專利名稱：七烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素fr－008復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種聚酮抗生素，特別是一種七烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素FR-008復(fù)合物，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鏈霉菌屬原核生物界放線菌目鏈霉菌科，是土壤中主要的微生物類群之一。聚酮是一類自然產(chǎn)物，很多聚酮類抗生素已應(yīng)用于醫(yī)用，獸用及農(nóng)用，包括紅霉素(抗菌)，制霉菌素(抗真菌)，阿維菌素(抗寄生的)，納巴霉素(免疫抑制劑)和道諾紅菌素(抗腫瘤)。例如免疫抑制劑FK506通過抑制T細(xì)胞激活與生長(zhǎng)所需的信號(hào)傳導(dǎo)途徑來阻礙免疫應(yīng)答。FK506被用來防止移植排拒反應(yīng)。并被用于某些自動(dòng)免疫疾病的治療。在結(jié)構(gòu)上，F(xiàn)K506也是一個(gè)大環(huán)內(nèi)酯，可由一些鏈霉菌產(chǎn)生。
經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，1986年作者Bolard，J.，在Biochim.Biophys.Acta(生物化學(xué).生物物理學(xué)報(bào))第864期257-304頁報(bào)道多烯抗生素是通過與真核細(xì)胞膜的固醇相互作用形成通道而引起小分子的丟失而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。七烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素兩性霉素B是結(jié)核鏈霉菌產(chǎn)生的一種在醫(yī)藥上具有重要用途的抗真菌抗生素。兩性霉素B對(duì)真菌細(xì)胞膜中數(shù)量最大的固醇麥角固醇具有很大的親和性，從而對(duì)真菌細(xì)胞具有選擇性的毒性。兩性霉素B是人類嚴(yán)重系統(tǒng)性真菌感染最重要的抗生素。七烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素制霉菌素也是人類真菌感染重要的醫(yī)用抗生素。殺念菌素是由灰色鏈霉菌IMRU3570產(chǎn)生的一種芳香七烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素。它對(duì)念珠菌有很強(qiáng)的抑制活性。然而，多烯大環(huán)內(nèi)酯的應(yīng)用至今仍然主要局限在對(duì)真菌病的治療上。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)背景技術(shù)中存在的不足和需要解決的技術(shù)問題，提供了一種七烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素FR-008復(fù)合物，即一簇結(jié)構(gòu)相關(guān)的多烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素FR-008，它們由FR-008生物合成基因簇所合成的，更具體的說是通過FR-008聚酮合酶中21個(gè)特異的聚酮合酶模塊介導(dǎo)的21個(gè)縮合步驟，以及其后的糖基化，羧基化，羥基化等修飾步驟合成的。
本發(fā)明是根據(jù)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明具有多烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素FR-008化學(xué)結(jié)構(gòu)式式I和式II。該化學(xué)結(jié)構(gòu)式與其它現(xiàn)有的七烯大環(huán)內(nèi)酯化學(xué)結(jié)構(gòu)式均有不同。七烯大環(huán)內(nèi)酯兩性霉素B和制霉菌素均不具有對(duì)氨基苯甲酸基團(tuán)。芳香七烯大環(huán)內(nèi)酯殺念菌素已報(bào)道的化學(xué)結(jié)構(gòu)式不包含有兩個(gè)順式的雙鍵。芳香七烯大環(huán)內(nèi)酯Vacidin A雖然也有兩個(gè)順式雙鍵，但位于不同的位置，而且在多羥基部分(C3-C13)有很大區(qū)別。式I和式II所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)式是至今未發(fā)現(xiàn)或報(bào)道的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
結(jié)構(gòu)相關(guān)的多烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素FR-008各組分，即式I和式II所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，R1為羥基，R2為羥基時(shí)為組分FR-008-I；R1為酮基，R2為羥基時(shí)為組分FR-008-II；R1為酮基，R2為H原子時(shí)為組分FR-008-IV。結(jié)構(gòu)相關(guān)的多烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素FR-008各組分，包括C-15位與C-19位不形成六元縮醛環(huán)即式I與形成六元縮醛環(huán)即式II兩種動(dòng)態(tài)平衡結(jié)構(gòu)。包含七個(gè)共扼雙鍵，其中在C-26-C-27和C-28-C-29位為兩個(gè)順式雙鍵，其余為反式雙鍵。攜帶有一個(gè)對(duì)氨基苯甲酸基團(tuán)，在C-21位附著的是氨基海藻糖糖基。
本發(fā)明所提供的七烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素FR-008復(fù)合物通過與真核細(xì)胞膜的固醇相互作用形成通道而引起小分子的丟失而導(dǎo)致真菌細(xì)胞死亡從而具有強(qiáng)的抗真菌活性。由于聚酮抗生素FR-008復(fù)合物還可以與細(xì)胞膜中的膽固醇發(fā)生作用，從而對(duì)蚊子幼蟲有高毒性，濃度為1ppm時(shí)，分別在24小時(shí)，48小時(shí)和72小時(shí)內(nèi)使孑孓的致死率達(dá)100％。這未在其它多烯抗生素中發(fā)現(xiàn)。
產(chǎn)生抗生素FR-008的菌株可以在20-40℃生長(zhǎng)，更適宜在24-37℃生長(zhǎng)。
FR-008聚酮抗生素可以不經(jīng)過改造直接用于抗生素用途，應(yīng)用于人類，動(dòng)物，植物等合適的對(duì)象。聚酮抗生素FR-008一般被認(rèn)為是指發(fā)酵過程終止時(shí)回收的抗生素FR-008復(fù)合物，也可以指抗生素FR-008復(fù)合物中的任一單一組分。聚酮抗生素FR-008產(chǎn)生于產(chǎn)生菌的菌絲體中，也可以分泌到發(fā)酵液中。聚酮抗生素FR-008可用紫外光380nm檢測(cè)，通過HPLC純化或通過其它標(biāo)準(zhǔn)的程序分離并純化。
從這些FR-008聚酮抗生素能衍生各種不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)分子。通過化學(xué)修飾得到包括從這些FR-008聚酮抗生素所能衍生的各種不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)分子。通過對(duì)這些FR-008聚酮抗生素的一系列化學(xué)反應(yīng)，可得到一系列新的，迄今未公開的具有很強(qiáng)活性的衍生物，提供了制備經(jīng)過修飾的大環(huán)內(nèi)酯的可能性。
FR-008聚酮抗生素可以以被分離開的或經(jīng)純化的，或者存在于宿主細(xì)胞的培養(yǎng)液中的形式存在或提供。FR-008聚酮抗生素也可以作為藥物組分形式的來提供。在產(chǎn)生這些FR-008聚酮抗生素的宿主細(xì)胞中也可以產(chǎn)生其它相關(guān)聯(lián)的聚酮抗生素或經(jīng)過修飾的聚酮抗生素。在這些FR-008聚酮抗生素的基礎(chǔ)上可以產(chǎn)生被進(jìn)一步改造的聚酮抗生素或經(jīng)過修飾的聚酮抗生素。
FR-008聚酮抗生素可以通過與特定的抗生素產(chǎn)生菌共培養(yǎng)而產(chǎn)生被進(jìn)一步改造的聚酮抗生素。FR-008聚酮抗生素亦可以經(jīng)過化學(xué)或生物的修飾或改造而得到具有潛在抗生素活性的化合物，以應(yīng)用于人類，動(dòng)物，植物等合適的對(duì)象。
FR-008聚酮抗生素可以在一定的條件下或與其它聚酮類似的條件通過宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)或發(fā)酵得到。產(chǎn)生FR-008聚酮抗生素的宿主細(xì)胞可以通過紫外誘變，化學(xué)誘變或進(jìn)一步的基因工程改造而得到提高FR-008聚酮抗生素產(chǎn)量的宿主細(xì)胞，這種宿主細(xì)胞可以用于工業(yè)化生產(chǎn)。
FR-008聚酮抗生素的藥用制劑也是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明包括FR-008聚酮抗生素用于治療易感細(xì)菌感染的組合物，包括FR-008聚酮抗生素和可接受的藥用載體。用FR-008聚酮抗生素的組合物治療易感菌感染的方法也是本發(fā)明的一部分。
FR-008聚酮抗生素可以作為藥物組分來應(yīng)用。本發(fā)明所提供的藥物組分可以以藥物制備形式來使用，例如以固體，半固體或液體形式。這種制備可以包含本發(fā)明一種或多種化合物作為適于外用，內(nèi)服或注射用的含有有機(jī)的或無機(jī)的載體或介質(zhì)的混合物中的有效成分。這種有效成分可以與通常的無毒副作用的，醫(yī)藥用的載體復(fù)合成藥片，藥球，膠囊，栓劑，溶液，乳劑，懸液以及其它適合的形式。
FR-008聚酮抗生素可以以脂質(zhì)體的形式來應(yīng)用以減少可能的毒副作用。脂質(zhì)體包括脂質(zhì)體劑型，是用脂質(zhì)體將FR-008聚酮抗生素包裹而成；脂質(zhì)體復(fù)合物，是脂質(zhì)體與FR-008聚酮抗生素交織；膠樣分散，用硫酸膽固醇與FR-008聚酮抗生素混合包裹。這些可用來與FR-008聚酮抗生素制備復(fù)合藥物的載體包括水，葡萄糖，乳糖，檸檬酸鈉，磷酸鹽，樹膠明膠，甘露醇，淀粉糊，硅酸鎂，硬脂酸鎂，滑石粉，玉米粉，角蛋白，硅膠，云母，土豆粉，尿素和其它適用于工業(yè)制備的載體，而且制作膠囊時(shí)可藥用的載體包括乳糖和高分子量的聚乙烯乙二醇。這種復(fù)合藥物可以為固體，半固體或液體的形式。復(fù)合藥物中可添加輔助的穩(wěn)定劑，加厚劑，著色劑或香料。
FR-008聚酮抗生素可以與無機(jī)或有機(jī)酸形成藥用加成鹽。用于形成酸加成鹽的包括硫酸，鹽酸，磷酸，氫溴酸，氫碘酸等無機(jī)酸，以及乙酸，碳酸，檸檬酸，苯甲酸，草酸，甲磺酸，甲苯磺酸，琥珀酸，對(duì)溴苯磺酸等有機(jī)酸。這樣的藥學(xué)上可接受的鹽包括硫酸鹽，焦硫酸鹽，硫酸氫鹽，亞硫酸鹽，亞硫酸氫鹽，氯化物，鹽酸鹽，氫溴酸鹽，溴化物，碘化物，甲酸鹽，異丁酸鹽，己酸鹽，庚酸鹽，富馬酸鹽，馬來酸鹽，檸檬酸鹽，乳酸鹽，羥基丁酸鹽，乙醇酸鹽，酒石酸鹽，磷酸鹽，磷酸一氫鹽，磷酸二氫鹽，偏磷酸鹽，焦磷酸鹽，乙酸鹽，丙酸鹽，癸酸鹽，辛酸鹽，苯甲酸鹽，氯苯甲酸鹽，甲基苯甲酸鹽，二硝基苯甲酸鹽，羥基苯甲酸鹽，甲氧基苯甲酸鹽，鄰苯二甲酸鹽，磺酸鹽，二甲苯磺酸鹽，苯基乙酸鹽，苯基丙酸鹽，苯基丁酸鹽，丙烯酸鹽，丙炔酸鹽，草酸鹽，丙二酸鹽，琥珀酸鹽，辛二酸鹽，癸二酸鹽，丁炔-1，4-二酸鹽，己炔-1，6-二酸鹽，甲磺酸鹽，丙磺酸鹽，萘-1-磺酸鹽，萘-2-磺酸鹽，扁桃酸鹽等。用于形成堿加成鹽的包括氨或堿金屬或堿土金屬氫氧化物，碳酸鹽，碳酸氫鹽等衍生自無機(jī)堿的鹽，可用于制備本發(fā)明的鹽的堿包括氫氧化鈉，氫氧化鉀，氫氧化鈣，氫氧化銨，碳酸鉀，碳酸鈉，碳酸鈣，碳酸氫鈉，碳酸氫鉀等。FR-008聚酮抗生素可以與可藥用的離子結(jié)合形成鹽。這些鹽包括堿性金屬鹽或堿性礦物金屬鹽，特別是鈣離子，鎂離子，鈉離子，鉀離子與FR-008聚酮抗生素形成鹽。
溶液或懸浮液可用于注射，藥用載體可以為水相，如水，等壓的鹽，等滲的葡萄糖，或非水相的，如植物油(包括棉籽油，花生油)，多羥基化合物(包括甘油和丙烯乙二醇)。
在感染的情況和疾病中，F(xiàn)R-008聚酮抗生素可以包含無毒副作用的藥用載體，輔劑或介質(zhì)的形式被用于口服，外用，注射，氣溶吸入(霧化吸入)或塞入直腸或陰道。這里所指的注射包括皮下注射，靜脈注射，肌肉注射和鞘內(nèi)給藥或灌輸技術(shù)。FR-008聚酮抗生素的用藥劑量為每人每天每千克體重0.01毫克到100毫克，更好的是約每人每天每千克體重0.1毫克到10毫克。而且，F(xiàn)R-008聚酮抗生素亦可以間歇給藥，例如間隔半周，一周，半月，一月等。和藥用載體材料混合的而配成的單劑藥方中FR-008聚酮抗生素有效成分的用量可依病體治療效果或特殊的方式。而且，對(duì)于任何特殊病體的使用FR-008聚酮抗生素的特定用量依賴于各種因素，包括所提供特定抗生素的的藥效，病體的年齡，重量，健康狀態(tài)，性狀態(tài)和飲食，還包括服藥時(shí)間和途徑以及排泄比率，亦包括治療中所用的復(fù)合藥物，還包括疾病或狀態(tài)的嚴(yán)重性。
FR-008聚酮抗生素可以單獨(dú)用于治療藥方，也可以與其它藥用成分組合用于治療藥方。本發(fā)明所提供的七烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素FR-008復(fù)合物除具有強(qiáng)的抗真菌活性。而且對(duì)蚊子幼蟲有高毒性，這未在其它多烯抗生素中發(fā)現(xiàn)。FR-008聚酮抗生素還以用來防止前列腺腫大和念珠菌陰道炎(又稱霉菌性陰道炎)。這些聚酮抗生素亦可能具有抗腫瘤，抗艾滋病毒，抗細(xì)菌等功能，以及其它潛在的抗生素活性。FR-008聚酮抗生素可用于敏感真菌所致的深部真菌感染且病情呈進(jìn)行性發(fā)展者，如敗血癥、心內(nèi)膜炎、腦膜炎(隱球菌及其它真菌)、腹腔感染(包括與透析相關(guān)者)、肺部感染、尿路感染和眼內(nèi)炎等。聚酮抗生素可用于深部真菌感染和敏感菌所致的內(nèi)臟或全身感染，包括念菌病，珠孢子菌病，球孢子菌病，隱球菌病，曲菌病、毛霉菌病，粗球孢子菌病，皮炎芽生菌病和組織胞漿菌病等。
FR-008聚酮抗生素可以在工業(yè)用高產(chǎn)菌株中得到，也可以在經(jīng)過基因改造的突變株中得到。改造特定的FR-008生物合成基因或中斷特定的FR-008生物合成基因或增加特定的結(jié)構(gòu)基因可以產(chǎn)生新型聚酮抗生素和被進(jìn)一步改造的聚酮抗生素。FR-008聚酮抗生素可以通過外來的特定基因或酶作用而產(chǎn)生相應(yīng)的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步改變的新型聚酮抗生素。
FR-008聚酮抗生素可以通過特定生物體中存在的糖苷轉(zhuǎn)移酶或氧化酶或羥基化酶或其它合適的修飾酶而產(chǎn)生新的有用化合物，這些特定的生物體包括灰色鏈霉菌，天藍(lán)色鏈霉菌，或其它合適的鏈霉菌，或其它細(xì)菌，真菌，植物或動(dòng)物。FR-008聚酮抗生素亦可以通過特定生物體中存在的糖苷轉(zhuǎn)移酶使之?dāng)y帶上新的糖基，這些特定的生物體包括灰色鏈霉菌，天藍(lán)色鏈霉菌，或其它合適的鏈霉菌，或其它細(xì)菌，真菌，植物或動(dòng)物。
本發(fā)明具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步，F(xiàn)R-008聚酮抗生素可應(yīng)用于抗真菌感染的用途。尤其可用于治療念珠菌所引起的霉菌性陰道炎。聚酮抗生素FR-008活性的一個(gè)重要方面是其對(duì)蚊子幼蟲的毒性，這在其它多烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素中未有報(bào)道。聚酮抗生素FR-008還可用于治療前列腺腫大。這些聚酮抗生素還可能具有其它潛在的抗生素活性。FR-008聚酮抗生素可用于產(chǎn)生被進(jìn)一步改造的聚酮抗生素或雜合抗生素或用于得到理化性質(zhì)提高的化學(xué)修飾抗生素或基因工程抗生素。本發(fā)明所提供的FR-008聚酮抗生素可以應(yīng)用并查找和發(fā)展可用于醫(yī)藥，工業(yè)，農(nóng)業(yè)的化合物。


以下通過附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步描述圖1為FR-008化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖。編號(hào)為C1’-C6’的為氨基海藻糖基團(tuán)。R1為羥基，R2為羥基時(shí)為組分FR-008-I；R1為酮基，R2為羥基時(shí)為組分FR-008-II；R1為酮基，R2為H原子時(shí)為組分FR-008-IV。C-26-C-27與C-28-C-29為兩個(gè)順式雙鍵。C-1”-C-6”為對(duì)氨基苯甲酸基團(tuán)。C-15位與C-19位有形成六元縮醛環(huán)與不形成六元縮醛環(huán)兩種動(dòng)態(tài)平衡結(jié)構(gòu)。
圖2為負(fù)責(zé)FR-008生物合成的整個(gè)FR-008基因簇的結(jié)構(gòu)。包括結(jié)構(gòu)基因，修飾基因，糖苷轉(zhuǎn)移酶基因及糖基合成酶基因等，負(fù)責(zé)FR-008的每一步生物合成及調(diào)節(jié)和外運(yùn)。
圖3為通過FR-008聚酮合酶中21個(gè)特異的聚酮合酶模塊介導(dǎo)的21個(gè)縮合步驟，以及其后的糖基化，羧基化，羥基化修飾而合成FR-008的過程。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明中FR-008聚酮抗生素描述本發(fā)明所提供的FR-008的聚酮抗生素如圖1所示。
R1為羥基，R2為羥基時(shí)為組分FR-008-I；R1為酮基，R2為羥基時(shí)為組分FR-008-II；R1為酮基，R2為H原子時(shí)為組分FR-008-IV。C-26-C-27與C-28-C-29為兩個(gè)順式雙鍵。C-1”-C-6”為對(duì)氨基苯甲酸基團(tuán)。它們都存在C-15位與C-19位形成六元縮醛環(huán)與不形成六元縮醛環(huán)兩種動(dòng)態(tài)平衡結(jié)構(gòu)。
以下進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明詳細(xì)描述由于FR-008有抗真菌活性，對(duì)蚊子幼蟲有高毒性和可以用來防止前列腺腫大以及念珠菌陰道炎以及在其它工業(yè)，農(nóng)業(yè)，醫(yī)藥上所具有的應(yīng)用潛能，本發(fā)明提供了FR-008聚酮抗生素復(fù)合物。
以下的實(shí)施例闡明了得到和應(yīng)用本發(fā)明所提供FR-008聚酮抗生素的途徑。這些實(shí)例只是用做說明而并不限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。
實(shí)施例1鏈霉菌FR-008的發(fā)酵培養(yǎng)基黃豆餅粉培養(yǎng)基淀粉 4％，黃豆餅粉 5％，NaCl 0.3％PH值7.2實(shí)施例2鏈霉菌FR-008的發(fā)酵培養(yǎng)用接種環(huán)從長(zhǎng)有鏈霉菌FR-008的斜面上挑取少量孢子，接種于10個(gè)裝有30ml黃豆餅粉培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，28℃培養(yǎng)48小時(shí)。約300ml培養(yǎng)液作為種子接種到裝有10L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中。在培養(yǎng)溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為500rpm。通氣量為10L/min的條件下，培養(yǎng)72小時(shí)。
實(shí)施例3FR-008提取分離用高速離心機(jī)在4℃，以6000rpm的速度將10升FR-008發(fā)酵液進(jìn)行離心，沉淀物用5倍的正丁醇萃取3次；上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃左右減壓濃縮到1/10體積，再用正丁醇萃取三次。合并萃取液，在低于55℃的條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至稠狀物。用乙醚洗滌稠狀物，離心，棄去上清夜，再用乙醚洗滌2次，得黃色粉末約20克。
實(shí)施例4大孔樹脂吸附用80％的甲醇分3次每次500ml，從中提取FR-008抗生素，不溶物離心除去。加水稀釋甲醇溶液至甲醇濃度為60％，獲得總體積約為2升純黃色的FR-008甲醇溶液。將裝有300ml大孔樹脂的層析柱，用兩倍于樹脂體積的60％甲醇溶液洗滌，用兩倍于樹脂體積的甲醇溶液洗滌，用大孔樹脂Amberlite XAD-16(Sigma)進(jìn)行吸附。用兩倍于樹脂體積的60％甲醇溶液洗滌，再用80％甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，用部分收集器收集，并用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，直到有明顯的七烯大環(huán)內(nèi)酯的特征峰出現(xiàn)，再改換80％的丙酮進(jìn)行解吸附。所有的溶液在進(jìn)入大孔樹脂以前均需減壓脫氣處理。合并黃色較深的試管中的溶液，減壓蒸去溶劑，得淡黃色固體2克。
實(shí)施例5分配層析層析載體使用薄層硅膠G，干法進(jìn)行裝柱，80％的丙酮作洗脫劑。系統(tǒng)連接一個(gè)蠕動(dòng)泵進(jìn)行快速循環(huán)，以平衡系統(tǒng)，并可達(dá)到消除柱內(nèi)氣泡的目的。然后再用經(jīng)減脫氣的80％丙酮洗滌層析柱。將1.5g淡黃色固體溶于80％的150ml的THF，硅膠G作固定相，80％的丙酮作洗脫劑，進(jìn)行分配層析，層析速度為5ml/min。收集紫外特征峰，蒸去溶劑，得FR-008樣品400mg。
實(shí)施例6HPLC分析樣品制備待分析樣品5mg的FR-008樣品溶于5ml 80％的THF中，充分溶解后，用0.4um過濾膜過濾。
待制備樣品50mg FR-008樣品溶于5ml 80％THF，0.4um過濾膜過濾。儲(chǔ)存于-20℃冰箱待用。
分析條件柱壓1200-1400psi；柱溫30℃；速度1.2ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)380nm。
流動(dòng)相由磷酸緩沖液和有機(jī)溶劑組成，比例通過儀器調(diào)整。使用前脫氣處理；色譜柱4.6×250mm Nucleosil RP-18(sigma，分析柱)；球形PR-18(中科院大連化物所，制備柱)；抗生素FR-008各組分的分離制備條件同上，進(jìn)樣量為10mg/ml，采用重疊進(jìn)樣的方法進(jìn)行制備，每10分鐘進(jìn)一次樣。對(duì)FR-008各組分分別進(jìn)行分離制備。后處理用Sephadex LH-20(Sigma)進(jìn)行脫鹽。
HPLC色譜儀四通道Perkin Elmer色譜儀；Perkin Elmer終端；Perkin ElmerLCI-100數(shù)據(jù)站；HP8451A二極管紫外分光光度計(jì)。
實(shí)施例7FR-008-II的二維NMR氫譜將上述制備的FR-008-II約8mg溶于1ml氘代DMSO中進(jìn)行2D 1H-1H NMR分析。
FR-008-II的二維NMR氫譜結(jié)果列出如下芳香殘基2”，6”-H 6.563”，5”-H 7.67抗生素母體結(jié)構(gòu)中的三個(gè)甲基H的化學(xué)位移分別為36-CH3，0.97(3H，d)；38-CH3，0.83(3H，d)和40-CH3，0.78(3H，d)；根據(jù)它們與所在C上的H的相關(guān)性，可以確定36-H，38-H，40-H分別為2.45(1H，m)，1.55(1H，m)，1.83(1H，m)。
對(duì)于氨基海藻糖(3，6-二脫氧-3-氨基-D-甘露己糖)的6種氫分別為1.15(3H，d，6′-H)；3.22(1H，m，5′-H)；3.12(1H，m，4′-H)；2.78(1H，d，3′-H)；4.50(1H，2′-H)和5.32(1H，1′-H)。三個(gè)6′-H屬于5′-C上的CH3，很容易從圖譜上找到，然后根據(jù)相關(guān)接力確定5′-H，4′-H和3′-H。
利用相關(guān)接力的方法確定七個(gè)共軛雙鍵兩端的氫21-H(非雙鍵上的氫)4.39；22-H5.88；23-H6.18；24-H6.37和31-H6.28；32-H6.36；33-H34-H6.12；35-H5.50。其它雙鍵上的氫(25-30)在6.1-6.4之間。
實(shí)施例8核磁共振將上述制備的FR-008-II約8mg溶于1ml氘代DMSO中進(jìn)行13C NMR分析。C譜的累加時(shí)間大約為8小時(shí)。FR-008-II主要C原子的化學(xué)位移如下表。
核磁共振儀Bruker AM 500 NMR
C原子 數(shù)目 化學(xué)位移 C原子 數(shù)目 化學(xué)位移酯鍵 2 氨基海藻糖 6C-1 166.6 C-1’ 96.9C-3780.3C-2’ 70.6RCOR 4C-3’ 56.0C-3 202.2 C-4’ 71.3C-7 208.7 C-5’ 72.8C-15213.0 C-6’ 17.9C-43196.7 RCH＝CHR 14芳環(huán)C原子 6C-22-C-35 124-137C-1”130.5 RCOOH 1 176.2C-2”，C-6” 125.2 RCH33 15.5 16.7 16.8C-3”，C-5” 112.4 R2CHOH 6 65-81C-4”153.5 RCH2R 12 29-50R3CH 436-39 C-211 57.5C-18 175.2化學(xué)位移(δ)單位為ppm實(shí)施例9FR-008各組分多級(jí)質(zhì)譜斷裂碎片LC/MS是在安捷倫公司的Agilent 1100 series LC/MSD Trap system上進(jìn)行。
高壓液相色譜的條件同上。質(zhì)譜是在離子井的負(fù)離子條件下進(jìn)行。干燥氣流為10 l/min，噴霧器壓力為50psi。干燥氣溫為325℃。轟擊電壓在1.0-1.8之間。
FR-008各組分的質(zhì)譜碎裂片段比較分析FR-008-I，F(xiàn)R-008-II和FR-008-IV在質(zhì)譜負(fù)離子模式下(比質(zhì)量數(shù)少1)的分子離子峰分別為1110，1108和1092。FR-008各組分均可被脫羧基和脫水，進(jìn)一步的質(zhì)譜多級(jí)碎裂片段亦顯示它們的結(jié)構(gòu)相關(guān)性。
實(shí)施例10FR-008的溶解度FR-008在不同溶劑中的溶解度如下表所示溶劑 溶解度(mg/ml)水 0.05甲醇 0.2880％甲醇 0.42丙酮 0.0480％丙酮 0.40四氫呋喃 0.0480％四氫呋喃3.8
正丁醇 0.0480％正丁醇 0.45DMSO1.8DMF 0.50應(yīng)用實(shí)例11FR-008分子中兩個(gè)順式雙鍵的存在聚酮合酶與動(dòng)物脂肪酸合成酶中的酮基還原酶結(jié)構(gòu)域組成了SDR還原酶總科中的一個(gè)亞科。聚酮合酶中酮基還原酶結(jié)構(gòu)域(KR)負(fù)責(zé)所合成碳鏈的立體構(gòu)型，而這種立體構(gòu)型的控制是通過酮基還原酶結(jié)構(gòu)域中一個(gè)特定位點(diǎn)的天冬氨酸來完成。這個(gè)天冬氨酸被認(rèn)為與酮基還原酶結(jié)構(gòu)域中112位的組氨酸和100位的酪氨酸共同控制所合成碳鏈的立體構(gòu)型。當(dāng)這個(gè)特定氨基酸是天冬氨酸(D)時(shí)，將酮基還原成D構(gòu)型的羥基；當(dāng)這個(gè)特定氨基酸是天冬氨酸以外的氨基酸時(shí)，將酮基還原成L構(gòu)型的羥基。在所有的酮基還原，脫水而形成反式雙鍵的反應(yīng)中，催化酮基還原的酮基還原酶結(jié)構(gòu)域都有這個(gè)特定的天冬氨酸。相反，在所有的酮基還原，脫水而形成順式雙鍵的反應(yīng)中，催化酮基還原的酮基還原酶結(jié)構(gòu)域都缺少這個(gè)特定的天冬氨酸或者這個(gè)特定的天冬氨酸發(fā)生改變。而且酮基還原酶結(jié)構(gòu)域這種對(duì)所合成碳鏈的立體構(gòu)型的控制不依賴于其它的酶或底物或酶促環(huán)境。FR-008聚酮合酶負(fù)責(zé)共扼雙鍵合成的聚酮合酶模塊8和模塊9中的酮基還原酶結(jié)構(gòu)域KR8和KR9的這個(gè)特定氨基酸分別是甘氨酸(G)和天冬酰氨(N)而不是天冬氨酸(D)，所以它們所負(fù)責(zé)合成的雙鍵均為順式雙鍵。即FR-008分子中C-26-C-27與C-28-C-29之間的雙鍵是順式雙鍵。
實(shí)施例12FR-008各組分紫外特征吸收FR-008各組分在HPLC中分離后，分別檢測(cè)各組分的紫外特征吸收，紫外特征吸收列出如下FR-008-I 360.6(肩峰)，381.6(主峰)FR-008-II 361.6(肩峰)，382.8(主峰)FR-008-IV 362.6(肩峰)，384.0(主峰)實(shí)施例13聚酮抗生素FR-008的抗真菌活性(真菌指示菌啤酒酵母)將指示菌啤酒酵母Y029接種到10.3％YEME液體培養(yǎng)基中，28℃搖床(200rpm)培養(yǎng)約24小時(shí)，離心收集菌體，分散在20％甘油中，按30μl分裝成小份，-20℃貯存?zhèn)溆?。融化PDA培養(yǎng)基并冷卻至50℃左右，每100ml培養(yǎng)基中加入30μl-20℃貯存的上述小份指示菌，立即混勻后倒入培養(yǎng)皿或方盤，待其凝固后，在合適的位置上擺好圓形濾紙片，將適量待測(cè)的FR-008聚酮抗生素滴于圓形濾紙片，30℃培養(yǎng)1-2天后觀察結(jié)果。生物活性測(cè)定呈現(xiàn)明顯的抑菌圈，顯示聚酮抗生素FR-008具有抗真菌的活性。
實(shí)施例14聚酮抗生素FR-008的殺蟲活性(蚊子幼蟲)聚酮抗生素FR-008用吡啶溶解，再用水系列稀釋成不同濃度的稀釋液，并以等濃度的溶劑(吡啶)和水做對(duì)照，用孑孓為試蟲。當(dāng)抗生素的濃度為100ppm，10ppm和1ppm時(shí)，分別在24小時(shí)，48小時(shí)和72小時(shí)內(nèi)使孑孓的致死率達(dá)100％；而在此濃度范圍內(nèi)的溶劑和水作為對(duì)照的處理不能使孑孓致死。顯示聚酮抗生素FR-008具有很強(qiáng)的殺蟲活性。
權(quán)利要求
1.一種七烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素FR-008復(fù)合物，其特征在于，多烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素FR-008化學(xué)結(jié)構(gòu)式式I為 式II為
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的七烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素FR-008復(fù)合物，其特征是結(jié)構(gòu)相關(guān)的多烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素FR-008各組分，即式I和式II中所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，R1為羥基，R2為羥基時(shí)為組分FR-008-I；R1為酮基，R2為羥基時(shí)為組分FR-008-II；R1為酮基，R2為H原子時(shí)為組分FR-008-IV。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的七烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素FR-008復(fù)合物，其特征是結(jié)構(gòu)相關(guān)的多烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素FR-008各組分，包括C-15位與C-19位不形成六元縮醛環(huán)即式I與形成六元縮醛環(huán)即式II兩種動(dòng)態(tài)平衡結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的七烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素FR-008復(fù)合物，其特征是結(jié)構(gòu)相關(guān)的多烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素FR-008各組分，包含七個(gè)共扼雙鍵，其中在C-26-C-27和C-28-C-29位為兩個(gè)順式雙鍵，其余為反式雙鍵。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的七烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素FR-008復(fù)合物，其特征是結(jié)構(gòu)相關(guān)的多烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素FR-008各組分，攜帶有一個(gè)對(duì)氨基苯甲酸基團(tuán)，在C-21位附著的是氨基海藻糖糖基。
全文摘要
一種七烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素FR－008復(fù)合物，多烯大環(huán)內(nèi)酯聚酮抗生素FR－008化學(xué)結(jié)構(gòu)式為式I、式II，這些FR－008聚酮抗生素具有抗真菌活性和對(duì)蚊子幼蟲的高毒性，可以應(yīng)用并查找和發(fā)展可用于醫(yī)藥，工業(yè)，農(nóng)業(yè)的化合物。
文檔編號(hào)A61P31/10GK1544453SQ20031010874
公開日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2003年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月20日
發(fā)明者鄧子新, 陳實(shí), 周秀芬, 黃曦 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)