專利名稱：1h－吲哚－2，3－二酮及其衍生物在制備治療貧血的藥物中的用途以及治療貧血的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物在制備治療貧血的藥物中的用途。
本發(fā)明還涉及一種治療貧血的、含有1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物的藥物。
背景技術(shù)：
胚胎的肝臟和成人的骨髓是生產(chǎn)紅細(xì)胞的主要器官，而紅細(xì)胞的產(chǎn)生受促紅細(xì)胞生成素(EPO)的影響。沒有EPO，就沒有紅細(xì)胞的生成。EPO與造血干細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合，使受體雙體化，激活細(xì)胞內(nèi)信息傳導(dǎo)通道，導(dǎo)致紅細(xì)胞生命延長，分化加速。EPO是一種糖蛋白；在人體內(nèi)，幾乎90％的EPO是由腎臟產(chǎn)生的，其余的部份產(chǎn)生于肝臟。腎小管細(xì)胞對體內(nèi)氧的含量十分敏感，體內(nèi)含氧量的降低，可通過腎小管細(xì)胞把信號(hào)傳導(dǎo)給分泌EPO的腎臟細(xì)胞，增加EPO的合成與分泌，進(jìn)而引起骨髓造血的增加。這個(gè)反遺調(diào)節(jié)環(huán)路，保持體內(nèi)紅細(xì)胞量的穩(wěn)定與平衡，確保血液帶氧功能的完善。
當(dāng)EPO與其受體結(jié)合后，最先被激活是EPO受體的磷酸化。磷酸化的EPO受體吸引其他信息傳導(dǎo)蛋白(如STAT5、P13 P85和SHP.1)與其符合，激活一系列的信號(hào)傳遞和細(xì)胞生物變化。
造血干細(xì)胞的生存及凋亡的平衡對體內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定至關(guān)重要。沒有象EPO這樣的生長因子的支持，紅細(xì)胞的凋亡就會(huì)加速。許多蛋白參與紅細(xì)胞凋亡過程的調(diào)節(jié)，其中包括Bcl-2家族的一些主要蛋白。
EPO基因位于第7對染色體上。腎臟是體內(nèi)主要合成EPO的器官。腎衰竭的病人，由于缺乏足夠量的EPO，常會(huì)發(fā)生貧血，需要補(bǔ)充外源性的EPO。接受骨髓抑制治療的腫瘤病人或者艾滋病人都會(huì)有貧血，需要EPO的治療。
根據(jù)對EPO基因的了解，Amgen公司利用基因技術(shù)，人工合成Epoetin alfa蛋白，并于1983年在美國獲FDA批準(zhǔn)上市。Epoafinalfa可促激紅細(xì)胞生成，其效果與其劑量成正比。在治療初期每周可以提高紅細(xì)胞2％。
雖然Epoetin alfa是一種非常有效的治療貧血的藥物，但其價(jià)格昂貴，使用不方便。Epoetin alfa作為一個(gè)蛋白試劑必須經(jīng)皮下和靜脈注射給藥。為了防止粘附在輸液管上，Epoetin alfa給藥時(shí)，靜脈皮管中必須有血。注射藥物之后，管子還應(yīng)該用生理水沖洗。Epoetin alfa的存放也不放便，必須放在2-8度的冰箱里，但不能冰凍；其在冰箱中儲(chǔ)存時(shí)間約為20天。
由于EPO是蛋白試劑，口服會(huì)造成蛋白質(zhì)被胃腸道的酶所水解，因而必須經(jīng)皮下或靜脈注射給藥，同時(shí)蛋白質(zhì)容易變性，容易滋生細(xì)菌，不易貯存。
為了發(fā)展新一代的促紅細(xì)胞生成素，研究人員做了大量的工作，并取得可喜的進(jìn)展。其中，最引人注目的是小分子藥物的開發(fā)，這些小分子具有EPO類似的藥理作用。在某些研究人員在篩選了許多克隆后，最近發(fā)展出一種小分子的多肽，這種多肽分子與EPO蛋白結(jié)構(gòu)上并沒有關(guān)連。但是這種多肽與EPO受體的結(jié)合相對較弱，作用也比較差。同時(shí)作為一種多肽，很難將其制成口服藥品。因此，研制一種能口服的小分子化合物是研究治療貧血藥物的發(fā)展方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可以用于制備治療貧血的小分子藥物，該藥物可以制成多種劑型，尤其是可以制成口服藥品，以方便給藥。
本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過了對上千個(gè)化合物的篩選，最后得到了少數(shù)幾個(gè)具有刺激紅細(xì)胞生成的藥理作用的化合物，它們是1H-吲哚-2，3-二酮(或叫靛紅)和/或其衍生物。其中，1H-吲哚-2，3-二酮(其英文名稱是Isatin或1H-Indole-2，3-dione或2，3-Indolinedione或Indole-2，3-dione)的分子式為C8H5NO2，其化學(xué)結(jié)構(gòu) 1H-吲哚-2，3-二酮的分子量為147.133，融化溫度為203℃，水溶性為1.53E+004。
本發(fā)明中，1H-吲哚-2，3-二酮的衍生物優(yōu)選采用一種或幾種具有如下結(jié)構(gòu)式的化合物 與EPO蛋白試劑相比，1H-吲哚-2，3-二酮及其衍生物具有分子量小、耐酸、耐堿、可制成口服制劑、成本低、便于使用和貯存的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明中，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物的治療貧血作用是指1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物的紅細(xì)胞生成促激作用。我們通過快速篩選方法(RAA法)對化合物進(jìn)行篩選，從而得到了具有紅細(xì)胞生成促激作用的化合物1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物，并通過RAA法、MTT法、CALCEIN法、DNA降解方法和活細(xì)胞計(jì)數(shù)法(trypan蘭染色法)對1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物的紅細(xì)胞生成的促激作用進(jìn)行了檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)證明(1)1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物具有與EPO相同的刺激紅細(xì)胞生成的作用，這種作用是通過抑制UT7/EPO細(xì)胞的凋亡而實(shí)現(xiàn)的；(2)1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物同EPO有很強(qiáng)的協(xié)同作用，當(dāng)1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物與EPO同時(shí)使用時(shí)，即使EPO的用量大大減少，仍可以達(dá)到同樣的效果；(3)1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物促進(jìn)紅細(xì)胞生成的作用是專一的，它對其它類的細(xì)胞的生長和增殖沒有明顯的不利影響。
由于1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物是小分子的化合物，因而在本發(fā)明中，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物可以制成口服液、片劑、膠囊劑、顆粒劑、注射劑、注射用無菌粉末、噴霧劑、栓劑或其它任何方便的制劑形式。
優(yōu)選地，可以將1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物制成口服液、片劑、膠囊劑、顆粒劑等口服制劑。
更優(yōu)選地，可以將1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物制成口服液。
將1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物制成口服制劑的原因在于口服制劑具有使用方便、安全、有效、適宜常溫下長期貯存的優(yōu)點(diǎn)。而口服液是各種口服制劑中最容易被機(jī)體吸收利用的，不像片劑等口服劑型，受崩解度和溶出度的限制。作為一種小分子的化合物，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物具有優(yōu)良的耐酸耐堿性質(zhì)，不易受胃腸道PH值條件的影響。因此，1H-引哚-2，3-二酮和/或其衍生物可以制成口服制劑。此外，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物的水溶性為1.53E+004，具有良好的水溶性，口服后可以迅速被機(jī)體所吸收利用，可以制成口服液。
本發(fā)明的口服液中，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物可以溶于蒸餾水、去離子水和/或生理鹽水中，或者制成其乳化液。該口服液中還可以含矯味劑、抗氧劑和/或抑菌劑。如果口服液配方中含有易氧化的成份，優(yōu)選加入抗氧劑。其中，抗氧劑可以選自亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、硫脲和維生素C中的一種或幾種；矯味劑可以是蔗糖、蜜糖、山梨醇、甘露醇等甜味劑，也可以是薄荷揮發(fā)油等芳香劑；抑菌劑可以是尼泊金類、苯甲酸、山梨酸等。在使用尼泊金類時(shí)，尼泊金乙酯與尼泊金丙酯或丁酯合用效果較好，其比例和用量優(yōu)選為乙丙混合物(1∶1)或乙丁混合物(1∶1)，其用量優(yōu)選為0.01％-0.25％。
本發(fā)明口服液中還可以含有著色劑等其他藥用物質(zhì)。加入著色劑的目的是為了改變口服液的顏色，使病人樂于接受。所加入的著色劑必須是可作內(nèi)服制劑的著色劑，可以是天然色素和/或合成色素。
本發(fā)明中1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物的各種劑型的配方中除了含有1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物外，還可以加入對治療貧血起輔助作用的藥用動(dòng)植物成分，組成復(fù)方制劑。這些藥用動(dòng)植物成分可以是阿膠、紅棗、大棗、黨參、當(dāng)歸、人參、白術(shù)、白芍、熟地黃、何首烏、紫河車、茯苓、黃芪、鹿角膠、龜板膠、半夏、枸杞子、炙雞內(nèi)金、六曲、木香、砂仁、白術(shù)、陳皮、炒棗仁、炙甘草、甘草、附子、大腹皮、厚樸、補(bǔ)骨脂、菟絲子、肉桂中的一種或幾種。優(yōu)選為加入阿膠、紅棗、當(dāng)歸、黨參、熟地黃、黃芪、白術(shù)、枸杞子中的一種或幾種，或者是其中一種或幾種成分的提取物。其中，阿膠具有補(bǔ)血滋陰、潤燥、止血的功效，其藥理作用優(yōu)于鐵劑，是最常用的補(bǔ)血藥物之一。
在既含1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物又含藥用動(dòng)植物成分的劑型中優(yōu)選為口服液。原因是藥用動(dòng)植物的成分復(fù)雜，注射易產(chǎn)生不良反應(yīng)。因此通常不宜制成注射液，而制成口服劑型。在各種口服劑型中，將1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物和藥用動(dòng)植物成分制成復(fù)方口服液，更有利于藥物的吸收利用。
本發(fā)明中，制備1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物的口服液的方法主要包括以下的步驟藥物的稱量、溶解和過濾。配方中的附加劑或溶解度小的藥物，應(yīng)事先將其溶解于溶劑中，再加入其它藥物使之溶解。如果在制劑中加入了溶解緩慢的藥物，則在溶解前需要采取粉碎、攪拌、加熱等措施。制備的溶液應(yīng)過濾，并通過濾器加溶劑至全量，過濾可用普通濾器、垂熔玻璃濾器以及沙濾棒等。
對于含藥用動(dòng)植物成分的復(fù)方口服液的制備，優(yōu)選先對藥用動(dòng)植物成分進(jìn)行提取和過濾。提取的方法有水提醇沉法、乙醇提水沉法、煎煮法、浸漬法與滲漉法等。過濾常需加入助濾劑，常用的助濾劑有滑石粉、紙漿、活性炭。濾器有垂熔玻璃濾器和沙濾棒等。
與Epoetin alfa相比，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物更容易被病人接受。1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物作為一種口服藥，治療過程簡單，特別是對輕型的貧血病人更易被接受。因而，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物在植被治療貧血藥物方面，具有非常具大的潛在市場。1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物作為EPO的協(xié)同劑，也具有潛在市場，特別對一些嚴(yán)重貧血反復(fù)使用Epoetin alfa或者反復(fù)輸血的貧血病人，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物可以幫助病人維持一定的紅細(xì)胞水平，減少Epoetin用量或輸血量。
本發(fā)明的1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物將是第一個(gè)用于治療貧血的口服藥物。目前，所有接受EPO注射治療的貧血病人基本上都可以使用口服1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物。另外許多輕度貧血的病人并不需要EPO注射治療，可使用口服1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物。由于這些病人體內(nèi)有內(nèi)源性的EPO激素，而1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物與EPO之間的有協(xié)同作用，他們只要口服1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物，就能保持正常的紅細(xì)胞數(shù)量。
適用于1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物治療的病人有如下幾種a.慢性腎功能衰竭的貧血病人美國有100萬慢性腎功能衰竭的病人，其中三分之一病人患有貧血。在沒有Epoetin alfa以前，這些病人依賴輸血。這些病人非常疲乏，虛弱，甚至影響到普通生活起居和正常腦思維。隨著時(shí)間的推移，病人也會(huì)出現(xiàn)心血管病狀。然而1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物作為一種口服的促紅細(xì)胞生成素進(jìn)入市場，將對這些貧血病人的治療產(chǎn)生第二次革命性的變化，給他們帶來福音，改善他們的生活質(zhì)量。
b.接受化療的腫瘤病人在美國每年有超過100萬腫瘤病人，而世界上每年有800萬人被診斷為腫瘤病人。不管是化療或者放療，許多腫瘤病人都會(huì)因疾病本身或是治療的副作用而貧血?，F(xiàn)在大多數(shù)病人都接受Epoetin alfa治療貧血。一旦1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物進(jìn)入市場，作為一種口服藥物，更方便于病人，而且對Epoetin有很強(qiáng)的協(xié)同作用。
c.艾滋病的病人(AIDS)艾滋病人也會(huì)出現(xiàn)貧血?？共《舅幬镆矔?huì)導(dǎo)致貧血，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物將會(huì)幫助這類病人改善貧血癥狀。
d.由其他原因造成的貧血。
以下結(jié)合實(shí)施例，來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例，任何在本發(fā)明基本精神上的改進(jìn)或替代，仍屬于本發(fā)明權(quán)利要求書中所要求的保護(hù)范圍。


圖1顯示了EPO對UT7/EPO細(xì)胞凋亡的抑制，圖中A為RAA法測量細(xì)胞凋亡；B為DNA降解法測量細(xì)胞凋亡。
圖2顯示了1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物對UT7/EPO細(xì)胞凋亡的抑制，圖中A為RAA法；B為Calcein法。
圖3顯示了1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物與EPO對UT7/EPO細(xì)胞凋亡抑制的協(xié)同作用，圖中A為RAA法；B為Calcein法。
圖4顯示了EA-4和EA-5對MO7細(xì)胞的凋亡的抑制作用。
圖5顯示了1H-吲哚-2，3-二酮衍生物4(EA-4)與EPO對JAK2磷酸化的影響，圖中A為EA-4引起與JAK2有關(guān)的EPO受體的磷酸化；B為EA-4引起與JAK2有關(guān)的EPO受體的磷酸化發(fā)生在5分鐘以后。
圖6顯示了1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物與EPO對EPO受體與STAT5磷酸化的影響。
圖7顯示了EA-5與EPO對Caspase蛋白表達(dá)的影響(Westernblot)。
圖8顯示了1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物與EPO對BCL-2家族蛋白表達(dá)的影響(Western blot)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物對紅細(xì)胞生成的促激作用為了能夠在短期時(shí)間內(nèi)篩選上千個(gè)化合物，必須擁有一種快速篩選的實(shí)驗(yàn)方法(RAA法)。由于沒有現(xiàn)存的酶學(xué)法或化學(xué)方法可借使用，因此我們采用了生物方法。選用UT7/EPO細(xì)胞。UT7/EPO細(xì)胞起源于UT7細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)表達(dá)EPO受體。其生存與生長必須依賴外源性的EPO支持。如果沒有EPO支持，UT7/EPO細(xì)胞就會(huì)死亡，細(xì)胞的凋亡就會(huì)增加(見圖1)。利用UT7/EPO細(xì)胞的這一特點(diǎn)，我們發(fā)展出一種快速測定細(xì)胞凋亡的方法(RAA)。如果篩選的化合物具有紅細(xì)胞生成的促激作用，UT7/EPO細(xì)胞的凋亡率就會(huì)減少。
試驗(yàn)中，我們采用了如下方法來檢驗(yàn)1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物紅對細(xì)胞生成的促激作用A、RAA一種本發(fā)明開發(fā)的測量細(xì)胞調(diào)亡的新方法B、MTT一種常用的測量細(xì)胞生存和增生的方法C、CALCEIN檢測法用來檢測細(xì)胞生長D、DNA降解方法(DNA Ladder Assay)用來測試細(xì)胞調(diào)亡E、活細(xì)胞計(jì)數(shù)法(trypan蘭染色法)用來測量細(xì)胞增生。
試驗(yàn)顯示(1)增高1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物的濃度，可以逐步提高對UT7/EPO細(xì)胞凋亡的抑制作用(見圖2中A和B)；(2)如果1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物與EPO合用，只需要較低的EPO濃度就能取得高濃度EPO的效果(見圖3)，顯示EPO與1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物對紅細(xì)胞生成的刺激作用具有協(xié)同作用。
上述實(shí)驗(yàn)說明，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物具有刺激UT7/EPO細(xì)胞增長的生物活性。1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物的作用的似乎比EPO弱。其IC50各個(gè)1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物化合物不同。藥效最強(qiáng)的1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物，IC50在10uM左右。1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物與EPO對刺激EPO受體具有協(xié)同作用。
實(shí)驗(yàn)還證明，采用低濃度的1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物同EPO一起來誘導(dǎo)紅細(xì)胞生成，可達(dá)高濃度EPO同樣的刺激作用。絕大多數(shù)貧血病人，體內(nèi)仍有EPO，僅僅口服1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物，就足夠誘導(dǎo)病人紅細(xì)胞生成，改善貧血。對那嚴(yán)重缺乏EPO而貧血的病人，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物可提高促紅細(xì)胞生成素的作用，減少Epoetin的用量。更重要的是，大多數(shù)的貧血病人也許僅需用口服1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物即可維持體內(nèi)紅細(xì)胞的水平，而減少對輸血或注射Epoetin的需求。
實(shí)施例2 1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物刺激紅細(xì)胞生成的特異性研究試驗(yàn)表明，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物只對UT7/EPO細(xì)胞的調(diào)亡具有抑制作用(見表1)，而對以下的其它細(xì)胞的凋亡沒有抑制作用(見圖4)A、由melphalan引起RPMI 8266細(xì)胞的凋亡；B、由melphalan引起新鮮分離的外周單核細(xì)胞的凋亡；C、由GM-CSF撕離后引起的MO7細(xì)胞的凋亡。
因此，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物對EPO受體的作用是十分特異的，它對其他類細(xì)胞的生長和增殖沒有任何影響。它只是對EPO受體起作用，促使細(xì)胞生長。它對其它c(diǎn)ytokine和生長因子的受體無效。在這一點(diǎn)上，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物的生物作用與EPO很像。
表11H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物(EA)對EPO撤除后引起的UT7/EPO細(xì)胞凋亡和GM-CSF撤除引起的MO7E細(xì)胞凋亡的作用的比較GM-CSF-撤除后EPO-撤除后EA處MO7E細(xì)胞UT7/EPO細(xì)胞RAA↓ -MTT↑ -Calcein↑ N.D.
DNA降解法 ↓ N.D.
活細(xì)胞數(shù)量(trypan blue stainiag) ↑ -實(shí)施例3 1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物刺激紅細(xì)胞生成機(jī)理的研究為了進(jìn)一步探索1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物促進(jìn)紅細(xì)胞生成的作用機(jī)理，我們從以下幾方面進(jìn)行了研究(1)如前所述，紅細(xì)胞生成素(EPO)與EPO受體結(jié)合使受體磷酸化，從而激活紅細(xì)胞生成途徑。1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物對UT7/EPO細(xì)胞的調(diào)亡有抑制作用。1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物促進(jìn)紅細(xì)胞生成可能是通過激活EPO受體而取得的。隨后，我們通過檢測EPO受體磷酸化實(shí)驗(yàn)，證實(shí)1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物能增加EPO受體的磷酸化而激活EPO受體。該激活作用與JAK-2有關(guān)(見圖5A和B)。然而，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物磷酸化EPO受體與EPO激活EPO受體有所不同。EPO能刺激游離的和結(jié)合的JAK-2磷酸化，而1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物只刺激結(jié)合的JAK-2磷酸化。從時(shí)間上分析，二者也有所不同。EPO誘導(dǎo)EPO受體磷酸化起始于第1分鐘、5分鐘達(dá)到高峰，60分鐘即消失。而1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物誘導(dǎo)EPO受體磷酸化的作用開始比較慢，但持續(xù)時(shí)間長，維持1小時(shí)以上(見圖5B)。值得注意的是，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物具有增加EPO的磷酸化作用(圖5B)，這一協(xié)同作用提示，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物作用于EPO受體可能有另外途徑。
(2)由于1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物延長了EPO受體的磷酸化過程，有一種可能性是1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物具有降低或抑制磷酸酶的作用，但我們的實(shí)驗(yàn)提示，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物對磷酸酶沒有任何作用。
(3)如前所述，由EPO誘導(dǎo)EPO受體磷酸化是通過JAK-2信號(hào)傳遞系統(tǒng)，啟動(dòng)STAT5信號(hào)，從而促使紅細(xì)胞生成。細(xì)胞經(jīng)過1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物誘導(dǎo)后，我們檢測了STAT5磷酸化。結(jié)果完全出乎我們預(yù)料，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物并沒有引起STAT5磷酸化發(fā)生改變(見圖6)。從另一個(gè)角度考量，這一結(jié)果進(jìn)一步提示，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物促進(jìn)紅細(xì)胞生成具有同EPO不一樣的機(jī)理。
(4)最近研究提示，EPO誘導(dǎo)EPO受體，部分通過MAPK信號(hào)傳遞系統(tǒng)?？墒牵谖覀兊膶?shí)驗(yàn)中，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物并不能激活MAPK信號(hào)傳遞系統(tǒng)。
(5)Caspase代表著導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的最后一步。我們做了一系列Caspase2-8的表達(dá)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物并不能抑制Caspase的表達(dá)(見圖7)。
(6)BCL2在細(xì)胞調(diào)亡過程中起了關(guān)鍵的作用。BCL-2根據(jù)其作用分為二類，一類為促進(jìn)細(xì)胞凋亡，另一類則抑制細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步探討1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物的作用機(jī)理，我們也檢測了BCL2、BAX、BCLX1在UT7/EPO細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。結(jié)果顯示，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物對BCL都沒有作用(圖8)。
(7)為了深入研究1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物的紅細(xì)胞生成的促激作用機(jī)理，我們檢測了一些細(xì)胞生長有關(guān)的蛋白，我們發(fā)現(xiàn)1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物可以提高C1P29、SET、STATHMIN這類蛋白量的活性，但這些蛋白并不是EPO受體有關(guān)的專一蛋白。這一結(jié)果再次提示，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物促進(jìn)紅細(xì)胞生成的機(jī)理可能與EPO不同。
實(shí)施例4 1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物口服液的制備取處方總量3/4量的溶劑(如蒸餾水)，加入稱好的1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物和蔗糖，攪拌使其溶解或乳化，加入尼泊金乙酯，攪拌使其溶解。然后用垂熔玻璃濾器過濾，并通過濾器加溶劑至全量。對濾液進(jìn)行質(zhì)量檢查。最后，分裝、密封、貼標(biāo)簽及進(jìn)行外包裝。
實(shí)施例5 含1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物與藥用動(dòng)植物成分的復(fù)方口服液取處方總量3/4量的溶劑，加入稱好的1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物、阿膠、蜂蜜，攪拌使其溶解，加入苯甲酸攪拌使其溶解。然后用垂熔玻璃濾器過濾，并通過濾器加蒸餾水至全量。對濾液進(jìn)行質(zhì)量檢查。最后，分裝、密封、貼標(biāo)簽及進(jìn)行外包裝。
權(quán)利要求
1.1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物在制備治療貧血的藥物中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物是選自于如下結(jié)構(gòu)式所示化合物中的一種或幾種
3.一種治療貧血的藥物，其特征在于，所述的藥物中含有1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物。
4.一種治療貧血的藥物，其特征在于，所述的1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物是選自于如下結(jié)構(gòu)式所示化合物中的一種或幾種
5.如權(quán)利要求3或4所述的藥物，其特征在于，所述的藥物是口服液、片劑、膠囊劑、顆粒劑、注射劑、注射用無菌粉末、噴霧劑或栓劑。
6.如權(quán)利要求5所述的藥物，其特征在于，所述的藥物是口服液。
7.如權(quán)利要求3或4所述的藥物，其特征在于，所述的藥物中還含有對治療貧血起輔助作用的藥用動(dòng)植物成分。
8.如權(quán)利要求7所述的藥物，其特征在于，所述的藥用動(dòng)植物成分是選自于阿膠、紅棗、大棗、黨參、當(dāng)歸、人參、白術(shù)、白芍、熟地、何首烏、龍眼、紫河車、茯苓、黃芪、鹿角膠、龜板膠、半夏、枸杞子、炙雞內(nèi)金、六曲、木香、砂仁、白術(shù)、熟地、陳皮、炒棗仁、炙甘草、甘草、附子、大腹皮、厚樸、補(bǔ)骨脂、菟絲子、肉桂中的一種或幾種，或其一種或幾種成分的提取物。
全文摘要
本發(fā)明公開了1H－吲哚－2，3－二酮和/或其衍生物在制備治療貧血的藥物中的用途以及含有1H－吲哚－2，3－二酮和/或其衍生物的藥物。本發(fā)明的藥物可以制成口服劑，便于給藥。
文檔編號(hào)A61K31/4439GK1605339SQ20031011172
公開日2005年4月13日 申請日期2003年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月9日
發(fā)明者伍勝, 楊洪浩, 陳海銘, 孫大力 申請人:孫大力