專利名稱：一種乙型干擾素IFN－β－cn及其突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的人IFN-β-cn干擾素蛋白及其突變體。
背景技術(shù)：
在急性病毒感染過程中，機(jī)體有不同的防御機(jī)制，包括細(xì)胞免疫、體液免疫以及干擾素系統(tǒng)、發(fā)熱等非特異性因子。但干擾素系統(tǒng)是目前所知的機(jī)體防御反應(yīng)中出現(xiàn)最早的，在感染的幾小時內(nèi)就起作用，所以稱其為第一線防御系統(tǒng)。大多數(shù)病毒或多或少地都對干擾素的抗病毒作用敏感，因而干擾素的抗病毒作用是廣譜的。當(dāng)干擾素系統(tǒng)在急性病毒感染時被激活后，動物可以在1～3周時間內(nèi)對其他病毒的重復(fù)感染有抵抗。保護(hù)性抗體比干擾素的出現(xiàn)要晚得多，一般在病毒感染發(fā)生后3天或更遲些時間出現(xiàn)于血清中，它是特異性地由病毒抗原所引起的，它也特異性地對相關(guān)抗原起作用?？贵w通過與病毒結(jié)合使其轉(zhuǎn)變?yōu)榉歉腥拘远l(fā)揮抗病毒作用。但是，由于抗體僅在血清和細(xì)胞外液中存在，故它對在細(xì)胞內(nèi)繁殖的病毒作用不大(Samuel C.，Clinical Microbiology Review，2001，14778-809)。
干擾素不是直接與靶分子發(fā)揮作用，而首先要與靶細(xì)胞表面的特異性受體相結(jié)合，通過信號傳遞，引發(fā)一系列特定的生化反應(yīng)，刺激細(xì)胞內(nèi)多種效應(yīng)蛋白質(zhì)分子合成。其中某些新合成的蛋白質(zhì)可以抑制病毒繁殖，從而發(fā)揮干擾素的功能。這些殺病毒蛋白包括RnaseL、PKR，MxProtein、ISG56、ADAR1/2、P200家族和RANTES。而其它新合成的蛋白質(zhì)可以提高機(jī)體免疫能力。它們包括MHC I/II、Interleukin-15和iNOS(Grandvaux N，et.al.，Current Opinion in Infectious Disease，2002，15259-267)。
干擾素是一種糖蛋白。目前所知，人的干擾素主要有α、β、γ、ω、г五個型號。其中，α、β、γ三種型號為主要的干擾素，因此，科學(xué)家對它們研究較多(Michael D.，BioTechniques，2001，33S58-S65)。一般認(rèn)為，兩種主要的病毒干擾素，即IFN-α和IFN-β，利用相同的信號傳遞網(wǎng)絡(luò)，引發(fā)一系列特定的生化反應(yīng)，刺激細(xì)胞合成相同效應(yīng)分子來對抗病毒。但是，近期研究結(jié)果顯示，IFN-α和β的信號傳遞網(wǎng)絡(luò)和所誘導(dǎo)的效應(yīng)分子也不完全相同。IFN-β的抗病毒功能經(jīng)過多年的研究已經(jīng)得到證實(Samuel C.，Clinical Microbiology Review，2001，14778-809)。如果將老鼠體內(nèi)的IFN-β基因切除，這樣的老鼠就對病毒失去抵抗力量，盡管體內(nèi)的所有IFN-α基因都正常。因此，IFN-β是機(jī)體防御病毒的必需部分，它的功能是IFN-α所無法取代的(Deonarain R，et.al.，J.Virology，2000，743404-3409)。其它研究也證明，IFN-α和IFN-β是干擾素防御系統(tǒng)中重要的組成部分，但它們功能和作用機(jī)制有區(qū)別。在用纖維肉瘤細(xì)胞所作的實驗中，有20多個效應(yīng)蛋白質(zhì)分子只能由IFN-β，而不是IFN-α，刺激細(xì)胞合成(Der SD，et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，9515623-15628)。其中之一是PKR，一種激酶，它的功能是抑制病毒蛋白合成且導(dǎo)致病毒感染細(xì)胞自殺。另一個例子為HIF-1α，它屬于轉(zhuǎn)錄因子，其功能是導(dǎo)致病毒感染細(xì)胞自殺。β-R1基因的表達(dá)也是由IFN-β控制的。它是一種趨化因子，其功能為調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫細(xì)胞的移動(Loetscher P，et.al.，J.Bio.Chem.，2001，2762986-2991)。在作用機(jī)制方面，IFN-β是通過受體α/βL傳遞信息的；而IFN-α主要是通過受體α/βS傳遞信息的(Platanias LC，et.al.，J.Bio.Chem.，1996，27123630-23633)。鑒于IFN-α和IFN-β的功能和作用機(jī)制有區(qū)別，且它們雖為防御病毒必需部分，但相互間又無法取代，這兩個干擾素對不同的病毒有不同的敏感性。比如，美國USAMRIID(U.S.Army Medical Research Institute of InfectiousDiseases)發(fā)現(xiàn)IFN-β能抑制SARS病毒繁殖，而其它干擾素卻不能。
IFN-β已在臨床上應(yīng)用于下列幾方面●治療多發(fā)性硬化癥，可以減少復(fù)發(fā)，延緩殘廢進(jìn)程(美國FDA網(wǎng)頁http//www.fda.gov/cber/products.htm)。
●治療病毒感染，包括丙型肝炎及相關(guān)肝癌(Alam J，CurrentOpinion in Biotechnology，1995，6688-691)。
●治療腫瘤，包括尖銳濕疣，腦癌和黑素瘤(Alam J，CurrentOpinion in Biotechnology，1995，6688-691)。
人體基因具有人種差異性，即不同人種間其基因序列會有差異。這種差異在生物治療上有重要意義，考慮到基因產(chǎn)品的生物活性，致免疫性及負(fù)作用，生物治療最好用源自同種人種的基因產(chǎn)品，然而，在已有技術(shù)中尚無源自中國人的IFN-β基因的人工合成制品及其突變體，也未見與此相關(guān)的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決至今尚無源自中國人的IFN-β基因的人工合成制品及其突變體，以致于在治療相關(guān)疾病中存在治療效果欠佳的問題，為此提供本發(fā)明的一種新的乙型干擾素IFN-β-cn及其突變體，本干擾素是用基因工程技術(shù)克隆了源自中國人的IFN-β基因，如此而命名為IFN-β-cn。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案其特殊之處在于其所含堿基序列及所推測的氨基酸序列為atg agc tac aac ttg ctt gga ttc cta caa aga agc agc aat ttt cag 48Met ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln1 5 10 15tgt cag aag ctc ctg tgg caa ttg aat ggg agg ctt gaa tac tgc ctc 96Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu20 25 30
aag gac agg atg aac ttt gac atc cct gag gag att aag cag atg cag 144Lys Asp Arg Met Ash Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Met Gln35 40 45cag ttc cag aag gag gac gcc gca ttg acc atc tat gac atg ctc cag 192Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln50 55 60aac atc ttt gct att ttc aga caa gat tca tct agc act ggc tgg aat 240Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Glu Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn65 70 75 80gag act att gtt gag aac ctc ctg gct aag gtc tat cat cag ata aac 288Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn85 90 95cat ctg aag aca gtc ctg gaa gaa aaa ctg gag aaa gaa gat ttc acc 366His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr100 105 110agg gga aaa ctc atg agc agt ctg cac ctg aaa aga tat tat ggg agg 384Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg115 120 125att ctg cat tac ctg aag gcc aag gag tac agt cac tgt gcc tgg acc 432Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu tyr Ser His Cys Ala Trp Thr130 135 140ata gtc aga gtg gaa atc cta agg aac ttt tac ttc att aac aga ctt 480Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu145 150 155 160aca gat tac ctc cga aac tga 501Thr Gly Tyr Leu Arg Asn165
其中，第47位氨基酸的密碼子的第一個堿基是A。
由此可以看出，IFN-β-cn的氨基酸序列和已發(fā)表的IFN-β的氨基酸序列不同在于第47位。IFN-β-cn的第47位是蛋氨酸，而IFN-β的第47位為亮氨酸。這一差別是由基因堿基序列不同而造成的。IFN-β-cn的第47位氨基酸的密碼子的第一個堿基是A；而IFN-β的第47位氨基酸的密碼子的第一個堿基是C。
為進(jìn)一步改善IFN-β-cn，本發(fā)明將其第17位的半胱氨酸改變?yōu)榻z氨酸，改良后的突變體命名為IFN-β-cn Ser17。其堿基序列及所推測的氨基酸序列為atg agc tac aac ttg ctt gga ttc cta caa aga agc agc aat ttt cag 48Met ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln1 5 10 15agt cag aag ctc ctg tgg caa ttg aat ggg agg ctt gaa tac tgc ctc 96Ser Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu20 25 30aag gac agg atg aac ttt gac atc cct gag gag att aag cag atg cag 144Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Met Gln35 40 45cag ttc cag aag gag gac gcc gca ttg acc atc tat gac atg ctc cag 192Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln50 55 60aac atc ttt gct att ttc aga caa gat tca tct agc act ggc tgg aat 240Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Glu Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn65 70 75 80gag act att gtt gag aac ctc ctg gct aag gtc tat cat cag ata aac 288Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
85 90 95cat ctg aag aca gtc ctg gaa gaa aaa ctg gag aaa gaa gat ttc acc 366His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr100 105 110agg gga aaa ctc atg agc agt ctg cac ctg aaa aga tat tat ggg agg 384Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg115 120 125att ctg cat tac ctg aag gcc aag gag tac agt cac tgt gcc tgg acc 432Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu tyr Ser His Cys Ala Trp Thr130 135 140ata gtc aga gtg gaa atc cta agg aac ttt tac ttc att aac aga ctt 480Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu145 150 155 160aca gat tac ctc cga aac tga 501Thr Gly Tyr Leu Arg Asn165從中可以看出，IFN-β-cn的第17位氨基酸的密碼子的第一個堿基T用定位突變法轉(zhuǎn)變?yōu)锳。與IFN-β-cn相比，IFN-β-cn Ser17的活性提高約10倍，且更容易分離純化，更穩(wěn)定，提高了它在臨床應(yīng)用的價值。
發(fā)明將IFN-β-cn和IFN-β-cn Ser17插入表達(dá)質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌，適合于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
本發(fā)明可以通過以下技術(shù)措施來實現(xiàn)為研究源自中國人的IFN-β基因，本發(fā)明從一位中國人體內(nèi)分離得到二倍體成纖維細(xì)胞。該細(xì)胞受Poly(I)·Poly(C)刺激以合成IFN-β-cn mRNA，然后將該細(xì)胞的mRNA分離。以所分離的mRNA為模板合成cDNA。再以cDNA為模板，用PCR方法將IFN-β-cn基因放大。放大后的基因用凝膠電泳分離，再用DNA重組技術(shù)將基因插入高效表達(dá)載體pTrp中。采用定位突變方法，把IFN-β-cn第17位的半胱氨酸改變?yōu)榻z氨酸，來獲得IFN-β-cn Ser17。分別將含有IFN-β-cn和IFN-β-cn Ser17基因的載體pTrp轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MM294中。含有表達(dá)載體的宿主MM294經(jīng)發(fā)酵來大量表達(dá)IFN-β-cn和IFN-β-cn Ser17蛋白。經(jīng)分離純化后，IFN-β-cn的比活性介于1.0-3.0×107IU/mg；IFN-β-cn Ser17的比活性介于1.0-3.5×108IU/mg。


圖1是質(zhì)粒載體pTrp-IFN-β-cn/pTrp-IFN-β-cn Ser17的結(jié)構(gòu)，該載體基于pBR322，外加大腸桿菌的trp啟動子(插入在EcoRI和ClaI之間)；IFN-β-cn或IFN-β-cn Ser17受trp啟動子控制。
圖2是IFN-β-cn Ser17的SDS-PAGE電泳膠圖。
圖3是IFN-β-cn Ser17的RP-HPLC色譜圖。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發(fā)明作詳細(xì)說明。
(一)、IFN-β-cn的制備步驟1二倍體成纖維細(xì)胞的分離二倍體成纖維細(xì)胞是從胎盤蛻膜中分離而得。胎盤蛻膜在不含鈣和鎂的Hanks’s Balanced Saline Solution(HBSS)中切成細(xì)片，然后在37℃的震蕩水浴中用0.5％的膠原酶和0.02％的脫氧核糖核酸酶降解20分鐘。將上層液于1500×g離心5分鐘后，沉淀混懸在HBSS中。混懸液先后用95微米和20微米的尼龍篩過濾。將濾液于1500×g離心5分鐘后，沉淀混懸在30％Percoll溶液中。該混懸液再慢慢加在60％Percoll溶液表面。于800×g離心30分鐘后，除掉上清液。沉淀細(xì)胞用PBS洗滌兩次后，混懸于RPMI-1640(無酚紅)+0.1mM丙酮酸鈉+100U/ml的青霉素+100微克/ml鏈霉素+10％FCS(無類固醇)。細(xì)胞在37℃及5％CO2中培養(yǎng)一夜，接種濃度為1×105個/cm2。第二天，換相同培養(yǎng)液，以后每三天換一次培養(yǎng)液。細(xì)胞長滿后，用trypsin+EDTA分養(yǎng)。細(xì)胞的純度用細(xì)胞免疫化學(xué)法測定(使用cytokeratin和vimentin的抗體)。細(xì)胞的純度大于95％。
步驟2刺激IFN-β-cn在二倍體成纖維細(xì)胞中合成二倍體成纖維細(xì)胞在含100微克/毫升Poly(I)·Poly(C)和50微克/毫升放線菌酮(Cycloheximide)的培養(yǎng)液中培養(yǎng)3小時后就可進(jìn)行RNA分離。
步驟3分離RNA用生理鹽水(PBS)清洗刺激過的二倍體成纖維細(xì)胞。將該細(xì)胞裂解于3.5-4.5毫升的異硫氰酸胍(4M)，冰上反應(yīng)15分鐘。在該裂解液中加入1.5-2.0毫升CsCl(5.8M)后，高速離心20小時，20-24℃，114000g。將沉淀的RNA溶解于TE緩沖夜，再用等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)萃取，混勻，離心，分離水相。向水相中加2倍體積的乙醇和1/10體積的乙酸鈉(3M，pH5.5)，混均，離心。將沉淀的RNA溶解于DEPC處理過的水。
步驟4cDNA的合成第一條cDNA鏈的合成使用如下反應(yīng)5-10微克上述RNA+1微克oligo(dT)+40mM焦磷酸鈉+30U AMV-RT+5微升10×反應(yīng)液(內(nèi)含dNTP)，用水稀釋總體積為50微升，37-48℃/15-60分鐘。
IFN-β-cn cDNA的擴(kuò)增使用如下PCR反應(yīng)0.01-0.1ng第一條cDNA鏈+0.1-1U Taq DNA聚合酶(Promega)+0.5-1.5mM MgCl2，+20-50mM每一個dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)+10-30pmoles每一個引物+5-10微升10×Taq反應(yīng)液(Promega)+H2O，總體積為50-100微升。PCR反應(yīng)條件94-96℃/1-2分鐘，53-55℃/1-2分鐘，70-72℃/1-2分鐘，1-2個循環(huán)；94-96℃/1-2分鐘，36-38℃/1-2分鐘，70-72℃/1-2分鐘，30個循環(huán)；94-96℃/1-2分鐘，36-38℃/1-2分鐘，70-72℃/10-15分鐘，1個循環(huán)。
PCR反應(yīng)使用的兩個引物的堿基序列為(HindIII和BamH1切割位用下畫線表出)引物15′-TATAAGCTTATGAGCTACAACTTGCTTGG-3′引物25′-TTAGGATTCTCAGTTTCGGAGGTAACCTG-3′步驟5分離和純化cDNA步驟4中所獲cDNA用1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離。將IFN-β-cn的cDNA帶切出(約500bp長)。用NaI(8M+0.022M DTT)把cDNA帶于50-56℃融化5-10分鐘。加入玻璃細(xì)珠，室溫反應(yīng)5分鐘，離心30秒。用乙醇(75％+TE)清洗后，玻璃細(xì)珠上的DNA用TE于50-56℃洗脫5分鐘。離心30秒，取上清液。
步驟6克隆cDNA到pTrp載體用限制性內(nèi)切酶切割I(lǐng)FN-β-cn cDNA1微克DNA+10U HindIII+10U BamH1+3微升3號反應(yīng)液(10×，New England Biolabs)+3微升BSA(1mg/ml)，用水稀釋總體積為30微升，在37℃反應(yīng)2小時。切割后DNA片段的分離和純化如同步驟5。
用限制性內(nèi)切酶切割pTrp載體1微克DNA+10U HindIII+10UBamH1+3微升3號反應(yīng)液(10×，New England Biolabs)+3微升BSA(1mg/ml)，用水稀釋總體積為30微升，在37℃反應(yīng)2小時。切割后DNA片段的分離和純化如同實施例5。所需的DNA片段為載體部分，約4kbp。
IFN-β-cn cDNA插入pTrp載體50ng酶切過的IFN-β-cn cDNA+15ng酶切過的pTrp+0.5-2.0U T4 Ligase(Promega)+1.5微升Ligase反應(yīng)液(10×，Promega，內(nèi)含ATP)，用水稀釋至總體積為15微升，在14-16℃反應(yīng)12-18小時。
轉(zhuǎn)化大腸桿菌將上述15微升反應(yīng)物用TE稀釋至總體積為60微升，然后加入100微升感受態(tài)XL1 Blue大腸桿菌(制備方法詳見“分子克隆”，T.曼尼阿蒂斯等，科學(xué)出版社，1987)。在冰上反應(yīng)20-40分鐘，再在42℃熱激1-3分鐘。加入500微升LB培養(yǎng)液，在37℃培養(yǎng)1-2小時。將整個培養(yǎng)液均勻地鋪在LB-Agar培養(yǎng)基上(內(nèi)含100微克/毫升氨芐青霉素)，在37℃培養(yǎng)15-20小時。
篩選克隆從對氨芐青霉素有抗藥性的XL1 Blue大腸桿菌克隆中分離和純化質(zhì)粒(制備方法詳見“分子克隆”，T.曼尼阿蒂斯等，科學(xué)出版社，1987)。如上所示，將質(zhì)粒用HindIII和BamH1切割，然后用1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，以證實質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)如圖1所示。具有正確載體結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒再進(jìn)一步作堿基測序列(Sanger方法，詳見“分子克隆”，T.曼尼阿蒂斯等，科學(xué)出版社，1987)，來獲得IFN-β-cncDNA的堿基序列。經(jīng)篩選后，其中一個正確載體pTrp-IFN-β-cn-12用于以下步驟。
步驟7發(fā)酵培養(yǎng)將步驟6的pTrp-IFN-β-cn-12轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MM294。挑單個菌落接種于3ml LB培養(yǎng)基里(內(nèi)含50微克/毫升氨芐青霉素)，37℃培養(yǎng)12小時，然后稀釋到總體積為300ml LB培養(yǎng)基里(內(nèi)含50微克/毫升氨芐青霉素)，37℃培養(yǎng)12小時，此即為發(fā)酵種子液。
發(fā)酵培養(yǎng)基檸檬酸鈉 3mMKH2PO430mM(NH4)2SO474mMMgSO4·7H2O 3mMMnSO4·H2O 46μMZnSO4·7H2O 46μMCuSO4·5H2O 1-2μMFeSO4·7H2O 74μM葡萄糖 0.5％色氨酸 350μM
鹽酸硫胺 0.002％氨芐青霉素 50μg/ml發(fā)酵時，pH保持于6.5±0.1；溫度保持于37±1℃；溶解氧保持于30％。發(fā)酵時間14小時。
步驟8分離純化發(fā)酵液經(jīng)4000RPM離心，菌體用PBS(0.1M磷酸鈉，pH7.4，0.15MNaCl)懸浮至100-200OD(680nm)。冰浴條件下超聲破碎5分鐘，10000×g離心10分鐘，去上清液，沉淀物用PBS+2％SDS+10mM DTT溶解，用等體積仲丁醇(2-butanol)萃取，再用冰醋酸沉淀，沉淀溶解于0.1M磷酸鈉(pH7.4)+10％SDS+10mM DTT+0.5mM EDTA。分別上Sephacryl S-200和Sephadex G-75。然后進(jìn)行鑒定。
(二)、IFN-β-cn Ser17的制備步驟1～步驟6與(一)中的步驟1～步驟6相同。
步驟7定位突變IFN-β-cn第17位的半胱氨酸為絲氨酸定位突變使用QuickChang試劑盒(Stratagene，目錄號200518)。
反應(yīng)混合物5微升10×反應(yīng)液+5-50ng pTrp-IFN-β-cn-12+125ng引物1+125ng引物2+1微升dNTP+1微升Pfu Turbo(2.5U/微升)，用水稀釋至總體積為50微升，再在頂部加PCR油。PCR反應(yīng)條件95℃/30秒，1個循環(huán)；95℃/30秒，55℃/1分鐘，68℃/5分鐘，12個循環(huán)。兩個引物的堿基序列為引物15′-GCAGCAATTTTCAGAGTCAGAAGCTCCTGTG-3′引物25′-CACAGGAGCTTCTGACTCTGAAAATTGCTGC-3′PCR反應(yīng)完后，加1微升DpnI(10U/微升)到反應(yīng)混合物，于37℃反應(yīng)1小時。
取1微升DpnI處理過的反應(yīng)混合物，加入到50微升感受態(tài)XL1Blue大腸桿菌，按步驟6轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
篩選克隆從對氨芐青霉素有抗藥性的XL1 Blue大腸桿菌克隆中分離和純化質(zhì)粒(制備方法詳見“分子克隆”，T.曼尼阿蒂斯等，科學(xué)出版社，1987)。如實施例6所示，將質(zhì)粒用HindIII和BamH1切割，然后用1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，以證實質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)如圖1所示。具有正確載體結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒再進(jìn)一步作堿基測序列(Sanger方法，可詳見“分子克隆”，T.曼尼阿蒂斯等，科學(xué)出版社，1987)，來獲得IFN-β-cn Ser17DNA的堿基序列。經(jīng)篩選后，其中一個正確載體pTrp-IFN-β-cn Ser17-68用于以下步驟。
步驟8發(fā)酵培養(yǎng)與(一)中的步驟7相同，只是用pTrp-IFN-β-cn Ser17-68代替實施例1的步驟7中的pTrp-IFN-β-cn-12。
步驟9與實施例1中的步驟8相同。
(三)、IFN-β-cn Ser17的供藥劑型IFN-β-cn Ser17的供藥劑型為針劑。每一針劑內(nèi)含冰凍干燥粉，包括300微克(約10MIU)IFN-β-cn Ser17，15毫克人白蛋白(USP)，15毫克甘露醇(USP)。用時加入1.2毫升0.54％NaCl溶液。給藥途徑為皮下注射。
IFN-β-cn和IFN-β-cn Ser17鑒定結(jié)果(1)SDS-PAGE圖2是IFN-β-cn Ser17的SDS-PAGE電泳膠圖，表明純化后的IFN-β-cn Ser17只出現(xiàn)單一條帶；SDS-PAGE膠用固綠染后，再作定量掃描，這樣估計的純度≥99％。IFN-β-cn的SDS-PAGE電泳膠圖和IFN-β-cn Ser17的一致。
(2)RP-HPLC圖3是IFN-β-cn Ser17的RP-HPLC色譜圖，經(jīng)對各峰作定量計算后，確定IFN-β-cn Ser17的純度≥99％。IFN-β-cn的RP-HPLC色譜圖和IFN-β-cn Ser17的一致。
(3)氨基酸分析氨基酸分析結(jié)果如表1所示表1 IFN-β-cn Ser17的氨基酸組成

注Ser，Trp，Cys和Pro的平均值按24小時數(shù)據(jù)計算。Cys的分析是由過甲酸氧化后進(jìn)行得。
此氨基酸組成和基因序列推導(dǎo)的氨基酸組成一致。和IFN-β-cnSer17一樣，IFN-β-cn的氨基酸組成和基因序列推導(dǎo)的氨基酸組成一致。
4)N-端測序IFN-β-cn Ser17的氨基酸N-端序列，共測序頭30個氨基酸，結(jié)果如表2所示
表2 IFN-β-cn Ser17的氨基酸N-端序列

注實驗用的樣品總量為35nmol；Ser主要PTH-dehydroserine的形式回收；Cys主要以PTH-cystine的形式確認(rèn)該結(jié)果和基因序列推導(dǎo)的氨基酸末端序列一致。注意基因序列推導(dǎo)的第一位氨基酸蛋氨酸已被大腸桿菌的MAP酶切除。和IFN-β-cnSer17一樣，IFN-β-cn的N-端序列和基因序列推導(dǎo)的氨基酸末端序列一致。
(5)比活性通過細(xì)胞病變抑制法(Cytopathic Effect Inhibition Assay)測定生物活性，IFN-β-cn的比活性介于1.0×107-3.0×107IU/mg；IFN-β-cn Ser17的比活性介于1.0×108-3.5×108IU/mg。IFN-β-cn Ser17比IFN-β-cn的活性約高10倍左右
權(quán)利要求
1.用生物技術(shù)合成的一種乙型干擾素IFN-β-cn，其特征在于含有如下堿基序列和氨基酸序列，其中第47位氨基酸的密碼子的第一個堿基是Aatg agc tac aac ttg ctt gga ttc cta caa aga agc agc aat ttt cag 48Met ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln1 5 10 15tgt cag aag ctc ctg tgg caa ttg aat ggg agg ctt gaa tac tgc ctc 96Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu20 25 30aag gac agg atg aac ttt gac atc cct gag gag att aag cag atg cag 144Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Met Gln35 40 45cag ttc cag aag gag gac gcc gca ttg acc atc tat gac atg ctc cag 192Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln50 55 60aac atc ttt gct att ttc aga caa gat tca tct agc act ggc tgg aat 240Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Glu Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn65 70 75 80gag act att gtt gag aac ctc ctg gct aag gtc tat cat cag ata aac 288Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn85 90 95cat ctg aag aca gtc ctg gaa gaa aaa ctg gag aaa gaa gat ttc acc 366His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr100 105 110agg gga aaa ctc atg agc agt ctg cac ctg aaa aga tat tat ggg agg 384Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg115 120 125att ctg cat tac ctg aag gcc aag gag tac agt cac tgt gcc tgg acc 432Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu tyr Ser His Cys Ala Trp Thr130 135 140ata gtc aga gtg gaa atc cta agg aac ttt tac ttc att aac aga ctt 480Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu145 150 155 160aca gat tac ctc cga aac tga 501Thr Gly Tyr Leu Arg Asn165
2.如權(quán)利要求1所述的干擾素，其特征該干擾素是從中國人的IFN-β基因克隆的。
3.一種如權(quán)利要求1所述的干擾素在第17位的突變體，其特征是其第17位的半胱氨酸可被剪除或被另一個氨基酸所取代。
4.如權(quán)利要求3所述的突變體，其特征是所述的氨基酸為絲氨酸。
5.如權(quán)利要求4所述的突變體，其特征是含有如下堿基序列和氨基酸序列atg agc tac aac ttg ctt gga ttc cta caa aga agc agc aat ttt cag 48Met ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln1 5 10 15agt cag aag ctc ctg tgg caa ttg aat ggg agg ctt gaa tac tgc ctc 96Ser Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu20 25 30aag gac agg atg aac ttt gac atc cct gag gag att aag cag atg cag 144Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Met Gln35 40 45cag ttc cag aag gag gac gcc gca ttg acc atc tat gac atg ctc cag 192Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln50 55 60aac atc ttt gct att ttc aga caa gat tca tct agc act ggc tgg aat 240Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Glu Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn65 70 75 80gag act att gtt gag aac ctc ctg gct aag gtc tat cat cag ata aac 288Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn85 90 95cat ctg aag aca gtc ctg gaa gaa aaa ctg gag aaa gaa gat ttc acc 366His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr100 105 110agg gga aaa ctc atg agc agt ctg cac ctg aaa aga tat tat ggg agg 384Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg115 120 125att ctg cat tac ctg aag gcc aag gag tac agt cac tgt gcc tgg acc 432Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu tyr Ser His Cys Ala Trp Thr130 135 140ata gtc aga gtg gaa atc cta agg aac ttt tac ttc att aac aga ctt 480Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu145 150 155 160aca gat tac ctc cga aac tga 501Thr Gly Tyr Leu Arg Asn165
6.用于治療疾病的劑型，其特征是該劑型中含有如權(quán)利要求1和/或4所述的IFN-β-cn。
7.如權(quán)利要求6所述的劑型，其特征是所述的疾病是與IFN-β有關(guān)的疾病，包括病毒感染，細(xì)胞生長失調(diào)及免疫疾病。
8.一種含有如權(quán)利要求1所述堿基序列的重組質(zhì)粒載體，其特征是該載體為采用了trp啟動子的pBR322質(zhì)粒。
9.一種由權(quán)利要求8所述的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌MM294。
10.一種含有如權(quán)利要求4所述的堿基序列的重組質(zhì)粒載體，其特征是該載體采用了trp啟動子的pBR322質(zhì)粒。
11.一種由權(quán)利要求10所述的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌MM294。
全文摘要
本發(fā)明公開了從一位中國人的二倍體成纖維細(xì)胞內(nèi)分離得到的一個新的乙型干擾素IFN－β－cn，以及它的基因序列和氨基酸序列。IFN－β－cn的47位為蛋氨酸，而IFN－β的47位為亮氨酸，這一差異不影響生物活性。本發(fā)明還公開了IFN－β－cn的突變體，即第17位的半胱氨酸改變?yōu)榻z氨酸。該發(fā)明詳細(xì)描述了IFN－β－cn及其突變體的克隆過程，表達(dá)載體，表達(dá)宿主，分離純化和鑒定方法。這為大量生產(chǎn)及臨床應(yīng)用創(chuàng)造了良好條件。
文檔編號A61P31/00GK1613872SQ200310113979
公開日2005年5月11日 申請日期2003年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月5日
發(fā)明者劉美星, 莫一平 申請人:浙江大學(xué)生物技術(shù)有限公司