專利名稱：具有綠色熒光蛋白示蹤和抗性篩選標(biāo)記的RNAi載體pGO的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，是一種可用于特異性抑制靶基因表達(dá)的具有綠色熒光蛋白示蹤和抗性篩選標(biāo)記的RNA干擾(RNAi)載體pGO。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNAi)是指雙鏈RNA(dsRNA)特異性地誘發(fā)與其同源序列的mRNA分子被降解，導(dǎo)致相應(yīng)基因表達(dá)被抑制的現(xiàn)象，是一種特殊的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)沉默現(xiàn)象。RNA干擾(RNAi)現(xiàn)象是1998年由Fire等在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)并報道。他們觀察到在線蟲中雙鏈RNA(dsRNA)可在轉(zhuǎn)錄后水平特異性抑制基因表達(dá)。隨后許多學(xué)者對線蟲、果蠅、植物和動物細(xì)胞進(jìn)行了大量研究，證實RNAi是相當(dāng)保守的生物模式。對果蠅的研究使RNAi機(jī)制基本被闡明當(dāng)長鏈的dsRNA進(jìn)入細(xì)胞時，被一種稱之為Dicer的核酸水解酶所識別，并被剪切成21-23核苷酸(nt)的siRNA，雙鏈的siRNA被RNA解鏈酶解鏈，以單鏈形式與另一核酸酶結(jié)合形成RNA酶復(fù)合體，復(fù)合體中的RNA鏈象向?qū)б粯右龑?dǎo)酶復(fù)合體識別序列與之互補的mRNA，并將該mRNA水解，從而特異性地抑制基因翻譯表達(dá)。2001年，Tuchl等首先發(fā)現(xiàn)合成21bp的siRNA可在哺乳動物細(xì)胞中特異并有效的抑制基因表達(dá)(Elbashir S.M.et al.Nature 411，494-498；2001)。不久，運用含有19-29bp反向重復(fù)序列的表達(dá)載體在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成發(fā)夾樣RNA也成功實現(xiàn)了RNAi(Brummelkamp T.R.et al.Science 296，550-553；2002)。隨后RNAi技術(shù)很快被應(yīng)用于抗病毒、抗腫瘤和對基因功能的研究中并取得了大量令人鼓舞的結(jié)果。
所謂RNAi技術(shù)是指基于RNAi現(xiàn)象而開發(fā)的抑制特定基因表達(dá)或降解特定RNA分子的分子生物學(xué)技術(shù)，其根據(jù)RNAi的基本原理，可針對致病基因的DNA核苷酸序列，選擇其中一段與其它基因同源性較低的序列作為靶序列，通過體外合成或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成具有21-29個堿基的互補寡核苷酸短鏈(siRNA)，在細(xì)胞中與靶基因的mRNA特異性結(jié)合，激活細(xì)胞自身的機(jī)制使其降解，從而特異性抑制該致病基因的表達(dá)。同樣，也可用RNAi對基因的功能進(jìn)行研究。體外合成是根據(jù)靶序列直接化學(xué)合成一對互補寡核苷酸短鏈(siRNA)；而體內(nèi)轉(zhuǎn)錄是將siRNA模板克隆入帶有RNA聚合酶III類啟動子(U6或H1)的載體中，在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄形成具有發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的siRNA而發(fā)揮作用。
雖然載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)誕生不到一年時間，然而由于其便捷、高效和低成本的特點，已經(jīng)成為研究使致病基因失活和研究基因功能的有力工具。目前實驗室通常使用的是早期開發(fā)的RNAi載體，如pSUPER、pSilencer、pSHAG和psiRNA等。它們的結(jié)構(gòu)相對簡單，通常僅帶有原核復(fù)制元件和基本的U6或H1啟動子轉(zhuǎn)錄單位，U6或H1啟動子是RNA聚合酶III家族啟動子，在體內(nèi)能很好地介導(dǎo)發(fā)夾樣siRNA的合成，是RNAi載體不可缺少的元件，但由于這些載體沒有示蹤和抗性篩選標(biāo)記，因此給研究工作帶來許多不便。比如在轉(zhuǎn)染細(xì)胞時對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞量很難估計，通常需要共轉(zhuǎn)染大量熒光蛋白報告基因或采用熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)染試劑來分選出被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，從而增加了實驗的難度和成本。另一方面，當(dāng)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后有一部分會整合入細(xì)胞基因組中，可隨著細(xì)胞染色體的復(fù)制而復(fù)制，如果載體上帶有抗性基因就可通過藥物篩選出這部分細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，從而在這些細(xì)胞中使靶基因永久沉默。然而由于這些載體沒有攜帶真核細(xì)胞的抗性篩選標(biāo)記，無法篩選出在基因組上穩(wěn)定整合RNAi載體的細(xì)胞，因此只能在短時間內(nèi)觀察靶基因表達(dá)的抑制(5-7天)而無法使其永久沉默。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種能示蹤轉(zhuǎn)染細(xì)胞并能長期抑制靶基因表達(dá)的RNAi載體pGO，其攜帶綠色熒光蛋白基因和新霉素抗性基因。現(xiàn)有綠色熒光蛋白載體pEGFP-C2真核細(xì)胞表達(dá)載體(Clontech公司產(chǎn)品)是攜帶經(jīng)改良而更適合哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因(EGFP)的載體，通常用于與目的基因融合來顯示該基因在細(xì)胞中的表達(dá)和定位情況，是常用的示蹤工具。該載體也帶有新霉素基因，其表達(dá)產(chǎn)物新霉素可抵抗藥物G418的毒性作用，因此，通過G418的作用可篩選出在基因組上穩(wěn)定整合了載體的細(xì)胞，從而使目的基因持續(xù)表達(dá)。本發(fā)明正是利用了該載體的這兩個特性，對pEGFP-C2作適當(dāng)改造后將帶有U6啟動子的轉(zhuǎn)錄元件插入該載體中構(gòu)成具有綠色熒光蛋白示蹤和抗性篩選標(biāo)記的RNAi載體。如果在該載體中插入針對目的基因的siRNA模板，就可在細(xì)胞內(nèi)抑制該目的基因的表達(dá)。因此本發(fā)明載體可用于制備治療腫瘤的藥物或用于制備研究基因功能的試劑。本發(fā)明RNAi載體對pEGFP-C2載體作如下改造1、去除多克隆位點pEGFP-C2載體主要構(gòu)件(見圖2)包括pUC復(fù)制起點(pUC ori)、CMV啟動子(CMV promoter)、增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因(EGFP)、多克隆位點(MCS)、SV40 PolyA、fl復(fù)制起點(fl ori)、細(xì)菌啟動子(P)、SV40早期啟動子(SV40epromoter)、卡那霉素/新霉素抗性基因(Kan/Neo)、HSV-TK PolyA等，其中多克隆位點處于綠色熒光蛋白和SV40 PolyA之間，帶有多個常用的酶切位點，如BglII、XholI、HindIII、EcoRI、SalI、BamHI等，原用于克隆目的基因與綠色熒光蛋白基因融合。而本發(fā)明中EGEP僅用于示蹤目的，原有克隆位點不適于克隆siRNA模板，故將其切除。因同尾酶BglII和BamHI恰好位于多克隆位點的兩端，故只需通過這兩種酶雙酶切再自連即可切除原有多克隆位點。
2、制備模板提取人胚腎細(xì)胞系HEK293細(xì)胞基因組DNA，作為擴(kuò)增人源的RNAIII類聚合酶U6啟動子的模板。
3、合成引物針對人源U6啟動子并帶有特殊酶切位點的核苷酸序列，設(shè)計并合成下列引物
其5’端引入MluI的酶切位點ACGCGT和BglII的酶切位點AGATCT； 其5’端依次引入MluI的酶切位點ACGCGT，XhoI的酶切位點CTCGAG，EcoRI的酶切位點GAATTC，BamHI的酶切位點GGATCC，SalI的酶切位點GTCGAC和BbsI的酶切位點GAAGAC。
4、PCR擴(kuò)增人源U6啟動子以HEK293細(xì)胞基因組DNA為模板，用上述合成的上游和下游引物，采用高保真的pfu酶擴(kuò)增，得到帶有多克隆位點的人源U6啟動子。
5、插入U6啟動子，構(gòu)建RNAi載體pEGFP-C2載體去除原有的多克隆位點后，還有一個Mlu I酶切位點，由于其位于完整的EGFP轉(zhuǎn)錄單位(包括CMV啟動子和SV40 polyA)和f1原核復(fù)制起點之間，因此外源插入片段不會改變載體上原有結(jié)構(gòu)的功能，同時載體上的結(jié)構(gòu)也不會影響U6啟動子轉(zhuǎn)錄元件的功能，因此U6啟動子就插于此位點中(參見附圖1、2)。如此改建后的載體命名為pGO。
pGO克服了常用RNAi載體的無法示蹤和不能穩(wěn)定整合的不足。使用時首先針對靶基因上一段長度21-29nt的核苷酸序列，設(shè)計并合成一對具有反向重復(fù)序列的互補脫氧寡核苷酸鏈，作為siRNA的轉(zhuǎn)錄模板，其中將反義序列置于正義序列之前，兩者之間以核苷酸序列GAAGCTTG間隔，經(jīng)退火后插入pGO載體。該載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，載體上的U6啟動子以其下游插入片段為模板，指導(dǎo)合成具有發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的siRNA，從而導(dǎo)致目的基因沉默(參見附圖3)。


圖1為本發(fā)明RNAi載體pGO的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為本發(fā)明RNAi載體pGO構(gòu)建流程圖。
圖3為RNAi載體介導(dǎo)的發(fā)夾樣siRNA構(gòu)建流程圖。
圖4為針對腫瘤相關(guān)基因β-catenin RNA干擾的免疫印記(Westem Blot)圖。
圖5為針對熒光素酶報告基因(Luciferase)RNA干擾的綠色熒光照片(A)及熒光素酶活性示意圖(B)。
具體實施例方式
實施例1具有綠色熒光蛋白示蹤和抗性篩選標(biāo)記的RNAi載體的構(gòu)建；一、人源小核RNA(U6)啟動子的克隆1.制備293細(xì)胞基因組DNA按常規(guī)將293細(xì)胞(購自ATCC公司)培養(yǎng)于含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中(購自Gibico公司)，離心收集1×107個細(xì)胞，應(yīng)用蛋白酶K和苯酚從細(xì)胞中分離基因組DNA(具體操作見分子克隆實驗指南)。
2.設(shè)計合成引物上游引物5’-CCGACGCGTAGATCTAAGGTCGGGCAGGAAGAG-3’，下游引物5’-CCGACGCGTCTCGAGGAATTCGGATCCGTCGACAAAAAGAAGACCACGGTGTTTCGTCCTTTC-3’(2OD，上海申能博彩合成)，上游引物中依次引入MluI和BglII酶切位點，下游引物中依次引入MluI，XholI，EcoRI，BamHI，SalI和BbsI酶切位點。用純凈水將引物調(diào)整到20μm濃度。
3.PCR擴(kuò)增U6啟動子以293細(xì)胞基因組DNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系模板1μl(100ng/μl)，上下游引物各1μl，dNTP(10mM)2μl，PCR緩沖液5μl，pfu酶0.5μl(10U/μl)，純凈水39.5μl；反應(yīng)條件96℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，35個循環(huán)，PCR儀購自BioRad，PCR反應(yīng)用試劑均購自上海申能博彩公司。PCR產(chǎn)物回收，膠回收試劑及回收柱購自上海申能博彩公司，具體操作見上海申能博彩膠回收試劑使用說明。共獲得回收產(chǎn)物20μl(100ng/μl)。回收產(chǎn)物用MluI(購自MBI)單酶切，反應(yīng)體系PCR回收產(chǎn)物25μl(2.5μg)，MluI(5U/μl)2μl，Y緩沖液3μl，37℃反應(yīng)3小時，再進(jìn)行膠回收，操作同前。
二、本發(fā)明RNAi載體pGO的構(gòu)建pEGFP-C2(購自CLONTECH公司)用BglII和BamHI雙酶切，反應(yīng)體系PEGFP-C2載體4μl(1μg/μl)，BglII和BamHI各1μl(5U/μl)，Y緩沖液6μl，純凈水18μl，37℃3小時，酶切產(chǎn)物回收同前。酶切產(chǎn)物同尾酶自連，反應(yīng)體系酶切回收產(chǎn)物8μl(50ng/μl)，連接緩沖液1μl，T4連接酶(T4連接酶購自上海申能博彩公司，下同)1μl，16℃過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細(xì)菌。在卡那霉素的平板上挑單菌落于5ml卡那霉素抗性LB培養(yǎng)液中搖菌過夜。小量提取質(zhì)粒(具體操作方法見分子克隆實驗指南)，BglII單酶切鑒定，反應(yīng)體系質(zhì)粒2μl(0.5μg/μl)，連接緩沖液1μl，BglII(10U/μl)1μl，37℃3小時，1％瓊脂糖凝膠電泳，電壓90V，短波紫外燈下可見未被切成線形化的環(huán)狀質(zhì)粒為陽性克隆。該陽性克隆的質(zhì)粒用MluI單酶切，反應(yīng)體系同前，膠回收，操作同前。將U6啟動子PCR酶切產(chǎn)物和改造的pEGFP-C2酶切線形產(chǎn)物連接及轉(zhuǎn)化，方法同前。
三、本發(fā)明RNAi載體pGO的鑒定1.酶切鑒定因U6啟動子是從改造的pEGFP-C2 MluI單酶切位點插入，須用酶切鑒定啟動子插入方向。因EcoRI酶切位點位于MluI酶切位點的3’方向，AgeI酶切位點位于U6啟動子上游，用AgeI和EcoRI雙酶切重組載體做鑒定，同時用AgeI和MluI雙酶切pEGFP-C2原始載體做參照，如重組載體酶切片段較參照的原始載體酶切片段大時，說明U6啟動子插入方向是正向的，如重組載體酶切片段較參照的原始載體酶切片段小時。則說明U6啟動子插入方向是反向的。
2.測序取正向插入U6啟動子的重組載體，用BglII和XhoI雙酶切反應(yīng)體系質(zhì)粒4μl(1μg/μl)，BglII(5U/μl)1μl，XhoI(5U/μl)1μl，R緩沖液3μl，純凈水21μl，37℃反應(yīng)3小時，進(jìn)行膠回收，操作同前?；厥债a(chǎn)物連入載體PbluescriptSK(-)(購自Stratagen公司)(載體酶切及回收操作同前)，連接體系目的片段9μl(50ng/μl)，載體3.5μl(50ng/μl)，緩沖液1.5μl，T4連接酶1μl，16℃過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細(xì)菌(感受態(tài)細(xì)菌制備見分子克隆實驗指南)，在氨芐青霉素平板上獲得的單克隆菌經(jīng)初步酶切鑒定后送上海申能博彩公司測序，測序引物為T3，測序結(jié)果正確，U6啟動子全長為265個核苷酸，證實重組載體為pGO。
實施例2針對腫瘤相關(guān)基因β-catenin的RNA干擾一、RNA干擾片段的選取β-catenin是Wnt途徑的效應(yīng)分子，該通路的異常激活與許多腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。我們依據(jù)文獻(xiàn)提供的經(jīng)驗自http//www.ambion.com/techilb/misc/sirna finder.html，根據(jù)β-catenin基因設(shè)計了siRNA片段，核苷酸序列如下 其中反義序列在前，正義序列在后，兩端分別帶有Bbs I(ACCG)和BamH I(GATC)酶切位點的粘性末端，連接兩序列的環(huán)狀結(jié)構(gòu)中包含有一個HindIII酶切位點(AAGCTT)，以便鑒定時使用。
二、RNA干擾片段的體外退火方法siRNA干擾片段由上海申能博彩公司合成(2OD)，溶于50μl純凈水中，互補雙鏈各取10μl混勻，放入100℃沸水中5分鐘，并讓其在水浴中自然緩慢冷卻至20℃，置-20℃保存。
三、RNA干擾片段與載體的連接及鑒定載體用BbsI和BamHI雙酶切，反應(yīng)體系載體4μl(1μg/μl)，BbsI和BamHI各1μl(10U/μl)，Y緩沖液6μl，純凈水18μl，37℃3小時。酶切產(chǎn)物回收同前。將酶切回收的上述載體和退火的RNA干擾片段連接轉(zhuǎn)化，具體操作方法同前。轉(zhuǎn)化后的質(zhì)粒用HindIII單酶切鑒定，如質(zhì)?？杀磺谐删€性，說明RNA干擾片段連入載體，HindIII酶切位點來自RNA干擾片段環(huán)狀結(jié)構(gòu)上的酶切位點。將鑒定正確的干擾載體命名為pGO-β。參見圖1、2、3。
四、帶有catenin基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體和干擾載體共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞以2×105/孔的密度在24孔板上鋪293細(xì)胞，24小時后進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。將帶有β-catenin基因序列的真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1-β-catenin和干擾載體pGO-β各200ng共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染試劑使用Lipotamine(購自Invitrogen)，以空干擾載體pGO作為對照，具體操作步驟見Invitrogen公司脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染使用說明。轉(zhuǎn)染后48小時用1×SDS上樣緩沖液裂解細(xì)胞(1×SDS上樣緩沖液配方見分子克隆實驗指南)，細(xì)胞裂解液跑8％的SDS-PAGE，100V，2小時30分鐘，用半干轉(zhuǎn)膜儀(購自BioRad)將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)膜條件100mA，2小時30分鐘。5％脫脂奶粉封閉1小時，一抗為β-catenin單抗(購自Santa Cruze公司)，二抗為帶有HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體(購自華舜公司)，ECL顯影劑(購自Santa Cruze公司)顯影，顯影膠片購自AFGA公司。結(jié)果參見圖4。如圖所示，pcDNA3.1-β-catenin與空干擾載體pGO共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后可見到較高水平的β-catenin表達(dá)，而pcDNA3.1-β-catenin與干擾載體pGO-β共轉(zhuǎn)染后，β-catenin表達(dá)水平顯著降低，但作為內(nèi)參照的β-actin表達(dá)不受影響，說明pGO-β可有效并特異的抑制β-catenin基因的表達(dá)。圖上顯示EGFP的表達(dá)量相同則說明pGO及pGO-β的轉(zhuǎn)染用量一致，而且其表達(dá)與RNA干擾作用互不影響。
實施例3針對熒光素酶報告基因(Luciferase)的RNA干擾一、RNA干擾片段的選取針對熒光素酶報告基因的干擾靶序列根據(jù)文獻(xiàn)應(yīng)用的已知有效片段設(shè)計(Genes & Development 16，948-958；2002) 反義序列在前，正義序列在后，兩端分別帶有Bbs I(ACCG)和BamH I(GATC)酶切位點的粘性末端，連接兩序列的環(huán)狀結(jié)構(gòu)中包含有一個HindIII酶切位點(AAGCTT)，以便鑒定時使用。
二、RNA干擾片段的體外退火方法(具體操作同前)載體用BbsI和BamHI雙酶切并回收，RNA干擾片段體外退火與載體連接及鑒定(具體操作同前)，干擾載體命名為pGO-FF。
三、熒光素酶基因和干擾載體共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞以1×105/孔的密度在24孔板上鋪HepG2細(xì)胞，24小時后進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。干擾載體pGO-FF及空載體pGO(作為對照)600ng，分別與熒光素酶基因載體pGL3-SV40(200ng)和pRL-TK(20ng)(熒光素酶基因載體購自Promega)共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染具體操作同前。轉(zhuǎn)染后24小時觀察到EGFP的表達(dá)；48小時用雙熒光素酶報告系統(tǒng)試劑(購自Promega)檢測針對熒光素酶的RNA干擾情況，具體操作見Promega雙熒光報告系統(tǒng)試劑使用說明，對熒光素酶報告基因的檢測顯示共轉(zhuǎn)染pGO-FF使報告基因活性下降約80％，參見圖5。從圖5A看出，轉(zhuǎn)染后24小時后根據(jù)EGFP的表達(dá)可以方便的分辨出被轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并說明pGO及pGO-FF的轉(zhuǎn)染用量一致；從圖5B看出共轉(zhuǎn)染pGO-FF后可以使熒光素酶活性下降約80％，提示pGO-FF能夠顯著抑制熒光素酶報告基因的表達(dá)。由此可見，本發(fā)明的RNAi載體pGO具有綠色熒光蛋白示蹤和真核細(xì)胞的抗性篩選標(biāo)記，并能夠有效抑制目的基因表達(dá)，故可用于制備治療腫瘤的藥物或用于制備研究基因功能的試劑。
權(quán)利要求
1.一種RNAi載體pGO，包括pUC復(fù)制起點pUC ori、fl復(fù)制起點fl ori、細(xì)菌啟動子P、卡那霉素基因Kan、HSV-TK PolyA、U6啟動子U6 promoter和多克隆位點MCS，其特征在于還含有用于表達(dá)綠色熒光蛋白基因的轉(zhuǎn)錄元件，包括CMV啟動子CMV promoter、增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因EGFP和SV40 PolyA，以及用于表達(dá)真核細(xì)胞抗性篩選標(biāo)志的新霉素基因轉(zhuǎn)錄元件，包括SV40早期啟動子SV40epromoter和新霉素抗性基因Neo。
2.權(quán)利要求1所述RNAi載體pGO在制備基因功能研究試劑和抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，是一種可用于特異性抑制靶基因表達(dá)的具有綠色熒光蛋白示蹤和真核細(xì)胞抗性篩選標(biāo)記的RNA干擾(RNAi)載體pGO。本發(fā)明RNAi載體pGO是對pEGFP－C2載體的改造，去除了其原有的多克隆位點，在SV40 polyA和fl原核復(fù)制起點之間插入帶有相應(yīng)多克隆位點的U6啟動子構(gòu)成。只要在U6啟動子下游的多克隆位點中的適當(dāng)位點插入針對靶基因的siRNA模板，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后就可特異并有效地抑制該基因的表達(dá)。因而本發(fā)明的RNAi載體pGO可用于制備研究基因功能的試劑或用于抗腫瘤藥物的研究和開發(fā)。
文檔編號A61P35/00GK1539979SQ20031010814
公開日2004年10月27日 申請日期2003年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月24日
發(fā)明者王紅陽, 鄢和新, 張瑞, 陳磊, 吳孟超 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)