專利名稱：腫瘤基因開關藥物的制作方法
技術領域：
腫瘤治療藥物。
背景技術：
從分子水平來看，腫瘤是涉及多基因活動異常的疾病，每種組織癌變或每種細胞表型都涉及數十乃至數百種基因活動。把哪個基因作為治療靶點仍不明確。但現在已初步明晰，腫瘤的發(fā)生是多步驟多階段進行的。與某一細胞表型相關基因群的活動是按時空有序進行的，有級聯式表達規(guī)律，處于級聯式下游的功能基因的活動是受上游的調控基因所控制。因此，通過改變上游的調控基因的活動異常，仍可以控制整個下游基因群的活動，進而使細胞表型從惡性表型恢復至良性表型，達到治愈腫瘤的目的。
上游的調控基因即是表達細胞核因子(DNA結合蛋白)的基因，包括腫瘤發(fā)生相關的原癌基因和抑癌基因。由于某些外界因素作用下，原癌基因激活而過度表達和抑癌基因的失活。即調控基因發(fā)生失控紊亂，本身表達調控失常，并引發(fā)其他下游基因調控及表達失常的連鎖反應，導致腫瘤發(fā)生，因此，原癌基因、抑癌基因是腫瘤基因治療的重要靶點。
腫瘤細胞一個特征是原癌基因過度表達，其中c-myc在髓性白血病、B淋巴瘤、T淋巴瘤、肉瘤等多種腫瘤均有高表達，并在白血病、乳腺癌、胃癌、小細胞肺癌、結腸癌、神經細胞瘤、膠質母細胞瘤、視網膜母細胞癌均有不同程度的擴增。在人肝癌細胞低甲基化引起過度表達。c-fos在骨肉瘤、淋巴瘤等過度表達。c-jun在小細胞性肺瘤和非小細胞性肺癌、結腸直腸癌高表達。在腫瘤的啟動、促瘤階段，有c-myc、c-jun的高表達(與腫瘤發(fā)生有關)。
腫瘤細胞另一特征失去細胞周期特異性，失去對細胞增殖信號的反應能力，而c-myc過度表達是細胞增殖的前提之一。MYC-MAX異二聚體結合于E-box，激活本身及下游通訊基因CYC25A等表達，形成細胞增殖表型，并與E2F共同作用，激活cyclinA、cyclin E，在細胞周期中G1→S期的轉化是起關鍵作用。c-myc還可活化端粒酶的表達，在促進腫瘤形成上起重要作用。c-jun和c-fos在RAS信號傳導途徑的下游核相中起重要作用。(被稱為早期快速反應基因或第三信使)。c-myc和c-fos在細胞分化中起重要作用。此外，c-myc、c-fos、c-jun在細胞凋亡、基因組穩(wěn)定、細胞成熟中有重要作用。因此，改變c-myc、c-fos、c-jun的調控異常，從而可以改變惡性增殖表型為良性表型，原癌基因和抑癌基因在正常細胞和腫瘤細胞同時存在，不同的是兩類細胞中的表達程度不同，腫瘤細胞是原癌基因過度表達，是正常細胞的2～10倍，且抑癌基因失活。這說明基因的表達調控出現了異常，這種異常是基因的調控區(qū)上順反式因子結合狀態(tài)及數量的發(fā)生了改變，如何消除這種異常，改變基因調控狀態(tài)，目前世界上有一種新的策略即轉錄因子“誘餌”(decoy)的方法，用特異性的DNA序列結合轉錄調控因子(包括原癌基因上增強子上的轉錄激活因子和抑癌基因沉默子上的轉錄抑制因子)，改變調控基因的表達狀態(tài)，從而改變細胞表型。
人們在DNA與蛋白質相互作用關系的基礎研究中，已發(fā)現并證實體外合成一段序列特異的短鏈DNA，可與細胞核蛋白提取物中某一種因子結合，在聚丙烯酰胺電泳中產生凝膠阻抑現象，為現在decoy核酸發(fā)展成為藥物提供了實驗基礎。自從90年代來，Bielinska(1990)提出用雙鏈寡聚核酸調控基因表達以來，decoy核酸已首先用于在治療心血管藥物開發(fā)，用E2F因子的decoy核酸治療靜脈搭橋術后血管的內膜增生(Mann.et al1999)已進入臨床，用NF-Kappa β的decoy核酸防治心肌梗塞(Sawa.1997.Tounita.1998)，還有AGE、SRF的decoy核酸等。decoy核酸應用于腫瘤治療剛處于起步階段，如CREB因子的decoy核酸(Cho-chong 1999)已在多種腫瘤細胞株及動物模型開展。ER的decoy核酸(PivaR et al 2000)用于抑制乳腺癌細胞生長。NF-Kappa β的decoy核酸(Sharma.HW etal)在小鼠纖維瘤體內外試驗取得一定抑制效果。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一是提供腫瘤基因開關藥物，其特征是一系列序列特異的decoy核酸，可特異性結合各自轉錄調控因子。下調過度表達的癌基因c-fos、c-jun、c-myc，從而抑制腫瘤細胞的惡性增殖，達到治療腫瘤的目的。
本發(fā)明的另一目的是提供含有本發(fā)明decoy核酸藥物組合物。
本發(fā)明的另一目的是本發(fā)明decoy核酸用于制備抗腫瘤藥物的用途。
本發(fā)明的目的可以通過以下措施來達到腫瘤基因開關藥物的設計是將轉錄因子特異結合的序列作為藥物decoy核酸的核心序列，并適當增加核心序列的側翼長度，使其易形成空間結構，以加強藥物的穩(wěn)定性及與靶因子的親和力。
藥物KGCD101A系列是為調控原癌基因C-FOS的過度表達而設計的。根據原癌基因C-FOS的調控區(qū)結合了多個因子，如SRF、CREB、AP-1、SIF因子等，其中CREB因子的結合位點CRE增強子序列STGACGTMR(序列1)作為藥物decoy核酸的核心序列，競爭結合CREB，下調原癌基因C-FOS的表達。例如藥物KGCD101a(序列6)由34個核苷酸組成，含此核心序列，并具有發(fā)夾結構。另如藥物KGCD101a-1也可以是由含此核心序列的序列7和序列8組成，48個核苷酸，兩個序列結合成雙鏈過程中形成十字形結構。藥物KGCD101a-2是由序列7與序列9形成T形結構。總之，這類decoy核酸藥物，可以設計為以STGACGTMR為核心序列，核苷酸總數為15-55個。并易形成發(fā)夾、假結、莖環(huán)、啞鈴、十字多種二級結構的短鏈DNA分子。
藥物KGCD101B和KGCD101C系列是為調控多種原癌基因而設計的。FOS-JUN形成異源二聚體，成為AP-1轉錄激活因子，其結合于多個基因的順式元件STGASTMA(序列2)上，激活多種基因的表達。采用該序列為藥物decoy核酸的核心序列，下調含AP-1增強子基因的表達，從而抑制腫瘤細胞的生長。例如藥物KGCD101b由序列10和序列11構成的，含此核心序列，核苷酸總數為42個的雙鏈DNA分子。藥物KGCD101b-1(序列12)，有35個核苷酸并含此核心序列，具有發(fā)夾結構。藥物KGCD101b-2(序列13)有42個核苷酸并含此核心序列，具有啞鈴結構，可用連接酶使5′和3′端連接成閉環(huán)，以增加藥物穩(wěn)定性。藥物KGCD101C由序列14和序列15組成，其核苷酸總數為42個，含此核心序列，具有十字形結構。藥物KGCD101c1由序列16和序列17組成，其核苷酸總數為44個，含此核心序列，具有十字形結構。總之，這類decoy核酸藥物，可以設計為以STGASTMA(序列2)為核心序列，核苷酸總數為15-55個‘并易形成發(fā)夾、假結、莖環(huán)、啞鈴、十字多種二級結構的短鏈DNA分子。
藥物KGCD102系列是為調控原癌基因c-jun而設計的。根據c-jun自身活化表達的作用。c-jun蛋白結合自身基因的增強子序列TTACCTCA(序列3)，該序列作為藥物KGCD102系列的decoy核酸的核心序列，下調c-jun表達。例如藥物KGCD102(序列18)為含此核心序列，核苷酸總數為37個，具有發(fā)夾結構的此類decoy核酸藥物之一。另有藥物KGCD102-1(序列19)為40個核苷酸，具有發(fā)夾結構。藥物KGCD102-2(序列20)為38個核苷酸，具有啞鈴結構。藥物KGCD102-3(序列21和序列22)為54個核苷酸，具有莖環(huán)結構。總之，這類decoy核酸藥物，可以設計為以TTACCTCA(序列3)為核心序列，核苷酸總數為15-55個，并易形成發(fā)夾、假結、莖環(huán)、啞鈴、十字多種二級結構的短鏈DNA分子。
藥物KGCD103a系列是為調控原癌基因C-MYC而設計的。根據C-MYC與自身增強子TCTCTTA(序列4)序列結合，將此核心序列作為decoy核酸藥物的基本組成，下調C-MYC基因表達。例如藥物KGCD103a由序列23和序列24形成的雙鏈DNA組成，52個核苷酸含此核心序列。藥物KGCD103a-1(序列25)有含此核心序列的35個核苷酸，發(fā)夾結構。藥物KGCD103a-2由序列26和序列27形成的莖環(huán)結構組成，43個核苷酸含此核心序列。藥物KGCD103a-3由序列28和序列29形成的錘形結構組成，36個核苷酸含此核心序列?？傊@類decoy核酸藥物，可以設計為以TCTCTTA(序列4)為核心序列，核苷酸總數為15-55個，并易形成發(fā)夾、假結、莖環(huán)、啞鈴、十字多種二級結構的短鏈DNA分子。
藥物KGCD103b是為調控控制細胞周期的相關基因而設計的。根據MYC-MAX異源二聚體促進細胞增殖，使細胞失去周期特異性，順式元件RACCACGTGGTY(序列5)作為decoy核酸的核心序列，體外合成并導入細胞，與基因本身的順式元件競爭結合MYC-MAX復合二聚體，抑制下游基因表達，改變惡性增殖表型。例如藥物KGCD103b(序列30)為32個核苷酸，含此核心序列。藥物KGCD103b-1由序列31和序列32形成的十字結構，47個核苷酸，含此核心序列。總之，這類decoy核酸藥物，可以設計為以RACCACGTGGTY(序列5)為核心序列，核苷酸總數為15-55個，并易形成發(fā)夾、假結、莖環(huán)、啞鈴、十字多種二級結構的短鏈DNA分子。
decoy核酸藥物經DNA全自動合成儀合成，硫代化，脫保護，純化和凍干，溶于水中，定量定性測定分析后，進行體外篩選和藥效試驗，用NCI-H460肺癌細胞作為篩選體系，將細胞加入96孔培養(yǎng)板，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，加入脂質體和上述decoy核酸，繼續(xù)于37℃，5％CO2中培養(yǎng)48h。用SRB比色法測定細胞的成活率。篩選結果表明六種decoy核酸對NCI--H460細胞都有不同程度的抑制作用，其中KGCD101a和KGCD102的抑制作用最大。這些decoy核酸都可開發(fā)成為抗腫瘤藥物。
本發(fā)明的優(yōu)點decoy核酸與反義核酸不同，結構上的差異為反義核酸為單鏈線性寡聚核酸，decoy核酸可形成雙鏈并具二級結構；作用位點的差異；反義核酸互補于基因的轉錄產物mRNA的某段序列，decoy核酸結合于基因轉錄調控因子(蛋白質)上；用量上的差異一個拷貝基因轉錄出200～300條mRNA，且mRNA具有瞬時性，需反義核酸藥量大，而一個拷貝基因上轉錄調控因子僅1～數個，需decoy核酸藥量少。
因decoy核酸的核心序列在6～12個堿基對之間，鏈短易降解，雙鏈不穩(wěn)定，常溫下易解鏈。無二級空間結構不易與蛋白結合，因而設計藥物時需適當增加堿基，加長鏈長，增強穩(wěn)定性及與轉錄因子的親和性，其中以回文結構、發(fā)夾、十字、莖環(huán)、啞玲狀等結構最佳，因此decoy核酸被設計成含有上述核心序列的15～55堿基之間，可合成出單鏈，自交形成雙鏈及其二級結構，也可各合成兩條單鏈，雜交形成雙鏈。因核酸在細胞內極易被核酸酶降解失去活性，因此需修飾保護，以增強抗降解能力，提高穩(wěn)定性。硫代修飾為最常見的保護基團。
綜上所述，本發(fā)明所述的五類decoy核酸對腫瘤細胞均有抑制作用，在抗腫瘤藥物開發(fā)上有相當大的應用前景，本發(fā)明的decoy核酸藥物可以與藥用載體合，藥用載體包括生理鹽水等常用載體和緩沖液及脂質體、聚合物等。


圖1KGCD系列的decoy核酸對腫瘤細胞NCI-H460的生長抑制2KGCD101a和KGCD102 decoy核酸對各種細胞的生長抑制3KGCD101a和KGCD102 decoy核酸對腫瘤細胞NCI-H460的半致死劑量(IC50)圖如圖1所示將肺癌細胞株NCI-H460分為陽性對照組、陰性對照組、空白對照組和六種KGCD系列的decoy核酸實驗組，分別接種于含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中的96孔培養(yǎng)板，接種數量為2-3×104/孔，培養(yǎng)24小時后，更換成無血清培養(yǎng)液，空白對照組僅加入0.6μl/孔空脂質體，其余均加入0.6μl/孔脂質體和終濃度為200nM的不同decoy核酸，處理5小時后，更換成含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)48小時后，用SRB染色，酶標儀于λ510nm測定其OD值，并計算細胞存活率，以空白對照組數值為100％，作出細胞生長抑制圖。從圖1中可見CRE代表陽性對照組的試驗結果，C代表陰性對照組的試驗結果，其余的6組均為KGCD系列decoy核酸實驗組的試驗結果，這6組KGCD系列decoy核酸對NCI-H460細胞均顯示出不同程度的抑制作用，其中以KGCD101a和KGCD102的抑制率最高。
如圖2所示用KGCD101a和KGCD102 decoy核酸分別處理下述腫瘤細胞株NCI-H460(肺癌)，CNE(鼻咽癌)，U251(神經膠質瘤)，MCF-7(乳腺癌)，BEL-7402(肝癌)和正常細胞株L-02(肝細胞)和NIH3T3，最淺色柱體代表陰性對照組(錯配序列)，對各種細胞生長影響較小。而用KGCD101a和KGCD102 decoy核酸對各種腫瘤細胞生長均有不同程度的抑制作用，其中對U251(神經膠質瘤)和NCI-H460(肺癌)抑制最大，而對正常細胞株的生長影響較小。
如圖3所示用不同濃度的KGCD101a和KGCD102的decoy核酸處理腫瘤細胞NCI-H460，由圖可見KGCD101a和KGCD102在較低濃度的條件下對NCI-H460細胞有抑制作用，它們的半致死量為30～50nM，而陰性對照組則對細胞生長無劑量差異。
具體實施例方式實施例1 decoy核酸藥物的制備和分析合成六種下述硫代decoy核酸藥物KGCD101a(序列6)，KGCD101b(序列10和序列11)’KGCD101c(序列14和序列15)，KGCD102(序列18)，KGCD103a(序列23和序列24)，KGCD103b(序列30)。
陰性對照序列5’-TGTGGTCATGTGGTCATGTGTCA-3’陽性對照序列5’-TGACGTCATGACGTCATGACGTCA-3’使用美國PE公司應用生物系統(tǒng)部(Applied Biosystems)制造的391型DNA合成儀。以亞磷酰胺固相合成法合成硫代的所設計的decoy核酸。主要原料有四種二異丙基β-氰乙基亞磷酰胺單體腺苷(A)、鳥苷(G)、胞苷(C)、胸苷(T)，四種控制孔徑玻璃粉(CPG)固相合成柱(A，G，C，T)。合成規(guī)模為10微摩爾。蓋帽試劑分別為乙酸酐/二甲基吡啶/四氫呋喃和1-甲基咪唑/四氫呋喃，硫代反應試劑Beaucage試劑/乙腈，脫三苯甲基試劑三氯乙酸/二氯甲烷，液體溶劑乙腈和三氯甲烷。堿基單體溶于無水乙腈中，濃度為100毫摩爾，其它試劑濃度及用量均按照儀器手冊進行。合成過程由儀器本身程序控制。合成產物用濃氨水(29％)收集在密封耐壓的玻璃瓶中，于55℃處理15小時脫去核酸分子上各種堿基保護基團和氨基保護基團。脫保護結束后揮發(fā)脫去大部分氨氣，凍干得白色粉末狀粗品，重新溶于緩沖液中，用Pharmacia Source 30 Q層析及AKTA層析系統(tǒng)進行純化。純化樣品G-15分子篩葡聚糖凝膠層析柱除鹽，凍干，得白色絮狀核酸純品。儲存于-20℃取少量樣品進行分析用毛細管電泳法測其純度及分子量和高效液相層析法測純度均為90％以上，DNA測序法測定序列完全正確，核磁共振法測硫代化程度大于98.5％。
實施例2六種KGCD系列decoy核酸對肺癌NCI-H460細胞的生長抑制將肺癌細胞株NCI-H460分為陽性對照組、陰性對照組、空白對照組和六種KGCD系列的decoy核酸實驗組，分別接種于含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中的96孔培養(yǎng)板，接種數量為2-3×104/孔，培養(yǎng)24小時后，更換成無血清培養(yǎng)液，空白對照組僅加入0.6μl/孔空脂質體，其余均加入0.6μl/孔脂質體和終濃度為200nM的不同decoy核酸，處理5小時后，更換成含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)48小時后，用SRB染色，酶標儀于λ510nm測定其OD值，并計算細胞存活率，以空白對照組數值為100％，作出細胞生長抑制圖。從圖中可見CRE代表陽性對照組的試驗結果，C代表陰性對照組的試驗結果，其余的6組均為KGCD系列decoy核酸實驗組的試驗結果，這6種KGCD系列decoy核酸對NCI-H460細胞均顯示出不同程度的抑制作用，其中以KGCD101a和KGCD102的抑制率最高。
實施例3 KGCD101a和KGCD102 decoy核酸對各種細胞的生長抑制用KGCD101a和KGCD102 decoy核酸分別處理下述腫瘤細胞株NCI-H460(肺癌)，CNE(鼻咽癌)，U251(神經膠質瘤)，MCF-7(乳腺癌)，BEL-7402(肝癌)和正常細胞株L-02(肝細胞)和NIH3T3，最淺色柱體代表陰性對照組(錯配序列)，對各種細胞生長影響較小。而用KGCD101a和KGCD102 decoy核酸對各種腫瘤細胞生長均有不同程度的抑制作用，其中對U251(神經膠質瘤)和NCI-H460(肺癌)抑制最大，而對正常細胞株的生長影響較小。
實施例4藥物KGCD101a和KGCD102對NCI-H460細胞的半致死量(IC50)用不同濃度的KGCD101a和KGCD102(5-200nM)分別處理NCI-H460細胞，培養(yǎng)一定時間后，測其OD值。從如圖3可以看出，KGCD101a和KGCD102在較低濃度的條件下對癌細胞有抑制作用，它們的半致死量為30～50nM，即為30～50μg/ml，遠遠低于抗腫瘤藥物篩選的標準(IC50≤10μg/ml)。
實施例5含decoy核酸的藥物組合物作為動物和人類體內給藥的decoy核酸藥物組合物組成如下decoy核酸KGCD101b1mg/ml生理鹽水或磷酸緩沖液(PH 7.4)適量本發(fā)明其它幾種核酸也采用同樣配方。
序列表<110>葉青<120>腫瘤基因開關藥物<160>32<210>1<211>9<212>DNA
<213>人工序列<400>1stgacgtmr 9<210>2<211>8<212>DNA<213>人工序列<400>2stgastma 8<210>3<211>8<212>DNA<213>人工序列<400>3ttacctca 8<210>4<211>7<212>DNA<213>人工序列<400>4tctctta 7<210>5<211>12<212>DNA<213>人工序列<400>5
raccacgtgg ty 12<210>6<211>34<212>DNA<213>人工序列<400>6gcctgacgtc aggggacttt ccctgacgtc aggc 34<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>7gtttcgcggt gacgtcaccc tttc 24<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>8gaaagggacg tacgtccgcg aaac 24<210>9<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>9gaaaggcgcg aaac 14
<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>10cgcttgctga ctcagccgga a 21<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>11ttccggctga gtcagcaagc g 21<210>12<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>12gatcgtgact cagcgcgatt ttcgcgctga gtcac 35<210>13<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>13actctctcag tctgactcat gctctcagcatgagtcagac tg 42<210>14<211>21
<212>DNA<213>人工序列<400>14ctcaacctga ctcagaaccc t 21<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>15agggttcact cagtggttga g 21<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>16ccggggctga ctcaggggca a 21<210>17<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>17ttgcccctaa cggttagccc cgg 23<210>18<211>37<212>DNA<213>人工序列
<400>18ttacctcatt acctcagccc gtgaggtaat gaggtaa 37<210>19<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>19ttacctcatt acctcattac ctcatgaggt aatgaggtaa 40<210>20<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>20gagcccgtcg ttacctcatc agcccgtgat gaggtaac 38<210>21<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>21ttacctcatt acgtcattac gtcattacct ca 32<210>22<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>22tgaggtaatg ataatgaggt aa 22
<210>23<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>23tcaccatctc ttatgcggtt gaatag 26<210>24<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>24ctattcaacc gcataagaga tggtga 26<210>25<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>25tctcttatga ctaatctctt attagtcata agaga 35<210>26<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>26tctcttagct ctcttagcct ctctta 26<210>27
<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>27taagagaggc taagaga 17<210>28<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>28gagtctctta ctcccgcgg 19<210>29<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>29ccgcgggtct cttagac 17<210>30<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>30cacggaacga gaccacgtgg tctcgttccg tg 32<210>31<211>24<212>DNA
<213>人工序列<400>31ttctctgacc acgtggtcct cttc 24<210>32<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>32gaagaggctc tcttagcaga gaa 2權利要求
1 本發(fā)明涉及一種腫瘤基因開關藥物，該藥物的組成特征為一段序列特異的寡聚脫氧核糖核酸，其分子一級結構由含有STGASTMA核心序列的15-55個核苷酸組成，并可以通過自交或互交形成雙鏈、進而形成發(fā)夾、假結、莖環(huán)、啞鈴、十字多種二級結構，包括序列10-序列17。
2 權利要求1所述的腫瘤基因開關藥物，與其核酸分子具有70％及以上的同源序列。
3 根據權利要求1所述的腫瘤基因開關藥物，其特征是核酸的分子結構特征為具有硫基、甲基、酰胺基中任意一種基團修飾的磷酸二酯鍵。
4 根據權利要求1所述的腫瘤基因開關藥物，其特征是劑型包括注射、口服、直接外敷、轉染和轉基因。
5 權利要求1所述核酸序列組成的藥物組合物。
6 權利要求1所述核酸序列用于抗腫瘤制備用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及腫瘤基因開關藥物的是由一段序列特異的decoy核酸組成的藥物，此類核酸可在細胞內特異地結合某些癌基因的轉錄調控因子，阻抑這些癌基因的過度表達，從而抑制腫瘤細胞生長，可發(fā)展成為腫瘤基因治療的藥物。
文檔編號A61K31/7088GK1507873SQ200310113538
公開日2004年6月30日 申請日期2002年3月28日 優(yōu)先權日2002年3月28日
發(fā)明者葉青, 王雪根, 陳武領, 馮瑩, 葉 青 申請人:葉青, 葉 青