專利名稱：含有半乳凝素9的醫(yī)藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到利用半乳凝素(galectin)9、特別是人半乳凝素9(Gal-9)對惡性腫瘤細胞的毒害細胞活性、對惡性腫瘤細胞的凋亡誘導(dǎo)活性、對惡性腫瘤細胞的抗腫瘤活性(抗癌活性)、活化T細胞的凋亡誘導(dǎo)活性、特別是CD4陽性T細胞的凋亡誘導(dǎo)活性、免疫抑制活性、抗炎癥作用、抗過敏作用的技術(shù)。本發(fā)明涉及到利用半乳凝素9及其相關(guān)技術(shù)的抗腫瘤劑(抗癌劑)、抗過敏劑、免疫抑制劑、自身免疫疾病用劑、抗炎癥劑以及腎上腺皮質(zhì)類固醇激素代用劑。
背景技術(shù)：
據(jù)報道，半乳凝素9在小鼠中惹起胸腺細胞的凋亡，一方面誘導(dǎo)大鼠脾細胞中的T細胞的凋亡，另一方面半乳凝素9雖然特異性地誘導(dǎo)CD8陽性T細胞的凋亡，但不誘導(dǎo)CD4陽性T細胞的凋亡。另外，其他的半乳凝素、例如半乳凝素1誘導(dǎo)活化T細胞的凋亡也有報道。另外，已知半乳凝素3通過將它進行基因?qū)?，可看到凋亡的抑?以上，非專利文獻1～4)。
本發(fā)明人等研究組成功地進行了來自人T細胞嗜酸性細胞游走因子的克隆，通過該研究工作發(fā)現(xiàn)該因子正是Tureci等報告的半乳凝素9(非專利文獻5)的變種、ecalectin(非專利文獻6)。本發(fā)明人等研究組進一步闡明了ecalectin與半乳凝素9是同一物質(zhì)，另外還闡明了人的半乳凝素9由于其連接肽的長度不同而分為短型、中型和長型3種(非專利文獻7)。
過敏和自身免疫疾病是由于CD4陽性T淋巴細胞的過剩免疫反應(yīng)引起的。對于難治性過敏或自身免疫疾病的治療使用類固醇激素或免疫抑制劑。然而，由于類固醇副作用強，所以存在很多問題，另外，到目前為止，存在著在已知的免疫抑制劑從副作用方面它是最強的問題。
非專利文獻1Wada J.et al.，J Clin Invest.，1997，992452-61非專利文獻2Tsuchiyama Y.et al.，Kidney Int.，2000，581941-52非專利文獻3Perillo NL et al.，Nature，Dec.14，1995，378(6558)736-9非專利文獻4Matarrese P.et al.，Int J Cancer.，F(xiàn)eb.15，2000，85(4)545-54非專利文獻5Tureci O.et al.，J Biol Chem.，Mar.7，1997，272(10)6416-22非專利文獻6Matsumoto R.et al.，J Biol Chem.，1998，27316976-84非專利文獻7Matsushita N.et al.，J Biol Chem.，2000，2758355-60生物體內(nèi)的生理活性物質(zhì)到目前為止雖然發(fā)現(xiàn)了很多，但其中很多，例如由于與作用于腫瘤細胞等同樣也作用于正常細胞，只闡明了其中一部分活性，就未必能簡單地謀求用于醫(yī)藥等。
半乳凝素9是β-半乳糖苷結(jié)合凝集素同類中的一員。半乳凝素表現(xiàn)出生物的發(fā)生·分化、細胞增殖、凋亡、細胞間粘附、細胞和細胞外基質(zhì)的粘附、以及游走活性等多種多樣的生物活性。半乳凝素9在半乳凝素之中也是由于各種各樣的刺激一方面是誘導(dǎo)其產(chǎn)生·釋放的物質(zhì)，另一方面，其產(chǎn)生和釋放在解離。另外，半乳凝素9由于其定域、即細胞質(zhì)、細胞膜以及細胞外的其存在場所不同，預(yù)測其功能也各不相同。
因此，期盼對半乳凝素9的更詳細的生物活性進行闡明，并且根據(jù)其闡明進行以醫(yī)藥品的開發(fā)為首的半乳凝素相關(guān)技術(shù)開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
半乳凝素9誘導(dǎo)活化T淋巴細胞的凋亡。另外半乳凝素9還誘導(dǎo)活化CD4陽性以及CD8陽性T淋巴細胞的凋亡，然而半乳凝素9并不誘導(dǎo)沒有活化的T淋巴細胞的凋亡。對于由該半乳凝素9引起的凋亡，CD4陽性淋巴細胞易感性更高。另外成功地發(fā)現(xiàn)了由半乳凝素9引起的凋亡可以經(jīng)由鈣、calpain、鈣蛋白酶1、半胱天冬酶3或7途徑被誘導(dǎo)。由于可以通過與作為抗炎癥劑、抗過敏劑、免疫抑制劑廣泛使用的腎上腺皮質(zhì)類固醇激素(糖皮質(zhì)激素)同樣的途徑誘起凋亡，直至認(rèn)識到半乳凝素9活性的表達預(yù)期具有與腎上腺皮質(zhì)類固醇激素同樣的生物活性，進而完成本發(fā)明。
另外，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)半乳凝素9雖然對腫瘤細胞表現(xiàn)出細胞損傷活性，但對于正常細胞沒有表現(xiàn)出細胞損傷活性、或?qū)τ谀[瘤細胞、特別是對于惡性腫瘤細胞或轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞表現(xiàn)出特征的作用(例如轉(zhuǎn)移抑制活性)，誘導(dǎo)更好的結(jié)果，或?qū)δ[瘤細胞誘導(dǎo)凋亡，但對正常細胞不誘導(dǎo)凋亡的現(xiàn)象，直至完成本發(fā)明。
本發(fā)明提供[1]醫(yī)藥或動物藥，其特征在于，(i)含有從(a)半乳凝素9及其類似物、(b)編碼半乳凝素9以及實質(zhì)上具有與其均等的生物活性的多肽的多核苷酸、(c)半乳凝素9產(chǎn)生以及釋放的誘導(dǎo)因子(d)抗半乳凝素9受體抗體、以及(e)針對半乳凝素9結(jié)合性糖鏈的抗體選出來的成分作為有效成分，(ii)所述藥物選自抗腫瘤劑、抗過敏劑、免疫抑制劑、自身免疫疾病用劑、抗炎癥劑以及腎上腺皮質(zhì)類固醇激素替代用活性成分劑。
以含有半乳凝素9或其類似物作為有效成分為特征的抗腫瘤劑。
以含有半乳凝素9或其類似物作為有效成分為特征的抗過敏劑。
以含有半乳凝素9或其類似物作為有效成分為特征的免疫抑制劑。
以含有半乳凝素9或其類似物作為有效成分為特征的自身免疫疾病用劑。
以含有半乳凝素9或其類似物作為有效成分為特征的抗炎癥劑。
以含有半乳凝素9或其類似物作為有效成分為特征的腎上腺皮質(zhì)類固醇激素替代劑。
以含有從(a)半乳凝素9及其類似物，以及(b)編碼半乳凝素9以及實質(zhì)上具有與其均等的生物活性的多肽的多核苷酸選出來的成分作為有效成分為特征的惡性細胞毒害劑。
以含有從(a)半乳凝素9及其類似物，以及(b)編碼半乳凝素9以及實質(zhì)上具有與其均等的生物活性的多肽的多核苷酸選出來的成分作為有效成分為特征的癌轉(zhuǎn)移抑制劑。
以含有從(a)半乳凝素9及其類似物、(b)編碼半乳凝素9以及實質(zhì)上具有與其均等的生物活性的多肽的多核苷酸、(c)半乳凝素9產(chǎn)生以及釋放的誘導(dǎo)因子(d)抗半乳凝素9受體抗體、以及(e)針對半乳凝素9結(jié)合性糖鏈的抗體選出來的成分作為有效成分為特征的對腫瘤細胞表現(xiàn)出毒害細胞活性的藥劑。
以含有從(a)半乳凝素9及其類似物、(b)編碼半乳凝素9以及實質(zhì)上具有與其均等的生物活性的多肽的多核苷酸、(c)半乳凝素9產(chǎn)生以及釋放的誘導(dǎo)因子(d)抗半乳凝素9受體抗體、以及(e)針對半乳凝素9結(jié)合性糖鏈的抗體選出來的成分作為有效成分為特征的對腫瘤細胞誘導(dǎo)凋亡的藥劑。
以含有從(a)半乳凝素9及其類似物、(b)編碼半乳凝素9以及實質(zhì)上具有與其均等的生物活性的多肽的多核苷酸、(c)半乳凝素9產(chǎn)生以及釋放的誘導(dǎo)因子(d)抗半乳凝素9受體抗體、以及(e)針對半乳凝素9結(jié)合性糖鏈的抗體選出來的成分作為有效成分為特征的對免疫細胞、例如活化T細胞誘導(dǎo)凋亡的藥劑。
以含有從(a)半乳凝素9及其類似物、(b)編碼半乳凝素9以及實質(zhì)上具有與其均等的生物活性的多肽的多核苷酸、(c)半乳凝素9產(chǎn)生以及釋放的誘導(dǎo)因子(d)抗半乳凝素9受體抗體、以及(e)針對半乳凝素9結(jié)合性糖鏈的抗體選出來的成分作為有效成分為特征的對起因于活化T細胞的疾病或病態(tài)癥狀的預(yù)防和/或治療劑。
上述[13]所述的預(yù)防和/或治療劑，其特征是起因于活化T細胞的疾病選自過敏、自身免疫疾病、對移植片的排斥反應(yīng)以及炎癥。
以從下面各成分中選出來的成分為特征的半乳凝素9結(jié)合因子[括弧內(nèi)的數(shù)字指的是可以通過在NCBI的網(wǎng)頁(http//www.ncbi.nih.gor/)輸入該數(shù)字獲得蛋白質(zhì)信息以及編碼他們的DNA等核酸序列的信息的數(shù)據(jù)庫上識別號]4F2重鏈抗原(177216)；ATPase，Na+/K+轉(zhuǎn)運，α1多肽(21361181)；鈉依賴中性氨基酸轉(zhuǎn)運體類型2截短的異構(gòu)體(15004317)；基質(zhì)細胞衍生因子受體1異構(gòu)體a(9257240)；基質(zhì)細胞衍生因子受體1異構(gòu)體b；熱休克90kDa蛋白1，β(20149594)；熱休克90kDa蛋白1，α；熱休克70kDa蛋白5(葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白，78kDa)(16507237)，熱休克70kDa蛋白8異構(gòu)體2(24234686)；熱休克70kDa蛋白9B前體(2423688)；脂肪酸輔酶A連接酶，長鏈3(27469830)；NADH脫氫酶(泛醌)Fe-S蛋白1，75kDa(NADH-輔酶Q還原酶)(4826856)；S-腺苷高半胱氨酸水解酶-like 1(21361647)；程序性細胞死亡8異構(gòu)體1(4757732)；60kDa熱休克蛋白，線粒體前體(129379)；ATP合酶，H+轉(zhuǎn)運，線粒體F1復(fù)合物，α亞基，異構(gòu)體 1，心肌(4757810)；[內(nèi)質(zhì)網(wǎng)]核酮糖結(jié)合糖蛋白(ribophorin)II前體(88567)；法尼基-二磷酸法尼基轉(zhuǎn)移酶1(4758350)；泛醇-細胞色素C還原酶復(fù)合物核心蛋白2，線粒體前體(21903482)；長醇基-二磷酸寡糖-蛋白糖基轉(zhuǎn)移酶(21104416)；鈣結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白(6841066)；NADH脫氫酶-泛醌Fe-S蛋白2前體(3540239)；肌動蛋白，β(14250401)；翻譯延伸因子EF-Tu-類蛋白P43前體，線粒體(7443384)；metaxin 1(4505281)；sideroflexin1(23618867)；TCR β鏈(2982508)；Hnrnp A1(2194069)；磷酸鹽載體前體異構(gòu)體1b(4505775)；ATP合酶，H+轉(zhuǎn)運，線粒體F1復(fù)合物，γ多肽1(4885079)；電壓依賴性陰離子通道1(4507879)；透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白前體(8699626)；雄激素調(diào)節(jié)的短鏈脫氫酶/還原酶1(20070798)；溶質(zhì)載體家族25(線粒體載體；酮戊二酸載體)，member 11(21361114)；3-羥基丁酸脫氫酶前體(17738292)；B-細胞受體相關(guān)蛋白(1673514)；ATP合酶，H+轉(zhuǎn)運，線粒體F1復(fù)合物，O亞基(4502303)；ATP合酶，H+轉(zhuǎn)運，線粒體F0復(fù)合物，亞基d(5453559)；ATP合酶，H+轉(zhuǎn)運，線粒體F0復(fù)合物，亞基b，異構(gòu)體1(21361565)；小的GTP結(jié)合蛋白(13569962)；NADH脫氫酶(泛醌)Fe-S蛋白8，23kDa(NADH-輔酶Q還原酶)(4505371)；小泡運輸?shù)鞍譻ec22b(4759086)；線粒體輸入受體Tom22(9910382)；信號序列受體，δ(5454090)；ATP合酶，α鏈(114517或P25705)；ATP合酶，β鏈(114549或P06576)；鈉/鉀-轉(zhuǎn)運ATPase β-3鏈(1703470或P54709)；ADP，ATP載體蛋白(113463，P12236，113459，P05141，113455，或P12235)；泛醇-細胞色素C還原酶復(fù)合物核心蛋白1(731047或P31930)以及細胞色素c氧化酶多肽II(117020或P00403)。以及[16]提供上述[15]所述的半乳凝素9結(jié)合因子與半乳凝素9之間的相互作用的半乳凝素9活性控制技術(shù)。
本發(fā)明的其他目的、特征、優(yōu)點及其他觀點對于同行人來說由以下所述應(yīng)當(dāng)明白。然而，以下所述以及包括具體的實施例等所述的本說明書所述是本發(fā)明的優(yōu)選方式，但希望理解為只是為了說明而給出的敘述。在本說明書公布的本發(fā)明的意圖以及范圍內(nèi)，進行種種變化和/或改變(或修飾)通過以下所述以及本說明書的其他部分的知識對于同行人應(yīng)當(dāng)很容易明白的。在本說明書被引用的所有專利文獻以及參考文獻是為了說明的目的而引用的，這些作為本說明書的一部分其內(nèi)容應(yīng)當(dāng)解釋為也包括在內(nèi)。
附圖的簡單說明

圖1(A)表示對于rGal-9的凋亡誘導(dǎo)活性用PI法進行流式細胞儀測定的結(jié)果。(B)表示對于rGal-9的凋亡誘導(dǎo)活性用AnnexinV法進行流式細胞儀測定的結(jié)果。數(shù)據(jù)表示4次實驗中的代表例。
圖2表示對于rGal-9的凋亡誘導(dǎo)活性在乳糖或蔗糖存在下或不存在下測定的結(jié)果。數(shù)據(jù)表示4次實驗結(jié)果的平均值±SEM。
圖3表示在各種細胞株中對于rGal-9的凋亡誘導(dǎo)活性用PI法進行流式細胞儀測定的結(jié)果。數(shù)據(jù)表示3次實驗結(jié)果的平均值±SEM。
圖4表示對于來自末梢血的T細胞的rGal-9的凋亡誘導(dǎo)活性用PI法進行流式細胞儀測定的結(jié)果。數(shù)據(jù)表示3次實驗結(jié)果的平均值±SEM。
圖5表示在各種半胱天冬酶抑制劑存在下對于Gal-9誘起凋亡的抑制效果的實驗結(jié)果。數(shù)據(jù)表示3次實驗結(jié)果的平均值±SEM。
圖6表示在濃度不同的泛半胱天冬酶抑制劑或半胱天冬酶抑制劑1存在下對于Gal-9誘起凋亡的抑制效果的實驗結(jié)果。數(shù)據(jù)表示3次實驗結(jié)果的平均值±SEM。
圖7表示在濃度不同的鈣蛋白酶抑制劑存在下對于Gal-9誘起凋亡的抑制效果的實驗結(jié)果。數(shù)據(jù)表示3次實驗結(jié)果的平均值±SEM。
圖8表示對Gal-9對使用受到Gal-9誘起凋亡的細胞后的鈣流入的影響進行實驗結(jié)果。數(shù)據(jù)表示3次實驗結(jié)果的平均值±SEM。
圖9表示對于Gal-9對通過DEX、抗Fas抗體以及依托泊甙誘導(dǎo)的凋亡的作用效果進行研究的實驗的結(jié)果。數(shù)據(jù)表示4次實驗結(jié)果的平均值±SEM。
圖10表示對于半乳凝素9對惡性骨髓瘤細胞MM-RU的凋亡誘導(dǎo)活性用PI法進行流式細胞儀測定的結(jié)果。
圖11表示從人骨髓瘤細胞株中的MM-BP和MM-RU採取mRNA，用RT-PCR法對半乳凝素的DNA量進行解析的結(jié)果的電泳照片。
圖12是表示作為胞巢形成性的細胞的乳腺癌細胞株MCF-7和由該細胞新建立的沒有表現(xiàn)出明顯的胞巢形成性的MCF-7K-10株的細胞形態(tài)的照片。
圖13是表示對于作為胞巢形成性的細胞的MCF-7K-4和新建立的沒有表現(xiàn)出明顯的胞巢形成性的MCF-7K-10株，通過Western blot法對半乳凝素9進行研究的結(jié)果的電泳照片。
圖14是表示對于從外邊向骨髓瘤細胞株MM-RU添加重組半乳凝素9，對于半乳凝素9的作用效果進行研究的結(jié)果的細胞形態(tài)照片。
圖15表示對于將半乳凝素9基因?qū)胗扇橄侔┘毎杲⒌腗CF-7K-10株時的作用效果進行研究的結(jié)果的細胞形態(tài)照片。
圖16表示來自MOLT4的蛋白質(zhì)中吸附于半乳凝素9CT柱的蛋白質(zhì)的電泳照片。
具體實施例方式
本發(fā)明是發(fā)現(xiàn)半乳凝素9對腫瘤細胞表現(xiàn)出毒害細胞活性，而對正常細胞不表現(xiàn)出毒害活性，另外對腫瘤細胞表現(xiàn)出誘導(dǎo)凋亡，而對正常細胞不誘導(dǎo)凋亡后做成的發(fā)明。由此，表示可將半乳凝素9蛋白質(zhì)、半乳凝素9激動劑、半乳凝素9拮抗劑拮抗物質(zhì)、抗半乳凝素9結(jié)合蛋白抗體、抗半乳凝素9結(jié)合糖鏈抗體、半乳凝素9產(chǎn)生·釋放誘導(dǎo)物質(zhì)等作為對正常細胞沒有作用，而對腫瘤細胞表現(xiàn)出毒害活性、誘導(dǎo)凋亡的抗腫瘤劑(抗癌劑)利用的途徑。另外，本發(fā)明提供通過利用半乳凝素9對轉(zhuǎn)移性惡性細胞有凝集誘導(dǎo)作用，具有對癌等惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移抑制活性的癌轉(zhuǎn)移抑制技術(shù)、例如半乳凝素9蛋白質(zhì)或其衍生物、或通過半乳凝素9基因?qū)牖驅(qū)Π肴槟?的產(chǎn)生·釋放進行誘導(dǎo)獲得癌轉(zhuǎn)移抑制作用的方法、以及方法中使用的試劑、或試劑盒、系統(tǒng)(包括檢測·測定系統(tǒng))等。
本發(fā)明是根據(jù)人半乳凝素9一方面對非活化(靜止)T細胞、特別是CD4陽性T細胞(協(xié)助者T細胞)的凋亡誘導(dǎo)不進行凋亡誘導(dǎo)，對于靜止CD8陽性T細胞(抑制者T細胞或毒害細胞性T細胞)的凋亡進行輕度誘導(dǎo)，另一方面人半乳凝素9對被CD3活化的CD4陽性T細胞(協(xié)助者T細胞)的凋亡誘導(dǎo)顯著誘導(dǎo)，活化CD8陽性T細胞(抑制者T細胞或毒害細胞性T細胞)的凋亡與半乳凝素1或半乳凝素3相比，進行強烈誘導(dǎo)的現(xiàn)象做成的。
人半乳凝素3由外面加入時，誘導(dǎo)活化的CD4陽性T細胞(協(xié)助者T細胞)以及CD8陽性T細胞(抑制者T細胞或毒害細胞性T細胞)的凋亡。另外發(fā)現(xiàn)由半乳凝素9引起的凋亡誘導(dǎo)與濃度有關(guān)、與時間有關(guān)。已知CD4陽性T細胞對于惹起免疫反應(yīng)表現(xiàn)出非常重要的作用，人們認(rèn)為由于CD4陽性T細胞的過剩反應(yīng)會惹起各種自身免疫疾病或過敏。
由以上現(xiàn)象，特別是半乳凝素9對于活化的CD4陽性T細胞顯著誘導(dǎo)凋亡現(xiàn)象，可以認(rèn)為通過半乳凝素、特別是半乳凝素9蛋白質(zhì)、或通過半乳凝素9基因?qū)牖蛘T導(dǎo)半乳凝素9的產(chǎn)生·釋放，誘導(dǎo)CD4陽性T細胞的凋亡，結(jié)果可以表現(xiàn)出免疫抑制效果或抗炎癥效果。利用這些技術(shù)，可以做成自身免疫疾病或過敏疾病、甚至抗炎癥藥使用。另外，由于上述T細胞等是免疫細胞，半乳凝素9正是對免疫細胞表現(xiàn)出誘導(dǎo)凋亡的活性的物質(zhì)。
凋亡是由作為種種物質(zhì)例如免疫抑制劑使用的糖皮質(zhì)激素、Fas配體或抗Fas抗體等惹起的。在本發(fā)明中，成功地闡明了由半乳凝素9引起的凋亡是通過什么樣的途徑被誘導(dǎo)的。即，首先闡明了取代人末梢血T細胞使用T細胞株Jurkat細胞或MOLT4細胞，通過碘化丙錠(PI)法和AnnexinV法半乳凝素9誘導(dǎo)這些細胞凋亡。接著，闡明了由半乳凝素9引起的凋亡的誘導(dǎo)被乳糖抑制，但由于不被蔗糖抑制，所以半乳凝素9的β半乳糖苷結(jié)合活性對于凋亡的誘導(dǎo)是必要的。
另外，根據(jù)本發(fā)明，對于半胱天冬酶是否參與了半乳凝素9誘導(dǎo)凋亡進行了研究，結(jié)果表明泛半胱天冬酶抑制劑在抑制由地塞米松、抗Fas抗體、TNF-α、C2神經(jīng)酰胺引起的凋亡的同時，也抑制由半乳凝素9引起的凋亡，并且與濃度、時間有關(guān)。另外，對處于其上游的半胱天冬酶1、8、9、10的抑制劑也進行了研究?？梢允褂冒腚滋於?抑制劑、半胱天冬酶8抑制劑、半胱天冬酶9抑制劑、半胱天冬酶10抑制劑。其結(jié)果由半乳凝素9引起的凋亡雖然被半胱天冬酶1特異的抑制劑抑制，但沒有被其他的半胱天冬酶抑制劑抑制。另外，地塞米松誘導(dǎo)凋亡同樣被半胱天冬酶1抑制劑抑制，另一方面抗Fas抗體和TNF-α引起的凋亡可被半胱天冬酶8以及10抑制劑抑制，C2神經(jīng)酰胺引起的凋亡被半胱天冬酶9的抑制劑抑制。由此可以認(rèn)為半乳凝素9經(jīng)由與地塞米松同樣的途徑誘導(dǎo)凋亡。
另外，已知對于半胱天冬酶1的活化，鈣蛋白酶的活化先行。因此，對于鈣蛋白酶抑制劑對半乳凝素9誘導(dǎo)凋亡的影響進行了研究。其結(jié)果表明鈣蛋白酶抑制劑依賴于濃度抑制半乳凝素9誘導(dǎo)凋亡。另外，由于在鈣蛋白酶的活化之前發(fā)現(xiàn)鈣向細胞內(nèi)流入，所以當(dāng)對由于半乳凝素9刺激惹起鈣流入進行研究時，發(fā)現(xiàn)半乳凝素9明顯誘導(dǎo)鈣向細胞內(nèi)流入。而且其流入被乳糖抑制，而不被蔗糖抑制。這些結(jié)果表明對于由半乳凝素9引起的鈣流入，β半乳糖苷結(jié)合活性是必需的。由到目前為止的結(jié)果可以認(rèn)為半乳凝素9通過與糖皮質(zhì)激素(地塞米松)同樣的途徑，即受體→鈣流入→鈣蛋白酶→半胱天冬酶1→半胱天冬酶3以及7這一途徑誘導(dǎo)凋亡。
另外，對半乳凝素9對由地塞米松、抗Fas抗體、依托泊甙(etoposide)引起的凋亡的效果進行了研究，結(jié)果表明半乳凝素9對于由抗Fas抗體或依托泊甙引起的凋亡表現(xiàn)出相加的效果，而在由地塞米松引起的凋亡中沒有看到由半乳凝素產(chǎn)生的相加效果。在嗜酸性細胞的凋亡中，半乳凝素9反而抑制由地塞米松引起的凋亡也被闡明。因此強烈暗示半乳凝素9和糖皮質(zhì)激素通過同樣的途徑誘導(dǎo)凋亡。以上事實表明在本發(fā)明中，半乳凝素9可以作為抗炎癥藥、抗過敏劑或免疫抑制劑使用的可能性很高。由于對半乳凝素9蛋白質(zhì)、半乳凝素9基因?qū)牖虬肴槟?進行誘導(dǎo)，做成副作用少的免疫抑制劑使用，或通過并用該抑制劑，也可以將糖皮質(zhì)激素等的用量減少，結(jié)果也可以使副作用減少。
現(xiàn)在，糖皮質(zhì)激素作為抗炎癥藥、抗過敏劑或免疫抑制劑被廣泛運用，對于難治性過敏反應(yīng)可以使用FK506等免疫抑制劑。作為缺點已知這些藥劑存在很多嚴(yán)重的副作用。但是，到目前為止的結(jié)果表明，可以用半乳凝素9作為取代上述糖皮質(zhì)激素承擔(dān)的生物活性的物質(zhì)，或作為承擔(dān)與糖皮質(zhì)激素同等以上的優(yōu)越的生物活性的物質(zhì)利用。通過對半乳凝素9、其類似物等的利用、半乳凝素9的生物體內(nèi)濃度、或表達進行控制，可以提供抗腫瘤劑、抗過敏劑、免疫抑制劑、自身免疫疾病用劑、抗炎癥劑以及腎上腺皮質(zhì)類固醇激素替代用活性成分劑。另外，利用半乳凝素9，可以應(yīng)用于糖皮質(zhì)激素表現(xiàn)出藥理作用·生物活性的領(lǐng)域。
過敏或自身免疫疾病是由于CD4陽性T淋巴細胞的過剩免疫反應(yīng)引起的，對于難治性過敏或自身免疫疾病的治療由于可以使用類固醇或免疫抑制劑，上述實驗表明半乳凝素9表現(xiàn)出免疫抑制作用、抗炎癥作用、抗過敏作用，所以給出了可以取代類固醇或免疫抑制劑，用半乳凝素9蛋白質(zhì)、半乳凝素9基因?qū)?、半乳凝?產(chǎn)生或釋放誘導(dǎo)因子、抗半乳凝素9受體抗體、抗半乳凝素9結(jié)合糖鏈的抗體等作為抗腫瘤劑、抗過敏劑、免疫抑制劑、自身免疫疾病用劑、抗炎癥劑以及腎上腺皮質(zhì)類固醇激素替代劑利用的途徑。
在本發(fā)明中，利用“基因重組技術(shù)”可對所定的核酸進行分離.序列決定，或制作重組體，獲得所定的肽。作為本說明書中能夠使用的基因重組技術(shù)(包括重組DNA技術(shù))，如該領(lǐng)域都知道的技術(shù)，例如J.Sambrook，E.F.Fritsch & T.Maniatis，“Molecular CloningALaboratory Manual(2nd edition)”，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York(1989)；D.M.Glover et al.ed，“DNA Cloning”，2nd ed.，Vol.1to4，(The Practical ApproachSeries)，IRL Press，Oxford University Press(1995)；日本生化學(xué)會編、“續(xù)生化學(xué)實驗講座1、基因研究法II”、東京化學(xué)同人(1986)；日本生化學(xué)會編、“新生化學(xué)實驗講座2、核酸III(重組DNA技術(shù))”、東京化學(xué)同人(1992)；R.Wu ed.，“Methods inEnzymology”，Vol.68(Recombinant DNA)，Academic Press，New York(1980)；R.Wu et al.ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.100(Recombinant DNA，Part B)&101(Recombinant DNA，Part C)，AcademicPress，New York(1983)；R.Wu et al.ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.153(Recombinant DNA，Part D)，154(Recombinant DNA，Part E)&155(Recombinant DNA，Part F)，Academic Press，New York(1987)；J.H.Miller ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.204，Academic Press，New York(1991)；R.Wu et al.ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.218，Academic Press，New York(1993)；S.Weissman(ed)，“Methods inEnzymology”，Vol.303，Academic Press，New York(1999)；J.C.Glorioso et al.(ed)，“Methods in Enzymology”，Vol.306，AcademicPress，New York(1999)等所述的方法或其中引用的文獻所述的方法或?qū)嵸|(zhì)上與上述方法同樣的方法或改變法進行(其中的某些記載由于參照也包括在本說明書的內(nèi)容中)[以下將這些方法都稱為“基因重組技術(shù)”]。
本說明書中，所謂“相同性”意味著在多肽序列(或氨基酸序列)或多核苷酸序列(或堿基序列)中的2條鏈之間，構(gòu)成該鏈的各個氨基酸殘基之間或各堿基之間的相互適合關(guān)系中能夠決定是同一那樣的單位的量(數(shù))，指的是兩個多核苷酸或兩個多肽序列之間的序列相關(guān)性的程度。相同性可以很容易算出。測定兩個多核苷酸或多肽序列之間的相同性的方法已知有很多種，“相同性”(也稱為“同一性”)的用語對于同行人眾所周知(例如、Lesk，A.M.(Ed.)，ComputationalMolecular Biology，Oxford University Press，New York，(1988)；Smith，D.W.(Ed.)，BiocomputingInformatics and Genome Projects，Academic Press，New York(1993)；Grifin，A.M.& Grifin，H.G.(Ed.)Computer Analysis of Sequence DataPart I，Human Press，NewJersey，(1994)；von Heinje，G.，Sequence Analysis in MolecularBiology，Academic Press，New York，(1987)；Gribskov，M.& Devereux，J.(Ed.)，Sequence Analysis Primer，M-Stockton Press，New York，(1991)等)。測定兩個序列的相同性使用的一般方法如Martin，J.Bishop(Ed.)，Guide to Huge Computers，Academic Press，San Diego，(1994)；Carillo，H.& Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，481073(1988)等公布的方法，但并不限定于這些方法。作為用于測定相同性的理想方法，如像為了獲得進行試驗的兩個序列間的最大適合關(guān)系部分那樣進行設(shè)計的方法。這樣的方法如作為計算機程序建立的方法。作為測定兩個序列間相同性的理想的計算機程序法如GCG程序包(Devereux，J.et al.，Nucleic Acids Research，12(1)387(1984)).BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，S.F.et al.，J.Mol.Biol，215403(1990))等，但并不限定于這些方法，可以使用該領(lǐng)域中眾所周知的方法。
作為本說明書中使用的用語“多肽”可以是以下所述的那樣的多肽。多肽的基本結(jié)構(gòu)眾所周知，在該技術(shù)領(lǐng)域中非常多的參考書以及其他刊物中都有記載。有鑒于此，在本說明書中使用的用語“多肽”指的是通過肽鍵或修飾的肽鍵相互結(jié)合的那樣的含有2個或2個以上的氨基酸的任意肽或任意的蛋白質(zhì)。作為本說明書中使用的用語“多肽”，在該領(lǐng)域中例如一般稱為肽、寡肽或肽聚物的短鏈的肽、以及蛋白質(zhì)，通常也可以指很多形態(tài)本身已知的長鏈的肽兩方。多肽通常往往也包括稱為天然型氨基酸(天然存在的氨基酸或被基因編碼的氨基酸)的氨基酸以外的氨基酸。多肽另外含有末端氨基酸殘基，很多這樣的氨基酸殘基在翻譯后不僅可以通過加工和其他改變(或修飾)的天然工程，也可以通過同行都眾所周知的化學(xué)改變技術(shù)進行加工，所以上述多肽要理解為可以改變(修飾)的多肽。對于加到該多肽的改變(修飾)已知有很多方式，這些方式在該領(lǐng)域的基礎(chǔ)參考書以及更詳細的論文和很多研究文獻中都有詳細記載，這些對于同行眾所周知。作為幾個所謂的常用的改變·修飾，例如烷基化、?；?、酯化、酰胺化、糖基化、脂質(zhì)結(jié)合、硫酸化、磷酸化、谷氨酸殘基的γ-羧基化、羥化以及ADP-核糖基化等，參照例如T.E.Creighton，Proteins-Structure and Molecular Properties，Second Edition，W.H.Freeman and Company，New York，(1993)；B.C.Johnson(Ed.)，Posttranslational Covalent Modification of Proteins，AcademicPress，New York，(1983)(Wold，F(xiàn).，“Posttranslational ProteinModifications“Perspective and Prospects”，pp.1-12)；Seifteret al.，“Analysis for Protein Modifications and nonproteincofactors”，Methods in Enzymology，182626-646(1990)；Rattan etal.，“Protein SynthesisPosttranslational Modification andAging”，Ann.N.Y.Acad.Sci.，663p.48-62(1992)等記載。
本說明書中，作為半乳凝素9，典型的如天然型半乳凝素9。作為天然型半乳凝素9報道了長型(L型)半乳凝素9、中型(M型)半乳凝素9以及短型(S型)半乳凝素9，L型半乳凝素9被認(rèn)為是通過WO 02/37114 A1公布的序列4的推定連接肽區(qū)域連接N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域形成的，M型半乳凝素9被認(rèn)為是通過WO 02/37114 A1公布的序列5的推定連接肽區(qū)域連接N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域形成的，S型半乳凝素9被認(rèn)為是通過WO 02/37114 A1公布的序列6的推定連接肽區(qū)域連接N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域形成的，在M型半乳凝素9中，在由L型半乳凝素9的該連接肽區(qū)域缺失該WO 02/37114 A1的序列7的序列的氨基酸殘基方面與L型半乳凝素9不同，而在S型半乳凝素9中，在由M型半乳凝素9的該連接肽區(qū)域缺失該WO 02/37114 A1的序列8的序列的氨基酸殘基方面與M型半乳凝素9不同，即在S型半乳凝素9中，在由L型半乳凝素9推定的該連接肽區(qū)域缺失該WO02/37114 A1的序列9的序列的氨基酸殘基方面與L型半乳凝素9不同。
在本說明書中，作為半乳凝素9可以指的是含有上述L型半乳凝素9、M型半乳凝素9和S型半乳凝素9、此外，這些天然半乳凝素9家族的天然產(chǎn)生的變異體、以及對于上述半乳凝素實施了人工變異(即、缺失、附加、修飾、插入一個以上的氨基酸殘基等)的變異體和含有其中一部分結(jié)構(gòu)域或一部分肽片段的變異體。
作為本發(fā)明的代表性半乳凝素9蛋白質(zhì)，如WO 02/37114 A1的序列表中的序列編號1～3(SEQ ID NO1～3)中的任一個氨基酸序列或?qū)嵸|(zhì)上含有與該序列同等的氨基酸序列的多肽，例如，含有SEQ IDNO1，2或3的氨基酸序列中的至少5～311，5～323或5～355個連續(xù)的氨基酸殘基，而且具有同等的抗原性等的實質(zhì)上同等的生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)、或具有它們的特征，而且與序列表的SEQ ID NO1，2或3中任一個的各結(jié)構(gòu)域中任一個至少50％以上高的相同性，或至少60％以上高的相同性，或至少70％以上高的相同性，或至少80％以上高的相同性，或至少90％以上高的相同性，或至少95％以上高的相同性，或至少98％以上高的相同性的蛋白質(zhì)等。
作為本發(fā)明的人半乳凝素9多肽，如含有WO 02/37114 A1的序列表中的SEQ ID NO1～3中的任一個氨基酸序列的全部或一部分的連續(xù)的氨基酸殘基，或含有SEQ ID NO1～3中的連續(xù)的氨基酸殘基5個以上，優(yōu)選10個以上、更優(yōu)選20個以上、更優(yōu)選30個以上、更優(yōu)選40個以上、更優(yōu)選50個以上、更優(yōu)選60個以上、更優(yōu)選70個以上、更優(yōu)選80個以上、更優(yōu)選90個以上、更優(yōu)選100個以上、更優(yōu)選110個以上的多肽。作為本發(fā)明的人半乳凝素9相關(guān)多肽，也可以含有該SEQ ID NO1，2和3選擇的氨基酸序列的一部分或全部(也可以缺失對應(yīng)于起始密碼子的Met)。含有這樣的序列的多肽都包含在內(nèi)。
作為編碼半乳凝素9或其構(gòu)成結(jié)構(gòu)域、該片段的核酸只要是所謂的與編碼與半乳凝素9具有同等抗原性等的實質(zhì)上具有同等生物學(xué)活性的肽的同效的堿基序列的核酸，無論什么樣都可以。編碼該半乳凝素9的核酸可以是單鏈DNA、雙鏈DNA、RNA、DNA:RNA雜交體、合成DNA等核酸，也可以是人基因組DNA、人基因組DNA文庫、來自人組織·細胞的cDNA、合成DNA中的任一個。編碼該半乳凝素9的核酸的堿基序列也可以被修飾(例如附加、除去、置換等)，也包含這樣修飾后的多肽。另外也可以是天然產(chǎn)生的變異體。這些核酸如可以是編碼L型、M型或S型半乳凝素9肽或其一部分的核酸，優(yōu)選的核酸如DNA。另外上述所謂的“同效的堿基序列”，如在嚴(yán)格條件下，與編碼WO 02/37114A1公布的序列表中的序列編號1的氨基酸序列的堿基序列中的連續(xù)的5個堿基以上的堿基序列、優(yōu)選10個以上的堿基序列、更優(yōu)選15個以上的堿基序列、更優(yōu)選20個以上的堿基序列雜交，編碼與該半乳凝素9實質(zhì)上同等的氨基酸序列的核酸或其互補鏈等。
編碼該半乳凝素9的核酸，代表性的如編碼WO 02/37114 A1的序列表中的SEQ ID NO1～3中的任一個表示的肽和其一部分連續(xù)的氨基酸序列的堿基序列的核酸(也包含只編碼各特征結(jié)構(gòu)域的核酸)、在編碼序列中附加起始密碼子(編碼Met的密碼子)和終止密碼子的核酸、或編碼與該堿基序列編碼的蛋白質(zhì)至少有50％相同性的氨基酸序列，而且含有該SEQ ID NO1～3的氨基酸序列中的至少特征的連續(xù)的氨基酸殘基、而且具有與同等的抗原性等肽實質(zhì)上同等的生物學(xué)活性的肽的核酸同效的堿基序列的核酸，無論什么樣都可以。
在本說明書中，所謂“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chainreaction)”或“PCR”一般指的是美國專利第4,683,195號說明書等所述的那樣方法，例如指用于在體外通過酶對所期望的核苷酸序列進行擴增的方法。一般來說，PCR法是包括使用能夠優(yōu)先與模板核酸進行雜交的2個寡核苷酸引物，反復(fù)進行引物延伸合成那樣的循環(huán)的方法。對于典型的PCR法中使用的引物可以使用對于模板內(nèi)部應(yīng)當(dāng)可擴增的核苷酸序列互補的引物，例如，優(yōu)選使用在與應(yīng)當(dāng)擴增的核苷酸序列的兩端互補、或與應(yīng)當(dāng)被擴增的核苷酸序列鄰接的引物。作為5’端的引物至少含有起始密碼子、或包含該起始密碼子可以擴增那樣地選擇，而作為3’端側(cè)的引物最好是能夠至少含有終止密碼子、或含有該終止密碼子能夠擴增那樣地進行選擇。引物優(yōu)選由5個以上的堿基，更優(yōu)選10個以上堿基構(gòu)成的寡核苷酸、更優(yōu)選由18～25個堿基構(gòu)成的寡核苷酸。
PCR反應(yīng)可以按照該領(lǐng)域眾所周知的方法或與這些方法實質(zhì)上同樣的方法或改變法進行，例如可以根據(jù)R.Saiki，etal.，Science，2301350，1985；R.Saiki，et al.，Science，239487，1988；H.A.Erlich ed.，PCR Technology，Stockton Press，1989；D.M.Glover et al.ed.，“DNA Cloning”，2nd ed.，Vol.1，(The PracticalApproach Series)，IRL Press，Oxford University Press(1995)；M.A.Innis et al.ed.，“PCR Protocolsa guide to methods andapplications”，Academic Press，New York(1990)；M.J.McPherson，P.Quirke and G.R.Taylor(Ed.)，PCRa practical approach，IRLPress，Oxford(1991)；M.A.Frohman et al.，Proc. Natl.Acad.Sci.USA，85，8998-9002(1988)等所述的方法或?qū)@些方法進行修飾、改變的方法進行。另外，PCR法也可以使用適用的市售試劑盒進行，根據(jù)試劑盒制造者或試劑盒銷售者指明的程序?qū)嵤?br> PCR反應(yīng)在代表性的場合，是將例如模板(例如，以mRNA為模板合成的DNA；1st strand DNA)和根據(jù)該基因設(shè)計的引物與10×反應(yīng)緩沖液(Taq DNA聚合酶附帶的)、dNTPs(脫氧核苷三磷酸dATP，dGTP，dCTP和dTTP的混合物)、Taq DNA聚合酶以及去離子蒸餾水混合。對于該混合物使用例如GeneAmp 2400 PCR system，Perkin-Elmer/Cetus公司等自動熱循環(huán)儀在一般的PCR循環(huán)條件下反復(fù)該循環(huán)25～60次，用于擴增的循環(huán)數(shù)可以根據(jù)相應(yīng)目的設(shè)為合適的次數(shù)。作為PCR循環(huán)條件，例如90～95℃變性5～100秒、40～60℃退火5～150秒、65～75℃延伸30～300秒的循環(huán)，優(yōu)選94℃變性15秒、58℃退火15秒、72℃延伸45秒的循環(huán)，退火的反應(yīng)溫度以及時間可以根據(jù)相應(yīng)實驗選擇適當(dāng)?shù)闹?，變性反?yīng)和延伸反應(yīng)的時間也可以根據(jù)預(yù)想的PCR產(chǎn)物的鏈長選擇適當(dāng)?shù)闹怠Ｍ嘶鸬姆磻?yīng)溫度最好是根據(jù)通常引物與模板DNA的雜交的Tm值改變。延伸反應(yīng)的時間通常大約每1000bp的鏈長1分鐘程度那樣的大概尺度，根據(jù)場合不同也可以選擇更短的時間。
在本說明書中，所謂“寡核苷酸”可以是比較短的單鏈或雙鏈的多核苷酸，優(yōu)選聚脫氧核苷酸，可以通過Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，Vol.28，pp.716-734(1989)所述的那樣已知方法、例如磷酸三酯法、磷酸二酯法、磷酸鹽法、磷酸酰胺法、膦酸酯法等方法化學(xué)合成。已知通常合成可以很便利地在被修飾的固體支持體上合成，例如可以使用自動化的合成儀器，該儀器有銷售。該核苷酸可以含有一個或一個以上的修飾堿基，例如可以含有次黃苷等天然而不是普通的堿基或三甲基化的堿基等，根據(jù)場合不同也可以含有帶有標(biāo)記的堿基。
在對所定核酸進行鑒定時，可以利用雜交技術(shù)。該雜交可以根據(jù)上述公布的“基因重組技術(shù)”文獻所述的方法或?qū)嵸|(zhì)上與它同樣的方法或改變法進行。例如，雜交可以使含有DNA等核酸的樣品轉(zhuǎn)移到含有尼龍膜等膜的載體，根據(jù)需要實施變成處理、固定化處理、清洗處理等后，使轉(zhuǎn)移到上述載體(例如膜等)的核酸根據(jù)需要與使其變成的標(biāo)記探針DNA片段在雜交用緩沖液中進行反應(yīng)。
雜交處理普通于約35～約80℃、于約50～約65℃下更合適，進行約15分鐘～約36小時，進行約1～約24小時更合適，可以選擇最適合條件進行。例如，雜交處理在約55℃下進行約18小時。作為雜交用緩沖液，可以使用選自該領(lǐng)域中普通使用的緩沖液，例如可以使用Rapid hybridization buffer(Amersham公司)等。作為轉(zhuǎn)移的載體(例如，膜等)的變成處理，可舉出使用堿性變性液的方法，優(yōu)選用其處理后中和液或緩沖液處理。另外，作為載體(例如，膜等的固定化處理，)普通通過于約40～約100℃、于約70～約90℃下更合適，進行約15分鐘～約24小時焙烤，進行約1～約4小時焙烤更合適，可以選擇最適合條件進行。例如，對膜等載體通過約80℃下進行約2小時焙烤進行固定化。作為轉(zhuǎn)移的載體(例如膜等)的清洗處理，可以通過用在該領(lǐng)域中普通使用的清洗液、例如含有1M NaCl、1mMEDTA和0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)的50mM Tris-HCl緩沖液，pH8.0等清洗進行。作為含有尼龍等膜的載體，可以使用從該領(lǐng)域普通使用的載體中選擇出來的載體。
作為上述堿性變性液、中和液、緩沖液，可以使用從該領(lǐng)域中普通使用的緩沖液中選出來的緩沖液，作為堿性變性液，例如可以使用含有0.5M NaOH和1.5M NaCl的液體，作為中和液，例如可使用含1.5MNaCl的0.5M Tris-HCl緩沖液，pH8.0等，作為緩沖液，例如可使用2×SSPE(0.36M NaCl、20Mm NaH2PO4和2mM EDTA)等。另外在雜交處理之前，為了防止非特異性雜交反應(yīng)，根據(jù)需要，進行轉(zhuǎn)移的載體(例如膜等)最好是進行預(yù)雜交處理。該預(yù)雜交處理可以通過例如浸入到預(yù)雜交溶液[50％甲酰胺、5×Denhardt′s溶液(0.2％牛血清白蛋白、0.2％聚乙烯吡咯烷酮)、5×SSPE、0.1％SDS、100μg/ml熱變性鮭精子DNA]等中，于約35～約50℃，優(yōu)選42℃下進行約4～約24小時，優(yōu)選約6～約8小時反應(yīng)，這樣的條件對從業(yè)者反復(fù)適宜實驗，可以決定更優(yōu)選的條件。在雜交中使用的標(biāo)記探針DNA片段的變性可以于約70～約100℃下、優(yōu)選約100℃下，進行約1～約60分鐘、優(yōu)選約5分鐘加熱等進行。而雜交可以利用其眾所周知的方法或根據(jù)這些的方法進行，在本說明書中，所謂嚴(yán)格的條件指的是例如，鈉濃度約15～約50mM、優(yōu)選約19～約40mM、更優(yōu)選約19～約20mM，溫度約35～約85℃、優(yōu)選約50～約70℃、更優(yōu)選約60～約65℃的條件。
雜交完了后，對膜等載體進行充分清洗處理，在除去進行特異的雜交反應(yīng)的標(biāo)記探針DNA片段以外的標(biāo)記探針等之后，可以進行檢測處理。膜等載體的清洗處理可以使用從該領(lǐng)域普通使用的方法選出來的方法進行，例如可以通過用含有0.1％SDS 0.5×SSC(XSSC＝0.15MNaCl、15mM檸檬酸)溶液等進行清洗實施。
進行雜交的核酸可以通過代表性的自動放射自顯影進行檢測，也可以從該領(lǐng)域中使用的方法中適當(dāng)選擇之后，在檢測中使用。將進行檢測的相當(dāng)于信號的核酸帶懸浮于適當(dāng)?shù)木彌_液、例如SM溶液(含有100mM NaCl和10mM MgSO4的50mM Tris-HCl緩沖液，pH7.5)等，然后對該懸浮液進行適度稀釋，對所定核酸進行分離·純化，然后再進行擴增處理。在本說明書中，所謂“高相同性”因該對象序列的長度不同而不同，例如可以是50％以上、進一步60％以上、優(yōu)選70％以上、更優(yōu)選80％以上，而對于特定場合也可以為95％以上，97％以上特別好。所謂“同效的堿基序列”，例如對于在嚴(yán)格條件下可與含有問題序列的核酸進行雜交的堿基序列，例如與該堿基序列中連續(xù)的5個以上的堿基序列、優(yōu)選10個以上的堿基序列、更優(yōu)選15個以上的堿基序列、更優(yōu)選20個以上的堿基序列進行雜交，編碼與該多肽實質(zhì)上同等的氨基酸序列的堿基序列等。核酸也可以通過化學(xué)合成獲得。此時化學(xué)合成片段，也可以通過酶進行結(jié)合。
通過雜交處理對從含有基因文庫或cDNA文庫等的核酸樣品中篩選目的核酸的處理可以反復(fù)進行?？梢允褂帽豢寺〉膩碜匀说腸DNA文庫、例如各種來自人的組織或培養(yǎng)細胞(特別是人的腎臟、腦、松果體、下垂體后葉、神經(jīng)細胞、網(wǎng)膜、網(wǎng)膜血管細胞、網(wǎng)膜神經(jīng)細胞、胸腺、血管、內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞、血液細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、精巢、卵巢、子宮、腸、心臟、肝臟、胰臟、小腸、大腸、齦關(guān)連細胞、皮膚關(guān)連細胞、線球體細胞、尿細管細胞、結(jié)合組織細胞等組織·細胞、以及各種腫瘤組織、癌細胞等)cDNA文庫。另外用作模板等的cDNA文庫也可以直接使用市售的來自各種組織的cDNA文庫，例如可以使用由Stratagene公司、Invitrogen公司、Clontech公司等銷售的cDNA文庫。作為典型的例子，可以使用由人組織·細胞制備的基因文庫、例如人P1 artificial chromosome基因組文庫(Human Genome Mapping Resource Center)、人組織cDNA文庫(例如，可從Clontech公司等獲得)。使用探針可以對由各種人組織或培養(yǎng)細胞等構(gòu)建的人基因組DNA文庫或來自人cDNA文庫進行篩選。對于通過用放射性同位素等對探針等進行標(biāo)記，可以使用市售的標(biāo)記試劑盒、例如隨機引物DNA標(biāo)記試劑盒(Boehringer Mannheim公司)等進行。例如使用random-priming試劑盒(Pharmacia LKB公司，Uppsala)等，用[α-32P]dCTP(Amersham公司)等對探針用DNA進行標(biāo)記，可以獲得帶有放射活性的探針。
保有所定核酸的噬菌體粒子、重組質(zhì)粒、重組載體等可以通過該領(lǐng)域中普通使用的方法對所定核酸進行純化分離，例如可以通過甘油梯度超離心分離法(Molecular Cloning，a Laboratory manual，ed.T.Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory，2nd ed.78，1989)、電泳法等進行純化。使用在該領(lǐng)域中普通使用的方法可以從噬菌體粒子中純化分離DNA，例如，將得到的噬菌體等懸浮于TM溶液(含有10mMMgSO4的50mM Tris-HCl緩沖液，pH7.8)等，用DNase I和RNase A等處理后，加20mM EDTA、50μg/ml蛋白酶K以及0.5％SDS混合液等，于約65℃，保溫約1小時后，對該溶液進行酚提取、二乙基醚提取后，通過乙醇沉淀使DNA沉淀，然后將得到的DNA用70％乙醇洗凈后干燥，溶解于TE溶液(含有10mM EDTA的10mM Tris-HCl緩沖液，pH8.0)等后得到。另外作為目的DNA通過亞克隆等大量獲得也是可能的，例如亞克隆，作為宿主可以使用大腸桿菌，用質(zhì)粒載體等進行。通過這樣亞克隆得到的DNA也與上述同樣，通過離心分離、酚提取、乙醇沉淀等方法純化分離。
在本說明書中，得到的PCR產(chǎn)物等核酸(含有DNA)通常進行1～2％瓊脂糖凝膠電泳，作為特異的帶從凝膠中切出，例如，使用Gene cleankit(Bio 101)等市場銷售的提取試劑盒進行提取。提取的DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖校鶕?jù)需要進行純化處理，或根據(jù)需要，對5’末端用T4多核苷酸激酶等進行磷酸化后，與pUC18等pUC系載體等適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體連接，轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)母惺軕B(tài)細胞。被克隆的PCR產(chǎn)物可以解析其堿基序列。對于PCR產(chǎn)物的克隆，可以使用例如p-Direct(Clontech)，pCR-ScriptTMSK(+)(Stratagene公司)、pGEM-T(Promega公司)，pAmpTM(Gibco-BRL公司)等市場銷售的質(zhì)粒載體。為了進行宿主細胞的轉(zhuǎn)化，例如可以使用噬菌體載體，使用鈣法、銣/鈣法、鈣/錳法、TFB高效率法、FSB冷凍感受態(tài)細胞法、迅速菌落法、電穿孔等該領(lǐng)域已知的方法或?qū)嵸|(zhì)上與該方法同樣的方法進行(D.Hanahan，J.Mol.Biol.，166557，1983等)。為了分離目的DNA，可以運用逆轉(zhuǎn)錄PCR(polymerase chain reaction coupledreverse transcription；RT-PCR)、RACE(rapid amplification of cDNAends)。RACE可以根據(jù)例如M.A.Innis et al.ed.，“PCR Protocols”(M.A.Frohman，“a guide to methods and applications”)，pp.28-38，Academic Press，New York(1990)等所述的方法進行。
DNA，可以根據(jù)需要克隆，例如可以利用質(zhì)粒、λ噬菌體、粘粒、P1噬菌體、F因子、YAC等。理想的是來自λ噬菌體的載體，例如可以利用Charon 4A、Charon 21A、λgt10、λgt11、λDASHII、λFIXII、λEMBL3、λZAPIITM(Stratagene公司)等。將得到的DNA整合到下面詳細說明那樣的適當(dāng)載體、例如質(zhì)粒pEX、pMAMneo、pKG5等載體，用下面詳細說明那樣的適當(dāng)?shù)乃拗骷毎?、例如大腸桿菌、酵母、CHO細胞、COS細胞等表達。另外該DNA片段直接或作為附加了適當(dāng)調(diào)控序列的DNA片段整合到適當(dāng)?shù)妮d體、然后導(dǎo)入動物后，可以做成表達所定基因的轉(zhuǎn)基因動物。作為動物如哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、牛等。最好是將該DNA片段導(dǎo)入小鼠等動物的受精卵，可以做成轉(zhuǎn)基因動物。對于所定基因產(chǎn)物的確認(rèn)可以使用轉(zhuǎn)化該外源基因的293T細胞、COS-1細胞等適于該基因的動物細胞等進行。
作為將外源基因?qū)氩溉閯游锏葎游锛毎姆椒?，可以通過該領(lǐng)域已知的方法或?qū)嵸|(zhì)上與該方法同樣的方法進行，例如磷酸鈣法(例如，F(xiàn).L.Graham et al.，Virology，52456，1973等)、DEAE-葡聚糖法(例如，D.Warden et al.，J.Gen.Virol.，3371，1968等)、電穿孔法(例如，E.Neumann et al.，EMBO J 1841，1982等)、微注射法、脂質(zhì)體法、病毒感染法、噬菌體粒子法等。這樣一來，轉(zhuǎn)染了所定基因的動物細胞產(chǎn)生的基因產(chǎn)物也可以對其進行解析。
作為整合所定基因等(本發(fā)明中得到的DNA等)的質(zhì)粒，只要是在基因工程中常用的宿主細胞(例如，大腸桿菌、枯草桿菌等原核細胞宿主，酵母、CHO細胞、COS細胞等真核細胞宿主，Sf21等昆蟲細胞宿主)中該DNA能夠表達的質(zhì)粒，什么樣的質(zhì)粒都可以。當(dāng)然也可以選用市售的試劑盒或試劑附帶的質(zhì)粒。在這樣的序列內(nèi)，也可以含有例如為了在選擇的宿主中表達而進行適當(dāng)修飾的密碼子，或設(shè)計限制酶部位，也可以含有為了使目的基因表達容易的調(diào)控序列、促進序列等、在結(jié)合目的基因中起作用的接頭、適配器等、以及調(diào)控抗生素抗性等、調(diào)控代謝、對篩選等有用的序列(也可以含有編碼雜化蛋白或融合蛋白質(zhì)的序列)等。最好是使用適當(dāng)?shù)膯幼?、例如在以大腸桿菌作為宿主的質(zhì)粒中，如使用色氨酸啟動子(trp)、乳糖啟動子(lac)、色氨酸-乳糖啟動子(tac)、脂蛋白啟動子(lpp)、λ噬菌體PL啟動子等，在以動物細胞作為宿主的質(zhì)粒中，可以使用SV40late啟動子、MMTV LTR啟動子、RSV LTR啟動子、CMV啟動子、SRα啟動子等，在以酵母作為宿主的質(zhì)粒中可以使用GAL1、GAL10啟動子等。另外也可以使用CYC1、HIS3、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、EN0、TP1、AOX1等調(diào)控系。
為了促進編碼所期望的多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄，可以在載體中插入增強子，作為這樣的增強子，如作用于啟動子，具有促進轉(zhuǎn)錄的作用，通常約10～100bp的具有cis作用的序列(元件)。很多增強子是從珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素等哺乳動物基因了解的。作為代表性的，使用從真核細胞感染性病毒得到的增強子合適，例如位于復(fù)制起點的late區(qū)域的SV40增強子(100-270bp)、巨細胞病毒的初期啟動子的增強子、位于多糖類的復(fù)制起點的late區(qū)域的增強子、腺病毒的增強子等。另外根據(jù)需要，也可以附加宿主中存在的信號序列，這些對于同行都是非常了解的增強子。
作為以大腸桿菌作為宿主的質(zhì)粒，例如pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pSP64、pSP65、pTZ-18R/-18U、pTZ-19R/-19U、pGEM-3、DGEM-4、pGEM-3Z、pGEM-4Z、pGEM-5Zf(-)、pBluescript KSTM(Stratagene公司)等。作為適于在大腸桿菌中表達的質(zhì)粒載體，如pAS、pKK223(Pharmacia公司)、pMC1403、pMC931、pKC30、pRSET-B(Invitrogen公司)等。作為以動物細胞為宿主的質(zhì)粒，例如SV40載體、多糖類·病毒載體、牛痘病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等，具體來說，如pcD、pcD-SRα、CDM8、pCEV4、pME18S、pBC12BI、pSG5(Stratagene公司)等。作為以酵母為宿主的質(zhì)粒，如YIp型載體、YEp型載體、YRp型載體、YCp型載體等，例如pGPD-2等。作為宿主細胞，當(dāng)宿主細胞為大腸桿菌時，如來自大腸桿菌K12株的，例如作為來自NM533、XL1-Blue、C600、DH1、DH5、DH11S、DH12S、DH5α、DH10B、HB101、MC1061、JM109、STBL2、B834株的，如BL21(DE3)pLYsS等。宿主細胞為酵母時，例如Saccharomyces cerevisiae，Schizosaccharomyces prombe，Pichia pastoris，Kluyveromyces株，Candida，Trichoderma reesia，以及其他酵母株等。
宿主細胞為動物細胞時，如來自非洲黑長尾猴纖維芽細胞的COS-7細胞、COS-1細胞、CV-1細胞、來自人腎細胞的293細胞、來自人表皮細胞的A431細胞、來自人結(jié)腸的205細胞、來自小鼠纖維芽細胞的COP細胞、MOP細胞、WOP細胞、來自中國倉鼠細胞的CHO細胞、CHO DHFR-細胞、人HeLa細胞、來自小鼠細胞的C127細胞、來自小鼠細胞的NIH 3T3細胞、小鼠L細胞、9BHK、HL60、U937、HaK、Jurkat細胞、其他被轉(zhuǎn)化后得到的細胞系、通常的二倍體、由體外一次培養(yǎng)組織誘導(dǎo)的細胞株等。作為昆蟲細胞，如以蠶核多角體病毒(Bombyxmori nuclear polyhedrosis virus)、來自它的病毒或其它合適的病毒作為載體，可以使用Spodoptera frugiperda(caterpillar)，Aedes aegypti(mosquito)，Aedes albopictus(mosquito)，Drosophila melanogaster(fruitfly)，蠶幼蟲或蠶培養(yǎng)細胞、例如BM-N細胞等(例如，Luckow et al.，Bio/Technology，6，47-55(1988)；Setlow，J.K.et al.(eds.)，GeneticEngineering，Vol.8，pp.277-279，Plenum Publishing，1986；Maedaet al.，Nature，315，pp.592-594(1985))。利用Agrobacteriumtumefaciens等，可以將植物細胞作為宿主細胞使用，與適合它的載體一起，在該領(lǐng)域已被廣泛了解。在本發(fā)明的基因工程手法中，可以使用在該領(lǐng)域已知或廣泛運用的限制酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、用于對適于將DNA片段克隆化的結(jié)構(gòu)進行修飾或進行變換的酶DNA修飾·分解酶、DNA聚合酶、末端核苷酸基轉(zhuǎn)移酶、DNA連接酶等。作為限制酶，例如R.J.Roberts，Nucleic Acids Res.，13r165，1985；S.Linn et al.ed.Nucleases，p.109，Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，New York，1982；R.J.Roberts，D.Macelis，Nucleic AcidsRes.，19Suppl.2077，1991等所述的酶。
根據(jù)本發(fā)明，用含有編碼多肽(或蛋白質(zhì))的核酸的表達載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體根據(jù)需要使用適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)志，通過反復(fù)克隆，可以獲得具有穩(wěn)定高表達能力的細胞株。例如，在作為宿主細胞使用動物細胞的轉(zhuǎn)化體中，作為選擇標(biāo)志利用dhfr基因時，通過慢慢提高MTX濃度進行培養(yǎng)，選擇抗性株，使編碼本發(fā)明的多肽的DNA擴增，可以獲得能更高表達的細胞株。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可以在可表達編碼本發(fā)明的多肽的核酸的條件下進行培養(yǎng)，使目的物生成、蓄積。該轉(zhuǎn)化體可以在該領(lǐng)域中廣泛使用的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。例如以大腸桿菌、枯草桿菌等原核細胞宿主、酵母等作為宿主的轉(zhuǎn)化體最好使用液體培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中可以含有該轉(zhuǎn)化體生育需要的碳源、氮源、無機物等。作為碳源，如葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖等，作為氮源，如銨鹽類、硝酸鹽類、玉米漿、胨、酪蛋白、肉提取物、麥芽提取物、大豆粕、馬鈴薯提取液等無機或有機物質(zhì)，作為無機物，例如氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂、碳酸鈣等。另外也可以添加酵母、維生素類、酪蛋白水解物、生長促進因子等。另外根據(jù)需要，為了更有效地使啟動子起作用，可以添加例如3β-吲哚丙烯酸那樣的藥劑。培養(yǎng)基的pH希望約5～約8。
培養(yǎng)，例如對于大腸桿菌通常于約15～約45℃下進行約3～約75小時，根據(jù)需要，也可以加通氣或攪拌。對宿主為動物細胞的轉(zhuǎn)化體進行培養(yǎng)時，作為培養(yǎng)基可以使用例如含有約5～約20％的胎牛血清的MEM培養(yǎng)基、PRMI1604培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基等。pH優(yōu)選約6～約8。培養(yǎng)通常于約30～約40℃下進行約15～約72小時，根據(jù)需要，也可以加通氣或攪拌。表達所定基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化體可以直接利用，也可以做成該細胞勻漿液利用，也可以將所定基因的產(chǎn)物分離后使用。當(dāng)從上述培養(yǎng)細胞提取時，可以適當(dāng)?shù)剡\用培養(yǎng)后用眾所周知的方法收集菌體或細胞，將它們懸浮于適當(dāng)?shù)木彌_液中，通過超聲波、溶菌酶和/或冷凍融解等破壞菌體或細胞后，通過離心分離或過濾很多粗提取液的方法等。在緩沖液中也可以加尿素或鹽酸胍等蛋白質(zhì)變性劑、TritonX-100(商品名)、吐溫-20(商品名)等表面活性劑。目的生成物向培養(yǎng)液中分泌時，培養(yǎng)結(jié)束后，通過這方面眾所周知的方法將菌體或細胞與上清分離，收集上清。
上述那樣得到的培養(yǎng)上清、或提取液中含有的目的生成物可以將對于目的生成物眾所周知的分離純化法適當(dāng)組合對其進行純化，例如通過硫酸銨沉淀法等鹽析、通過交聯(lián)葡聚糖等凝膠過濾法、使用帶有例如二乙基氨乙基或羧甲基等的載體的離子交換層析法、例如，使用帶有丁基、辛基、苯基等疏水性基團的載體等的疏水性層析法、色素凝膠層析法、電泳法、透析、超濾、親和層析法、高效液相層析法等進行純化獲得。理想的是可以通過聚丙烯酰胺凝膠電泳、固定了配體等的親和層析等進行處理，進行純化分離處理。例如明膠-瓊脂糖親和層析、肝素-瓊脂糖層析等。
得到的本發(fā)明的多肽(或蛋白質(zhì))可以通過化學(xué)的手法再對其含有的氨基酸殘基進行修飾，或使用肽酶，例如胃蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、肽鏈內(nèi)切酶、肽鏈外切酶等酶進行修飾，進行部分分解后作為其衍生物等。本發(fā)明的多肽C末端通常為羧基(-COOH)或羧酸鹽基(-COO-)，C末端也可以是酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)。其中作為酯中的R，除了可以使用甲基、乙基、n-丙基、異丙基或n-丁基等C1-6烷基、例如環(huán)戊基、環(huán)己基等C3-8環(huán)烷基、例如苯、α-萘等C6-12芳香基、例如芐基、苯乙基等苯-C1-2烷基或α-萘甲基等α-萘-C1-2烷基等C7-14芳烷基之外，還可以使用作為口服用酯被廣泛運用的三甲基乙酰氧甲基等。當(dāng)本發(fā)明的蛋白質(zhì)C末端以外含有羧基(或羧酸鹽)時，羧基被酰胺化或酯化后的產(chǎn)物也包括在本發(fā)明的多肽中。作為此時的酯，例如可以使用上述的C末端的酯等。
另外，在本發(fā)明的多肽(或蛋白質(zhì))中，也包括在上述的多肽中，N末端的蛋氨酸殘基的氨基被保護基(例如，甲?；?、乙?；菴1-5烷基-羰基等C1-6?；?保護的產(chǎn)物，N端側(cè)在生物體內(nèi)被切斷生成的谷?；M行焦谷氨酰化的產(chǎn)物、分子內(nèi)氨基酸的側(cè)鏈上的取代基(例如，-OH、-COOH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)用適當(dāng)?shù)谋Ｗo基(例如，甲?；⒁阴；菴1-6?；?保護的產(chǎn)物、或結(jié)合了糖鏈的所謂糖蛋白等復(fù)合蛋白質(zhì)等。
另外，通過使用以本發(fā)明涉及到的基因的堿基序列作為基礎(chǔ)的基因工程常用的方法，例如在所定的多肽的氨基酸序列中適當(dāng)?shù)刂脫Q、缺失、插入、轉(zhuǎn)移或附加1個或多個以上氨基酸，可以制造導(dǎo)入了變異相當(dāng)?shù)亩嚯摹Ｗ鳛檫@樣的變異·變換·修飾法，例如日本生化學(xué)會編、“續(xù)生化學(xué)實驗講座1、基因研究法II”、p.105(廣瀨進)、東京化學(xué)同人(1986)；日本生化學(xué)會編、“新生化學(xué)實驗講座2、核酸III(重組DNA技術(shù))”、p.233(廣瀨進)、東京化學(xué)同人(1992)；R.Wu，L.Grossman，ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.154，p.350&p.367，，Academic Press，New York(1987)；R.Wu，L.Grossman，ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.100，p.457&p.468，Academic Press，New York(1983)；J.A.Wells etal.，Gene，34315，1985；T.Grundstroem et al.，Nueleic AcidsRes.，133305，1985；J.Taylor et al.，Nucleic AcidsRes.，138765，1985；R.Wu ed.，“Methods inEnzymology”，Vol.155，p.568，Academic Press，New York(1987)；A.R.Oliphant et al.，Gene，44177，1986等所述的方法。例如，利用合成寡核苷酸等的位置指定突變導(dǎo)入法(部位特異的突變導(dǎo)入法)(Zoller et al.，Nucleic Acids Res.，106487，1987；Carter et al.，Nucleic Acids Res.，134331，1986)、盒(序列)突變導(dǎo)入法(cassettemutagenesisWells et al.，Gene，34315，1985)，限制部位選擇突變導(dǎo)入法(restriction selection mutagenesisWells etal.，Philos.Trans.R.Soc.London Ser A，317415，1986)，丙氨酸·掃描法(Cunningham &Wells，Science，2441081-1085，1989)，PCR突變導(dǎo)入法，Kunkel法，dNTP[αS]法(Eckstein)，使用亞硫酸或亞硝酸等的區(qū)域指定突變導(dǎo)入法等方法。
另外，當(dāng)用基因重組法進行制造時，以融合多肽(融合蛋白質(zhì))使其表達，在生物體內(nèi)或生物體外，也可以變換·加工為實質(zhì)上具有與所期望的多肽同等生物學(xué)活性的多肽。可以使用基因工程常用的融合產(chǎn)生法，這樣融合的多肽利用其融合部，通過親核層析等也可以進行純化。作為這樣融合多肽，如可以與組氨酸盒融合的融合多肽，或與β-半乳糖苷酶(β-gal)、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)(MBP)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、硫氧還蛋白(thioredoxin)(TRX)或Cre Recombinase的氨基酸序列融合的融合多肽。同樣，多肽可以附加異種的抗原表位標(biāo)記，通過使用與該抗原表位特異結(jié)合的抗體的免疫親和層析也可以進行純化。在更適合的上述方式中，如聚組氨酸(poly-His)或聚組氨酸-甘氨酸(poly-His-Gly)標(biāo)記，而作為抗原表位標(biāo)記，例如AU5，c-Myc，CruzTag 09，CruzTag 22，CruzTag 41，Glu-Glu，HA，Ha.11，KT3，F(xiàn)LAG(registered trademark，Sigma-Aldrich)，Omni-probe，S-probe，T7，Lex A，V5，VPl6，GAL4，VSV-G等(Field et al.，Molecularand Cellular Biology，8pp.2159-2165(1988)；Evan etal.，Molecular and Cellular Biology，5pp.3610-3616(1985)；Paborsky et al.，Protein Engineering，3(6)pp.547-553(1990)；Hopp et al.，BioTechnology，6pp.1204-1210(1988)；Martin etal.，Science，255pp.192-194(1992)；Skinner etal.，J.Biol.Chem.，266pp.15163-15166(1991)；Lutz-Freyermuthet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87pp.6393-6397(1990)等)。也可以利用使用酵母的雙雜交(two-hybrid)法。
另外作為融合多肽，也可以是附加了成為可檢測的蛋白質(zhì)那樣的標(biāo)志的融合多肽。在更合適的實施方式中，該可檢測標(biāo)志可以是生物素/鏈抗生物素蛋白系的Biotin Avi Tag、發(fā)熒光的物質(zhì)等。作為發(fā)該熒光的物質(zhì)，如來自オワン水母(Aequorea victorea)等發(fā)光水母的綠色熒光蛋白(green fluorescent proteinGFP)、對其進行改變后的變異體(GFP變異體)、例如EGFP(enhanced-humanized GFP)、rsGFP(red-shift GFP)，黃色熒光蛋白(yellow fluorescentproteinYFP)，綠色熒光蛋白(green fluorescent proteinGFP)、藍綠色熒光蛋白(cyan fluorescent proteinCFP)，藍色熒光蛋白(blue fluorescent proteinBFP)，來自ウミシイタケ(Renillareniformis)的GFP等(宮脅敦史編、實驗醫(yī)學(xué)另冊后基因組時代的實驗講座3-GFP和Bioimaging、羊土公司(2000年))。也可以使用特異識別上述融合蛋白的抗體(包括單克隆抗體和其片段)進行檢測。這樣的融合多肽的表達和純化也可以使用適用于表達和純化的試劑盒，按照試劑盒制造者或試劑盒銷售者明確給出的程序?qū)嵤?br> 得到的蛋白質(zhì)(可以包括肽和多肽)，通過酶免疫測定法等已知手法使它結(jié)合于適當(dāng)?shù)妮d體或固相，可以進行固定化。固相化蛋白質(zhì)、固相化肽可很便利地用于結(jié)合分析或物質(zhì)的篩選。
多肽或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)的修飾·改變等可以參考例如日本生化學(xué)會編“新生化學(xué)實驗講座1、蛋白質(zhì)VII、蛋白質(zhì)工程”東京化學(xué)同人(1993)，根據(jù)該文獻所述的方法或其引用的文獻所述的方法、或與其實質(zhì)上同樣的方法進行。在如下面所述的那樣的生物學(xué)活性中，也可以包括免疫方面活性、例如抗原性。在該修飾·改變中，可以是脫氨基化、羥基化、羧基化、磷酸化、硫酸化、甲基化等烷基化、乙?；弱；?、酯化、酰胺化、開環(huán)、閉環(huán)、糖基化、向含糖鏈種類不同方面改變、將含糖鏈數(shù)增減、脂質(zhì)結(jié)合、對D-體氨基酸殘基的置換等。這些方法都是在該領(lǐng)域已知的方法(例如、T.E.Creighton，ProteinsStructure and Molecular Properties，pp.79-86 W.H.Freeman & Co.，San Francisco，USA(1983)等)。
本發(fā)明的來自人的肽或多肽(或蛋白質(zhì))，1個以上的氨基酸殘基在同一性方面與天然的不同，也可以是1個以上氨基酸殘基的位置與天然的位置不同。本發(fā)明的來自人的肽包含缺少人半乳凝素9(包括L，M以及S型)蛋白質(zhì)中特有的氨基酸殘基中1個以上(例如，1～80個、優(yōu)選1～60個、更優(yōu)選1～40個、更優(yōu)選1～20個、特別優(yōu)選1～10個等)的缺失類似物、特有氨基酸殘基中的1個以上(例如，1～80個、優(yōu)選1～60個、更優(yōu)選1～40個、更優(yōu)選1～20個、特別優(yōu)選1～10個等)被其它殘基置換的置換類似物、也包含附加1個以上(例如，1～80個、優(yōu)選1～60個、更優(yōu)選1～40個、更優(yōu)選1～20個、特別優(yōu)選1～10個等)的氨基酸殘基的附加類似物。
如果作為天然的人半乳凝素9蛋白質(zhì)的特征的區(qū)域結(jié)構(gòu)或糖結(jié)合能力被維持，象上述那樣的變異體全部包含在本發(fā)明中。另外，可以認(rèn)為本發(fā)明的肽或多肽也包含具有與天然的人半乳凝素9蛋白質(zhì)實質(zhì)上同等的一級結(jié)構(gòu)構(gòu)象或具有其一部分的肽或多肽，還包含與天然的具有實質(zhì)上同等生物學(xué)活性的肽或多肽。另外，還可以是天然產(chǎn)生的變異體之一。本發(fā)明的所謂來自人的蛋白質(zhì)(或肽或多肽)，如對選自WO 02/37114 A1的序列表中的SEQ ID NO1～3的氨基酸序列具有60％、因場合不同，比70％更高的相同性的蛋白質(zhì)，更優(yōu)選的是具有80％或90％以上高的相同氨基酸序列的蛋白質(zhì)。所謂本發(fā)明的來自人的蛋白質(zhì)的一部分是來自人的蛋白質(zhì)的一部分肽(即該蛋白質(zhì)的部分肽)，只要是具有與本發(fā)明的半乳凝素9蛋白質(zhì)實質(zhì)上同等活性的肽，無論哪一個都可以。例如，該本發(fā)明的蛋白質(zhì)的部分肽如具有該人半乳凝素9的構(gòu)成氨基酸序列中至少5個以上，優(yōu)選20個以上、更優(yōu)選50個以上、更優(yōu)選70個以上、更優(yōu)選100個以上、有時200個以上的氨基酸序列的肽，理想的是這些肽是對應(yīng)于連續(xù)的氨基酸殘基的肽，或例如有關(guān)在該WO 02/37114 A1的序列表中的SEQ ID NO1～3的任一個表示的氨基酸序列中對于對應(yīng)的區(qū)域的相同性，具有與上述同樣的相同性的肽。
在本說明書中，所謂“實質(zhì)上同等”意思是指蛋白質(zhì)的活性、例如所定的毒害細胞活性、凋亡誘起活性、抗炎癥活性、抗過敏活性、免疫抑制活性、糖鏈結(jié)合活性、生理活性、生物學(xué)活性實質(zhì)上相同。另外，在該用語的意思中還可以包含實質(zhì)上具有同質(zhì)的活性的場合，作為該實質(zhì)上同質(zhì)的活性，如結(jié)合活性、毒害細胞活性、凋亡誘起活性等。所謂實質(zhì)上同質(zhì)的活性表示這些活性性質(zhì)上是同質(zhì)，例如生理方面、藥理學(xué)方面、或生物學(xué)方面同質(zhì)。例如，結(jié)合活性、毒害細胞活性、凋亡誘起活性等活性最好是同等(例如，約0.001～約1000倍、優(yōu)選約0.01～約100倍、更優(yōu)選約0.1～約20倍、更優(yōu)選約0.5～約2倍)，這些活性的程度、蛋白質(zhì)的分子量等量的要素也可以不同。然后，氨基酸的置換、缺失、或插入常常都不會使多肽的生理特性或化學(xué)特性發(fā)生大的變化，在某些場合會給出理想的變化。這樣進行的場合，實施其置換、缺失、或插入的多肽應(yīng)當(dāng)當(dāng)作為與沒有進行這樣的置換、缺失、或插入的多肽實質(zhì)上同一。作為該氨基酸序列中的氨基酸的實質(zhì)上同一的置換體，該氨基酸可以從所屬的類中的其它氨基酸類選擇。例如，作為非極性(疏水性)氨基酸，如丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、色氨酸、蛋氨酸等，作為極性(中性)，如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺等，作為帶有正電荷的氨基酸(堿性氨基酸)，如精氨酸、賴氨酸、組氨酸等，作為帶有負(fù)電荷的氨基酸(酸性氨基酸)，天冬氨酸、谷氨酸等。
對于本發(fā)明的蛋白質(zhì)和其一部分肽的合成，可以使用該肽合成領(lǐng)域中已知的方法，例如液相合成法、固相合成法等化學(xué)合成法。在這樣的方法中，使用例如蛋白質(zhì)或肽合成用樹脂，使適當(dāng)保護的氨基酸通過這方面眾所周知的各種縮合方法按照所期望的氨基酸序列依次在該樹脂上結(jié)合。對于縮合反應(yīng)最好是使用這方面眾所周知的各種活化試劑，作為這樣的試劑，最好使用例如二環(huán)己基碳二亞胺等碳二亞胺類。生成物含有保護基時，可以通過除去適當(dāng)保護基獲得目的生成物。
本發(fā)明的肽(或多肽)以游離型得到時，可以通過這方面眾所周知的方法或根據(jù)這些方法的方法變換為鹽，而這些生成物以鹽形式獲得時，可以通過這方面眾所周知的方法或根據(jù)這些方法的方法變換為游離型產(chǎn)物或其它的鹽。
作為本發(fā)明的肽(或多肽)的鹽，作為生理上容許的或作為醫(yī)藥容許的鹽是優(yōu)選的，但不限定于這些。作為這樣的鹽，例如與鹽酸、溴氫酸、硫酸、硝酸、磷酸等無機酸的鹽，例如與醋酸、甲酸、馬來酸、延胡索酸、琥珀酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、苯甲酸、甲磺酸、p-甲苯磺酸、苯磺酸等有機酸的鹽等。而作為該鹽如銨鹽、如乙胺、二甲基胺、三甲基胺、羥乙胺等有機堿基的鹽等。
對于半乳凝素9表達基因(包括cDNA等DNA以及mRNA等RNA)根據(jù)上述“基因重組技術(shù)”，通過在該領(lǐng)域中用于檢測測定特定基因的表達已知的手法、例如原位(in situ)雜交、Northern blotting、dot blotting、RNase保護分析、RT-PCR、Real-Time PCR(Journalof Molecular Endocrinology，25，169-193(2000)以及其中引用的文獻)、DNA陣列解析法(Mark Shena編，“Microarray BiochipTechnology”，Eaton Publishing(2000年3月)等進行檢測·測定，可以檢測與本說明書公布的半乳凝素9表現(xiàn)出的生物活性相關(guān)的現(xiàn)象等。利用這樣的技術(shù)的半乳凝素9表達測定系、測定系中利用的試劑、方法、程序等都包括在本發(fā)明的技術(shù)以及技術(shù)中利用的系統(tǒng)。對于該in situ雜交，可以包括例如非RI in situ雜交，其中也可以包括直接法和間接法。該直接法是使用可檢測的分子(報告分子)直接結(jié)合于核酸探針的方法，該間接法是使用針對報告分子的抗體等使信號擴增的方法。在核酸探針中的寡核苷酸中，導(dǎo)入官能團(例如，第一級脂肪族氨基、SH基等)，可以使庚烯、熒光色素、酶等結(jié)合于這樣的官能團。作為核酸探針的標(biāo)記，代表性的如洋地黃毒苷(DIG)、生物素、熒光素等，象上述那樣在抗體的地方可以從進行說明的標(biāo)記中適當(dāng)選擇使用，另外也可以利用多重標(biāo)記，還可以利用標(biāo)記抗體。作為核酸探針的標(biāo)記法，可以從該領(lǐng)域中已知的方法中選擇使用，例如隨機引物法、切口平移法、利用PCR的DNA的擴增、標(biāo)記/加尾法、in vitrotranscription法等。對于可處理的樣品的觀察，可以從該領(lǐng)域中已知的方法中適當(dāng)選擇使用，例如可以使用暗視野顯微鏡、位相差顯微鏡、反射對照顯微鏡、熒光顯微鏡、數(shù)字圖像顯微鏡、電子顯微鏡等，另外也可以利用流式細胞儀。
本說明書中，所謂惡性細胞可以包含進行轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞。進行轉(zhuǎn)移的腫瘤在惡性腫瘤中一般將其惡性腫瘤分為上皮性和非上皮性的腫瘤，有時也區(qū)分為癌、肉瘤、白血病等，單稱為“癌”時，在一般人中大多指惡性腫瘤。在本說明書中所謂“癌”可以按照廣泛意思解釋，并不單解釋為上皮性的惡性腫瘤。在本說明書中所謂“癌”可以包含上皮性惡性腫瘤和非上皮性惡性腫瘤(既包含腫瘤形成性的腫瘤，也包含非形成性的腫瘤)，如皮膚癌(也包含黑素瘤)、乳腺癌、卵巢癌、子宮癌、睪丸惡性腫瘤、前列腺癌、膀胱癌、腎癌、甲狀腺癌、咽頭·喉頭癌、舌癌、上顎癌、食道癌、胃癌、結(jié)腸·直腸癌、肺·支氣管癌、肝癌(包括肝細胞癌、肝內(nèi)膽管癌)、肝外膽管·膽囊癌、胰贓癌、白血病、惡性淋巴瘤、形質(zhì)細胞瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤、惡性血管瘤、惡性血管內(nèi)皮瘤、腦腫瘤(包括腦膜瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤等)等，并不限定于這些，應(yīng)當(dāng)理解為利用半乳凝素9具有的活性，成為本發(fā)明所定目的對象的都包括在內(nèi)，沒有特別限定。
利用在本發(fā)明中闡明的半乳凝素9起到的功能，可以篩選對該半乳凝素9的所定生物學(xué)活性等功能(例如，毒害細胞活性、凋亡誘導(dǎo)活性、與糖皮質(zhì)激素類似的活性、抑制惡性細胞的轉(zhuǎn)移的活性等)促進的化合物(激動劑)或抑制的化合物(拮抗劑)或它們的鹽。這也意味著可以提供該篩選試劑。因此，也可以提供有關(guān)利用在本發(fā)明中闡明的該半乳凝素9蛋白質(zhì)等多肽、其一部分肽或它們的鹽表現(xiàn)出的活性的各種各樣的物質(zhì)，對本發(fā)明中該半乳凝素9蛋白質(zhì)、其一部分肽或它們的鹽等表現(xiàn)出的生物學(xué)活性等所定功能促進的化合物(激動劑)或抑制的化合物(拮抗劑)或它們的鹽的篩選方法。
在該篩選中，例如(i)使適當(dāng)?shù)脑囼灅悠放c半乳凝素9蛋白質(zhì)、其一部分肽或它們的鹽(也包括表達該蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體)等接觸的場合，(ii)與在本發(fā)明的蛋白質(zhì)、其一部分肽或它們的鹽等中不存在問題的試驗樣品場合進行比較。(iii)具體來說，在上述篩選中，測定該生物學(xué)活性(例如，與各個半乳凝素9蛋白質(zhì)和生物體成分之間的相互作用有關(guān)的活性等)后進行比較。
在該篩選系也可以存在為了便于測定的適當(dāng)?shù)臋z測用底物。作為該底物，只要是在測定中可有效利用的，無論什么樣的都可以。例如，從作為眾所周知的底物已知的底物中選擇使用，優(yōu)選是可以使用合成的化合物等。底物可以直接使用，但優(yōu)選是使用用熒光素等熒光、酶或放射性物質(zhì)標(biāo)記的底物。
作為試驗樣品，例如蛋白質(zhì)、肽、非肽性化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、植物提取物、動物等組織提取物、細胞提取物等。在試驗樣品中使用的試驗化合物的例子中優(yōu)選含有抗凝集素抗體、酶抑制劑、細胞因子、各種具有抑制活性的化合物、特別是合成化合物等。這些化合物可以是新的化合物，也可以是眾所周知的化合物。該篩選可以根據(jù)通常的結(jié)合活性或酶活性的測定法實施，例如可以參考該領(lǐng)域中眾所周知的方法等進行。另外，可以使用各種標(biāo)記、緩沖液系以及其它適當(dāng)?shù)脑噭┑?，可以按照在此說明的操作等進行。使用的肽等可以用活化劑進行處理，也可以預(yù)先將其前體或潛在型的前體變換為活性型的前體。測定通常在Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液等對反應(yīng)沒有壞的影響的那樣緩沖液等中，例如在pH約4～約10(優(yōu)選pH約6～約8)中進行。當(dāng)分別進行篩選時，在各個方法中的通常的條件、操作法中除了同行的通常技術(shù)考慮后，可以構(gòu)建與本發(fā)明的該半乳凝素9蛋白質(zhì)或與其實質(zhì)上具有同等活性的多肽或肽有關(guān)的測定系。有關(guān)這些一般的技術(shù)手段的詳細敘述可以參照綜述、出版的書等[例如、Methods in Enzymology Academic Press公司(USA)發(fā)行等]。另外，凋亡誘導(dǎo)活性測定法等可以參考田沼靖一監(jiān)修、“細胞工程手冊實驗程序系列、凋亡實驗程序”株式會社秀潤社、1995年1月20日(第1版第2次印刷)等，也可以使用市售測定試劑盒。
使用本發(fā)明的篩選方法或篩選試劑盒得到的化合物或其鹽是從上述的試驗化合物、例如肽、蛋白質(zhì)、非肽性化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細胞提取物、植物提取物、動物組織提取物等選擇的化合物，是促進或抑制本發(fā)明的蛋白質(zhì)等的功能的化合物。作為該化合物的鹽，如藥學(xué)上容許的鹽等。例如，與無機堿基的鹽、與有機堿基的鹽、與無機酸的鹽、與有機酸的鹽、與堿性或酸性氨基酸的鹽等。作為與無機堿基的鹽的合適例子，如鈉鹽、鉀鹽等堿金屬鹽，鈣鹽、鎂鹽等堿土金屬鹽，以及鋁鹽、銨鹽等。作為與有機堿基的鹽的合適例子，如與三甲基胺、三乙基胺、吡啶、甲基吡啶、2，6-二堿基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、環(huán)己基胺、二環(huán)己基胺、N，N-二芐基乙二胺等的鹽。作為與無機酸的鹽的合適例子，如與鹽酸、溴氫酸、硫酸、磷酸等的鹽。作為與有機酸的鹽的合適的例子，例如與甲酸、醋酸、丙酸、延胡索酸、草酸、酒石酸、馬來酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、甲磺酸、苯磺酸、苯甲酸等的鹽。而作為與堿性氨基酸的鹽的合適例子，如與精氨酸、賴氨酸、組氨酸等的鹽，作為與酸性氨基酸的鹽的合適的例子，如與天冬氨酸、谷氨酸等的鹽。
本說明書中，抗半乳凝素9抗體可以使用眾所周知的手段獲得多克隆抗體或單克隆抗體。
本說明書中，所謂“抗體”用語，可以是在廣義的意思使用的用語，可以是針對所期望的半乳凝素9多肽以及相關(guān)肽片段的單克隆抗體的單一抗體或針對各種抗原表位的具有特異性的抗體組合物，另外，包括1價抗體或多價抗體以及多克隆抗體和單克隆抗體的用語，也可以是表示天然型(intact)分子以及它們的片段和衍生物的用語，被認(rèn)為是包含所謂的F(ab’)2，F(xiàn)ab’以及Fab的片段，還包含含有至少兩個抗原或表位(epitope)結(jié)合部位的嵌合抗體或雜種抗體、或例如四價體(quadrome)、三價體(triome)等二重特異性重組抗體、種間雜種抗體、抗個體基因型抗體、以及經(jīng)化學(xué)修飾或加工等生成的那些衍生物的用語、運用眾所周知的細胞融合或雜交瘤技術(shù)或抗體工程，使用合成或半合成技術(shù)得到的抗體、運用從抗體生成的觀點眾所周知的以往技術(shù)，利用DNA重組技術(shù)制備的抗體、對于在本說明書中所述、而且定義的靶抗原物質(zhì)或靶表位具有中和特性的抗體或具有結(jié)合特性的抗體。特別理想的本發(fā)明的抗體是能夠特異識別天然型的M型半乳凝素9(galectin-9 medium isoform or medium typegalectin-9)多肽或天然型的L型半乳凝素9(galectin-9 longisoform or long type galectin-9)多肽的抗體，例如能夠?qū)型半乳凝素9多肽或M型半乳凝素9多肽和S型半乳凝素9多肽(galectin-9 short isoform or short type galectin-9)區(qū)別識別的抗體。
為了以多克隆抗體形式獲得抗半乳凝素9抗體，將作為免疫源的半乳凝素9和其片段、半乳凝素9序列的一部分肽免疫哺乳動物、鳥類等，從該哺乳動物、鳥類等採取血清。然后可以使用該抗血清中含有的多克隆抗體。
作為以該半乳凝素9作為致敏抗原被免疫的哺乳動物，沒有特別限定，一般來說可以使用嚙齒類動物、例如小鼠、大鼠、土拔鼠等，以及兔、綿羊、山羊、牛、馬、豬、狗、貓、猴等靈長類、雞等鳥類等。另外，有時考慮到與細胞融合使用的母細胞的適合性后進行選擇更好。
將致敏抗原免疫動物可以根據(jù)眾所周知的方法進行。例如，作為一般的方法，通過將致敏抗原注射到哺乳動物等腹腔內(nèi)或皮下進行。另外，在致敏抗原免疫時可以使用適當(dāng)?shù)妮d體。
含有多克隆抗體的抗血清可以在所定期間對被免疫動物進行飼養(yǎng)后，從該動物採集的血液中制備。得到的抗血清確認(rèn)能夠特異識別半乳凝素9后，可以作為本發(fā)明的所定的活性成分供給。
首先，作為獲得抗體的致敏抗原使用的半乳凝素9可以通過眾所周知的表達半乳凝素9基因/氨基酸序列獲得(而半乳凝素9的氨基酸序列是WO 02/37114 A1公布的)。即，將編碼半乳凝素9或其一部分的結(jié)構(gòu)域、半乳凝素9的一部分蛋白質(zhì)或多肽片段、具有相當(dāng)于半乳凝素9的氨基酸序列的一部分的氨基酸序列的肽的基因序列插入到眾所周知的表達載體系后，轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷毎?，通過眾所周知的方法從其宿主細胞中或培養(yǎng)上清中純化目的半乳凝素9或其一部分結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)、半乳凝素9的一部分的蛋白質(zhì)或多肽片段、相當(dāng)于半乳凝素9的氨基酸序列的一部分氨基酸序列的肽。
另外，在本發(fā)明中，作為抗半乳凝素9抗體可以使用來自哺乳動物的以單克隆抗體形式獲得的抗體。
針對抗原物質(zhì)制作的單克隆抗體是通過培養(yǎng)中的一系列細胞系使用可以提供抗體分子產(chǎn)生的任意方法產(chǎn)生的。所謂修飾語“單克隆”表示從實質(zhì)上均質(zhì)的抗體集團得到的顯示該抗體的性格的抗體，不能看作必須要通過某一個特定方法產(chǎn)生該抗體。各個單克隆抗體除了也許是自然產(chǎn)生的變異體或許只是微量存在的以外，也包含同一的那樣抗體集團。單克隆抗體具有高特異性，針對具有單一抗原性的部位。與典型的含有針對不同抗原決定族(表位)的各種各樣抗體的通常的(多克隆)抗體制備物相比，各個單克隆抗體是針對該抗原上的單一抗原決定族的抗體。除了其特異性以外，單克隆抗體通過雜交瘤培養(yǎng)合成，其優(yōu)點是沒有其它免疫球蛋白類夾雜或很少夾雜。單克隆抗體包括雜化抗體和重組抗體。這些抗體只要是表現(xiàn)出所期望的生物活性，不管其來源或免疫球蛋白類或亞類的類別如何，將可變區(qū)結(jié)構(gòu)域用恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域置換(例如，人源化抗體)、或輕鏈用重鏈置換，或某種鏈用另外一種鏈置換，或與異種的蛋白質(zhì)融合獲得(例如美國專利第4816567號；Monclonal Antibody Production Techniques andApplications，pp.79-97，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987等)。
在制造單克隆抗體的合適的方法的例子中，除了雜交瘤法(G.Kohler and C.Milstein，Nature，256，pp.495-497(1975))；人B細胞雜交瘤法(Kozbor et al，Immunology Today，4，pp.72-79(1983))；Kozbor，J.Immunol.，133，pp.3001(1984)；Brodeur etal.，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.NewYork(1987)；triome法；EBV-雜交瘤法(Cole et al.，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，AlanR.Liss，Inc.，pp.77-96(1985))(用于產(chǎn)生人單克隆抗體的方法)；美國專利第4946778號(用于產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù))之外，關(guān)于抗體如以下文獻所述S.Biocca et al，EMBO J，9，pp.101-108(1990))；R.E.Bird et al，Science，242，pp.423-426(1988))；M.A.Boss etal，Nucl.Acids Res.，12，pp.3791-3806(1984))；J.Bukovsky etal，Hybridoma，6，pp.219-228(1987))；M.DAINO et al，Anal.Biochem.，166，pp.223-229 (1987))；J.S.Huston et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，pp.5879-5883(1988))；P.T.Jones et al，Nature，321，pp.522-525(1986))；J.J.Langone et al.(ed.)，“Methods inEnzymology”，Vol.121(Immunochemical Techniques，Part IHybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)，AcademicPress，New York(1986)；S.Morrison et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，pp.6851-6855(1984))；V.T.Oi et al，BioTechniques，4，pp.214-221(1986))；L.Riechmann et al，Nature，332，pp.323-327(1988))；A.Tramontano et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，pp.6736-6740(1986))；C.Wood et al，Nature，314，pp.446-449(1985)；Nature，314，pp.452-454(1985))或這些文獻中引用的文獻(這些文獻中的某些記載由于參照它們，所有也包括在本說明書的內(nèi)容中)。
本發(fā)明中涉及到的單克隆抗體只要是它們表現(xiàn)出所期望的生物活性，可以是重鏈和/輕鏈的一部分與由特定的種誘導(dǎo)的或?qū)儆谔囟ǖ目贵w類或亞類的抗體的對應(yīng)序列同一或同系，另一方面，特別包含鏈的其余部分是與另外種誘導(dǎo)的或?qū)儆诹硗獾目贵w類或亞類的抗體的對應(yīng)序列同一或同系的“嵌合”抗體(美國專利第4816567號說明書；Morrison et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，pp.6851-6855(1984))。
本發(fā)明的單克隆抗體如通過來自哺乳動物的雜交瘤產(chǎn)生的抗體、以及通過基因工程手法通過用含有抗體基因的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主生產(chǎn)的抗體。
產(chǎn)生抗半乳凝素9抗體的產(chǎn)生單克隆抗體雜交瘤可以象以下那樣使用骨髓瘤細胞的細胞融合技術(shù)制作。
即，使用半乳凝素9或其片段作為致敏抗原，按照通常的免疫方法進行免疫，將得到的免疫細胞通過通常的細胞融合法與眾所周知的母細胞融合，可以通過通常的篩選法，通過篩選產(chǎn)生單克隆抗體的細胞制作。有關(guān)半乳凝素9或其片段的制備方法以及對哺乳動物的免疫方法等可以按照上述的制備含有多克隆抗體的抗血清的手法進行。此時，特別是在對哺乳動物免疫后，從確認(rèn)血清中所期望的抗體水平上升的哺乳動物採取免疫細胞，進行細胞融合，作為優(yōu)選的免疫細胞特別例舉脾細胞。
作為可與上述免疫細胞融合的另一方母細胞，使用哺乳動物的骨髓瘤細胞。作為該骨髓瘤細胞可以使用眾所周知的各種細胞株。免疫細胞與骨髓瘤細胞的融合等基本上可以根據(jù)眾所周知的方法、例如Kohler和Milstein方法(Kohler，G.and Milstein，C.，MethodsEnzymol.(1981)73，3-46)等進行。
以下以單克隆抗體為例，詳細地說明抗體的制作。
本發(fā)明的抗體可以是利用使用骨髓瘤細胞的細胞融合技術(shù)得到的單克隆抗體，例如可以按照如下那樣的工序制作。
(1)免疫原性抗原的制備、(2)用免疫原性抗原免疫動物、(3)骨髓瘤細胞的制備、(4)產(chǎn)生抗體細胞與骨髓瘤細胞的細胞融合、(5)雜交瘤(融合細胞)的選擇以及單克隆化、以及(6)單克隆抗體的制造(1)免疫原性抗原的制備如下進行。作為抗原如上所述，可以使用對天然型半乳凝素9多肽或由其衍生的大片段(可以包含一部分結(jié)構(gòu)域多肽、連接多肽、片段、一部分肽、合成多肽)進行分離后的多肽，可以利用根據(jù)決定的半乳凝素9的氨基酸序列信息為基礎(chǔ)，化學(xué)合成適當(dāng)?shù)墓央淖鳛榭乖４硇缘目乖绱嬖谟谶x自(1)WO02/37114 A1公布的序列表中序列編號1以及序列編號2的氨基酸序列或其一部分結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；(2)序列編號3的一部分結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；(3)序列表中的序列編號4，5，7，8和9的氨基酸序列；(4)序列表中的序列編號1中的序列編號構(gòu)成與4相當(dāng)?shù)陌被嵝蛄邢嘟拥腃端側(cè)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列或其一部分片段；(5)序列表中的序列編號1中序列編號構(gòu)成與4相當(dāng)?shù)陌被嵝蛄兄暗腘端側(cè)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列或其一部分片段等區(qū)域的氨基酸殘基中的具有連續(xù)的至少5個以上氨基酸的肽。
抗原可以直接與適當(dāng)?shù)淖魟┗旌虾笤趯游锩庖邥r使用，也可以做成免疫原性綴合物等。例如，作為免疫原使用的抗原也可以是使半乳凝素9片段化后的產(chǎn)物、或根據(jù)其氨基酸序列選擇特征性的序列區(qū)域，對多肽進行設(shè)計，通過化學(xué)合成得到的合成多肽。另外。將該片段借助于適當(dāng)?shù)目s合劑，與種種載體蛋白質(zhì)結(jié)合，做成象半抗原-蛋白質(zhì)那樣免疫原性綴合物，使用該綴合物可以用于設(shè)計能夠只與特定序列反應(yīng)(或能夠只識別特定序列)的單克隆抗體。在被設(shè)計的多肽中可預(yù)先附加半胱氨酸殘基等，可以很容易地制備免疫原性綴合物。當(dāng)與載體蛋白質(zhì)類結(jié)合時，載體蛋白質(zhì)類首先能夠被活化。例如，當(dāng)進行這樣的活化時，導(dǎo)入活化結(jié)合基。
作為活化結(jié)合基，例如(1)活化酯或活化羧基、例如硝基苯酯基、五氟苯酯基、1-苯并三唑酯基、N-琥珀酰亞胺酯基等、(2)活化二硫基、例如2-吡啶二硫基等。作為載體蛋白質(zhì)類，如眼孔蝛屬血籃蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白、球蛋白、聚賴氨酸等多肽、細菌菌體成分、例如BCG等。
(2)用免疫原性抗原免疫動物象如下那樣實施。免疫抗原通過同行都知道的方法進行，例如根據(jù)村松繁、他編、實驗生物學(xué)講座14、免疫生物學(xué)、丸善株式會社、昭和60年、日本生化學(xué)會編、續(xù)生化學(xué)實驗講座5、免疫生化學(xué)研究法、東京化學(xué)同人、1986年、日本生化學(xué)會編、新生化學(xué)實驗講座12、分子免疫學(xué)III、抗原·抗體·補體、東京化學(xué)同人、1992年等所述的方法進行。將免疫化劑(根據(jù)需要可以與佐劑一起)通過一次或一次以上的次數(shù)給哺乳動物注射進行免疫化。代表性作法是通過將該免疫化劑和/或佐劑對哺乳動物進行多次皮下注射或腹腔內(nèi)注射。免疫化劑如含有上述抗原或其相關(guān)肽片段的制劑。免疫化劑也可以使用使它與在進行免疫處理的哺乳動物中可作為免疫原性的已知蛋白質(zhì)(例如上述載體蛋白質(zhì)類)形成綴合物后使用。作為佐劑，例如付氏完全佐劑、Ribi佐劑、百日咳疫苗、BCG、脂質(zhì)A、脂質(zhì)體、氫氧化鋁、二氧化硅佐劑等。免疫可以使用例如BALB/c等小鼠、土拔鼠、以及其它適當(dāng)?shù)膭游镞M行。抗原的給于量，例如對于小鼠約1～400μg/動物，一般向宿主動物的腹腔內(nèi)或皮下注射，以后每隔1～4周，優(yōu)選每隔1～2周向腹腔內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)反復(fù)進行2～10次追加免疫。作為免疫用的小鼠除了BALB/c類小鼠之外，也可以使用BALB/c類小鼠與其他系小鼠的F1小鼠等。根據(jù)需要，制備抗體測定系，測定抗體效價后，可以確認(rèn)動物免疫的程度。本發(fā)明的抗體可以是從這樣免疫的動物得到的抗體，例如包含抗血清、多克隆抗體等。
(3)骨髓瘤細胞的制備如下實施。作為細胞融合使用的可無限增殖的細胞株(腫瘤細胞株)，可以從不產(chǎn)生免疫球蛋白的細胞株選擇，例如可以使用P3-NS-1-Ag4-1(NS-1，Eur.J.Immunol.，6511-519，1976)、SP-2/0-Ag14(SP-2，Nature，276269～270，1978)、來自小鼠骨髓瘤MOPC-21細胞株的P3-X63-Ag8-U1(P3U1，Curr.topics Microbiol.Immunol.，811-7，1978)、P3-X63-Ag8(X63，Nature，256495～497，1975)、P3-X63-Ag8-653(653，J.Immunol.，1231548～1550，1979)等。8-氮雜鳥嘌呤抗性的小鼠骨髓瘤細胞株在Dulbecco′s MEM培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基)、RPMI-1640培養(yǎng)基等細胞培養(yǎng)基中加例如青霉素、丁胺卡那霉素等抗生素、胎牛血清(FCS)等，再加8-氮雜鳥嘌呤(例如5～45μg/ml)的培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，在細胞融合的前2～5日用正常培養(yǎng)基進行繼代，準(zhǔn)備所需要數(shù)的細胞株。另外，使用的細胞株也可以將冷凍保存的細胞株于約37℃完全解凍后，用RPMI-1640培養(yǎng)基等正常培養(yǎng)基清洗3次以上后，用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，準(zhǔn)備所需數(shù)的細胞株。
(4)產(chǎn)生抗體細胞與骨髓瘤細胞的細胞融合可以象如下那樣實施。按照上述(2)的工序被免疫的動物、例如小鼠在最終免疫后2～5日后，摘出他的脾臟，從脾臟中獲得脾細胞懸浮液。除了脾細胞之外，還可以得到活體各個地方的淋巴節(jié)細胞，在細胞融合時可以使用。更具體來說，細胞融合，例如在細胞融合促進劑存在下，于通常的營養(yǎng)培養(yǎng)液中進行。作為上述細胞融合中使用的培養(yǎng)液，可以使用例如適合上述骨髓瘤細胞株的增殖的RPMI1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液以及該種細胞培養(yǎng)中使用的通常培養(yǎng)液，另外也可以并用胎牛血清(FCS)等血清補液。這樣一來，將如此得到的脾細胞懸浮液和在上述(3)工序中得到的骨髓瘤細胞株置于例如最小必需培養(yǎng)基(MEM培養(yǎng)基)、DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基等細胞培養(yǎng)基中，添加細胞融合促進劑、例如聚乙二醇(PEG)。作為細胞融合促進劑，可以使用其它各種該領(lǐng)域中已知的促進劑，作為這樣的促進劑如非活化的仙臺病毒(HVJHemagglutinating virus of Japan)等。最好是加例如30～60％的聚乙二醇0.5～2ml，可以使用分子量為1,000～8,000的聚乙二醇，更優(yōu)選使用分子量為1,000～4,000的聚乙二醇。融合培養(yǎng)基中的聚乙二醇的濃度最好配成例如30～60％。根據(jù)需要，例如加少量二甲基亞砜等輔助劑，也可以提高融合效率。免疫細胞和骨髓瘤細胞的使用比例，即融合中使用的脾細胞(淋巴細胞)骨髓瘤細胞株的比例可以任意設(shè)定，例如設(shè)定為1∶1～20∶1，更優(yōu)選4∶1～10∶1設(shè)定。
細胞融合將免疫細胞與骨髓瘤細胞的所定量于培養(yǎng)液中充分混合，按照通常的30～60％(w/v)的濃度添加預(yù)先加溫到37℃程度的PEG溶液(例如平均分子量1000-6000程度)，通過混合，形成目的融合細胞(雜交瘤)。然后，通過重復(fù)進行逐次添加適當(dāng)培養(yǎng)液，離心除去上清的操作，除去對雜交瘤的生育不利的細胞融合劑。
進行1～10分鐘融合反應(yīng)，融合加RPMI-1640培養(yǎng)基等細胞培養(yǎng)基。融合反應(yīng)處理也可以進行多次。融合反應(yīng)處理后，通過離心等分離細胞后移至選擇用培養(yǎng)基。
(5)雜交瘤(融合細胞)的選擇以及單克隆化象如下那樣實施。作為選擇用培養(yǎng)基，如通常的選擇培養(yǎng)基，例如含有次黃嘌呤、氨基蝶呤以及胸腺嘧啶的含有FCS的MEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基等培養(yǎng)基，所謂HAT培養(yǎng)基。在上述HAT培養(yǎng)液中培養(yǎng)時，為了消滅除雜交瘤以外的細胞(非融合細胞)，要繼續(xù)充分時間(通常數(shù)日～數(shù)周)。選擇培養(yǎng)基交換方法一般是第二天加與分注到培養(yǎng)皿的容量等容量的量，其后每隔1～3日，按照用HAT培養(yǎng)基交換一半量那樣進行處理，也可以適當(dāng)?shù)剡M行變更。在融合后8～16日，除去氨基蝶呤用所謂HT培養(yǎng)基每隔1～4日進行培養(yǎng)基交換。作為飼養(yǎng)細胞也可以使用例如小鼠胸腺細胞，那樣更優(yōu)選。
將雜交瘤增殖旺盛的培養(yǎng)孔的培養(yǎng)上清用例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(ELISA)、熒光免疫分析(FIA)、發(fā)光免疫分析(LIA)、Western blotting等測定系，或熒光激活細胞分選儀(FACS)等，使用所定的片段肽作為抗原，或使用標(biāo)記抗小鼠抗體測定目的抗體等，進行篩選。對產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤進行篩選。克隆于瓊脂培養(yǎng)基中對菌落進行收集，或通過有限稀釋法可以完成。用有限稀釋法進行更理想。克隆最好進行多次。這樣制作的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤在通常的培養(yǎng)液中可進行繼代培養(yǎng)，另外也可以在液氮中長期保存。
(6)單克隆抗體的制造如下實施。為了從該雜交瘤獲得單克隆抗體，可以采用按照通常的方法對該雜交瘤進行培養(yǎng)，獲得其培養(yǎng)上清的方法、或?qū)㈦s交瘤注入到與該雜交瘤適合的哺乳動物后，使其增殖，獲得其腹水的方法等。前者的方法適于獲得高純度的抗體，而后者的方法適于抗體的大量生產(chǎn)。
這樣一來，得到的雜交瘤株于含有FCS的MEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基等適當(dāng)?shù)脑鲋秤门囵B(yǎng)基中進行培養(yǎng)，從該培養(yǎng)基上清可以獲得所期望的單克隆抗體。為了獲得大量的抗體，如使雜交瘤腹水化。此時，將各雜交瘤移植到與來自雜交瘤細胞的動物同系的組織適合性動物的腹腔內(nèi)，可以使其增殖、或回收產(chǎn)生在該動物的腹水中的單克隆抗體。動物在雜交瘤移植之前，也可以預(yù)先向腹腔內(nèi)注入姥鮫烷(2，6，10，14-四甲基十五烷)等礦物油，進行該處理后，使雜交瘤增殖，採取腹水。腹水也可以直接使用，或通過以往眾所周知的方法、例如硫酸銨沉淀法等鹽析、通過交聯(lián)葡聚糖等凝膠過濾法、離子交換層析法、電泳法、透析、超濾法、親和層析法、高效液相層析法等進行純化，作為單克隆抗體使用。優(yōu)選是將含有單克隆抗體的腹水經(jīng)硫銨分級后，通過如DEAE-瓊脂糖那樣的陰離子交換凝膠和蛋白A柱那樣的親和柱等處理，可以純化分離處理。固定了抗原或抗原片段(例如合成肽、重組抗原蛋白質(zhì)或肽、抗體特異識別的部位等)的親和層析、固定了蛋白A的親和層析、羥磷灰石層析等更優(yōu)選。
另外，轉(zhuǎn)基因小鼠或其他生物，例如其他哺乳動物可以用于表達針對本發(fā)明的免疫原多肽產(chǎn)物的人源化抗體等的抗體。
而決定這樣大量獲得的抗體的序列，利用編碼從雜交瘤株編碼得到的抗體的核酸序列，通過基因重組技術(shù)也可以制作抗體。編碼該單克隆抗體的核酸，例如可以通過使用能夠與編碼小鼠抗體重鏈或輕鏈的基因特異結(jié)合的寡核苷酸探針等的慣用手法進行分離，進行序列決定。一旦分離的DNA插入表達載體，可以進入CHO、COS等宿主細胞。該DNA會取代例如同源的小鼠的序列，置換為編碼人的重鏈或輕鏈的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的序列等， 可以進行修飾(Morrison etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816581，1984)。這樣一來，也可以制備具有所期望的結(jié)合特異性的嵌合抗體或雜化抗體。另外，抗體可以運用包括使用下面那樣的縮合劑的化學(xué)的蛋白質(zhì)合成技術(shù)，也可以進行制備嵌合抗體或雜化抗體等的修飾。
人源化抗體可以通過該領(lǐng)域已知的技術(shù)進行(例如，Jones etal.，Nature，321pp.522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332pp.323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science，239pp.1534-1536(1988))。人單克隆抗體也可以通過該領(lǐng)域已知的技術(shù)進行，用于生產(chǎn)人單克隆抗體的人骨髓瘤細胞或人·小鼠異骨髓瘤細胞在該領(lǐng)域是已知的(Kozbor，J.Immunol.，133，pp.3001(1984)；Brodeur etal.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.New York(1987))。制造bispecific抗體的方法在該領(lǐng)域中也已知(Millstein et al.，Nature，305pp.537-539(1983)；WO93/08829；Traunecker et al.，EMBO J.，10pp.3655-3659(1991)；Suresh et al.，“Methods in Enzymology”，Vol.121，pp.210(1986))。
另外，用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等酶對這些抗體進行處理，可以變成由于處理狀況不同被還原后得到Fab、Fab’、F(ab’)2的抗體片段后使用。
作為代表性的抗半乳凝素9抗體，如與L、M和S型半乳凝素9都結(jié)合的抗體，與L以及M型半乳凝素9雙方都結(jié)合，而與S型半乳凝素9不反應(yīng)的抗體，與L型半乳凝素9雙方都結(jié)合，而與M和S型半乳凝素9不反應(yīng)的抗體，分別對L、M和S型半乳凝素9特異的抗體，對半乳凝素9的C-末端側(cè)CRD或其片段肽特異的抗體，對半乳凝素9的N-末端側(cè)CRD或其片段肽特異的抗體，對各連接肽或其片段肽特異的抗體等。
抗體可以在已知的任意測定法、例如競爭性結(jié)合測定、直接和間接夾心測定、以及免疫沉淀測定中使用(Zola，MonoclonalAntibodiesA Manual of Techniques，pp.147-158(CRC Press，Inc.，1987))。
在對可檢測抗體的原子基團分別進行綴合時，可以使用該領(lǐng)域中已知的任意方法，例如David et al.，Biochemistry，13卷，1014-1021頁(1974)；Pain et al，J.Immunol.Meth.，40pp.219-231(1981)；以及“Methods in Enzymology”；Vol.184，pp.138-163(1990)所述的方法。作為帶有標(biāo)記物的抗體，可以使用IgG級分、以及胃蛋白酶消化后還原得到的特異結(jié)合部Fab’。作為這些場合的標(biāo)記物的例子，有如下所述那樣的酶(過氧化物酶、堿性磷酸酶或β-D-半乳糖苷酶等)、化學(xué)物質(zhì)、熒光物質(zhì)和放射性同位素等。
在本發(fā)明中的檢測·測定可以通過免疫染色、例如組織或細胞染色、免疫電子顯微鏡、免疫分析、例如競爭性免疫分析或非競爭性免疫分析進行，可以使用放射免疫測定法(RIA)、FIA、LIA、EIA、ELISA等，也可以進行或不進行B-F分離，進行其測定。優(yōu)選RIA、EIA、FIA、LIA，以及夾心型分析。例如在夾心型分析中，以其中一方作為針對本發(fā)明的L型半乳凝素9多肽的抗體或針對L型半乳凝素9的相關(guān)肽片段的抗體，另一方為半乳凝素9的C末端側(cè)殘基的抗體，而且將一方進行可檢測標(biāo)記化(不言而喻，其它組合也可以，根據(jù)目的可以適當(dāng)設(shè)計)。將可識別同樣抗原的其它抗體固定于固相上。根據(jù)需要為了使檢體和標(biāo)記化抗體以及固相化抗體依次反應(yīng)，進行溫育處理，然后分離非結(jié)合抗體后，測定標(biāo)記物。被測定的標(biāo)記的量與抗原、即半乳凝素9多肽抗原的量成比例。在該分析中，按照不溶化抗體和標(biāo)記化抗體的添加順序，稱為同時夾心型分析、正向(forward)夾心型分析或反向夾心型分析等。例如清洗、攪拌、振蕩、過濾或抗原的預(yù)備提取等在特定的狀況的基礎(chǔ)下，于它們測定工序中適當(dāng)采用。特定的試劑、緩沖液等濃度、溫度或溫育處理時間等其它測定條件可以根據(jù)檢體中抗原的濃度、檢體樣品的性質(zhì)等要素改變。同行人使用通常的實驗法對于各個測定適當(dāng)選擇有效的最適條件進行測定。
已知有很多能夠?qū)⒖乖蚩贵w固相化的載體，在本發(fā)明中，可以從其中適當(dāng)選擇使用。作為載體，已知有各種在抗原抗體反應(yīng)等中使用的載體，在本發(fā)明中，不用說，可以從這些眾所周知的載體中選擇使用。作為特別合適使用的載體，例如玻璃、例如氨基烷基硅玻璃等活化玻璃、多孔質(zhì)玻璃、硅膠、二氧化硅氧化鋁、氧化鋁、磁化鐵、磁化合金等無機材料、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙稀、聚偏氟乙烯、聚乙烯、聚醋酸乙烯酯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚丙烯酰胺、交聯(lián)聚丙烯酰胺、苯乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物、聚縮水甘油基甲基丙烯酸酯、丙烯醛-乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物等、交聯(lián)白蛋白、膠原、明膠、葡聚糖、瓊脂糖、交聯(lián)瓊脂糖、纖維素、微結(jié)晶纖維素、羧甲基纖維素、纖維素醋酸酯等天然或變性纖維素、交聯(lián)葡聚糖、尼龍等聚酰胺、聚氨酯、聚環(huán)氧樹脂等有機高分子物質(zhì)、以及將它們?nèi)榛酆系玫降奈镔|(zhì)、硅橡膠等、細胞、紅血球等，根據(jù)需要通過有機硅烷偶合劑等導(dǎo)入官能團后的物質(zhì)。
另外，濾紙、珠、管、比色杯、試驗容器的內(nèi)壁、例如試管、滴定板、滴孔、微量板、玻璃室、合成樹脂制室等由合成材料構(gòu)成的室、玻璃棒、由合成材料構(gòu)成的棒、末端變粗的或變細的棒、末端帶有圓的突起或帶有偏平突起的棒、成薄板狀的棒等固體物質(zhì)(物體)的表面等。
可以使抗體結(jié)合于那些載體，優(yōu)選是可以使對在本發(fā)明中得到的抗原特異反應(yīng)的抗半乳凝素9抗體(包括抗血清或純化抗體)或抗半乳凝素9單克隆抗體結(jié)合。載體與參與這些抗原抗體反應(yīng)的抗體之間的結(jié)合可以通過使用吸附等物理手法、或使用縮合劑等，或使用被活化的物質(zhì)等化學(xué)方法、以及利用相互的化學(xué)結(jié)合反應(yīng)的手法等進行。作為標(biāo)記，如酶、酶底物、酶抑制劑、補充分子類、輔酶、酶前體、脫輔基酶、熒光物質(zhì)、色素物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光化合物、發(fā)光物質(zhì)、發(fā)色物質(zhì)、磁物質(zhì)、金屬粒子、例如金膠體等、非金屬粒子、例如硒膠體等、放射性物質(zhì)等。作為酶，如脫氫酶、還原酶、氧化酶等氧化還原酶、例如催化氨基、羧基、甲基、?；⒘姿峄绒D(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移酶、例如水解酯鍵、糖苷鍵、醚鍵、肽鍵等的水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、連接酶等。酶也可以聯(lián)合使用多個酶用于檢測。例如，也可以利用酶的循環(huán)。作為代表性的放射性物質(zhì)的標(biāo)記用同位素，如[32P]、[125I]、[131I]、[3H]、[14C]、[35S]等。作為代表性酶標(biāo)記，如西洋辣根過氧化物酶等過氧化物酶、大腸桿菌β-D-半乳糖苷酶等半乳糖苷、馬來酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、乙酰膽堿酯酶、過氧化氫酶、牛小腸堿性磷酸酶、大腸桿菌堿性磷酸酶等堿性磷酸酶等。使用堿性磷酸酶時，通過使用4-甲基umbellipheryl磷酸鹽等傘形酮衍生物、硝基苯磷酸酯等磷酸化苯酚衍生物、利用NADP的酶循環(huán)系、蟲熒光素衍生物、二氧雜環(huán)丁烷(dioxetane)衍生物等底物，通過產(chǎn)生的熒光、發(fā)光等可以測定。也可以利用蟲熒光素、蟲熒光素酶系。使用過氧化氫酶時，由于與過氧化氫反應(yīng)生成氧，所有該氧氣可以通過電極等檢測。作為電極可以是玻璃電極、使用難溶性鹽膜的離子電極、液膜型電極、高分子膜電極等。
酶標(biāo)記也可以置換為生物素標(biāo)記和酶標(biāo)記抗生物素蛋白(鏈抗生物素蛋白)。這樣一來，可以使用生物素-抗生物素蛋白系，可以適當(dāng)采用使用針對抗半乳凝素抗體的抗體等二次抗體等在該領(lǐng)域眾所周知的靈敏度增強法。標(biāo)記也可以使用多個不同種類的標(biāo)記。此時，連續(xù)或非連續(xù)地、同時或分別地進行多個測定也成為可能。
在本發(fā)明中，在信號的形成中也可以利用4-羥基苯乙酸、鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、5-氨基水楊酸、3，3-二氨基聯(lián)苯胺四氫氯化物(DAB)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、對羥基苯乙胺、氨基苯二酰肼、光澤精熒光素及其衍生物、Pholad luciferin等和西洋辣根過氧化物酶等的過氧化物酶、lumigen PPD、4-甲基umbelliferyl磷酸鹽、p-硝基苯酚-磷酸、苯酚-磷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)、AMPAKTM(DAKO)、AmpliQTM(DAKO)、等和堿性磷酸酶、稱為4-甲基umbelliferyl-β-D-半乳糖苷的umbelliferyl半乳糖苷、稱為o-硝基苯酚-β-D-半乳糖苷的硝苯半乳糖苷等和β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、ABTS等和葡萄糖氧化酶等酶試劑的組合，也可以利用通過酶等的作用可以形成對氫醌、羥基苯醌、羥基蒽醌等醌化合物、硫辛酸、谷胱甘肽等巰基化合物、酚衍生物、二茂(絡(luò))鐵衍生物等產(chǎn)物。
作為熒光物質(zhì)和化學(xué)發(fā)光化合物，如異硫氰酸酯熒光素(FITC)、例如羅丹明B異硫氰酸酯、四甲基羅丹明異硫氰酸酯(RITC)、四甲基羅丹明異硫氰酸酯同分異構(gòu)體(TRITC)等羅丹明衍生物、7-氨基-4-香豆素-3-乙酸、丹黃酰氯、丹黃酰氟、熒光胺、藻膽色素蛋白質(zhì)、吖啶鎓鹽、熒光素、熒光素酶、aequorin等氨基苯二酰肼、咪唑、草酸酯、稀土類螯合化合物、香豆素衍生物等。為了檢測包括發(fā)色、熒光等生成的信號等，雖然可以通過視覺，但也可以使用眾所周知的儀器，例如熒光光度計、板讀出儀等。另外為了檢測放射性同位素(同位素)等發(fā)出的信號，可以使用眾所周知的儀器，例如可以使用γ計數(shù)器、閃爍掃描計數(shù)器等。
為了進行標(biāo)記，可以利用巰基和馬來酰亞胺基的反應(yīng)、吡啶二硫化物基團和巰基的反應(yīng)、氨基和醛基的反應(yīng)等進行，可以從眾所周知的方法或該領(lǐng)域同行容易進行的方法、研究對這些方法進行修飾的方法中選擇適用的。另外，可以使用在上述免疫原性復(fù)合物制作中可以使用的縮合劑、與載體的結(jié)合中可以使用的縮合劑等。作為縮合劑，例如甲醛、戊二醛、六亞甲基二異氰酸酯、六亞甲基二異硫氰酸酯、N，N’-聚亞甲基二碘乙酰胺、N，N’-亞甲基二馬來酰亞胺、乙二醇二琥珀酰亞胺基琥珀酸酯、雙二氮聯(lián)苯胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺、N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亞胺4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC)、N-硫代琥珀酰亞胺4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯、N-硫代琥珀酰亞胺(4-碘乙酰)氨基苯甲酸酯、N-琥珀酰亞胺4-(1-馬來酰亞胺苯基)丁酯、N-(ε-馬來酰亞胺己酰氧)琥珀酰亞胺(EMCS)、iminothiolane、S-乙酰巰基琥珀酸酐、甲基-3-(4′-二硫吡啶基)丙酸亞氨酸酯、甲基-4-巰基丁基亞氨酸酯、甲基-3-巰基丙酸亞氨酸酯、N-琥珀酰亞胺基-S-乙酰巰基乙酸酯等。
根據(jù)本發(fā)明的測定法，使用酶等標(biāo)記的抗血清、純化抗體或單克隆抗體等標(biāo)記抗體試劑與載體結(jié)合的抗體依次與要測定的物質(zhì)反應(yīng)，也可以同時反應(yīng)。加試劑的順序因選擇的載體類型不同而不同。使用被致敏的塑料等珠時，可以將標(biāo)記的抗血清、純化抗體或單克隆抗體等標(biāo)記抗體試劑與含有要測定物質(zhì)的檢體樣品一起最初加入到適當(dāng)?shù)脑嚬苤?，然后通過加該被致敏的塑料等珠，進行測定。
在本發(fā)明的測定法中，可以使用免疫學(xué)測定法，此時作為固相載體，可以任意選擇對抗體等吸附好的聚苯乙烯制、聚碳酸酯制、聚丙烯制或聚乙烯制的球、微滴板、棒、微粒子或試管等各種材料和形態(tài)使用。
在測定時，可以在最適pH、例如pH維持在約4～約9那樣適當(dāng)?shù)木彌_液中進行。作為特別適合的緩沖劑，例如乙酸鹽緩沖劑、檸檬酸鹽緩沖劑、磷酸緩沖劑、Tris緩沖劑、三乙醇胺緩沖劑、硼酸緩沖劑、甘氨酸緩沖劑、碳酸鹽緩沖劑、Tris-HCl緩沖劑、巴比妥緩沖劑等。緩沖劑可以以任何比例混合后使用?？乖贵w反應(yīng)最好是在約0℃～約60℃之間的溫度下進行。
雖然用酶等標(biāo)記的抗血清、純化抗體、或單克隆抗體等抗體試劑研究與載體結(jié)合的抗體試劑、以及要測定的物質(zhì)的溫育處理可以一直進行到平衡，但在抗原抗體反應(yīng)的平衡達到之前稍早一點的時刻，對固相和液相進行分離，在有限定的溫育處理之后可以停止反應(yīng)，可以測定液相或固相中任一個中的酶等的標(biāo)記的存在程度。測定操作可以使用自動化的測定儀器進行，使用發(fā)光檢測器、光檢測器等，檢測底物經(jīng)酶作用被變換生成的表示信號，也可以測定。在抗原抗體反應(yīng)中，謀求可以使分別使用的試劑、要測定的物質(zhì)、以及酶等的標(biāo)記穩(wěn)定化、使抗原抗體反應(yīng)本身穩(wěn)定那樣的適當(dāng)手段。另外，為了除去非特異性反應(yīng)、將起抑制作用的影響減少，或使測定反應(yīng)活化，也可以將蛋白質(zhì)、穩(wěn)定化劑、下面敘述的那樣的表面活性劑、螯合劑等加到溫育溶液中。作為螯合劑，更優(yōu)選乙二胺四乙酸鹽(EDTA)。也可以實施在該領(lǐng)域中普通采用的或同行都知道的防止非特異結(jié)合反應(yīng)的封閉處理，例如可以用哺乳動物等的正常血清或血清蛋白質(zhì)、白蛋白、血紅蛋白、卵清清蛋白(OVA)、脫脂奶、乳發(fā)酵物質(zhì)、膠原、明膠等進行處理。只要是防止非特異結(jié)合反應(yīng)的目的，可以沒有特別限定地使用那些方法。另外，在樣品或固相等的清洗中，從上述緩沖液系或食鹽液選擇適當(dāng)?shù)囊菏褂?，可以向其中添加從Tween20(商品名)、Tween80(商品名)、NP-40(商品名)、Triton X100(商品名)、Briji(商品名)等非離子表面活性劑、CHAPS等兩離子性表面活性劑以及陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑等選擇出來的物質(zhì)后使用。
作為用本發(fā)明的測定方法中被測定的樣品，可以使用所有形態(tài)的溶液或膠體溶液、非流體樣品等，優(yōu)選使用來自生物體的樣品，如胸腺、睪丸、腸、腎臟、腦、乳房組織、卵巢、子宮、前列腺、結(jié)腸和直腸、胃、肺、支氣管、胰贓癌、肝臟等所有的臟器以及組織、以及這些臟器·組織的惡性腫瘤、白血病組織、血液、血清、血漿、關(guān)節(jié)液、腦脊髓液、胰液、膽汁液、唾液、羊水、尿、其它體液、細胞培養(yǎng)液、組織培養(yǎng)液、組織勻漿液、活檢樣品、組織、細胞等。
當(dāng)將包括這些各個免疫學(xué)的測定法的各種分析·定量法運用于本發(fā)明的測定方法時，不需要特別的條件、操作等的設(shè)定。在各個方法中的通常條件、操作法中加上同行的通常技術(shù)的關(guān)照，可以構(gòu)建本發(fā)明的該對象物質(zhì)或具有與其實質(zhì)上同等活性的物質(zhì)的測定系。
作為半乳凝素9的測定系，例如對于組織可以有利利用免疫染色(METHODS，24，289-296(2001)；J Immunol Methods，47(2)，129-144(1981)；ibid.，150(1-2)，5-21，23-32 & 151-158(1992)；Cancer J；7(1)，24-31(2001)等)、免疫電子顯微鏡(MolBiotechnol，7(2)，145-151(1997)；J Electron Microsc Tech.，19(1)，57-63 & 64-79(1991)；ibid.，19(3)，305-315(1991)等蛋白質(zhì)測定系，稱為原位雜交的表達基因測定系，對于組織提取物可以有利利用EIA、RIA、FIA、LIA、and Western blotting(J ElectronMicrosc(Tokyo)，45(2)，119-127(1996)；Methods BiochemAnal.，33，1-58(1988)；Methods Enzymol.，271，177-203(1996)；ibid.，305，333-345(2000)；J Immunol Methods，152(2)，227-236(1992)；ibid.，170(2)，177-184(1994)；ibid.，195(1-2)，149-152(1996)；口野嘉幸他編、“基因·蛋白質(zhì)、實驗操作封閉法”、株式會社軟件科學(xué)公司、昭和62年10日發(fā)行等)的蛋白測定系、Northernblotting、dot bloting、RNase保護分析、RT-PCR(reversetranscription polymerase chain reaction)、Real-Time PCR(Clinical Chemistry，4611，1738-1743(2000)的表達基因測定系、而對于血中、體液等，可以有利利用EIA、RIA、FIA、LIA、and Westernblotting蛋白測定系。另外，作為抗半乳凝素9抗體的測定系，例如對于血中、體液等可以有利利用EIA、RIA、FIA、LIA、Western blotting蛋白測定系。
在EIA的測定系中，例如在競爭法中使用抗半乳凝素9結(jié)合分子抗體作為固相化抗體使用，也可以使用標(biāo)記抗原和非標(biāo)記抗原(作為抗原如半乳凝素9或其結(jié)合分子和其片段肽等)，而在非競爭法中，例如在夾心法中，除了可以利用固相化抗半乳凝素9抗體或標(biāo)記抗半乳凝素9抗體外，也可以利用對抗半乳凝素9抗體直接進行標(biāo)記；也可以不固相化，對針對抗半乳凝素9抗體的抗體進行標(biāo)記進行固相化后進行。作為靈敏度擴增法，例如在與非酶標(biāo)記一次抗體的組合中，利用與高分子聚合物和酶和一次抗體的組合(應(yīng)用Envision試劑的組合，Enhanced Polymer One-Step Staining(EPOS))，在與非酶標(biāo)記二次抗體的組合中，例如PAP(peroxidase-antiperoxidase)法等的酶和抗酶抗體復(fù)合物的組合，SABC(avidin-biotinylated peroxidasecomplex)法等的生物素標(biāo)記二次抗體與生物素標(biāo)記酶-抗生物素蛋白復(fù)合物體的組合、ABC(streptavidin-biotin complex)法、LSAB(labeled streptavidin-biotin)法等的生物素標(biāo)記二次抗體與生物素標(biāo)記酶-鏈抗生物素蛋白復(fù)合物的組合、CSA(catalyzed signalamplification)法等的SABC與生物素標(biāo)記tyramide和酶標(biāo)記鏈抗生物素蛋白的組合、用高分子聚合物對二次抗體和酶進行標(biāo)記等。
有關(guān)這些一般技術(shù)手段的詳細記載可以參照綜述、出版的書等[例如，入江寬編，“放射免疫分析”，講談社，昭和49年發(fā)行；入江寬編，“續(xù)放射免疫分析”，講談社，昭和54年發(fā)行；石川榮治等編，“酶免疫測定法”，醫(yī)學(xué)書院，昭和53年發(fā)行；石川榮治等編，“酶免疫測定法”(第2版)，醫(yī)學(xué)書院，昭和57年發(fā)行；石川榮治等編，“酶免疫測定法”(第3版)，醫(yī)學(xué)書院，昭和62年發(fā)行；H.V.Vunakiset al.(ed.)，“Methods in Enzymology”，Vol.70(ImmunochemicalTechniques，Part A)，Academic Press，New York(1980)；J.J.Langoneet al.(ed.)，“Methods in Enzymology”，Vol.73(ImmunochemicalTechniques，Part B)，Academic Press，New York(1981)；J.J.Langoneet al.(ed.)，“Methods in Enzymology”，Vol.74(ImmunochemicalTechniques，Part C)，Academic Press，New York(1981)；J.J.Langoneet al.(ed.)，“Methods in Enzymology”，Vol.84(ImmunochemicalTechniques，Part DSelected Immunoassays)，Academic Press，NewYork(1982)；J.J.Langone et al.(ed.)，“Methods in Enzymology”，Vol.92(Immunochemical Techniques，Part EMonoclonal Antibodiesand General Immunoassay Methods)，Academic Press，New York(1983)；J.J.Langone et al.(ed.)，“Methods in Enzymology”，Vol.121(Immunochemical Techniques，Part IHybridoma Technology andMonoclonal Antibodies)，Academic Press，New York(1986)；J.J.Langone et al.(ed.)，“Methods in Enzymology”，Vol.178(Antibodies，Antigens，and Molecular Mimicry)，AcademicPress，New York(1989)；M.Wilchek et al.(ed.)，“Methods inEnzymology”，Vol.184(Avidin-Biotin Technology)，AcademicPress，New York(1990)；J.J.Langone et al.(ed.)，“Methods inEnzymology”，Vol.203(Molecular Design and ModelingConceptsand Applications，Part BAntibodies and Antigens，NucleicAcids，Polysaccharides，and Drugs)，Academic Press，NewYork(1991)等所述的方法或其中引用的文獻(其中的某些記載由于參照它們也包括在本說明書的內(nèi)容中)。
當(dāng)將本發(fā)明的活性成分[例如(a)該半乳凝素9多肽、其一部分肽或它們的鹽、與其相關(guān)的肽等、(b)編碼該半乳凝素9或相關(guān)多肽的DNA等核酸等、(c)本發(fā)明的所定抗體、其一部分片段(包括單克隆抗體)或其衍生物、(d)控制該半乳凝素9蛋白質(zhì)的問題活性的化合物(該半乳凝素9蛋白質(zhì)的毒害細胞活性、凋亡誘導(dǎo)活性、對正常細胞沒有壞的影響，促進或抑制·阻礙起著所定功效的活性等的現(xiàn)象、或促進或抑制·阻礙組織或蛋白質(zhì)的變質(zhì)·過剩生產(chǎn)或分解現(xiàn)象這些生物學(xué)活性的化合物)或其鹽、(e)使用本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的活性物質(zhì)等]作為醫(yī)藥使用時，通?？梢詥为毣蚺c藥理上容許的各種制劑輔助劑混合后，作為醫(yī)藥組合物或醫(yī)藥制備物等給予。優(yōu)選是以適合經(jīng)口給藥、局部給藥、或非經(jīng)口給藥等使用的制劑制備物的形態(tài)給藥，根據(jù)目的也可以通過任一種給藥方式(也包括吸入法、或直腸給藥)給藥。
另外，本發(fā)明的活性成分也可以配合各種醫(yī)藥、例如抗腫瘤劑(抗癌劑)、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑、血栓形成抑制劑、關(guān)節(jié)破壞治療劑、鎮(zhèn)痛劑、消炎劑和/或免疫抑制劑使用，這些制劑只要是具有有利的作用可以無限制地使用，例如可以從該領(lǐng)域中已知的制劑中選擇。
而作為非經(jīng)口給藥方式，可以包括局部、經(jīng)皮、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或腹腔內(nèi)給藥，也可以直接向患部給藥，對于某些場合也適合。優(yōu)選的是向包括人在內(nèi)的哺乳動物經(jīng)口、或非經(jīng)口(例如，細胞內(nèi)、組織內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、腹腔內(nèi)、胸腔內(nèi)、脊髓腔內(nèi)、點滴法、注腸、經(jīng)直腸、點耳、點眼或點鼻、齒、向皮膚或粘膜涂布等)給藥。作為具體的制劑制備物的形態(tài)，如溶液制劑、分散制劑、半固形制劑、粉粒體制劑、成型制劑、浸出制劑等，例如片劑、包被片劑、實施了糖衣的制劑、丸劑、口含片、硬膠囊劑、軟膠囊劑、微膠囊劑、埋入劑、粉末劑、散劑、顆粒劑、細粒劑、注射劑、液劑、酏劑、乳劑、灌注劑、糖漿、水劑、乳劑、懸濁劑、擦劑、洗劑、氣霧劑、噴霧劑、吸入劑、噴霧劑、軟膏制劑、硬膏制劑、貼附劑、糊劑(paste)、糊劑(cata plasm)、膏劑、油劑、坐劑(例如直腸坐劑)、酊劑、皮膚用水劑、點眼劑、點鼻劑、點耳劑、涂布劑、輸液劑、用于注射用液劑等的粉末劑、冷凍干燥制劑、凝膠制備品等。
醫(yī)藥用的組合物可以根據(jù)通常的方法進行制劑化。例如，根據(jù)適當(dāng)?shù)男枰?，可以單獨或組合使用生理學(xué)上認(rèn)可的載體、作為醫(yī)藥容許的載體、佐劑、賦形劑、輔形劑、稀釋劑、香味劑、香料、甜味劑、膨化劑(expander)、防腐劑、穩(wěn)定劑、結(jié)合劑、pH調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、表面活性劑、基劑、溶劑、填充劑、增量劑、溶解輔助劑、可溶化劑、等滲劑、乳化劑、懸濁化劑、分散劑、增粘劑、凝膠化劑、硬化劑、吸收劑、粘接劑、彈性劑、增塑劑、崩解劑、噴射劑、保存劑、抗氧化劑、遮光劑、保濕劑、緩和劑、防止帶電劑、無痛化劑等，通過將它們一起與本發(fā)明的蛋白質(zhì)等混合，可以制造成一般認(rèn)可的制劑實施中要求的單位用量形態(tài)。
作為非經(jīng)口使用的制劑，活性成分與水或其它的藥學(xué)上容許的介質(zhì)的無菌溶液、或懸濁液劑等、例如注射劑等。一般來說，水、鹽水、葡萄糖水溶液、其它相關(guān)的糖的溶液、乙醇、丙二醇、聚乙二醇等乙二醇類可作為優(yōu)選的注射劑用的液體載體。制備注射劑時，使用蒸餾水、林格液、生理鹽水那樣的載體、適當(dāng)?shù)姆稚┗驖窕瘎┖蛻覞峄旱?，用該領(lǐng)域已知的方法制備成對于像溶液、懸濁液、乳劑可以注射的形式。
作為注射用的水性液，如包括生理鹽水、葡萄糖或其它的輔助藥(例如，D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、氯化鈉等)等滲液等，也可以與藥理上容許的適當(dāng)溶解輔助劑、例如醇(例如乙醇等)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性表面活性劑(例如，聚山梨酯80TM，HCO-50等)等并用。作為油性液，如芝麻油、大豆油等，也可以與作為溶解輔助劑，如苯甲酸芐酯、芐醇等并用。也可以與緩沖劑(例如，磷酸鹽緩沖液、醋酸鈉緩沖液等)或用于浸透壓調(diào)節(jié)的試劑、無痛化劑(例如，氯芐烷銨、鹽酸普魯卡因等)、穩(wěn)定劑(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存劑(例如，芐醇、酚等)、抗壞血酸等抗氧化劑、吸收促進劑等配合。制備的注射液通常被填充到適當(dāng)?shù)陌碴称恐小?br> 對于非經(jīng)口給藥，可以加或不加表面活性劑以及其它藥學(xué)上容許的助劑，水、乙醇或油那樣的制備成無菌的藥學(xué)上容許的液體中的溶液或懸濁液形式的制劑。作為制劑中使用的油性載體或溶劑，如天然的、合成的或半合成的單、或雙、或三甘油酯類、天然的、合成的或半合成的油脂類或脂肪酸類，例如，花生油、玉米油、大豆油、芝麻油等植物油。例如，該注射劑可以通常制備成含有0.1～10重量％程度的本發(fā)明化合物。
作為適用于局部、例如口腔或直腸使用的制劑，例如洗口劑、磨齒劑、口腔噴霧劑、吸入劑、軟膏劑、牙科填充劑、牙科包被劑、牙科膏劑、坐劑等。作為洗口劑、其它牙科用劑，可以使用藥理上容許的載體，通過慣用的方法制備。作為口腔噴霧劑、吸入劑，使本發(fā)明化合物本身或與藥理上容許的非活性載體一起溶解于氣溶膠或噴霧器用的溶液，或做成吸入用微粉末給予牙齒等。軟膏劑，可以添加通常使用的基劑、例如軟膏基劑(白色凡士林、石蠟、橄欖油、聚乙二醇400、聚乙二醇軟膏等)等，通過慣用的方法制備。
向牙、皮膚局部涂布用的藥品可以在適當(dāng)滅菌的水或非水賦形劑的溶液或懸濁液中配制。作為添加劑，如亞硫酸氫鈉或乙二胺四乙酸二鈉那樣的緩沖劑；含有醋酸或硝酸苯汞、氯芐烷銨或雙氯苯雙胍己烷那樣的滅菌和抗真菌劑的防腐劑和羥丙甲纖維素那樣的增粘劑。
坐劑使用在該領(lǐng)域中眾所周知的載體、優(yōu)選是非刺激性的適當(dāng)?shù)妮o形劑、例如聚乙二醇類、羊毛脂、可可脂、脂肪酸甘油三酯等的，優(yōu)選是在常溫下雖然是固體，但在腸道的溫度下以液體，在直腸內(nèi)融解釋放藥物的載體等，通過慣用的方法制備，通?？梢灾苽涑珊?.1～95重量％程度的本發(fā)明化合物。通過使用的賦形劑和濃度不同的藥品可以懸浮于或溶解于賦形劑中。象局部麻醉劑、防腐劑以及緩沖劑那樣的輔助藥可以溶解于賦形劑中。
適于作為經(jīng)口使用的制劑，如片劑、丸劑、膠囊、粉末劑、顆粒劑、口含片(troche)那樣的固形組合物，或液劑、糖漿、懸濁劑那樣的液狀組合物等。進行制劑制備時，使用在該領(lǐng)域中已知的制劑輔助劑等。片劑和丸劑也可以包腸衣后制造。調(diào)劑單位形態(tài)為膠囊時，可以在上述類型的材料中再含有油脂那樣的液狀載體。
另外，活性成分為蛋白質(zhì)或多肽時，由于聚乙二醇(PEG)在哺乳動物中毒性極低，所有與它結(jié)合特別有用。而與PEG結(jié)合，有時可以有效地減少異種性化合物的免疫原性以及抗原性。該化合物也可以加入到微膠囊裝置中給予。象PEG那樣的聚合物可以簡單地附著于在氨基末端的氨基酸的α-氨基、賴氨酸側(cè)鏈的ε-氨基、天冬氨酸或谷氨酸的側(cè)鏈的羧基、羧基末端的氨基酸的α-羧基、或某種天冬酰胺、絲氨酸或蘇氨酸殘基的糖基鏈被活化的衍生物。
已知有很多適于與蛋白質(zhì)直接反應(yīng)的被活化形式的PEG。作為對于與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)有用的PEG試劑，羧酸、碳酸衍生物的活性酯、特別是解離基為N-羥基琥珀酰亞胺、p-硝基苯酚、咪唑、或1-羥基-2-硝基苯-4-磺酸酯的PEG。同樣，含有氨基肼或酰肼基的PEG在通過蛋白質(zhì)中的過碘化酸氧化生成的醛反應(yīng)中有用。
另外，本發(fā)明的DNA等核酸作為象上述那樣的治療或預(yù)防劑使用時，該核酸可以單獨使用，或用于與象上述那樣的基因重組技術(shù)中使用的適當(dāng)載體、例如來自逆病毒的載體等來自病毒的載體等結(jié)合等。本發(fā)明的DNA等核酸可以通過通常的已知的方法給予，直接，或為了促進向細胞內(nèi)的攝取，與適當(dāng)?shù)妮o助劑或生理上容許的載體等一起被制劑化后，象上述那樣可以做成醫(yī)藥組合物或醫(yī)藥制備物等給予。另外，也可以適用作為基因治療已知的方法。
本發(fā)明的活性成分可以在很寬的范圍選擇其給予量后給予，其給予量以及給予的次數(shù)等根據(jù)處置患者性別、年齡、體重、一般健康狀態(tài)、膳食、給予時間、給予方法、排泄速度、藥物的組合、患者當(dāng)時進行治療的病狀的程度，考慮這些因素以及其它要因后決定。
當(dāng)制造醫(yī)藥品時，其添加劑等或制備方法等可以參考例如日本藥局方解說書編輯委員會編、第十四改正日本藥局方解說書、平成13年6月27日發(fā)行、株式會社廣川書店；一番ケ瀨尚他編醫(yī)藥品的開發(fā)12卷(制劑材料[I])、平成2年10月15日發(fā)行、株式會社廣川書店；同、醫(yī)藥品的開發(fā)12卷(制劑材料[II])、平成2年10月28日發(fā)行、株式會社廣川書店等記載之后從其中根據(jù)需要適當(dāng)選擇運用。
本發(fā)明的活性成分如在本說明書中說明的(a)半乳凝素9及其類似物、(b)半乳凝素9以及編碼實質(zhì)上具有與其均等的生物活性的多肽的多核苷酸、(c)半乳凝素9產(chǎn)生以及釋放的誘導(dǎo)因子、(d)抗半乳凝素9受體抗體、以及(e)針對半乳凝素9結(jié)合性糖鏈的抗體等，它們在利用半乳凝素9對正常細胞沒有毒害作用，而對腫瘤細胞表現(xiàn)出毒害細胞活性的性狀、對腫瘤細胞誘導(dǎo)凋亡，而對正常細胞不誘導(dǎo)凋亡的性狀、抑制惡性細胞的轉(zhuǎn)移性的性狀、活化的免疫細胞、特別是誘導(dǎo)活化的CD4陽性T細胞的凋亡的活性(與此相反，不誘導(dǎo)靜止T細胞、特別是CD4陽性T細胞(協(xié)助者T細胞)的凋亡的性狀)等上是有用的，有望作為抗腫瘤劑、抗過敏劑、免疫抑制劑、自身免疫疾病用劑、抗炎癥劑以及利用與腎上腺皮質(zhì)類固醇激素同樣的活性的藥劑。

可以對與半乳凝素9發(fā)揮上述本說明書中公布的新的功能有關(guān)的半乳凝素9結(jié)合分子、特別是與凋亡有關(guān)的半乳凝素9結(jié)合蛋白質(zhì)進行探索·鑒定。作為探索對象沒有特別限定，可以使用來自各種生物的材料，代表性的可以將來自人T細胞株MOLT-4那樣的由于半乳凝素9添加誘導(dǎo)細胞死亡的細胞株選定為起始材料進行探索·鑒定，有時很理想。作為相互作用分子探索法，可以將該領(lǐng)域中已知的各種各樣方法單獨或組合后進行。例如，對于從候補蛋白質(zhì)鑒定與半乳凝素9進行相互作用的蛋白質(zhì)，例如，可以選擇以下方法運用。從已知進行相互作用的蛋白質(zhì)可以了解靶蛋白的新的功能以及調(diào)節(jié)機制、例如借助于半乳凝素9的功能與機制。
作為可利用的方法，如①免疫沉降法，②West Western法(包括West Western法，或far Western法、配體印跡法)，③分子間交聯(lián)法，④表達克隆法，⑤雙雜合(體)系統(tǒng)(two-hybrid system)，⑥噬菌體呈現(xiàn)法，⑦表面胞質(zhì)團共振法，⑧熒光偏光法等，并不限定于這些方法，可以運用在該領(lǐng)域中已知的方法以及其改變法。
所謂免疫沉降法，向作為樣品的各種各樣的蛋白質(zhì)溶液加對目的蛋白質(zhì)特異的抗體，對與目的蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)以免疫復(fù)合物的免疫沉降物分離，通過用SDS-PAGE或再通過Western blotting等進行鑒定的手法，研究可能與目的蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的存在是有效的。在此，除了可以使用捕獲目的蛋白質(zhì)特異的抗體或?qū)σ阎鞍踪|(zhì)特異的抗體、蛋白A或蛋白G瓊脂糖等抗體的樹脂等外，最好準(zhǔn)備用RI等標(biāo)記的蛋白質(zhì)溶液。也可以利用市售的試劑盒，例如，Affi-Prep 10，Affi-Gel Hz(BIO-RAD公司)，NHS Sepharose HP(Pharmacia公司)等。
作為測定對象蛋白質(zhì)，可以利用作為融合蛋白質(zhì)制作·純化的蛋白質(zhì)，此時，有效利用針對Tag的抗體很便利，作為重組蛋白質(zhì)，除了可以利用大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞等宿主表達系之外，也可以利用網(wǎng)狀紅細胞的無細胞翻譯系。另外，向蛋白質(zhì)溶液加過量的目的融合蛋白等，對融合蛋白進行簡便純化時也可以利用co-purification。這些方法可以參照例如Rudner，D.Z.etal.，Mol.Cell Biol.，116，1765-1773，1998(利用His-tag)，Cleveland，D.W.et al.，J.Mol.Biol.，116，207-225，1977(利用tau(microtubule-associated protein))等。
所謂West-Western法或far Western法是Western法的變法，是用標(biāo)記的目的蛋白質(zhì)等或已知的蛋白質(zhì)等的探針·蛋白質(zhì)代替抗體，通過嘗試與轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白質(zhì)的結(jié)合，進行檢測·測定的方法。是以目的蛋白質(zhì)作為探針，可以了解結(jié)合的蛋白質(zhì)的分布、區(qū)域、分子量等的手法。該方法在表達文庫的篩選應(yīng)用后，可以在cDNA克隆中利用(野村照明、他、“免疫’92”(利用蛋白質(zhì)探針的cDNA克隆)、中山書店、pp169-175(1992))。作為探針的蛋白質(zhì)是可以被蛋白激酶磷酸化標(biāo)記的蛋白質(zhì)，可以有效利用。所謂配體·印跡法是與配體結(jié)合的蛋白質(zhì)的解析手法，指Far Western法中的一種方法，是使用用RI標(biāo)記的配體，通過該RI進行檢測、使用生物素-配體，用鏈抗生物素蛋白再進行檢測，使用未標(biāo)記配體，使用特異抗體和標(biāo)記二次抗體進行檢測等手法。作為標(biāo)記，也可以利用非RI標(biāo)記。本法可以參照例如Soutar，A.K. & Wade，D.P.，Protein functiona practicalapproach(Creighton，T.E.eds.)，IRL press，pp55-76，1989等。
分子間交聯(lián)法是使用化學(xué)交聯(lián)劑，使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間交聯(lián)，用SDS-PAGE分離，并用Western blotting法或免疫沉降法，進行檢測的方法，是在目的蛋白質(zhì)的寡聚物結(jié)構(gòu)的解析或進行相互作用的蛋白質(zhì)或存在鄰近的蛋白質(zhì)(或結(jié)構(gòu)域)的解析以及受體等亞基結(jié)構(gòu)的解析中有效的手法?；瘜W(xué)交聯(lián)劑等信息可以參照PIERCB公司的網(wǎng)址(http//www.piercenet.com/)。本法可以參照例如Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press，1996等。
表達克隆法是使cDNA庫中的任意cDNA在細胞中表達，使用目的蛋白質(zhì)或帶有Tag的蛋白質(zhì)作為探針，從與相互作用被確認(rèn)的細胞有關(guān)連的使用的cDNA組克隆特定的cDNA的方法，是借助于受體、配體等的克隆進行解析的方法。對于表達克隆，可以利用利用大腸桿菌等的原核細胞的表達系、哺乳動物細胞等的培養(yǎng)細胞的表達系、非洲爪蟾卵細胞的表達系等、在該領(lǐng)域中已知的表達系。本法可以參照例如佐佐木博己編、“無敵的生物技術(shù)系列特別編·生物實驗進展”、第6章、羊土社、1997等。在用大腸桿菌的表達克隆中，可以用λgtl1，λZAPII等的cDNA文庫轉(zhuǎn)化大腸桿菌等，進行篩選，基本上使用Farwestern法進行克隆。另外在培養(yǎng)細胞中的表達克隆，使具有特定的cDNA的表達載體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)細胞，從確認(rèn)表達的細胞中挑選與目的蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)，通過克隆進行篩選。挑選雖然沒有特別限定，但適合使用ELISA法或FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting)法等。另外，也可以由特定的cDNA在體外合成mRNA，向非洲爪蟾卵微注射，利用表達的蛋白質(zhì)與目的蛋白質(zhì)相互作用或其結(jié)果引起的細胞的反應(yīng)，進行挑選、克隆。
雙雜合(體)系統(tǒng)是當(dāng)目的蛋白質(zhì)或其蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域部分與獨立的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域相互作用，利用為了使報告基因表達而構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄活性因子的功能恢復(fù)的現(xiàn)象，對相互作用的蛋白質(zhì)進行探索的手法的克隆系統(tǒng)。在本方法中，也可以利用市售的預(yù)制(premade)文庫，但并不限定于此，例如MATCHMAKER GAL4 cDNA LIBRARY，MATCHMAKER LexAcDNA LIBRARY(Clontech公司)等。另外作為自作的制作文庫用，并不限定于此，例如HybriZAP Two-hybrid vector system(Stratagene公司)等。本法可以參照例如山本雅編、生物手冊系列1，基因工程的基礎(chǔ)技術(shù)、羊土社、1993，Downward，J.，F(xiàn)EBLLett.，338，113-117，1994等。
所謂噬菌體呈現(xiàn)法是通過使用在噬菌體表面帶有5～7個殘基的隨機的氨基酸序列的文庫，反復(fù)進行收集與目的蛋白質(zhì)結(jié)合單獨噬菌體，使噬菌體增殖的操作，醋酸特異性高的氨基酸序列的手法。另外，由得到的結(jié)果檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，也可以從已知的蛋白質(zhì)中選擇對應(yīng)的蛋白質(zhì)。本法可以參照Smith，G.P. & Scott，J.K.，Methods inEnzymology，Vol，217，pp228-257，1993等。
所謂表面胞質(zhì)團共振法典型的是利用BIACORETM系統(tǒng)，以實時對在傳感器芯片上的生物體分子間的相互作用進行監(jiān)測的目的開發(fā)的手法。在該BIACORETM中，將光按照全反射那樣照著沒有固定生物體分子一側(cè)的傳感器芯片(金屬膜)，在發(fā)射光的一部分可觀察到發(fā)射光低下單獨部分(SPR信號發(fā)生)。利用該光表現(xiàn)暗的部分的角度(＝折射率的變化)依賴于傳感器芯片上的質(zhì)量的現(xiàn)象。作為該傳感器芯片，如傳感器芯片CM5帶有羧甲基葡聚糖表面，傳感器芯片SA是預(yù)先固定了鏈抗生物素蛋白的芯片，傳感器芯片NTA是固定了NTA的芯片，用鎳進行螯合，對poly-His融合蛋白進行固定的芯片等。本法如橋本せつ子、分析5、利用表面胞質(zhì)團共振現(xiàn)象的生物體分子相互作用的解析、pp362-368，1997、夏目徹、生物手冊UP系列、蛋白質(zhì)的分子間相互作用實驗法、pp211-230，羊土社、1996等。
熒光偏光法是利用具有在平面偏光激發(fā)的熒光水平的分子在激發(fā)狀態(tài)中進行旋轉(zhuǎn)等運轉(zhuǎn)時放射的熒光變成與激發(fā)光不同的平面的現(xiàn)象，由于分子的純度宇受到很大影響，通過形成復(fù)合物等變成高分子，保持偏光、在以低分子運動性高時，偏光被解除。因此，測定該偏光度，可以連接其相互作用。至于熒光標(biāo)記可以利用各種各樣的標(biāo)記，例如可以使用FS、FITC、and FXS等。測定可以使用例如FBEACONTM等進行。
另外，適合利用親和層析柱對與凋亡有關(guān)的半乳凝素9結(jié)合蛋白質(zhì)進行探索·鑒定。作為親和層析柱的配體，可以使用合成肽、融合蛋白、抗體等。作為代表性的分離例子，就以MOLT-4的細胞破碎液作為起始原料的半乳凝素9結(jié)合蛋白質(zhì)的獲得進行說明，將MOLT-4的細胞破碎液通過半乳凝素9CT(C末端區(qū)域)柱，回收半乳凝素9結(jié)合分子。然后將來自回收的細胞的蛋白質(zhì)加到凝膠上進行電泳，根據(jù)分子量進行分離，對分離得到的凝膠片進行蛋白質(zhì)內(nèi)部的氨基酸序列解析，可以鑒定半乳凝素9結(jié)合蛋白質(zhì)。候補半乳凝素9結(jié)合蛋白質(zhì)通過對來自上述候補蛋白質(zhì)的與半乳凝素9進行相互作用的蛋白質(zhì)進行鑒定的手法可以確定。
因此，作為半乳凝素9結(jié)合蛋白質(zhì)，是來自人的蛋白質(zhì)，如以下所示蛋白質(zhì)4F2重鏈抗原(177216)；ATPase，Na+/K+轉(zhuǎn)運，α1多肽(21361181)；鈉依賴中性氨基酸轉(zhuǎn)運體類型2截短的異構(gòu)體(15004317)；基質(zhì)細胞衍生因子受體1異構(gòu)體a(9257240)；基質(zhì)細胞衍生因子受體1異構(gòu)體b；熱休克90kDa蛋白1，β(20149594)；熱休克90kDa蛋白1，α；熱休克70kDa蛋白5(葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白，78kDa)(16507237)，熱休克70kDa蛋白8異構(gòu)體2(24234686)；熱休克70kDa蛋白9B前體(24234688)；脂肪酸輔酶A連接酶，長鏈3(27469830)；NADH脫氫酶(泛醌)Fe-S蛋白質(zhì)1，75kDa(NADH-輔酶Q還原酶)(4826856)；S-腺苷高半胱氨酸水解酶類1(21361647)；程序性細胞死亡8異構(gòu)體1(4757732)；60kDa熱休克蛋白，線粒體前體(129379)；ATP合酶，H+轉(zhuǎn)運，線粒體F1復(fù)合物，α亞基，異構(gòu)體1，心肌(4757810)；[內(nèi)質(zhì)網(wǎng)]核酮糖結(jié)合糖蛋白II前體(88567)；法尼基-二磷酸法尼基轉(zhuǎn)移酶1(4758350)；泛醇-細胞色素C還原酶復(fù)合物核心蛋白2，線粒體前體(21903482)；長醇基-二磷酸寡糖-蛋白糖基轉(zhuǎn)移酶(21104416)；鈣結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白(6841066)；NADH脫氫酶-泛醌Fe-S蛋白2前體(3540239)；肌動蛋白，β(14250401)；翻譯延伸因子EF-Tu-類蛋白P43前體，線粒體(7443384)；metaxin 1(4505281)；sideroflexin 1(23618867)；TCRβ鏈(2982508)；Hnrnp A1(2194069)；磷酸酯載體前體異構(gòu)體1b(4505775)；ATP合酶，H+轉(zhuǎn)運，線粒體F1復(fù)合物，γ多肽1(4885079)；電壓依賴性陰離子通道1(4507879)；透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白前體(8699626)；雄激素調(diào)節(jié)的短鏈脫氫酶/還原酶1(20070798)；溶質(zhì)載體家族25(線粒體載體，酮戊二酸載體)，member 11(21361114)；3-羥基丁酸脫氫酶前體(17738292)；B-細胞受體相關(guān)蛋白(1673514)；ATP合酶，H+轉(zhuǎn)運，線粒體F1復(fù)合物，O亞基(4502303)；ATP合酶，H+轉(zhuǎn)運，線粒體F0復(fù)合物，亞基d(5453559)；ATP合酶，H+轉(zhuǎn)運，線粒體F0復(fù)合物，亞基b，異構(gòu)體1(21361565)；小的GTP結(jié)合蛋白(13569962)；NADH脫氫酶(泛醌)Fe-S蛋白8，23kDa(NADH-輔酶Q還原酶)(4505371)；小泡運輸?shù)鞍譻ec22b(4759086)；線粒體輸入受體Tom22(9910382)；信號肽受體，δ(5454090)；ATP合酶，αchain(114517或P25705)；ATP合酶，β鏈(114549或P06576)；鈉/鉀-轉(zhuǎn)運ATPaseβ-3鏈(1703470或P54709)；ADP，ATP載體蛋白(113463，P12236，113459，P05141，113455，或P12235)；泛醇-細胞色素C還原酶復(fù)合物核心蛋白1(731047或P31930)以及細胞色素c氧化酶多肽II(117020或P00403)。作為半乳凝素9結(jié)合蛋白質(zhì)，特別是作為來自人的蛋白質(zhì)，即關(guān)于以下的蛋白質(zhì)4F2重鏈抗原(177216)；ATPase，Na+/K+轉(zhuǎn)運，α1多肽(21361181)；鈉依賴中性氨基酸轉(zhuǎn)運體類型2截短的異構(gòu)體(15004317)；基質(zhì)細胞衍生因子受體1異構(gòu)體a(9257240)；基質(zhì)細胞衍生因子受體1異構(gòu)體b；熱休克90kDa蛋白1，β(20149594)；熱休克90kDa蛋白1，α；熱休克70kDa蛋白5(葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白，78kDa)(16507237)；熱休克70kDa蛋白8異構(gòu)體2(24234686)；熱休克70kDa蛋白9B前體(24234688)；S-腺苷高半胱氨酸水解酶類1(21361647)；程序性細胞死亡8異構(gòu)體1(4757732)；60kDa熱休克蛋白，線粒體前體(129379)；[內(nèi)質(zhì)網(wǎng)]核酮糖結(jié)合糖蛋白II前體(88567)；法尼基-二磷酸法尼基轉(zhuǎn)移酶1(4758350)；長醇基-二磷酸寡糖-蛋白糖基轉(zhuǎn)移酶(21104416)；鈣結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白(6841066)；TCRβ鏈(2982508)；透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白前體(8699626)；雄激素調(diào)節(jié)的短鏈脫氫酶/還原酶1(20070798)；B-細胞受體相關(guān)蛋白(1673514)以及鈉/鉀轉(zhuǎn)運ATPaseβ-3鏈(1703470或P54709)，運用上述①免疫沉降法，②West-Western法(包括West-Western法，或Far-Western法、配體印跡法)，③分子間交聯(lián)法，④表達克隆法，⑤雙雜合(體)系統(tǒng)(Two-Hybrid System)，⑥噬菌體呈現(xiàn)法，⑦表面胞質(zhì)團共振法(SPR)，⑧熒光偏光法等，可以對作為與半乳凝素9進行相互作用的蛋白質(zhì)的性狀進行詳細研究。
而上述括弧()內(nèi)的數(shù)字通過在NCBI的主頁(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)輸入該數(shù)字，就可以獲得蛋白質(zhì)信息以及編碼該蛋白的DNA等的核酸序列的信息。因此，可以利用該氨基酸序列信息和DNA等核酸序列信息，即以本說明書中半乳凝素9為例說明的技術(shù)·手法同樣也適用于該蛋白質(zhì)和編碼基因序列。在這樣的可適用的技術(shù)·手法中，當(dāng)然包括包含單克隆抗體的制作以及利用在內(nèi)的抗體制作和利用技術(shù)。因此，在本說明書中，取代半乳凝素9置換為半乳凝素9結(jié)合分子后，應(yīng)當(dāng)可讀懂該記載，這樣的另一種讀法得到的內(nèi)容也都包括在本說明書中。
例如，可以提供以對被驗者的生體樣品中的半乳凝素9結(jié)合分子的多核苷酸的存在量進行試驗，將多核苷酸的存在量比健康人的量多的被驗者判定半乳凝素9易感性和可期待的由半乳凝素9誘起的生理活性的人為特征的診斷方法。同樣，可以提供以對被驗者的生體樣品中的半乳凝素9結(jié)合分子蛋白質(zhì)的存在量進行試驗，將半乳凝素9結(jié)合分子蛋白質(zhì)存在量比健康人的量多的被驗者判定半乳凝素9易感性或可期待的由半乳凝素9誘起的生理活性的人為特征的診斷方法。另外，也提供與半乳凝素9結(jié)合分子多核苷酸在嚴(yán)格條件下進行雜交的寡核苷酸和多核苷酸，以及備有與該半乳凝素9結(jié)合分子多核苷酸在嚴(yán)格條件下進行雜交的寡核苷酸或半乳凝素9結(jié)合分子多核苷酸的DNA微陣列、用于對半乳凝素9結(jié)合分子多核苷酸進行PCR擴增的引物組、識別半乳凝素9結(jié)合分子的抗體、與該抗體不同的表位結(jié)合的抗體等。另外，還提供至少包含以下要素(a)識別半乳凝素9結(jié)合分子的抗體；以及(b)與上述(a)抗體不同的表位結(jié)合的抗體，而且以由標(biāo)記化抗體構(gòu)成作為特征的半乳凝素9易感性或由半乳凝素9誘起的生理活性的期待度的檢測方法，以及檢測試劑盒；至少包括以下要素(a)固定了識別半乳凝素9結(jié)合分子的板或膜；以及(b)與上述(a)抗體不同的表位結(jié)合的抗體，而且由標(biāo)記化抗體構(gòu)成作為特征的半乳凝素9易感性或由半乳凝素9誘起的生理活性的期待度的測定或檢測方法或測定或檢測試劑盒；至少包括以下工序(a)將被驗者的生體樣品與固定有上述抗體的載體接觸的工序；(b)對與該生體樣品接觸的固相載體進行洗滌的工序；(c)將與該生體樣品接觸的固相載體與標(biāo)記化的上述抗體接觸的工序；(d)對固相化標(biāo)記或游離的標(biāo)記進行測定的工序；(e)將工序(d)中測定的標(biāo)記量作為半乳凝素9結(jié)合分子量的指標(biāo)，與對照生體樣品的結(jié)果進行比較的工序；以及(f)將與對照生體比較后顯著高的半乳凝素9結(jié)合分子蛋白質(zhì)存在量作為表示半乳凝素9易感性或由半乳凝素9誘起的生理活性的期待度的程度的指標(biāo)使用的工序為特征的測定上述記載的半乳凝素9相關(guān)生理反應(yīng)的程度的方法，至少包含以下工序(a)由被驗者的生體樣品制備RNA的工序；(b)對工序(a)制備的RNA進行電泳分離的工序；(c)將工序(b)分離的RNA和半乳凝素9結(jié)合分子多核苷酸在嚴(yán)格條件下與標(biāo)記核苷酸探針進行雜交的工序；(d)將工序(c)進行雜交的標(biāo)記量作為半乳凝素9結(jié)合分子多核苷酸表達量的指標(biāo)，與對照生體樣品的結(jié)果進行比較的工序；以及(e)將與對照生體樣品比較后顯著高的半乳凝素9結(jié)合分子多核苷酸表達量作為表示半乳凝素9易感性或由半乳凝素9誘起的生理活性的期待度的程度的指標(biāo)使用的工序為特征的測定上述記載的半乳凝素9相關(guān)生理反應(yīng)的程度的方法，至少包含以下工序(a)由被驗者的生體樣品制備RNA的工序；(b)以工序(a)制備的RNA為模板，使用dT引物制備第1鏈cDNA的工序；(c)以工序(b)制備的cDNA為模板，使用用于對半乳凝素9結(jié)合分子多核苷酸進行PCR擴增的引物組進行PCR擴增的工序；(d)對工序(c)中得到的PCR產(chǎn)物進行電泳分離的工序；(e)將工序(d)中分離的PCR產(chǎn)物和半乳凝素9結(jié)合分子多核苷酸在嚴(yán)格條件下與標(biāo)記核苷酸探針進行雜交的工序；(f)將在工序(e)中進行雜交的標(biāo)記量作為半乳凝素9結(jié)合分子多核苷酸表達量的指標(biāo)，與對照生體樣品的結(jié)果進行比較的工序；以及(g)將與正常的生體樣品比較后顯著高的半乳凝素9結(jié)合分子多核苷酸表達量作為表示半乳凝素9易感性或由半乳凝素9誘起的生理活性的期待度的程度的指標(biāo)使用的工序為特征的測定上述記載的半乳凝素9相關(guān)生理反應(yīng)的程度的方法，至少包含以下工序(a)將被驗者的生體樣品進行組織固定化處理的工序；(b)以工序(a)制備的組織固定化標(biāo)本作為切片的工序；(c)切片化的組織進行利用識別半乳凝素9結(jié)合分子的抗體的免疫組織染色的工序；(d)將被驗者的生體樣品中的免疫組織染色的程度與對照樣品的染色程度進行比較的工序；以及(e)將與對照樣品比較后顯著高的半乳凝素9結(jié)合分子蛋白質(zhì)存在量作為表示半乳凝素9易感性或由半乳凝素9誘起的生理活性的期待度的程度的指標(biāo)使用的工序為特征的測定上述記載的半乳凝素9相關(guān)生理反應(yīng)的程度的方法，以包含從以下工序(a)對被驗者的生體樣品使用用于對半乳凝素9結(jié)合分子多核苷酸進行PCR擴增的引物組進行PCR擴增的工序；(b)對從被驗者的生體樣品分離的核酸級分使用上述DNA微陣列進行分析的工序；(c)將從被驗者的生體樣品分離的核酸級分與和半乳凝素9結(jié)合分子多核苷酸在嚴(yán)格條件下進行雜交的寡核苷酸或多核苷酸進行雜交的工序中選擇出來的至少一個工序、而且包括對被驗者的生體樣品中的半乳凝素9結(jié)合分子多核苷酸的存在量進行試驗，多核苷酸的存在量與健康人的量進行比較為特征的測定上述記載的半乳凝素9相關(guān)生理反應(yīng)的程度的方法，以定量地測定半乳凝素9結(jié)合分子蛋白質(zhì)存在量或半乳凝素9結(jié)合分子多核苷酸表達量為特征的上述任一個所述的測定上述記載的半乳凝素9相關(guān)生理反應(yīng)的程度的方法，以上述任一個所述的測定半乳凝素9相關(guān)生理反應(yīng)的程度的方法中使用的含有上述任一個所述的抗體為特征的試劑，以使用識別半乳凝素9結(jié)合分子的抗體，對檢體樣品中的半乳凝素9結(jié)合分子蛋白質(zhì)的量或半乳凝素9結(jié)合分子多核苷酸表達量進行測定為特征的對半乳凝素9易感性或由半乳凝素9誘起的生理活性的期待度的程度或半乳凝素9相關(guān)生理反應(yīng)的程度進行測定或診斷的方法，也提供含有識別半乳凝素9結(jié)合分子的抗體，對檢體樣品中的半乳凝素9結(jié)合分子蛋白質(zhì)的量或半乳凝素9結(jié)合分子多核苷酸表達量進行測定，對半乳凝素9易感性或由半乳凝素9誘起的生理活性的期待度的程度或半乳凝素9相關(guān)生理反應(yīng)的程度進行測定或診斷的試劑。作為診斷、測定等中的具體的判定基準(zhǔn)，被驗者的多核苷酸的存在量例如與對照的進行比較，為10％以上、優(yōu)選30％以上、更優(yōu)選70％以上、更優(yōu)選100％以上的場合。
作為微陣列的制作方法，已知有在固相載體表面直接合成寡核苷酸的方法(on-chip法)，將預(yù)先制備的寡核苷酸或多核苷酸固定于固相載體表面的方法。在本發(fā)明中使用的微陣列可以用任一個方法制作。作為on-chip法，可以通過將光照有選擇地除去保護基的使用以及在半導(dǎo)體制造中利用的光刻(蝕)技術(shù)和固相合成技術(shù)組合，在微少的陣列的所定區(qū)域進行有選擇合成的方法(掩蔽技術(shù)例如，F(xiàn)odor，S.P.A.Science 251，767，1991)等進行。另外，在將預(yù)先制備的寡核苷酸或多核苷酸固定于固相載體表面時，合成導(dǎo)入官能團的寡核苷酸或多核苷酸，將寡核苷酸或多核苷酸點著在進行了表面處理的固相載體表面，使其共價結(jié)合(例如，Lamture，J.B.et al.Nucl.AcidsRes.22，2121-2125，1994；Guo，Z.et a1.Nucl.Acids Res.22，5456-5465，1994)。
寡核苷酸或多核苷酸一般是借助于隔片或交聯(lián)分子與進行表面處理的固相載體共價結(jié)合。已知有使聚丙烯酰胺凝膠的微小片定向?qū)?zhǔn)排列于玻璃表面，使合成寡核苷酸共價結(jié)合于小片上的方法(Yershov，G.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，4913，1996)。另外，已知有在硅微陣列上制作微小電極陣列，在電極上設(shè)置含有鏈抗生物素蛋白的瓊脂糖的浸透層，作為反應(yīng)部位，通過使該部位帶正電荷，固定生物素化的寡核苷酸，通過控制部位的帶電荷，可以高速進行嚴(yán)密的雜交的方法(Sosnowski，R.G.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，1119-1123，1997)。
當(dāng)使用這樣的微陣列進行診斷或測定時，利用將從被驗者的細胞分離的mRNA作為模板，合成cDNA、進行PCR擴增。此時，整合標(biāo)記dNTP，作為標(biāo)記cDNA。使該標(biāo)記cDNA與微陣列接觸，對與微陣列的捕捉探針(寡核苷酸或多核苷酸)雜交的cDNA進行檢測。雜交可以通過分注到96孔或384孔塑料板，將標(biāo)記cDNA點著在微陣列上實施。點著的量可以為1～100nl程度。雜交優(yōu)選是在室溫～70℃溫度范圍，實施6～20小時。雜交結(jié)束后，使用表面活性劑和緩沖液的混合溶液進行清洗，除去未反應(yīng)的標(biāo)記cDNA。作為表面活性劑，優(yōu)選使用十二烷基硫酸鈉(SDS)。作為緩沖液可以使用檸檬酸緩沖液、磷酸緩沖液、硼酸緩沖液、Tris緩沖液、Good′s緩沖液等，優(yōu)選使用檸檬酸緩沖液。
半乳凝素9結(jié)合分子多肽的測定使用引物組，也可以測定該多核苷酸(具體來說是mRNA)的表達量。在該手法中，適合使用RT-PCR法。另外也優(yōu)選使用競爭PCR法進行定量測定。該引物組可以根據(jù)眾所周知的堿基序列進行設(shè)計、經(jīng)合成·純化各個工序制備。同樣競爭用引物也可以以半乳凝素9結(jié)合分子基因的堿基序列為基礎(chǔ)設(shè)計、合成。另外，作為引物設(shè)計的注意點如下所述?？紤]使引物的大小(堿基數(shù))滿足與模板DNA之間的特異的退火，可以為15-40堿基、希望為15-30堿基。但是，在進行LA(long accurate)PCR時，至少要30堿基才有效果。在避免由有意義鏈(5’末端側(cè))和反意義鏈(3’末端側(cè))構(gòu)成的1組和1對(2條)引物相互不能退火那樣的兩引物間的互補序列的同時，為了防止引物內(nèi)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成，也要避免自身互補序列。另外，為了確保與模板DNA的穩(wěn)定結(jié)合，要使GC含量為約50％、引物內(nèi)GC豐度或AT豐度平均。退火溫度由于與Tm(meltingtemperature)值有關(guān)，所有為了獲得特異性高的PCR產(chǎn)物，選定Tm值在55-65℃相互近似的引物。另外，還需要注意PCR中引物使用的最終濃度要調(diào)整到約0.1～約1μM等。另外，可以使用引物設(shè)計用的市售的軟件、例如OliogoTM[National Bioscienoe Inc.(美國)生產(chǎn)]、GENETYX[軟件開發(fā)(株)(日本)生產(chǎn)]等。
對于半乳凝素9結(jié)合分子表達基因(包括cDNA等DNA和mRNA等的RNA)根據(jù)上述“基因重組技術(shù)”使用在該領(lǐng)域中用于檢測測定特定基因的表達的已知手法，例如原位雜交、Northern blotting、dotblotting、RNase保護分析、RT-PCR、Real-Time PCR(Journal ofMolecular Endocrinology，25，169-193(2000)以及其中引用的文獻)、DNA陣列解析法(Mark Shena編，“Microarray BiochipTechnology”，Eaton Publishing(2000年3月)等進行檢測·測定，可以檢測與本說明書公布的半乳凝素9相關(guān)的生理現(xiàn)象以及半乳凝素9結(jié)合分子表現(xiàn)出的生物活性相關(guān)的現(xiàn)象等。利用這樣技術(shù)的半乳凝素9結(jié)合分子表達基因測定系、凋亡檢測系、抗腫瘤檢測系、這些系統(tǒng)中利用的試劑、方法、工序、解析程序等都包括在本發(fā)明的技術(shù)以及技術(shù)中利用的系統(tǒng)。對于該原位雜交，可以包括例如非RI原位雜交，其中也可以包括例如直接法和間接法。該直接法是使用可檢測的分子(報告分子)直接結(jié)合于核酸探針的方法，該間接法是使用針對報告分子的抗體等使信號擴增的方法。在核酸探針中的寡核苷酸中，導(dǎo)入官能團(例如，伯脂肪族氨基、SH基等)，可以使庚烯、熒光色素、酶等結(jié)合于這樣的官能團。作為核酸探針的標(biāo)記，代表性的如洋地黃毒苷(DIG)、生物素、熒光素等，可以從在抗體的地方進行說明的標(biāo)記中適當(dāng)選擇使用，另外也可以利用多重標(biāo)記，還可以利用標(biāo)記抗體。
作為核酸探針的標(biāo)記法，可以從該領(lǐng)域中已知的方法中選擇使用，例如隨機引物法、切口平移法、利用PCR的DNA的擴增、標(biāo)記/加尾法、體外轉(zhuǎn)寫法(in vitro transcription)等。對于可處理的樣品的觀察，可以從該領(lǐng)域中已知的方法中適當(dāng)選擇使用，例如可以使用暗視野顯微鏡、位相差顯微鏡、反射對照顯微鏡、熒光顯微鏡、數(shù)字圖像顯微鏡、電子顯微鏡等，另外也可以利用流式細胞儀等。在本發(fā)明中，可以將半乳凝素9結(jié)合分子蛋白質(zhì)或其相關(guān)多肽或寡肽和半乳凝素9結(jié)合分子表達基因作為各種各樣的標(biāo)志或抗腫瘤標(biāo)志或發(fā)癌或癌惡化的標(biāo)志使用，通過該標(biāo)志可以做成各種形態(tài)的癥狀檢測劑或危險的檢測和/或測定劑、半乳凝素9相關(guān)生理現(xiàn)象的檢測法或危險的檢測和/或測定法、以及這樣的檢測或危險檢測和/或測定試劑盒或系統(tǒng)，在本說明書中公布說明的各種各樣的疾病·癥狀的診斷、預(yù)防、治療中不僅有用，而且很好。另外這些試劑或測定法對于疾病治療后，即預(yù)后也可以作為以該疾病作為對象的再發(fā)檢測劑或預(yù)后檢測和/或測定劑、它們的檢測法或危險性檢測和/或測定法、以及用于這些方法的檢測和/或測定試劑盒或系統(tǒng)，作為預(yù)后的檢測測定預(yù)期也具有優(yōu)良的功能、作用效果。
可以提供將對被驗者的生體樣品中的半乳凝素9結(jié)合分子蛋白質(zhì)的存在量進行試驗，半乳凝素9結(jié)合分子蛋白質(zhì)存在量比對照的量多時判定為半乳凝素9易感性或由半乳凝素9誘起的生理活性的期待度的程度或半乳凝素9相關(guān)生理反應(yīng)的程度高的方法。作為具體的判定基準(zhǔn)，被驗者的半乳凝素9結(jié)合分子蛋白質(zhì)存在量與對照進行比較，為10％以上、優(yōu)選30％以上、更優(yōu)選70％以上、更優(yōu)選100％以上的場合。半乳凝素9結(jié)合分子蛋白質(zhì)的存在量可以使用識別半乳凝素9結(jié)合分子的抗體或與半乳凝素9結(jié)合分子特異結(jié)合的抗體(抗半乳凝素9結(jié)合分子抗體)進行測定。該抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，可以與半乳凝素9結(jié)合分子蛋白質(zhì)的抗原表位結(jié)合的全體分子以及Fab、F(ab′)2、Fv片段等都包括在內(nèi)。
作為測定系，例如對組織可以有利地利用免疫染色、免疫電子顯微鏡等的蛋白質(zhì)測定系、原位雜交等表達基因測定系，對于組織提取物可以有利利用EIA、RIA、FIA、LIA、Western blotting等蛋白測定系、Northern blotting、Southern blotting、dot blotting、RNase保護分析、RT-PCR(reverse transcription polymerase chainreaction)、Real-Time PCR、競爭PCR等表達基因測定系、而對于血中、體液等可以有利利用EIA、RIA、FIA、LIA、and Western blotting等蛋白測定系。
在EIA的測定系中，例如在競爭法中使用抗半乳凝素9結(jié)合分子抗體作為固相化抗體使用，也可以使用標(biāo)記抗原和非標(biāo)記抗原(作為抗原如半乳凝素9結(jié)合分子和其片段肽等)，而在非競爭法中，例如在夾心法中，除了可以利用固相化抗半乳凝素9結(jié)合分子抗體或標(biāo)記抗半乳凝素9結(jié)合分子抗體外，也可以利用對抗半乳凝素9結(jié)合分子抗體直接進行標(biāo)記、也可以不固相化，對針對抗半乳凝素9結(jié)合分子抗體的抗體進行標(biāo)記進行固相化后進行。作為靈敏度擴增法，例如在與非酶標(biāo)記一次抗體的組合中，利用與高分子聚合物和酶和一次抗體的組合(應(yīng)用Envision試劑的組合，Enhanced polymer one-StepStaining(EPOS))，在與非酶標(biāo)記二次抗體的組合中，例如PAP(peroxidase-antiperoxidase)法等的酶和抗酶抗體復(fù)合物的組合，SABC(avidin-biotinylated peroxidase復(fù)合物)法等的生物素標(biāo)記二次抗體與生物素標(biāo)記酶-抗生物素蛋白復(fù)合物體的組合、ABC(streptavidin-biotin 復(fù)合物)法、LSAB(labeledstreptavidin-biotin復(fù)合物)法等的生物素標(biāo)記二次抗體與生物素標(biāo)記酶-鏈抗生物素蛋白復(fù)合物的組合、CSA(catalyzed signalamplification)法等的SABC與生物素標(biāo)記酪酰胺(tyramide)和酶標(biāo)記鏈抗生物素蛋白的組合、在高分子聚合物中對二次抗體和酶進行標(biāo)記的組合等。
實施例以下給出實施例，對本發(fā)明進行具體說明，該實施例只是為了本發(fā)明的說明，為了作為其具體方式的參考而提供的。這些例示是為了說明本發(fā)明的特定的具體的方式的例子，并不表示限定或限制在本申請中公布的發(fā)明的范圍。至于本發(fā)明應(yīng)當(dāng)理解為可以是基于本說明書的思想的各種各樣的實施方式。
所有的實施例除了另外詳細敘述內(nèi)容之外，都是使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)進行實施的例子、或能夠?qū)嵤┑睦?，這對于同行人是眾所周知、慣用的方式。
實施例1(1)材料和方法(a)細胞培養(yǎng)物MOLT-4(T細胞)、Jurkat(T細胞)、BALL-1(B細胞)、THP-1(來自acute monocytic leukemia的細胞)以及HL60(來自acutemonocytic leukemia的細胞)由美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)獲得。所有細胞系都在添加了10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基(Sigma、圣路易斯、美國)中于5％CO2的條件、37℃下進行維持。為了抑制Gal-9的活性，在培養(yǎng)用培養(yǎng)基中添加30mM的乳糖。作為對照使用同濃度的蔗糖。
(b)重組體Gal-9(rGal-9)的表達和純化按照眾所周知的方法(例如，Matsushita，N.et al.，J.Biol.Chem.，2758355(2000)；以及Nishi，N.et al.，Endocrinology，1413194(2000))那樣操作，將rGal-9做成(His)6-半乳凝素-9(短型)[(His)6-Gal-9(S)]，使其表達，進行純化。即，使帶有Gal-9表達質(zhì)粒的大腸桿菌BL-21株在含有100μg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(Gibco BRL、Rockville、馬里蘭州、美國)中增殖。
為了誘導(dǎo)融合蛋白的表達，添加IPTG(異丙基-β-D-(-)-硫代半乳糖苷、和光純藥、大阪、日本)。將大腸桿菌提取物加到乳糖瓊脂糖(生物化學(xué)工業(yè)、東京、日本)的親和層析柱。將被吸附的蛋白質(zhì)用200mM的乳糖洗脫。收集洗脫級分，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，用考馬斯亮藍(coomassie brilliant blue)R250染色后進行解析。將含有rGal-9的級分收集，對含有0.1mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol(DTT))的PBS進行透析。
另外，有關(guān)野生型半乳凝素9(galectin-9S，galectin-9M以及galectin-9L)的表達載體的構(gòu)建、重組蛋白質(zhì)的表達以及純化按照M.Sato et al.，Glycobiology，Vol.12，No.3，pp.191-197(2002)所述那樣進行。
(c)凋亡分析(1)利用PI的細胞周期(apoptosis)解析(PI法)將被凋亡誘導(dǎo)處理的細胞于4℃、1000rpm下進行5分鐘離心處理后，將細胞團再懸浮于PBS(300μl)，一邊渦旋、一邊向細胞懸浮液慢慢添加100％冷乙醇(700μl)，終濃度變?yōu)?0％乙醇。于4℃下進行30分鐘溫育處理，對細胞進行固定，然后加PBS(1ml)，于4℃、1000rpm下進行5分鐘離心處理后，將細胞團再懸浮于PBS(440μl)。將細胞與2.5mg/ml的核酸酶A(10μl，終濃度50μg/ml，Sigma，圣路易斯、密蘇里州、美國)一起于37℃下進行30分鐘溫育處理，然后與2.5mg/ml的碘化丙錠(propidium iodide)(4μl；PI，終濃度20μg/ml，Sigma)一起于4℃、暗中進行10分鐘溫育處理。通過尼龍篩除去變成集塊的細胞后，用PBS將細胞增加體積，將染色細胞通過流式細胞儀(Sandstrom，K.et al.，J ImmunolMethods，24055(2000)以及Zhang L.et al.，CancerLett，142129(1999))進行解析。
(2)TUNEL(TdT-mediated標(biāo)記dUTP nick end labeling)法對于通過DNA的片段化產(chǎn)生的末端，用在DNA末端附加核苷酸的酶(TdT末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶)整合標(biāo)記的核苷酸(dUTP-biotin或FITC-dUTP等)后，對作為凋亡的顯著特征的細胞核DNA的片段進行檢測。
在實驗中，使用MEBSTAIN Apoptosis Kit Direct(MBL、名古屋、日本)。根據(jù)試劑盒業(yè)主的指示，象下述那樣進行實驗。即，將進行了凋亡誘導(dǎo)的細胞(約2×105個/樣品)用含有0.2％FSA的PBS洗，然后加4％多聚甲醛(0.1M NaH2PO4，pH7.4中)，于4℃、下進行30分鐘固定化后，用含有0.2％FSA的PBS洗。向細胞團添加70％冷乙醇在-20℃培養(yǎng)30分鐘，使透過性亢進。用含0.2％FSA的PBS洗后，向細胞團加TdT反應(yīng)液(TdT、FITC-dUTP以及TdT緩沖液的混合物)，攪拌后，于37℃下進行1小時溫育處理，用含有0.2％FSA的PBS洗后，再懸浮于用含有0.2％FSA的PBS中，對染色細胞通過流式細胞儀進行解析。
(3)將培養(yǎng)的細胞株于rGal-9一起進行適當(dāng)時間、例如24小時溫育。然后通過上述(1)的PI法進行凋亡解析。
另外，為了通過膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-PI進行凋亡解析，使用MEBCYTO(登錄商標(biāo))凋亡試劑盒(MBL、名古屋、日本)。根據(jù)試劑盒業(yè)主的指示，象如下那樣進行實驗。即，將進行了凋亡誘導(dǎo)的細胞(約2×105個/樣品)用PBS洗，然后再懸浮于結(jié)合用緩沖液。將試劑盒的Annexin V-FITC以及5μl的PI(終濃度5μg/ml)加到細胞懸浮液中后，將細胞于暗處進行15分鐘溫育處理。使用流式細胞儀(EPICS XL-MCL，CouHer，Miami，F(xiàn)L，美國)進行解析。
細胞與Gal-9一起在10μM的Z-VAD-FMK(泛半胱天冬酶抑制劑)、Z-YVAD-FMK(半胱天冬酶1抑制劑)、Z-IETD-FMK(半胱天冬酶8抑制劑)、Z-LEHD-FMK(半胱天冬酶9抑制劑)、Z-AEVD-FMK(半胱天冬酶10抑制劑)、或Z-LLY-FMK(鈣蛋白酶抑制劑)(以上、BioVision，CA，美國)的存在下進行溫育處理后，研究半胱天冬酶或鈣蛋白酶是否參與由Gal-9誘導(dǎo)的凋亡。使用Z-FA-FMK(BioVision，CA，美國)作為對照(VuC.C.et al.，J.Biol.Chem.，27637602(2001)以及Sweeney E.A.et al.，F(xiàn)EBS Lett.，42561(1998))。各個抑制劑在Gal-9刺激的1小時前添加。
以下試劑分別從如下所示的供應(yīng)商購入DEX(BioVision，CA，美國)、抗Fas抗體(Clone CH-11，MBL)、TNFα(Genzyme，Cambridge，MA，美國)、C2神經(jīng)酰胺(SIGMA)以及依托泊甙(BioVision)。
(d)T細胞解析將24孔板各個孔，每孔3μg/ml的抗CD3抗體(Immunotech，Marseille、法國)的TBS液(pH8.0)于4℃下溫育過夜處理后，除去抗CD3抗體，用PBS洗滌孔，得到用抗CD3抗體包被的孔板。
使用HISTOPAQUE(登錄商標(biāo)、SIGMA)從加肝素的血液中分離單核白血球細胞。然后，使用CD4陽性分離試劑盒(CD4-positiveisolation kit；DYNAL，Oslo，挪威)以及Dynabeads(登錄商標(biāo)，DYNAL，oslo，挪威)M-450 CD8(DYNAL，Oslo，挪威)，按照試劑盒制造業(yè)主所述那樣分別分離CD4陽性T細胞以及CD8陽性T細胞。
為了對T細胞進行活化，將CD4陽性T細胞或CD8陽性T細胞于含有10％FCS的RPMI-1640中調(diào)整為1×106個/ml的細胞，于37℃下在用抗CD3抗體包被的板上于5％CO2培養(yǎng)箱中溫育處理20～24小時，然后與rGal-9[(His)6-rGal-9(S)]一起于37℃下在5％CO2培養(yǎng)箱中進行溫育處理。然后，象上述(c)那樣，進行凋亡·分析。即，將細胞于37℃下與50μg/ml的PI(SIGMA)一起在暗處進行溫育處理10分鐘。將染色細胞通過流式細胞儀(Sandstrom，K.et al.，JImmunol Methods，24055(2000)以及Zhang L.et al.，Cancer Lett，142129(1999))進行解析。
對于非活化(靜息)T細胞也與rGal-9[(His)6-rGal-9(S)]一起于37℃下在5％CO2培養(yǎng)箱中進行溫育處理后，與上述同樣進行凋亡分析。
作為比較，用半乳凝素1以及半乳凝素3處理的場合也進行試驗。
(e)Ca2+流入培養(yǎng)基(10％FCS，含有10mM HEPES的RPMI-1640，pH7.2)中的細胞(大致為106～107個/ml)與作為細胞內(nèi)鈣指示劑的fluo-3AM(最終濃度10μM，Dojindo，Kumamoto，日本)一起于37℃下進行30分鐘溫育處理(Sharp，B.M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，938294(1996))。然后將細胞清洗之后，再懸浮于培養(yǎng)基中(最終濃度，大約2×105個/ml·樣品)。再用流式細胞儀測定細胞內(nèi)鈣。測定休止細胞的熒光強度后1分鐘，對該細胞加刺激。
然后直至在加另一個刺激之前，連續(xù)地再次開始收集紀(jì)錄。有關(guān)乳糖抑制分析，在30mM的乳糖的存在下，對細胞進行刺激。作為對照，使用30mM的蔗糖(Sano，H.et al.，J.Immunol.，1652156(2000))。作為陽性對照使用A23187(鈣離子載體、終濃度5ng/ml，Wako，Osaka，日本)。
(1)通過Gal-9進行凋亡的誘導(dǎo)研究Gal-9對各種細胞株的凋亡誘導(dǎo)活性。結(jié)果表明，rGal-9一起進行溫育處理的MOLT-4細胞用PI被染色。該被染色的細胞作為引起凋亡的細胞計數(shù)。就像圖1A所示那樣，rGal-9(1μM)誘導(dǎo)MOLT-4細胞的凋亡(在對照的PBS中，14.8％的細胞是被PI染色的細胞，是引起凋亡的細胞，而在用Gal-9處理的組中，34.5％的細胞是被PI染色的細胞，引起凋亡)。Gal-9對這樣的凋亡誘導(dǎo)與時間、以及用量有關(guān)。用PI法檢測的凋亡隨著rGal-9的濃度變大而增加，如果延長溫育時間，還要增加(例如，如果用0.3μM的rGal-9，溫育時間24小時，而如果用1μM的rGal-9，溫育時間為6小時)。
凋亡期間會產(chǎn)生磷脂酰絲氨酸，由于它可以用染色法進行檢測，所有使用Annexin V染色法可以研究Gal-9的促凋亡。用Annexin V染色法檢測的引起凋亡的細胞如果使用1μM的Gal-9由對照的13.2％增大到69.1％，(圖1B)。由此可確認(rèn)Gal-9對于MOLT-4細胞具有凋亡活性。
然后，當(dāng)研究乳糖對Gal-9的凋亡誘導(dǎo)活性的作用時，就像圖2所示那樣，Gal-9的促凋亡活性幾乎被30mM的乳糖完全抑制，但不被蔗糖抑制。這表明對于Gal-9的誘起的凋亡β-半乳糖苷酶結(jié)合活性是必需的。
(2)由Gal-9引起的各種各樣細胞的凋亡的發(fā)生Gal-9的促凋亡活性對于其它細胞株是否表現(xiàn)出該活性進行研究。即，在1μM的rGal-9存在下或不存在下，對細胞進行24小時培養(yǎng)，研究是否發(fā)生凋亡。就像圖3所示那樣，凋亡不僅在Jurkat細胞和MOLT-4細胞等T細胞，而且在B細胞(BALL-1)、單核細胞(THP-1)以及骨髓性細胞(HL60)也被Gal-9誘導(dǎo)。而圖3中的黑棒表示Gal-9的處理組，白棒表示對照。另外，Gal-9的促凋亡活性被乳糖抑制，而不受蔗糖抑制。
接下來，對人的末梢血T細胞進行Gal-9誘起凋亡研究。T細胞分離為CD4+細胞和CD8+細胞，在抗CD3抗體存在下和不存在下進行溫育。然后對非活化(靜息)T細胞和抗CD3抗體活化的T細胞在1μM的rGal-9存在下進行溫育處理。結(jié)果如表1所示。
表1

表1中，CD3(+)表示在用抗CD3抗體包被的板上被處理、活化的狀態(tài)，CD3(-)由于沒有進行通過抗CD3抗體包被的板的處理，所以，表示非活化(靜息)細胞。各個半乳凝素下的(+)表示在其存在下的處理，(-)表示不存在下的處理，而CD4表示CD4陽性T細胞，CD8表示CD8陽性T細胞。
由圖4表明與靜息CD4+T細胞和靜息CD8+T細胞進行比較，Gal-9更能使CD3-活化CD4+T細胞和CD3-活化CD8+T細胞兩者凋亡。圖4中的黑棒表示Gal-9存在下的處理組，白棒表示對照。另外與CD8+T細胞比較，進一步確認(rèn)CD4+T細胞方對Gal-9的易感性(圖4) 。
(3)半胱天冬酶抑制對于半胱天冬酶活化途徑是否參與Gal-9誘起凋亡進行研究。首先與泛半胱天冬酶抑制劑Z-VAD-FMK一起對MOLT-4細胞進行溫育處理，然后與rGal-9一起進行溫育。Gal-9誘起凋亡幾乎完全被該半胱天冬酶抑制劑抑制(圖5和圖6)。例如，通過地塞米松(DEX)、抗Fas抗體、TNF-α、C2神經(jīng)酰胺等其它的刺激誘導(dǎo)的凋亡可被該泛半胱天冬酶抑制劑抑制也可觀察到。
使用各種針對半胱天冬酶的半胱天冬酶抑制劑，即針對半胱天冬酶-1的Z-YVAD-FMK、針對半胱天冬酶-8的Z-IETD-FMK、針對半胱天冬酶-9的Z-LEHD-FMK、以及針對半胱天冬酶-10的Z-AEVD-FMK進行實驗。
結(jié)果如圖5所示。唯一Z-YVAD-FMK(半胱天冬酶-1抑制劑)抑制Gal-9誘起的凋亡，其它的抑制劑都不抑制Gal-9誘起的凋亡。同時發(fā)現(xiàn)該半胱天冬酶-1抑制劑抑制DEX誘起的凋亡，半胱天冬酶-8抑制劑以及半胱天冬酶-10抑制劑抑制抗Fas抗體誘起凋亡以及TNF-α誘起凋亡，半胱天冬酶-9抑制劑抑制C2神經(jīng)酰胺誘起凋亡。另外，如圖6所示那樣，泛半胱天冬酶抑制劑和半胱天冬酶-1抑制劑兩者抑制Gal-9與用量有關(guān)。這樣的抑制現(xiàn)象也可以在使用其它細胞株的實驗中得到。由這些結(jié)果可以認(rèn)為Gal-9是借助于半胱天冬酶-1誘導(dǎo)凋亡的，并不能通過其它的半胱天冬酶的途徑進行誘導(dǎo)。
(4)鈣-鈣蛋白酶途徑對于半胱天冬酶-1的活化由于需要鈣依賴性蛋白酶-鈣蛋白酶，所以，對鈣蛋白酶半胱天冬酶-1活化系統(tǒng)是否與MOLT-4細胞的Gal-9誘起凋亡有關(guān)進行研究。如圖7所示那樣，作為鈣蛋白酶抑制劑的Z-LLY-FMK抑制Gal-9誘起凋亡與用量有關(guān)。
另外，為了對Gal-9是否能夠使MOLT-4細胞中的鈣的流入發(fā)生進行研究，進行F1uo-3分析。如圖8所示那樣，當(dāng)添加Gal-9時，在10～20秒內(nèi)MOLT-4細胞內(nèi)鈣的流入上升，但Gal-9誘起的鈣的流入被乳糖抑制。而蔗糖不抑制Gal-9誘起的鈣的流入。作為對照使用的A23187(終濃度5ng/ml)顯然抑制MOLT-4細胞中的鈣的流入(圖8)。
另外，在其它的細胞中，也可以確認(rèn)在Gal-9誘起凋亡中有鈣蛋白酶以及鈣的流入?yún)⑴c。
(5)Gal-9對于由DEX、抗Fas抗體以及依托泊甙誘起的凋亡的效果對于Gal-9對由其它刺激(例如，DEX、抗Fas抗體以及依托泊甙等)誘導(dǎo)的凋亡影響的作用效果進行研究。
rGal-9、DEX、抗Fas抗體以及依托泊甙都顯著誘導(dǎo)MOLT-4細胞的凋亡(圖9)。
將MOLT-4細胞與rGal-9以及DEX一起進行溫育處理時，引起凋亡的細胞的比例(％)幾乎為微小的差異或沒有差異。另外，rGal-9對抗Fas抗體誘起凋亡以及依托泊甙誘起凋亡表現(xiàn)出附加作用(圖9)。這些結(jié)果表明由Gal-9引起的凋亡化途徑與由DEX以外的其它刺激引起凋亡的途徑不同。
接著，發(fā)現(xiàn)Gal-9在各種各樣的細胞、特別是被試驗的所有免疫細胞中都誘導(dǎo)凋亡(圖3和4)。這表明Gal-9起著作為對很多類型的細胞具有促凋亡活性因子的功能。
例如，關(guān)于糖皮質(zhì)激素(GC)、抗Fas抗體、氧化性的應(yīng)激等其它的刺激，可對凋亡化途徑分別進行解析。例如，抗Fas抗體與Fas配體結(jié)合后，借助于半胱天冬酶-8活性誘導(dǎo)凋亡，依托泊甙阻礙DNA，使線粒體的細胞色素c游離，對半胱天冬酶-9進行活化，最終誘導(dǎo)凋亡(Sun X.M.et al.，J.Biol.Chem.，2745053(1999))。DEX對鈣依賴性內(nèi)切核酸酶以及半胱天冬酶-1進行活化，引起細胞死亡(Cheneval，D.et al.，J.Biol.Chem.，27317846(1998))；McConkey，D.J.，J.Biol.Chem.，27122398(1996)以及Cohen，J.J.et al，JImmunol.，13238(1984))。GC在很多類型的細胞中誘導(dǎo)凋亡，當(dāng)然在T細胞中也誘導(dǎo)凋亡(Dobashi H.et al.，F(xiàn)ASEB，151861(2001)以及Nittoh，T.et al.，Eur.J.Pharmacol.，35473(1998))。其機制已經(jīng)被解析，表明GC以及半胱天冬酶-1在胸腺細胞中誘導(dǎo)鈣依賴性凋亡(McConkey，D.J.，J.Biol.Chem.，27122398(1996)以及Cohen，J.J.et al.，J Immunol.，13238(1984))。
在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)Gal-9誘導(dǎo)凋亡，凋亡繼Ca2+流入(圖8)、鈣蛋白酶參與(圖7)、然后半胱天冬酶-1的活化(圖5和6)后發(fā)生，該現(xiàn)象表明Gal-9使用鈣-鈣蛋白酶-半胱天冬酶-1途徑，就像GC那樣誘導(dǎo)凋亡。
鈣通過鈣-鈣蛋白酶途徑和線粒體途徑兩方誘導(dǎo)U937細胞的凋亡(Li M.et al.，J.Biol.Chem.，27539702(2000))。另外，Gal-9還會增加由抗Fas抗體或依托泊甙誘導(dǎo)的凋亡。
在由GC誘導(dǎo)的細胞死亡的期間，Gal-1基因被過量表達(Goldstone S.D.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，178746(1991))。而且Gal-1在Jurkat細胞中誘導(dǎo)Ca2+流入以及凋亡(Walzel，H.et al.，Glycobiology，10131(2000))。這表明鈣-鈣蛋白酶-半胱天冬酶-1途徑至少部分與由Gal-1介導(dǎo)的凋亡的途徑有關(guān)。事實上，在Gal-1誘導(dǎo)凋亡中，不需要細胞內(nèi)鈣的上升(Pace，K.E.etal.，J Immunol.，1652331(2000))。另外，Gal-7應(yīng)當(dāng)是具有JNK活化以及在細胞色素C游離的上游的細胞內(nèi)發(fā)揮作用的促凋亡活性的半乳凝素(Kuwabara，I.et al.，J.Biol.Chem.，2773487(2002)以及Bernerd，F(xiàn).et al.，Proc.Nat l.Acad.Sci.USA，9611329(1999))。這表明Gal-7的促凋亡活性途徑與Gal-1以及Gal-9的活性途徑不同。
本發(fā)明人到目前為止發(fā)現(xiàn)了Gal-9結(jié)合于試驗的細胞的細胞表面。GC與細胞內(nèi)的受體一結(jié)合，該受體結(jié)合后向核移動(Galigniana，M.D.et al.，J.Biol.Chem.，27416222(1999)以及Guiochon-Mantel，A.et al.，EMBO J.，103851(1991))。另外，我們認(rèn)為Gal-9與細胞表面的結(jié)合分子結(jié)合，然后誘導(dǎo)Ca2+流入、鈣蛋白酶-半胱天冬酶-1活化，直至使細胞凋亡。Gal-9的受體以及其存在的場所雖然與DEX不同，但Gal-9通過與GC場合相似的凋亡化途徑誘導(dǎo)凋亡。事實上，Gal-9表現(xiàn)出對抗Fas抗體介導(dǎo)的凋亡或依托泊甙介導(dǎo)的凋亡雙方進行附加的作用，但對于DEX介導(dǎo)的凋亡不具有任何的附加作用或只是具有一點點的附加作用(圖9)。另外，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)Gal-9可使由抗Fas抗體引起的凋亡增強，而Gal-9抑制由DEX-誘起嗜酸性細胞凋亡。
另外，發(fā)現(xiàn)DEX在大鼠中在CD4+T細胞以及CD8+T細胞雙方細胞中誘導(dǎo)凋亡(Tsuchiyama，Y.et al.，Kidney Int.，581941(2000))以及在人T細胞中誘導(dǎo)凋亡(Dobashi H.etal.，F(xiàn)ASEB，151861(2001))。另外，Gal-9在腎炎的大鼠中在活化的脾臟CD8+T細胞中誘導(dǎo)有選性的凋亡(Tsuchiyama，Y.etal.，Kidney Int.，581941(2000))。
在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)Gal-9在來自人末梢血細胞中，與被活化的CD8+T細胞(抑制者T細胞和細胞傷害性T細胞)相比，更誘導(dǎo)被活化的CD4+T細胞(協(xié)助者T細胞)(圖4)。這表明Gal-9作為免疫抑制因子(immunosuppressive factor)起作用的可能性。因此，可以認(rèn)為Gal-9與嗜酸性細胞活化的活性一起通過誘導(dǎo)CD4+T細胞等各種各樣的免疫細胞的凋亡，對免疫的控制調(diào)整起著重要的作用。
實施例2(1)半乳凝素9的毒害細胞活性對Jurkat T細胞株、K-562白血病細胞、正常淋巴細胞通過使用PI的流式細胞儀解析法測定毒害細胞活性。即，對靶細胞和1mM的半乳凝素9進行16小時溫育處理后，在最后的15分鐘加PI，在受到傷害的靶細胞中，PI進入細胞內(nèi)。用FACS測定由該PI發(fā)出的熒光。作為陰性對照使用不加任何其它物質(zhì)的細胞，作為100％死細胞使用用福爾馬林固定的細胞，作為陽性對照使用H2O2(過氧化氫溶液)。就像表2表示的那樣，半乳凝素9對Jurkat細胞株、K-562細胞表現(xiàn)出明顯的毒害細胞活性，而對正常淋巴細胞沒有表現(xiàn)出傷害活性。
表2

(2)由半乳凝素9引起的癌細胞凋亡用PI法進行凋亡的測定。將與半乳凝素9一起培養(yǎng)的細胞洗凈后，用乙醇固定，片段化的DNA流到細胞外。然后，與PI一起進行溫育處理時，凋亡細胞熒光強度變低。通過該細胞的比例研究凋亡。就像圖10所表示的那樣，由于在與半乳凝素9一起共培養(yǎng)72小時的惡性黑素瘤細胞MM-RU中強烈地誘導(dǎo)凋亡，所以表明半乳凝素9誘導(dǎo)癌細胞凋亡。該凋亡與作為陽性對照使用的H2O2(過氧化氫溶液)同等。另外，通過其它的凋亡測定法TUNEL法也得到同樣的結(jié)果。然后對于其它的惡性腫瘤細胞也進行能否看到由半乳凝素9引起的凋亡誘導(dǎo)進行研究，結(jié)果如表3所示。
表3

表3中，Jurkat以及MOLT-4是來自T細胞的惡性細胞、BALL-1是來自B細胞的惡性細胞、THP-1是來自acute monocytic leukemia的細胞、HL60是來自acute promyelotic leukemia的細胞、MM-RU是惡性黑素瘤細胞、MCF-7是乳腺癌細胞、KATO-III是胃癌細胞。在半乳凝素9存在下進行溫育處理至少進行48小時以上。由表3可知由半乳凝素9引起的凋亡在非上皮惡性細胞、上皮性惡性細胞中的任一種都可看到。Daudi細胞(B細胞)和HMC-1(肥大細胞)中都看不到凋亡的誘導(dǎo)。由此表明在細胞表面存在作為與凋亡的信號有關(guān)系的結(jié)合因子，而且與半乳凝素9結(jié)合因子沒有工序的因子。利用此，可以進行與凋亡有關(guān)的半乳凝素9結(jié)合分子的鑒定或利用它進行腫瘤增殖抑制技術(shù)的開發(fā)。
半乳凝素9在上皮性惡性細胞(癌)和非上皮惡性細胞(肉瘤或白血病等)所有細胞中表現(xiàn)出抗腫瘤活性。而在沒有被活化的正常的T細胞幾乎不表現(xiàn)出凋亡誘導(dǎo)活性。例如，在有1μM的半乳凝素9存在下，測定凋亡誘導(dǎo)活性的結(jié)果如下面表4所示那樣(表4中半乳凝素3也為1μM)。
表4

由此可以將半乳凝素9蛋白質(zhì)、半乳凝素9激動劑、半乳凝素9拮抗劑拮抗物質(zhì)、抗半乳凝素9結(jié)合蛋白抗體、抗半乳凝素9結(jié)合糖鏈抗體、半乳凝素產(chǎn)生·游離誘導(dǎo)物質(zhì)等用作對于正常細胞沒有作用，而對腫瘤細胞表現(xiàn)傷害活性、誘導(dǎo)凋亡的抗腫瘤劑(抗癌劑)使用。
實施例3(1)由半乳凝素9引起的癌轉(zhuǎn)移抑制活性在人黑素瘤細胞株中，在MM-BP和MM-RU中如果培養(yǎng)它們的細胞株，前者凝集，對胞巢形成性表現(xiàn)出增殖，而后者以游離的形式進行增殖。從人黑素瘤細胞株的MM-BP和MM-RU探取mRNA，通過RT-PCR法對半乳凝素的DNA量進行解析，結(jié)果表明在MM-BP和MM-RU中半乳凝素1和半乳凝素3的量沒有差異，而在半乳凝素9中只在胞巢形成性的MM-BP中明顯看到，但在以游離形式進行增殖的MM-RU中非常弱(圖11)。
乳腺癌細胞株MCF-7雖然是胞巢形成性的細胞MCF-7，但通過有限稀釋法制作亞克隆，建立不表現(xiàn)出明顯的胞巢形成性的MCF-7K-10株(圖12)。MCF-7雖然用Western blot法含有半乳凝素9，但在MCF-7K-10株中不能檢測半乳凝素9(圖13)。而通過免疫染色法主要在細胞質(zhì)中看到MCF-7的半乳凝素9。
RT-PCR根據(jù)T.Kageshita et al.，Int.J.Cancer，99809-816(2002)所述的方法進行。
MCF-7的細胞培養(yǎng)在添加谷氨酸鹽、10％胎牛血清(fetal bovineserum)以及盤尼西林和鏈霉素(ICN biomedicals，Aurora，OH，美國)的Dulbecco修飾Eagle′s培養(yǎng)基中進行，溫育使用5％CO2/37℃的條件。
Western blot解析象下面那樣進行取大約106個細胞，用含有150mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH7.5，0.5％NonidetP-40(Boehringer-Mannheim，GmbH，德國)，1mM PMSF(ICNbiomedicals)，50TIU抑酶肽(Wako，大阪，日本)以及50mg/ml亮抑酶肽(Calbiochem，San Diego，CA，美國)的溶解緩沖液處理，破壞細胞膜。將得到的上清液與2×樣品緩沖液(125mM Tris-HCl，pH6.8，20％丙三醇，2％2-巰基乙醇，4％SDS，0.02％溴酚藍)一起進行5分鐘煮沸處理，加到5-15％梯度膠，通過使用Mini-gel裝置(Bio-Rad，Richmond，CA，美國)的SDS/PAGE進行分離處理。被分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore，Bedford，MA，美國)上，在含有0.05％Tween 20(Sigma，St.Louis，MO，美國)的5％脫脂乳進行1小時封閉處理后，與2μg/ml的抗半乳凝素-9抗體(α-galectin-9CT)液(5ml)一起進行溫育處理。然后用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊的抗兔IgG抗體(Amarsham，Buckinghamshire，UK)處理，通過ECL系統(tǒng)(Amarsham)使帶可視化。
免疫染色象下面那樣進行為了用抗半乳凝素-9多克隆抗體(α-galectin-9CT)對福爾馬林固定石蠟?zāi)ぐ窠M織切片進行免疫組織化學(xué)染色，使用DAKO EnVision+TM，過氧化物酶，兔系統(tǒng)，按照試劑盒制造業(yè)者的指示書進行操作。對4μm的福爾馬林固定石蠟?zāi)ぐ窠M織切片進行脫石蠟化以及在再水合化之前于抗原再生用的檸檬酸鹽緩沖液(10mM)中進行16分鐘煮沸處理。用0.3％過氧化物處理，使內(nèi)因性的過氧化物酶活性消失之后，將該切片用5％牛血清白蛋白(BSA)進行處理2小時，于室溫下對非特異染色進行封閉。將該組織切片與第一抗體一起溫育處理過夜，然后于室溫下與含有抗兔IgG以及辣根過氧化物酶(使兩者都結(jié)合于聚合物上)的EnVision+TM液一起進行溫育處理1小時。使用3，3′-二氨基聯(lián)苯胺·四氫化氯作為發(fā)色劑。作為陰性對照使用來自免疫前的兔得到的血清中的免疫球蛋白級分(DAKO)。所有的切片再用Giemsa液進行復(fù)染，對于各個切片中的每一個，二人的觀察者分別求被染色的腫瘤細胞的比率，將比50％大的值的細胞染色作為陽性染色。
(2)由半乳凝素9引起的細胞凝集誘導(dǎo)由外部向MM-RU添加向大腸桿菌導(dǎo)入基因后制作的重組半乳凝素9，就半乳凝素9的作用效果進行研究，結(jié)果表明用半乳凝素9從0.1μM濃度開始誘導(dǎo)MM-RU的凝集。而其凝集程度依賴于濃度，在0.3～1.0μM顯著。另外凝集在添加半乳凝素9后2小時可看到，12小時后看到強的凝集(圖14)。作為對照使用的半乳凝素1和半乳凝素3至少在1μM的濃度也沒有誘導(dǎo)明顯的凝集。
將半乳凝素9基因?qū)胗扇橄侔┘毎杲⒌腗CF-7 K-10株，該細胞在細胞質(zhì)中帶有半乳凝素9的同時，進行培養(yǎng)時，一邊表現(xiàn)出明顯的胞巢形成性，一邊進行增殖(圖15)。
人半乳凝素9的三個亞型、即半乳凝素-9S、半乳凝素-9M、半乳凝素-9L的表達載體的構(gòu)建將具有編碼各個半乳凝素的區(qū)域全部、而且在其起始密碼子的上游附加7個核苷酸的cDNA插入到pBK-CMV(Stratagene)的EcoRI-XhoI位點進行。半乳凝素9向細胞的導(dǎo)入使用Fugene 6轉(zhuǎn)染試劑(Roche Molecular Medicals)，按照試劑制造業(yè)主的程序進行導(dǎo)入。MCF-7K-10株細胞對于以pBK-CMV質(zhì)粒單獨轉(zhuǎn)染的細胞，以及用帶有人半乳凝素9cDNA的載體轉(zhuǎn)染的細胞進行試驗。細胞在2周內(nèi)用800μg/ml的G418進行選擇處理。
這樣一來，顯然半乳凝素9對于轉(zhuǎn)移性惡性細胞進行凝集誘導(dǎo)作用，具有癌等的惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移抑制活性，作為癌轉(zhuǎn)移抑制劑是有用的。由這樣的事實，通過半乳凝素9蛋白質(zhì)或其衍生物、或半乳凝素9基因?qū)牖蛘T導(dǎo)半乳凝素9的產(chǎn)生·游離可以獲得癌轉(zhuǎn)移抑制作用，以及提供癌轉(zhuǎn)移抑制劑。
人半乳凝素9一方面對腫瘤細胞表現(xiàn)出毒害細胞活性，另一方面對正常細胞不表現(xiàn)出毒害細胞活性引人注目。另外，人半乳凝素9雖然誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，但不誘導(dǎo)正常細胞凋亡。另外，人半乳凝素9不誘導(dǎo)非活性化T細胞的凋亡，而誘導(dǎo)活化的T細胞的凋亡。由此表明半乳凝素9作為抗腫瘤劑、抗過敏劑、免疫抑制劑、自身免疫疾病用劑、抗炎癥劑以及/或腎上腺皮質(zhì)類固醇激素替代劑是有用的。在本發(fā)明中，已經(jīng)確認(rèn)人半乳凝素9影響由DEX、抗Fas抗體以及依托泊甙誘起的凋亡的作用和效果，由此確認(rèn)人半乳凝素9在上述用途中非常有用。
實施例4對MOLT-4(人T細胞)(約7.25×109個細胞，濕重約18g)反復(fù)進行凍融，進行細胞破碎處理。將得到的細胞破碎處理物進行洗滌處理(含200mM乳糖(lac)液)，進行勻漿處理，使細胞破碎液勻一化。進行離心分離，回收沉淀物(塊)。使用表面活性劑，進行沉淀物的可溶化。作為代表性的表面活性劑，使用Triton(商品名)進行沉淀物的可溶化。離心處理后回收上清。然后將得到的上清加到GST-柱(非特異性吸附柱)。收集通過柱子的級分。然后將通過GST-柱通過液添加到GST-gal9CT柱，使半乳凝素特異吸附。將柱子洗滌后，使含200mM乳糖(lac)液通過柱子，使半乳凝素9CT(galectin 9CT)與細胞含有蛋白質(zhì)的結(jié)合解離。來自懸浮液gal9CT柱的細胞(MOLT-4)的蛋白質(zhì)的SDS-PAGE的結(jié)果如圖16所示。
對于圖16所示的各個級分1～12以及A、B、C、D它們中含有的蛋白質(zhì)進行解析。解析委托株式會社APRO Life Science Institute(德島縣鳴門市瀨戶町)進行。對于帶A、B、C、D它們中含有的蛋白質(zhì)進行解析，對于帶1～12進行質(zhì)量分析(LC-MS/MS)，對候補進行鑒定。首先，在蛋白質(zhì)的內(nèi)部序列解析中，將上述通過SDS-PAGE分離的帶得到的樣品用蛋白酶有限分解(例如，凝膠消化)，得到的蛋白酶有限分解樣品大于1pmol時，利用反向HPLC進行肽的分離處理(肽作圖)后，使用序列分析儀進行氨基酸序列分析，當(dāng)?shù)玫降牡鞍酌赣邢匏鈽悠反笥?.1pmol時，用質(zhì)量分析儀(LC-MS/MS)進行分析，進行數(shù)據(jù)庫研究。通過Mascot search對該蛋白質(zhì)進行記分化，記分高的值(開始值或更高值)作為候補，進行篩選。關(guān)于Mascot search由Matrix Science Ltd.可以獲得更詳細的信息(http//www.matrixscience.com/)。Mascot是以Mowse算法(D.J.C.Pappin，et al.，Curr.Biol.，3，327-332(1993))作為基礎(chǔ)商品化的產(chǎn)物。
作為氨基酸序列分析儀，可以使用Procise 494HT(AppliedBiosystems)，Hewlett-Packard G1005A，島津PSQ-1(梯度系統(tǒng))，Procise 494cLC(Applied Biosystems)等。數(shù)據(jù)庫可以使用NCBInr(Protein)，dbEST(DNA)。作為LC-MS/MS儀器如Q-TOF2&毛細管HPLC等。因場合不同，也可以進行MALDI-TOF MS分析，也可以利用MS-Fit檢索。MALDI-TOF MS分析可以利用Voyager-DE STR等。
<結(jié)果>
至于質(zhì)量分析(LC-MS/MS)，就所有前體離子得到的產(chǎn)物離子的數(shù)值通過Mascot以所有的生物種(all entries)為對象進行數(shù)據(jù)庫(NCBInr)檢索。在NCBInr數(shù)據(jù)庫，除了消化酶或人角蛋白以外，在有意義的記分沒有達到的場合在dbEST數(shù)據(jù)庫(以人、小鼠、其它動物為對象)中進行檢索。
以有意義的記分標(biāo)的的蛋白質(zhì)，按照Mascot Search Results的標(biāo)的編號表示如下。在同一的標(biāo)的編號中，有許多蛋白質(zhì)達到時，對代表性蛋白質(zhì)(主要選擇與樣品同一的生物種)進行記載。而使用的消化酶或人角蛋白(來自操作上的污染)達到時從數(shù)據(jù)中除去。
另外，在NCBI主頁(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)通過輸入“gi|”后的數(shù)字，可以獲得蛋白質(zhì)信息以及編碼基因信息。
帶1超過[NCBInr(all entries)]47分的為有意義(1)蛋白質(zhì)名4F2重鏈抗原來源 人總分 153肽匹配 5數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|177216序列覆蓋 12％(2)蛋白質(zhì)名ATPase，Na+/K+轉(zhuǎn)運，α1多肽來源 人總分 150肽匹配 4數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|21361181序列覆蓋 5％(3)蛋白質(zhì)名鈉依賴性中性氨基酸轉(zhuǎn)運類型2截短的異構(gòu)體來源 人總分 134肽匹配 4數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|15004317序列覆蓋 8％(5)蛋白質(zhì)名基質(zhì)細胞衍生因子受體1異構(gòu)體a來源 人總分 57肽匹配 1數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|9257240序列覆蓋 3％
(6)蛋白質(zhì)名熱休克90kDa蛋白1，β來源 人總分 46肽匹配 1數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|20149594序列覆蓋 3％帶2超過[NCBInr(all entries)]47分的為有意義(1)蛋白質(zhì)名熱休克70kDa蛋白5(葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白，78kDa)來源 人總分 227肽匹配 8數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|16507237序列覆蓋 21％(3)蛋白質(zhì)名熱休克70kDa蛋白8異構(gòu)體2來源 人總分 192肽匹配 5數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|24234686序列覆蓋 20％(4)蛋白質(zhì)名熱休克70kDa蛋白9B前體來源 人總分 182肽匹配 3數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|24234688
序列覆蓋 6％(16)蛋白質(zhì)名脂肪酸輔酶A連接酶，長鏈3來源 人總分 64肽匹配4數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|27469830序列覆蓋 6％(21)蛋白質(zhì)名NADH脫氫酶(泛醌)Fe-S蛋白1，75kDa NADH-輔酶Q還原酶)來源 人總分 55肽匹配2數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|4826856序列覆蓋 3％帶3超過[NCBInr(all entries)]47分的為有意義(4)蛋白質(zhì)名S-腺苷高半胱氨酸水解酶-like 1來源(生物)人總分 100肽匹配3數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|21361647序列覆蓋 11％(5)蛋白質(zhì)名分子伴侶GroEL來源(生物)大腸桿菌0157
總分 91肽匹配 3數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|15834378序列覆蓋 11％(6)蛋白質(zhì)名程序性細胞死亡8異構(gòu)體1來源(生物) 人總分 78肽匹配 3數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|4757732序列覆蓋 5％(8)蛋白質(zhì)名60kDa熱休克蛋白，線粒體前體來源(生物) 人總分 66肽匹配 1數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|129379序列覆蓋 3％(9)蛋白質(zhì)名ATP合酶，H+轉(zhuǎn)運，線粒體F1復(fù)合物，α亞基，異構(gòu)體1，心肌來源(生物) 人總分 61肽匹配 1數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|4757810序列覆蓋 2％(9)蛋白質(zhì)名[內(nèi)質(zhì)網(wǎng)]核糖體結(jié)合糖蛋白II前體來源(生物) 人總分55肽匹配 3數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|88567序列覆蓋10％帶5超過[NCBInr(all entries)]47分的為有意義(1)蛋白質(zhì)名法尼基-二磷酸法尼基轉(zhuǎn)移酶1來源人總分345肽匹配 6數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|4758350序列覆蓋18％(2)蛋白質(zhì)名泛醇-細胞色素C還原酶復(fù)合物核心蛋白2，線粒體前體來源人總分222肽匹配 6數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|21903482序列覆蓋17％(3)蛋白質(zhì)名長醇基-二磷酸寡糖-蛋白糖基轉(zhuǎn)移酶來源人總分158肽匹配 4數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|21104416序列覆蓋19％
(4)蛋白質(zhì)名鈣結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白來源 人總分 83肽匹配2數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|6841066序列覆蓋 6％(5)蛋白質(zhì)名NADH脫氫酶-泛醌Fe-S蛋白2前體來源 人總分 71肽匹配2數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|3540239序列覆蓋 8％(6)蛋白質(zhì)名肌動蛋白，β來源 人總分 57肽匹配3數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|14250401序列覆蓋 18％(10)蛋白質(zhì)名翻譯延伸因子EF-Tu-類蛋白P43前體，線粒體來源 人總分 47肽匹配1數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|7443384序列覆蓋 3％帶6
超過[NCBInr(all entries)]47分的為有意義(1)蛋白質(zhì)名肌動蛋白，β來源(生物)人總分 306肽匹配12數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|14250401序列覆蓋 45％(4)蛋白質(zhì)名半乳凝素9，短異構(gòu)體來源(生物)人總分 245肽匹配4數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|4504987序列覆蓋 15％(16)蛋白質(zhì)名GSTmFra2/2-327來源(生物)表達載體pGH/F2.2-327總分 139肽匹配4數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|3002516序列覆蓋 13％(24)蛋白質(zhì)名ATP合酶，H+轉(zhuǎn)運，線粒體F1復(fù)合物，α亞基，異構(gòu)體1，心肌來源(生物)人總分 103肽匹配1數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|4757810序列覆蓋 2％
帶7超過[NCBInr(all entries)]47分的為有意義(1)蛋白質(zhì)名metaxin 1來源 人總分 63肽匹配 1數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|4505281序列覆蓋 4％(2)蛋白質(zhì)名sideroflexin 1來源 人總分 62肽匹配 2數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|23618867序列覆蓋 9％(3)蛋白質(zhì)名TCR β鏈來源 人總分 60肽匹配 1數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|2982508序列覆蓋 5％(4)蛋白質(zhì)名Hnrnp A1來源 人總分 55肽匹配 1數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|2194069
序列覆蓋 8％帶8超過[NCBInr(all entries)]47分的為有意義(1)蛋白質(zhì)名磷酸載體前體異構(gòu)體1b來源 人總分 222肽匹配 8數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|4505775序列覆蓋 31％(2)蛋白質(zhì)名sideroflexin 1來源 人總分 204肽匹配 5數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|23618867序列覆蓋 24％(3)蛋白質(zhì)名ATP合酶，H+轉(zhuǎn)運，線粒體F1復(fù)合物，γ多肽1，來源 人總分 112肽匹配 2數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|4885079序列覆蓋 8％(4)蛋白質(zhì)名電壓依賴性陰離子通道1來源 人總分 65肽匹配 2
數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|4507879序列覆蓋10％(5)蛋白質(zhì)名透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白前體來源人總分62肽匹配 2數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|8699626序列覆蓋19％(6)蛋白質(zhì)名雄激素調(diào)節(jié)的短鏈脫氫酶/還原酶1來源人總分58肽匹配 1數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|20070798序列覆蓋4％(7)蛋白質(zhì)名溶質(zhì)載體家族25(線粒體載體；酮戊二酸載體)，member11來源人總分55肽匹配 3數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|21361114序列覆蓋11％(8)蛋白質(zhì)名3-羥基丁酸脫氫酶前體來源人總分52肽匹配 1
數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|17738292序列覆蓋4％(9)蛋白質(zhì)名B-細胞受體相關(guān)蛋白來源人總分49肽匹配 2數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|1673514序列覆蓋8％帶9超過[NCBInr(all entries)]47分的為有意義(1)蛋白質(zhì)名ATP合酶，H+轉(zhuǎn)運，線粒體F1復(fù)合物，O亞基，來源人總分255肽匹配 7數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|4502303序列覆蓋39％(2)蛋白質(zhì)名ATP合酶，H+轉(zhuǎn)運，線粒體F0復(fù)合物，亞基d，來源人總分217肽匹配 8數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|5453559序列覆蓋55％(3)蛋白質(zhì)名ATP合酶，H+轉(zhuǎn)運，線粒體F0復(fù)合物，亞基b，異構(gòu)體1來源人總分139肽匹配 4數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|21361565序列覆蓋24％(4)蛋白質(zhì)名小的GTP-結(jié)合蛋白來源人總分111肽匹配 2數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|13569962序列覆蓋15％(6)蛋白質(zhì)名NADH脫氫酶(泛醌)Fe-S蛋白8，23kDa NADH-輔酶Q還原酶)來源人總分79肽匹配 2數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|4505371序列覆蓋28％(7)蛋白質(zhì)名小泡運輸?shù)鞍譻ec22b來源人總分76肽匹配 1數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|4759086序列覆蓋6％帶11超過[NCBInr(all entries)]46分的為有意義
(1)蛋白質(zhì)名線粒體輸入受體Tom22來源 人總分 223肽匹配7數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|9910382序列覆蓋 51％(2)蛋白質(zhì)名信號肽受體，δ來源 人總分 159肽匹配3數(shù)據(jù)庫上的鑒定編號gi|5454090序列覆蓋 19％內(nèi)部序列解析的結(jié)果帶A+B蛋白質(zhì)名ATP合酶，α鏈肽匹配 5添加數(shù)據(jù) gi|114517或P25705序列覆蓋 10.13％C蛋白質(zhì)名 ATP合酶，β鏈肽匹配 4添加數(shù)據(jù) gi|114549或P06576序列覆蓋 8.13％蛋白質(zhì)名 鈉/鉀-轉(zhuǎn)運ATPaseβ-3鏈肽匹配 1添加數(shù)據(jù) gi|1703470或P54709序列覆蓋 3.23％
D蛋白質(zhì)名 ADP，ATP載體蛋白肽匹配 4添加數(shù)據(jù)gi|113463或P12236gi|113459或P05141gi|113455或P12235序列覆蓋14.43％4蛋白質(zhì)名 泛醇-細胞色素C還原酶復(fù)合物核心蛋白1肽匹配 1添加數(shù)據(jù)gi|731047或P31930序列覆蓋2.29％10蛋白質(zhì)名 細胞色素c氧化酶多肽II肽匹配 1添加數(shù)據(jù)gi|117020或P00403序列覆蓋2.64％上述被鑒定的候補半乳凝素9結(jié)合分子再象以下那樣進行與半乳凝素9的相互作用的解析，作為半乳凝素9結(jié)合分子可以對最適合的分子進行鑒定，另外對于其功能也可以進行解析、闡明。
①免疫沉降法加半乳凝素9，使它與細胞反應(yīng)后，對細胞進行溶解處理，制備細胞提取液。如果細胞內(nèi)存在與半乳凝素9結(jié)合的物質(zhì)，應(yīng)當(dāng)以與半乳凝素9結(jié)合的狀態(tài)存在于細胞提取液中。使掛在凝膠等上的抗半乳凝素9抗體與細胞提取液反應(yīng)，使抗半乳凝素9抗體結(jié)合?；蚴沟鞍譇等與抗半乳凝素9抗體結(jié)合后，經(jīng)離心分離處理，與抗體一起使半乳凝素9沉降。此時，如果存在與半乳凝素9結(jié)合的蛋白質(zhì)，由于也與抗體一起沉降，所有可以進行鑒定。沉降物被適當(dāng)洗滌處理，或根據(jù)場合不同被變性，例如進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，根據(jù)需要轉(zhuǎn)移到膜等后，可以通過Western blotting檢測。
②West western法或far-Western法(包括配體印跡法等)1.對細胞蛋白質(zhì)提取液進行電泳，轉(zhuǎn)移到膜(PVDF等)上。
2.對半乳凝素9進行標(biāo)記，使其與膜上蛋白質(zhì)進行特異結(jié)合。
3.通過檢測標(biāo)記，可知半乳凝素9的結(jié)合的蛋白質(zhì)的分布(通過使用來自任意組織的細胞，可知與哪個組織結(jié)合的蛋白質(zhì)是否存在)、局部存在(使用細胞質(zhì)、細胞膜等的組分)、分子量。
而對于半乳凝素9的標(biāo)記，可無限制地使用眾所周知的手法，例如以下的方法。
A.125I或3H等RI進行檢測。
B.用生物素進行標(biāo)記，用鏈抗生物素蛋白進行檢測。
C.用熒光物質(zhì)進行標(biāo)記，檢測其激發(fā)光或發(fā)色光。
D.對半乳凝素9進行磷酸化標(biāo)記，用抗磷酸化抗體進行檢測。
E.使Tag(Flag、His、GST等)與半乳凝素9融合，用針對Tag的抗體進行檢測。
③分子加交聯(lián)法1.將半乳凝素9添加到培養(yǎng)細胞后，加化學(xué)交聯(lián)劑，增強半乳凝素9與靶蛋白的結(jié)合。
2.將細胞溶解，用SDS-PAGE從得到的蛋白質(zhì)提取液分離半乳凝素9結(jié)合蛋白質(zhì)。
3.靶蛋白質(zhì)的檢測使用抗半乳凝素9抗體，用Western blotting或免疫沉降法等進行。
④表達克隆法1.用大腸桿菌的表達克隆法
a.使用大腸桿菌，使作為候補的蛋白質(zhì)表達。
b.將表達候補蛋白質(zhì)的大腸桿菌重組體溶解，制備蛋白質(zhì)提取液。
c.對大腸桿菌提取液進行電泳，通過Western blotting法或抗半乳凝素9抗體進行檢測。用于檢測的標(biāo)記方法使用與West-Western法同樣的方法。
2.使用大腸桿菌和噬菌體的表達克隆法a.使表達任意蛋白質(zhì)的噬菌體(噬菌體文庫)感染大腸桿菌。
b.將噬菌體重組體轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，使蛋白質(zhì)表達。
c.將標(biāo)記的半乳凝素9添加到硝酸纖維素膜上，對結(jié)合的表達蛋白質(zhì)的噬菌體重組體進行鑒定。
d.從噬菌體重組體可以知道與半乳凝素9結(jié)合的蛋白質(zhì)的cDNA。
3.用培養(yǎng)細胞的表達克隆法a.將作為候補的蛋白質(zhì)的cDNA導(dǎo)入到培養(yǎng)細胞，使候補蛋白質(zhì)表達。
b.將半乳凝素9添加到培養(yǎng)細胞進行培養(yǎng)后，為了除去非特異性結(jié)合的半乳凝素9，對細胞進行清洗。
c.使用熒光物質(zhì)或發(fā)色劑標(biāo)記的半乳凝素9反應(yīng)，半乳凝素9與表達的蛋白質(zhì)是否結(jié)合用ELISA或FACS(讀取熒光或發(fā)光物質(zhì)的方法以及機械·儀器)檢測。
⑤Two-Hybrid system本系統(tǒng)是以報告基因的轉(zhuǎn)錄活性作為指標(biāo)，對酵母內(nèi)兩個蛋白質(zhì)間的相互作用進行檢測的系統(tǒng)。本法的特征是可以對酵母生物體內(nèi)(invivo)兩個蛋白質(zhì)間的相互作用進行檢測，可以進行弱的一時的相互作用也能夠檢測的高靈敏度的分析。另外，還具有在對相互作用進行檢測階段，不需要蛋白質(zhì)的純化或抗體。
作為操作步驟1.使半乳凝素9基因(bait)與DNA結(jié)合蛋白質(zhì)(DNA-BD)融合的融合基因以及編碼認(rèn)為與使該基因進行相互作用的候補蛋白質(zhì)的基因(prey)與轉(zhuǎn)錄活性化基因(DNA-AD)融合后的基因雙方在酵母內(nèi)進行表達。
2.檢測轉(zhuǎn)錄活性的報告基因整合到酵母的染色體中，可以開發(fā)、利用各種各樣的報告基因，這樣的基因可以沒有限制地利用。該報告基因可以使用通常營養(yǎng)性功能基因或lacZ基因。
3.在酵母細胞內(nèi)只有半乳凝素9(bait)與候補的蛋白質(zhì)(prey)進行相互作用時，融合的轉(zhuǎn)錄活性化基因起作用，報告基因上游的轉(zhuǎn)錄被活化，可使靶基因表達。
4.實際上，通過培養(yǎng)板上的營養(yǎng)要求性的恢復(fù)或β半乳糖苷酶活性的測定檢測相互作用。即，在預(yù)先設(shè)置為在進行相互作用時，酵母細胞增殖，而在不相互作用時，酵母不增殖的培養(yǎng)條件，可以通過β半乳糖苷酶引起的發(fā)色進行檢測。
另外，除了在酵母內(nèi)對兩個蛋白質(zhì)間的相互作用進行檢測的系統(tǒng)之外，還有使用哺乳動物細胞的系統(tǒng)。這樣的系統(tǒng)也可以沒有限制地使用。
⑥噬菌體顯示法噬菌體顯示可用于鑒定具有與其它分子相互作用的蛋白質(zhì)或肽。
作為步驟1.將DNA插入噬菌體基因組，以與噬菌體衣殼蛋白質(zhì)(包被噬菌體DNA的表面蛋白質(zhì))融合的狀態(tài)時作為候補的蛋白質(zhì)在噬菌體分子的表面提示。
2.使噬菌體與包被于板表面的半乳凝素9反應(yīng)。將與半乳凝素9非特異結(jié)合的噬菌體重組體(表達蛋白質(zhì)的噬菌體)沖洗掉。
3.重復(fù)進行上述操作，從任意的噬菌體重組體的候補中只選擇表達具有與半乳凝素9特異相互作用的候補的分子的噬菌體，并進行濃縮。
4.由于可以從被選擇的噬菌體制備表達的蛋白質(zhì)的cDNA，所有也可以與基因、蛋白質(zhì)一起進行鑒定。
5.選擇時，再使用與包被半乳凝素9的96孔板進行相互作用的噬菌體，進行ELISA，可以從發(fā)色的強度選擇表達更強結(jié)合的蛋白質(zhì)的噬菌體。
⑦關(guān)于表面胞質(zhì)團共振法(使用BIAcore的方法)本Biacore的檢測系是采用表面胞質(zhì)團共振(Surface PlasmonResonance＝SPR)的光學(xué)現(xiàn)象的手法。這樣一來，伴隨著2分子間的結(jié)合與解離，在傳感器芯片表面產(chǎn)生的微量的質(zhì)量變化可作為SPR信號檢測。
本方法的原理如果象全反射那樣將光照到生物體分子的沒有固定化的一側(cè)的傳感器芯片(金薄膜)，在反發(fā)射光的一部分中可觀察到反射光強度低下的部分(SPR信號發(fā)生)。該光的暗部分出現(xiàn)的角度(＝折射率的變化)與傳感器芯片上的質(zhì)量有關(guān)。
當(dāng)向傳感器的表面的半乳凝素9(配體)添加候補蛋白質(zhì)(分析物)，就會引起結(jié)合反應(yīng)，發(fā)生質(zhì)量變化(＝質(zhì)量增)，光的暗的部分由I漂移到II?？芍?mm2如果結(jié)合1ng的物質(zhì)，I→II漂移0.1度。反之，由于解離如果質(zhì)量減少，II→I只返回0.1度。
在Biacore中，由I向II漂移的量、即可以將以傳感器芯片表面的質(zhì)量變化作為縱軸，而將質(zhì)量的時間變化作為測定數(shù)據(jù)表示(傳感器圖)。縱軸的單位用共振單位(＝RU Resonance Unit)表示，表示相當(dāng)于1RU＝1pg/mm2。
不僅可以進行生物體分子標(biāo)記，而且可以實時觀察相互作用。
步驟如下1.將半乳凝素9(稱為配體)固定在傳感器芯片上。
2.將含有認(rèn)為有作用的候補蛋白質(zhì)(稱為分析物)的溶液以一定的流速輸送到傳感器芯片上。
3.當(dāng)半乳凝素9與候補蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合和解離，其信號可以作為表面胞質(zhì)團共振被檢測。
4.由于結(jié)合的強度可以根據(jù)信號的強弱定量，所有可以鑒定與半乳凝素9具有更強相互作用的蛋白質(zhì)。
⑧熒光偏光法熒光偏光法對于溶液中的糖鏈-蛋白質(zhì)、抗原-抗體或蛋白質(zhì)間相互作用不進行固定化或示蹤分子的分離作業(yè)，而可以直接分析它們的相互作用。
本熒光偏光法的原理是液體中的熒光標(biāo)記的半乳凝素9分子被平面偏光一激發(fā)，在同一平面上發(fā)偏光熒光。然而，在激發(fā)狀態(tài)中由于布朗運動導(dǎo)致旋轉(zhuǎn)，向與激發(fā)平面不同的平面發(fā)熒光，熒光偏光被解除。即所謂熒光偏光度應(yīng)當(dāng)表示在從被激發(fā)開始直至發(fā)出熒光的期間，熒光性分子進行旋轉(zhuǎn)的程度。一般通過熒光性探針被標(biāo)記的小的分子在溶液中由于布朗運動激烈旋轉(zhuǎn)，表現(xiàn)出低的偏光度。另外，其它的蛋白質(zhì)分子一結(jié)合，溶液中的布朗運動減少，偏光度上升。因此，通過偏光法以偏光度的變化為指標(biāo)，應(yīng)當(dāng)可以解析溶液中的蛋白質(zhì)間相互作用。
步驟如下1.測定進行了熒光標(biāo)記的半乳凝素9的熒光偏光度。
2.加其它蛋白質(zhì)溶液，檢測由于結(jié)合進行熒光標(biāo)記的半乳凝素9發(fā)出的熒光偏光有無變化。
3.更大偏光度變化時，作為候補蛋白質(zhì)的結(jié)合引起的變化，進行相互作用的蛋白質(zhì)的鑒定。
如上所述，被鑒定的半乳凝素9結(jié)合分子，利用它根據(jù)本說明書中公布的技術(shù)，可以在控制它的物質(zhì)的檢索中利用。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性通過本發(fā)明，半乳凝素9雖然對腫瘤細胞表現(xiàn)出毒害細胞活性或凋亡誘導(dǎo)活性，但對正常細胞由于不表現(xiàn)出傷害活性，而且不誘導(dǎo)凋亡，所以可將半乳凝素9蛋白質(zhì)、半乳凝素9激動劑、半乳凝素9拮抗劑拮抗物質(zhì)、抗半乳凝素9結(jié)合蛋白抗體、抗半乳凝素9結(jié)合糖鏈抗體、半乳凝素9產(chǎn)生·游離誘導(dǎo)物質(zhì)等用作對于正常細胞沒有作用，而對腫瘤細胞表現(xiàn)傷害活性、誘導(dǎo)凋亡的抗腫瘤劑(抗癌劑)的技術(shù)的開發(fā)變?yōu)榭赡堋?br> 另外，人半乳凝素9不誘導(dǎo)非活化(靜息)T細胞、特別是CD4陽性T細胞(協(xié)助者T細胞)的凋亡，但顯著誘導(dǎo)活化CD4陽性T細胞(協(xié)助者T細胞)的凋亡，活化CD8陽性T細胞(抑制者T細胞和毒害細胞性T細胞)的凋亡與半乳凝素1或半乳凝素3相比，誘導(dǎo)更強烈，而且與糖皮質(zhì)激素(地塞米松)同樣的途徑，即受體→鈣流入→鈣激活蛋白酶→半胱天冬酶1→半胱天冬酶3以及7這一途徑誘導(dǎo)凋亡，半乳凝素9可以作為抗炎劑、抗過敏劑和免疫抑制劑利用，由于半乳凝素9蛋白質(zhì)、半乳凝素9基因?qū)牒屯ㄟ^誘導(dǎo)半乳凝素9作為副作用少的免疫抑制劑使用，和通過與它并用，可以減少糖皮質(zhì)激素等的用量，結(jié)果也可以使副作用變少。這樣一來，可以提供通過半乳凝素9、其類似物等的利用、對半乳凝素9的生物體內(nèi)濃度、或表達進行控制，可以提供抗腫瘤劑、抗過敏劑、免疫抑制劑、自身免疫疾病用劑、抗炎癥劑以及腎上腺皮質(zhì)類固醇激素替代用活性成分劑。另外，利用半乳凝素9，可以應(yīng)用于糖皮質(zhì)激素表現(xiàn)出的藥理作用·生物活性的領(lǐng)域。
本發(fā)明除了上述說明以及實施例特別記載的以外，顯然可以實施。鑒于上述的示范，本發(fā)明的許多的改變和變形都是可能的，因此這些也都是本申請所附的權(quán)利要求范圍的范圍內(nèi)的內(nèi)容。
權(quán)利要求
1.醫(yī)藥或動物藥，其特征在于，(i)含有從(a)半乳凝素9及其類似物、(b)編碼半乳凝素9以及實質(zhì)上具有與其均等的生物活性的多肽的多核苷酸、(c)半乳凝素9產(chǎn)生以及釋放的誘導(dǎo)因子(d)抗半乳凝素9受體抗體、以及(e)針對半乳凝素9結(jié)合性糖鏈的抗體選出來的成分作為有效成分，(ii)所述藥物選自抗腫瘤劑、抗過敏劑、免疫抑制劑、自身免疫疾病用劑、抗炎癥劑以及腎上腺皮質(zhì)類固醇激素替代用活性成分。
2.抗腫瘤劑，其特征在于，含有半乳凝素9或其類似物肽作為有效成分。
3.抗過敏劑，其特征在于，含有半乳凝素9或其類似物肽作為有效成分。
4.免疫抑制劑，其特征在于，含有半乳凝素9或其類似物肽作為有效成分。
5.自身免疫疾病用劑，其特征在于，含有半乳凝素9或其類似物肽作為有效成分。
6.抗炎癥劑，其特征在于，含有半乳凝素9或其類似物肽作為有效成分。
7.腎上腺皮質(zhì)類固醇激素替代劑，其特征在于，含有半乳凝素9或其類似物肽作為有效成分。
8.惡性毒害細胞劑，其特征在于，含有從(a)半乳凝素9及其類似物，以及(b)編碼半乳凝素9以及實質(zhì)上具有與其均等的生物活性的多肽的多核苷酸選出來的成分作為有效成分。
9.癌轉(zhuǎn)移抑制劑，其特征在于，含有從(a)半乳凝素9及其類似物，以及(b)編碼半乳凝素9以及實質(zhì)上具有與其均等的生物活性的多肽的多核苷酸選出來的成分作為有效成分。
10.對腫瘤細胞表現(xiàn)出毒害細胞活性的藥劑，其特征在于，(i)含有從(a)半乳凝素9及其類似物、(b)編碼半乳凝素9以及實質(zhì)上具有與其均等的生物活性的多肽的多核苷酸、(c)半乳凝素9產(chǎn)生以及釋放的誘導(dǎo)因子(d)抗半乳凝素9受體抗體、以及(e)針對半乳凝素9結(jié)合性糖鏈的抗體選出來的成分作為有效成分。
11.對腫瘤細胞誘導(dǎo)凋亡的藥劑，其特征在于，(i)含有從(a)半乳凝素9及其類似物、(b)編碼半乳凝素9以及實質(zhì)上具有與其均等的生物活性的多肽的多核苷酸、(c)半乳凝素9產(chǎn)生以及釋放的誘導(dǎo)因子(d)抗半乳凝素9受體抗體、以及(e)針對半乳凝素9結(jié)合性糖鏈的抗體選出來的成分作為有效成分。
12.對免疫細胞、例如活化T細胞誘導(dǎo)凋亡的藥劑，其特征在于，(i)含有從(a)半乳凝素9及其類似物、(b)編碼半乳凝素9以及實質(zhì)上具有與其均等的生物活性的多肽的多核苷酸、(c)半乳凝素9產(chǎn)生以及釋放的誘導(dǎo)因子(d)抗半乳凝素9受體抗體、以及(e)針對半乳凝素9結(jié)合性糖鏈的抗體選出來的成分作為有效成分。
13.對起因于活化T細胞的疾病或病的癥狀的預(yù)防和/或治療劑，其特征在于，(i)含有從(a)半乳凝素9及其類似物、(b)編碼半乳凝素9以及實質(zhì)上具有與其均等的生物活性的多肽的多核苷酸、(c)半乳凝素9產(chǎn)生以及釋放的誘導(dǎo)因子(d)抗半乳凝素9受體抗體、以及(e)針對半乳凝素9結(jié)合性糖鏈的抗體選出來的成分作為有效成分。
14.半乳凝素9結(jié)合因子[括弧內(nèi)的數(shù)字指的是可以通過在NCBI的主頁(httpwww.ncbi.nlm.nih.gov/)輸入該數(shù)字獲得蛋白質(zhì)信息以及編碼他們的DNA等核酸序列的信息的數(shù)據(jù)庫上識別號]，其特征在于，所述結(jié)合因子選自4F2重鏈抗原(177216)；ATPase，Na+/K+轉(zhuǎn)運，α1多肽(21361181)；鈉依賴中性氨基酸轉(zhuǎn)運體類型2截短的異構(gòu)體(15004317)；基質(zhì)細胞衍生因子受體1異構(gòu)體a(9257240)；基質(zhì)細胞衍生因子受體1異構(gòu)體b，熱休克90kDa蛋白1，β(20149594)；熱休克90kDa蛋白1，α；熱休克70kDa蛋白5(葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白，78kDa)(16507237)，熱休克70kDa蛋白8異構(gòu)體2(24234686)，熱休克70kDa蛋白9B前體(2423688)；脂肪酸輔酶A連接酶，長鏈3(27469830)；NADH脫氫酶(泛醌)Fe-S蛋白1，75kDa(NADH-輔酶Q還原酶)(4826856)；S-腺苷高半胱氨酸水解酶-like1(21361647)；程序性細胞死亡8異構(gòu)體1(4757732)；60kDa熱休克蛋白，線粒體前體(129379)；ATP合酶，H+轉(zhuǎn)運，線粒體F1復(fù)合物，α亞基，異構(gòu)體1，心肌(4757810)；[內(nèi)質(zhì)網(wǎng)]核酮糖結(jié)合糖蛋白(ribophor)II前體(88567)；法尼基-二磷酸法尼基轉(zhuǎn)移酶1(4758350)；泛醇-細胞色素C還原酶復(fù)合物核心蛋白2，線粒體前體(21903482)；長醇基-二磷酸寡糖-蛋白糖基轉(zhuǎn)移酶(21104416)；鈣結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白(6841066)；NADH脫氫酶-泛醌Fe-S蛋白2前體(3540239)；肌動蛋白，β(14250401)；翻譯延伸因子EF-Tu-類蛋白P43前體，線粒體(7443384)；metaxin 1(4505281)；sideroflexin 1(23618867)；TCRβ鏈(2982508)；Hnrnp A1(2194069)；磷酸鹽載體前體異構(gòu)體1b(4505775)；ATP合酶，H+轉(zhuǎn)運，線粒體F1復(fù)合物，γ多肽1(4885079)；電壓依賴性陰離子通道1(4507879)；透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白前體(8699626)；雄激素調(diào)節(jié)的短鏈脫氫酶/還原酶1(20070798)；溶質(zhì)載體家族25(線粒體載體；酮戊二酸載體)，member11(21361114)；3-羥基丁酸鹽脫氫酶前體(17738292)；B-細胞受體相關(guān)蛋白(1673514)；ATP合酶，H+轉(zhuǎn)運，線粒體F1復(fù)合物，O亞基(4502303)；ATP合酶，H+轉(zhuǎn)運，線粒體F0復(fù)合物，亞基d(5453559)；ATP合酶，H+轉(zhuǎn)運，線粒體F0復(fù)合物，亞基b，異構(gòu)體1(21361565)；小的GTP結(jié)合蛋白(13569962)；NADH脫氫酶(泛醌)Fe-S蛋白8，23kDa(NADH-輔酶Q還原酶)(4505371)；小泡運輸?shù)鞍譻ec22b(4759086)；線粒體輸入受體Tom22(9910382)；信號序列受體，δ(5454090)；ATP合酶，α鏈(114517或P25705)；ATP合酶，β鏈(114549或P06576)；鈉/鉀-轉(zhuǎn)運ATPaseβ-3鏈(1703470或P54709)；ADP，ATP載體蛋白(113463，P12236，113459，P05141，113455，或P12235)；泛醇-細胞色素C還原酶復(fù)合物核心蛋白1(731047或P31930)以及細胞色素c氧化酶多肽II(117020或P00403)。
15.利用權(quán)利要求14所述的半乳凝素9結(jié)合因子與半乳凝素9之間的相互作用的半乳凝素9活性控制技術(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有半乳凝素9的醫(yī)藥。半乳凝素9一方面由于其定域不同，其生物學(xué)功能也各不相同，另一方面預(yù)測半乳凝素9與各種各樣的生物學(xué)功能有關(guān)，因此對其詳細的生物學(xué)活性進行闡明之后，尋求進行包括醫(yī)藥品開發(fā)在內(nèi)的半乳凝素9相關(guān)技術(shù)的開發(fā)。人半乳凝素9對腫瘤細胞表現(xiàn)出毒害細胞活性或凋亡誘導(dǎo)活性，但由于對正常細胞沒有表現(xiàn)出傷害活性，也不誘導(dǎo)凋亡，所以可將半乳凝素9蛋白質(zhì)、半乳凝素9激動劑、半乳凝素9拮抗劑拮抗物質(zhì)、抗半乳凝素9結(jié)合蛋白抗體、抗半乳凝素9結(jié)合糖鏈抗體、半乳凝素產(chǎn)生·游離誘導(dǎo)物質(zhì)等作為抗腫瘤劑、抗過敏劑、免疫抑制劑、自身免疫疾病用劑、抗炎癥劑以及腎上腺皮質(zhì)類固醇激素替代用活性成分劑開發(fā)。
文檔編號A61P35/00GK1744910SQ0382605
公開日2006年3月8日 申請日期2003年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月24日
發(fā)明者平島光臣, 西望, 山內(nèi)清明, 吉田尚子, 積正子 申請人:株式會社嘉爾藥物