專利名稱：苯乙?；?(n-甲基)亮氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-(n-甲基)哌嗪的鹽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于苯乙酰基-(N-甲基)亮氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪[化學(xué)名(3S)-3-[(2S)-甲基-2-(N-甲基-2-苯乙酰氨基)戊酰氨基]-3-{N-[(1S)-2-(4-甲基哌嗪基)-2-氧代-1-芐乙基]甲氨?；鶀-丙酸]的鹽，及該鹽的制備過程、以及含該鹽作為活性成分抑制、改變或防止細(xì)胞粘附以及由細(xì)胞粘附所介導(dǎo)的病理過程的藥物組成，及使用該些鹽抑制和防止細(xì)胞粘附以及由細(xì)胞粘附所介導(dǎo)的病理過程的方法，還包括其用于生產(chǎn)諸如人類等溫血動物的治療或預(yù)防劑作為藥物的用途，以及制造藥物的用途。其特別適用于許多炎性疾病和自身免疫性疾病的治療。
背景技術(shù)：
細(xì)胞粘附是細(xì)胞之間發(fā)生相互聯(lián)系、細(xì)胞移向特定的靶組織或滯留在細(xì)胞外的基質(zhì)中的過程。這種粘附可能需要細(xì)胞的激活、遷移、增殖和分化。細(xì)胞與細(xì)胞以及細(xì)胞與基質(zhì)間相互作用是通過數(shù)個細(xì)胞粘附分子族，包括篩選因子、整合素和免疫球蛋白所介導(dǎo)的。正如此，細(xì)胞粘附是許多生物學(xué)現(xiàn)象所蘊(yùn)涵的基本原理之一，并且在許多病理過程中都發(fā)揮著作用，例如在哺乳動物中存在的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。
總蛋白群中稱為整合素的蛋白的是造血細(xì)胞之間以及其與微環(huán)境之間發(fā)生粘附作用的關(guān)鍵介質(zhì)。[ME.Hemler“整合素族中的VLA(極遲抗原)蛋白結(jié)構(gòu)、功能以及在白細(xì)胞內(nèi)的作用”。Ann.Rev.Immunol.8，P365，1990]。整合素是由a和ss兩個亞基組成的非共價的雜合二聚體復(fù)合物。目前至少已發(fā)現(xiàn)16種不同的a亞基以及至少9種不同的ss亞基。
VLA-4整合素是在CD34表達(dá)的造血干細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的最早期的粘附受體之一(Teixido et al.，J.Clin.Invest.，90358-367，1992)。三個不同的研究小組各自獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)了VLA-4整合素雜合二聚體，并且鑒定為淋巴細(xì)胞的表面抗原(Sanchez-Madrid et al.，Eur.J.Immunol.，161343-1349，1986；Claybergeret al.，J.Immunol.，1381510-1541，1987；Hemler et al.，J.Biol.Chem.，26211478-11485，1987)。VLA-4的配體包括血管粘附分子-1(VCAM-1)和纖維蛋白結(jié)合素的CS-1功能區(qū)。VCAM-1是免疫球蛋白系列成員之一，并且在體內(nèi)由炎癥部位的內(nèi)皮細(xì)胞所表達(dá)(見R.Lobb et al.“血管細(xì)胞粘附分子1”于細(xì)胞與分子炎癥的機(jī)理，C.G.Cochrane and M，A.Gimbrone，Eds.；Acad.Press，SanDiego，1993，P.151.)。VCAM-1是由血管內(nèi)皮細(xì)胞對炎癥前細(xì)胞因子的響應(yīng)所產(chǎn)生的(見A.J.H.Gearing and W.Newman，“疾病中的循環(huán)粘附分子”，Immunol.Today，14，506，1993)。通過改變纖維結(jié)合素的內(nèi)部連接而產(chǎn)生的CS-1含有25個氨基酸序列(綜述見R.O.Hynes“Fibronectins.”，Springer-Velag，NY，1990)。在炎癥情況下VLA-4/CS-1相互作用已經(jīng)提出(見M J.Elices細(xì)胞粘附與人類疾病中的“整合素oc4ssl(VLA-4)作為治療靶點(diǎn)”，Ciba Found.Symp.，John Wiley & Sons，NY，1995，P.79)。
抗VLA-4單克隆抗體(“mAb’s”)在體外與體內(nèi)已顯示出能夠抑制依賴VLA-4的細(xì)胞粘附反應(yīng)。體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果提示抑制依賴于VLA-4的細(xì)胞粘附反應(yīng)有可能防止、抑制或改變某些炎癥和免疫反應(yīng)的病理過程。
(3S)-3-[(2S)-甲基-2-(N-甲基-2-苯乙酰氨基)戊酰氨基]-3-{N-[(1S)-2-(4-甲基哌嗪基)-2-氧代-1-芐乙基]甲氨酰基}-丙酸及其類似物的實(shí)例在以下的專利申請中已披露WO0002903，WO9515973 andWO9842656。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的具有藥用價值的苯乙?；?(N-甲基)亮氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪的鹽。
本發(fā)明的另一目的是提供上述結(jié)構(gòu)(I)化合物的鹽所制備的藥用制劑。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供上述結(jié)構(gòu)(I)化合物的鹽在制備治療炎癥疾病，自身免疫性疾病，關(guān)節(jié)炎、哮喘、過敏性疾病、多型性硬化癥、中樞神經(jīng)炎的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明是由下面的結(jié)構(gòu)(I)所表達(dá)的苯乙?；?(N-甲基)亮氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪[化學(xué)名(3S)-3-[(2S)-甲基-2-(N-甲基-2-苯乙酰氨基)戊酰氨基]-3-{N-[(1S)-2-(4-甲基哌嗪基)-2-氧代-1-芐乙基]甲氨?；鶀-丙酸]所形成的鹽的一種化合物，這種鹽的特性在于由一種無機(jī)酸或有機(jī)酸與結(jié)構(gòu)(I)的化合物反應(yīng)所形成；或者這種鹽的特性在于由一種金屬離子或有機(jī)陽離子的堿與結(jié)構(gòu)(I)的化合物反應(yīng)所形成； 上述的酸是選自無機(jī)酸或有機(jī)酸且該酸可與結(jié)構(gòu)(I)化合物能形成藥學(xué)上可接受的鹽；上述的堿是選自金屬離子堿或有機(jī)陽離子堿且該堿可與結(jié)構(gòu)(I)化合物能形成藥學(xué)上可接受的鹽；合適的無機(jī)酸包括鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，磷酸，亞硫酸和亞磷酸，最好是鹽酸；合適的有機(jī)酸包括琥珀酸，馬來酸，醋酸，富馬酸，枸櫞酸，酒石酸，草酸，苯甲酸，苯磺酸，對甲苯磺酸，甲磺酸，乙磺酸或萘磺酸，最好是甲磺酸；合適的金屬離子堿的離子是鋁離子，堿金屬離子如鋰，鈉或鉀，堿土金屬離子如鈣或鎂；最好是鈉和鉀；合適的有機(jī)陽離子堿的離子是氨離子或取代的氨離子，像那些低級烷烴的氨如三乙胺，羥基烷烴氨如2-羥基乙胺或者吡啶類。
本發(fā)明提供了(3S)-3-[(2S)-甲基-2-(N-甲基-2-苯乙酰氨基)戊酰氨基]-3-{N-[(1S)-2-(4-甲基哌嗪基)-2-氧代-1-芐乙基]甲氨?；鶀-丙酸的鹽、以及在研究、診斷、治療和預(yù)防與細(xì)胞粘附有關(guān)的疾病時有可能用作為的制劑與方法。與細(xì)胞粘附有關(guān)的疾病有(但不僅限于此)關(guān)節(jié)炎、哮喘、過敏性疾病、成人呼吸窘迫綜合征、心血管疾病、血栓或有害的血小板聚集反應(yīng)、同種移植排斥反應(yīng)、腫瘤、銀屑病、多型性硬化癥、中樞神經(jīng)炎、Crohn氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、腎小球腎炎以及與炎癥有關(guān)的腎臟病、糖尿病、眼炎(例如葡萄膜炎)、動脈粥樣硬化、各種炎癥以及自身免疫性疾病。
結(jié)構(gòu)(I)的鹽化合物可單獨(dú)或與一種或多種治療劑配伍使用，配伍治療可用固定的形式或用本發(fā)明中的化合物與一種或多種治療劑錯開使用或獨(dú)立的一種使用，或以固定的配伍與一種或多種治療劑配伍使用。結(jié)構(gòu)(I)的鹽化合物不局限于，尤其是腫瘤治療中與化療，放療，手術(shù)或與這些手段的混合相配伍的使用。上述方式根據(jù)治療方式的情況，長期治療與佐劑治療是相同可能的。其它可能的治療是腫瘤退化后保持病人的身份，或甚至化學(xué)預(yù)防性治療，例如，病人自擔(dān)風(fēng)險。
本發(fā)明的化合物不僅用于人類且用于其它熱血動物，例如商業(yè)上有用的動物。該化合物在以上描述的實(shí)驗(yàn)中可用作參考標(biāo)準(zhǔn)與其它化合物對照。
本發(fā)明的化合物可能是結(jié)晶體或非結(jié)晶體，如果是晶體應(yīng)可以隨意水合或溶于水。這項(xiàng)發(fā)明包括了它的范圍化學(xué)計算水合物、這個化合物有不確定量的水。
本發(fā)明延續(xù)至所有結(jié)構(gòu)(I)的鹽化合物的異構(gòu)體形式，空間異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體，包括對映體和其混合物，如消旋體。不同的異構(gòu)體形式可以用常規(guī)方法分離或拆分，指定的異構(gòu)體可以用常規(guī)合成方法或特殊空間合成或不對稱合成或酶催化合成所獲得。
可以用各種人工方法來制備與結(jié)構(gòu)(I)的鹽化合物有關(guān)的無毒前體藥物。精通此術(shù)的人同樣可以認(rèn)識到很多種無毒的溶劑可以用來溶解發(fā)現(xiàn)的化合物，例如水，乙醇，無機(jī)油，植物油，二甲亞砜。
具有結(jié)構(gòu)(I)的鹽化合物可以通過吸入、噴霧、或直腸的方式，經(jīng)口、局部或腸外注射給藥，藥物的成分應(yīng)該是方便無毒的合適媒介物、輔藥和賦形劑。經(jīng)口給藥的劑型是藥片、膠囊、酏劑、糖漿、錠劑等。這里所用的腸外注射方法包括皮下注射、皮膚內(nèi)、血管內(nèi)(例如靜脈內(nèi))、肌肉內(nèi)、脊柱、鞘內(nèi)注射或其他類似的注射或灌輸技術(shù)。此外，這里提供了一種組合包含了結(jié)構(gòu)(I)的鹽化合物和適用的載體。具有結(jié)構(gòu)(I)的鹽一種或多種化合物應(yīng)該有一種適合口服的劑型，例如藥片、藥劑、錠劑、水或油的懸浮液、散粉或細(xì)粒、乳濁液、硬或軟膠囊、糖漿或酏劑。
用于口服的藥品可采用任何已知的制藥方法生產(chǎn)，藥品應(yīng)包含一種以上的下列精選成分甜味劑、香精、色素、和防腐劑，這樣可以提供一個精致的成品。藥片包含活性成分，藥片是含有無毒適用的賦形劑的混合物，這些賦形劑使得藥片易于生產(chǎn)。這些賦形劑可以是惰性稀釋劑，例如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；粒狀和崩解劑如玉米淀粉或藻酸；粘合劑例如淀粉、動物膠；潤滑劑如硬脂酸鎂、硬脂酸和滑石。藥片可以不包衣或包衣，眾所周知的包衣技術(shù)推遲了藥物在胃腸道的崩解和吸收，使其在長時間里維持活性，這些推遲分解的物質(zhì)如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯等。
用于口服的劑型可以是硬動物膠做成的膠囊，其活性成分混合在惰性固體稀釋劑中，例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土，或者是軟動物膠膠囊其活性成分混合在水或油介質(zhì)中，例如花生油，液體石蠟或橄欖油。制造包含活性成分的水性懸浮液應(yīng)用適合制造用的賦形劑。這些賦形劑是懸浮劑例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素鈉、氫丙基甲基纖維素鈉、藻酸鈉、聚乙烯吡咯酮、西黃耆膠和阿拉伯膠；分散劑和潤濕劑應(yīng)該是一種自然形成的磷脂，例如卵磷脂；或者是脂肪酸與烯化氧化物的濃縮物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯；或者是具有長鏈脂肪族醇的乙烯氧化物濃縮物，例如17碳乙烯氧基16醇；或者是乙烯氧化物與脂肪酸和己糖醇中部分酯的衍生物例如聚氧乙烯山梨糖醇；或者是乙烯氧化物與從脂肪酸和己糖醇酐中衍生出的部分酯，例如聚氧乙烯山梨糖醇。水性懸浮液用樣應(yīng)包含一種或多種防腐劑，例如乙烯基、正丙基、對羥基苯酚，也應(yīng)包含一種或多種色素，一種或多種香精和一種或多種甜味劑如蔗糖或糖精。
油性懸浮液的形成是活性成分懸浮在植物油中，例如花生油、橄欖油、芝麻油、椰子油或者是象液體石蠟一樣的礦物油。油性懸浮液應(yīng)有增稠劑，例如蜂蠟、固體石蠟、十六烷基乙醇。上述甜味劑和調(diào)味劑應(yīng)該被加到規(guī)定的可口的口服成藥中。這些成分應(yīng)該通過加入抗氧化劑如Vc，來達(dá)到防腐的目的。
散粉和顆粒經(jīng)水而成的懸浮液，再加上一些粉末或濕的藥劑、懸浮液藥劑以及至少一種防腐劑，制成的混合物可以提供活性物質(zhì)。具體合適的粉末、濕劑與懸浮液前文已經(jīng)列明，另外一些添加劑，如甜味劑、香精、色素等等也可以加進(jìn)去。
這種新藥的有效成分也可以作成乳濁液的形式，油劑可以選用菜油(如橄欖油、脂肪族醇)或礦物油(如液體石蠟)。合適的乳化劑是自然形成的乳膠，如阿拉伯膠、西黃耆膠；自然形成磷脂如大豆、卵磷脂以及從脂肪酸中衍生而來的酯類；酐例如山梨酸醇。這種乳濁液也可以假如甜味劑和香精。
糖漿和香味由甜味劑產(chǎn)生，甜味劑可以是甘油、1、2-丙二醇、山梨糖醇或蔗糖。這一類的藥劑也可以加入緩釋劑、防腐劑、香精和色素。
這種新藥的有效成分還可以制成栓劑，適用于直腸和陰道。藥栓由藥物和無刺激性的成型劑混合而成。這種成型劑在常溫下是固體，而在直腸或陰道的溫度里則變成液體，這樣藥栓就融化了并釋放出藥性。此類原料包括可可油和聚乙二醇。
這種藥物也可以作成無菌的、可注射的水狀或油狀懸浮液。這種懸浮液可采用已知的工藝使用前文提到的合適的粉末或濕劑與溶液構(gòu)成。這種無菌的可注射的成品也可以是無菌的稀釋液或溶液，例如1、3-butanediol溶液?？刹捎玫馁x形劑和溶劑是水、林格溶液和等滲性的氯化鈉溶液，此外無菌的固態(tài)油劑通常被用來作為溶劑或懸浮液介質(zhì)。包括人造甘油酯或甘油二酯在內(nèi)的任何無刺激性的固體油劑都普遍適用。另外象油酸這類的脂肪酸有利于注射該種藥品。
該種藥品也可被精通此術(shù)的人用于經(jīng)皮注射(Chien；WO94/04157)。
結(jié)構(gòu)(I)的鹽化合物可以通過無菌載體不經(jīng)腸道使用。附著在載體上并經(jīng)濃縮的藥物能夠懸浮或溶解在載體中，有利的是一些輔藥諸如局部麻醉劑、防腐劑、緩沖劑也能夠溶解在載體中。
如果用于動物身上，這種藥物可以加在動物的食物和水中。藥品必須便于和動物的飲食結(jié)合起來，以至于動物吃東西的時候就能夠攝入適當(dāng)?shù)乃幬?。如果把藥作成一種預(yù)先混合物就更便于加到水和食物中。
這里所談到的關(guān)于結(jié)構(gòu)(I)的鹽化合物的用法中，每天的服用劑量最好根據(jù)體重從0.01mg/Kg到200mg/Kg。每天的注射劑量包括靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、皮下注射和非腸道注射以及灌腸術(shù)等需根據(jù)整個體重從0.01mg/Kg到200mg/Kg。每天的局部用量最好從0.01mg到200mg每天一到四次。經(jīng)皮使用的濃縮物最好保持一天的計量在0.01-200mg/Kg。每天吸入使用的量最好根據(jù)體重從0.01mg/Kg到200mg/Kg。
當(dāng)然對于特別的病人也可以使用不同的劑量，這主要取決于下列因素具體的有效成分、年齡、體重、健康狀況、性別、食量、服藥時間、服藥方式、排泄率、用藥禁忌。
更好的此類化合物應(yīng)具有某些藥理學(xué)特性，這些特性包括口服生物利用率、低毒性、低血清蛋白凝固性和較好的體內(nèi)體外半衰期及其他。
分析法可用于預(yù)測所需要的藥理學(xué)屬性。用于預(yù)測生物利用率的方法包括通過人體腸內(nèi)單層細(xì)胞進(jìn)行運(yùn)輸，如Caco-2單層細(xì)胞。人工肝細(xì)胞毒理檢驗(yàn)可用于預(yù)測化合物的毒性。該化合物對血黏度的影響可通過對實(shí)驗(yàn)室的動物靜脈注射該藥之后進(jìn)行檢測。
血清蛋白粘合度可通過蛋白質(zhì)粘合度分析來預(yù)測。相關(guān)分析可參見Oravcova評論。
化合物的半衰期和服用的頻率成反比。體外半衰期可通過體外代謝的半衰期來分析預(yù)測。
動物模型小鼠哮喘模型的評價一.材料與方法1.試劑配置2mg/mL卵白蛋白卵白蛋白(V級)溶于10％新鮮制備的氫氧化鋁凝膠，臨用前配。
VLA-4拮抗劑溶液將VLA-4拮抗劑溶液生理鹽水中，配成所需溶度。
1％卵白蛋白將卵白蛋白溶于0.9％的生理鹽水中，配置成1％的卵白蛋白溶液，臨用前配置。
2.動物致敏致敏組用新鮮配置的2mg/mL卵白蛋白作皮下注射，空白對照組僅用10％的氫氧化鋁凝膠。每只小鼠在兩后足跖、兩腹股溝、背部兩點(diǎn)、腹腔，共10點(diǎn)，每點(diǎn)皮下注射0.05ml，共計0.35ml。
3.分組及給藥實(shí)驗(yàn)共分六組即①正常對照組，n＝7，0.9％的生理鹽水；②模型組(MD)，n＝10，0.9％的生理鹽水；③地塞米松組(1mg/mL)，n＝9；④息喘肽低劑量組(1mg/mL)，n＝11；⑤息喘肽中劑量組(3mg/mL)，n＝11；⑥息喘肽高劑量組(10mg/mL)。上述各組于致敏三周后開始給藥，以霧化吸入器霧化各種藥物，將小鼠置于2L的密閉玻璃罩內(nèi)，吸入霧化液20分鐘，每日一次，共7天。
4.卵白蛋白攻擊致敏三周后，每天給藥后1小時霧化吸入10mg/mL卵白蛋白30分鐘。
5.肺機(jī)械功能測定最后一次卵白蛋白攻擊后24小時。腹腔注射250mg/mL烏拉坦4ml/kg麻醉，固定后，行氣管插管、頸外靜脈插管、胸膜腔插管。利用MedLab生物信號采集處理系統(tǒng)記錄給氯化乙酰甲膽堿(Mch)前小鼠潮氣量、氣道流速和跨肺壓，作為基礎(chǔ)值。然后給小鼠一次靜脈注射溶度為0.125μg/kg、0.25μg/kg、0.5μg/kg、1.0μg/kg、2.0μg/kg Mch，觀察三分鐘內(nèi)小鼠氣道流速、潮氣量和跨肺壓的變化。
6.支氣管—肺泡灌洗(BAL)測完氣道高反應(yīng)性的小鼠放血處死后，打開胸腔，結(jié)扎左支氣管，用1.5ml生理鹽水灌洗液灌洗右側(cè)肺葉3次。
7.支氣管—肺泡灌洗液(BALF)中白細(xì)胞計數(shù)和分類計數(shù)。
取BALF0.05ml，用白細(xì)胞計數(shù)液3倍稀釋后行白細(xì)胞計數(shù)。剩余液體以500g離心10min，收集上清液，凍存于-70℃同時，取沉渣涂片，自然干燥，用瑞氏—姬姆薩染色后作白細(xì)胞分類計數(shù)。
8.肺組織病理切片制作與觀察取左側(cè)肺葉浸入10％福爾馬林溶液固定3day后，取出肺組織，切取組織塊2mm左右厚度制作組織切片，脫水、透明、包埋、切片，用蘇木素—伊紅染色后觀察。根據(jù)支氣管肺粘膜的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤及小氣道重塑的嚴(yán)重程度進(jìn)行分類。嗜酸性粒細(xì)胞浸潤主要觀察氣道和血管之間區(qū)域和其在氣道壁上的浸潤情況，按照各個切片的浸潤嚴(yán)重程度分成0~5級，作半定量分析。氣道重塑我們選用內(nèi)徑和周長差不多的小氣道作為觀察對象，以小氣道壁的厚度作為衡量指標(biāo)。
9.統(tǒng)計方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，采用Sigma Stat統(tǒng)計軟件包，用Student-Newman-Keuls比較各組間的差異性，P＜0.05表示有顯著性差異。
二.結(jié)果1.VLA-4拮抗劑對致敏小鼠氣道高反應(yīng)的影響致敏小鼠在抗原攻擊后再吸入Mch，呈劑量依賴關(guān)系誘導(dǎo)氣道高反應(yīng)性，與對照組比較，RLPC100(使RL增加100％所需要的Mch濃度)和CdynPC25(使Cdyn降低25％所需要的Mch濃度)明顯減小，表明氣道反應(yīng)性明顯增高。致敏三周后，每天給息喘肽1mg/mL、3mg/mL和10mg/mL霧化吸入20min，藥后1h再霧化吸入卵白蛋白10mg/mL 30min，每天1次，共7d。結(jié)果顯示VLA-4拮抗劑呈劑量反應(yīng)抑制Mch誘導(dǎo)的小鼠氣道高反應(yīng)性。
2.VLA-4拮抗劑對致敏小鼠抗原攻擊后BALF中白細(xì)胞總數(shù)及分類計數(shù)的影響模型組白細(xì)胞總數(shù)明顯增高，與正常對照組差異顯著。VLA-4拮抗劑10mg/mL與模型組比較差異顯著(P＜0.05)，但VLA-4拮抗劑1mg/mL與3mg/mL組無顯著性差異。模型組嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)較正常對照組明顯增高。用藥組嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目與正常組比較存在顯著性差異，且VLA-4拮抗劑中劑量組和高劑量組嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)目與模型組相比存在顯著性差異(P＜0.05)。
3.VLA-4拮抗劑對致敏小鼠支氣管肺組織病理影響模型組小鼠肺部出現(xiàn)明顯過敏性炎癥表現(xiàn)，細(xì)支氣管、小血管的管壁增厚，炎癥細(xì)胞浸潤，嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目明顯增多，地塞米松組和VLA-4拮抗劑高劑量組肺部表現(xiàn)基本正常，只有輕微的病理變化，與模型組相比有明顯的差異。而所有實(shí)驗(yàn)組與正常組相比，評分明顯增加。
合成路線



具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
有關(guān)縮寫代表了以下的化合物EDC鹽酸1-(3-一二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺CH3CH2＝C＝NCH2CH2CH2N(CH3)2·HClHOBt1-羥基苯并三唑水合物Bzl苯甲基、芐基Boc-Phe-OH叔丁氧-甲?；?苯丙氨酸Leu白氨酸、亮氨酸DIEA二異丙基乙胺Asp天冬氨酸實(shí)施例1苯乙酰基-(N-甲基)亮氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪鹽酸鹽[化學(xué)名(3S)-3-[(2S)-甲基-2-(N-甲基-2-苯乙酰氨基)戊酰氨基]-3-{N-[(1S)-2-(4-甲基哌嗪基)-2-氧代-1-芐乙基]甲氨?；鶀-丙酸鹽酸鹽]步驟1.合成叔丁氧-甲酰基-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪[Boc-Phe-(N-Me)哌嗪鹽酸鹽]用400ml二甲基甲酰氨(DMF)將40g(151mmol)Boc-Phe-OH溶于1000ml圓底燒瓶中，攪拌然后加入20.4g(151mmol)HOBt并溶解，用乙晴-干冰浴將混合物冷卻至-30℃在加入28.9g(151mmol)EDC后再加入16ml(141mmol)的1-甲基哌嗪，將反應(yīng)混合物升溫至室溫并放置過夜，減壓除去DMF，向殘留物中加入1000ml醋酸乙醋(EtOAc)，上述有機(jī)溶液依次用飽和的碳酸氫鈉(300ml×3)、水(300ml×3)以及鹽水(300ml)洗滌，然后再用硫酸鎂進(jìn)行干燥，過濾，蒸發(fā)后獲得48.9g(141mmol，收率99％)的油狀產(chǎn)物Boc-Phe-(N-Me)哌嗪。
步驟2.合成天冬氨酸(O-苯甲基)-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪鹽酸鹽[HCl·Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪]向48.99克(141mmol)Boc-Phe-(N-Me)哌嗪中加入350ml、4N的鹽酸二惡烷溶液立即生成凝膠狀固體，上述反應(yīng)混合物于室溫下靜止6小時，使反應(yīng)物完全反應(yīng)掉，過量的HCl及溶劑蒸發(fā)除去，得到的固體產(chǎn)物用乙醚進(jìn)行破碎(250ml×2)，得到40g(141mmol)HCl·Phe-(N-Me)哌嗪，收率100％。
向上述HCl·Phe(N-Me)哌嗪40g(141mmol)中加入500ml DMF，然后加入24.5ml(141mmol)DIEA以及46.5g(143mmol)Boc-Asp(OBzl)-OH(第1步產(chǎn)物)，反應(yīng)混合物溶液呈均相，將此溶液用丙酮-干冰浴冷卻至-50℃，在加入27.3g(143mmol)EDC后加入19.3g(143mmol)HOBt，反應(yīng)混合物升溫至室溫后過夜，減壓除去DMF，向殘留物中加入600ml醋酸乙醋，上述有機(jī)溶劑依次用飽和碳酸氫鈉溶液(300ml×6)，水(300ml×3)以及鹽水(300ml)洗滌，然后用硫酸鎂進(jìn)行干燥，過濾，蒸發(fā)后得到55g(100mmol)的半固體產(chǎn)物為Boc-Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪，收率71％，通過高效液相色譜(HPLC)檢測其純度為90％。
將25g(45.3mmol)Boc-Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪與150ml 4N HCl二惡烷溶液進(jìn)行反應(yīng)1小時后反應(yīng)完全，過量的HCl溶液蒸發(fā)除去，生成的固體用250ml乙醚進(jìn)行破碎，在通入氬氣條件下過濾收集固體，得到白色的HCl·Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪固體22g，收率99.5％，純度為86％。
步驟3.合成(N-甲基)-亮氨酸(O-苯甲基)-天冬氨酸-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪鹽酸鹽[HCl·(N-Me)Leu-Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪]將一個含有21g(43mmol)HCl·Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪，11g(44.9mmol)Boc-(N-Me)亮氨酸，8.2ml(47.3mmol)DIEA以及200ml DMF的混合物于0℃下攪拌15min，然后向混合物中加9.5g(49.7mmol)EDC以及5.7g(42mmol)HOBt，0℃下攪拌反應(yīng)混合物3小時，經(jīng)HPLC檢測顯示反應(yīng)完全，減壓蒸發(fā)除去溶劑，將殘留物用200ml醋酸乙醋稀釋，上述醋酸乙醋溶液用碳酸氫鈉水溶液洗兩次，然后再依次用水，鹽水洗滌，然后用硫酸鈉干燥，濃縮溶液得到Boc-(N-Me)Leu-Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪。
向上述生成物中加入100ml4N的鹽酸二惡烷溶液，然后于室溫下攪拌1小時，經(jīng)HPLC檢測顯示反應(yīng)完全，過量的HCl及溶劑通過蒸發(fā)除去，殘留物用200ml乙醚破碎，在通以氬氣的條件下過濾收集固體，得到26g(43mmol)HCl·(N-Me)Leu-Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪，收率100％，純度78％。
步驟4.合成苯乙?；?(N-甲基)亮氨酸-(O-苯甲基)天冬氨酸-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪[苯乙?；?(N-Me)Leu-Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪]將26g(43mmol)HCl·(N-Me)Leu-Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪以及20ml(115mmol)DIEA溶于450ml二氯甲烷(DCM)的混合物于0℃下攪拌15min并于0℃下在45min時間內(nèi)滴加苯乙酰氯的DCM溶液(9.3ml，70mmol in 50ml二氯甲烷中)，通過HPLC確定反應(yīng)完全，反應(yīng)混合物依次用飽和碳酸氫鈉溶液(100ml×2)，水(100ml×2)以及鹽水(100ml)洗滌，然后用硫酸鎂進(jìn)行干燥，經(jīng)過濾蒸發(fā)后得到29g(42mmol)的苯乙酰基-(N-Me)Leu-Asp(Obrl)-Phe-(N-Me)哌嗪粗品，收率98％，純度76％。
步驟5.合成苯乙?；?(N-甲基)亮氨酸-(O-苯甲基)天冬氨酸-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪鹽酸鹽[苯乙酰基-(N-Me)Leu-Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪·HCl]將29g上述得到的產(chǎn)物通過下述方法轉(zhuǎn)化成鹽酸鹽將上述生成物溶于200ml乙醚中，然后加入200ml HCl-乙醚溶液，反應(yīng)混合物放置10分鐘，除去上清液，固體再放200ml乙醚洗滌，除去上清液后將殘留的乙醚蒸發(fā)除去。
上述得到的苯乙酰基-(N-Me)Leu-Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪鹽酸鹽通過以下幾個重結(jié)晶方法過程進(jìn)行純化1)將上述鹽酸鹽溶于250ml丙酮中，然后加入250ml乙醚，將上述澄清液于-20℃下放置過夜，在通以氬氣的條件下將固體過濾收集，用冷的丙酮/乙醚(1∶1，50ml×2)洗滌兩次，然后將固體轉(zhuǎn)移至燒瓶中，漏斗用甲醇沖洗，除去溶劑后得到15.5g，94％純度的鹽酸鹽，回收率50％。2)第二次重結(jié)晶時用200ml丙酮∶乙醚(1∶1)同樣處理，得到15.0g純度為96.8％的鹽酸鹽，回收率為97.5％。3)第三次時使用280ml丙酮∶乙醚(1∶1)得到純度為99.1％的鹽酸鹽13.8g回收率為95％。4)第四次時使用250ml丙酮∶乙醚(1∶1)，得到純度為99.5％的鹽酸鹽13.4g，回收率為97％。
步驟6.合成苯乙?；?(N-甲基)亮氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪鹽酸鹽[苯乙?；?(N-Me)Leu-Asp-Phe-(N-Me)哌嗪·HCl]將上述苯乙?；?(N-Me)Leu-Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪鹽酸鹽(13.4g，19mmol)溶于400ml乙醇中，加入2g 10％的鈀炭催化劑(Pd/C)，用氫氣球向反應(yīng)混合物中通入氫氣進(jìn)行氫化反應(yīng)14小時，經(jīng)HPLC檢測表明反應(yīng)進(jìn)行完全，用0.2um的尼龍膜過濾除去催化劑，然后減壓蒸發(fā)除去溶劑，得到的白色粉狀固體，在真空爐中于42至43℃高真空度下進(jìn)一步干燥5天，得到11.1g苯乙?；?(N-Me)Leu-Asp-Phe-(N-Me)哌嗪鹽酸鹽，收率為95％，經(jīng)HPLC檢測，純度為99.7％，質(zhì)譜(M+1)608。
實(shí)施例2苯乙?；?(N-甲基)亮氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪鈉鹽[化學(xué)名(3S)-3-[(2S)-甲基-2-(N-甲基-2-苯乙酰氨基)戊酰氨基]-3-{N-[(1S)-2-(4-甲基哌嗪基)-2-氧代-1-芐乙基]甲氨酰基}-丙酸步驟1.合成叔丁氧-甲?；?苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪[Boc-Phe-(N-Me)哌嗪鈉鹽]將30.0g苯乙酰基-(N-Me)Leu-Asp(OBrl)-Phe-(N-Me)哌嗪鹽酸鹽(參見實(shí)施例1步驟5)混合于500ml醋酸乙醋中，將該溶液轉(zhuǎn)移至1000ml分液漏斗中，向上述被中和的鹽酸鹽加入300ml飽和的碳酸氫鈉溶液，充分混合后收集醋酸乙酯相，水溶液用150ml醋酸乙酯萃取，合并醋酸乙酯相然后依次用水(250ml×2)以及鹽水(250ml)洗滌，然后用硫酸鎂進(jìn)行干燥過濾，蒸發(fā)后得到27.0g(38.7mmol)苯乙?；?N-Me)Leu-Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪，純度為99.5％，回收率為95％。
將上述苯乙酰基-(N-Me)Leu-Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪(27g 38.7mmol)溶于800ml乙醇中，將上述溶液等體積地分裝于兩個1000ml燒瓶中，每個燒瓶中加入2g 10％的鉑炭催化劑(Pd/C)，用兩個氫氣球向反應(yīng)混合物中通入氫氣進(jìn)行氫化反應(yīng)16小時，經(jīng)HPLC檢測表明兩個燒瓶中的反應(yīng)進(jìn)行完全，用0.2um的尼龍膜過濾除去催化劑，合并兩批濾液，再加入乙醇進(jìn)行稀釋至總體積為2200ml，然后減壓蒸發(fā)除去溶劑，得到的白色固體基本上呈細(xì)粉狀，得到23.5g(38.7mmol)苯乙?；?(N-Me)Leu-Asp-Phe-(N-Me)哌嗪(上述通式I)。
將1g(1.6mmol)苯乙?；?(N-Me)Leu-Asp-Phe-(N-Me)哌嗪與5ml乙醇混合然后加入2N NaOH 33微升于溶液中攪拌加熱至40℃ 1小時，蒸發(fā)至干得一白色固體即為標(biāo)題化合物。質(zhì)譜(M+23)630。
實(shí)施例3苯乙?；?(N-甲基)亮氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪甲磺酸鹽[化學(xué)名(3S)-3-[(2S)-甲基-2-(N-甲基-2-苯乙酰氨基)戊酰氨基]-3-{N-[(1S)-2-(4-甲基哌嗪基)-2-氧代-1-芐乙基]甲氨?；鶀-丙酸甲磺酸酸鹽]
參照實(shí)施例2方法制備，最后使用一分子比甲磺酸代替NaOH得標(biāo)題化合物，質(zhì)譜(M+1)608。
實(shí)施例4苯乙?；?(N-甲基)亮氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪琥珀酸鹽[化學(xué)名(3S)-3-[(2S)-甲基-2-(N-甲基-2-苯乙酰氨基)戊酰氨基]-3-{N-[(1S)-2-(4-甲基哌嗪基)-2-氧代-1-芐乙基]甲氨酰基}-丙酸琥珀酸鹽]參照實(shí)施例2方法制備，最后使用一分子比琥珀酸代替NaOH得標(biāo)題化合物，質(zhì)譜(M+1)608。
權(quán)利要求
1.下述結(jié)構(gòu)(I)所形成的鹽
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)構(gòu)(I)的鹽是由一種無機(jī)酸或有機(jī)酸與結(jié)構(gòu)(I)的化合物反應(yīng)所形成的鹽；或者是由一種金屬離子或有機(jī)陽離子的堿與結(jié)構(gòu)(I)的化合物反應(yīng)所形成鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的結(jié)構(gòu)(I)的鹽所用無機(jī)酸或有機(jī)酸可與結(jié)構(gòu)(I)化合物能形成藥學(xué)上可接受的鹽；或者所用金屬離子堿或有機(jī)陽離子堿可與結(jié)構(gòu)(I)化合物能形成藥學(xué)上可接受的鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的結(jié)構(gòu)(I)的鹽所用的與結(jié)構(gòu)(I)的化合物反應(yīng)所形成的鹽的無機(jī)酸包括鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，磷酸，亞硫酸和亞磷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的結(jié)構(gòu)(I)的鹽所用的與結(jié)構(gòu)(I)的化合物反應(yīng)所形成的鹽的有機(jī)酸包括琥珀酸，馬來酸，醋酸，富馬酸，枸櫞酸，酒石酸，草酸，苯甲酸，苯磺酸，對甲苯磺酸，甲磺酸，乙磺酸或萘磺酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的結(jié)構(gòu)(I)的鹽所用的與結(jié)構(gòu)(I)的化合物反應(yīng)所形成的鹽的金屬離子堿的離子是鋁離子，堿金屬離子如鋰，鈉或鉀，堿土金屬離子如鈣或鎂。
7.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的結(jié)構(gòu)(I)的鹽所用的與結(jié)構(gòu)(I)的化合物反應(yīng)所形成的鹽的有機(jī)陽離子堿的離子是氨離子或取代的氨離子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的結(jié)構(gòu)(I)的鹽，選自(3S)-3-[(2S)-甲基-2-(N-甲基-2-苯乙酰氨基)戊酰氨基]-3-{N-[(1S)-2-(4-甲基哌嗪基)-2-氧代-1-芐乙基]甲氨?；鶀-丙酸鹽酸鹽；(3S)-3-[(2S)-甲基-2-(N-甲基-2-苯乙酰氨基)戊酰氨基]-3-{N-[(1S)-2-(4-甲基哌嗪基)-2-氧代-1-芐乙基]甲氨?；鶀-丙酸鈉鹽；(3S)-3-[(2S)-甲基-2-(N-甲基-2-苯乙酰氨基)戊酰氨基]-3-{N-[(1S)-2-(4-甲基哌嗪基)-2-氧代-1-芐乙基]甲氨酰基}-丙酸甲磺酸酸鹽；(3S)-3-[(2S)-甲基-2-(N-甲基-2-苯乙酰氨基)戊酰氨基]-3-{N-[(1S)-2-(4-甲基哌嗪基)-2-氧代-1-芐乙基]甲氨?；鶀-丙酸琥珀酸鹽。
9.權(quán)利要求1至8項(xiàng)中任意一項(xiàng)的鹽所制備的藥劑，所說的藥劑是任何一種藥劑學(xué)上所說的片劑、膠囊、酏劑、糖漿、錠劑、吸入劑、噴霧劑、注射劑、膜劑、貼劑、散劑、顆粒劑、塊劑、乳劑、栓劑、復(fù)方制劑。
10.權(quán)利要求1至8項(xiàng)中任意一項(xiàng)的鹽在制備治療炎癥疾病和自身免疫性疾病的藥物中的應(yīng)用。
11.權(quán)利要求1至8項(xiàng)中任意一項(xiàng)的鹽在制備治療關(guān)節(jié)炎、哮喘、過敏性疾病、多型性硬化癥、中樞神經(jīng)炎的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于苯乙?；?N－甲基)亮氨酸－天冬氨酸－苯丙氨酸－(N－甲基)哌嗪[化學(xué)名(3S)－3－[(2S)－甲基－2－(N－甲基－2－苯乙酰氨基)戊酰氨基]－3－{N－[(1S)－2－(4－甲基哌嗪基)－2－氧代－1－芐乙基]甲氨酰基}－丙酸]的鹽，及該鹽的制備過程、以及含該鹽作為活性成分抑制、改變或防止細(xì)胞粘附以及由細(xì)胞粘附所介導(dǎo)的病理過程的藥物組成，及使用該些鹽抑制和防止細(xì)胞粘附以及由細(xì)胞粘附所介導(dǎo)的病理過程的方法，還包括其用于生產(chǎn)諸如人類等溫血動物的治療或預(yù)防劑作為藥物的應(yīng)用，以及制造藥物的應(yīng)用。其特別適用于許多炎性疾病和自身免疫性疾病的治療。
文檔編號A61P19/02GK1542006SQ20031010622
公開日2004年11月3日 申請日期2003年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月7日
發(fā)明者陳國慶, 濮存海 申請人:陳國慶