專利名稱：脂質(zhì)體內(nèi)皮抑素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于脂質(zhì)體內(nèi)皮抑素的制備方法。
背景技術(shù)：
脂質(zhì)體是一種很有發(fā)展?jié)摿Φ乃幬镙d體，目前采用的熔解擠壓法(United States Patent6,387,401)制備的脂質(zhì)體欠穩(wěn)定，作為藥物載體經(jīng)靜脈注入體內(nèi)后，因血中的蛋白，酶等因素的作用，易造成脂質(zhì)體的破裂及包封藥物的快速滲漏。
內(nèi)皮抑素是哈佛大學(xué)O′Reilly MS在1997年的Cell雜志第88卷第2期277～285頁的文章中提出發(fā)現(xiàn)的一種新型抗腫瘤藥物，它具有血管內(nèi)皮細胞增殖抑制活性和抗腫瘤生長和轉(zhuǎn)移活性，在動物實驗中對Lewis肺癌、黑素瘤、纖維素瘤、血管內(nèi)皮瘤、腎細胞癌等有顯著的抑瘤效果，它有望成為一種新的抗腫瘤藥物。但是，目前采用靜脈注射與肌肉注射方式，不但給藥量大、療程長、而且藥物在體內(nèi)的半衰期短，難以長期維持較高的血藥濃度，影響療效并且加重病人的負(fù)擔(dān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種脂質(zhì)體內(nèi)皮抑素的制備方法；本發(fā)明的另一目的是提供一種脂質(zhì)體內(nèi)皮抑素的應(yīng)用。
穩(wěn)定的內(nèi)皮抑素脂質(zhì)體，能夠有效包裹重組內(nèi)皮抑素蛋白并實現(xiàn)在體內(nèi)的可控緩慢釋放，延長其血循環(huán)半衰期，使藥物到達腫瘤靶部位前避免受到體內(nèi)蛋白酶等各種因子的降解作用而損耗，并在體內(nèi)能長期保持有效的血藥濃度，提高藥物的療效。本發(fā)明采用新型膜材結(jié)合旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和冷凍干燥方法合成穩(wěn)定性好、蛋白包裹率高、形態(tài)好的內(nèi)皮抑素脂質(zhì)體緩釋劑型。1.5～2％山梨醇在維持冷凍或凍干狀態(tài)下的脂質(zhì)體的粒徑大小方面效果明顯，脂質(zhì)體的粒徑平均值保持恒定，而粒度分布稍微有所放寬。不加山梨醇或加入山梨醇的含量過高，過低，脂質(zhì)體的粒徑大小均會發(fā)生一定程度的變化。
由于脂質(zhì)體是由天然磷脂組成，故可在體內(nèi)進行代謝，無毒性和抗原性。脂質(zhì)體包裹重組內(nèi)皮抑素蛋白無需化學(xué)結(jié)合，因而可以保護蛋白分子免受體內(nèi)蛋白酶的降解。由于脂質(zhì)體制劑滲透性有限，因而可成為一種可控制的時間依賴性釋放系統(tǒng)，并能促進細胞對內(nèi)皮抑素的吸收，脂質(zhì)體的脂質(zhì)成份，大小，電荷，滲透性和表面配體等因素可控制其在體內(nèi)的分布類型。包裹在脂質(zhì)體內(nèi)的藥物不能被代謝，因此藥物的吸收和分布不再取決于藥物的理化特性，而取決于脂質(zhì)體的理化性狀，后者更容易控制。
本發(fā)明將溶于氯仿的磷脂酰膽堿(PC)、膽固醇(CH)、磷脂酰絲氨酸(PS)和硬脂酸胺(SA)按摩爾比為15～20∶15～20∶2～5∶0.5～1.5混合，在36～40℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)4～6h，旋轉(zhuǎn)速度為80～120rpm，形成一薄層脂膜，以氮氣流除盡殘余痕量有機溶劑，加入2mL H2O繼續(xù)以120rpm旋轉(zhuǎn)溶解下脂膜，在20～25℃下浴式超聲10～15min，形成多囊脂質(zhì)體(MLV)，室溫下靜置孵育1～2h，冰浴下進行探針超聲，6～10×0.5min，每次間隔0.5～1min，懸液靜置孵育2～3h，8000rpm離心10min，取上清液小單層脂質(zhì)體(SUV)，以0.22μm膜除菌過濾后，同4mg/mL內(nèi)皮抑素溶液等體積混合，內(nèi)皮抑素是通過基因工程方法在大腸桿菌中表達并經(jīng)Ni-NTA Sepharose親和層析柱純化的重組人內(nèi)皮抑素蛋白，加入脂質(zhì)體凍干保護劑，凍干保護劑為6～8％海藻糖、0.6～0.8％明膠、0.5-1％人血清白蛋白、1.5～2％山梨醇、1％谷氨酸鈉、1％尿素、0.5％抗壞血酸和0.2％L-精氨酸(L-Arg)，在-45℃冷凍干燥8～10h，收獲內(nèi)皮抑素脂質(zhì)體。應(yīng)用時對凍干脂質(zhì)體先加入0.1mL H2O，待20～30min后加入0.2mL、20mmol/L、pH＝7.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)，待20～40min后加入0.7mL、20mmol/L、pH＝7.0的PBS。
采用本技術(shù)制備的脂質(zhì)體粒徑大小在150nm～180nm，蛋白包裹率是35～42％。在凍干狀態(tài)下，內(nèi)皮抑素脂質(zhì)體在-20℃可以保存12個月，在4～8℃可以保存6個月，在20～25℃可以保存2個月，在內(nèi)皮抑素脂質(zhì)體重新水合形成膠體溶液時，在4～8℃穩(wěn)定期為6d，在20～25℃穩(wěn)定期為60h。該脂質(zhì)體具有穩(wěn)定性好、蛋白包裹率高、粒徑大小均勻、操作簡單、適合工業(yè)化大批量生產(chǎn)的優(yōu)點。采用內(nèi)皮抑素脂質(zhì)體緩釋劑型應(yīng)用于臨床，有利于延長其在體內(nèi)的持續(xù)時間并實現(xiàn)內(nèi)皮抑素在體內(nèi)的可控制釋放。
具體實施例方式
實施例1將溶于氯仿的磷脂酰膽堿、膽固醇、磷脂酰絲氨酸、硬脂酸胺按摩爾比為20∶20∶5∶1.5混合，40℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)6h，旋轉(zhuǎn)速度為120rpm，形成一薄層脂膜，以氮氣流除盡殘余痕量有機溶劑，加入2mL H2O繼續(xù)以120rpm旋轉(zhuǎn)溶解下脂膜，25℃下浴式超聲15min，室溫下靜置孵育2h，冰浴下進行探針超聲，10×0.5min，每次間隔1min，懸液靜置孵育3h，8000rpm離心10min，取上清液小單層脂質(zhì)體，以0.22μm膜除菌過濾后，同4mg/mL內(nèi)皮抑素溶液等體積混合，加入脂質(zhì)體凍干保護劑，凍干保護劑為8％海藻糖、0.8％明膠、1％人血清白蛋白、2％山梨醇、1％谷氨酸鈉、1％尿素、0.5％抗壞血酸和0.2％L-Arg，-45℃冷凍干燥10h，收獲內(nèi)皮抑素脂質(zhì)體。應(yīng)用時對凍干脂質(zhì)體先加入0.1mL H2O，待30min后加入0.2mL、20mmol/L、pH＝7.0的PBS，待40min后加入0.7mL、20mmol/L、pH＝7.0的PBS。
實施例2將溶于氯仿的磷脂酰膽堿、膽固醇、磷脂酰絲氨酸、硬脂酸胺按摩爾比為15∶15∶2∶0.5混合，36℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)4h，旋轉(zhuǎn)速度為80rpm，形成一薄層脂膜，以氮氣流除盡殘余痕量有機溶劑，加入2mL H2O繼續(xù)以80rpm旋轉(zhuǎn)溶解下脂膜，20℃下浴式超聲10min，室溫下靜置孵育1h，冰浴下進行探針超聲，6×0.5min，每次間隔0.5min，懸液靜置孵育1h，8000rpm離心10min，取上清液小單層脂質(zhì)體，以0.22μm膜除菌過濾后，同4mg/mL內(nèi)皮抑素溶液等體積混合，加入脂質(zhì)體凍干保護劑，凍干保護劑為6％海藻糖、0.6％明膠、0.5％人血清白蛋白、1.5％山梨醇、1％谷氨酸鈉、1％尿素、0.5％抗壞血酸和0.2％L-Arg，-45℃冷凍干燥8h，收獲內(nèi)皮抑素脂質(zhì)體。應(yīng)用時對凍干脂質(zhì)體先加入0.1mL H2O，待20min后加入0.2mL、20mmol/L、pH＝7.0的PBS，待20min后加入0.7mL、20mmol/L、pH＝7.0的PBS。
實施例3將溶于氯仿的磷脂酰膽堿、膽固醇、磷脂酰絲氨酸、硬脂酸胺按摩爾比為18∶18∶3∶1混合，37℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)5h，旋轉(zhuǎn)速度為100rpm，形成一薄層脂膜，以氮氣流除盡殘余痕量有機溶劑，加入2mL H2O繼續(xù)以100rpm旋轉(zhuǎn)溶解下脂膜，22℃下浴式超聲12min，室溫下靜置孵育1.5h，冰浴下進行探針超聲，8×0.5min，每次間隔45s，懸液靜置孵育2.5h，8000rpm離心10min，取上清液小單層脂質(zhì)體，以0.22μm膜除菌過濾后，同4mg/mL內(nèi)皮抑素溶液等體積混合，加入脂質(zhì)體凍干保護劑，凍干保護劑為7％海藻糖、0.7％明膠、0.8％人血清白蛋白、1.8％山梨醇、1％谷氨酸鈉、1％尿素、0.5％抗壞血酸和0.2％L-Arg，-45℃冷凍干燥9h，收獲內(nèi)皮抑素脂質(zhì)體。應(yīng)用時對凍干脂質(zhì)體先加入0.1mL H2O，待25min后加入0.2mL、20mmol/L、pH＝7.0的PBS，待35min后加入0.7mL、20mmol/L、pH＝7.0的PBS。
實施例4將溶于氯仿的磷脂酰膽堿、膽固醇、磷脂酰絲氨酸、硬脂酸胺按摩爾比為20∶20∶5∶1混合，37℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)6h，旋轉(zhuǎn)速度為80rpm，形成一薄層脂膜，以氮氣流除盡殘余痕量有機溶劑，加入2mL H2O繼續(xù)以80rpm旋轉(zhuǎn)溶解下脂膜，25℃下浴式超聲10min，室溫下靜置孵育1h，冰浴下進行探針超聲，9×0.5min，每次間隔1min，懸液靜置孵育2h，8000rpm離心10min，取上清液小單層脂質(zhì)體，以0.22μm膜除菌過濾后，同4mg/mL內(nèi)皮抑素溶液等體積混合，加入脂質(zhì)體凍干保護劑，凍干保護劑為6％海藻糖、0.8％明膠、0.5％人血清白蛋白、2％山梨醇、1％谷氨酸鈉、1％尿素、0.5％抗壞血酸和0.2％L-Arg，-45℃冷凍干燥8h，收獲內(nèi)皮抑素脂質(zhì)體。應(yīng)用時對凍干脂質(zhì)體先加入0.1mL H2O，待25min后加入0.2mL、20mmol/L、pH＝7.0的PBS，待30min后加入0.7mL、20mmol/L、pH＝7.0的PBS。
實施例5將溶于氯仿的磷脂酰膽堿、膽固醇、磷脂酰絲氨酸、硬脂酸胺按摩爾比為18∶18∶5∶1.5混合，40℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)5h，旋轉(zhuǎn)速度為100rpm，形成一薄層脂膜，以氮氣流除盡殘余痕量有機溶劑，加入2mL H2O繼續(xù)以100rpm旋轉(zhuǎn)溶解下脂膜，20℃下浴式超聲10min，室溫下靜置孵育1h，冰浴下進行探針超聲，10×0.5min，每次間隔40s，懸液靜置孵育2h，8000rpm離心10min，取上清液小單層脂質(zhì)體，以0.22μm膜除菌過濾后，同4mg/mL內(nèi)皮抑素溶液等體積混合，加入脂質(zhì)體凍干保護劑，凍干保護劑為8％海藻糖、0.6％明膠、1％人血清白蛋白、1.5％山梨醇、1％谷氨酸鈉、1％尿素、0.5％抗壞血酸和0.2％L-Arg，-45℃冷凍干燥8h，收獲內(nèi)皮抑素脂質(zhì)體。應(yīng)用時對凍干脂質(zhì)體先加入0.1mL H2O，待25min后加入0.2mL、20mmol/L、pH＝7.0的PBS，待40min后加入0.7mL、20mmol/L、pH＝7.0的PBS。
實施例6將溶于氯仿的磷脂酰膽堿、膽固醇、磷脂酰絲氨酸、硬脂酸胺按摩爾比為20∶20∶5∶1混合，36℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)6h，旋轉(zhuǎn)速度為120rpm，形成一薄層脂膜，以氮氣流除盡殘余痕量有機溶劑，加入2mL H2O繼續(xù)以120rpm旋轉(zhuǎn)溶解下脂膜，22℃下浴式超聲12min，室溫下靜置孵育2h，冰浴下進行探針超聲，10×0.5min，每次間隔1min，懸液靜置孵育2.5h，8000rpm離心10min，取上清液小單層脂質(zhì)體，以0.22μm膜除菌過濾后，同4mg/mL內(nèi)皮抑素溶液等體積混合，加入脂質(zhì)體凍干保護劑，凍干保護劑為7％海藻糖、0.8％明膠、0.5％人血清白蛋白、2％山梨醇、1％谷氨酸鈉、1％尿素、0.5％抗壞血酸和0.2％L-Arg，-45℃冷凍干燥9h，收獲內(nèi)皮抑素脂質(zhì)體。應(yīng)用時對凍干脂質(zhì)體先加入0.1mL H2O，待20min后加入0.2mL、20mmol/L、pH＝7.0的PBS，待40min后加入0.7mL、20mmol/L、pH＝7.0的PBS。
權(quán)利要求
1.一種脂質(zhì)體內(nèi)皮抑素的制備方法，將溶于氯仿的磷脂酰膽堿、膽固醇、磷脂酰絲氨酸和硬脂酸胺按摩爾比為15～20∶15～20∶2～5∶0.5～1.5混合，在36～40℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)4～6h，旋轉(zhuǎn)速度為80～120rpm，形成一薄層脂膜，以氮氣流除盡殘余痕量有機溶劑，加入2mL H2O繼續(xù)以120rpm旋轉(zhuǎn)溶解下脂膜，在20～25℃下浴式超聲10～15min，形成多囊脂質(zhì)體，室溫下靜置孵育1～2h，冰浴下進行探針超聲，6～10×0.5min，每次間隔0.5～1min，懸液靜置孵育2～3h，8000rpm離心10min，取上清液小單層脂質(zhì)體，以0.22μm膜除菌過濾后，同4mg/mL內(nèi)皮抑素溶液等體積混合，內(nèi)皮抑素是通過基因工程方法在大腸桿菌中表達并經(jīng)Ni-NTA Sepharose親和層析柱純化的重組人內(nèi)皮抑素蛋白，加入脂質(zhì)體凍干保護劑，凍干保護劑為6～8％海藻糖、0.6～0.8％明膠、0.5-1％人血清白蛋白、1.5～2％山梨醇、1％谷氨酸鈉、1％尿素、0.5％抗壞血酸和0.2％L-精氨酸，在-45℃冷凍干燥8～10h，收獲內(nèi)皮抑素脂質(zhì)體。
2.按權(quán)利要求1所述方法制備的內(nèi)皮抑素脂質(zhì)體，應(yīng)用時對凍干脂質(zhì)體先加入0.1mL H2O，待20～30min后加入0.2mL、20mmol/L、pH＝7.0的磷酸鹽緩沖液，待20～40min后加入0.7mL、20mmol/L、pH＝7.0的PBS。
全文摘要
本發(fā)明屬于脂質(zhì)體內(nèi)皮抑素的制備方法。結(jié)合旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和冷凍干燥方法制備的內(nèi)皮抑素脂質(zhì)體粒徑大小在150nm～180nm，蛋白包裹率是35～42％。在凍干狀態(tài)下，內(nèi)皮抑素脂質(zhì)體在－20℃可以保存12個月，在4～8℃可以保存6個月，在20～25℃可以保存2個月。在內(nèi)皮抑素脂質(zhì)體重新水合形成膠體溶液時，在4～8℃穩(wěn)定期為6d，在20～25℃穩(wěn)定期為60h。該脂質(zhì)體具有穩(wěn)定性好、蛋白包裹率高、粒徑大小均勻、操作簡單、適合工業(yè)化大批量生產(chǎn)的優(yōu)點。
文檔編號A61K47/24GK1546168SQ20031011593
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月16日
發(fā)明者王群, 王 群 申請人:中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所