專利名稱：以紅細(xì)胞作為載體延長蛋白質(zhì)藥物的體內(nèi)半衰期的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用紅細(xì)胞作為載體延長蛋白質(zhì)藥物半衰期的方法。
背景技術(shù)：
近年來，由于基因工程的普及應(yīng)用，蛋白質(zhì)類藥物在臨床上(包括心血管疾病的治療)的應(yīng)用越來越廣。但由于本身理化性質(zhì)的原因，大多數(shù)蛋白質(zhì)藥物不太穩(wěn)定，在體內(nèi)的半衰期很短，很多藥物需要每天給藥。同時(shí)，由于消化道中蛋白酶的存在，蛋白質(zhì)藥物很難通過口服給藥，連續(xù)的滴注給藥或持續(xù)的注射給病人帶來精神和肉體上的雙重折磨。因此越來越多的研究機(jī)構(gòu)將精力集中在蛋白質(zhì)藥物的劑型研究上，主要是研究長效藥物和口服、噴霧給藥等。
目前有關(guān)長效藥物的研究主要集中在以下幾個(gè)方面1.蛋白質(zhì)的修飾主要是PEG修飾和糖基的修飾。其中，PEG化的IFN(干擾素)、G-SCF(粒細(xì)胞集落刺激因子)已經(jīng)研究成功，并且在美國成功上市。而Amgen公司通過改變EPO(紅細(xì)胞生成素)的糖基化位點(diǎn)增加重組人EPO的唾液酸修飾從而使EPO的半衰期延長了幾倍。
2.融合蛋白的方式研究表明一些小分子蛋白通過與白蛋白、免疫球蛋白Fc段融合的方式增加了蛋白分子量，延長了蛋白在體內(nèi)的半衰期。
3.劑型的改變兩性酶素的脂質(zhì)體劑型研究成功給蛋白質(zhì)藥物的研究給了很多啟示。研究者用脂質(zhì)體包埋蛋白質(zhì)藥物，防止蛋白酶的降解和延緩在體內(nèi)的代謝。此外，還有借用凝膠等物質(zhì)將藥物植入體內(nèi)，然后藥物通過凝膠緩慢的釋放。
4.借用機(jī)械的方式實(shí)現(xiàn)藥物的緩慢釋放通過微泵的方式實(shí)現(xiàn)藥物在體內(nèi)的緩慢的可控的釋放。
紅細(xì)胞承擔(dān)著給機(jī)體輸送氧氣的任務(wù)，血液中血細(xì)胞絕大多數(shù)為紅細(xì)胞，紅細(xì)胞的體內(nèi)平均壽命在120天左右，而且紅細(xì)胞一般局限在血液系統(tǒng)內(nèi)循環(huán)。因此，有人嘗試使用紅細(xì)胞作為藥物載體以傳送藥物。國內(nèi)對此也有一定的研究。南京鼓樓醫(yī)院麻醉醫(yī)師汪小海、駱璇等經(jīng)過兩年的研究，發(fā)明了一種優(yōu)化藥物生物效應(yīng)的新技術(shù)——紅細(xì)胞包蔽嗎啡溶液用于病人術(shù)后鎮(zhèn)痛，即運(yùn)用自身紅細(xì)胞作為藥物載體，在病人手術(shù)麻醉前，抽取其3毫升靜脈血，采用高滲法將鎮(zhèn)痛藥物嗎啡包裹于紅細(xì)胞內(nèi)，在病人手術(shù)完成時(shí)，把包蔽嗎啡的血液重新輸回到病人體內(nèi)，使得嗎啡藥物在人體內(nèi)緩慢釋放，從而達(dá)到了術(shù)后長效鎮(zhèn)痛的目的。新的止痛方法，具有較好的安全性并且費(fèi)用低廉。
但是，以上研究局限于用藥物進(jìn)入紅細(xì)胞內(nèi)，然后再緩慢釋放，這種技術(shù)不大適合蛋白質(zhì)類藥物，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)類藥物分子量較大，很難進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。
近年來，生物技術(shù)的發(fā)展給眾多的心血管疾病患者帶來福音，已經(jīng)上市的溶栓藥物尿激酶、鏈激酶、組織纖溶酶原激活物等挽救了許許多多的心肌梗塞及中風(fēng)病人。但溶栓以后往往會出現(xiàn)出血以及再栓塞等反應(yīng)。如何防止溶栓后的再栓塞及降低出血反應(yīng)成為一個(gè)十分重要的研究課題。

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，本領(lǐng)域仍需要一種技術(shù)，該技術(shù)能將蛋白質(zhì)藥物傳送到體內(nèi)，并能延長該藥物的體內(nèi)半衰期。本發(fā)明即能滿足這種需求。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種延長蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)半衰期的方法，該方法采用化學(xué)交聯(lián)或標(biāo)記后親和作用的方式將蛋白質(zhì)藥物連接在紅細(xì)胞表面，從而延長了藥物的體內(nèi)半衰期。
本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)藥物指直接在血液系統(tǒng)中起作用的蛋白質(zhì)，包括但不限于水蛭素、尿激酶、鏈激酶、尿激酶原、蝮蛇抗栓酶等藥物。本發(fā)明的蛋白質(zhì)藥物優(yōu)選溶栓藥物和抗凝藥物，如尿激酶原、鏈激酶、水蛭素等。其中，水蛭素是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)有力的凝血酶抑制劑，還有很強(qiáng)的抗血栓作用，對多種實(shí)驗(yàn)性血栓模型有阻抑作用。其中對凝血酶或內(nèi)毒素所致的彌散性血管內(nèi)微血栓形成作用最強(qiáng)。其次，對靜脈阻塞所致的頸靜脈血栓也有較強(qiáng)的抗血栓作用。此外，水蛭素對血管內(nèi)膜損傷及旁路循環(huán)的動(dòng)脈血栓形成、化學(xué)損傷所致的冠脈血栓形成以及電流刺激所致的冠脈血栓的產(chǎn)生、實(shí)驗(yàn)性冠脈血栓經(jīng)鏈激酶溶栓再通后血栓性再阻塞的發(fā)生有明顯阻抑作用。重組水蛭素的抗凝效力與其在血液中的濃度相關(guān)。水蛭素在體內(nèi)不降解，在組織中無沉積，攝入后主要分布于細(xì)胞外的空間，經(jīng)腎小球過濾，以活性組分的形式通過腎臟排出體外，經(jīng)對鼠、家兔和狗的靜脈注射發(fā)現(xiàn)，重組水蛭素半衰期為1小時(shí)左右。因此，要更好地發(fā)揮水蛭素的預(yù)防血栓作用，延長其半衰期是必要的。
本發(fā)明所述的化學(xué)交聯(lián)作用包括使用化學(xué)交聯(lián)劑，較佳是作用條件溫和的雙交聯(lián)劑，在體外通過化學(xué)反應(yīng)將紅細(xì)胞與蛋白質(zhì)偶聯(lián)成復(fù)合物。所述化學(xué)交聯(lián)劑優(yōu)選異型雙功能交聯(lián)劑，選自但不限于N-羥基琥珀酰亞胺基-3-(2-砒啶基二硫)-丙酸酯(SPDP)、N-羥基琥珀酰亞胺基碘代乙酸酯、N-羥基琥珀酰亞胺基-間-(N-馬來酰亞胺基)-苯甲酸酯(SMB)等。
SPDP可以通過分子中的活潑酯成分與氨基反應(yīng)，同時(shí)引入巰基，然后通過巰基交換反應(yīng)或巰基加成反應(yīng)與另一分子交聯(lián)，同類的交聯(lián)劑還有N-羥基琥珀酰亞胺基-(4-α-甲基-α-(2-砒啶基二硫代甲基)-苯甲酸酯(SMPT)、N-羥基琥珀酰亞胺基-3-(2-砒啶基二硫)-丁酸酯(SPDB)，通過在二硫鍵的α位引入阻性基團(tuán)如甲基，增加交聯(lián)物的穩(wěn)定性。
N-羥基琥珀酰亞胺基碘代乙酸酯的活潑酯成分和α位活潑鹵素可以分別與蛋白分子的巰基及氨基反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)分子間的交聯(lián)，形成的硫醚鍵在血漿中十分穩(wěn)定。
SMB的N-羥基琥珀酰亞胺基可以和蛋白的氨基反應(yīng)，引入馬來酰亞胺基，然后馬來酰亞胺基與另一含有游歷巰基的分子如紅細(xì)胞上的蛋白通過巰基對雙鍵的加成反應(yīng)連接起來。
本發(fā)明所述的標(biāo)記后親和作用包括在紅細(xì)胞和蛋白質(zhì)上分別作分子標(biāo)記，利用標(biāo)記物之間或標(biāo)記物與同一分子作用使紅細(xì)胞與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物。具體而言，標(biāo)記后親和作用涉及生物素、親和素和/或鏈霉親和素的使用。
生物素又稱輔酶R或維生素H，在機(jī)體內(nèi)以輔酶形式參與各種羧化酶反應(yīng)。生物素分子量244.31，分子式C10H16O3N2S，有兩個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中I環(huán)為咪唑酮環(huán)，是與親和素結(jié)合的主要部位；II環(huán)為噻吩環(huán)，C2上有一戊酸側(cè)鏈，其末端羧基是結(jié)合抗體和其他生物大分子的唯一結(jié)構(gòu)。利用生物素的羧基加以化學(xué)修飾可制成各種活性基團(tuán)的衍生物，稱為活化生物素，以適合與各種生物大分子結(jié)合的需要。主要有標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的生物素N-羥基丁二酰亞胺酯(NHS-biotin)和生物素對硝基酚酯(pBNP)。
親和素亦稱抗生物素蛋白、卵白素或親和素，是從卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白；等電點(diǎn)10-10.5，含糖約10％，分子量為68kDa。親和素由四個(gè)相同的亞基組成，能結(jié)合4個(gè)分子的生物素。親和素與生物素之間具有非常強(qiáng)的親和力，其親和常數(shù)高達(dá)1015mol-1，比抗原抗體結(jié)合的親和常數(shù)(105-11mol-1)至少高10萬倍，因此二者能快速結(jié)合，具有高度特異性和穩(wěn)定性。
鏈霉親和素(SA)是鏈霉菌(Streptomyces avidinii)在培養(yǎng)過程中分泌的一種蛋白質(zhì)產(chǎn)物。SA的分子量為65kD，由4條序列相同的肽鏈組成。鏈霉親和素與生物素的親和常數(shù)亦為1015mol-1。SA的每條肽鏈含159個(gè)氨基酸殘基，等電點(diǎn)為6.0，不帶任何糖基。SA在檢測應(yīng)用中出現(xiàn)的非特異中結(jié)合遠(yuǎn)低于親和素。而且SA在大腸桿菌中已獲得高效表達(dá)。
生物素與親和素(或鏈霉親和素)在分析系統(tǒng)中已廣泛應(yīng)用，主要優(yōu)點(diǎn)有(1)親和素和生物素之間非常強(qiáng)的親合力；(2)可以將生物素連接到許多探針或配體上，而不改變它們的生物活性和生理特性；(3)存在許多商品化的生物素化試劑以及含親和素的探針。
生物素標(biāo)記蛋白目前已得到廣泛的應(yīng)用，生物素標(biāo)記的抗體被廣泛地應(yīng)用于診斷及蛋白檢測，生物素標(biāo)記相對比較溫和，可以保留原蛋白的生物活性。親和素及鏈霉親和素標(biāo)記蛋白也有很多的應(yīng)用，比如親和素及鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶及堿性磷酸酯酶已經(jīng)在檢測中廣泛應(yīng)用。
生物素標(biāo)記紅細(xì)胞的方法相對比較成熟。Magnani M.等(Biotechnol.Appl.Biochem.，20335-345，1994)用NHS-Biotin(與紅細(xì)胞膜蛋白的氨基結(jié)合)和生物素酰肼(biotin hydrazide，可引起紅細(xì)胞膜的?；趸?使紅細(xì)胞生物素化。通過比較發(fā)現(xiàn)，用NHS-Biotin進(jìn)行標(biāo)記具有更高的體外恢復(fù)率(＞90％)，并在循環(huán)中24小時(shí)不受損害。相反，生物素酰肼標(biāo)記的細(xì)胞恢復(fù)率僅為5-30％，24小時(shí)內(nèi)幾乎消失。由于NHS-Biotin是脂溶性物質(zhì)，只能用脂類物質(zhì)來溶解，從而不可避免地帶來了在標(biāo)記過程中脂類物質(zhì)對紅細(xì)胞及動(dòng)物體的毒副作用。在體外標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，常用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)來作為溶劑。DMF的毒性通過測量清洗標(biāo)記紅細(xì)胞后的上清液中DMF的濃度來確定。Hoffmann-Fezer等(Ann.Hematol.74231-238，1997)用氣相色譜法測得上清液中DMF濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于由生理毒性動(dòng)力模型計(jì)算的工作場所暴露在10ppmDMF氣體中的劑量，因此，用DMF溶解NHS-Biotin標(biāo)記紅細(xì)胞并經(jīng)過清洗后，再將紅細(xì)胞注入動(dòng)物體內(nèi)，不會發(fā)生危險(xiǎn)。在體內(nèi)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，常用DMSO和DMA(二甲基乙酰胺)，雖然DMSO的毒性被描述過(狗LD50＝2.5g/kg)，但它與DMA相比毒性較低，而且作為NHS-Biotin的溶劑效果更好。在實(shí)驗(yàn)中，通常給動(dòng)物注射硫酸阿托品來抵消DMSO的潛在的副作用。Suzuki等(Blood，70(3)791-795，1987)發(fā)現(xiàn)將NHS-Biotin與紅細(xì)胞共同孵育會引起紅細(xì)胞的棘化，在用琥珀酰化的BSA(succinylated BSA)處理后，阻止了紅細(xì)胞的形變，使之保持與對照紅細(xì)胞相同的形態(tài)。Cavill等(Br.J.Haematol.70491-493，1988)用NHS-LC-biotin和51Cr標(biāo)記，測量19人的紅細(xì)胞體積，發(fā)現(xiàn)兩種標(biāo)記之間沒有差異。將紅細(xì)胞同時(shí)標(biāo)記上NHS-Biotin和14C，并用14C標(biāo)記對照紅細(xì)胞，在一定時(shí)間間隔內(nèi)監(jiān)外周血中生物素標(biāo)記和14C標(biāo)記的紅細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)兩種標(biāo)記的紅細(xì)胞具有相同的生存能力。Russo等(Biotechnol.Appl.Biochem.，20335-345，1994)用流式細(xì)胞計(jì)證明了標(biāo)記紅細(xì)胞具有正常的生存周期。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，用生物素分別標(biāo)記紅細(xì)胞和水蛭素，然后用鏈霉親和素將兩者連在一起，形成紅細(xì)胞與水蛭素的復(fù)合物。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，先用生物素標(biāo)記紅細(xì)胞，然后用化學(xué)交聯(lián)的方法將鏈霉親和素與水蛭素連接，然后通過生物素與鏈霉親和素的親和作用使兩者形成復(fù)合物。此復(fù)合物中，每個(gè)紅細(xì)胞表面將有幾千到上萬個(gè)水蛭素分子。
本發(fā)明還提供了將尿激酶原連接于紅細(xì)胞表面的實(shí)施例，用生物素標(biāo)記尿激酶原與紅細(xì)胞，然后通過鏈霉親和素將二者連接在一起，得到尿激酶與紅細(xì)胞的復(fù)合物。
本發(fā)明的另一目的是提供一種蛋白質(zhì)藥物-紅細(xì)胞復(fù)合物，其中，復(fù)合物中的蛋白質(zhì)通過化學(xué)交聯(lián)作用或標(biāo)記后親和作用的方法連接于紅細(xì)胞上。所述化學(xué)交聯(lián)作用包括使用化學(xué)交聯(lián)劑，較佳是作用條件溫和的雙交聯(lián)劑，在體外通過化學(xué)反應(yīng)將紅細(xì)胞與蛋白質(zhì)偶聯(lián)成復(fù)合物。所述化學(xué)交聯(lián)劑優(yōu)選異型雙功能交聯(lián)劑，選自但不限于N-羥基琥珀酰亞胺基-3-(2-砒啶基二硫)-丙酸酯(SPDP)、N-羥基琥珀酰亞胺基碘代乙酸酯、N-羥基琥珀酰亞胺基-間-(N-馬來酰亞胺基)-苯甲酸酯(SMB)等。所述標(biāo)記后親和作用包括在紅細(xì)胞和蛋白質(zhì)上分別作分子標(biāo)記，利用標(biāo)記物之間或標(biāo)記物與同一分子作用使紅細(xì)胞與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物。具體是通過生物素、親和素和/或鏈霉親和素之間的相互作用，使它們所比較的蛋白質(zhì)藥物和/或紅細(xì)胞相連。
為此，本發(fā)明提供了一個(gè)優(yōu)選的蛋白質(zhì)藥物-紅細(xì)胞復(fù)合物，具體為由生物素標(biāo)記的紅細(xì)胞通過鏈霉親和素與生物素標(biāo)記的水蛭素連接而形成的水蛭素-紅細(xì)胞復(fù)合物。
本發(fā)明還提供另一優(yōu)選的蛋白質(zhì)藥物-紅細(xì)胞復(fù)合物，具體為由生物素標(biāo)記的紅細(xì)胞與鏈霉親和素標(biāo)記的水蛭素通過生物素與鏈霉親和素之間的連接而形成的復(fù)合物。
在又一實(shí)施例中，本發(fā)明還提供了尿激酶原-紅細(xì)胞復(fù)合物和鏈激酶-紅細(xì)胞復(fù)合物。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，通過使蛋白質(zhì)藥物與紅細(xì)胞連接，延緩了該藥物被腎小球?yàn)V過，從而延長了藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間。同時(shí)通過紅細(xì)胞將藥物限制在血管內(nèi)作用，降低藥物在其他組織中的分布，不僅可以防止藥物在其他組織中的副反應(yīng)，而且可以通過降低藥物的表觀分布體積來減少藥物的用量，從而降低藥物的副反應(yīng)。
本發(fā)明的水蛭素-紅細(xì)胞復(fù)合物與單獨(dú)的水蛭素相比，在保留了與單獨(dú)的水蛭素相當(dāng)?shù)膹?qiáng)抗凝、抗栓效果的同時(shí)，大大延長了體內(nèi)半衰期。由于一個(gè)紅細(xì)胞上可以標(biāo)記有幾千到上萬個(gè)生物素，然后與幾千到上萬個(gè)鏈霉親和素結(jié)合，而每個(gè)鏈霉親和素有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，即還有3個(gè)空余的位點(diǎn)與生物素化的水蛭素結(jié)合。因此，實(shí)際形成的復(fù)合物中，每個(gè)紅細(xì)胞上最終連接有幾萬個(gè)水蛭素。
將尿激酶、鏈激酶、水蛭素等藥物連接于紅細(xì)胞表面，也獲得了類似的效果。即，所形成的蛋白質(zhì)藥物-紅細(xì)胞復(fù)合物，其作用時(shí)間得到延長，藥物劑量減少，而且防止了藥物進(jìn)入血管外、引起出血的危險(xiǎn)。
本發(fā)明的另一優(yōu)點(diǎn)是，使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)藥物-紅細(xì)胞復(fù)合物(包括水蛭素、EPO、G-CSF等藥物與紅細(xì)胞形成的復(fù)合物)可以避免藥物的每天注射，既減輕了病人的痛苦，還可以增加一些新的臨床應(yīng)用。
以下以實(shí)施例的方式進(jìn)一步闡述本發(fā)明。但是，并不能認(rèn)為本發(fā)明限制于以下的優(yōu)選實(shí)施例。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 水蛭素與紅細(xì)胞復(fù)合物的制備1.1 紅細(xì)胞的生物素標(biāo)記抽取全血，加肝素抗凝，然后離心收集紅細(xì)胞，用pH 7.4磷酸緩沖液(PBS，125mM NaCl+20mM PB)洗滌三次，按10％紅血球容積懸浮于PBS-G(PBS+5mMglucose)。將NHS-biotin按200mg/ml溶解于90％的DMSO中，然后按每毫升紅細(xì)胞加0.055mg的NHS-biotin混勻，37℃保溫1小時(shí)，然后用PBS洗滌三次，得到標(biāo)記好的紅細(xì)胞。
1.2 水蛭素的生物素標(biāo)記用DMF將NHS-Biotin配成1mg/ml溶液，然后用0.1M，pH 9.0NaHCO3將水蛭素稀釋成1mg/ml。將NHS-Biotin與水蛭素按重量比1∶7左右混合，室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)4小時(shí)，裝入透析袋，對0.05M pH 7.2 PBS在4℃透析過夜，去除未反應(yīng)的NHS-biotin。
1.3 水蛭素-紅細(xì)胞復(fù)合物的制備先將生物素化的水蛭素與鏈霉親和素按摩爾數(shù)比1∶1混合，室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)30分鐘，然后加入生物素化的紅細(xì)胞，輕輕搖動(dòng)反應(yīng)30分鐘，離心收集紅細(xì)胞-水蛭素復(fù)合物。
1.4 水蛭素比活性的測定水蛭素的測活方法為水蛭素抗凝血酶法100μL含水蛭素的溶液中，加入0.2ml 0.5％纖維蛋白原的Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)中，混勻后，在室溫下逐滴加入標(biāo)準(zhǔn)凝血酶溶液(100NIH-U/ml)，每次5μL，邊加邊震蕩，然后放置，如果纖維蛋白原在1分鐘內(nèi)凝固，即滴定完畢，由消耗的凝血酶量計(jì)算出水蛭素的活性。然后將活性除以水蛭素的蛋白量得到水蛭素的比活。
用上述方法測定未標(biāo)記的水蛭素、生物素化的水蛭素及水蛭素-紅細(xì)胞復(fù)合物中水蛭素的比活，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記后比活略有降低，但仍保持絕大部分抗凝血酶活性。
實(shí)施例2 水蛭素與紅細(xì)胞復(fù)合物的制備2.1 紅細(xì)胞的生物素標(biāo)記同實(shí)施例1的步驟1.1。
2.2 水蛭素的鏈霉親和素標(biāo)記將凍于的水蛭素溶解在含有1.25％戊二醛的0.1M pH 6.8PB緩沖液中，終濃度為10mg/ml，室溫作用過夜；裝入透析袋，對0.05M pH 7.2PBS在4℃透析12小時(shí)；取出透析物，每毫升水蛭素溶液加入15mg鏈霉親和素和0.5ml 1M pH 9.5Na2CO3，置4℃結(jié)合24小時(shí)；加入50ul 0.2M賴氨酸室溫2小時(shí)終止反應(yīng)；裝入透析袋，對0.05M pH 7.2PBS在4℃透析過夜。離心去除大分子聚合物，得到鏈霉親和素標(biāo)記的水蛭素。
2.3 水蛭素-紅細(xì)胞復(fù)合物的形成將生物素化的紅細(xì)胞與鏈霉親和素標(biāo)記的水蛭素(按每個(gè)生物素化紅細(xì)胞結(jié)合10000個(gè)鏈霉親和素標(biāo)記的水蛭素計(jì)算)進(jìn)行混合，在室溫下輕輕搖動(dòng)反應(yīng)30分鐘，離心收集紅細(xì)胞-水蛭素復(fù)合物。
2.4 水蛭素的比活性測定測定方法參照1.4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)鏈霉親和素標(biāo)記的水蛭素及與紅細(xì)胞形成的復(fù)合物仍具有與未標(biāo)記的水蛭素可比的抗凝血酶活性。
實(shí)施例3 水蛭素-紅細(xì)胞復(fù)合物與單獨(dú)的水蛭素的體內(nèi)半衰期比較取新西蘭家兔30只，分成六組，分別靜脈注射水蛭素或水蛭素-紅細(xì)胞復(fù)合物，劑量(按水蛭素的蛋白重量計(jì)算)分高(0.4毫克/公斤)、中(0.2毫克/公斤)、低(0.1毫克/公斤)三組，然后在注射后5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)取血，然后用夾心ELISA檢測水蛭素濃度。所得數(shù)據(jù)用P87軟件計(jì)算T1/2(α相不計(jì)算，只計(jì)算β相)。結(jié)果表明，水蛭素與紅細(xì)胞融合后半衰期大大延長。
實(shí)施例4 尿激酶原-紅細(xì)胞復(fù)合物的制備方法參照實(shí)施例1，但是使用尿激酶原替換水蛭素，制得尿激酶原-紅細(xì)胞復(fù)合物。測得所制得的尿激酶原-紅細(xì)胞復(fù)合物中的尿激酶原仍保持絕大部分抗凝血酶活性。按照實(shí)施例3所述的方法測試本實(shí)施例的尿激酶原-紅細(xì)胞復(fù)合物，結(jié)果表明，尿激酶原與紅細(xì)胞融合后其半衰期大大延長。
實(shí)施例5 鏈激酶-紅細(xì)胞復(fù)合物的制備方法參照實(shí)施例1，但使用鏈激酶替換水蛭素，制得鏈激酶-紅細(xì)胞復(fù)合物。測得所制得的鏈激酶-紅細(xì)胞復(fù)合物中的鏈激酶仍保持絕大部分抗凝血酶活性。按照實(shí)施例3所述的方法測試本實(shí)施例的鏈激酶-紅細(xì)胞復(fù)合物，結(jié)果表明，鏈激酶與紅細(xì)胞融合后其半衰期大大延長。
權(quán)利要求
1.一種延長蛋白質(zhì)藥物體內(nèi)半衰期的方法，其特征在于，該方法包括，采用化學(xué)交聯(lián)作用或標(biāo)記后親和作用的方法將所述蛋白質(zhì)藥物連接于紅細(xì)胞表面，形成蛋白質(zhì)藥物-紅細(xì)胞復(fù)合物。
2.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述化學(xué)交聯(lián)作用包括使用化學(xué)交聯(lián)劑在體外通過化學(xué)反應(yīng)將紅細(xì)胞與蛋白質(zhì)偶聯(lián)成復(fù)合物。
3.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述標(biāo)記后親和作用包括在紅細(xì)胞和蛋白質(zhì)上分別作分子標(biāo)記，利用標(biāo)記物之間或標(biāo)記物與同一分子作用使紅細(xì)胞與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物。
4.如權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，所述標(biāo)記物選自生物素和親和素或鏈霉親和素。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)藥物選自水蛭素、尿激酶、鏈激酶、尿激酶原和蝮蛇抗栓酶。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)藥物是水蛭素。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括用生物素分別標(biāo)記紅細(xì)胞和水蛭素，用鏈霉親和素將標(biāo)記的紅細(xì)胞與標(biāo)記的水蛭素連在一起，形成紅細(xì)胞-水蛭素復(fù)合物。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括用生物素標(biāo)記紅細(xì)胞，用化學(xué)交聯(lián)的方法將鏈霉親和素與水蛭素連接，然后通過生物素與鏈霉親和素的親和作用使兩者形成復(fù)合物。
9.一種蛋白質(zhì)藥物-紅細(xì)胞復(fù)合物，其特征在于，該復(fù)合物中的蛋白質(zhì)藥物通過化學(xué)交聯(lián)作用或標(biāo)記后親和作用的方法連接于紅細(xì)胞上。
10.如權(quán)利要求9所述的蛋白質(zhì)藥物-紅細(xì)胞復(fù)合物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)藥物-紅細(xì)胞復(fù)合物為生物素或鏈霉親和素標(biāo)記的水蛭素、尿激酶、鏈激酶、尿激酶原或蝮蛇抗栓酶與生物素標(biāo)記的紅細(xì)胞形成的蛋白質(zhì)藥物-紅細(xì)胞復(fù)合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用紅細(xì)胞作為載體延長蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)的半衰期的方法。此方法不僅可以延長藥物在體內(nèi)的半衰期，還可以降低藥物用量，防止藥物擴(kuò)散到血管外，從而降低藥品的副作用。本發(fā)明還涉及一種蛋白質(zhì)藥物－紅細(xì)胞復(fù)合物，該蛋白質(zhì)藥物以紅細(xì)胞為載體而被傳送至體內(nèi)。
文檔編號A61K38/55GK1628844SQ20031010948
公開日2005年6月22日 申請日期2003年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月17日
發(fā)明者倪健, 楊子義, 楊武劍 申請人:上海富純中南生物技術(shù)有限公司