專利名稱：由丹參水提物或丹參素制備防治骨質(zhì)疏松癥新藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由唇形科植物丹參salvia miltiorrhiz Bge的水提物，或丹參的水溶性成分丹參素制備防治骨質(zhì)疏松癥的新藥。丹參的水提物包括原兒茶醛(ProtocateChualdehyde)、丹參素(Danshen Su)等。由丹參的水溶性成分提取的丹參素，也稱為D(+)β-(3，4-二羥基苯基)乳酸。
背景技術(shù)：
原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥(包括絕經(jīng)期后骨質(zhì)疏松和老年性骨質(zhì)疏松)是一種以骨量減少、骨組織微細結(jié)構(gòu)退化(松質(zhì)骨骨小梁變細、斷裂，數(shù)量減少；皮質(zhì)骨多孔、變薄)為特征的，以致骨的脆性增加，骨折危險性增加的全身性的老年性骨骼疾病。骨質(zhì)疏松癥是一種疾病，表現(xiàn)為骨量減少伴有在正常身體活動下骨骼脆性增加和骨骼疼痛等臨床表征。由于骨量減少、骨的微細結(jié)構(gòu)退化和骨的脆性增加，造成骨的生物力學(xué)強度下降，難以承載原有的或相對增加的載荷，可悄然發(fā)生微細骨折或完全骨折，嚴重影響老年人的生活質(zhì)量，給患者、家庭和社會帶來極大負擔(dān)。骨質(zhì)疏松癥的流行病學(xué)研究表明，女性49歲絕經(jīng)，52--60歲可患骨量減少，62--76歲可患骨質(zhì)疏松，72--86歲可患嚴重骨質(zhì)疏松癥。除原發(fā)性骨質(zhì)疏松外，繼發(fā)性骨質(zhì)疏松，特別是皮質(zhì)類固醇性骨質(zhì)疏松也面臨嚴峻的現(xiàn)實，在接受皮質(zhì)類固醇治療的慢性疾病的病人中，最終也有30～50％發(fā)展為骨質(zhì)疏松[1]，更嚴重的是導(dǎo)致股骨頭壞死及股骨骨折，是不容忽視的醫(yī)原性疾病問題。隨時國民經(jīng)濟的發(fā)展，人民生活水平的提高，人口壽命逐漸延長，未來的社會將成為老年性社會。我國60歲以上老年人口已增長到1.34億人，按照國際標(biāo)準(zhǔn)，我國已進入了老年社會。如果再加上60歲以下的中老年人口，其數(shù)量更為可觀。作為老年性疾病之一的骨質(zhì)疏松癥和骨質(zhì)疏松性骨折，已使越來越多的人深受其害，并已成為世界性關(guān)注的嚴重社會問題，我國已將它列為三大重點攻關(guān)研究的老年性疾病之一。WHO已對骨質(zhì)疏松癥制訂出全球性戰(zhàn)略目標(biāo)，改善全世界對骨質(zhì)疏松的診斷和處理，在各大學(xué)、研究所、制藥公司已紛紛大副度增加經(jīng)費以加速抗骨質(zhì)疏松新藥的研究與開發(fā)，因此防治老年性骨質(zhì)疏松是保證人們身體健康，提高生活質(zhì)量的一項十分迫切的研究課題。
目前認為骨質(zhì)疏松是一種多病因的疾病，其基本病理機理是在骨代謝過程中骨吸收和骨形成的平衡出現(xiàn)缺陷，導(dǎo)致人體內(nèi)的鈣磷代謝失調(diào)，使骨密度逐漸減少而引起臨床癥狀、其病因主要與年齡，內(nèi)分泌紊亂，鈣吸收不良，肢體廢用以及免疫，營養(yǎng)、遺傳等因素有關(guān)。在晚近20年，骨質(zhì)疏松的藥物治療策略和途徑主要是二大類，一為抗骨吸收的藥物，二為促成骨藥。臨床使用中90％以上為抗骨吸收藥物，如雌激素替代療法，是治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的經(jīng)典療法。但雌激素引起生殖系統(tǒng)腫瘤的危險性已被肯定[2]，美國已宣稱雌激素為致癌物之一；二磷酸鹽類可有效治療骨吸收所致骨量丟失，但長期應(yīng)用副作用大，也不易作為預(yù)防用藥；降鈣素對溶骨性骨痛和骨質(zhì)疏松作用顯著，但治療需個體化，也受到給藥途徑限制，且價格昂貴；目前關(guān)注的雌激素受體調(diào)節(jié)劑(ERMs)，由于保留了對骨骼的雌激素樣作用而阻斷對生殖系統(tǒng)的刺激作用，具有優(yōu)勢，已有2-3個新藥進入臨床III期試驗(美國)。所有這些抗骨吸收劑，均抑制了因骨吸收而增加耦聯(lián)的骨形成，使舊骨和新骨的轉(zhuǎn)換率減少，長期應(yīng)用影響骨的質(zhì)量及力學(xué)性能[3]。目前促骨形成藥已逐漸成為研究熱點，短鏈甲狀旁腺激素(PTH)是非常明顯的促骨形成藥，在美國也進入II期臨床，但實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTH可增加皮質(zhì)骨多孔性(因同時增加皮質(zhì)骨哈佛氏管的吸收)，降低骨折的遠期療效并未肯定[4]；活性VitD長期應(yīng)用易致高血鈣及尿鈣癥；氟化物是較早用于骨質(zhì)疏松癥的促骨形成藥，但它易使類骨質(zhì)增加而伴有骨礦化缺陷，限制了在臨床廣泛應(yīng)用，主要源于它的安全范圍窄，副作用大，療效需進一步考證。
丹參為唇形科植物丹參salvia miltiorrhiza Bge的干燥根，近代已從中分離得多種化學(xué)成分，有脂溶性和水溶性兩類，脂溶性成分有丹參酮I、丹參酮IIa、丹參酮IIb、隱丹參酮等；水溶性成分有原兒茶醛、丹參素(丹參酸甲)、丹參酸乙等。近年來對丹參的作用研究主要集中在改善心、肝、肺的缺血再灌注損傷、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和抗感染等方面，丹參的抗氧化作用，降血脂作用，抗凝、促纖溶作用，保肝作用，對腎臟的保護等作用已取得了重要的研究進展，在臨床上已廣為應(yīng)用。從1934年至1976年間，國內(nèi)外對丹參進行了大量研究工作，先后從中分離得到15種成分，測定了結(jié)構(gòu)式，并依次命名為丹參酮(tanshinone，Tan)I、IIa、IIb，隱丹參酮，異丹參酮I、IIA，異隱丹參酮，羥基丹參酮IIa，丹參酸甲酯，miltirone，salviol，二氫丹參酮I，丹參新醌甲、乙和丙。研究表明，丹參酮類均含有鄰醌或?qū)︴Y(jié)構(gòu)。由于醌類成分易被還原為二酚類衍生物，后者再被氧化又易轉(zhuǎn)變?yōu)轷?，在轉(zhuǎn)變過程中起電于傳遞作用；同時、它們在生物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物容易參與機體的多種生物化學(xué)反應(yīng)，并作為生物反應(yīng)的輔酶對某些生化反應(yīng)起促進或干擾作用，因此表現(xiàn)出多種藥理作用[12]。近年來研究已證明丹參酮IIa是一種新的有效的天然抗氧化劑，能消除心肌線粒體膜脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生的脂類自由基，使線粒體呼吸功能不受影響。藥理實驗還證明了丹參酮IIa有抗動脈粥樣硬化作用，抗菌消炎作用，抗腫瘤作用，其抗腫瘤作用機制可能與誘導(dǎo)腫瘤細胞分化、凋亡有關(guān)。丹參酮IIa作為新藥已經(jīng)上市，臨床上主要用于治療冠心病、痤瘡、痛經(jīng)、失眠癥及抗菌消炎，如扁桃體炎、耳癤、化膿性骨髓炎、燒傷中的金葡菌感染，效果顯著。丹參的水溶性提取物丹參注射液已廣泛應(yīng)用于臨床治療心腦血管病已達20多年。從丹參水溶性部分分離得到有效成分丹參素，即D(+)β-(3，4-二輕基苯基)乳酸。丹參素是丹參中的主要有效成分，且丹參素在丹參水溶性部分中含量較高，對丹參素的實驗藥理研究證明[13]丹參素能擴張心腦血管，抵抗血小板粘附聚集，清除氧自由基的作用。丹參素具有抑制細胞內(nèi)源性膽固醇(Ch)合成的作用，具有抗脂蛋白氧化的作用，從而防止氧化蛋白對細胞的損傷。丹參素的藥理作用研究還表明，丹參素可增加心血管系統(tǒng)的冠脈流量，降低心肌興奮性和傳導(dǎo)性，并保護心肌缺血缺氧，縮小心肌梗死范圍。同時還有改善微循環(huán)，加速血液流速，抵抗血小板凝聚和血栓形成的作用。具有提高機體抗凝和纖溶活性的作用。丹參素可使收縮的冠狀動脈擴張，用于拮抗嗎啡鎮(zhèn)痛時冠脈的收縮作用。丹參素還可用于皮膚病治療。丹參素亦已初步試用于臨床治療冠心病，且有一定療效。

發(fā)明內(nèi)容
我們通過大量的動物實驗研究和篩選，我們發(fā)現(xiàn)了唇形科植物丹參salviamiltiorrhiza Bge的干燥根丹參的水提取物，包括原兒茶醛(Protocate Chualdehyde)、丹參素(Danshen Su)等成分，特別是丹參素具有明顯的防治骨質(zhì)疏松的作用，丹參這種防治骨質(zhì)疏松的用途徑骨質(zhì)疏松的治療難題將具有重要的作用。
本發(fā)明的任務(wù)是用科學(xué)的工藝把丹參及其有效成份丹參素的提取物做成制劑，使該制劑用于人類防治骨質(zhì)疏松癥，該制劑既能阻止骨質(zhì)的丟失，又能促進新骨的形成，為解決骨質(zhì)疏松的難題提供新的用途。
解決這一任務(wù)的途徑是這樣實現(xiàn)的，選取唇形科植物丹參salvia miltiorrhiza Bge的干燥根，即中藥稱為丹參的藥用部份，按傳統(tǒng)的工藝加15倍水，分別蒸煮三次，每次2小時，過濾，合并三次濾液，濃縮至一定的濃度，作為丹參的水提物，同時，按已知的工藝提取丹參素和丹參酮，然后用本研究室建立大白鼠骨質(zhì)疏松模型進行給藥研究，比較觀察這些受試品抗骨質(zhì)疏松的藥效學(xué)功能。
研究結(jié)果丹參的水提物，丹參素和丹參酮三個品種均有顯著的預(yù)防實驗動物骨質(zhì)疏松的作用，效果最好的是丹參素，丹參的水提物和丹參酮也有較好的作用。丹參素可使去卵巢大鼠骨量顯著增加，不發(fā)生骨質(zhì)疏松，同時，對長期大量應(yīng)用腎上腺糖皮質(zhì)激素造成的大鼠骨質(zhì)疏松也有很好的預(yù)防和治療作用，丹參的水提物和丹參酮也有相同的作用。
具體實施例方式長期超生理劑量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素可導(dǎo)致繼發(fā)性骨質(zhì)疏松以及由此引起的自發(fā)性骨折、無菌性壞死嚴重影響人們的生活質(zhì)量。據(jù)Lane[1]等報道，在接受糖皮質(zhì)激素慢性治療的患者中，不論任何年齡，均有30-50％的可能性并發(fā)骨質(zhì)疏松。目前治療糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松并沒有理想的方法，原因是由此引起的骨質(zhì)疏松機理復(fù)雜[1]。經(jīng)典的骨吸收抑制藥如雌激素、二磷酸鹽類等副作用又大。因此，尋找有效防治糖皮質(zhì)激素所致骨質(zhì)疏松的藥物有重要意義。
丹參是著名的傳統(tǒng)中藥，具有抗氧化、改善微循環(huán)防止血栓形成等多種功能，近年來又發(fā)現(xiàn)丹參可促進骨愈合[2]，預(yù)防股骨頭壞死[3]，有效降低絕經(jīng)期婦女骨質(zhì)疏松血中骨吸收生物指標(biāo)[4]，這些報道提示丹參可能是預(yù)防糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致骨代謝不良反應(yīng)的有效藥物。丹參的水溶性成份和脂溶性成份在化學(xué)結(jié)構(gòu)上不同；前者主要含丹參素、兒茶醛A和B等，后者有丹參酮IIA和隱丹參酮等。不同提取方法及臨床不同制劑其作用各異。為探討丹參的水提成份是否具有調(diào)節(jié)骨代謝，防治骨質(zhì)疏松的作用，我們通過建立長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素所致骨質(zhì)疏松的大鼠體內(nèi)模型，用骨組織形態(tài)計量學(xué)定量研究方法觀察丹參水提物的作用效應(yīng)，同時在體外采用大鼠成骨細胞的實驗探討丹參水提物和丹參素的作用機制及時效和量效關(guān)系，為闡明丹參是否具有抗骨質(zhì)疏松新用途提供實驗依據(jù)。
1材料與方法1.1材料1.1.1藥物與試劑 丹參水提物(DWE)，由本天然藥物實驗室提取提供，經(jīng)高效液相色譜(HPLC)測定，其中丹參素含量為0.25％，即每克生藥得2.5mg純丹參素。丹參素對照品(danshensu，SU)購自中國藥品生物制品檢定所，北京。醋酸潑尼松(廣東仙居制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號981220)，Tetracyclin，Calcein熒光標(biāo)記物(Sigma Chemical Co.，USA)，司坦唑醇(廣西南寧百會藥業(yè)集團有限公司，批號010214)，維生素D3(上海第九制藥廠，批號010703)，葡萄糖酸鈣(廣西南寧百會藥業(yè)集團有限公司，批號010901)，I型膠原酶(Sigma Co，USA)，透明質(zhì)酸酶(Sigma Co，USA)，胰酶(Sigma Co，USA)，胎牛血清(Hyclone Laboratories)，Dulbecco’s modified Eagle’s medium培養(yǎng)基(DMEM，GibcoBRL)均購自括號所示地方。1.1.2實驗動物4月齡SD雄性大鼠32只，體重228±10g(SPF級，由廣東醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，廣東省實驗動物質(zhì)量合格證編號2002A014；廣東省實驗動物環(huán)境合格證編號2002B011)，喂養(yǎng)飼料中鈣含量為1.33％，磷含量為0.96％，飼養(yǎng)于室溫24℃-26℃，相對濕度67％的清潔環(huán)境中。
1.2方法1.2.1給藥與分組 大鼠隨機分為4組，對照組灌服溶劑對照溶液(Intact+Veh)，其余3組先清晨用醋酸潑尼松以2.7mg·kg-1·d-1灌胃，然后下午分別給予溶劑對照溶液(Pred+Veh)、丹參水提物5.0g·kg-1·d-1、丹參素12.5mg·kg-1·d-1，和綜合治療陽性組(司坦唑醇0.5mg·kg-1·d-1+維生素D3250IU·d-1+葡萄糖酸鈣0.5g·kg-1·d-1，Pred+SDC)，所有動物灌胃給藥，給藥時間為12周。在動物處死(取骨標(biāo)本)前14天和13天皮下注射tetracyclin(25mg·kg-1)，處死前4天和3天皮下注射Calcine(10mg·kg-1)進行體內(nèi)雙熒光標(biāo)記，以觀察骨形成的動態(tài)參數(shù)。
1.2.2骨成分測定及骨形態(tài)學(xué)標(biāo)本制備 大鼠心臟抽血刺死，分離血清作血清Ca測定。取左側(cè)尺骨，除凈肌肉和軟組織，80℃烘烤48h至恒重得骨干重，然后于6mol·L-1HCl，108℃溫度下消化16h后過濾取過濾液，用ICP(電感偶合等離子體直讀光譜儀)測定骨中鈣(Ca)、磷(P)含量，以及骨羥脯氨酸(Hyp)含量(羥脯氨酸試劑盒為南京建成生物工程公司產(chǎn)品)。分離右側(cè)脛骨，用慢速鋸在近端作矢狀打開髓腔，放入10％福爾馬林緩沖液固定，然后脫水，脫脂作塑料包埋。用硬組織切片機分別切下不脫鈣4μm和8μm切片，4μm切片用Goldner’sTrichrome染色[5]封片，進行骨計量學(xué)靜態(tài)參數(shù)(static parameters)測量。8μm切片不染色封片作熒光觀察進行骨計量學(xué)動態(tài)參數(shù)(dynamic parameters)測量。
1.2.3脛骨近端松質(zhì)骨組織形態(tài)計量學(xué)參數(shù)測量及統(tǒng)計 用全自動圖象分析系統(tǒng)(OsteoMeasureOsteoMetrics，Inc，USA)，按國際骨形態(tài)計量參數(shù)測量的定義和計算標(biāo)準(zhǔn)[6]，對右側(cè)脛骨上段矢狀面骨骺線下1mm和4mm之間的松質(zhì)骨進行定量分析。靜態(tài)參數(shù)包括骨組織面積(TV，mm2)、骨小梁面積(BV，mm2)、骨小梁表面周長(BS，mm)、破骨細胞數(shù)目(OC.N)和周長(OC.Pm)及其相應(yīng)計算參數(shù)骨小梁面積百分率(BV/TV，％)、骨小梁數(shù)目(TbN，#/mm2)、骨小梁厚度(TbTh，μm)、骨小梁分離度(TbSp，μm)、破骨細胞數(shù)目指數(shù)(OC.N/BV，mm-2)和破骨細胞周長指數(shù)(OC/BS，％)。動態(tài)參數(shù)包括單熒光周長(SL.Pm)、雙熒光周長(DL.Pm)和二次熒光標(biāo)記間距(IrL.Wi，μm)及其計算參數(shù)礦化表面周長百分率(熒光標(biāo)記周長百分率，MS/BS，％)、礦化沉積率(MAR，μm/day)、骨形成率BFR/BS(表示骨表面形成率，μm/d×100)、骨形成率BFR/BV(表示骨轉(zhuǎn)換程度，％/year)和骨形成率BFR/TV(表示骨組織形成率，％/year)。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用方差分析和q檢驗，P＜0.05有顯著性差別。
1.2.4大鼠成骨細胞原代培養(yǎng)及藥物對成骨細胞堿性磷酸酶(ALP)活性測定 無菌條件下分離新生大鼠顱蓋骨，用0.2％I型膠原酶和0.1％透明質(zhì)酸酶系列消化后收集細胞，置于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞融合后，用0.25％胰酶消化傳代。將傳一代的細胞按4×105個/ml濃度接種于48孔板，繼續(xù)培養(yǎng)2天后，換含1％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，同時加入不同濃度的藥物(丹參水提物DWE的濃度單位是g·L-1，純品丹參素SU的濃度單位是mg·L-1)，對照組加不含血清的DMEM或溶劑對照。分別于藥物作用第2、10天測定細胞堿性磷酸酶活性(PNPP法)。測定時，去掉培養(yǎng)液，PBS沖洗，加入Triton-X100 100μl裂解細胞，然后加入含25mmol·L-1二乙醇胺，2mmol·L-1氯化鎂和2mmol·L-1的PNPP(Sigma，Co.USA)反應(yīng)液，37℃保溫0.5小時后用0.1mol·L-1的NAOH 100μl終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀于405nm波長下測定OD值。酶活性增加百分率(％changes of control)＝(給藥組OD值-對照組OD值)/對照組OD值×100％。
2結(jié)果2.1丹參水提物和丹參素對潑尼松干預(yù)的大鼠體重、骨成份及血鈣的影響 由表1(Tab 1)可見，潑尼松降低大鼠體重(p＜0.05)、尺骨鈣(Ca)含量(p＜0.05)和尺骨羥脯氨酸(HyP)含量(p＜0.01)，同時升高血鈣(p＜0.05)。丹參水提物預(yù)防組和丹參素組全對抗?jié)娔崴伤斐傻淖兓黾芋w重，增加尺骨Ca，骨HyP含量(p＜0.05)，降低血鈣(p＜0.05)，特別是明顯增加尺骨干重，高于正常對照組(p＜0.05)。綜合治療組可對抗?jié)娔崴伤斐傻捏w重降低和血鈣增加，但不能增加骨HyP的含量及骨干重。
表1丹參水提物和丹參素對潑尼松干預(yù)大鼠的體重、骨成分和血鈣的影響組別體重 骨干重骨鈣含量骨磷含量骨膠元含量 血清鈣(g) (mg) (mg/g) (mg/g) (mg/g) (μg/ml)對照組 287±19 137±7.1 29.1±1.4 12.3±0.5 5.56±0.57 2.73±0.17潑尼松組250±20*130±1126.4±2.2*12.9±1.34.48±0.76**3.16±0.28*丹參水提物組298±26Δ202±11*Δ#28.9±2.0Δ12.9±0.65.91±1.4Δ#2.71±0.10Δ丹參素組299±23Δ205±10*Δ#29.3±2.1Δ12.8±0.55.89±1.3Δ#2.69±0.11Δ綜合治療組 308±22Δ144±8.2 27.8±1.5 13.8±1.34.35±0.46**2.77±0.12Δ與對照組比較，*p＜0.05**p＜0.01；與模型組比較，Δp＜0.05ΔΔp＜0.01；與綜合組比較，#p＜0.05##p＜0.01。
2.2丹參水提物和丹參素對潑尼松干預(yù)的大鼠脛骨松質(zhì)骨骨形態(tài)計量學(xué)參數(shù)的影響 由表2、3(Table2、3)可見，潑尼松使骨小梁面積降低了43％(p＜0.01)，伴隨骨小梁數(shù)目減少(p＜0.01)、骨小梁厚度減少(p＜0.05)和骨小梁間隙增加(p＜0.01)，同時破骨細胞數(shù)目和周長明顯增多(p＜0.01)。動態(tài)參數(shù)顯示潑尼松有降低礦化骨形成的趨勢，但差別無顯著性(p＞0.05)，但可明顯降低骨形成率參數(shù)BFR/TV(p＜0.01)。與潑尼松組比較，丹參水提物和丹參素預(yù)防組增加了75％的骨小梁面積(p＜0.01)，已與正常組大鼠骨量相當(dāng)。同時增加骨小梁數(shù)目和厚度(p＜0.01)，減少間隙距離(p＜0.01)，減少破骨細胞數(shù)目和周長(p＜0.01)，增加骨形成率BFR/TV(p＜0.05)。綜合預(yù)防組也可對抗?jié)娔崴伤鹿莵G失和增加BFR/TV，但骨量的增加(57％)略比DWE組(75％)低。
表2丹參水提物和丹參素對潑尼松干預(yù)大鼠脛骨上段骨組織形態(tài)靜態(tài)參數(shù)的影響骨小梁面積骨小梁數(shù)目 骨小梁厚度 骨小梁間隙 破骨細胞數(shù)目破骨細胞周長組別(％)(mm-1) (μm)(μm) (mm-2) (％)對照組 15.07±1.70 2.92±0.2351.86±6.48 292.88±25.5211.42±1.460.873±0.09潑尼松組8.83±0.98**1.98±0.20**44.47±2.43*463.53±54.54**38.38±8.65**2.54±0.34**
丹參水提物 15.47±2.87ΔΔ3.08±0.41ΔΔ50.13±5.84ΔΔ278.85±41.28ΔΔ14.72±2.14*ΔΔ1.12±0.15*ΔΔ丹參素組 14.67±2.56ΔΔ2.98±0.43ΔΔ49.85±5.32ΔΔ265.86±42.35ΔΔ14.36±2.22*ΔΔ1.10±0.13*ΔΔ綜合治療組 13.93±2.48ΔΔ2.83±0.50ΔΔ49.02±1.92ΔΔ311.03±56.31ΔΔ16.14±3.33*ΔΔ1.15±0.26*ΔΔ與對照組比較，*p＜0.05**p＜0.01；與模型組比較，Δp＜0.05ΔΔp＜0.01；與綜合組比較，#p＜0.05##p＜0.01。I-％與對照組比較百分率變化；P-％與模型組比較百分率變化；S-％與綜合組比較百分率變化。
表3丹參水提物和丹參素對潑尼松干預(yù)大鼠脛骨上段骨組織形態(tài)動態(tài)參數(shù)的影響雙熒光周長百分率礦化沉積率骨表面骨形成率 骨轉(zhuǎn)換率骨組織骨形成率組別(％)(μm/d) (μm/d×100) (％/year) (％/year)對照組 31.88±8.19 0.85±0.1610.28±3.98 336.6±140.849.3±17.7潑尼松組 29.81±9.02 0.81±0.258.91±3.97 332.8±142.529.6±13.2*丹參水提物組 28.70±9.51 0.90±0.159.52±3.47 312.0±94.0 50.0±23.0Δ丹參素組 27.85±9.36 0.89±0.149.45±3.52 316.0±96.4 49.3±22.0Δ綜合治療組 31.67±5.41 0.92±0.1110.81±2.85 366.1±89.0 51.3±15.6Δ與對照組比較，*p＜0.05**p＜0.01；與模型組比較，Δp＜0.05ΔΔp＜0.01；與綜合組比較，#p＜0.05##p＜0.01。I-％與對照組比較百分率變化；P-％與模型組比較百分率變化；S-％與綜合組比較百分率變化。
2.3丹參水提物和丹參素對體外培養(yǎng)的成骨細胞活性的影響 丹參水提物的濃度在0.5-10.0g·L-1范圍可隨濃度增加而刺激成骨細胞分泌堿性磷酸酶(p＜0.01)，以1.0、2.0g·L-1作用最強，濃度增加到10.0g·L-1時作用減弱，50g·L-1時可抑制成骨細胞。丹參素的濃度在0.1-5.0mg·L-1的范圍內(nèi)可刺激成骨細胞分泌堿性磷酸酶(p＜0.01)，低于0.01mg·L-1和高于10mg·L-1均無作用。丹參素促進ALP作用隨時間延長作用明顯增加，從第2天增加27％至第10天增加101％。結(jié)果表明丹參素對成骨細胞堿性磷酸酶活性有濃度依賴性和時間依賴性。丹參水提物的作用與丹參素作用相吻合，說明丹參水提物的作用物質(zhì)很可能是丹參素。
2.4丹參水提物和丹參素能有效預(yù)防大鼠中樞毒性作用 本研究還觀察到丹參水提物和丹參素制劑對潑尼松長期應(yīng)用所造成的大鼠大腦功能下降有明顯的預(yù)防作用。研究證明應(yīng)用潑尼松可使大鼠海馬結(jié)構(gòu)發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，特定區(qū)域單位面積神經(jīng)錐體細胞數(shù)目下降，大錐體細胞發(fā)生明顯核固縮性壞死，腦組織切片檢查發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠海馬CA2和CA3區(qū)交界處神經(jīng)元大小分布規(guī)則，細胞結(jié)構(gòu)和層次清晰，呈C狀排列。潑尼松組大鼠海馬大錐體細胞數(shù)量下降，其中CA2和CA3區(qū)交界處362.5um長度范圍內(nèi)單位面積神經(jīng)錐體細胞數(shù)下降9％；海馬細胞結(jié)構(gòu)紊亂、排列分散，胞體腫脹或皺縮，部分可見核固縮深染，甚至可見神經(jīng)元壞死，大錐體細胞層中可見出現(xiàn)較多膠質(zhì)細胞。一般情況下，神經(jīng)元細胞核固縮現(xiàn)象極少見，而神經(jīng)元細胞核發(fā)生固縮是細胞死亡前的表現(xiàn)，潑尼松組大鼠海馬細胞發(fā)生明顯的變化提示潑尼松長期應(yīng)用可造成海馬神經(jīng)細胞死亡或加速神經(jīng)元退化，提示糖皮質(zhì)激素長期應(yīng)用導(dǎo)致的機體衰老、記憶力衰退可能與海馬細胞的凋亡有關(guān)。丹參水提物和丹參素組大鼠的單位面積海馬神經(jīng)元計數(shù)均有上升趨勢，大鼠海馬特定區(qū)域單位面積神經(jīng)錐體細胞數(shù)目分別比潑尼松組上升11％和9％，鏡下可見大錐體細胞排列規(guī)則，變性少，比潑尼松組明顯改善，提示丹參水提物和丹參素可有效保護由糖皮質(zhì)激素長期應(yīng)用所導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元損傷。
3討論本實驗結(jié)果顯示，糖皮質(zhì)激素在大鼠可引起類似人類的骨質(zhì)疏松，表現(xiàn)為骨的無機物(Ca)和有機質(zhì)物(HyP)均降低，骨量降低，伴隨松質(zhì)骨的骨結(jié)構(gòu)異常，血鈣增加，骨吸收增加和骨形成率減少。目前認為糖皮質(zhì)激素造成的骨質(zhì)疏松機制大致有三方面，(1)抑制成骨細胞的功能從而抑制骨基質(zhì)的形成；(2)鈣平衡失調(diào)引起繼發(fā)性甲狀旁腺激素(PTH)增高導(dǎo)致骨吸收增加，血鈣增加；(3)對抗雄激素的作用。綜合因素最終可導(dǎo)致骨形成減降，骨吸收增加，骨量丟失及骨結(jié)構(gòu)的破壞，從而易致骨折的產(chǎn)生[1]。還有學(xué)者認為，激素可造成骨髓脂肪代謝紊亂，脂肪在骨細胞內(nèi)沉積而導(dǎo)致成骨細胞死亡，并認為可引起骨髓微循環(huán)障礙和供血不足，兩者可導(dǎo)致股骨骨質(zhì)疏松和股骨頭無菌性壞死[7，8]。因此，本實驗選擇能改善骨的脂質(zhì)代謝和改善骨髓微循環(huán)的藥物丹參為候選藥物，目的是尋找能對抗糖皮質(zhì)激素所致骨質(zhì)疏松的新型藥物。
研究結(jié)果表明丹參水提物和丹參素能完全對抗由潑尼松所致骨指標(biāo)和血清鈣的異常，表現(xiàn)為明顯增加骨干重，骨鈣和骨羥脯氨酸的含量，骨形態(tài)計量學(xué)分析發(fā)現(xiàn)能提高骨量和改善骨結(jié)構(gòu)，降低骨小梁表面破骨細胞的數(shù)目和周長，增加骨形成率。骨有機質(zhì)中骨膠原占90％以上，主要由成骨細胞分泌產(chǎn)生，羥脯氨酸(HyP)是骨膠原中特殊成分，約占12.5％，測定HyP含量則可反映骨有機質(zhì)的相對含量，丹參水提物和丹參素均可使HyP增加比Ca增加更明顯。此外，丹參水提物和丹參素均明顯降低了骨小梁表面的破骨細胞數(shù)目和周長，降低血鈣，可推測丹參水提物和丹參素糾正了由潑尼松引起的繼發(fā)性甲狀旁腺素(PTH)增加導(dǎo)致破骨細胞功能升高而引起增加血鈣。這些結(jié)果表明丹參水提物和丹參素防止骨質(zhì)丟失與增加骨有機質(zhì)合成和抑制骨吸收有關(guān)。
研究結(jié)果還顯示，丹參水提物和丹參素可刺激大鼠原代培養(yǎng)的成骨細胞分泌堿性磷酸酶，引起酶活性增加的丹參水提物中丹參素含量與純品丹參素的濃度相對應(yīng)，說明丹參水提物的作用物質(zhì)可能就是丹參素。丁寅[9，10]等報導(dǎo)了丹參注射液有促進小鼠成骨細胞樣細胞MC3T3-E1的堿性磷酸酶活性，并抑制小鼠骨髓培養(yǎng)中破骨細胞的生成。已有許多研究證實丹參素具有抗脂質(zhì)氧化、擴張血管、改善微循環(huán)作用[11]，丹參的水溶性成份兒茶醛B可上調(diào)血管內(nèi)皮生長激素及其受體的表達刺激微血管生成，促進微循環(huán)[12]，兒茶醛A還可抑制低密度脂蛋白(LDL)的氧化從而抗動脈粥樣硬化[13]。因此，丹參水提物和丹參素保護糖皮質(zhì)激素對骨的作用，可能與這些水溶性成份密切相關(guān)，它們可改善與骨重建相密切交流的骨髓微循環(huán)環(huán)境，提高成骨細胞功能和可能抑制骨髓脂質(zhì)代謝，從而改善骨結(jié)構(gòu)。
本實驗還根據(jù)臨床對糖皮質(zhì)激素引起骨質(zhì)疏松的預(yù)防原則設(shè)計了綜合預(yù)防陽性組，藥物包括司坦唑醇、VitD3和鈣劑。目的檢驗造模的成功與否，及比較丹參水提物的療效。結(jié)果顯示綜合組也有預(yù)防作用，但在增加骨量，骨質(zhì)量(骨干重，骨鈣，骨有機質(zhì))方面，丹參水提物超過綜合組。對長期大量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素引起的腦損害丹參水提物和丹參素有保護作用，綜合預(yù)防陽性組沒有。提示丹參水提物作用更優(yōu)，為臨床應(yīng)用提供了充分依據(jù)。
綜上所述，丹參水提物有效預(yù)防糖皮質(zhì)激素所造的大鼠骨質(zhì)疏松，其機制與促進成骨細胞活性，促進骨基質(zhì)形成和抑制骨吸收有關(guān)。
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1.丹參的水提物在制備防治骨質(zhì)疏松癥的制劑中的應(yīng)用。
2.丹參素在制備防治骨質(zhì)疏松癥的制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了本發(fā)明涉及由唇形科植物丹參salvia miltiorrhiz Bge的水提物，或丹參的水溶性成分丹參素制備防治骨質(zhì)疏松癥的新藥。丹參的水提物包括原兒茶醛(Protocate Chualdehyde)、丹參素(Danshen Su)等。由丹參的水溶性成分提取的丹參素，也稱為D(+)β一(3，4一二羥基苯基)乳酸。本研究證明了丹參的水提物，丹參的水溶性成分丹參素制備的制劑對實驗動物骨質(zhì)疏松模型有明顯的防治作用。對長期大量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素引起骨質(zhì)疏松，丹參的水提物和丹參素有明顯的防治作用，該作用比綜合預(yù)防陽性組(藥物包括司坦唑醇、VitD3和鈣劑)更好，綜合組也有較好的預(yù)防作用，但在增加骨量，骨質(zhì)量(骨干重，骨鈣，骨有機質(zhì))方面，丹參水提物和丹參素的作用超過綜合組，對長期大量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素引起的腦損害丹參水提物和丹參素有保護作用，綜合預(yù)防陽性組沒有。本發(fā)明對丹參的水提物和丹參素用于防治人類骨質(zhì)疏松癥提出了新的思路。
文檔編號A61K31/185GK1543940SQ20031011628
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月17日
發(fā)明者崔燎, 吳鐵, 鄒麗宜, 劉鈺瑜, 艾春媚, 吳怡, 崔 燎 申請人:廣東醫(yī)學(xué)院