專(zhuān)利名稱(chēng):非對(duì)映異構(gòu)四氫吡啶并{2，3-d}嘧啶衍生物的制法的制作方法
本發(fā)明涉及N-(4-〔2-(5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-烷基〕-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸的兩個(gè)單獨(dú)的非對(duì)映異體，其中每個(gè)異構(gòu)體基本上不含有其他所有異體;本發(fā)明還涉及它們的制備方法及其作為抗腫瘤藥物的作用。
葉酸抗代謝物，氨基蝶呤(白血寧)和氨甲蝶呤(也就是通常所說(shuō)的10甲氨基蝶呤或氨甲蝶呤，methotrexate)都是抗腫瘤藥物。這些化合物抑制包括葉酸的代謝衍生物在內(nèi)的酶轉(zhuǎn)化。例如氨甲蝶呤(ameth-opterin)抑制二氫葉酸還原酶，這是一種從二氫葉酸轉(zhuǎn)化為四氫葉酸所必需的酶，而二氫葉酸是在胸苷酸合成酶作用下，把2-脫氧尿苷酸鹽轉(zhuǎn)化為胸苷酸鹽過(guò)程中形成的。
葉酸氨基蝶呤的其它衍生物已被合成，并進(jìn)行抗代謝物試驗(yàn)。在這些化合物的分子中，亞甲基或次甲基占據(jù)了通常分別由亞氨基或三價(jià)氮基占據(jù)的位置。這些衍生物具有不同程度的抗代謝活性。10-去氮(deaza)氨基蝶呤是高活性的(Sirotak等.，Cancer Treat.Rep.，1978，62，1047)，而5-去氮氨基蝶呤的活性和氨甲蝶呤相似(Taylor等，J.Org.Chem.，1983，48，4852)。據(jù)報(bào)導(dǎo)8，10-去氮氨基蝶呤也是有活性的(美國(guó)專(zhuān)利4460591號(hào))，5，8，10-三去氮氨基蝶呤則具有抗L1210小鼠白血病的活性(Yan等，J.Heterocycl.Chem，1979，16，541)。另一方面，10-去氮葉酸則未顯示明顯的活性(Struck等，J.Med.Chem，1971，14，693)，5-去氮葉酸也只有輕微的細(xì)胞毒性作用。8，10-去氮葉酸只能勉強(qiáng)算作二氫葉酸還原酶抑制劑(De Graw等.，“Chemistry and Biology of Pteridines”“蝶啶的化學(xué)與生物學(xué)”，Eisevier，1979，229)，5，8，10-三去氮葉酸對(duì)L1210小鼠白血病也僅有不高的活性(Oatis等，J.Med.Chem.，1977，20，1393)。Taylor等已報(bào)導(dǎo)了5，10-二去氮氨基蝶呤、5，10-二去氮-5，6，7，8-四氫氨基蝶呤以及相應(yīng)的5，10-二去氮葉酸衍生物(J.Med.Chem.，28∶7，914，1985)。
正如南非專(zhuān)利86/1235號(hào)所述，化合物N-(4-〔2-(2-氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲?；?-L-谷氨酸是一種廣譜抗腫瘤藥物。在此化合物中存在兩個(gè)手性中心在四氫吡啶并〔2，3-d〕嘧啶環(huán)的6位上的碳原子和谷氨酸基團(tuán)中的α-碳原子。理論上此化合物可以有四種形式存在，但正如南非專(zhuān)利86/1235所述，此類(lèi)化合物在開(kāi)始偶聯(lián)時(shí)使用的是L-谷氨酸，因而就減少了兩種可能性。但這兩種形式在其后的氫化期間同時(shí)產(chǎn)生，因而除去保護(hù)基后，得到所需產(chǎn)物是(S，S)和(R，S)的非對(duì)映異構(gòu)體的混合物
這些非對(duì)映異構(gòu)體可以用物理法，如色層法加以分離，但由于這些化合物在大多數(shù)有機(jī)溶劑中溶解度低，因而使這種分離方法受到一定程度的阻礙，特別是在大規(guī)模生產(chǎn)中。這兩種非對(duì)映異構(gòu)體的混合物也可以用于治療目的，二者都可作為有關(guān)葉酸酶的底物。但鑒于它們具有稍為不同的生物外形，所以更有利的是將它們相互分離最為理想，每一形式都基本上不含有另一形式，即每一形式的旋光純度大于95%。
用一種實(shí)用的手性酸處理非對(duì)映異構(gòu)體N-(4-〔2-(2-乙酰氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸二乙酯或其它帶保護(hù)基衍生物的混合物溶液，于是生成鹽。然后通過(guò)一步或多步分級(jí)結(jié)晶來(lái)分離所得到的非對(duì)映異構(gòu)體的鹽。此后通過(guò)用一種堿處理和除去保護(hù)基，使分離出的至少一種鹽的陽(yáng)離子部分的游離堿釋放。鹽的陽(yáng)離子的釋放，可以在除去保護(hù)基團(tuán)之前或之后，以獨(dú)立的步驟完成，或者，若這些基團(tuán)在堿性條件下，易于脫除的話，也可以與除去保護(hù)基同時(shí)完成，即堿水解。
適宜的手性酸包括下述化合物的單個(gè)對(duì)映體。這些化合物有10-樟腦磺酸、樟腦酸、α-溴樟腦酸、
氧基乙酸、酒石酸、二乙酰酒石酸、蘋(píng)果酸、吡咯烷酮-5-羧酸及其它。
這樣就可得到(ⅰ)〔α〕25589nm為-21.06°的N-(4-〔2-(2-氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕-嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸的非對(duì)映異構(gòu)體，它基本上不含有〔α〕25589nm為+31.09°的N-(4-〔2-(2-氨基-4羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸非對(duì)映異構(gòu)體;和(ⅱ)〔α〕為+31.09°的N-(4-〔2-(2-氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲?；?-L-谷氨酸的非對(duì)映異構(gòu)體，它也基本不含有〔α〕25589nm為-21.06°的N-(4-〔2-(2-氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲?；?-L-谷氨酸非對(duì)映異構(gòu)體。
除去保護(hù)基可通過(guò)水解實(shí)現(xiàn)，水解可在常溫下用酸或堿的水溶液進(jìn)行。例如用堿金屬氫氧化物的水溶液，還可任選地，在與水相溶的有機(jī)溶劑，諸如甲醇、乙醇、四氫呋喃、二甲基甲酰胺等存在下進(jìn)行;或用酸，例如用三氟乙酸進(jìn)行。當(dāng)用堿時(shí)，該鹽放出陽(yáng)離子部分，得到二陽(yáng)離子的谷氨酸鹽產(chǎn)物，通過(guò)調(diào)節(jié)pH(例如用乙酸酸化)可以使之容易地沉淀。所得到的產(chǎn)物一般是高熔點(diǎn)的晶體或微晶狀固體。
實(shí)例11.0克N-(4-〔2-(2-乙酰氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕-嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲?；?-L-谷氨酸二乙酯和880毫克d(+)-10-樟腦磺酸的混合物，在50毫升無(wú)水乙醇中加熱回流4小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，并放置過(guò)夜。生成的白色固體經(jīng)過(guò)濾收集，并在乙醇中分級(jí)結(jié)晶6次，得到37毫克N-(4-〔2-(2-乙酰氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲?；?-L-谷氨酸二乙酯非對(duì)映異構(gòu)體“B”的d(+)-10-樟腦磺酸鹽，熔點(diǎn)223-225℃，〔α〕25589nm＝-20.02°。
靠蒸發(fā)除去母液中的溶劑，生成的固體在乙醇中重結(jié)晶兩次，得到N-(4-〔2-(2-乙酰氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲?；?-L-谷氨酸二乙酯非對(duì)映異構(gòu)體“A”的d(+)-10-樟腦磺酸鹽，〔α〕25589nm＝+29.35°。
將N-(4-〔2-(2-乙酰氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲?；?-L-谷氨酸二乙酯非對(duì)映異構(gòu)體“B”的d(+)-10-樟腦磺酸鹽加入含3毫升1N氫氧化鈉水溶液的50毫升甲醇中，在室溫下攪拌該溶液72小時(shí)。加入2毫升乙酸，接著離心，就得到N-(4-〔2-(2-氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕-嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲?；?-L-谷氨酸的非對(duì)映異構(gòu)體“B”，熔點(diǎn)224-227℃(分解)〔α〕25589nm＝-21.0581°(C＝0.636，0.1N NaOH);λmax278nm，222nm;NMR(CDCl3)δ1.85(m，2H)，1.98(m，1H)，2.25(m，1H)，2.45(m，1H)，2.68(m，1H)，2.92(m，5H)，3.25(t，J＝10Hz，1H)，3.82(d，J＝10Hz，1H)，513(m，1H)，7.43(d，J＝9Hz，2H)，7.84(d，J＝9Hz，2H)，旋光純度為＞97%。
按上述程序操作，只是用N-(4-〔2-(2-乙酰氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲?；?-L-谷氨酸二乙酯非對(duì)映異構(gòu)體“A”的d(+)-10-樟腦磺酸鹽代替對(duì)映異構(gòu)體B。這樣就得到N-(4-〔2-(2-氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕-嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲?；?-L-谷氨酸的非對(duì)映異構(gòu)體“A”，熔點(diǎn)253-255℃(分解)〔α〕25589nm＝+31.0915°(C＝3.605，0.1N NaOH);λmax278nm，222nm;NMR(CDCl3)δ1.85(m，2H)，1.98(m，1H)，2.25(m，1H)，2.45(m，1H)，2.68(m，1H)，2.92(m，5H)，3.25(t，J＝10Hz，1H)，3.82(d，J＝10Hz，1H)，5.13(m，1H)，7.43(d，J＝9Hz，2H)，7.84(d，J＝9Hz，2H)。旋光度大于97%。
實(shí)例2在全細(xì)胞(人白血病細(xì)胞系CCRF-CEM)中測(cè)定了非對(duì)映異構(gòu)體“A”和“B”的IC50值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下化合物 IC50(微克/毫升)非對(duì)映異構(gòu)體“A” 2.6×10-3非對(duì)映異構(gòu)體“B” 3.4×10-3實(shí)例3在C57BL/G小鼠腋下皮下植入B-16黑素瘤腫瘤細(xì)胞。每個(gè)劑量用一個(gè)試驗(yàn)組，每個(gè)試驗(yàn)組有十只小鼠。每日腹膜內(nèi)各注射N(xiāo)-(4-〔2-(2-氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲?；?-L-谷氨酸的非對(duì)映異構(gòu)體“A”和非對(duì)映異構(gòu)體“B”。10天后測(cè)量對(duì)照組腫瘤(只接受稀釋劑)的質(zhì)量，并與接受試驗(yàn)化合物的試驗(yàn)組動(dòng)物的腫瘤質(zhì)量對(duì)比，以計(jì)算抑制百分率。結(jié)果如下化合物 劑量(毫克/公斤) 抑制百分率(%) 存活率異構(gòu)體A和B的 1.60 5 9/9混合物 3.12 12 9/96.25 13 9/912.50 50 9/9異構(gòu)體A 1.60 47 9/93.12 24 9/96.25 0 9/912.50 0 9/9異構(gòu)體B 1.60 71 10/103.12 91 10/106.25 98 10/1012.50 100 10/1025.00 100 10/1050.00 100 9/10100.00 100 8/10200.00 100 6/10
實(shí)例4以10只C3H雌性小鼠為一組，在腋下腹膜內(nèi)接種6C3HED淋巴肉瘤細(xì)胞。然后將試驗(yàn)化合物置于0.5毫升Emulphor IP中，給藥共8天。對(duì)照組動(dòng)物接受同樣處理，但不給試驗(yàn)化合物。
化合物 劑量(毫克/公斤) 抑制百分率(%) 存活率異構(gòu)體A 6.00 74 10/1012.50 89 10/1025.00 100 10/1050.00 100 10/10100.00 100 10/10異構(gòu)體B 3.60 71 10/106.25 84 10/1012.50 89 10/1025.00 99 10/1050.00 100 10/10100.00 100 8/10實(shí)例5C3H小鼠組被植入C3H乳腺癌細(xì)胞，并按如下所示方式注射給予異構(gòu)體B，對(duì)照組動(dòng)物只接受稀釋劑。
連續(xù)輸注(2毫升/天)(于1%NaHCO3溶液中，每天一次，共5天)劑量(毫克/公斤) 抑制百分率(%) 存活率0.62 20 5/51.25 59 6/62.50 93 6/65.00 中毒 0/6
腹膜內(nèi)給藥(0.5毫升/天)(于Emulphor中，每天一次，共10天)劑量(毫克/公斤) 抑制百分率(%) 存活率3.60 76 10/106.25 93 10/1012.50 99 8/1025.00 100 7/1050.00 100 8/10100.00 中毒 0/10腹膜內(nèi)給藥(0.5毫升/天)(于Emulphor中，僅第1，3，5，7，和9天)劑量(毫克/公斤) 抑制百分率(%) 存活率50 91 10/10100 96 10/10200 100 10/10400 100 8/10腹膜內(nèi)給藥(0.6毫升/天)(于Emulphor中，僅第1，3，5，7和9天)劑量(毫克/公斤) 抑制百分率(%) 存活率6.25 39 10/1012.50 21 10/1025.00 59 10/1050.00 60 10/10100.00 94 10/10
實(shí)例6C3H小鼠組被植入X5563漿細(xì)胞性骨髓瘤細(xì)胞，并按如下所示方式注射給予異構(gòu)體B，對(duì)照組動(dòng)物僅接受稀釋劑。
腹膜內(nèi)給藥(0.6毫升/天)(于Emulphor中，每天一次，共10天)劑量(毫克/公斤) 抑制百分率(%) 存活率3.60 62 10/106.25 76 7/1012.50 90 10/1025.00 99 8/1050.00 99 7/9100.00 中毒 0/10
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生下述兩種非對(duì)映異構(gòu)體之中至少一種的方法步驟(i)[a]25589nm為-21.06°的N-(4-[2-(2-氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-乙基]-苯甲酰基)-L-谷氨酸的非對(duì)映異構(gòu)體，它基本上不含有[a]25589nm為+31.09°的N-(4-[2-(2-氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-乙基]-苯甲?；?-L-谷氨酸的非對(duì)映異構(gòu)體，以及(ii)[a]25589nm為+31.09°的N-(4-[2-(2-氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-乙基]-苯甲?；?-L-谷氨酸的非對(duì)映異構(gòu)體，它基本上不含有[a]25589nm為-21.06°的N-(4-[2-(2-氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-乙基]-苯甲?；?-L-谷氨酸的非對(duì)映異構(gòu)體。此方法步驟包括用實(shí)用的手性酸處理下列結(jié)構(gòu)通式的非對(duì)映異構(gòu)化合物的混合物溶液以與上述混合物生成鹽，
其中R1和R2是相同或不同的羧酸保護(hù)基，R3是氫或一個(gè)氨基保護(hù)基，和標(biāo)有*號(hào)的碳原子的構(gòu)型為L(zhǎng)，分離出上述酸和上述化合物所生成的兩種非對(duì)映異構(gòu)體的鹽，然后用堿處理以游離堿形式釋放至少一種上述分離所得鹽的陽(yáng)離子部分，并除去上述保護(hù)基團(tuán)，上述釋放可以作為獨(dú)立步驟，在上述保護(hù)基團(tuán)除去之前或之后完成，也可以與除去保護(hù)基同時(shí)進(jìn)行。
2.按照權(quán)利要求
1的方法，該法可獲得選自下列一組中的一個(gè)化合物(ⅰ)〔α〕25589nm為-21.06°的N-(4-〔2-(2-氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕-嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲?；?-L-谷氨酸的非對(duì)映異構(gòu)體，它基本不含有〔α〕25589nm為+31.09°的N-(4-〔2-(2-氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基〕-乙基〕-苯甲?；?-L-谷氨酸的非對(duì)映異構(gòu)體，(ⅱ)其4(3H)-氧代互變異構(gòu)體形式，以及(ⅲ)它在藥物學(xué)上可接受的堿金屬、堿土金屬、無(wú)毒金屬、銨或取代銨的鹽，它基本上不含有〔α〕25589nm為+31.09°的那個(gè)非對(duì)映異構(gòu)體的相應(yīng)的鹽。
3.按照權(quán)利要求
1的方法，該法所獲得的化合物為〔α〕25589nm為-21.06°的N-(4-〔2-(2-氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲?；?-L-谷氨酸的非對(duì)映異構(gòu)體，它基本上不含有〔α〕25589nm為+31.09°的N-(4-〔2-(2-氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲?；?-L-谷氨酸的非對(duì)映異構(gòu)體。
4.按照權(quán)利要求
1的方法，該法可獲得選自下列一組中的一個(gè)化合物(ⅰ)〔α〕25589nm為+31.09°的N-(4-〔2-(2-氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕-嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲?；?-L-谷氨酸的非對(duì)映異構(gòu)體，它基本不含有〔α〕25589nm為-21.06°的N-(4-〔2-(2-氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲?；?-L-谷氨酸的非對(duì)映異構(gòu)體，(ⅱ)其4(3H)-氧代互變異構(gòu)體形式，以及(ⅲ)它在藥物學(xué)上可接受的堿金屬、堿土金屬、無(wú)毒金屬、銨或取代銨的鹽，它基本上不含有〔α〕25589nm為-21.06°的那個(gè)非對(duì)映異構(gòu)體的相應(yīng)的鹽。
5.按照權(quán)利要求
1的方法，該法所獲得的化合物為〔α〕25589nm為+31.09°的N-〔4-〔2-(2-氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲?；?-L-谷氨酸的非對(duì)映異構(gòu)體，它基本上不含有〔α〕25589nm為+21.06°的N-(4-〔2-(2-氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲?；?-L-谷氨酸的非對(duì)映異構(gòu)體。
專(zhuān)利摘要
N-(4-[2-(2-氨基-4-羥基-5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-乙基]-苯甲?；?-L-谷氨酸的非對(duì)映異構(gòu)體形式是抗腫瘤藥物。通過(guò)分離相應(yīng)的帶保護(hù)基的谷氨酸衍生物的非對(duì)映異構(gòu)體，和水解或氫解除去羧酸和/或氨基保護(hù)基，即可制備此類(lèi)化合物。
文檔編號(hào)A61K31/195GK87104103SQ87104103
公開(kāi)日1987年12月30日 申請(qǐng)日期1987年6月6日
發(fā)明者愛(ài)德華·C·泰勒, 喬治·彼得·比爾茲利, 石全, 斯蒂芬·R·弗萊徹 申請(qǐng)人:普林斯頓大學(xué)托管委員會(huì)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan