNF)。
60.權(quán)利要求55的融合蛋白，其中CDR特異地結(jié)合TNFα。
61.權(quán)利要求43的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)包含抗體的VH或VL區(qū)的氨基末端結(jié)構(gòu)域。
62.權(quán)利要求61的融合蛋白，其中氨基末端結(jié)構(gòu)域包含至少一個(gè)CDR。
63.權(quán)利要求62的融合蛋白，其中氨基末端結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)CDR。
64.權(quán)利要求1或43的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)的血清半衰期被延長(zhǎng)，超過未被融合狀態(tài)下的抗體可變區(qū)的血清半衰期。
65.權(quán)利要求43的融合蛋白，其中治療性蛋白質(zhì)或肽被融合到Tf的C末端。
66.權(quán)利要求43的融合蛋白，其中治療性蛋白質(zhì)或肽被融合到Tf的N末端。
67.權(quán)利要求43的融合蛋白，其中治療性蛋白質(zhì)或肽被插入到Tf的至少一個(gè)環(huán)中。
68.權(quán)利要求43的融合蛋白，其中Tf蛋白不結(jié)合TfR。
69.權(quán)利要求43的融合蛋白，其中Tf蛋白對(duì)鐵離子的親合性降低。
70.權(quán)利要求69的融合蛋白，其中Tf蛋白不結(jié)合鐵離子。
71.權(quán)利要求43的融合蛋白，其中所述Tf蛋白的糖基化減少或未糖基化。
72.權(quán)利要求71的融合蛋白，包含至少一個(gè)防止糖基化的突變。
73.權(quán)利要求43的融合蛋白，其中所述Tf蛋白包含Tf蛋白的N末端結(jié)構(gòu)域的一部分、橋連肽和Tf蛋白的C末端結(jié)構(gòu)域的一部分。
74.權(quán)利要求73的融合蛋白，其中橋連肽將治療性蛋白質(zhì)或肽連接到Tf上。
75.權(quán)利要求73的融合蛋白，其中治療性蛋白質(zhì)、肽或多肽插入到Tf蛋白的N末端結(jié)構(gòu)域和C末端結(jié)構(gòu)域之間。
76.權(quán)利要求73的融合蛋白，其中Tf蛋白在Tf鉸鏈區(qū)具有至少一個(gè)氨基酸取代、刪除或添加。
77.權(quán)利要求76的融合蛋白，其中所述鉸鏈區(qū)選自約殘基94到約殘基96、約殘基245到約殘基247、約殘基316到約殘基318、約殘基425到約殘基427、約殘基581到約殘基582，以及約殘基652到約殘基658。
78.權(quán)利要求43的融合蛋白，其中Tf蛋白選自Asp 63、Gly 65、Tyr 95、Tyr188、Lys 206、His 207、His 249、Asp 392、Tyr 426、Tyr 514、Tyr 517、His 585、Thr 120、Arg 124、Ala 126、Gly 127、Thr 452、Arg 456、Ala 458和Gly 459的位置上具有至少一個(gè)氨基酸取代、刪除或添加。
79.權(quán)利要求67的融合蛋白，其中治療性蛋白或肽取代至少一個(gè)環(huán)。
80.權(quán)利要求71的融合蛋白，其中糖基化位點(diǎn)選自對(duì)應(yīng)于氨基酸N413、N611的氨基酸殘基。
81.編碼權(quán)利要求1或43的融合蛋白的核酸分子。
82.包含權(quán)利要求81的核酸分子的載體。
83.包含權(quán)利要求82的載體的宿主細(xì)胞。
84.包含權(quán)利要求81的核酸分子的宿主細(xì)胞。
85.表達(dá)Tf融合蛋白的方法，包括在表達(dá)被編碼的融合蛋白的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求83的宿主細(xì)胞。
86.表達(dá)Tf融合蛋白的方法，包括在表達(dá)被編碼的融合蛋白的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求84的宿主細(xì)胞。
87.權(quán)利要求83的宿主細(xì)胞，其中該細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
88.權(quán)利要求84的宿主細(xì)胞，其中該細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
89.權(quán)利要求87的宿主細(xì)胞，其中該細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
90.權(quán)利要求88的宿主細(xì)胞，其中該細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
91.包含81的核酸分子的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
92.制備Tf融合蛋白的方法，包括從權(quán)利要求91的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中分離融合蛋白。
93.權(quán)利要求92的方法，其中Tf融合蛋白包含乳鐵蛋白。
94.權(quán)利要求93的方法，其中融合蛋白從來自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生物液體中分離。
95.權(quán)利要求93的方法，其中液體是血清或乳汁。
96.治療患者中的疾病或疾病癥狀的方法，包括施用權(quán)利要求1或權(quán)利要求43的融合蛋白的步驟。
97.權(quán)利要求1或權(quán)利要求43的融合蛋白，其中Tf蛋白在蛋白質(zhì)的各端具有N末端結(jié)構(gòu)域。
98.權(quán)利要求97的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)被融合到Tf蛋白的各個(gè)N末端結(jié)構(gòu)域中。
99.權(quán)利要求1或權(quán)利要求43的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)特異性地結(jié)合毒素。
100.權(quán)利要求96的方法，其中抗體可變區(qū)結(jié)合TNF。
101.權(quán)利要求100的方法，其中該疾病選自膿毒性休克；內(nèi)毒素性休克；與細(xì)菌感染、病毒感染、寄生蟲感染、瘤形成疾病相關(guān)的惡病質(zhì)綜合癥；自體免疫性疾病、炎癥性疾病、關(guān)節(jié)炎，以及與防止移植排斥的處理相關(guān)的副作用。
102.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白包含單一的N末端結(jié)構(gòu)域。
103.權(quán)利要求9的融合蛋白，其中Tf中的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸被取代。
104.權(quán)利要求12a的融合蛋白，其中一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸被絲氨酸取代。
105.權(quán)利要求33的融合蛋白，其中化合物是衣霉素。
106.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中融合蛋白已經(jīng)用酶處理來將部分或全部的糖類去糖。
107.權(quán)利要求25的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)取代Tf環(huán)的一部分以及鄰近Tf環(huán)的一部分。
全文摘要
公開了轉(zhuǎn)鐵蛋白與治療性蛋白或肽優(yōu)選為抗體可變區(qū)的被修飾的融合蛋白，其血清半衰期或者血清穩(wěn)定性被提高。優(yōu)選的融合蛋白包括那些使轉(zhuǎn)鐵蛋白部分不發(fā)生或減少糖基化，結(jié)合鐵離子和/或結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的修飾。
文檔編號(hào)A61K47/48GK1694895SQ03824745
公開日2005年11月9日 申請(qǐng)日期2003年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月30日
發(fā)明者霍馬揚(yáng)·薩德吉, 克里斯托弗·P·普里奧爾, 安德魯·特納 申請(qǐng)人:比奧雷克西斯藥物公司