專利名稱：二硫鍵交聯(lián)的糖蛋白激素類似物及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖蛋白激素的類似物及其制備和應(yīng)用。更具體地說，本發(fā)明涉及二硫鍵交聯(lián)的糖蛋白激素類似物及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖蛋白激素包括絨膜促性腺激素(CG)、促黃體素(LH)、促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)。人的這些激素稱為人絨膜促性腺激素(hCG)、人促黃體素(hLH)、人促卵泡激素(hFSH)、人促甲狀腺激素(hTSH)。這些激素在性腺和甲狀腺功能上有重要作用(Pierce等人，1981，Molye等人，1995)。CG和LH結(jié)合并刺激LH受體，F(xiàn)SH結(jié)合并刺激FSH受體，TSH結(jié)合并刺激TSH受體。CG主要由一些哺乳動物(包括靈長類的那些動物)胎盤大量產(chǎn)生的激素。靈長類動物CGβ亞基的氨基酸序列通常和LH的不同。馬也產(chǎn)生CG，但是它的氨基酸序列與馬的LH相同(Murphy等人，1991)。
如Pierce等人1981年的綜述所述，糖蛋白激素是包括α和β亞基的異二聚體。異二聚體并非通過共價鍵連接在一起，可以通過酸或尿素處理激素來分離它們的亞基(Pierce等人，1981)。大多數(shù)高等脊椎動物只有一種編碼α亞基的基因(Fiddes等人，1984)；同一α亞基通常和LH、FSH、TSH以及CG(當其存在時)的β亞基結(jié)合。然而，翻譯后的蛋白加工，尤其是糖基化(Baenziger等人，1988)會導致LH、FSH、TSH和CGα亞基的組成不同。這些激素間的大部分氨基酸序列差異在它們的激素特異性β亞基中(Pierce等人，1981)。它們由不同的基因產(chǎn)生(Fiddes等人，1984，Bo等人，1992)。
除很少例外(Blithe等人，1991)，α-β異二聚體的激素活性比游離亞基更高(Pierce等人，1981)。天然存在的α和β亞基形成的α，β異二聚體比它們形成的α，α均二聚體或β，β均二聚體更佳。實際上，hCG α亞基和β亞基基因在哺乳動物細胞內(nèi)一起表達導致形成α-β-異二聚體、α亞基單體以及β亞基單體。如果有α，α均二聚體或β，β均二聚體，也只形成或從細胞中分泌出了很少的量。
兩個實驗室已經(jīng)報道了人絨膜促性腺激素(hCG)的高分辨率X射線晶體結(jié)構(gòu)(Lapthorn等人，1994；Wu等人，1994)。這些結(jié)構(gòu)指出，原來提出的二硫鍵方式(Mise等人，1980和1981)是不正確的，激素是半胱氨酸結(jié)節(jié)(knot)蛋白家族的一個成員(Sun等人，1995)。由于半胱氨酸在所有糖蛋白激素中的相對位置是相似的，因此它們可能具有在hCG中發(fā)現(xiàn)的半胱氨酸結(jié)節(jié)結(jié)構(gòu)。
脊椎動物糖蛋白激素α亞基中的半胱氨酸殘基的位置是相似的(

圖1A和1B)。用hCGα亞基作為模型，看出半胱氨酸結(jié)節(jié)由第2、第3、第5、第7、第8和第9個α亞基半胱氨酸形成的。這產(chǎn)生了三個大的α亞基環(huán)(圖1A和1B)。環(huán)1是第二和第三半胱氨酸間的氨基酸序列；環(huán)2是第五和第七α亞基半胱氨酸間的氨基酸序列；環(huán)3是第七和第八半胱氨酸之間的氨基酸序列。半胱氨酸殘基在脊椎動物糖蛋白激素β亞基中的位置是相似的(Pierce等人，1981)。采用hCGβ亞基作為模型，看出半胱氨酸結(jié)節(jié)由第1、第4、第5、第6、第8和第9半胱氨酸形成。這產(chǎn)生了三個大的β亞基環(huán)(圖2A和2B)。環(huán)1是第1和第4半胱氨酸之間的氨基酸序列；環(huán)2是第5和第6半胱氨酸之間的序列；環(huán)3是第6和第8半胱氨酸之間的序列。用另一α亞基的同源部分代替α亞基部分，或用另一β亞基的同源部分代替β亞基部分，可以制得每個糖蛋白激素亞基的功能性嵌合體(Campbell等人，1991；Moyle等人，1990；Moyle等人，1994；Cosowsky等人，1995；Moyle等人，1995；Cosowsky等人，1997)。圖1C中大致示出了糖蛋白激素亞基中的結(jié)構(gòu)元件，下表1A中顯示了人糖蛋白激素亞基與氨基酸殘基的對應(yīng)關(guān)系。
表1A人激素亞基氨基酸序列與圖1C所示結(jié)構(gòu)元件的對應(yīng)關(guān)系

除了它的半胱氨酸結(jié)節(jié)外，β亞基還含有稱為“座位系帶(seat-belt)”的序列(Lapthorn等人，1994)，該序列纏繞第二α亞基環(huán)。座位系帶起始于第9半胱氨酸(β亞基半胱氨酸結(jié)節(jié)中的最后一個殘基)，并包括第10、第11和第12半胱氨酸。它通過第12半胱氨酸(即座位系帶的羧基末端)和第3半胱氨酸(即在第一個β亞基環(huán)中)之間形成的二硫鍵與第一β-亞基環(huán)相連。
座位系帶是hCGβ-亞基的一部分，它對hCG鑒別LH和FSH受體的能力有顯著(如果不是主要)的影響(Campbell等人，1991；Moyle等人，1994)。用hFSH中發(fā)現(xiàn)的座位系帶序列代替所有或部分的hCG座位系帶氨基酸序列，結(jié)果改變了所得激素類似物的受體結(jié)合特異性。通常，hCG和LH受體的結(jié)合比與FSH或TSH受體的結(jié)合強1000倍以上。然而，hCG的類似物(例如CF94-117和CF101-109，其中hCG座位系帶殘基101-109(即Gly-Gly-Pro-Lys-Asp-His-Pro-Leu-Thr)被其hFSH對應(yīng)物(即Thr-Val-Arg-Gly-Leu-Gly-Pro-Ser-Tyr)代替)與FSH受體的結(jié)合比與hCG受體的結(jié)合好得多(Moyle等人，1994)。另外，通過操縱座位系帶的組成，可以制備具有不同程度的LH和FSH活性的hCG類似物(Moyle等人，1994；Han等人，1996)。這些類似物具有潛在的用于增強男性和女性生育力的治療用途。
大多數(shù)、但并非所有的糖蛋白激素亞基內(nèi)二硫鍵是其生物活性所必需的。用其它氨基酸(尤其是丙氨酸)代替各個半胱氨酸的研究表明，半胱氨酸結(jié)節(jié)所有的二硫鍵以及座位系帶是異二聚體折疊所必需的(Suganuma等人，1989；Bedows等人，1993；Furuhashi等人，1994)。人α亞基半胱氨酸7-31和59-87之間以及hCGβ-亞基半胱氨酸23-72之間的其余二硫鍵并非為異二聚體形成或激素活性所必需。
但是還沒有描述任何糖蛋白激素和其受體相互反應(yīng)的高分辨晶體結(jié)構(gòu)。已經(jīng)建立了幾個模型試圖來描述激素受體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。這些模型大部分是根據(jù)hCG和核糖核酸酶抑制劑(一種在結(jié)構(gòu)上和糖蛋白激素受體胞外結(jié)構(gòu)域相似的蛋白)的晶體結(jié)構(gòu)。為鑒別接觸受體的激素殘基所做的大多數(shù)努力是根據(jù)導致受體結(jié)合減少的化學、酶促或基因突變的影響。不幸的是，由于結(jié)合的減少可能由特異性接觸的破壞或激素構(gòu)型變化所引起(Cosowsky等人，1997)，因此這些變化的效應(yīng)很難解釋(如果不是不可能的話)。這在本領(lǐng)域中產(chǎn)生了很大的分歧(Remy等人，1996；Berger等人，1996)，一些研究者得出結(jié)論，確定受體復(fù)合物中激素的取向是不可能的(Blowmick等人，1996)。
確定受體復(fù)合物中激素取向的其它方法依靠鑒定出不接觸受體的激素區(qū)域。這些區(qū)域在激素結(jié)合受體后仍舊外露，和/或能發(fā)生改變而不破壞激素-受體相互作用。當在hCG晶體結(jié)構(gòu)上作出這些圖譜后(Lapthorn等人，1994；Wu等人，1994)，就可以用hCG可能與LH受體相互作用的方式設(shè)計出假想模型(Moyle等人，1995)。該方法提示第二個α亞基環(huán)和第一個以及第三個β亞基環(huán)形成的激素溝槽涉及主要的受體接觸(Cosowsky等人，1995)。這也解釋了為什么最強的激素-受體結(jié)合需要兩個亞基的原因(Pierce等人，1981)。在下面幾段中將討論支持該結(jié)論的數(shù)據(jù)。然而，應(yīng)當注意，本領(lǐng)域中大部分(如果不是其它所有)研究者支持這樣一個模型，其中激素的取向很不相同(Remy等人，1996；Berger等人，1996)，即使這些研究者意識到描繪的只是模型(即他們引用了描述該模型的論文，模型中的主要受體結(jié)合位點由激素溝槽(groove)形成)。
看來不與受體接觸的hCGα亞基的許多部分可被替代而不會破壞與LH受體的結(jié)合。這些區(qū)域中有一些顯然在激素-受體復(fù)合物中是外露的，因為它們在hCG結(jié)合LH受體時還能被單克隆抗體識別(Molye等人，1990；Cosowsky等人，1995；Molye等人，1995)。例如，盡管人和牛的α亞基具有很不相同的氨基酸序列，但是含有牛α亞基和hCGβ亞基的異二聚體能很好地結(jié)合大鼠和人LH受體(Cosowsky等人，1997)。這些異二聚體很容易用識別hCGα亞基的環(huán)1和3上表位的單克隆抗體來區(qū)分(Molye等人，1995)。這些觀察表明，人和牛的α亞基環(huán)1和環(huán)3的表面不同，并提示激素的這一區(qū)域不形成關(guān)鍵的受體接觸。
通過比較單克隆抗體識別hCG類似物(其部分α亞基從人或牛蛋白衍生獲得)的能力，就可以鑒別出參與抗體結(jié)合的關(guān)鍵的α亞基殘基(Molye等人，1995)。識別hCGα亞基上表位的一些單克隆抗體還與α亞基的片段(通過胰蛋白酶消化制得，缺少大部分的第二α亞基環(huán))結(jié)合(Lapthorn等人，1994；Wu等人，1994；Birken等人，1986)。這一觀察也用來確定和/或確認這些抗體的結(jié)合位點(Molye等人，1995)。當hCG和LH受體復(fù)合時，識別其α亞基表位的兩個單克隆抗體(稱為A105和A407)(Molye等人，1995)與hCG結(jié)合。因此，被這些抗體識別的α亞基殘基看來不接觸LH受體(Molye等人，1995)。α亞基的其余部分包括第二個α亞基環(huán)和蛋白的C端。α亞基的這些高度保守部分中的一些殘基可能參與了受體接觸。
看來不接觸LH受體的hCGβ亞基的許多部分也可被突變代替而不破壞與LH受體的結(jié)合。這些部分包括hCGβ亞基第2環(huán)。hCG類似物(其中hCGβ亞基第2環(huán)的殘基被hFSHβ亞基第2環(huán)中通常所見的那些殘基(稱為CF39-58)代替(Campbell等人，1991))很容易被識別FSH但不識別hCGβ亞基第2環(huán)中的殘基的單克隆抗體區(qū)別開來。這表明，該類似物中的第二亞基環(huán)的結(jié)構(gòu)與hCG中的不同。然而，該β亞基類似物與α亞基結(jié)合形成的α，β-異二聚體與LH受體相互作用類似于hCG(Campbell等人，1991)。因此，看來hCG第二β亞基環(huán)中很少(如果有的話)殘基直接和LH受體形成必需的接觸。類似地，hFSH第二β亞基環(huán)看來不接觸FSH受體。已經(jīng)報道了hCGβ亞基的類似物，其中第10個β亞基半胱氨酸和C端之間的殘基或殘基94-114之間的殘基被hFSH的對應(yīng)殘基代替。這些類似物命名為CF94-117(Campbell等人，1991)和CFC94-114(Wang等人，1994)。兩者與FSH受體的結(jié)合大大優(yōu)于和LH受體的結(jié)合，即使它們在第2個β亞基環(huán)中含有全部hCG序列。由于hCG的第2β-亞基環(huán)看來對該激素結(jié)合LH或FSH受體的能力的影響最小，因此它似乎不可能參與和LH或FSH受體的高親和性基本接觸。另外，hCG的第2β亞基環(huán)靠近第一和第三α亞基環(huán)，該二部分α亞基似乎也不接觸受體。因此，看來含有第一和第三α亞基環(huán)和第二β亞基環(huán)殘基的hCG整個區(qū)域有可能不接觸受體。如下面所討論的，認為該部分激素伸入由受體胞外結(jié)構(gòu)域形成的馬蹄形空穴內(nèi)(Molye等人，1995)。
不參與高親和性受體接觸的hCGβ亞基的殘基在激素結(jié)合LH受體后仍可被單克隆抗體識別(Campbell等人，1991；Molye等人，1990；Moyle等人，1994；Cosowsky等人，1995)。它們包括距離α亞基界面最遠的環(huán)1和3中發(fā)現(xiàn)的hCGβ-亞基的部分，它們可被例如B105、B108、B111和B112抗體所識別。這些抗體在hCG與LH受體復(fù)合時結(jié)合hCG(Molye等人，1990；Cosowsky等人，1995)，這證明β亞基第1環(huán)和第3環(huán)的這些部分不形成基本的受體接觸。其它研究表明，可以除去hCGβ亞基的第1個半胱氨酸與N端之間以及第12個半胱氨酸與C端之間的殘基而不會消除該激素結(jié)合LH受體的能力(Huang等人，1993)。β亞基的其余部分包括“座位系帶”。這些殘基中少數(shù)幾個看來形成了高親和性結(jié)合LH或FSH受體所需的基本接觸。例如，發(fā)現(xiàn)改變“安全帶”中第11和第12個半胱氨酸之間的殘基對結(jié)合LH受體的影響最小(如果有的話)(Molye等人，1994)。改變第10和第11個半胱氨酸之間的殘基對FSH受體的結(jié)合作用減少了5倍(Molye等人，1994)。另外，馬LH(eLH)和馬CG(eCG)座位系帶中的大部分殘基與FSH不同(Pierce等人，1981；Murphy等人，1991)，但是這些激素與大鼠FSH受體的結(jié)合很好。實際上，純化eLH在體外結(jié)合大鼠FSH受體至少為hFSH的30％(Molye等人，1994)。仍未予說明的hCGβ亞基部分包括最靠近α亞基界面的環(huán)1和環(huán)3表面。因此，這些可能是激素接觸受體的位點。當hCG與LH受體復(fù)合時，α亞基的某些部分也能被單克隆抗體識別。這些部分包括被抗體A105和A407識別的殘基(Molye等人，1995)。
鑒別與受體相互作用的糖蛋白激素區(qū)域的其它策略包括采用識別多個受體的激素類似物(Campbell等人，1991；Moyle等人，1994；Han等人，1996；Campbell等人，1997)。因此，通過將hCGβ亞基的座位系帶簡單地改變成hFSH的座位系帶，可能制備能結(jié)合FSH和TSH變體的hCG類似物(Campbell等人，1997)。該類似物不含TSH特異性殘基，但是仍然能刺激TSH應(yīng)答，最大水平和TSH一樣。如果比較這些多功能性類似物中一些類似物的活性，可以得出結(jié)論，大多數(shù)“座位系帶”和幾乎所有的第二β亞基環(huán)不可能形成關(guān)鍵的高親和性受體基本接觸。
關(guān)于LH、FSH或TSH受體晶體結(jié)構(gòu)的報道還沒有。然而，幾種糖蛋白激素受體的氨基酸序列是已知的(Moyle等人，1994；McFarland等人，1989；Loosfelt等人，1989；Segaloff等人，1990；Sprengel等人，1990；Braun等人，1991；Nagayama等人，1991；Nagayama等人，1989；Jia等人，1991)。這些蛋白看來具有胞外、跨膜、和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在沒有表達出跨膜或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Braun等人，1991；Ji等人，1991；Xie等人，1990；Moyle等人，1991)或與其它跨膜結(jié)構(gòu)域一起表達(Moyle等人，1991)時，發(fā)現(xiàn)胞外結(jié)構(gòu)域提供了受體對配體大部分的親合力。這些蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域是富含亮氨酸重復(fù)序列蛋白家族的成員，而跨膜結(jié)構(gòu)域看來具有7個跨越質(zhì)膜的疏水性螺旋構(gòu)型(McFarland等人，1989)。已經(jīng)測定了核糖核酸酶抑制劑的晶體結(jié)構(gòu)(一種富含亮氨酸重復(fù)序列蛋白質(zhì)的模型結(jié)構(gòu))并顯示出它具有馬蹄形狀(Kobe等人，1993和1995)。該發(fā)現(xiàn)提示LH、FSH和TSH受體的胞外結(jié)構(gòu)域是馬蹄形的(Moyle等人，1995)。利用LH/FSH受體嵌合體，已經(jīng)鑒定出控制其hCG和hFSH結(jié)合特異性的LH和FSH受體胞外結(jié)構(gòu)域的部分(Moyle等人，1994)。在考慮了最可能接觸LH受體的hCG部分和負責配體結(jié)合特異性的LH受體部分后，設(shè)計出一種模型來解釋該激素與LH受體相互作用并引發(fā)信號轉(zhuǎn)導的能力(Moyle等人，1995)。在該模型中，第2α亞基環(huán)和第1和第3β亞基環(huán)之間的溝槽接觸靠近馬蹄形中間的受體胞外結(jié)構(gòu)域邊緣(Moyle等人，1995)。激素的其余部分伸入馬蹄形臂之間的空間內(nèi)。當激素與受體結(jié)合并伸入該空間時，它使信號轉(zhuǎn)導所需的胞外結(jié)構(gòu)域的構(gòu)型穩(wěn)定。這通過細胞表面上合適的受體表達所需的胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域之間的特異性接觸，來作用于跨膜結(jié)構(gòu)域上(Moyle等人，1991)。這個模型解釋了寡糖影響信號轉(zhuǎn)導的能力(Moyle等人，1975；Matzuk等人，1989)。然而，盡管該模型能解釋這些信息，但是還提出了hCG不同部分與受體相互作用的其它模型(Jiang等人，1995)。因此，仍然不清楚糖蛋白激素是怎樣和其受體相互作用的。
激素受體相互作用的這種觀點還解釋了一些單克隆抗體對hCG結(jié)合的抑制作用，這些單抗識別認為不參與關(guān)鍵的受體接觸的hCG區(qū)域。如以前所討論的，這些區(qū)域包括由α亞基環(huán)1和環(huán)3以及β亞基環(huán)2形成的激素表面。在該模型中，這些區(qū)域伸入受體胞外結(jié)構(gòu)域的N端和C端臂之間的空間內(nèi)?？贵w與這些部位的結(jié)合阻止了激素進入該空間。
大多數(shù)脊椎動物種類的糖蛋白激素中半胱氨酸位置相似(Pierce等人，1981)提示，它們會象hCG一樣折疊。由于其胞外結(jié)構(gòu)域中富含亮氨酸的重復(fù)序列以及其跨膜結(jié)構(gòu)域中大量保守性殘基的相似性(Moyle等人，1994；Braun等人，1991；Nagayama等人，1991)，糖蛋白激素受體的結(jié)構(gòu)可能也非常類似。因此，成功地解釋了hCG和LH受體相互作用的的任何模型似乎還能預(yù)計其它糖蛋白激素與其受體相互作用的能力。座位系帶能影響配體-受體相互作用特異性的一種方式是改變激素亞基的相對位置(Cosowsky等人，1997)。這將改變第二α亞基環(huán)和第一和第三β亞基環(huán)之間溝槽的形狀。已經(jīng)指出，激素和受體中的抑制性元件負責阻止不合適的配體-受體相互作用(Moyle等人，1994)。因此，座位系帶的作用是改變激素的形狀以減少其裝配入馬蹄形中央部分的能力。
糖蛋白激素有幾種治療用途。FSH用來在女性排卵誘導準備中誘導卵泡發(fā)育(Galway等人，1990；Shoham等人，1991；Gast，1995；Olive，1995)。LH和hCG也用來誘導已經(jīng)開始發(fā)育的卵泡的排卵。FSH、LH和hCG在男性中用來誘導睪丸功能。盡管現(xiàn)有的激素能用來刺激男性和女性生殖腺和甲狀腺功能，但是這些激素實踐用于此目的需要它們是異二聚體。這些可以從腦垂體腺(即LH和FSH)、血清(馬絨膜促性腺激素)或懷孕婦女尿液(hCG)或絕經(jīng)期后婦女尿液(hLH和hFSH的混合物)中分離得到?；钚援惗垠w還可自表達α和β亞基的細胞培養(yǎng)物，包括腫瘤細胞培養(yǎng)(Cole等人，1981)或已經(jīng)轉(zhuǎn)染了編碼α和β亞基的cDNA或基因組DNA的細胞培養(yǎng)(Reddy等人，1985)中分離得到。實際上，后者是具有治療用途的糖蛋白激素的重要來源。由于糖蛋白激素的寡糖已經(jīng)表現(xiàn)出影響它們引發(fā)信號轉(zhuǎn)導的能力(Moyle等人，1975；Matzuk等人，1989)，因此活性異二聚體的制備和合成最好在真核細胞中進行。這些細胞能將大量甘露糖寡糖加入寡糖中，并在一些情況下將它們加工成天然激素中所見的寡糖復(fù)合物(Baenziger等人，1988)。然而，由于真核細胞能以不同方式加工糖蛋白，因此糖蛋白激素的合成通常在哺乳動物細胞系(例如從中國倉鼠卵巢(CHO)衍生獲得的細胞系)中進行。雖然能在非哺乳動物真核細胞中制得激素，但是其寡糖鏈的潛在抗原性限制了它們的臨床應(yīng)用。
異二聚體激素也已被用作免疫原來引發(fā)抗血清用于限制生育力(Singh等人，1989；Pal等人，1990；Talwar等人，1986；Talwar等人，1992；Moudgal等人，1971和1972；Moudgal，1976；Ravindranath等人，1990；Moudgal等人，1978)。鑒于hCG在維持人懷孕中的基本作用，產(chǎn)生針對hCG的免疫應(yīng)答可作為一種避孕方式，人們已經(jīng)作了許多努力來設(shè)計一種以hCG為基礎(chǔ)的避孕疫苗。然而，在原則上，針對激素的抗體也可用來促進生育力。例如，在一些患多囊性卵巢疾病的女性中，LH水平看來是過量的。因此，設(shè)計一種能減少但不消除循環(huán)性LH活性的方法將有利于恢復(fù)生育力。
對糖蛋白激素代謝的了解很少。已經(jīng)知道，該激素的半衰期受其寡糖含量的影響(Baenziger等人，1988)，尤其是其末端糖殘基含量的影響。最穩(wěn)定的激素是該位置的唾液酸含量最高的那些激素(Murphy等人，1991；Baenziger等人，1992；Fiete等人，1991；Smith等人，1993；Rosa等人，1984)。然而，寡糖并不完全負責激素的穩(wěn)定性，因為知道游離的激素亞基具有明顯較短的循環(huán)半衰期，即使它們具有和異二聚體相同的寡糖(Wehmann等人，1984；Kardana等人，1991)。實際上，已經(jīng)提出，激素可能被導致亞基解離的蛋白水解滅活(Kardana等人，1991；Birken等人，1991；Cole等人，1991；Cole等人，1991；Cole等人，1993)。有缺口的hCG比hCG更快地解離成其無活性的亞基(Cole等人，1993)。因此，預(yù)計能阻止或減少亞基解離的步驟將提高激素效率。
在變性條件(包括熱處理、極端pH和尿素)下，糖蛋白激素亞基迅速解離(Pierce等人，1981；Cole等人，1993)。出于這個原因，大多數(shù)糖蛋白激素制備物以凍干粉末形式保藏。提高異二聚體穩(wěn)定性的步驟能用來保藏激素制備物并使其分配在水溶液中。這樣就不需要購買分開的激素稀釋劑，成品使用者也不需要另外進行激素的重建。
人們已經(jīng)作了一些嘗試，試圖通過“交聯(lián)”它們的亞基來使激素穩(wěn)定?；瘜W交聯(lián)方法已被采用(Weare等人，1997和1979)；然而，這會導致活性降低。還可以通過β和α亞基基因融合來產(chǎn)生單鏈激素。該分子比異二聚體更穩(wěn)定，并具有高的生物活性(Sugahara等人，1995)；然而，它與天然分子有很大不同。
交聯(lián)蛋白質(zhì)的另一種方法是用二硫鍵將它們系在一起。這種策略自然地發(fā)生能使半胱氨酸結(jié)節(jié)超家族其它蛋白(Sun等人，1995)穩(wěn)定，并可能替代“座位系帶”。另外，在蛋白質(zhì)中增加二硫鍵可增強它們的穩(wěn)定性，只要該二硫鍵的加入不提高蛋白質(zhì)內(nèi)的內(nèi)部應(yīng)變力(Matthews，1987；Matsumura等人，1989)。加拿大專利CA 2188508已經(jīng)報道了用二硫鍵使糖蛋白異二聚體穩(wěn)定。在Han等人(1996)中也有關(guān)于這些亞基間二硫鍵的評論，但是該文獻報道說，引入這樣的二硫鍵可能會降低激素活性。這非常有可能，因為這些異二聚體是具有幾個二硫鍵的復(fù)合蛋白。在這些蛋白中增加一個半胱氨酸可能會破壞折疊，產(chǎn)生無功能的蛋白。另外，人們也不可能根據(jù)其它半胱氨酸結(jié)節(jié)蛋白來預(yù)計使糖蛋白激素穩(wěn)定的二硫鍵位置，因為其它半胱氨酸結(jié)節(jié)蛋白中的亞基組織方式和糖蛋白激素中的有很大不同(Sun等人，1995)。
本文引用的任何文章并不意味著承認該文章與現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)或被認為是本申請任一權(quán)利要求專利性的材料。關(guān)于任何文章的內(nèi)容和日期的聲明是根據(jù)提交時申請人獲得的信息，這并不是指承認該文章的正確性。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個目的是克服了如上所述的現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。本發(fā)明的糖蛋白激素類似物提供了改進的穩(wěn)定性，并同時保留了對應(yīng)糖蛋白激素的至少一部分生物活性。較佳的是，本發(fā)明的類似物保留了對應(yīng)激素針對其天然受體的至少25％的親和力。本發(fā)明的這些類似物比現(xiàn)有技術(shù)中的糖蛋白激素類似物有所改進，因為通過修飾一個α或β或兩個亞基中的殘基，合理地設(shè)計亞基間二硫鍵的位置，從而最大程度地減少了亞基間交聯(lián)對激素結(jié)構(gòu)的潛在影響。
本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這種改進的糖蛋白激素類似物最好應(yīng)符合這樣的規(guī)則，即亞基間交聯(lián)必須放置在涉及天然二硫鍵的兩個已有(天然)半胱氨酸殘基內(nèi)而不在對應(yīng)的天然亞基最外面的半胱氨酸之外。具有亞基間二硫鍵的現(xiàn)有技術(shù)中的糖蛋白激素類似物沒有一種符合該規(guī)則。
本發(fā)明另一方面是提供一種糖蛋白激素類似物，它在α亞基半胱氨酸結(jié)節(jié)和β亞基半胱氨酸結(jié)節(jié)之間有亞基間二硫鍵。這最大程度地減少了糖蛋白激素的微擾，并使其基本上保留了對應(yīng)的天然激素所具有的刺激促性腺激素受體的活性，同時賦予了改進的穩(wěn)定性?，F(xiàn)有技術(shù)中也未曾公開或提示過該特征。
本發(fā)明另一方面是提供一種糖蛋白激素類似物，該類似物在α亞基環(huán)3內(nèi)半胱氨酸殘基和β亞基環(huán)2內(nèi)半胱氨酸殘基之間或α亞基環(huán)1和β亞基環(huán)2之間具有亞基間二硫鍵。這也限制了糖蛋白激素的微擾，并使其保留了一部分對應(yīng)天然激素所具有的刺激促性腺激素受體的活性，同時賦予了改進的穩(wěn)定性?，F(xiàn)有技術(shù)中也未曾公開或提示過該特征。
將本發(fā)明的類似物配制到藥物組合物中后，它可用來治療不育癥或限制需要治療患者的生育力。本發(fā)明類似物的異二聚體能作為液體藥物制劑穩(wěn)定地運輸和保藏。
本發(fā)明還提供了含有編碼該糖蛋白激素類似物α和β亞基的核苷酸序列的重組DNA分子，該重組DNA分子可以是表達載體。本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)化這些重組DNA分子的真核宿主細胞，以及用來制備本發(fā)明類似物的方法。
附圖簡述圖1A-1C顯示了hCGα亞基的結(jié)構(gòu)(圖1A)，用單字母密碼表示氨基酸序列(圖1B)，以及糖蛋白激素亞基中結(jié)構(gòu)元件的大致示意圖(圖1C)。從圖1A可以看出，半胱氨酸結(jié)節(jié)將亞基分成三個大環(huán)。環(huán)1和3顯示在頂部。注意，黑線指氨基酸骨架的Cα原子，而灰線指二硫鍵。圖1B中的線表示二硫鍵。表1A中列出的糖蛋白激素亞基的結(jié)構(gòu)元件以示意圖形式顯示在圖1C中。
圖2A和2B表示hCGβ亞基的結(jié)構(gòu)(圖2A)及其用單個字母密碼表示的氨基酸序列(圖2B)。從圖2A可以看出，半胱氨酸結(jié)節(jié)將β亞基分成三個大環(huán)。環(huán)2顯示在頂部。發(fā)現(xiàn)圖右側(cè)的小環(huán)在座位系帶中。該區(qū)域中帶正電荷和負電荷的殘基分別對LH和TSH活性很重要。顯示出連接該小環(huán)和β亞基環(huán)1的殘基(看上去從小的座位系帶環(huán)向下跑向β亞基的其余部分)對FSH和TSH受體結(jié)合有主要的影響。注意，黑線指氨基酸骨架的Cα原子，而灰線指二硫鍵。已經(jīng)繪出的圖2B中的線來描述二硫鍵。
圖3A和3B顯示了質(zhì)粒pSVL-α，pCI-α，pSVL-αC7S和pC7-αC7S編碼的α(圖3A)和αC7S(圖3B)的翻譯的氨基酸序列。由于每個翻譯的蛋白具有相同的前導序列，因此預(yù)計兩者以相同方式加工，產(chǎn)生由92個氨基酸組成的蛋白并具有以APD為開始的N端氨基酸序列。用于此圖以及其它圖中的單字母密碼是A，丙氨酸(Ala)；C，半胱氨酸(Cys)；D，天冬氨酸(Asp)；E，谷氨酸(Glu)；F，苯丙氨酸(Phe)；G，甘氨酸(Gly)；H，組氨酸(His)；I，異亮氨酸(Ile)；K，賴氨酸(Lys)；L，亮氨酸(Leu)；M，甲硫氨酸(Met)；N，天冬酰胺(Asn)；P，脯氨酸(Pro)；Q，谷氨酰胺(Gln)；R，精氨酸(Arg)；S，絲氨酸(Ser)；T，蘇氨酸(Thr)；V，纈氨酸(Val)；W，色氨酸(Trp)；和Y，酪氨酸(Tyr)。大寫字母表示Cys7被絲氨酸替代形成C7S的位置。
圖4A和4B表示質(zhì)粒pSVL-hCGβ′和pSVL-hCGβ′C7S編碼的hCGβ′(圖4A)和hCGβ′Y37C(圖4B)的翻譯的氨基酸序列。由于每個序列具有相同的前導序列，因此預(yù)計兩者以相同方式加工產(chǎn)生由145個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，并具有以SKE為開始的N端氨基酸序列。大寫字母指Tyr37突變成半胱氨酸的位置。
圖5表示α亞基中C7S突變對α亞基單克隆抗體A113和A407結(jié)合的影響。對在細胞培養(yǎng)中制備的重組hCG(rhCG)以及每對條圖下所示的、其結(jié)構(gòu)在實施例中有所描述的類似物進行夾心免疫試驗，采用B112作為捕獲抗體，放射性碘化的A113或A407作為檢測抗體。B112識別含有β亞基環(huán)3中殘基的表位；A113識別包括α亞基環(huán)1中殘基的表位；A407識別包括α亞基N端以及α亞基環(huán)1不同部分的殘基的表位。A407和A113識別的表位不重疊，因為兩者能同時結(jié)合hCG。每一對的右側(cè)條圖指B112/A407試驗。左側(cè)條指B112/A113試驗。從圖中看出，C7S突變對A407結(jié)合的影響比對A113結(jié)合的影響大得多。
圖6顯示了hCG(α31-β37)與LH受體的結(jié)合。該圖描述了細胞培養(yǎng)中制得的rhCG(向上的三角)、尿液中純化的hCG(方塊)或細胞培養(yǎng)中制得的hCG(α31-β37)(向下的三角)抑制125I-hCG和表達LH受體的200,000 CHO細胞結(jié)合的能力?？v軸數(shù)值指在培育末與細胞結(jié)合的放射性標記的hCG的數(shù)量。該試驗表明，hCG(α31-β37)與LH受體的結(jié)合和hCG相似。
圖7顯示了hCG(α31-β37)的LH受體信號轉(zhuǎn)導活性，并描述了rhCG和hCG(α31-β37)促進表達LH受體的200,000CHO細胞中環(huán)腺苷酸累積的能力。在對激素刺激應(yīng)答中產(chǎn)生的環(huán)腺苷酸是一種廣泛認同的信號轉(zhuǎn)導參數(shù)。該試驗表明，hCG(α31-β37)刺激的環(huán)腺苷酸累積和hCG相似。
圖8顯示了含有亞基間二硫鍵的hCG類似物以及hCG的熱穩(wěn)定性。根據(jù)橫坐標指定的間隔時間85℃培育相似量的hCG和類似物。冷卻樣品作夾心免疫試驗，用抗hCGα亞基抗體A113(捕獲抗體)和放射性碘化的抗hCGβ亞基抗體B112(檢測抗體)確定保留的異二聚體的量。橫坐標上的數(shù)值指該試驗中相對于加熱前hCG起始量存留的活性量。該試驗表明，在85℃，hCG被迅速破壞，而交聯(lián)的類似物基本上保留其活性至少20分鐘。
圖9顯示了hCG和交聯(lián)類似物對尿素解離的穩(wěn)定性。圖中描述了在每條泳道頂部鑒定的8M尿素對rhCG和交聯(lián)的hCG類似物的影響。用8M尿素處理hCG來促進其亞基解離是眾所周知的，該發(fā)現(xiàn)在這里得到確認。從圖中可以看出，用8M尿素處理交聯(lián)類似物不會促進亞基解離而導致對應(yīng)于異二聚體的條帶喪失。圖中左側(cè)標出了異二聚體和游離的β亞基的位置。在未處理的和經(jīng)尿素處理的樣品進行電泳后，將凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉硝酸纖維素表面上殘留的非特異性蛋白位點，用放射性碘化的B105檢測二聚體和游離的β亞基。
圖10A和10B示出了以氨基酸單字母密碼表示的質(zhì)粒pSVL-CFC101-114β和pSVLCFC101-114βY37C編碼的CFC101-114β′(圖10A)和CFC101-114β′Y37C(圖10B)的翻譯的氨基酸序列。由于兩者有相同的前導序列，因此預(yù)計兩者以相同方式加工產(chǎn)生由145個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，具有以SKE為開始的N端氨基酸序列。大寫字母的位置表示Tyr37突變成半胱氨酸的位置。有下劃線的序列從hFSHβ亞基衍生獲得。殘基Arg95-Ser96的密碼子形成了BglII位點，Val102-Arg-103-Gly104的密碼子形成了SstII位點。
圖11顯示了α31-β37以及α51-β99二硫鍵對α亞基單克隆抗體A113和A407結(jié)合雙功能性hCG/hFSH嵌合類似物的影響。對每對條圖下方示出的hCG和CFC101-114類似物(其結(jié)構(gòu)在實施例中有所描述)進行夾心免疫試驗，用B112作為捕獲抗體，放射性碘化的A113或A407作為檢測抗體。B112識別含有β亞基環(huán)3中殘基的表位；A113識別包括α亞基環(huán)1中殘基的表位；A407識別包括α亞基N端以及α亞基環(huán)1不同部分的殘基的表位。A407和A113識別的表位不重疊，因為兩者能同時結(jié)合hCG。每一對的右側(cè)條圖指B112/A407試驗。左側(cè)條圖指B112/A113試驗。從圖中看出，α31-β37和α51-β99二硫鍵均沒有恢復(fù)A407與CFC101-114的結(jié)合活性。
圖12顯示了hCG、CFC101-114和含有亞基間二硫鍵的CFC101-114類似物的熱穩(wěn)定性。根據(jù)橫坐標指定的間隔時間85℃培育hCG、CFC101-114和CFC101-114類似物。冷卻樣品作夾心免疫試驗，用抗hCGα亞基抗體A113(捕獲抗體)和放射性碘化的抗hCGβ亞基抗體B112(檢測抗體)確定存留的異二聚體的量。橫坐標上的數(shù)值指試驗中相對于加熱前hCG起始量存留的活性量。該試驗表明，在85℃，hCG和CFC101-114被迅速破壞，而交聯(lián)的類似物基本上保留其活性至少20分鐘。
圖13顯示了hCG、CFC101-114和CFC101-114在表達LH受體的細胞中刺激環(huán)腺苷酸累積的能力。該圖表示，在為了比較它們刺激LH受體信號轉(zhuǎn)導而設(shè)計的試驗中，CFC101-114(α31-β37)(實心三角)的效力至少和CFC101-114(空心標記)一樣高。盡管CFC101-114(α51-β99)也刺激了信號轉(zhuǎn)導，但是其效力低于CFC101-114或CFC101-114(α51-β99)。因此，與制得α51-β99二硫鍵所需的突變相反，制得α31-β37二硫鍵所需的突變不影響信號轉(zhuǎn)導。座位系帶影響受體結(jié)合特異性是眾所周知的。因此，此圖中的數(shù)據(jù)支持了這樣一個觀點，即將二硫鍵導入認為不參與受體接觸或結(jié)合特異性的激素區(qū)域會對受體結(jié)合或信號轉(zhuǎn)導產(chǎn)生最低程度的影響。因此，不接觸受體和/或不提供受體結(jié)合特異性的激素區(qū)域?qū)⑹侵苽涠蜴I交聯(lián)的異二聚體的較佳的部位。
圖14顯示了hFSH、CFC101-114和CFC101-114(α31-β37)在表達FSH受體細胞中刺激環(huán)腺苷酸累積的能力。該圖表明，在為了比較它們刺激FSH受體信號轉(zhuǎn)導能力而設(shè)計的試驗中，針對CFC101-114(α31-β37)(實心三角)的最大應(yīng)答半值與CFC101-114(空心標記)的最大應(yīng)答半值相近。CFC101-114(α51-β99)的活性比CFC101-114或CFC101-114(α51-β99)低得多。因此，與制得α51-β99二硫鍵所需的突變相反，制得α31-β37二硫鍵所需的突變對FSH誘導的信號轉(zhuǎn)導的影響最小。座位系帶影響受體結(jié)合特異性是眾所周知的。因此，此圖中的數(shù)據(jù)支持了這樣一個觀點，即將二硫鍵導入認為不參與受體接觸或結(jié)合特異性的激素區(qū)域，將對FSH受體結(jié)合或信號轉(zhuǎn)導產(chǎn)生最低程度的影響。因此，不接觸受體和/或不提供受體結(jié)合特異性的激素區(qū)域?qū)⑹侵苽涠蜴I交聯(lián)的異二聚體的較佳部位。
圖15A和15B示出了質(zhì)粒pSVL-αK51C和pSVL-hcGβ′D99C編碼的αKSIC(圖15A)和hCGβD99C(圖15B)的翻譯的氨基酸序列。由于每個以hCGα-亞基為基礎(chǔ)的蛋白和每個以hCGβ亞基為基礎(chǔ)的蛋白具有和hCGα以及β亞基相同的信號肽前導序列，因此預(yù)計它們以相同方式被加工。因此，預(yù)計αK51C將含有含N端序列APD的92個氨基酸殘基，預(yù)計hCGβ′D99C將含有含N端序列SKE的145個氨基酸殘基。這里所用的氨基酸單字母密碼已經(jīng)在圖3A和圖3B圖例中定義。大寫字母指進行突變以形成亞基間二硫鍵的位置。
圖16顯示了hCG(用帶圓圈的實線表示)和hCG(α51-β99)(用帶向上三角的虛線表示)抑制放射性標記的hCG和表達LH受體的CHO細胞結(jié)合的相對能力。
圖17顯示了hCG(用帶圓圈的實線表示)、hCG(α-βD99C)(用帶向下三角的虛線表示)、hCG(α51-β99)(用帶向上三角的虛線表示)和hCG(αK51C-β)(用帶菱形的虛線表示)抑制放射性標記的hCG和表達LH受體的CHO細胞結(jié)合的相對能力。
圖18顯示了hCG(用帶圓圈的實線表示)和hCG(αK51A-β)(用帶向下三角的虛線表示)與放射性標記的hCG競爭結(jié)合表達LH受體的CHO細胞的相對能力。
圖19顯示了hCG(用帶圓圈的實線表示)、hCG(α51-β99)(用帶空心方塊的虛線表示)、hCG(α-βD99C)(用帶向上三角的虛線表示)和hCG(αK51C-β)(用帶圓圈的虛線表示)的相對的LH受體信號轉(zhuǎn)導活性。
圖20顯示了hCG(用帶圓圈的實線表示)和hCG(αK51A-β)(用帶空心方塊的虛線表示)的相對的LH受體信號轉(zhuǎn)導活性。
圖21示出了質(zhì)粒pSVL-CFC101-114β′D99C編碼的翻譯的氨基酸序列。由于該翻譯的蛋白具有和hCGβ亞基相同的信號序列，因此預(yù)計它以相同的方式加工，并產(chǎn)生有145個氨基酸并具有N-端氨基酸序列SKE的分泌的蛋白。大寫字母指進行突變以引入二硫鍵的位置。
圖22描述了hCG(用實線表示)、CFC101-114(用帶向上三角的虛線表示)、CFC101-114(α51--β99)(用帶向下三角的虛線表示)、CFC101-114(α-βD99C)(用帶實心菱形的虛線表示)和CFC101-114(αK51C-β)(用帶空心菱形的虛線表示)的相對的LH受體結(jié)合活性。
圖23描述了rhCG(用帶方塊的實線表示)、CFC101-114(用帶向上三角的虛線表示)和CFC101-114(αK51A-β)(用帶圓圈的虛線表示)的相對的LH受體結(jié)合活性。
圖24描述了hCG(用帶實心圓圈的實線表示)、CFC101-114(用帶空心方塊的虛線表示)、CFC101-114(α-βD99C)(用帶菱形的虛線表示)、CFC101-114(αK51C-βD99C)(用單個點表示)和CRC101-114(αK51C-β)(用最靠近橫坐標的線表示)的相對的LH受體信號轉(zhuǎn)導活性。
圖25描述了rhCG(用帶圓圈的實線表示)和CFC101-114(αK51A-β)(用帶向上三角的虛線表示)的相對的LH受體信號轉(zhuǎn)導活性。
圖26描述了hFSH(用帶圓圈的實線表示)、CFC101-114(用帶方塊的虛線表示)、CFC101-114(α-βD99C)(用帶向上三角的虛線表示)、CFC101-114(αK51C-βD99C)(用帶向下三角的實線表示)和CFC101-114(αK51C-β)(用帶空心標記的實線表示)抑制125I-hFSH結(jié)合表達hFSH受體的CHO細胞的相對能力。
圖27描述了hFSH(用帶圓圈的實線表示)、CFC101-114(用帶空心標記的虛線表示)在攜帶hFSH受體的CHO細胞中激發(fā)信號轉(zhuǎn)導的相對能力。CFC101(α51-β99)、CFC101-114(α-βD99C)和CFC101-114(αK51C-β)的信號轉(zhuǎn)導活性低得不能在所用類似物濃度下檢測到。
圖28描述了hFSH(用帶圓圈的實線表示)、CFC101-114(用帶空心方塊的虛線表示)和CFC101-114(αK51A-β)(用帶向上三角的虛線表示)在表達hFSH受體的CHO細胞中激發(fā)信號轉(zhuǎn)導的相對能力。
圖31A和31B顯示了用小寫字母氨基酸單字母密碼表示的αC7S，K51C(圖31A)和hCGβ′Y37C，D99C(圖31B)的氨基酸序列。圖31A中代替Cys7的絲氨酸和圖31B中代替Tyr37和Asp99的半胱氨酸用大寫字母表示。
圖29描述了hCG(用帶空心標記的實線表示)、hCG(α31-β37，α51-β99)(用帶實心標記的虛線表示)抑制125I-hCG結(jié)合表達LH受體的CHO細胞的能力。
圖30描述了hCG(用帶向下三角的實線表示)和hCG(α31-β37，α51-β99)(用帶圓圈的實線表示)在表達LH受體的CHO細胞內(nèi)刺激信號轉(zhuǎn)導的能力。
圖32A和32B顯示了αC27A(圖32A)和hFSHβY31C(圖32B)的氨基酸序列，αC27A是一種預(yù)計可用來制備通過α和β亞基之間的半胱氨酸結(jié)節(jié)間二硫鍵穩(wěn)定化的hCG，hLH，hFSH和hTSH類似物的α亞基類似物，hFSHβY31C是一種預(yù)計可用來制備通過α和β亞基之間的半胱氨酸結(jié)節(jié)間二硫鍵穩(wěn)定化的hFSH類似物的β亞基類似物。該圖用小寫字母氨基酸單字母密碼描述了α亞基類似物和hFSHβ亞基類似物的氨基酸序列。預(yù)計αC7A氨基酸序列中用大寫字母表示的α亞基中以丙氨酸替代Cys7和實施例1和2中描述的用絲氨酸替代Cys7有相同的效果。hFSHβY31C序列中31位的半胱氨酸殘基的存在也用大寫字母表示。表達該FSHβ亞基類似物以及αC7A或已經(jīng)被鑒定為αC7S的α亞基類似物的細胞預(yù)計將分泌出具有FSH活性的二硫鍵交聯(lián)的異二聚體蛋白。hFSHβY31C的這一信號序列與hFSHβ-亞基相同，因此，預(yù)計它象hFSHβ亞基一樣加工。因此，它的N端序列將會是NSC。
圖33顯示了制備糖蛋白激素類似物的遺傳密碼。
圖34A和34B顯示了αQ5C(圖34A)和hCGβR8C(圖34B)的氨基酸序列，αQ5C是一種預(yù)計可用來制備通過α和β亞基N端部分之間的亞基間二硫鍵穩(wěn)定化的hCG，hLH，hFSH和hTSH類似物的α亞基類似物，hCGβR8C是一種預(yù)計可用來制備通過α和β亞基N端部分之間的亞基間二硫鍵穩(wěn)定化的hCG類似物的β亞基類似物。該圖描述了一個α亞基類似物以及一個hCGβ亞基類似物的編碼序列，當這兩者共同表達時，預(yù)計會形成一個具有LH活性的二硫鍵交聯(lián)的激素類似物。該蛋白的氨基酸序列及其信號序列以單字母密碼描述。大寫字母表示形成亞基間二硫鍵所需突變的位置。
圖35顯示了hFSHβS2C的氨基酸序列，它是一種hFSHβ亞基類似物，預(yù)計可用來制備通過α和β亞基N端部分之間的亞基間二硫鍵穩(wěn)定化的hFSH類似物，其中Ser2被轉(zhuǎn)變成半胱氨酸。共同表達αQ5C(以前描述的)和hFSHβS2C的細胞預(yù)計將產(chǎn)生一個基本上有FSH活性的二硫鍵交聯(lián)的異二聚體。
圖36顯示了hLHβY37C的氨基酸序列，它是一種β亞基類似物，預(yù)計可用來制備通過α和β亞基之間的半胱氨酸結(jié)節(jié)間二硫鍵穩(wěn)定化的hLH類似物，小寫字母代表氨基酸單字母密碼。用大寫字母表示37位存在半胱氨酸殘基。表達該LHβ亞基類似物和以前鑒定為αC7S或αC7A的α亞基類似物的細胞預(yù)計將分泌出具有LH活性的二硫鍵交聯(lián)的異二聚體蛋白。hLHβY31C的這一信號序列與hLHβ-亞基的相同，因此，預(yù)計它象hLHβ亞基一樣被加工。因此，其N端序列將會是SRE。
圖37顯示了hLHβW8C的氨基酸序列，它是一種β亞基類似物，預(yù)計可用來制備通過α和β亞基N端部分之間的亞基間二硫鍵穩(wěn)定化的hLH類似物，其中Trp8被轉(zhuǎn)變成半胱氨酸。共同表達αQ5C(以前描述的)和hLHβW8C的細胞預(yù)計將產(chǎn)生一個有LH基本活性的二硫鍵交聯(lián)的異二聚體。
圖38顯示了hTSHβY30C的氨基酸序列，它是一種β亞基類似物，預(yù)計可用來制備通過α和β亞基之間的半胱氨酸結(jié)節(jié)間二硫鍵穩(wěn)定化的hTSH類似物，小寫字母代表氨基酸單字母密碼。用大寫字母表示30位存在半胱氨酸。表達該TSHβ亞基類似物和以前鑒定為αC7S或αC7A的α亞基類似物的細胞預(yù)計將分泌出具有TSH活性的二硫鍵交聯(lián)的異二聚體蛋白。hTSHβY31C的這一信號序列與hTSHβ-亞基的相同，因此，預(yù)計它象hTSHβ亞基一樣被加工。因此，其N端序列將會是FCI。
圖39顯示了hTSHβF1C的氨基酸序列，它是一種β亞基類似物，預(yù)計可用來制備通過α和β亞基N端部分之間的亞基間二硫鍵穩(wěn)定化的hTSH類似物，其中Phe1被轉(zhuǎn)變成半胱氨酸。共同表達αQ5C(前面描述的)和hTSHβF1C的細胞預(yù)計將產(chǎn)生一個基本有TSH活性的二硫鍵異二聚體。
圖40示出了αC7S密碼子的構(gòu)建。
圖41示出了pSVL-CFC101-114β′的構(gòu)建。
圖42示出了pSVL-CVC94-114β′的構(gòu)建。
圖43示出了pSVL-CFC101-106β′的構(gòu)建。
圖44示出了pSVL-αK51C的構(gòu)建。
圖45顯示了hFSH以及類似物αV76C+hFSHβV38C在表達人FSH受體的CHO細胞中刺激環(huán)腺苷酸累積的能力。
圖46顯示了hCG以及類似物α+hCGβR6C，Y37C在表達LH受體的CHO細胞中刺激環(huán)腺苷酸累積的能力。
發(fā)明詳述本發(fā)明的糖蛋白激素類似物代表了超過CA2188508和Han等人(1996)通用說明的改進之處。亞基間二硫鍵使糖蛋白激素異二聚體的α和β亞基穩(wěn)定。改進的類似物被特別設(shè)計成減少激素三維結(jié)構(gòu)的微擾，因而更有可能在體內(nèi)形成二聚體，形成的二聚體將對天然受體有親合力，并對其有拮抗活性。
本文所用的術(shù)語“類似物”指糖蛋白激素選自人絨膜促性腺激素(hCG)、人促黃體素(hLH)、人促卵泡激素(hFSH)、人促甲狀腺激素(hTSH)，及其功能性突變蛋白，其中對它們的α和β亞基的氨基酸序列作修飾，在每個亞基內(nèi)產(chǎn)生游離的半胱氨酸來形成亞基間二硫鍵，從而使異二聚體穩(wěn)定。
本文所用的術(shù)語“突變蛋白”指經(jīng)修飾的、但未經(jīng)修飾以產(chǎn)生亞基間二硫鍵的糖蛋白激素hCG、hLH、hFSH和hTSH，它們基本上(至少80％)保留了它們的功能性生物活性，例如受體親和性和激素效能、抗體識別性，或針對不同的糖蛋白激素而言提高它們的親和性或特異性(嵌合型糖蛋白激素會產(chǎn)生這種情況)，無論這些突變蛋白是否表述成具有功能。
為了產(chǎn)生糖蛋白激素的突變蛋白，可用本領(lǐng)域中認同的任何方法修飾蛋白。方便起見，修飾可分為在合適宿主細胞中表達編碼修飾蛋白的修飾基因來實現(xiàn)的那些修飾(稱為“突變”)，或是并非在細胞中表達的那些修飾(稱為“衍生”)。
盡管通常衍生物的制備是首先合成前導分子然后再衍生，但是也可直接制備衍生物。然而，術(shù)語“衍生物”的隱含意義是通過修飾前導分子用可行技術(shù)獲得衍生物，即使那不是較佳的生產(chǎn)方法。
對蛋白的修飾可分為下列幾類有利的—這些修飾增強了特定用途蛋白的效用。
中性—這些修飾既不增強也不削弱特定用途蛋白質(zhì)的效用。
不利的—這些修飾削弱(但不一定消除)了特定用途蛋白的效用。
滅活性—這些修飾消除了特定用途蛋白的效用。
可以忍受的—這些修飾是有利的、中性、或不利的，但是并非滅活。
由于蛋白可能有一種以上的用途，因此一種修飾可能對一種用途有利、對第二種用途不利、對第三種用途呈中性，而對第四種用途為滅活。
通常，對于蛋白特定結(jié)構(gòu)或多或少有特異性的用途(而不是僅取決于蛋白質(zhì)氨基酸組成、分子量或總體物理性質(zhì)的用途)將討論修飾對蛋白適合性的影響。
蛋白可出于各種原因被修飾，包括一種或多種下列目的
·為了使分子更容易被檢測，例如放射性標記的、酶標記的和熒光標記的衍生物；·為了使分子對特定的物理、化學或生物因素(例如熱、光、氧化劑、還原劑和酶)更穩(wěn)定；·為了使分子在感興趣的溶劑中更易溶(例如有助于給藥)或更難溶(例如促進其沉淀或使其用于捕獲其它分子)；·為了限制分子能參與反應(yīng)的性質(zhì)(例如將保護基團置于氨基酸側(cè)鏈)，或相反地，用來擴展可能的反應(yīng)(例如將反應(yīng)基團置于分子上以促進隨后的偶聯(lián)反應(yīng))；·為了使分子的免疫原性更弱(或更強)；·為了增加(或減少)分子在給予對象后在特定器官或組織中的停留時間，或加速(或減慢)分子到達特定器官或組織；·為了增強(或削弱)分子的一種或多種生物學或免疫學活性，例如增加或減少分子其對受體的親和性，或改變其特異性；或·為了賦予新活性以補充原先的天然活性(例如將毒素和抗腫瘤抗體連接)；或·為了抑制分子的不需要的負效應(yīng)。
蛋白質(zhì)大多數(shù)的殘基能耐受一定程度的突變。突變形式可以是單個或多個替代、插入或缺失。較佳的是，插入或缺失發(fā)生在分子的末端、表面環(huán)或結(jié)構(gòu)域間的邊界上。
末端插入(更合適地應(yīng)稱為“增加”或“融合”)沒有較佳的最大值。常規(guī)方法是將一種蛋白和另一種蛋白融合以促進表達，或提供具有其成分生物活性的組合的融合蛋白。融合蛋白可用作一種前體，它能斷裂釋放活性蛋白，即使融合蛋白本身缺少活性。
對于末端缺失，更合適地應(yīng)稱為“截短”，這種修飾的目的非常重要。常規(guī)的方法是，當感興趣的僅僅是蛋白的免疫學性能時，將該蛋白充分地截短。人們可以將一個蛋白減至小到5個氨基酸的表位，并用其自身來引發(fā)T細胞應(yīng)答，或和其自身拷貝或免疫原性載體偶聯(lián)來引發(fā)B細胞應(yīng)答。當它生物活性必須保留時，對截短的限制可能將更嚴格。
較佳的是，在考慮了替代和任何內(nèi)部缺失和插入后，突變體的序列和原來的蛋白質(zhì)至少有50％(更佳的至少80％)相同。
蛋白可能更耐受下列突變(a)突變是替代而不是插入或缺失；(b)突變是在末端而不是內(nèi)部的插入或缺失，或如果突變在內(nèi)部，則突變在環(huán)中或結(jié)構(gòu)域間的接頭中；(c)突變影響的是表面殘基而不是內(nèi)部殘基；
(d)突變影響遠離結(jié)合部位的分子部分；(e)突變是一個氨基酸被另一個大小、電荷和/或疏水性相似的氨基酸替代；和(f)突變所在部位實際上是在感興趣的蛋白所屬的同源蛋白家族中的變化。
這些考慮可用來設(shè)計功能性突變體。
較佳的對于讀框殘基來說，更佳的對于整個鏈來說，修飾蛋白的預(yù)計的或試驗測得的三維結(jié)構(gòu)具有這樣一條主鏈(Cα碳)構(gòu)型，它和原先天然蛋白的預(yù)計的或試驗測得的三維結(jié)構(gòu)的均方根偏差宜小于5，更佳的小于3，還要佳的小于2，最佳的小于1。
蛋白三維結(jié)構(gòu)的測定對于人們設(shè)法修飾蛋白用于有用的目的或至少是避免滅活性修飾提供了相當多的指導。如果知道了全部三維結(jié)構(gòu)，實踐者就能知道那些殘基在表面上，那些在內(nèi)部，那些具有指向外部的側(cè)鏈，那些殘基被緊密包裹而那些沒有，鏈在何處可屈曲，在何處受約束，那些殘基在二級結(jié)構(gòu)中，那些殘基因鏈折疊而相互毗鄰，那些殘基可能以H鍵和鹽橋形式相互作用。
表面殘基的突變比內(nèi)部殘基更容易被耐受。內(nèi)部殘基的突變更有可能使蛋白不穩(wěn)定，從而通過蛋白變性影響其整個結(jié)合活性。表面殘基處的突變可能對結(jié)合活性沒有一點影響，或可能影響了一些活性，但不影響其它活性。無論如何，它們都不可能使蛋白變性。
測定蛋白的全部三維結(jié)構(gòu)的主要方法是X射線晶體學和NMR光譜學，而獲得高分辨率X射線衍射數(shù)據(jù)的主要障礙是結(jié)晶化步驟。hCG的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)從兩個實驗室(Lapthorn等人，1994；Wu等人，1994)獲得，并作為hLH，hFSH和hTSH的模型。
就較小的蛋白(較佳的是小于20kDa)而言，核磁共振(NMR)光譜也可用來描述三維結(jié)構(gòu)。關(guān)于NMR結(jié)構(gòu)測定的用途參見McIntosh等人1987年的著作。NMR也能提供較大蛋白結(jié)構(gòu)的部分信息。用重組DNA技術(shù)或可控制的蛋白水解方法可以分開產(chǎn)生較大蛋白的特別感興趣的區(qū)域，然后用NMR研究。
各種光譜變化拌有某些氨基酸環(huán)境電荷的改變。如果將氨基酸色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和組氨酸移動到極性較低的環(huán)境中，λmax和ε增加。因此，如果在極性溶劑中這些氨基酸之一的λmax和ε較高，則對于其游離氨基酸和相同的溶劑來說，該殘基必定被非極性氨基酸包圍和屏蔽。另外，如果蛋白光譜對溶劑極性的變化敏感，則所關(guān)注的氨基酸必定在表面上。氨基酸的另一個例子是，如果可滴定基團(例如酪氨酸的OH、組氨酸的咪唑、和半胱氨酸的SH)帶電荷，則λmax和ε始終增加。因此，通過將特殊變化和pH變化關(guān)聯(lián)起來，可能能推導出可滴定基團在表面上還是被包埋。通過比較(溶劑)分子具有不同平均直徑的溶劑所得的結(jié)果，可能能將深裂隙中的殘基和完全在表面上或完全包埋的那些殘基區(qū)分開來。
除了用于確定特定殘基的位置外，這些光譜技術(shù)還能幫助解決X射線和NMR分析中的不確定處。
氨基酸特異性化學親和標記可用來查出哪些殘基實際上是外露的。最有用的標記可能是與帶電荷殘基反應(yīng)的那些標記，因為那些標記最可能出現(xiàn)在表面上。樣品標記包括下列

然后使標記的和未標記的蛋白分開受片段化試劑(例如溴化氰、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶或亞碘?；郊姿?的作用。用二維電泳比較標記蛋白斷裂產(chǎn)生的肽和從天然蛋白衍生的那些肽。對遷移率改變的肽測序，確定已修飾的氨基酸。
Adachi等人(1989)用Arg和Lys特異性試劑來研究這些殘基在EC-SOD的催化和肝素結(jié)合活性中的作用。他們發(fā)現(xiàn)，這些殘基的修飾結(jié)果減弱了這些活性；然而，他們沒有辨明那些殘基已經(jīng)被修飾。
表面殘基還可用光親和標記來鑒定，這些光親和標記在光照時形成高度活性的中間產(chǎn)物，例如氮賓和卡賓。這些物質(zhì)能插入C-H鍵，因此能和任何可及的氨基酸反應(yīng)。出于這個原因，現(xiàn)已用光親和標記來研究膜拓撲圖。一些蛋白在膜的四周，其它一些與膜成為一體。
非特異性標記試劑的另一個例子是氚?？梢允拐郫B蛋白氚化(用氚化水交換氫)、變性并變成片段，對片段測序并測試放射活性氚的存在。
所有這些標記方法還可用來確定殘基(除了在表面上之外)是否還是結(jié)合部位的一部分。將游離蛋白標記后獲得的標記分布與復(fù)合蛋白標記后獲得的分布比較。由于在復(fù)合物中結(jié)合伙伴封閉了結(jié)合蛋白的結(jié)合部位殘基，因此游離蛋白中的結(jié)合部位殘基應(yīng)當被標記，而復(fù)合蛋白中的則沒有被標記。
通常，在序列和功能相似的蛋白家族中，表面殘基比內(nèi)部殘基更可能改變。這更可能的原因是表面殘基不可能參與與其它殘基的相互作用，這種相互作用是維持蛋白整體構(gòu)型所必需的。
鑒定蛋白表面殘基的最可靠的方法是用X射線衍射測定蛋白的三維結(jié)構(gòu)。即使是不完整的三維結(jié)構(gòu)也能用來設(shè)計突變體。遷移率高的殘基(通過高于平均晶體學熱系數(shù)證明)是最不易發(fā)生失去穩(wěn)定突變的那些殘基。見Alber等人(1987)。
盡管在表面位置可進行許多氨基酸替代而不會產(chǎn)生不利的影響，但是內(nèi)部位置的替代卻會使蛋白嚴重地不穩(wěn)定。在同源蛋白家族內(nèi)，最保守的殘基除了功能性氨基酸外就是被包埋的那些殘基。
對蛋白折疊自由能、進而是蛋白穩(wěn)定性的主要貢獻來自包埋在內(nèi)部的疏水性側(cè)鏈，從而將它們和溶劑隔離。堆積密度通常很高。通常，蛋白對改變核心殘基體積的突變的耐受能力更大程度上取決于整個核心殘基體積中的凈電荷，而不是單個殘基體積變化量。換句話說，核心位置體積的增加可以補償另一個核心位置體積的減少。較佳的是，整個核心殘基體積中的凈電荷不超過10％，更佳的不超過5％。見Lim等人(1989)；Lim等人(1992)。
在沒有相反證據(jù)的情況下，所有被鑒定成是內(nèi)部殘基的殘基可能被假定成是單個核心的一部分。然而，蛋白質(zhì)可能折疊形成幾個不同的核心，上述體積保守規(guī)則應(yīng)分開應(yīng)用于每個核心。
蛋白包埋核心的結(jié)構(gòu)不僅取決于包埋的每個氨基酸(如果有的話)的傾向，而且還取決于該氨基酸在蛋白質(zhì)中出現(xiàn)的總頻率。最常見的包埋殘基是(按遞減次序)Val、Gly、Leu、Ala、Ile和Ser。
Lim等人(1992)報道，用親水性氨基酸(Asn，Gln)代替蛋白核心中的單個疏水性氨基酸(Leu，Val)可防止蛋白完全折疊并破壞生物活性。
包埋的Cys(-S-S-形式)、Asp、Gly、His、Pro和Trp在同源蛋白中有70％以上的可能不帶電荷。因此，如果這些殘基出現(xiàn)在感興趣蛋白內(nèi)被包埋的位置中，則最好使它們不帶電荷。它們的保守性可作如下解釋Cys(二硫鍵鍵合)、Asp(帶電荷但有剛性的側(cè)鏈)、Gly(鏈的柔韌性)、His(在生理pH下帶電荷和不帶電荷狀態(tài)均有)、Pro(唯一的鏈幾何結(jié)構(gòu))和Trp(最大的側(cè)鏈)。
其它殘基(除Met外)在倍包埋隱蔽時有40-60％的可能不帶電荷(Met只有26％的可能不帶電荷，但是它有25％的可能被Leu代替)。
下列包埋殘基替代的可能性超過10％Ala→Val，Glu→Gln，Phe→Leu，Ile→Leu，Ile→Val，Lys→Arg，Leu→Ile，Leu→Val，Met→Leu，Met→Val，Asn→Asp，Asn→Ser，Arg→Lys，Arg→Gln，Ser→Ala，Thr→Ser，Val→Ile，Val→Leu，Thr→Phe，Cys(-SH)→Ala下列替代的可能性在5-10％范圍內(nèi)Ala→Ser，Asp→Asn，Glu→Arg，Glu→Val，Phe→Ile，
Phe→Val，Phe→Tyr，His→Val，Leu→Phe，Met→Ala，Met→Ile，Gln→Glu，Gln→His，Gln→Met，Ser→Gly，Ser→Thr，Thr→Val，Val→Ala，Trp→Phe，Tyr→Leu，Cys(-SH)→Ser.
見Overington等人(1992)表5。
最相容的交換基團看來是(Arg，Lys)、(Leu，Ile，Met，Val，Phe)和(Ser，Thr，Ala)。然而，Ala和Val似乎相當容易混淆。
因此，通常最好完全避免突變包埋的殘基。然而，如果它們被突變，則應(yīng)限制核心體積中的總體變化，最好應(yīng)將突變限制為一個殘基用另一個殘基代替，這種典型替代可能性超過0(較佳的至少5％，最佳的至少10％)。包埋的Cys(-S-S)、Asp、Gly、His、Pro和Trp的突變應(yīng)當避免，這是不需要其它證據(jù)的正當理由。最安全的核心突變是一個疏水性氨基酸交換成另一個，以及Arg和Lys交換(或相反)。
然而，可以用內(nèi)部殘基的合理突變來改進蛋白的穩(wěn)定性。這些突變可印入與本來的結(jié)構(gòu)相容的增加的穩(wěn)定化相互作用(氫鍵、離子對)，或通過用較大的氨基酸代替較小的氨基酸或用支鏈或芳族側(cè)鏈代替線性側(cè)鏈來減少附近的相互作用基團的遷移率。見Alber等人(1987)。
更重要的是，除了對上述糖蛋白激素中殘基修飾的概述外，關(guān)于糖蛋白激素(尤其是hCG)的區(qū)域也有大量可獲得的信息，這些區(qū)域在結(jié)合糖蛋白激素受體后可能外露或不外露，并且不破壞激素受體相互作用(即受體親和性和激素效力)。關(guān)于可被安全修飾的殘基和區(qū)域的這些可獲得的信息在相關(guān)技術(shù)章節(jié)中以及本說明書其它處有所描述。因此，根據(jù)本文所述的以及從科學文獻獲得的大量結(jié)構(gòu)和功能的資料，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易對糖蛋白激素的氨基酸序列作出不破壞其功能的修飾。
另外，糖蛋白激素的功能性突變蛋白包括嵌合的糖蛋白激素，其中糖蛋白激素的一個或多個殘基或區(qū)域，即β亞基座位系帶，被另一個糖蛋白激素的對應(yīng)的殘基或區(qū)域代替，這種代替例如可能改變了受體結(jié)合特異性。本說明書中將討論影響受體結(jié)合特異性等的一些殘基和區(qū)域例子。
糖蛋白激素突變蛋白還包括單鏈糖蛋白激素，其中α-和β-亞基被翻譯成單鏈并正確折疊成其異二聚體構(gòu)型。
下面概述了一種可用來鑒定具有形成二硫鍵可能的殘基的程序。如下列實施例所證明的，并非所有的使hCG異二聚體及其類似物穩(wěn)定化的二硫鍵都保留了其全部的生物學效力。然而，在半胱氨酸結(jié)節(jié)之間導入亞基間二硫鍵能提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性而不破壞激素效力。
本發(fā)明的二硫鍵交聯(lián)的糖蛋白激素類似物可如下制得在每個亞基中產(chǎn)生游離的半胱氨酸，這些游離的半胱氨酸能交聯(lián)形成一個或多個亞基間二硫鍵。這可通過用半胱氨酸的密碼子代替一個或多個氨基酸的密碼子或用其它任何氨基酸的密碼子代替已有二硫鍵中半胱氨酸殘基密碼子來實現(xiàn)。然而，不能期望所有的這些替代都會產(chǎn)生亞基間二硫鍵。這里描述了在設(shè)計類似物時應(yīng)考慮的兩個因素。
1)最有用的二硫鍵交聯(lián)的糖蛋白激素類似物預(yù)計將具有類似于hCG，hLH，hFSH或hTSH的結(jié)構(gòu)。因此，二硫鍵不應(yīng)使蛋白的整個構(gòu)型有很大的扭曲。從表1B中數(shù)據(jù)可以預(yù)測預(yù)計對蛋白構(gòu)型破壞性影響最少的二硫鍵位置，該表描述了hCGα亞基中選定氨基酸(每對欄目的左欄)與hCGβ亞基的一個或多個鄰近殘基(每對欄目的右欄)的Cα和Cβ碳原子之間的大致距離。這些數(shù)值可以用幾種熟知的、廣泛使用的且公眾可得到的分子模型軟件包(包括Sybyl，Insight，Rasmol和Kinemage等一些名字)從hCG的晶體結(jié)構(gòu)計算出。表1B中所示的hCGα亞基中的氨基酸殘基和鄰近的hCGβ亞基的一個或多個殘基之間的距離，很容易從公開的hCG晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)(Lapthorn等人，1994；Wu等人，1994)計算出。
表1B選定hCGα-和β-亞基殘基的Cα和Cβ碳原子之間的大致距離




*[Cα碳之間的距離()，Cβ碳之間的距離()]與每個β亞基殘基有關(guān)的括號內(nèi)每對數(shù)值的左面數(shù)值表示β亞基殘基Cα碳原子與左欄內(nèi)對應(yīng)的α亞基殘基之間的距離。括號內(nèi)每對數(shù)值的右面數(shù)值表示這些殘基的Cβ碳原子之間的對應(yīng)距離。原理上，用半胱氨酸代替這些殘基配對將允許形成亞基間二硫鍵，只要兩個亞基內(nèi)不存在其它干擾性半胱氨酸。并非所有的半胱氨酸配對形成亞基間二硫鍵的可能性都相同。預(yù)計對異二聚體構(gòu)型影響最少的亞基間二硫鍵的形成將受其組成半胱氨酸側(cè)鏈原子取向的影響。放置二硫鍵的有利和較佳的位置包括Cβ碳原子之間的距離小于Cα碳原子之間距離的氨基酸配對。放置亞基間二硫鍵的最有利和最佳的位置是Cα和Cβ碳原子之間距離與天然存在的二硫鍵類似(即分別約為5.0-6.5和3.5-4.2)的那些配對。
因此，產(chǎn)生Cα碳原子相距4-8、Cβ碳原子更近1-2的半胱氨酸亞基間配對的替代，預(yù)計將最有機會形成對整個蛋白結(jié)構(gòu)影響最小的二硫鍵，和/或最有機會促進兩個或多個分子的分子間交聯(lián)。實際上，如實施例所示，本發(fā)明的這種“拇指(thumb)”規(guī)則已經(jīng)成功地產(chǎn)生了幾種保留hCG許多免疫學和激素性能的二硫鍵交聯(lián)的hCG類似物。
2)最具活性的二硫鍵交聯(lián)的糖蛋白激素類似物預(yù)計將在受體結(jié)合或信號轉(zhuǎn)導不需要的部位和/或激素活性構(gòu)型穩(wěn)定化不需要的部位含有交聯(lián)鍵。已經(jīng)知道，糖蛋白激素中有大量殘基是其生物活性所不需要的。這些殘基包括半胱氨酸結(jié)節(jié)中的大多數(shù)N端殘基(即天然α亞基中的第二個半胱氨酸和天然β亞基中的第一個半胱氨酸)。例如，已經(jīng)制得了高效的hFSH類似物，其中FSHβ亞基殘基(Asn1，Ser2)被其hCG對應(yīng)物(Ser1，Lys2，Glu3，Pro4，Leu5，Arg6，Pro7，Arg8)代替。因此，分子的該區(qū)域中通過用半胱氨酸代替hCGα亞基Gln5和β亞基Arg8產(chǎn)生的二硫鍵預(yù)計不會消除二硫鍵交聯(lián)的異二聚體的LH活性。類似地，通過用半胱氨酸代替hFSHα亞基Gln5和β亞基Ser2產(chǎn)生的二硫鍵預(yù)計不會消除二硫鍵交聯(lián)的異二聚體的FSH活性。通過將α亞基Cys31改變成Ala或Ser，和用Cys代替hCGβ亞基Arg6，或在FSHβ亞基的N端增加Cys，預(yù)計可以在hCG或hFSH的α和β亞基的N端區(qū)域產(chǎn)生二硫鍵。預(yù)計該二硫鍵不會破壞此二激素類似物任何一個的活性。
hCG的晶體結(jié)構(gòu)揭示，其每個亞基由半胱氨酸結(jié)節(jié)組成。因此，每個亞基含有稱為α1、α2、α3和β1、β2、β3的三個環(huán)。另外，β亞基有額外的20個氨基酸，它們稱為“座位系帶”，圍繞α2固定異二聚體，并在構(gòu)型上使其穩(wěn)定化使能結(jié)合其唯一受體。促黃體素、促卵泡激素和促甲狀腺激素中的半胱氨酸位置提示，所有這三個分子具有類似的整體折疊方式，且hCG的晶體結(jié)構(gòu)將是導入亞基間二硫鍵的合理指導。然而，F(xiàn)SH和TSH的結(jié)構(gòu)還未確定，這只能從hCG的結(jié)構(gòu)來推斷。每個亞基的半胱氨酸結(jié)節(jié)的晶體結(jié)構(gòu)均顯示各自高度相似。這是因為它們受三個組成的二硫鍵的高度約束。因此，預(yù)計半胱氨酸結(jié)節(jié)內(nèi)及毗鄰的殘基在每個激素中有類似的構(gòu)型。另外，在所有三類激素中在環(huán)β1和β3中相似位置上均有一個半胱氨酸。它們在hCG中形成了二硫鍵，預(yù)計在所有糖蛋白激素中都將形成二硫鍵。hCG的這些環(huán)中的骨架原子內(nèi)和之間的此二硫鍵和大量氫鍵提示，所有三個激素種類中的β1和β3的構(gòu)型非常相似。環(huán)α1和α3也含有幾個氫鍵，這提示分子的這部分在所有三個激素種類中也類似。這一觀點得到以下觀察結(jié)果的支持，即游離α亞基的NMR結(jié)構(gòu)顯示，α1和α3即使不在異二聚體中時也具有相似的構(gòu)型(DeBeer等人，1996)。盡管所有三種激素的其它部分在構(gòu)型上與hCG差不多相似，但是它們不可能象上述分子部分那樣和hCG結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。例如，β2含有相對較少的內(nèi)部氫鍵和/或和α1和α3接觸。由于它看來并非如hCG中那樣高度受約束，因此沒有理由相信它的結(jié)構(gòu)與其它激素的結(jié)構(gòu)完全相同。實際上，TSH中的環(huán)β2比hCG或hFSH中的大2個氨基酸殘基。α2的N端和C端參與大量的氫鍵接觸，而α2的C端部分也接觸β1。因此，α2的這些部分可能在大多數(shù)激素中相似。然而，α2的中央部分只和座位系帶(在三種激素中并不是非常保守的蛋白區(qū)域)接觸。α亞基的NMR結(jié)構(gòu)表明α2是高度無序的，該觀察結(jié)果提示，hCG中激素的這部分在異二聚體中有秩序良好的結(jié)構(gòu)僅僅是因為它被夾在β1、β3和座位系帶之間。座位系帶中的差異預(yù)計會改變α2的構(gòu)型，尤其是不靠近半胱氨酸結(jié)節(jié)的那些部分。
本發(fā)明者通過用免疫學探針研究能結(jié)合促黃體素和促卵泡激素受體的hCG類似物，已經(jīng)洞察了座位系帶對激素結(jié)構(gòu)的影響。這些數(shù)據(jù)提示，座位系帶的組成能改變激素構(gòu)型。相似的數(shù)據(jù)還提示，激素構(gòu)型能受受體影響。例如，結(jié)合位點已部分確定的單克隆抗體(Moyle等人，1990；Moyle等人，1995)已被用來研究雙功能性hCG類似物(CF101-109)在游離時以及結(jié)合LH和FSH受體時的構(gòu)型。已通過用hFSH座位系帶殘基95-103代替hCG座位系帶殘基101-109來制得CF101-109(Moyle等人，1994)。CF101-109被單克隆抗體識別的能力表明，座位系帶中FSH殘基的存在改變了兩個亞基間的相互作用。因此，A407(一種針對包括hCG而不是hFSHα亞基N端殘基的構(gòu)型表位的抗體)大大減少了對CF101-109的親合力，即使其表位遠離突變部位(表1C)。通過在結(jié)合LH受體時能A407識別CF101-109但結(jié)合FSH受體時不能識別的這一事實(表1D)，可見受體對激素結(jié)構(gòu)的影響。識別全部位于α1和/或α2內(nèi)或β1和/或β3內(nèi)的表位的其它抗體即使在CF101-109結(jié)合受體時也識別CF101-109。
綜合起來，這些觀察結(jié)果提示，激素內(nèi)亞基的位置可能不相同，并可能受到與其受體相互作用的影響。因此，本發(fā)明者確定，除了考慮從hCG晶體結(jié)構(gòu)獲得的可進行半胱氨酸替代的相對位置和取向外，還應(yīng)考慮這樣一個可能hCG的晶體結(jié)構(gòu)將代表促卵泡激素和促甲狀腺激素的結(jié)構(gòu)和/或激素-受體復(fù)合物中激素的構(gòu)型。最有可能與hCG中的該部分相同、且最不可能在受體相互作用時被改變的激素部分包括在半胱氨酸結(jié)節(jié)之中或附近的殘基。
表1C用抗hCGα亞基單克隆抗體識別hCG、hFSH和hCG/hFSH嵌合體

注意嵌合體通過hCG的殘基被hFSH的殘基代替來鑒定。因此，CF94-97指hCGβ亞基殘基94-97被其FSH對應(yīng)物替代的類似物。hCGβ亞基殘基94-97在小的座位系帶環(huán)內(nèi)；101-109在座位系帶的羧基端一半內(nèi)；94-117在小的座位系帶環(huán)、座位系帶的羧基端一半、以及羧基端內(nèi)；39-58在環(huán)2內(nèi)以及環(huán)3的第一個殘基上。hCG和嵌合體被B112(上行)和B410(下行)捕獲。hFSH被抗體B602捕獲。數(shù)值代表一式三份的平均值，并相對于hCG標準化(顯示成100％)。當其與LHR復(fù)合時，只有A105和A407還和hCG結(jié)合(Moyle等人，1995)。
表1D放射性標記的抗體和與大鼠LHR或人HSFR復(fù)合的hCG或CF101-109的結(jié)合

注意形成配體受體復(fù)合物，然后如文中所述用放射性標記的單克隆抗體檢測。所述數(shù)值(一式三份的平均值±SEM)是cpm減去空白值。在大多數(shù)情況下，在相同實驗(用左欄數(shù)字表示)中獲得結(jié)合LHR和FSHR的數(shù)據(jù)?！芭cB105之比”通過將每個抗體所見放射性標記量除以B015獲得的量并對這些數(shù)值取平均值來計算出。除了A407對結(jié)合FSHR的CF94-117以及CF101-109的結(jié)合以外，所有數(shù)值均大于0(p＜0.05)。
半胱氨酸結(jié)節(jié)之間的區(qū)域是最具吸引力的用于工程改造二硫鍵的部位之一，是亞基間二硫鍵的較佳部位。每個亞基的半胱氨酸結(jié)節(jié)通過三個二硫鍵來穩(wěn)定，使得其成為分子中最具剛性的部分。本發(fā)明者的實驗結(jié)果表明，改變hCGβ亞基殘基Tyr37對激素活性的影響相當小。因此，本發(fā)明者預(yù)計，該部位存在半胱氨酸不會改變激素活性。加拿大專利CA 2188508沒有公開說明α和β亞基的半胱氨酸結(jié)節(jié)之間的亞基間二硫鍵將使促性腺激素異二聚體穩(wěn)定化，并保留激素活性。如本文實施例所示，能實現(xiàn)此目的的一種方式是用Ala或Ser代替α亞基殘基Cys7，以破壞Cys7-Cys31的亞基間二硫鍵，并用Cys代替hCGβ亞基Tyr37。產(chǎn)生的交聯(lián)的hCG類似物具有高的LH活性。類似地，在另一個非限制性例子中，可以制得一種交聯(lián)的CFC101-114類似物，它是一種hCG/hFSH嵌合體，其中hCGβ亞基氨基酸殘基101-114被其hFSH對應(yīng)物(即β亞基殘基95-108)代替。CFC101-114結(jié)合并激活LH和FSH受體。二硫鍵交聯(lián)類似物也能結(jié)合并激活LH和FSH受體。后一觀察結(jié)果表明，該二硫鍵沒有妨礙FSH受體活性，因此hFSH中的相似的二硫鍵也非常有可能不破壞其激素活性。二硫鍵交聯(lián)的hFSH的制備可這樣實現(xiàn)使α亞基cDNA和hFSHβ亞基cDNA共同表達，α亞基cDNA中Cys7被轉(zhuǎn)變成Ala，hFSHβ亞基cDNA中Tyr31被轉(zhuǎn)變成Cys。半胱氨酸結(jié)節(jié)中的二硫鍵也能和其它地方(例如在α環(huán)2和β座位系帶之間，或在α-N端和β-N端之間，這是一個較佳的實例)的另一亞基間二硫鍵一起出現(xiàn)。另外，α和β亞基的Cys結(jié)節(jié)之間形成的二硫鍵將游離出N端附近的殘基，即αCys7Ser，它能有利地用于聚乙二醇化。
位于α和β亞基的半胱氨酸結(jié)節(jié)之間的亞基間二硫鍵可能還符合這樣一個一般規(guī)則通過將交聯(lián)位置置于參與天然二硫鍵的兩個已有(天然)半胱氨酸殘基內(nèi)部而不在最N端或C端天然半胱氨酸的外部(即更N端或C端)來最大程度地減少結(jié)構(gòu)擾動的危險性，從而最大程度地減少亞基間交聯(lián)對激素結(jié)構(gòu)的潛在影響。加拿大專利CA2188508中公開和說明的亞基間二硫鍵沒有一個符合該一般規(guī)則。
不符合上述一般規(guī)則的通過α亞基環(huán)1或3與β亞基環(huán)2之間的二硫鍵交聯(lián)的激素類似物預(yù)計也會保留激素活性。這些區(qū)域?qū)Π被崽娲叨软槒?。因此，用牛α亞基代替人hCG或hFSH中的α亞基通常不會消除激素活性，即使牛和人α亞基在該區(qū)域中明顯不同。同樣，在β亞基環(huán)2中用hCG殘基成批替代hFSH殘基(以及反過來)不會消除任一激素的活性。因此，預(yù)計該區(qū)域中的二硫鍵不會破壞促黃體素或促卵泡激素的生物活性。這些二硫鍵包括通過將α亞基Gln27和hCG或hLHβ亞基Val44或hFSHβ亞基Val38變成Cys產(chǎn)生的那些二硫鍵。它們還包括通過將α亞基Val76和hCGβ亞基Val44或hFSHβ亞基Val38變成Cys制得的二硫鍵。預(yù)計保留基本活性的另一個亞基間二硫鍵交聯(lián)的類似物是α亞基殘基Lys75和hCG或hLHβ亞基殘基Gln46、或hFSHβ亞基殘基Lys40變成Cys的類似物。然而，后一類似物所帶正電荷少于hCG或hFSH，因此其整體LH或FSH活性可能較低。還可以將亞基間二硫鍵插入促黃體素和促卵泡激素的其它區(qū)域。這些二硫鍵中的一些包括β亞基座位系帶中的殘基(即通過Cys替代hCGβ亞基Asp99產(chǎn)生)和α亞基環(huán)2中的殘基(即，通過Cys替代α亞基Lys51產(chǎn)生)。該二硫鍵大大降低了hCG的LH活性以及雙功能性類似物CFC101-114的LH和FSH活性。從表2-4所示的這些蛋白中α和β亞基殘基的“等價”位置可以確定hLH、hFSH和hTSH中可以突變成半胱氨酸并且預(yù)計能產(chǎn)生二硫鍵的殘基位置。
表2人糖蛋白激素β亞基中的等價位置(未描述前導序列)hCG SKEPLRPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMTRV..QGVLPALPQVVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCALCRRSTTDCGGPKDHPLTCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPRLPGPSDTPILPQhLH SREPLRPWCHPINAILAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMMRV..LQAVLPPLPQVVCTYRDVRFESIRLPGCPRGVDPVVSFPVALSCRCGPCRRSTSDCGGPKDHPLTCDHPQLSGLLFL................... .
hFSH......NSCELTNITIAVEKEGCGFCITINTTWCAGYCYTRDLV..YKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE...........................
hTSH.......FCIPTEYMTHIERRECAYCLTINTTICAGYCMTRDINGKLFLPKYALSQDVCTYRDFIYRTVEIPQCPLHVAPYFSYPVALSCKCGKCNTDYSDCIHEAIKTNYCTKPQKSY...........................
注意點(.)指該位置沒有殘基。
表2中的信息可用來計算占據(jù)每種人激素β亞基中“等價”位置的殘基。現(xiàn)在只獲得了hCG的晶體結(jié)構(gòu)。然而，由于所有糖蛋白激素的氨基酸序列有高度的相似性(尤其是它們的亞基內(nèi)二硫鍵)，因此預(yù)計所有的激素將具有相似的形狀。所有異二聚體的整體構(gòu)型與hCG相似的結(jié)論還得到了下列觀察結(jié)果的支持可以制得hCG/hFSH、hCG/hLH和hCG/hTSH嵌合體，這些嵌合體保留了用來衍生獲得該嵌合體的先祖的區(qū)域中所見的表位。因此，預(yù)計該表中確定的等價殘基的替代將使亞基間二硫鍵具有已經(jīng)制得和鑒定的那些二硫鍵的類似性質(zhì)?！暗葍r位置”定義為縱坐標。因此，在hFSHβ亞基中，半胱氨酸3與hCGβ亞基的半胱氨酸9“等價”。
表3選定的脊椎動物α亞基氨基酸序列中的等價位置(未顯示前導序列)人 ....APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKS羊 FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKPDAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNVRVENHTECHCSTCYYHKS豬 FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNARVENHTECHCSTCYYHKS牛 FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKPDAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNVRVENHTECHCSTCYYHKS馬 FPDGEFTTQDCPECKLRENKYFFKLGVPIYQCKGCCFSRAYPTPARSRKTMLVPKNITSESTCCVAKAFIRVTVMGNIKLENHTQCYCSTCYHHKI大鼠LPDGDLIIQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKSFTKATVMGNARVENHTKCHCSTCYYHKS小鼠LPDGDFIIQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNARVENHTECHCSTCYYHKS家兔FPDGEFAMQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEAGCCVAKAFTKATVMGNAKVENHTECHCSTCYYHKS雞 FPDGEFLMQGCPECKLKENRFFSKPGAPIYQCTGCCFSRAYPTPMRSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKITLKDNVRIENHTECHCSTCYYHKS鯉魚-1 YPRNDMNNFGCEECKLKENNIFSKPGAPVYQCMGCCFSRAYPTPKRSKKTMLVPKNITSEATCCVAKEVKKILVNDV.KLVNHTDCHCSTCYYHKS鯉魚-2 YPRNYMNNFGCEECTLKENNIFSKPGAPVYQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVPKNITSEATCCVAKEFKQVLVNDI.KLVNHTDCHCSTCYYHKSEur.Eel YPNNEMARGGCDECRLQENKIFSKPSAPIFQCVGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVPKNITSEATCCVAREVTRL...DNMKLENHTDCGCSTCYYHKF鰻魚YPNNEISRGGCDECRLKDNKFFSKPSAPIFQCVGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVPKDITSEATCCVAREVTKL...DNMKLENHTDCHCSTCYYHKS鮭魚-1 YQNSDMTNVGCEECKLKENKVFSNPGAPVLQCTGCCFSRAYPTPLQSKKAMLVPKNITSEATCCVAKEGERV.VVDNIKLTNHTECWCNTCYHHKS鮭魚-2 YPNSDKTNMGCEECKLKPNTIFPNPGAPIMQCTGCCFSRAYPTPLRSKQTMLVPKNITSEATCCVAKEGERVTTKDGFPVTNHTECHCSTCYYHKS注意點(.)指該位置沒有殘基。
表3中的信息可用來計算占據(jù)每種激素α亞基中“等價”位置的殘基。僅有hCG的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)報道。由于所有糖蛋白激素的氨基酸序列高度相似，尤其是它們的亞基內(nèi)二硫鍵，因此預(yù)計所有種類的激素將具有相似的形狀。這一觀點還得到了下列觀察結(jié)果的支持可以制得人/牛α亞基嵌合體，該嵌合體保留了嵌合體中所見的其先祖區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的表位。因此，預(yù)計該表中確定的等價殘基的替代將使亞基間二硫鍵具有已經(jīng)制得和鑒定的那些二硫鍵的類似性質(zhì)。
表4選定脊椎動物β亞基序列中的等價位置(未顯示前導序列)hCG SKEPLRPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMTRV..LQGVLPALPQVVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCALCRRSTTDCGGPKDHPLTCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ....
hLH SREPLRPWCHPINAILAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMMRV..LQAVLPPLPQVVCTYRDVRFESIRLPGCPRGVDPVVSFPVALSCRCGPCRRSTSDCGGPKDHPLTCDHPQLSGLLFL............................
cCG SRGPLRPLCRPINATLAAEKEACPICITFTTSICAGYCPSMVRV..MPAALPAIPQPVCTYRELRFASIRLPGCPPGVDPMVSFPVALSCHCGPCQIKTTDCGVFRDQPLACAPQASSSSKDPPSQPLTSTSTPTPGASRRSSHPLPIKTSdLH SRGPLRPLCRPINATLAAENEACPVEITFTTTICAGYCPSMVRV..LPAALPPVPQPVCTYHELHFASIRLPGCPPGVDPMVSFPVALSCRCGPCRLSNSDCGGPRAQSLACDRPLLPGLLFL............................
cLH LGGGGRPPCRPINVTVAVEKDGCPQCMAVTTTACGGTCRTREPV..YRSPLGPPPQSACTYGALRYERWALWGCPLGSDPRVLLPVALSCRCARCPMATSDCTVQGLGPAFCGAPGGFGGE..............................
bLH SRGPLRPLCQPINATLAAEKEACPVCITFTTSICAGYCPSMKRV..LPVILPPMPQRVCTYHELRFASVRIPGCPPGVDPMVSFPVALSCHCGPCRLSSTDCGGPRTQPLACDHPPLPDILFL............................
oLH SRGPLRPLCQPINATLAAEKEACPVCITFTTSICAGYCPSMKRV..LPVILPPMPQRVCTYHELRFASVRLPGCPPGVDPMVSFPVALSCHCGPCRLSSTDCGPGRTQPLACDHPPLPDIL..............................
lLH PEPARGPLRPLCRPVNATLAAENEACPVCITFTTSICAGYCPSMVRV..LPAALPPVPQPVCTYRELRFASIRLPGCPPGVDPEVSFPVALSCRCGPCRLSSSDCGGPRAEPLACDLPHLPG.............................
sGTH SLGQ..P.CQPINQTVSLEKEGCPTCLVIRAPICSGHCVTKEPV..FKSPFSTVTQHVCTYRDVRYEMIRLPDCPPWSEPHVTYPVALSCDCSLCNMDTSDCTIESLQPDFCITQRVLTDGDHW..........................
sGTH1 .GTECRYGCRLNRMTIIVEREDCHGSITITT..CAGLCETTDLN..YESTWLPRSQGVCNFKEWSYEKVYLEGCPSGVEPFFI.PVAKSCDCIKCKTDNTDCDRISMATPSCIVNPLEN...............................
sGTh2 SLMQ..P.CQPINQTVSLEKEGCPTCLVIQTPICSGHCVTKEPV..FKSPFSTVIQHVCTYRDVRYETIRLPDCPPWVDPHVTYPVALSCDCSLCNMDTSDCTIESLQPDFCITQVLTDGDMW...........................
hFSH ......NSCELTNITIAVEKEGCGFCITINTTWCAGYCYTRDLV..YKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE...............................
eFSH ......NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLV..YKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATACHCGKCNSDSTDCTVRGLGPSYCSFGDMKE...............................
oFSH .......SCELTNITITVEKEECSFCISINTTWCAGYCYTRDLV..YKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFSDIER...............................
bFSH .......SCELTNITITVEKEECGFCISINTTWCAGYCYTRDLV..YRDPARPNIQKFKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCSKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFREIKE.............................
pFSH ......NSCELTNITITVEKEECNFCISINTTWCAGYCYTRDLV..YKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFSEMKE...............................
rFSH .......SCELTNITISVEKEECRFCISINTTTTWCEGYCYTRDLV..YKDPARPNTQKVCTFKELVYETIRLPGCARHSDSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE.............................
hTSH .......FCIPTEYMTHIERRECAYCLTINTTICAGYCMTRDINGKLFLPKYALSQDVCTYRDFIYRTVEIPQCPLHVAPYFSYPVALSCKCGKCNTDYSDCIHEAIKTNYCTKPQKSY...............................
bTSH .......FCIPTEYMMHVERKECAYCLTINTTVALGYCMTRDVNGKLFLPKYALSQDVCTYRDMYKTAEIPQCPRHVTPYFSYPVAISCKCGKCNTDYSDCIHEAIKTNYCTKPQKSYMVGFSI..........................
pTSH .......FCIPTEYMMHVERKECAYCLTINSTICAGYCMTRDFDGKLFLPKYALSQDVCTYRDMYKTVEIPQCPHHVTPYFSYPVAISCKCGKCDTDYSDCIHEAIKTNYCTKPEKSY................................
mTSH .......FCIPTEYTMYVDRRECAYCLTINTTICAGYCMTRDINGKLFLPKYALSQDVCTYRDIYRTVEIPQCPHHVTPYFSFPVAVSCKCGKCNTDHSDCIHEAVRTNYCTKPQSFYLGGFSY..........................
rTSH .......FCIPTEYMMYVDRRECAYCLTINTTICAGYCMTRDINGKLFLPKYALSQDVCTYRDTYRTVEIPQCPHHVAPYFSYPVALSCKCGKCNTDYSDCTHEAVKTNYCTKPQTFYLGGFSG..........................
dLG 縮寫h，人；e，馬；d，狗；c，雞；b，牛；o，羊；l，兔；s，鮭魚；p，豬；r，大鼠；m，小鼠注意點(.)指該位置沒有殘基表4中的信息可用來計算占據(jù)每種脊椎動物β亞基中“等價”位置的殘基。
本發(fā)明的實施例描述了怎樣將二硫鍵導入能結(jié)合LH、FSH和/或TSH受體的糖蛋白激素和類似物。亞基間二硫鍵的存在增強了hCG以及具有顯著的FSH和TSH活性的hCG類似物的穩(wěn)定性。因此，預(yù)計增加亞基間二硫鍵也能使該激素家族中的其它成員以及相關(guān)類似物穩(wěn)定。當二硫鍵位于不參與受體結(jié)合或不涉及受體結(jié)合特異性的激素部位時，二硫鍵不妨礙激素功能。實際上，一些亞基間二硫鍵能增強激素類似物的功能。除了一個例外(Blithe等人，1991)，激素亞基幾乎都沒有內(nèi)分泌活性。因此，使異二聚體穩(wěn)定的方法可能能延長這些激素的生物活性，并且預(yù)計能增強它們的治療用途。
本發(fā)明改善異二聚體糖蛋白激素穩(wěn)定性的方法包括鑒定每個亞基中能被取代從而產(chǎn)生游離半胱氨酸的殘基，游離的半胱氨酸很有可能形成亞基間二硫鍵，該亞基間二硫鍵將改善異二聚體的穩(wěn)定性而不扭曲激素蛋白的整個構(gòu)型。在每個亞基中取代這些殘基產(chǎn)生游離的半胱氨酸可通過在α和β亞基的核苷酸序列中取代對應(yīng)的密碼子來在基因水平上實現(xiàn)。培養(yǎng)經(jīng)重組DNA分子(攜帶有編碼α和β亞基并與啟動子序列操作性相連的修飾的核苷酸序列)轉(zhuǎn)化的、能表達經(jīng)修飾的糖蛋白激素的宿主細胞，并表達修飾的糖蛋白激素(本發(fā)明稱為類似物)。然后，回收表達的糖蛋白激素類似物，并用糖蛋白激素純化領(lǐng)域熟知的技術(shù)純化。
在基因水平上，用本領(lǐng)域熟知的任何合適的定點誘變技術(shù)(如Ausubel等人，《當代分子生物學方法》Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publications andWiley Interscience(New York，1987-1997)中第8章“克隆DNA的誘變”所述)產(chǎn)生本發(fā)明的糖蛋白激素類似物。該《當代分子生物學方法》出版物被納入本文作參考，它是闡述重組DNA技術(shù)總原理的標準參考課本。
重組DNA分子中所含的編碼糖蛋白激素類似物α和β亞基的核苷酸序列可以插入能在宿主細胞中表達該類似物的合適表達載體中。為了能夠表達糖蛋白激素類似物，表達載體應(yīng)當具有特定的核苷酸序列，這些序列含有轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控信息，與編碼亞基的DNA相連，從而允許糖蛋白激素類似物的基因表達和生產(chǎn)。首先，為了使基因被轉(zhuǎn)錄，它前面必須有可被RNA聚合酶識別的啟動子，聚合酶和該啟動子結(jié)合，從而啟動轉(zhuǎn)錄過程。
如果DNA所含核苷酸序列含有轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控信息且這些序列和編碼多肽的核苷酸序列“操作性相連”，則稱該DNA“能表達”該多肽。操作性相連是指DNA調(diào)控序列和待表達DNA序列以允許基因表達的方式連接?；虮磉_所需的調(diào)控區(qū)通常包括啟動子區(qū)域以及在轉(zhuǎn)錄成RNA時會傳遞啟動蛋白質(zhì)合成信號的DNA序列。這些區(qū)域通常包括參與轉(zhuǎn)錄和翻譯啟動的5′非編碼序列。在哺乳動物和昆蟲細胞系統(tǒng)中有各種啟動子常用于高水平蛋白表達。
將含有編碼本發(fā)明類似物α和β亞基的核苷酸序列以及操作性相連的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控信號的重組DNA分子插入一個或多個載體中，該載體能在宿主細胞中瞬時表達亞基或能將所需的基因序列整合到宿主細胞染色體內(nèi)。為了能選擇其染色體中已經(jīng)穩(wěn)定整合了導入的DNA的細胞，采用一種或多種允許選擇含有表達載體的宿主細胞的標記。標記能為營養(yǎng)缺陷型宿主提供原養(yǎng)型，殺生物劑抗性(例如對抗生素或重金屬(如銅)等的抗性)?？蛇x擇的標記基因可直接連接待表達的DNA基因序列，或通過共轉(zhuǎn)染導入同一細胞中。為使mRNA的合成最優(yōu)，可能還需要其它額外的元件。這些元件可能包括剪接信號，以及轉(zhuǎn)錄啟動子、增強子和終止信號。插入這些元件的cDNA表達載體包括Okayama(1983)中描述的那些。
能在轉(zhuǎn)染真核宿主細胞后高水平瞬時表達所需蛋白的表達載體是本領(lǐng)域中熟知的，通常是公眾能獲得的或在商業(yè)上能從分子生物學供應(yīng)商購得(例如質(zhì)粒pcDM8，購自Invitrogen，San Diego，CA；pSVL，購自Pharmacia，Piscataway，NJ；pCI，購自Promega，Madison，WI；等)。一旦制得了用于表達的含有構(gòu)建物的載體或DNA序列，就可用各種合適的方法將表達載體導入合適的宿主細胞中，這些方法例如是轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、偶聯(lián)、原生質(zhì)體融合、電穿孔、磷酸鈣沉淀、直接顯微注射等。
真核宿主細胞可以是哺乳動物細胞，例如人細胞、猴(COS細胞)、小鼠和中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，因為它們?yōu)榈鞍踪|(zhì)分子提供了翻譯后修飾，包括正確的折疊、正確的二硫鍵形成以及正確位點的糖基化。然而，昆蟲細胞(如 桿狀病毒)能過量生產(chǎn)多肽，并且也能進行翻譯后多肽修飾(包括糖基化)。COS、CHO和昆蟲細胞中的異位蛋白表達是本領(lǐng)域熟知的，可以合適地采用例如Ausubel等人(1987-1997)章節(jié)16.9-16.14“用桿狀病毒載體在昆蟲細胞中表達蛋白以及在哺乳動物細胞中表達蛋白”中所述的方法。可對表達糖蛋白激素類似物的α和β亞基的轉(zhuǎn)化宿主細胞培養(yǎng)，以產(chǎn)生類似物。
可培養(yǎng)表達糖蛋白激素類似物α和β亞基的轉(zhuǎn)化宿主細胞來產(chǎn)生糖蛋白激素類似物，然后用常見的熟知的糖蛋白激素純化技術(shù)進行回收和純化。產(chǎn)生的糖蛋白激素的量可用如實施例1所述的夾心免疫試驗方法作定量測定。另外，測定本發(fā)明糖蛋白激素類似物的受體親和性以及生物活性的試驗(如實施例1中描述的放射性配體受體和信號轉(zhuǎn)導試驗(測定結(jié)合受體引發(fā)環(huán)腺苷酸累積應(yīng)答的能力))也很容易進行而無需過多試驗。
本發(fā)明的糖蛋白激素類似物有幾種治療用途。hFSH類似物可用來在準備女性排卵誘導中誘導卵泡發(fā)育。hLH和hCG的類似物將用于誘導已經(jīng)開始發(fā)育的卵泡的排卵。這些類似物還可用來誘導男性睪丸功能。另外，本發(fā)明的糖蛋白激素類似物還可用作免疫原來引發(fā)抗血清以限制生育力，例如作為避孕疫苗。相反，針對糖蛋白激素類似物的拮抗類似物或抗體也可用來促進生育力，例如當一些患多囊卵巢病的女性中出現(xiàn)過量的hLH水平時。
一種具有改善的穩(wěn)定性、且還保留了生物活性和功能(例如對糖蛋白激素受體的親和性以及激素效力)的糖蛋白激素類似物，例如本發(fā)明的類似物，是非常有用的。本發(fā)明的類似物不僅可用于特定的治療目的，而且這些類似物還能在溶液中和升高的溫度下提供優(yōu)秀的功能穩(wěn)定性，抵抗蛋白變性劑(如尿素等)的變性作用。由于這種穩(wěn)定性，預(yù)計本發(fā)明的類似物在體內(nèi)會有改善的半衰期。
本發(fā)明的糖蛋白激素類似物能通過實現(xiàn)其目的的各種方式給予需要它的患者。例如，給予可以是不同的腸胃外途徑，包括(但不局限于)皮下、靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、口服、經(jīng)皮或頰途徑。腸胃外給藥可以是 烷基注射或隨時間逐漸灌輸。
一種預(yù)防、抑制或治療淀粉樣或類淀粉樣沉積相關(guān)疾病的典型方案包括用單劑或用幾個月到幾年時間內(nèi)的多劑給予有效量。
可以理解，給予的劑量取決于接受者的年齡、性別、健康狀況和體重，并行治療的類型(如果有的話)、治療頻率以及所需效果的性質(zhì)。每次治療所需的總劑量可通過多劑或單劑來給予。“有效量”是指能實現(xiàn)其指定目的的糖蛋白激素類似物的濃度。這些濃度通常可由本領(lǐng)域技術(shù)人員來確定。
腸胃外給藥制劑包括無菌水性或非水性溶液，懸浮液和乳劑，它可以含有本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的輔助劑或賦形劑。
包含本發(fā)明糖蛋白激素類似物的藥物組合物包括所有組分，其中含有實現(xiàn)指定目的的有效量的類似物。另外，藥物組合物可含有合適的藥學上可接受的載體，包括有助于將活性化合物加工成可在藥學上使用的制劑的賦形劑和輔助劑。合適的藥學上可接受的載體是本領(lǐng)域中熟知的，它們在Alfonson Gennaro編輯的《Remington藥物科學》第18版(Mack Publishing Co.)(Easton，PA，1990)的例子中有所描述，它是本領(lǐng)域中的標準參考課本。藥學上可接受的載體通常根據(jù)給藥方式以及糖蛋白激素類似物的溶解度和穩(wěn)定性來選擇。例如，用于靜脈內(nèi)給藥的制劑可包括無菌水溶液，水溶液中還可含有緩沖液、稀釋劑和其它合適的添加劑。
用于腸胃外給藥的合適的制劑包括以水溶性形式的活性化合物(水溶性鹽)的水溶液。另外，可以給予以合適的油性注射懸液形式的活性化合物懸液。合適的親脂性溶劑或載體包括脂肪油(例如芝麻油)、或合成的脂肪酸脂(例如油酸乙酯或甘油三酯)。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液粘度的物質(zhì)，它們例如包括羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、和/或葡聚糖。懸浮液還可任選地含有穩(wěn)定劑。
在總地描述了本發(fā)明后，通過參考下列實施例將更容易了解本發(fā)明，提供這些實施例只是為了描述，并不意味著限制了本發(fā)明實施例1通過半胱氨酸結(jié)節(jié)之間的亞基間二硫鍵穩(wěn)定的hCG:hCG(α31-β37)按照亞基間二硫鍵交聯(lián)的標準，表1B中的數(shù)據(jù)提示，如果在α亞基殘基31產(chǎn)生一個游離的半胱氨酸，用半胱氨酸代替在β亞基Tyr37，則有可能制得通過半胱氨酸結(jié)節(jié)之間的亞基間二硫鍵穩(wěn)定的hCG類似物。通過制得Tyr37被半胱氨酸取代的hCGβ亞基類似物和Cys7被Ser取代的人α亞基類似物，實現(xiàn)此目的。后一變化破壞了α亞基內(nèi)氨基酸Cys7和Cys31之間通常所見的二硫鍵，使得殘基31留下的游離的α亞基半胱氨酸能和β亞基殘基37導入的半胱氨酸形成二硫鍵。當這些亞基構(gòu)建物每個都在培養(yǎng)的哺乳動物細胞中表達時，α亞基殘基31的半胱氨酸和β亞基殘基37的半胱氨酸形成亞基間二硫鍵。
二硫鍵的形成大大提高了異二聚體的穩(wěn)定性。與hCG不同的是，交聯(lián)的異二聚體在尿素或低pH下不解離。然而，hCH(α31-β37)被大多數(shù)單克隆抗體識別、結(jié)合LH受體、以及引發(fā)信號轉(zhuǎn)導的能力與hCG類似。這表明，二硫鍵的存在沒有破壞激素的功能。
在Campbell等人1991年描述的并含有hCGα亞基cDNA的表達載體(pKBM-hCGα)中，將α亞基中Cys7的密碼子變成絲氨酸密碼子。pKBM載體是pUC載體(Yanisch-Perron等人，1985)的衍生物，其中多接頭被含有一個XhoI位點的多接頭代替，它允許cDNA插入物在pKBM和表達載體pSVL之間轉(zhuǎn)移(Pharmacia，Piscataway，NJ)。由于只有一個α亞基基因，因此hCG，hLH，hFSH和hTSH的α亞基cDNA含有相同的密碼子，因此該表達載體稱為pKBM-α。如圖40所示，pKBM-α含有在α亞基編碼序列5′的唯一的XhoI內(nèi)切核酸酶限制性位點，在氨基酸9-11密碼子的附近有唯一的BsmI內(nèi)切核酸酶限制性位點。設(shè)計聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物(Oligo425和Oligo847，表5)以包括該區(qū)域，將Cys7的密碼子改為絲氨酸密碼子，產(chǎn)生一個能用來鑒別突變構(gòu)建物的新的內(nèi)切核酸酶限制性位點(BspEI)。
表5用來制備二硫鍵交聯(lián)類似物的引物序列

以Xho I和BsmI消化用這些引物和pSVL-hCGα(Campbell等人，1991)作為模板的PCR產(chǎn)物，并用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)亞克隆到pKBM-α的唯一的XhoI-BsmI位點內(nèi)(Maniatis等人，1989)。
用雙脫氧法(Maniatis等人，1989)測得含有BspEI內(nèi)切核酸酶限制性位點的重組質(zhì)粒的序列位于已經(jīng)由PCR為基礎(chǔ)的誘變改變的區(qū)域中。該載體(pKBM-αC7S)編碼的蛋白質(zhì)具有圖3所示的氨基酸序列。通過XhoI和BamHI消化從pKBM載體中取出修飾的α亞基cDNA，并亞克隆到pSVL的XhoI-BamI位點中，產(chǎn)生pSVL-αC7S，該程序允許αC7S在COS-7細胞中表達。將編碼序列另插入另一表達載體(pCI)的XhoI-BamHI位點中，該載體購自Promega(Madison，WI)，它已作修飾以有利于這種以及相關(guān)構(gòu)建物的亞克隆。pCI的修飾涉及除去其BamHI位點，用具有下列內(nèi)切核酸酶限制性位點的新的多接頭代替它的多接頭(即限制性位點NheI-NotI)NheI-XhoI-EcoRI-MluI-KpnI-XbaI-SalI-BamHI。通過從pKBM或pSVL中取出含有所需編碼區(qū)的XhoI-BamHI片段，將其連接到已經(jīng)用XhoI和BamHI消化的pCI中，這允許將構(gòu)建物從pKBM和pSVL為基礎(chǔ)的載體亞克隆到pCI為基礎(chǔ)的載體中。本文其它處所指的pCI為基礎(chǔ)的載體是指如上所述經(jīng)修飾的pCI載體。α亞基編碼區(qū)從pSVL轉(zhuǎn)移到pCI分別產(chǎn)生了pCI-α和pCI-αC7S，以促進在培養(yǎng)細胞中的表達。
不一定要用絲氨酸代替半胱氨酸來制得不能在Cys7和Cys31之間形成二硫鍵的α亞基類似物。已經(jīng)用丙氨酸來破壞該鍵(Furuhashi等人，1994)，預(yù)計用其它氨基酸取代Cys7也將破壞Cys7-Cys31二硫鍵。
通過已經(jīng)插入pUC為基礎(chǔ)的載體(稱為pKBM-hCGβ′)(Campbell等人，1991)的hCGβ亞基cDNA中的盒式誘變來修飾hCGβ亞基編碼序列，以便用Cys的密碼子代替Tyr37密碼子。該構(gòu)建物在氨基酸35-36和45-46的密碼子處含有唯一的NgoMI和PstI限制性位點。用Oligo845和Oligo874(表5)退火產(chǎn)生的盒代替NgoMI和PstI位點之間的短片段，導入突變密碼子。這樣還導入了一個PmlI內(nèi)切核酸酶限制性位點，該位點能用來幫助鑒別含有該突變的質(zhì)粒。
用本領(lǐng)域熟知的標準方法(Maniatis等人，1989)將該盒亞克隆到pKBM-hCGβ′(Campbell等人，1991)中，用雙脫氧測序法確認突變區(qū)的所需序列。由于pKBM不是表達載體，將它亞克隆到pSVL中，使得該β亞基構(gòu)建物在哺乳動物細胞中表達。它按如下方法實現(xiàn)取XhoI和BamHI消化pKBM-hCGβ′獲得的小片段，將其和pSVL經(jīng)XhoI和BamHI消化后留下的大片段連接，產(chǎn)生稱為pSVL-hCGβ′Y37C的表達載體。pSVL-hCGβ′和pSVL-hCGβ′Y37C編碼的氨基酸序列如圖4所示。將它們也亞克隆到修飾的pCI載體的XhoI和BamHI位點中。
這些編碼序列的制備還可用標準的DNA合成技術(shù)通過商業(yè)上可獲得的儀器來實現(xiàn)。這些技術(shù)可用來制得能連接在一起的長的寡核苷酸，如Campbell等人，1992年所述。應(yīng)注意，DNA編碼序列還能購自專門構(gòu)建合成寡核苷酸和制備合成cDNA基因的幾家公司。這些公司包括Midland Certified Reagent Company，Midland，Texas，和Genosys Biotechnologies，Inc.，The Woodlands，Texas。這些亞基的表達還可在培養(yǎng)的哺乳動物細胞(即COS-7細胞)中用任何商業(yè)上可購得的載體如pSVL(Pharmacia，Piscataway，NJ)或pCI(Promega，Madison，WI)用類似于Campbell等人，1991已經(jīng)描述的且本領(lǐng)域中常見的方法來實現(xiàn)。
用本領(lǐng)域熟知的且已有描述(Campbell等人，1991)的常規(guī)方法在COS-7細胞中共同表達pSVL-α和pSVL-hCGβ′、pSVL-αC7S和pSVL-hCGβ′Y37C、pCI-α和pCI-hCGβ′、pCI-αC7S和pCI-hCGβ′Y37C。用標準的磷酸鈣沉淀法(如Kriegler，1990所述)轉(zhuǎn)染入COS-7細胞中。COS-7細胞從ATCC，Rockville，MD獲得。轉(zhuǎn)染后第二天，除去細胞培養(yǎng)基，用無血清DMEM培養(yǎng)基代替。再培育細胞三天，使分泌的產(chǎn)物在培養(yǎng)基中累積。然后離心培養(yǎng)基，除去細胞碎片和其它沉淀物，將上清轉(zhuǎn)移到透析袋中，將袋置于吸濕性粉末床上，濃縮高分子量組分(Aquacide，Calbiochem，La Jolla，CA)。
用夾心免疫試驗(Moyle等人，1982)定量測定已經(jīng)分泌到培養(yǎng)基中的hCG和交聯(lián)的hCG，試驗分別采用抗體A113和125I-B105來捕獲和檢測，用從尿中純化出的hCG作為標準。在該試驗中，使抗hCGα亞基抗體A113(0.05毫升中1微克)吸附到微量滴定板上，37℃放置1小時。除去未吸附的抗體，每個孔用含有0.9％NaCl和1毫克/毫升的牛血清白蛋白溶液封閉其余的蛋白吸附位點。將轉(zhuǎn)染三天的細胞培養(yǎng)基等份(0.05毫升)加入孔中，使hCG或交聯(lián)的hCG類似物于37℃ 1小時結(jié)合吸附的抗體。除去未結(jié)合的激素或激素類似物，用0.9％NaCl清洗孔，使捕獲的分析物和如上所述制得的放射性碘化的抗hCGβ亞基抗體125I-B105反應(yīng)。吸棄不結(jié)合hCG或交聯(lián)的hCG類似物的125I-B105，用γ計數(shù)器測定結(jié)合微量滴定板表面的放射性標記。該試驗很容易檢測0.1ng hCG。該試驗不一定要用這些特定的抗體，還可使用幾種商業(yè)上可購得的抗體。大多數(shù)抗hCGα亞基抗體以及對hCG和游離hCGβ亞基的親合力高于108M-1的抗hCGβ亞基抗體均可使用。后者包括購自Pierce，3747 North Meridian Road，Rockford，IL的ZMCG13和ZMCG7。
抗體、hCG和hFSH的碘化用購自Pierce Chemical Co.，Rockford，IL的Iodo-Gen完成。在該步驟中，將50微升丙酮配的1.5微克Iodo-Gen加入能盛方約0.75毫升液體的小玻璃管中，使丙酮蒸發(fā)。這使得Iodo-Gen殘余物包被在試管底部。然后，加入10微克B105，用塑料蓋蓋上試管，用微量注射器通過蓋子注射加入0.2M磷酸鈉緩沖液(pH7.2)配的含250-500μCi Na125I的5微升溶液。20-30秒后，加入0.02M磷酸鈉緩沖液(pH7.2)配的0.1毫升0.9％NaCl溶液，吸出混合物，加入2毫升BioGelP6DG(BioRad，Richmond，CA)柱中。用凝膠過濾分離游離的碘和碘化的蛋白質(zhì)。用于碘化的Na125I的用量取決于蛋白質(zhì)在放射性碘化后保留其功能的能力?？贵w和hCG通常碘化至比活為50μCI/μg，而hFSH通常碘化至比活為10-25μCi/μg。
表6描述了突變不破壞交聯(lián)hCG類似物的形成。已經(jīng)轉(zhuǎn)染了含pSVL編碼序列或pCI編碼序列的細胞產(chǎn)生了相當量的交聯(lián)的類似物和hCG。
表6轉(zhuǎn)染的COS-7細胞產(chǎn)生hCG和hCG(α31-β37)

在夾心免疫試驗中相對于hCG標準測定了hCG和hCG(α31-β37)，用針對α亞基的抗體(A113)作捕獲抗體，用針對β亞基的碘化抗體(B105)來檢測。
在夾心免疫試驗中用抗體A113和B105來測定交聯(lián)的hCG類似物的產(chǎn)生是因為它們識別預(yù)計遠離突變位點的激素區(qū)域(Cosowsky等人，1995；Moyle等人，1995)。hCG(α31-β37)類似物不象hCG那樣和A407結(jié)合(圖5)，已經(jīng)表明，該抗體識別的表位包括α亞基的N端部分(C7S突變的部位)(Moyle等人，1995)。抗體A407從哥倫比亞大學(New York，NY)Robert E.Canfield博士處獲得。然而，已經(jīng)表明A407識別hCG-受體復(fù)合物(Moyle等人，1995)，因此激素構(gòu)型的這種小變化預(yù)計不會干擾交聯(lián)的hCG類似物的生物活性。
在放射性配體受體和信號轉(zhuǎn)導試驗中，監(jiān)測了hCG(α31-β37)和其它交聯(lián)的類似物的生物活性。這些試驗采用已經(jīng)轉(zhuǎn)染了編碼LH受體cDNA的基因并因此在其表面表達功能性LH受體的CHO細胞。CHO細胞從ATCC，Rockville，MD獲得。大鼠LH受體cDNA用聚合酶鏈反應(yīng)從大鼠卵巢文庫獲得(如Bernard等人，1990所述)。應(yīng)注意，采用這些表達LH受體的細胞只是由于方便，放射性配體受體試驗可用表達LH受體的其它組織來進行。這些組織包括成年大鼠睪丸的勻漿物或從已經(jīng)注射了懷孕母馬血清促性腺激素和hCG(均購自Sigma，St.Louis，MO)的未性成熟大鼠中獲得的卵巢勻漿物。為了產(chǎn)生能高親和性結(jié)合hCG的卵巢制備物，給予21日齡雌性大鼠皮下注射50i.u.懷孕母馬血清促性腺激素。約65小時后，給予皮下注射25i.u.hCG。7天后處死，取其卵巢勻漿，將對應(yīng)于1/20卵巢的勻漿等份用于各試驗管中。表達大鼠LH受體的細胞結(jié)合放射性碘化hCG(可如上所述制得或購自New England Nuclear，Boston，MA的一種示蹤物)。它們還結(jié)合未標記的hCG(一種購自Sigma Co.，St.Lousi，MO的激素)。表達LH受體的CHO細胞在對hCG 37℃處理10-30分鐘的應(yīng)答中合成環(huán)腺苷酸。用對環(huán)腺苷酸有特異性的放射性免疫試驗(RIA)(已有描述，Brooker等人，1979)測定產(chǎn)生的環(huán)腺苷酸。
hCGα和β亞基半胱氨酸結(jié)節(jié)中的殘基間加入亞基間二硫鍵沒有破壞交聯(lián)的異二聚體結(jié)合LH受體或引發(fā)環(huán)腺苷酸累積應(yīng)答的能力。因此，hCG和hCG(α31-β37)均能阻斷125I-hCG與表達LH受體的CHO細胞的結(jié)合(圖6)。hCH和hCG(α31-β37)還能在這些相同的細胞中引發(fā)環(huán)腺苷酸累積(圖7)。這表明，該亞基間二硫鍵的存在沒有破壞hCG的整體功能活性。
亞基間二硫鍵的存在使得hCG(α31-β37)能抵抗破壞hCG的酸、尿素和加熱處理。這可從圖8和9的數(shù)據(jù)看出。圖8描述了升高的溫度對異二聚體穩(wěn)定性的影響，異二聚體在夾心免疫試驗中進行監(jiān)測，用A113作捕獲抗體，用125I-B112作檢測抗體。注意，B105和B112結(jié)合的重疊表位包括靠近第3個β亞基環(huán)附近轉(zhuǎn)折的殘基(Moyle，1990；Cosowsky等人，1995)，該部位遠離hCG(α31-β37)的α或β亞基中的突變。在該試驗中，使hCG和hCG(α31-β37)受85℃的溫度作用不同時間，最高為20分鐘。hCG的活性在7-8分鐘被基本上破壞，而交聯(lián)的類似物在培育20分鐘后還保留了至少75％的活性(圖8)。由于該夾心免疫試驗對二聚體有特異性，因此hCG活性的喪失看來是由于亞基的解離，該過程由于亞基間二硫鍵的存在而被阻止。
在高濃度尿素中培育促性腺激素會促進亞基解離是眾所周知的(Pierce等人，1981)。因此，當hCG在8M尿素中培育時，它解離成其亞基，該現(xiàn)象很容易通過Western印跡來檢測(圖9)。已經(jīng)轉(zhuǎn)染了編碼hCGα和β亞基的基因的哺乳動物細胞通常將游離的β亞基和αβ異二聚體分泌到培養(yǎng)基中。這很容易用采用α亞基特異性抗體和β亞基抗體的夾心免疫試驗來區(qū)分。αβ異二聚體和游離的β亞基還可在Western印跡中通過它們的大小來區(qū)分。因此，通過用聚丙烯酰胺凝膠電泳將它們分離，然后在Western印跡中檢測它們，就可以監(jiān)測培養(yǎng)基中hCG和游離β亞基的相對量。這可用結(jié)合hCG和游離hCGβ亞基的放射性碘化單克隆抗體來實現(xiàn)(如圖9所示)。分析表達hCGα和β亞基的細胞培養(yǎng)基，結(jié)果表明異二聚體(上方條帶)和游離的β亞基(下方條帶)均存在。用8M尿素處理培養(yǎng)基使得異二聚體解離成其亞基。結(jié)果，上方條帶消失。尿素不能促使二硫鍵交聯(lián)的異二聚體hCG(α31-β37)解離成其亞基，因此對應(yīng)于異二聚體的條帶保持完整(圖9)。
實施例2通過位于α和β亞基中半胱氨酸結(jié)節(jié)之間的亞基間二硫鍵而穩(wěn)定的多功能糖蛋白激素類似物眾所周知，座位系帶會影響hCG的受體結(jié)合活性(Campbell等人，1991；Moyle等人，1994；Han等人，1996)。hCGβ亞基氨基酸殘基101-109被其hFSH對應(yīng)物(即hFSHβ亞基殘基95-103)代替導致類似物的FSH活性大大增加，而不損害它的LH活性(Moyle等人，1994；Han等人，1996)。實際上，該替代還增強了hCG的TSH活性(Campbell等人，1997)，即使它不導入hTSH中見到的任何特殊殘基。研究亞基間二硫鍵對相關(guān)的多功能類似物活性的影響顯示了特異性二硫鍵怎樣影響促黃體素、促卵泡激素和促甲狀腺激素的活性。本實施例描述了半胱氨酸結(jié)節(jié)之間的亞基間二硫鍵怎樣影響hCG類似物(CFC101-114)(其中hCGβ亞基殘基101-114被其hFSH對應(yīng)物(即hFSHβ亞基殘基95-108)取代)的LH和FSH活性。
CFC101-114(α31-β37)的表達需要使細胞被編碼αC7S和CFCβ′101-114Y37C的載體轉(zhuǎn)染。實施例1中已經(jīng)描述了α亞基的修飾。用來制備CFC101-114β′Y37C的CFC101-114β亞基前體的DNA序列編碼了按次序依次連接的hCGβ亞基殘基1-100、hFSHβ亞基殘基95-108、和hCGβ亞基殘基115-145。它通過在兩個hCG/hFSHβ亞基嵌合體共有的SstII位點上組合它們的編碼序列來產(chǎn)生(圖41-43)。將含有信號序列和pSVL-CFC101-114β′殘基1-103的密碼子的pSVL-CFC101-106β′的XhoI-SstII片段亞克隆到pSVL-CFC94-114β′的XhoI-BamHI片段中。這樣，pSVL-CFC101-114β′中所見的hFSHβ亞基殘基88-94的密碼子被其hCGβ亞基同源物(即殘基94-100)取代，并且導入了一個BglII位點。如下所述，這些編碼載體每一個都通過修飾分子3′半中密碼子從hCGβ亞基cDNA衍生獲得。
通過PCR誘變pSVL-CFC94-106β′(一種載體，它編碼了按該次序依次連接的hCGβ亞基殘基1-93、hFSHβ亞基殘基88-100、和hCGβ亞基殘基107-145)制得pSVL-CFC94-114β′。制備pSVL-CFC94-114β′的第一步是用SOEing PCR誘變(Ho等人，1989)制得pSVL-CFCβ′94-106。PCR反應(yīng)以O(shè)ligo508和Oligo368(表5)為引物，pSVL-hCGβ′(Campbell等人，1991)為模板，產(chǎn)生的產(chǎn)物含有CFC94-106β亞基密碼子101-145，hCGβ亞基終止密碼子、3′非翻譯區(qū)、BamHI內(nèi)切核酸酶限制性位點和BamHI位點3′的pSVL載體序列的一部分。用Oligo510和Oligo365(表5)的第二個PCR反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物含有其XhoI位點5′的pSVL序列、pSVL-hCGβ的5′非翻譯區(qū)(Campbell等人，1991)、hCGβ亞基信號序列的20個密碼子、以及CFC94-106β亞基密碼子1-107。含有CFC94-106β亞基密碼子101-107的這些PCR產(chǎn)物的部分是互補的，以滿足在“SOEingPCR”期間重疊延伸的需求。使這兩個PCR產(chǎn)物和Oligo363以及Oligo364(表5)混合，并在第三個PCR反應(yīng)中擴增，以產(chǎn)生編碼CFC94-106β亞基全長序列的PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物的5′和3′端附近分別有XhoI和BamHI限制性位點。該PCR產(chǎn)物在殘基102-104密碼子處也有SstII位點，將其克隆到pSVL的XhoI和BamHI位點內(nèi)，產(chǎn)生pSVL-CFC94-106β′。用雙脫氧測序法確認編碼區(qū)的序列。
制備pSVL-CFC94-114β′β亞基的最后一步涉及用引物Oligo596和Oligo368(表5)以及模板pSVL-hCGβ′進行PCR來產(chǎn)生5′和3′端附近分別有SstII和BamHI位點的產(chǎn)物。當用這些酶消化后，它產(chǎn)生了一個DNA片段，該片段含有按次序的hFSHβ亞基殘基97-108密碼子以及hCGβ亞基密碼子115-145。將它亞克隆到pSVL-CFC94-106β′的唯一的SstII-BamHI位點中，產(chǎn)生pSVL-CFC94-114β′，在PCR期間已經(jīng)擴增的序列部分用雙脫氧測序法確認。
pSVL-CFC101-106β′的制備從稱為pMB135的載體開始，它編碼殘基114處截短的hCGβ亞基類似物，且Gly102密碼子被纈氨酸密碼子代替。pMB135這樣制得，使Oligo435和Oligo436(表5)退火，用酶法填平3′末端，產(chǎn)生含有PvuII和SstI位點的雙鏈彈夾。后一位點是終端密碼子的3′端。該彈夾按以下序列編碼hCGβ亞基殘基87-101、纈氨酸、和hCGβ亞基殘基103-114，并且在密碼子94-95處含有一個BglII限制性位點。將它亞克隆到pSVL-hCGβ′的PvuII-SstI位點中，用雙脫氧測序法確認PvuII-SstI位點之間的該序列。在PCR反應(yīng)中，用pMB135作為模板，用Oligo562和Oligo365(表5)產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在XhoI和SstII消化后按以下次序具有hCGβ-亞基cDNA非翻譯區(qū)和信號序列、hCGβ亞基密碼子1-100、以及hFSHβ亞基密碼子95-98。將該PCR產(chǎn)物克隆到pSVL-CFC94-106β′的XhoI-SstII位點內(nèi)，制得pSVL-CFC101-106β′，其序列用雙脫氧測序法來確定。
顯然，不一定要用這種方法來產(chǎn)生pSVL-CFC101-114β′。出于歷史原因，采用這些步驟。因為在其它試驗期間已經(jīng)制得了各種中間載體，并可用來制備編碼CFC101-114β′的載體。
組合編碼Y37C突變的pSVL-hCGβ′Y37C的5′″半″和編碼hFSHβ亞基氨基酸95-108的pSVL-CFC101-114β′的3′″半″，制得質(zhì)粒pSVL-CFC101-114β′Y37C。這通過連接用XhoI和Bsu36I消化獲得的pSVL-hCGβ′Y37C小片段和用相同酶消化pSVL-CFC101-114β′產(chǎn)生的大片段來實現(xiàn)。這就使CFC101-114β′的信號序列和氨基酸1-54的密碼子被hCGβ′Y37C的密碼子代替，該變化導致Tyr37被半胱氨酸代替。以前所述的將Xho-I-BamHI片段亞克隆到經(jīng)修飾的pCI構(gòu)建物的XhoI-BamHI位點中產(chǎn)生了稱為pCI-CFC101-114β′Y37C的構(gòu)建物。圖10中描述了CFC101-114β′和CFC′101-114β′Y37C的氨基酸序列。
用實施例1所述的方法在COS-7細胞中共同表達pSVL-α加上pSVL-CFC101-114β；pSVL-αC7S加上pSVL-CFC101-114βY37C；pCI-α加上pCI-CFC101-114β；和pCI-αC7S加上pCI-CFC101-114βY37C，產(chǎn)生CFC101-114和CFC101-114(α31-β37)。用夾心免疫試驗(Moyle等人，1982)定量測定濃縮培養(yǎng)基中的CFC101-114和交聯(lián)的CFC101-114(α31-β37)，用抗體A113作捕獲抗體，用125I-B105或125I-B112作檢測抗體，用從尿液中純化的hCG作為標準。和前面一樣，應(yīng)注意該試驗不一定要使用這些特定的抗體；商業(yè)上可獲得的抗體預(yù)計均能滿意地工作。大多數(shù)對hFSH也有高親和性的抗hCGα亞基抗體(如A113)或?qū)CG有高親和性的抗hFSHα抗體均可用于該試驗。然而，由于這些類似物在座位系帶區(qū)部分含有的hFSH殘基(即第11和12個β亞基半胱氨酸之間的氨基酸殘基(Moyle等人，1994))對FSH活性有主要影響，因此CFC101-114的類似物并不被所有的抗hCGα亞基抗體識別。這可以從A407看出(圖11)，該抗體結(jié)合hCG但不結(jié)合hFSH。因此，盡管A407結(jié)合hCG，但它結(jié)合CFC101-114和交聯(lián)的CFC101-114類似物的能力很差。A407結(jié)合CFC101-114(α31-β37)的能力也低。
除了識別β亞基中FSH殘基占據(jù)區(qū)域附近的殘基的那些抗體外，CFC101-114類似物能用大多數(shù)對hCG和游離hCGβ亞基親和力高于108M-1的抗hCGβ亞基來抗體檢測。因此，CFC101-114和類似物不被B111抗體識別，已經(jīng)表明該抗體受hCG殘基108-114的影響很大(Cosowsky等人，1995)。然而，大多數(shù)識別hCG、hLH、游離的hCGβ亞基和游離的hLHβ亞基的抗體(如B105)能用于該試驗。另外，識別hCG和游離的hCGβ亞基的許多抗體(如B112)也能用于該試驗。B105/B112表位區(qū)域是小鼠hCG中最具抗原性的區(qū)域，針對該區(qū)域的抗體可如實施例1所述在商業(yè)上購得。
CFC101-114(α31-β37)中二硫鍵交聯(lián)的存在相對于CFC101-114而言提高了其熱穩(wěn)定性(圖12)。夾心免疫試驗表明hCG和CFC101-114的活性分別被85℃加熱7.5分鐘和15分鐘破壞。然而，在同一溫度下20分鐘后，卻保留了大量CFC101-114(α31-β37)。這表明，二硫鍵的存在增強了該類似物的穩(wěn)定性。由于該類似物和在第11和12β亞基半胱氨酸之間有FSH殘基的其它類似物具有FSH和TSH活性(Campbell等人，1997)，因此預(yù)計該二硫鍵也能提高FSH和TSH的穩(wěn)定性。
CFC101-114能刺激LH受體處的信號轉(zhuǎn)導。CFC101-114半胱氨酸結(jié)節(jié)之間加入α31-β37亞基間二硫鍵在該試驗中不減少其活性(圖13)。因此，在采用已經(jīng)工程改造能表達LH受體的CHO細胞的試驗中，CFC101-114和CFC101-114(α31-β37)具有大致相同高的刺激環(huán)腺苷酸累積的能力。因此，該二硫鍵的存在看來不影響具有促黃體素活性的分子的活性。該鍵使這些分子穩(wěn)定的能力預(yù)計可賦予促黃體素有用的治療性質(zhì)。
盡管CFC101-114的氨基酸序列與hCG的序列比hFSH的序列更接近，但是CFC101-114(α31-β37)的FSH活性比hCG(已經(jīng)知道該激素在該試驗中幾乎沒有活性)高得多。CFC101-114半胱氨酸結(jié)節(jié)之間加入α31-β37亞基間二硫鍵對其在表達FSH受體的CHO細胞中刺激環(huán)腺苷酸累積的能力影響很小(圖14)。因此，該二硫鍵的存在看來不會給具有促卵泡激素活性的分子的活性帶來負面影響，該鍵使這些分子穩(wěn)定的能力預(yù)計賦予促卵泡激素有用的治療性質(zhì)。
實施例3通過座位系帶和α亞基環(huán)2之間的亞基間二硫鍵而穩(wěn)定的hCGhCGα和β亞基中殘基的Cα和Cβ碳原子之間的距離(表1B)提示，有可能制得亞基由一個或多個二硫鍵聯(lián)接的其它許多二聚體。hCG和CFC101-114在α亞基殘基31和β亞基殘基37之間的交聯(lián)，明顯增強了所得類似物的穩(wěn)定性，并且對其生物活性的影響最小。為了了解將二硫鍵導入前已表明影響受體結(jié)合的該分子一部分中是否會改變其穩(wěn)定性和活性，在hCG和CFC101-114中的α亞基環(huán)2和座位系帶之間工程改造產(chǎn)生二硫鍵。這些研究結(jié)果表明，在糖蛋白激素該區(qū)域內(nèi)導入二硫鍵提高了它們的穩(wěn)定性。然而，產(chǎn)生二硫鍵所需的替代影響了它們與受體相互作用并引發(fā)信號轉(zhuǎn)導的能力。這表明最好將二硫鍵導入不參與受體相互作用或受體特異性的激素部分內(nèi)來維持高的內(nèi)分泌活性。由于兩種二硫鍵交聯(lián)的類似物保留了它們的免疫學活性，因此在設(shè)計免疫原時，二硫鍵的位置可能并不重要。該二硫鍵對信號轉(zhuǎn)導的影響可能可用來開發(fā)激素拮抗劑或免疫原。
為了制備通過α亞基環(huán)2和座位系帶之間的亞基間二硫鍵而穩(wěn)定的hCG類似物，用半胱氨酸代替α亞基環(huán)2的Lys51和β亞基座位系帶的Asp99。α亞基中的變化涉及以前未曾描述的已有載體的盒式誘變。因此，下面將描述這些中間載體的構(gòu)建(圖44)。
用含有限制性酶切位點EcoRI-XhoI-NcoI-PacI-BamHI-EcorI的多接頭取代pIBI31(一種購自International Biotechnologies，Inc.(New Haven，CT)的克隆載體)的多接頭，產(chǎn)生稱為pRM102的載體。用NcoI和BamHI消化pKBM-α，并克隆到pRM102的NcoI-BamHI位點內(nèi)，產(chǎn)生pRM116，從而消除了在克隆pKBM-α期間已經(jīng)導入的5′非翻譯前導序列和不需要的5′XbaI位點。這樣，pRM116中唯一的XbaI位點對應(yīng)于α亞基氨基酸34-35的密碼子。用Oligo758和Oligo760(表5)對α亞基cDNA作PCR產(chǎn)生的載體的XbaI-BamHI片段，取代pRM116的XabI-BamHI片段，產(chǎn)生pRM117。這消除了α亞基cDNA中發(fā)現(xiàn)的3′非翻譯區(qū)，該過程還消除了該區(qū)域中不需要的PstI限制性位點。pRM17中保留的唯一的PstI位點位于殘基83-85的密碼子中。將α亞基cDNA經(jīng)Oligo 730和Oligo839(表5)作PCR獲得的產(chǎn)物克隆到pRM117的獨特的XbaI-PstI位點中，產(chǎn)生pMB507。這分別將BglII和SpeI位點導入α亞基編碼序列的密碼子42-43和54-55中。將pMB507的XhoI-BamHI片段亞克隆到pSVL的XhoI-BamHI位點中產(chǎn)生pMB512。pMB512在BglII和SpeI位點之間的片段用Oligo877和Oligo878(表5)代替，產(chǎn)生pMB561。最后，pMB512的BglII-SpeI片段用Oligo921和Oligo922(表5)退火得到的盒代替，產(chǎn)生pSVL-αK51C(圖15)。不需要用該策略來制備pSVL-αK51C，采用該策略只是出于歷史原因，因為可得到其它試驗中產(chǎn)生的各種載體中間物。
通過PCR誘變，用pSVL-hCGβ′作為模板，Oligo368和Oligo925(表5)作為引物，制得β亞基類似物hCGβ′D99C。Oligo368是與pSVL中BamHI內(nèi)切核酸酶限制性位點3′的一個部位互補的反向引物。Oligo925含有所需的突變，并產(chǎn)生BglII位點。用BglII和BamHI消化PCR產(chǎn)物并亞克隆到pSVL-CFC101-114β′的BglII-BamHI位點中。這從pSVL-CFC101-1114β′中除去了hFSH密碼子，并將Asp99變成半胱氨酸(圖15)。
如實施例1所述，在COS-7細胞中共同表達質(zhì)粒pSVL-αK51C和pSVL-hCGβ′D99C。在夾心免疫試驗中相對于hCG標準測定hCG和hCG(α51-β99)，用針對α亞基的抗體(A113)捕獲，用針對β亞基的放射性碘化的抗體(B105)檢測。該試驗中不一定要用這些特定的抗體。識別異二聚體中hCGα亞基的任何抗體以及識別hCG及其游離的β亞基的親和力超過108M-1的任何β亞基抗體均可用于該試驗。轉(zhuǎn)染的COS-7細胞產(chǎn)生hCG和hCG(α51-β99)導致細胞培養(yǎng)基中交聯(lián)蛋白質(zhì)類似物的累積，這很容易用A113/125I B105或A113/125IB112夾心免疫試驗(表7)來檢測，這表明導入二硫鍵所需的突變不阻礙亞基結(jié)合。
表7轉(zhuǎn)染的COS-7細胞產(chǎn)生hCG和hCG(α51-β99)

用實施例1所述方法在LH受體結(jié)合和信號轉(zhuǎn)導試驗中測定hCG(α51-β99)的生物活性。hCG(α51-β99)能抑制125I-hCG與表達LH受體的CHO細胞結(jié)合，但是hCG只有5-10％的效力(圖16)。二硫鍵引起的對LH受體親和力的減少是由于1)α亞基殘基Lys51被半胱氨酸取代(即帶電荷氨基酸被中性氨基酸取代)，2)β亞基殘基Asp99被半胱氨酸取代(即帶負電荷氨基酸被中性氨基酸取代)，或3)由于兩個亞基間存在共價鍵而增加的約束。已經(jīng)表明，Asp99的修飾能減少或消除hCG的LH活性(Chen等人，1991)。通過比較hCG類似物(含有未修飾的β亞基以及Lys51變成半胱氨酸的α亞基(hCG(αK51C-β))，以及含有未修飾的α亞基和Asp99變成半胱氨酸的β亞基(hCG(α-βD99C)))和hCG以及hCG(α51-β99)的LH受體結(jié)合活性，就可以區(qū)分半胱氨酸取代的影響和二硫鍵的影響(圖17)。這些分析表明，α亞基Lys51替代成半胱氨酸對類似物抑制125I-hCG結(jié)合LH受體的能力有很大的抑制性影響。hCG(α51-β99)和hCG(α-β99)的活性類似，這證明β亞基Asp99替代成半胱氨酸是hCG(α51-β99)的LH受體結(jié)合活性減少的主要原因。Lys51變成丙氨酸也減少了hCG的活性(圖18)。
還測試了這些hCG類似物刺激信號轉(zhuǎn)導(環(huán)腺苷酸累積)的能力。用半胱氨酸或丙氨酸取代α亞基殘基Lys51使得激素刺激環(huán)腺苷酸累積的能力幾乎完全喪失(圖19和20)。與僅含α亞基Lys51的單個半胱氨酸替代的類似物相比，在兩個亞基中加入半胱氨酸產(chǎn)生hCG(α51-β99)恢復(fù)了大量活性(圖19)。β亞基殘基Asp99被半胱氨酸替代本身對LH受體信號轉(zhuǎn)導的影響小得多。這表明，二硫鍵減少了hCG類似物的相對效力，該性質(zhì)可用于拮抗劑的設(shè)計。
座位系帶和α亞基環(huán)2之間的亞基間二硫鍵的存在提高了hCG的熱穩(wěn)定性(圖8)。它還防止亞基在8M尿素存在下解離(圖9)。這些觀察結(jié)果確認了亞基間二硫鍵對糖蛋白激素穩(wěn)定性的有利作用。
實施例4通過座位系帶和α亞基環(huán)2之間的亞基間二硫鍵穩(wěn)定的雙功能糖蛋白激素類似物在能和三種主要的糖蛋白激素受體相互作用的糖蛋白激素類似物CFC101-114的座位系帶和α亞基環(huán)2之間產(chǎn)生二硫鍵。這樣就能分析該蛋白區(qū)域?qū)蚅H和FSH受體相互作用的相對影響。
通過pSVL-CFC101-114β′盒式誘變制得產(chǎn)生CFC101-114β′(α51-β99)所需的β亞基表達載體(即，pSVL-CFC101-114β′D99C)。該載體在氨基酸95-96的密碼子中含有BglII內(nèi)切核酸酶限制性位點，在氨基酸102-104的密碼子中含有SstII位點。用BglII和SstII消化pSVL-CFC101-114β′，用Oligo924和Oligo923(表5)退火獲得的合成的寡核苷酸盒取代小片段，制得pSVL-CFC101-114β′D99C。這也引入了用來選擇重組克隆的BsrGI位點。所得載體pSVL-CFC101-114β′D99C中變化的堿基序列用雙脫氧測序法確認。圖21中描述了該載體編碼的CFC101-114β′(α51-β99)的氨基酸序列。
如實施例1所述，從COS-7細胞共同表達pSVL-αK51C和pSVL-CFC101-114β′D99C。在夾心免疫試驗中測定該二聚體，用A113作捕獲抗體，用放射性碘化的B112作檢測抗體，用純化的尿hCG作為標準。和其它類似物一樣，不一定要用這些特定的抗體來檢測培養(yǎng)基中的CFC101-114(α51-β99)。能結(jié)合hCG和hFSH的大多數(shù)α亞基抗體可用作捕獲抗體。能結(jié)合hCG和游離的β亞基的大多數(shù)抗體(除了識別包括已經(jīng)變成FSH的序列的殘基的那些)可用作檢測抗體。不能使用的一個抗體例子是B111(Cosowsky等人，1995)。
A407(一種識別hCGα亞基N端部分決定簇的α亞基單克隆抗體(Moyle等人，1995))幾乎不識別CFC101-114，并結(jié)合hCG(圖5)。認為這是由于座位系帶對糖蛋白激素α和β亞基整個相互作用的影響(可能涉及到受體結(jié)合特異性的控制)。在α亞基殘基51和β亞基殘基99之間增加二硫鍵不能使所得類似物被A407識別(圖11)。
和其它二硫鍵交聯(lián)的類似物一樣，在熱變性試驗中也發(fā)現(xiàn)CFC101-114(α51-β99)比其親代前體(即CFC101-114和hCG)更穩(wěn)定(圖12)。實際上，看上去α亞基殘基51和β亞基殘基99之間二硫鍵的存在使蛋白質(zhì)穩(wěn)定性增加的程度比α亞基殘基31和β亞基殘基37之間的二硫鍵高。
CFC101-114(α51-β99)的座位系帶和α亞基環(huán)2之間二硫鍵的存在減少了它結(jié)合LH受體的能力(圖22)。因此，盡管CFC101-114在抑制放射性碘化的hCG結(jié)合LH受體中和重組hCG幾乎一樣有效，但是CFC101-114(α51-β99)的活性低大約100倍。監(jiān)測CFC101-114、CFC101-114(α51-β99)、CFC101-114(αK51C-β)、CFC101-114(αK51A-β)和CFC101-114(α-βD99C)的活性，比較了單個亞基突變以及二硫鍵的相對重要性。此比較表明，α亞基Lys51被半胱氨酸或丙氨酸替代本身對受體結(jié)合有很大的抑制影響(圖22和23)。因此，CFC101-114(αK51C-β)的活性和CFC101-114(α51-β99)的活性相當。與其對hCG的LH活性的影響不同，用半胱氨酸代替CFC101-114β亞基Asp99只說明了CFC101-114(α51-β99)結(jié)合LH受體能力減少的一部分原因。然而，CFC101-114(α51-β99)比CFC101-114(αK51C-β)更具活性，該效應(yīng)不能解釋成是因為α亞基中Lys51被半胱氨酸代替而致。
還進行研究來測定座位系帶-α亞基二硫鍵對CFC101-114的信號轉(zhuǎn)導活性的影響(圖24和25)。CFC101-114刺激LH受體處的信號轉(zhuǎn)導的效能稍稍不如hCG(圖24)。然而，二硫鍵交聯(lián)的類似物CFC101-114(α51-β99)只是在測試的最高濃度下有活性。在前面討論的研究確認，這看來主要是由于α亞基Lys51變成半胱氨酸，而只有β亞基Asp99變成半胱氨酸的類似物(即CFC101-114(α51-β99))卻基本上保留了其活性。在結(jié)合試驗中，此處的二硫鍵能補償α亞基Lys51被半胱氨酸或丙氨酸替代引起的一些活性損失，亞基間二硫鍵恢復(fù)了一些信號轉(zhuǎn)導(圖24)。
CFC101-114在FSH試驗中有顯著的活性。然而，產(chǎn)生座位系帶-α亞基環(huán)2二硫鍵交聯(lián)所需的半胱氨酸替代對CFC101-114的FSH活性的影響比對LH活性的影響更大(圖26、27和28)，不可能區(qū)分二硫鍵本身的影響。因此，只有α亞基Lys51或β亞基Asp99被改變的類似物喪失了其大多數(shù)FSH活性。β亞基Asp99的突變對FSH活性的影響高于對LH活性的影響這一發(fā)現(xiàn)支持了以前關(guān)于座位系帶在LH和FSH活性中作用的觀察結(jié)果(Han等人，1996；Baird等人，1993)。這些報道提示，影響LH受體結(jié)合的座位系帶區(qū)域在氨基酸94-96附近，而影響FSH受體結(jié)合的區(qū)域在氨基酸101-109附近。
實施例5通過實施例1和3的二硫鍵穩(wěn)定的hCG為了了解多個二硫鍵導入糖蛋白激素會怎樣影響其生物活性，制得含有實施例1和3所示二硫鍵的hCG類似物。通過交換實施例1和3所述的表達載體的部分，制得這些類似物。用BsmI消化pSVL-αC7S和pSVL-αK51C，用瓊脂糖凝膠電泳分離每次消化產(chǎn)生的小的和大的片段，連接pSVL-αC7S的大片段和pSVL-αK51C獲得的小片段，制得pCI-α(C7S，K51C)。用XhoI和BamHI消化所得構(gòu)建物，并連接入具有實施例1所述的修飾的多接頭的pCI中。用AcoI(Bsu36I的isochizamer)和BamHI消化pSVL-hCGβ′(D99C)和pCI-hCGβ′Y37C，用瓊脂糖凝膠電泳分離小的和大的片段，將pSVL-hCGβ′D99C衍生的小片段與pCI-hCGβ′Y37C衍生的大片段相連接，制得pCI-hCGβ′(Y31C，D99C)。圖31中描述了這些載體編碼的類似物的氨基酸序列。
如實施例1所述，在COS-7細胞中共同表達pCI-α(C7S，K51C)和pCI-hCGβ′(Y31C，D99C)。濃縮分泌到培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)，如實施例1所述用夾心免疫試驗監(jiān)測，只是用放射性碘化的B112代替B105。多個二硫鍵的存在沒有阻止糖蛋白激素折疊或從細胞中分泌出來(通過培養(yǎng)基中存在類似物來表明)(圖8)。在夾心免疫試驗中相對于hCG標準品測定hCG(α31-β37，α51-β99)，用針對α亞基的抗體(A113)作捕獲抗體，并用針對β亞基的放射性碘化的抗體(B112)作檢測抗體。該類似物不被抗體A407很好地識別，這可能是α亞基N端附近的突變造成的后果。由于蛋白的這個區(qū)域并非激素活性所需，因此缺少該表位看來影響不大。圖31中的大寫字母指導入形成二硫鍵的突變的位置。
表8轉(zhuǎn)染的COS-7細胞產(chǎn)生hCG和hCG(α31-β37，α51-β99)

在熱變性試驗中，與hCG相比，hCG(α31-β37，α51-β99)中兩個二硫鍵的存在增加了它的穩(wěn)定性(圖8)。另外，hCG(α31-β37，α51-β99)對尿素變性比hCG更穩(wěn)定(圖9)。這提示，多個二硫鍵的存在不會使此分子不穩(wěn)定。
hCG(α31-β37，α51-β99)能結(jié)合LH受體并刺激環(huán)腺苷酸累積(圖30和31)。它在這些試驗中的活性與hCG(α51-β99)類似，這再一次表明α亞基殘基31和β亞基殘基37之間的亞基間二硫鍵對受體結(jié)合或信號轉(zhuǎn)導的不利影響很小(如果有的話)。因此，當希望保留內(nèi)分泌活性時，為了工程改造增加二硫鍵以便使糖蛋白激素穩(wěn)定，α31-β37半胱氨酸結(jié)節(jié)間位點是較佳的。
實施例6通過α和β亞基之間的半胱氨酸結(jié)節(jié)間二硫鍵而穩(wěn)定的hFSH類似物hCG和CFC101-114能通過它們的半胱氨酸結(jié)節(jié)之間的亞基間二硫鍵來穩(wěn)定而且不破壞其LH和/或FSH活性的發(fā)現(xiàn)提示，該區(qū)域是激素活性所不需要的。因此，預(yù)計在FSH中工程改造增加類似的二硫鍵將產(chǎn)生具有增加的穩(wěn)定性、強效FSH活性的hFSH類似物。預(yù)計該類似物還能結(jié)合識別hCG和hFSHα亞基的抗體(如A113)。預(yù)計它也能結(jié)合識別遠離該突變位點的hFSHβ亞基環(huán)1和/或環(huán)3的區(qū)域的抗體(如B602)。
圖3中已經(jīng)描述了制備在α亞基殘基31和β亞基殘基31之間交聯(lián)的hFSH類似物所需的一個α亞基類似物序列。圖32說明了也可用于制備此類似物(αC7A)的極性較差的α亞基的氨基酸序列。圖32中還示出了預(yù)計和αC7A或αC7S形成半胱氨酸結(jié)節(jié)間二硫鍵的hFSHβY31C的氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用圖33所示的遺傳密碼從人α亞基和hFSHβ亞基cDNA制得編碼這些蛋白的載體所需的核酸序列。這些序列也可以從實施例1中列舉的供應(yīng)商處購得。
用任何本領(lǐng)域熟知的方法(如實施例1中參考的方法)，可以將能驅(qū)動αC7S和hFSHβY31C或αC7A和hFSHβY31C瞬時或穩(wěn)定表達的載體導入COS-7或其它真核細胞中。在夾心免疫試驗中，用作為標準品的hFSH、識別遠離α亞基N端的hFSH表位的捕獲抗體和識別β亞基環(huán)1和/或環(huán)3中hFSH表位部位的檢測抗體，測定產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。
如實施例1中交聯(lián)的hCG類似物所進行的那樣，預(yù)計交聯(lián)的hFSH類似物在熱變性或尿素變性試驗中比hFSH更穩(wěn)定。交聯(lián)的FSH類似物預(yù)計也將和放射性碘化的hFSH競爭結(jié)合已經(jīng)轉(zhuǎn)染了人FSH受體的CHO細胞。預(yù)計它還會在這些細胞中刺激環(huán)腺苷酸累積。體外試驗可以成功地預(yù)測完全糖基化的糖蛋白激素類似物在體內(nèi)的生物活性。由于預(yù)計導入突變來交聯(lián)糖蛋白激素類似物不會改變它們相對于重組糖蛋白激素的整個糖基化方式，因此預(yù)計交聯(lián)的FSH類似物在體內(nèi)也將具有活性。
實施例7通過α和β亞基N端區(qū)域之間的二硫鍵而穩(wěn)定的hCG類似物實施例1-4描述了糖蛋白激素及其類似物的亞基之間的單個亞基間二硫鍵能增強它們的穩(wěn)定性。這些實施例還表明，二硫鍵對于分子的受體結(jié)合以及信號轉(zhuǎn)導活性的影響很小，只要它不涉及對于受體結(jié)合、受體結(jié)合特異性重要的殘基或不將蛋白扭曲成不適當?shù)臉?gòu)型。α和β亞基的N端部分可作很大變化而不破壞激素活性，這說明蛋白的這一部分不參與關(guān)鍵的受體接觸。因此，預(yù)計在糖蛋白激素N端在(圖1B所示的有利位點)導入二硫鍵將使蛋白質(zhì)穩(wěn)定而不嚴重地破壞它們的生物活性。
圖1B顯示，α亞基Gln5和hCGβ亞基Arg8的位置很有利，用半胱氨酸替代這些殘基將導致形成二硫鍵交聯(lián)的類似物。預(yù)計該類似物相對于hCG而言具有增強的穩(wěn)定性，并保留了結(jié)合和刺激LH受體的能力。
圖34A和34B描述了制備用來表達該類似物的載體所需的氨基酸序列。
實施例8通過α和β亞基N端部分之間的二硫鍵而穩(wěn)定的hFSH類似物如前所述，實施例1-4描述了糖蛋白激素及其類似物的亞基之間的亞基間二硫鍵能增強它們的穩(wěn)定性。這些實施例還說明了二硫鍵對受體結(jié)合以及信號轉(zhuǎn)導的影響，只要二硫鍵不涉及對受體結(jié)合或受體結(jié)合特異性重要的殘基。因此，根據(jù)本發(fā)明，預(yù)計在hFSH N端引入一個二硫鍵將使其穩(wěn)定，并導致產(chǎn)生一種具有有用的治療性質(zhì)的類似物。
根據(jù)表1B(顯示了α亞基Gln5和hCGβ亞基Arg8的有利位置)以及表2(顯示了hCG和hFSH中的“等價”殘基)中的數(shù)據(jù)，預(yù)計用半胱氨酸殘基取代α亞基Gln5和hFSHβ亞基Ser2會產(chǎn)生二硫鍵交聯(lián)的hFSH類似物。預(yù)計這些類似物的穩(wěn)定性比hFSH有所增強，并且將保留結(jié)合和刺激FSH受體的能力。圖35中描述了制備用來表達該類似物的載體所需的氨基酸序列。
實施例9通過α和β亞基間的半胱氨酸結(jié)節(jié)間二硫鍵或α和β亞基N端部分之間的亞基間二硫鍵穩(wěn)定的hLH類似物最密切相關(guān)的人促黃體激素是hCG和hLH。因此，預(yù)計制備有活性的二硫鍵交聯(lián)的hCG類似物所需的突變也可用來制備有活性的二硫鍵交聯(lián)的hLH類似物。hLH是促性腺激素中最不穩(wěn)定的，因此預(yù)計亞基間二硫鍵將大大提高hLH的穩(wěn)定性。圖36和37中分別描述了制備半胱氨酸結(jié)節(jié)間二硫鍵交聯(lián)的hLH所需β亞基的氨基酸序列以及在其N端附近交聯(lián)的hLH。
實施例10預(yù)計能用來制備通過α和β亞基之間的半胱氨酸結(jié)節(jié)間二硫鍵、或α和β亞基N端部分之間的亞基間二硫鍵穩(wěn)定的hTSH類似物的β亞基類似物-hTSHβY30C如前所述，實施例1-4描述了糖蛋白激素及其類似物的亞基之間的亞基間二硫鍵能增強它們的穩(wěn)定性。這些實施例還說明了二硫鍵對受體結(jié)合和信號轉(zhuǎn)導的影響，只要二硫鍵不涉及對于受體結(jié)合或受體結(jié)合特異性重要的殘基。因此，預(yù)計在hTSHα和β亞基的半胱氨酸結(jié)節(jié)中或hTSHα和β亞基N端中的殘基之間，引入二硫鍵將使該異二聚體穩(wěn)定，從而產(chǎn)生具有有用治療性能(例如在放射性碘切除治療前刺激甲狀腺)的類似物。
根據(jù)表1B(顯示了α亞基Cys31和hCGβ亞基Tyr37的有利位置)以及表2(顯示了hCG和hTSH中的“等價”殘基)中的數(shù)據(jù)，預(yù)計表達αC7S或αC7A以及Tyr30被半胱氨酸殘基取代的hTSHβ亞基類似物的細胞將產(chǎn)生二硫鍵交聯(lián)的hTSH類似物。同樣，根據(jù)表1B(顯示了α亞基Gln5和hCGβ亞基Arg8的有利位置)以及表2(顯示了hCG和hTSH中的“等價”殘基)中的數(shù)據(jù)，預(yù)計用半胱氨酸殘基取代α亞基Gln5和hTSHβ亞基Phe1會產(chǎn)生二硫鍵交聯(lián)的hTSH類似物。預(yù)計這些類似物的穩(wěn)定性比hTSH有所增強，并且將保留結(jié)合和刺激TSH受體的能力。
圖38和39中描述了制備用來表達這些類似物的載體所需的氨基酸序列。
實施例11二硫鍵交聯(lián)的激素拮抗劑的制備眾所周知，糖蛋白激素的去糖基化降低了它們引發(fā)生物信號的能力(Moyle等人，1975；Matzuk等人，1989)。然而，由于它們不穩(wěn)定，去糖基化的激素不能用于治療。預(yù)計將二硫鍵交聯(lián)入通過基因改變而去糖基化的激素會提高它們作為激素拮抗劑的用途。LH或hCG的拮抗劑有促進生育力和抗生育力的用途。因此，當其給予具有不適當高水平LH而不育的女性時，LH拮抗劑將增強生育力。當其給予處于懷孕早期的女性時，hCG拮抗劑將終止懷孕。也可使用雙功能LH/FSH分子的拮抗劑，例如CFC101-114或CF101-109(Moyle等人，1994)。該拮抗劑的短時期使用可用來終止不適當?shù)穆殉补δ埽瑥亩乖陆?jīng)周期重新恢復(fù)。這具有潛在的促進生育的效應(yīng)。在懷孕早期使用這種拮抗劑預(yù)計能抑制孕酮和雌二醇的產(chǎn)生并終止懷孕。
除了引入亞基間二硫鍵交聯(lián)，交聯(lián)的拮抗劑的制備還涉及改變已描述的或能參照表1B可產(chǎn)生的類似物中α亞基上或α和β亞基上的N連接的糖基化信號。這將涉及到改變在糖蛋白激素α和β亞基中發(fā)現(xiàn)的序列Asn-X-Ser/Thr，用另一氨基酸取代Asn，將Ser或Thr變成另一個氨基酸，或?qū)sn或Ser/Thr之間的氨基酸(用X表示)變成脯氨酸。
實施例12表9-15中列出了預(yù)計比親代激素更穩(wěn)定的促性腺激素的其它二硫鍵交聯(lián)類似物。這些類似物可通過用能表達α亞基和β亞基構(gòu)建物的載體共轉(zhuǎn)染細胞來制得(如實施例1-5所述)。
表9可用來制備hCG、hLH、hFSH和hTSH的二硫鍵交聯(lián)類似物的人α亞基的其它類似物(注意突變用大寫字母表示)

表10用來制備與適當?shù)摩羴喕愃莆锝Y(jié)合的二硫鍵交聯(lián)的hFSH類似物的hFSHβ亞基的其它類似物(注意突變用大寫字母表示)

表11用來制備與合適的α亞基類似物結(jié)合的二硫鍵交聯(lián)的hCG類似物的hCGβ亞基的其它類似物(注意突變用大寫字母表示)

表12用來制備與合適的α亞基類似物結(jié)合的二硫鍵交聯(lián)的hLH類似物的hLHβ亞基的其它類似物(注意突變用大寫字母表示)

表13含有提高其穩(wěn)定性的亞基間二硫鍵的hFSH異二聚體

注意預(yù)計基本上保留生物活性的那些構(gòu)建物用星號表示。這根據(jù)參與受體結(jié)合或受體結(jié)合特異性的殘基的作用來計算(如實施例1-4所示)。交聯(lián)的異二聚體可用實施例1所述的方法通過指定的α和β亞基類似物cDNA共轉(zhuǎn)染到哺乳動物細胞中來制得。
表14含有提高其穩(wěn)定性的亞基間二硫鍵的hCG異二聚體

注意預(yù)計基本上保留生物活性的那些構(gòu)建物用星號表示。這根據(jù)參與受體結(jié)合或受體結(jié)合特異性的殘基的作用來計算(如實施例1-4所示)。交聯(lián)的異二聚體可用實施例1所述的方法通過指定的α和β亞基類似物cDNA共轉(zhuǎn)染到哺乳動物細胞中來制得。
表15含有提高其穩(wěn)定性的亞基間二硫鍵的hLH異二聚體


注意預(yù)計基本上保留生物活性的那些構(gòu)建物用星號表示。這根據(jù)參與受體結(jié)合或受體結(jié)合特異性的殘基的作用來計算(如實施例1-4所示)。交聯(lián)的異二聚體可用實施例1所述的方法通過指定的α和β亞基類似物cDNA共轉(zhuǎn)染到哺乳動物細胞中來制得。
實施例13β亞基環(huán)2和α亞基環(huán)3之間含有二硫鍵的hCG類似物產(chǎn)生該二硫鍵的殘基在認為未參與高親和性受體接觸的hCG區(qū)域內(nèi)(Moyle等人，1995)。hCG的第二β亞基環(huán)和第三β亞基環(huán)均非促黃體素活性所需的，因此可以制得兩者均缺失的有活性的hCG類似物(Moyle等人，1998)。另外，已經(jīng)制得了具有全部活性的β亞基環(huán)2被其hFSH對應(yīng)物代替的hCG類似物(Campbell等人，1991)。因此，本發(fā)明者預(yù)計，在蛋白的這些部分之間加入亞基內(nèi)二硫鍵不會破壞其生物活性。該類似物可通過修飾編碼hCGα和β亞基的載體并在哺乳動物細胞中共同表達這些載體來制得。α亞基構(gòu)建物編碼了具有表9所示稱為αV76C的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。該構(gòu)建物通過用寡核苷酸1131和1132作為引物(表5)，pMB589作為模板利用PCR誘變來制得。質(zhì)粒pMB589是在pCI′中的一種構(gòu)建物，它所編碼的人α亞基類似物中Asn52的密碼子被變成天冬氨酸，Arg42和Ser43的密碼子被修飾產(chǎn)生沉默的BglII位點。
將pMB532的XhoI-BamHI插入物亞克隆到pCI′載體的XhoI-BamHI位點之間，制得pMB589，而pBM532則通過以寡核苷酸850和851為引物(表5)、以pMB507為模板的PCR從以前描述的構(gòu)建物pMN507制得。用BglII和SpeI消化PCR產(chǎn)物，并亞克隆到pMB507的BglII和SpeI位點中并測序，獲得pMB532。
用BglII和PstI消化PCR產(chǎn)物，將插入物克隆到pMB507的BglII和PstI位點中，產(chǎn)生pMB910。通過已經(jīng)導入該構(gòu)建物的額外的DraI位點的存在來鑒定陽性克隆。在用雙脫氧法確認pMB910的DNA序列后，通過XhoI和BamHII消化從pMB910中除去編碼整個α亞基類似物的DNA片段，并亞克隆到pCI′載體的XhoI和BamHI位點中，產(chǎn)生pMB926。pMB926編碼αV76C。
為了產(chǎn)生αV76C的hCGβ亞基伙伴，制得編碼hCGβ′V44C的載體。這是hCGβ亞基的類似物，預(yù)計它將和在pMB926同一細胞中表達的αV76C形成二硫鍵交聯(lián)的異二聚體。合成寡核苷酸1133和1134(表5)，并連接到pKMB-β′的NgoMI-PstI位點中，產(chǎn)生pMB909。將pBM909的XhoI-BamHI片段轉(zhuǎn)移到pCI′中，產(chǎn)生pMB941。表11顯示了pMB941編碼的hCGβV44C的氨基酸序列。
實施例14β亞基環(huán)2和α亞基環(huán)3之間含有二硫鍵的hFSH類似物根據(jù)hCG和hFSHβ亞基的氨基酸序列、尤其是半胱氨酸(表4)的相似性，預(yù)計此兩種蛋白具有類似的結(jié)構(gòu)。hCGβ亞基環(huán)2中Val44和α亞基環(huán)3中Val76的相對位置提示，將這些殘基變?yōu)榘腚装彼釋⒃讦聛喕h(huán)2和α亞基環(huán)3之間產(chǎn)生亞基間二硫鍵。Val38在hFSHβ亞基中占據(jù)的位置與hCGβ亞基中的Val44相似。因此，認為將hFSHβVal38變成半胱氨酸并使所得構(gòu)建物和αV76C一起表達將導致二硫鍵交聯(lián)的異二聚體。為了將hFSH中的Val38變成半胱氨酸，本發(fā)明者從pMB603開始，該構(gòu)建物在pCI′載體中XoI和BamHI限制性位點之間含有減去非翻譯3′和5′末端的hFSHβcDNA編碼序列。pMB603的BstXI和PpuMI之間的小DNA片段被寡核苷酸1154和115(表5)退火制得的寡核苷酸盒取代。
篩選缺少BstXI位點且存在PpuMI位點的所得構(gòu)建物，稱為pMB920。在DNA測序確認所需變化存在后，將pMB920和pMB926(驅(qū)動αV76C表達的載體)一起共同轉(zhuǎn)染到COS-7細胞中。該細胞將異二聚體分泌到培養(yǎng)基中，該異二聚體很容易在夾心免疫試驗(用抗α亞基單克隆抗體A113作捕獲抗體、用放射性標記的抗hFSHβ亞基的單克隆抗體B602)中檢測到。表10中顯示了pMB920編碼的hFSHβ38C氨基酸序列。由αV76C和hFSHβV38C組成異二聚體在表達人FSH受體的CHO細胞中刺激了環(huán)腺苷酸的累積(圖45)。
實施例15每個亞基N端之間以及半胱氨酸結(jié)節(jié)之間含有二硫鍵的hCG類似物前述的二硫鍵交聯(lián)的異二聚體通過修飾每個亞基產(chǎn)生能參與亞基間二硫鍵的游離的巰基來制得。這里要說明的是，有可能只通過修飾hCG的β亞基來制備二硫鍵交聯(lián)的hCG。hCG的晶體結(jié)構(gòu)顯示，α亞基Cys31位于β亞基Tyr37附近，兩個亞基的側(cè)鏈彼此指向?qū)Ψ?。前面用該觀察結(jié)果將亞基間二硫鍵插入hCGα亞基殘基31和β亞基殘基37之間。hCG的晶體結(jié)構(gòu)還顯示，α亞基殘基Cys7位于hCGβ亞基殘基Arg6附近。實際上，α亞基殘基Cys7和Cys31位于β亞基殘基Arg6和Tyr37附近，因此轉(zhuǎn)變Arg6和Tyr37可能會促進形成含有αCys7-αCys31以及βCys6-βCys37亞基間二硫鍵的異二聚體、含有αCys7-βCys6以及αCys31-βCys37亞基間二硫鍵的異二聚體、或含有αCys7-βCys37和αCys31-βCys6亞基間二硫鍵的異二聚體。計算機模擬顯示，這些二硫鍵每一個都能形成而蛋白不會有過度的應(yīng)變。多個二硫鍵的形成可用來產(chǎn)生一組具有不同半衰期的異構(gòu)體或同種型。這些異構(gòu)體或同種型可能有新的治療用途，特別是當生物應(yīng)答需要“跳躍-啟動”時。在使用這些物質(zhì)時，可以給予大塊類似物來啟動激素應(yīng)答。預(yù)計未交聯(lián)的異二聚體組分的清除比交聯(lián)的異二聚體更快。因此，最初的大量注射足以啟動應(yīng)答，但是它的活性會降低至較低的水平，該水平將長時間地維持以保持應(yīng)答。預(yù)計該類似物還可作為中間產(chǎn)物來制備聚乙二醇化的類似物。半胱氨酸殘基具有獨特的反應(yīng)性，通常希望在蛋白質(zhì)表面增加游離的半胱氨酸。然而，由于半胱氨酸的反應(yīng)性，這種類型的蛋白很難產(chǎn)生。已經(jīng)知道，α亞基Cys7-Cys31二硫鍵很容易還原成產(chǎn)生游離半胱氨酸的狀態(tài)。在β亞基中殘基6和37之間引入半胱氨酸預(yù)計會產(chǎn)生相似類型的二硫鍵。預(yù)計這些二硫鍵中的半胱氨酸會比蛋白中的其它半胱氨酸更活潑，特別是因為它們在促進二硫鍵交換的位置中。因此，本發(fā)明者預(yù)計，可以使α亞基殘基Cys7處已有的半胱氨酸和β亞基殘基Cys6處加入的半胱氨酸和修飾蛋白的試劑反應(yīng)。這些可包括能使蛋白聚乙二醇化、使其生物半衰期穩(wěn)定的那些半胱氨酸。該方法中“釋放出的”半胱氨酸能形成使蛋白質(zhì)穩(wěn)定的亞基間二硫鍵。該類似物的制備需要在已知為hCGβ′Y37C的類似物中加入第二個半胱氨酸。
用寡核苷酸1161和1163(表5)作為引物，pCI′-hCGβ′作為模板，通過PCR誘變制得編碼類似物hCGβ′的構(gòu)建物pMB940。寡核苷酸1161引導了位于pCI′載體內(nèi)的序列，而寡核苷酸1163編碼了突變。用XhoI和BanI消化PCR產(chǎn)物，和pSVL-hCGβ′Y37C獲得的BanI-BamHI片段一起連接到pCI′的大的XhoI-BamHI片段中，產(chǎn)生pMB941。用雙脫氧法確認pMB941編碼序列的DNA序列。pMB941編碼的氨基酸序列如下所示hCGβ′R6C，Y37CmemfqglllllllsmggtwaskeplCprcrpinatlavekegcpvcitvntticagCcptmtrvlqgvlpalpqvvcnyrdvrfesirlpgcprgvnpvvsyavalscqcalcrrsttdcggpkdhpltcddprfqdssssk將pMB940和pSV2Neo共同轉(zhuǎn)染到CHO細胞中，選擇對毒性藥物G418有抗性的穩(wěn)定的細胞系。用夾心免疫試驗定量測定從培養(yǎng)基收獲的蛋白，用抗α亞基抗體A113作捕獲抗體，用放射性碘化的抗β亞基抗體B112作檢測抗體。該試驗確認培養(yǎng)基中存在異二聚體。在環(huán)腺苷酸累積試驗中，用表達大鼠LH受體的CHO細胞測定該異二聚體的生物活性。圖46描述了該試驗的結(jié)果。
實施例16每個亞基N端之間以及半胱氨酸結(jié)節(jié)之間含有二硫鍵的hFSH類似物如前所述，多個二硫鍵的形成可能能用來產(chǎn)生一組具有不同半衰期的蛋白同種型。相似的類似物將提供一種改善的方法來刺激卵泡發(fā)育。不含亞基間二硫鍵因此不交聯(lián)的異二聚體組分的清除應(yīng)當比含有亞基間交聯(lián)的異二聚體組分更快。因此，最初的大量注射足以刺激初始的卵泡發(fā)育，但是它的活性將降低至較低的水平，該水平應(yīng)維持較長的時間。這將更接近地模擬卵泡期所見的FSH刺激類型，并可能減少過量刺激的機會。預(yù)計將半胱氨酸加到hFSHβ亞基N端或?qū)CGβ亞基氨基端加到hFSHβ亞基N端將有助于形成異二聚體和亞基間交聯(lián)。預(yù)計hFSHβ亞基類似物形成與實施例15中的類似物相似的異二聚體將具有下列氨基酸序列hFSH′βR-2C，Y31CmemfqglllllllsmggtwaskeplCnsceltnitiavekegcgfcitinttwcagCcytrdlvykdparpkiqktctfkelvyetvrvpgcahhadslytypvatqchcgkcdsdstdctvrglgpsycsfgemke實施例17具有強效hFSH活性、含有類似于實施例15類似物的二硫鍵排列的hCG類似物β亞基氨基酸94-110被其hFSH對應(yīng)物取代的hCG類似物具有高的FSH活性。含有hFSHβ亞基殘基95-103代替hCGβ亞基殘基101-109、且在β亞基殘基6和37處有半胱氨酸的hCG和hFSH的嵌合物預(yù)計將形成和實施例15中類似的二硫鍵排列。預(yù)計它們也將具有高的FSH活性。這樣一種類似物的β亞基的氨基酸序列將會是CFC94-117βR6C，Y37CmemfqglllllllsmggtwaskeplCprcrpinatlavekegcpvcitvntticagCcptmtrvlqgvlpalpqvvcnyrdvrfesirlpgcprgvnpvvsyavalscqcalcdsdstdctvrglgpsycsfgemkesssskapppslpspsrlpgpsdtpilpq現(xiàn)在在全部描述了本發(fā)明后，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下無需作過多試驗，就可在范圍相當寬的等價參數(shù)、濃度和條件下進行相同的發(fā)明。
盡管本發(fā)明已經(jīng)聯(lián)系特定的實例作了描述，但是應(yīng)當理解，它能作進一步改進。本申請覆蓋了通常按照本發(fā)明理論對本發(fā)明所作的任何變化、應(yīng)用或改編，所包括對本文公開內(nèi)容的改動是本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)已知的或在常規(guī)實踐內(nèi)，可能適用于下文所附權(quán)利要求范圍內(nèi)的提出的必要技術(shù)特征。
本文引用的所有參考文獻，包括雜志、論文或摘要，公開的或相應(yīng)的美國或外國專利申請，均全部納入本文作參考，其中包括引用文獻中的所有數(shù)據(jù)、表格、圖形以及文本。另外，本文引用的參考文獻中引用的文獻的全部內(nèi)容也全部納入本文作參考。
引用參考已知的方法步驟、或常規(guī)的方法步驟并不等于以任何方式承認本發(fā)明的所有方面、描述或?qū)嵗呀?jīng)在相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域中公開、指出或有提示。
前面對特定實例的描述非常全面地揭示了本發(fā)明的總體特征，其它人無需作過多試驗就可在不脫離本發(fā)明的總體思路下運用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的知識(包括本文引用文獻中的內(nèi)容)將這些具體實例改進和/或改用于各種應(yīng)用。因此，根據(jù)本文的說明和指導，這些改動和變化均在所公開實例等價意義和范圍內(nèi)。應(yīng)當理解，本文的措詞和術(shù)語只是為了描述，而無限制性，本說明書的術(shù)語或措詞可由本領(lǐng)域技術(shù)人員依據(jù)本文的說明和指導結(jié)合本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識來作解釋。
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權(quán)利要求
1.一種糖蛋白激素類似物，它選自人絨膜促性腺激素hCG、人促黃體素hLH、人促卵泡激素hFSH、人促甲狀腺激素hTSH、以及它們的功能性突變蛋白，它具有α亞基和β亞基，其中所述糖蛋白激素亞基的氨基酸序列經(jīng)過修飾在所述α亞基環(huán)3和所述β亞基環(huán)2之間、或在所述α亞基環(huán)1和所述β亞基環(huán)2之間形成一個亞基間二硫鍵來改善穩(wěn)定性，所述類似物保留了針對對應(yīng)的天然糖蛋白激素受體的至少一部分生物活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的類似物，其中所述α亞基的氨基酸序列經(jīng)過修飾，Val76被半胱氨酸取代，所述hFSHβ亞基經(jīng)修飾，Val38被半胱氨酸取代，從而在所述α亞基的殘基76和所述hFSHβ亞基的殘基38之間產(chǎn)生一個亞基間二硫鍵。
3.一種藥物組合物，它包含有效量的權(quán)利要求1所述的類似物以及藥學上可接受的賦形劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，它是一種液體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，它是穩(wěn)定的。
6.權(quán)利要求3所述的藥物組合物用于制備治療不育癥的藥物中的用途。
7.權(quán)利要求3所述的藥物組合物用于制備限制生育力的藥物中的用途。
8.一種重組DNA分子，它包含編碼權(quán)利要求1所述的類似物α亞基的核苷酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組DNA分子，它是一種表達載體。
10.一種用權(quán)利要求9所述的重組DNA分子轉(zhuǎn)化的真核宿主細胞，其中所述宿主細胞能表達糖蛋白激素類似物的α亞基。
11.一種重組DNA分子，它包含編碼權(quán)利要求1所述的類似物的β亞基的核苷酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的重組DNA分子，它是一種表達載體。
13.一種用權(quán)利要求11所述的重組DNA分子轉(zhuǎn)化的真核宿主細胞，其中所述宿主細胞能表達糖蛋白激素類似物的β亞基。
14.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的類似物的方法，該方法包括下列步驟培養(yǎng)經(jīng)同一表達載體或分開的表達載體上攜帶的α和β亞基核苷酸序列轉(zhuǎn)化的真核宿主細胞；表達該類似物；和回收表達的類似物。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有亞基間二硫鍵交聯(lián)的糖蛋白激素類似物及其制備和應(yīng)用。本發(fā)明還公開了對應(yīng)的DNA序列、宿主細胞以及藥物組合物。
文檔編號A61K38/00GK1548458SQ20031010284
公開日2004年11月24日 申請日期1998年6月25日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月25日
發(fā)明者W·R·莫伊爾, W R 莫伊爾 申請人:應(yīng)用研究系統(tǒng)Ars股份公司