專利名稱：補(bǔ)充癌癥治療所破壞細(xì)胞的方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及補(bǔ)充癌癥治療所破壞細(xì)胞的方法。
癌癥治療中采用化療最嚴(yán)重的副作用之一是患者因紅細(xì)胞喪失造成的能量喪失。在消滅癌細(xì)胞的過程中，化療經(jīng)常會(huì)破壞快速分化的細(xì)胞，如骨髓細(xì)胞。骨髓負(fù)責(zé)產(chǎn)生紅細(xì)胞、白細(xì)胞及血小板。骨髓活性下降稱為骨髓抑制?；熂胺派浏煼墒辜t細(xì)胞數(shù)降低至低水平，最后導(dǎo)致疲勞、能量不足及貧血。骨髓抑制是大部分有效化療藥物的劑量限制性(dose-limiting)毒性。近年來，通過使用SC移植(SCT)使這一限制得以克服。實(shí)際上，高劑量化療后實(shí)施SCT可以進(jìn)一步加速劑量強(qiáng)度，從而提高許多晚期惡性腫瘤患者的生存時(shí)間。然而，接受SCT治療的大部分患者經(jīng)歷更長時(shí)間的中性粒細(xì)胞減少癥及血小板減少癥，導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率上升。
有些人認(rèn)為疲勞是癌癥的第一副作用，癌癥患者中有72％～95％均有此癥狀。一些人稱之為“絕望(hitting a wall)”的癌癥患者所患慢性或急性疲勞不同于健康人群。它使人虛弱和消沉，影響正?；顒?dòng)，是享受人生樂趣的障礙。國立癌癥研究所將疲勞的社會(huì)影響描述為可能是“深遠(yuǎn)的”。
長期以來被低估的疲勞已變得更加突出，因?yàn)橹委熥兊酶咂茐男裕蛊诟訍夯?，而且由于健康專業(yè)人士已經(jīng)認(rèn)識(shí)到疲勞是治療的劑量限制性毒性，是可以定量和治療的副作用。其已成為嚴(yán)肅的研究主題，包括生物化學(xué)、病理生理學(xué)、生理學(xué)及行為學(xué)的變數(shù)(variable)。不幸的是，盡管醫(yī)學(xué)科學(xué)在治療癌癥本身方面平穩(wěn)進(jìn)步，但癌癥相關(guān)的疲勞經(jīng)常被忽視、低估，缺乏治療。除了感覺疲憊引起的不適外，疲勞可產(chǎn)生對(duì)處理癌癥和獲得可用治療的全部益處的許多障礙。疲勞可嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，限制可施用的化療周期數(shù)，這些均可限制治療的效果。
過去對(duì)于癌癥治療相關(guān)的疲勞的優(yōu)選治療是服用諸如依泊艾汀α(Procrit)的藥物，或是病情更嚴(yán)重時(shí)輸送紅細(xì)胞。
目前可用的藥物中如依泊艾汀α沒有一種可以使化療所至疲勞完全緩解。盡管這些藥物有助于減少一些問題并提供一定的緩解，其也有副作用，使患者產(chǎn)生一系列新的問題。同樣，通常只有在患者經(jīng)歷了疲勞的最嚴(yán)重反應(yīng)后才實(shí)施輸送紅細(xì)胞。
因此可以看出必須使癌癥化療或放射療法相關(guān)的疲勞降到最低，從而為正進(jìn)行癌癥治療的患者提供更好的生活質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是補(bǔ)充癌癥治療所破壞細(xì)胞的方法，該方法包括從靈長類哺乳動(dòng)物取出血細(xì)胞，使細(xì)胞在7天內(nèi)以產(chǎn)生至少為7倍的擴(kuò)增系數(shù)(expansion factor)的速度受控制地?cái)U(kuò)增，同時(shí)保持細(xì)胞的三維幾何形狀以及其細(xì)胞-細(xì)胞支持和細(xì)胞-細(xì)胞幾何位置，從血細(xì)胞中除去任意有毒物質(zhì)，并在一定時(shí)間內(nèi)把細(xì)胞重新導(dǎo)入靈長類哺乳動(dòng)物體內(nèi)，所述時(shí)間足以防止靈長類哺乳動(dòng)物因造血細(xì)胞或其他細(xì)胞喪失所致的能動(dòng)性(mobility)降低。癌癥治療的損害可來自骨髓移植、化療或放射療法。優(yōu)選的是在相當(dāng)短的時(shí)間內(nèi)實(shí)施細(xì)胞的重新導(dǎo)入，優(yōu)選為癌癥治療過程后一周內(nèi)，但不應(yīng)遲于癌癥治療過程后一個(gè)月。
本發(fā)明中，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落形成單位(CFU-GM)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-紅細(xì)胞-巨核細(xì)胞集落形成單位(CFU-GEMM)的數(shù)量到培養(yǎng)第7天時(shí)分別增加約7倍和約9倍，紅細(xì)胞爆式集落形成單位(BFU-E)的數(shù)量在培養(yǎng)到第5天時(shí)將增加約2.7倍。表達(dá)CD34+、CD34+/CD38+、CD34+/CD33+、CD34+/CD15+及CD34+/CD90+的細(xì)胞數(shù)目顯著增加，表達(dá)CD34+/CD38-和CD19表面抗原的細(xì)胞數(shù)目顯著減少。
重組造血生長因子為臨床醫(yī)生提供了有用的工具以治療患有化療誘導(dǎo)性骨髓抑制的患者。這些因子包括骨髓生長因子如粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，這些可以縮短中性粒細(xì)胞減少癥的持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重感染的發(fā)生率。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供補(bǔ)充癌癥治療所破壞細(xì)胞的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供使正在接受癌癥化療或放射治療的患者的疲勞減輕的方法。
這些和其他目的以及本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)將因下述優(yōu)選實(shí)施方案的說明變得一目了然。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明將通過下文所述優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行更全面的說明。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，造血細(xì)胞在癌癥患者進(jìn)行化療前從患者體中取出來。這里的血細(xì)胞指多能成體干細(xì)胞。將血細(xì)胞置于生物反應(yīng)器中，如美國專利5,702,941所述的生物反應(yīng)器，在此將其引入作為參考。以使血細(xì)胞保持懸浮的速度旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器容器，從而維持其三維幾何形狀以及其細(xì)胞-細(xì)胞支持和幾何位置。細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)的時(shí)侯，補(bǔ)給營養(yǎng)，并除去有毒物質(zhì)。將細(xì)胞擴(kuò)增到基本比起始細(xì)胞更多的體積。然后對(duì)患者實(shí)施化療。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，外周血(PB)細(xì)胞從正常干細(xì)胞(SC)供應(yīng)者獲得。簡要地說就是從SC供應(yīng)者的首次分離性輸血(apheresis)產(chǎn)物獲得單核細(xì)胞(MNC)。在分離性輸血前每個(gè)供應(yīng)者用6:g/kg的G-CSF進(jìn)行處理，每12小時(shí)一次處理3天，然后在第4天處理一次。將每個(gè)供應(yīng)者的全體積血用Cobe Spectra細(xì)胞分離器進(jìn)行3輪連續(xù)流式白細(xì)胞分離，以此收集MNC。
操作方法A)細(xì)胞的收集和維持將收集的MNC(0.75×106細(xì)胞/ml)懸于Iscove′s改良Dulbeco′s培養(yǎng)基(IMDM)(GIBCO，Grand Island，NY)中，培養(yǎng)基添加20％胎牛血清(FCS)(FlowLaboratories，McClean，VA)、5％人白蛋白(HA)或20％人血漿，100ng/ml重組人G-CSF(Amgen Inc.，Thousand Oaks，CA)，以及100ng/ml重組人干細(xì)胞因子(SCF)(Amgen)。將培養(yǎng)混合物注入300ml或500ml Life Cell無致熱原的塑料袋(Baxter，Deerfield，IL)中，并置于5％CO2的濕化氣氛下的37EC濕化孵箱中。每天檢查培養(yǎng)袋。于第2天、第5天、第6天和第7天將每一培養(yǎng)物混合，并抽取樣品用臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)進(jìn)行計(jì)數(shù)。如果袋中的細(xì)胞濃度超過了0.75×106細(xì)胞/ml，則向袋中注入IMDM，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度到0.75×106細(xì)胞/ml，所述IMDM添加了20％FCS、5％HA或20％人血漿，100ng/ml G-CSF，以及100ng/ml SCF。
B)造血集落形成細(xì)胞的分析造血集落形成細(xì)胞使用以前已述試驗(yàn)的改進(jìn)方法進(jìn)行分析。簡要地說，將105MNC培養(yǎng)于0.8％甲基纖維素中，所述0.8％甲基纖維素中添加IMDM、30％FCS、1.0U/ml紅細(xì)胞生成素(Amgen)、50ng/ml重組人GM-CSF(Immunex Corp.，Seattle，WA)及50ng/ml SCF(Amgen)。取每一培養(yǎng)混合物的1ml小樣置于35-mm培養(yǎng)皿(Nunc Inc.，Naperville，IL)中，在5％CO2的濕化氣氛中、在空氣中于37EC進(jìn)行雙份孵育。7天后所有培養(yǎng)物均評(píng)估紅細(xì)胞爆式集落形成單位(BFU-E)集落(定義為500個(gè)以上血色素化細(xì)胞的集合體或是3個(gè)或更多的紅細(xì)胞亞集落)數(shù)，粒細(xì)胞或單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞或二者所形成的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落形成單位(CFU-GM)的集落數(shù)，以及含所用成分的粒細(xì)胞-紅細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-巨核細(xì)胞集落形成單位(CFU-GEMM)的數(shù)目。用微量吸管從培養(yǎng)物中吸取單個(gè)集落進(jìn)行細(xì)胞組成分析。
C)淋巴細(xì)胞分析淋巴細(xì)胞用下列抗體組合進(jìn)行雙色染色后進(jìn)行分析CD56+CD16-PE/CD3-FITC、CD3-PE/CD4-FITC、CD3-PE/CD8-FITC、CD19-PE。對(duì)照包括用于同種型的IgG1-PE/IgG1-FITC和用于設(shè)門(gating)的CD14-PE/CD45-FITC。祖細(xì)胞用下列抗體組合進(jìn)行三色染色后進(jìn)行分析CD/45/CD90/CD34、CD45/CD34/CD38、CD45/CD34/CD33及CD45/CD34/CDD15。CD45/IgG1/IgG1用作對(duì)照。簡要地說，來自各供應(yīng)者的106個(gè)細(xì)胞與10∶1的抗體一起于2～8EC避光孵育15分鐘，然后在磷酸鹽緩沖鹽水中洗滌兩次。然后將細(xì)胞重懸，用1％甲醛固定，在裝有CELLQuest軟件(BectonDickinson)的FACScan流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson)上分析。分析淋巴細(xì)胞時(shí)，從各管俘獲10,000個(gè)細(xì)胞，根據(jù)前向角及右向角光散射模式設(shè)門。臨界點(diǎn)根據(jù)視覺設(shè)定為同種型對(duì)照的背景陽性水平之上。分析祖細(xì)胞時(shí)，從各管俘獲75,000個(gè)細(xì)胞，然后設(shè)門。
D)造血集落形成細(xì)胞的增加在本發(fā)明人的組織培養(yǎng)系統(tǒng)中孵育供應(yīng)者的PB細(xì)胞顯著增加造血集落形成細(xì)胞的數(shù)量。觀察到7天時(shí)，CFU-GM集落形成細(xì)胞(最高為7倍)和CFU-GEMM集落形成細(xì)胞(最高為9倍)的數(shù)量持續(xù)增加，沒有明確的平臺(tái)期。
E)CD34+細(xì)胞的增加在本發(fā)明人的組織培養(yǎng)系統(tǒng)中孵育來自正常供應(yīng)者的MNC細(xì)胞顯著增加CD34+細(xì)胞的數(shù)量。培養(yǎng)到第6天時(shí)，CD34+細(xì)胞的平均數(shù)量增加了10倍，同時(shí)這天也達(dá)到了平臺(tái)期。第5天及第6天時(shí)，共表達(dá)髓系標(biāo)志物CD15和CD33的CD34+細(xì)胞相對(duì)數(shù)量顯著增加。
擴(kuò)增的細(xì)胞在化療治療的一周內(nèi)重新導(dǎo)入體內(nèi)，從而使軀體維持在足以克服化療所致疲勞的水平。
盡管本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案已于上文說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是可在本發(fā)明的范圍內(nèi)進(jìn)行其他變更。
權(quán)利要求
1.一種補(bǔ)充癌癥治療所破壞細(xì)胞的方法，該方法包括從靈長類哺乳動(dòng)物取出血細(xì)胞，使細(xì)胞在7天內(nèi)以產(chǎn)生至少為7倍的擴(kuò)增系數(shù)的速度受控制地?cái)U(kuò)增，同時(shí)保持細(xì)胞的三維幾何形狀及其細(xì)胞-細(xì)胞支持和細(xì)胞-細(xì)胞幾何位置，從血細(xì)胞中除去任意有毒物質(zhì)，并在一定時(shí)間內(nèi)把細(xì)胞重新導(dǎo)入靈長類哺乳動(dòng)物體內(nèi)，所述時(shí)間足以防止靈長類哺乳動(dòng)物因造血細(xì)胞或其他細(xì)胞喪失所致的能動(dòng)性降低。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述癌癥治療為骨髓移植。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述癌癥治療為化療。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述癌癥治療為放射治療。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述擴(kuò)增血細(xì)胞的重新導(dǎo)入在癌癥治療后1個(gè)月內(nèi)完成。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述擴(kuò)增血細(xì)胞的重新導(dǎo)入在癌癥治療后1周內(nèi)完成。
7.一種補(bǔ)充癌癥治療所破壞細(xì)胞的方法，該方法包括從靈長類哺乳動(dòng)物取出外周血細(xì)胞，擴(kuò)增細(xì)胞，同時(shí)保持細(xì)胞的三維幾何形狀以及其細(xì)胞-細(xì)胞支持和細(xì)胞-細(xì)胞幾何位置，從外周血細(xì)胞中除去任意有毒物質(zhì)，并在一定時(shí)間內(nèi)把細(xì)胞重新導(dǎo)入靈長類哺乳動(dòng)物體內(nèi)，所述時(shí)間足以防止靈長類哺乳動(dòng)物因造血細(xì)胞或其他細(xì)胞喪失所致的能動(dòng)性降低。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述靈長類哺乳動(dòng)物為人類。
9.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述癌癥治療為骨髓移植。
10.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述癌癥治療為化療。
11.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述癌癥治療為放射治療。
12.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述擴(kuò)增血細(xì)胞的重新導(dǎo)入在癌癥治療后1個(gè)月內(nèi)完成。
13.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述擴(kuò)增血細(xì)胞的重新導(dǎo)入在癌癥治療后1周內(nèi)完成。
全文摘要
本文公開補(bǔ)充癌癥治療所破壞細(xì)胞的方法。該方法包括從靈長類哺乳動(dòng)物取出血細(xì)胞，使細(xì)胞在7天內(nèi)以產(chǎn)生至少為700％的擴(kuò)增系數(shù)(expansion factor)的速度受控制地?cái)U(kuò)增，同時(shí)保持細(xì)胞的三維幾何形狀及其細(xì)胞－細(xì)胞支持和細(xì)胞－細(xì)胞幾何位置，從血細(xì)胞中除去任意有毒物質(zhì)，并在一段時(shí)間內(nèi)把細(xì)胞重新導(dǎo)入靈長類哺乳動(dòng)物體內(nèi)，所述時(shí)間足以防止靈長類哺乳動(dòng)物因造血細(xì)胞或其他細(xì)胞喪失所致的能動(dòng)性降低。
文檔編號(hào)A61P7/00GK1826125SQ03827017
公開日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2003年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月2日
發(fā)明者唐尼·拉德 申請(qǐng)人:雷格內(nèi)泰克公司