專(zhuān)利名稱(chēng)：從流感疫苗制劑中去除內(nèi)毒素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)過(guò)程，特別提供了一種從流感疫苗制劑中去除內(nèi)毒素的方法。
背景技術(shù)：
隨著基因工程技術(shù)的日益成熟，越來(lái)越多的重組蛋白質(zhì)藥物被開(kāi)發(fā)利用。由于生產(chǎn)過(guò)程中涉及到革蘭氏陰性的大腸桿菌以及分離純化過(guò)程復(fù)雜，因此會(huì)造成內(nèi)毒素的污染。
親和技術(shù)是分離純化生物大分子的有效手段，主要利用配基與生物大分子之間的親和作用原理。將配基通過(guò)化學(xué)鍵共價(jià)鍵合到多孔介質(zhì)上就得到親和介質(zhì)，可以用來(lái)選擇性地吸附內(nèi)毒素，實(shí)現(xiàn)從重組蛋白質(zhì)溶液中去除內(nèi)毒素的目標(biāo)。已有的親和配基和親和介質(zhì)包括單克隆抗體，多克隆抗體，抗生素，多粘菌素B，聚乙烯亞胺，組氨酸，凝膠過(guò)濾柱，親和膜，顆粒吸附劑等。如專(zhuān)利EP0800862，采用含有磺酸基的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，利用離子交換的原理，來(lái)去除重組蛋白質(zhì)腫瘤壞死因子或白介素中的內(nèi)毒素，主要吸附重組蛋白質(zhì)。
專(zhuān)利EP0337243，使用串聯(lián)的兩只反相液相色譜柱，來(lái)純化重組人IL-2。在純化重組人白介素-2的同時(shí)，去除內(nèi)毒素雜質(zhì)，流速低，介質(zhì)昂貴。
專(zhuān)利US4885168，采用低分子量殼聚糖，利用殼聚糖上帶正電荷的氨基來(lái)與帶負(fù)電荷的核酸與內(nèi)毒素作用，達(dá)到除去核酸與內(nèi)毒素的目的。但殼聚糖的利用率低。
專(zhuān)利00123290.6，魏桂林等的一種用于內(nèi)毒素去除的疏水荷正電親和膜，將胺類(lèi)疏水荷正電親和配基鍵合到纖維素膜上，得到相應(yīng)的親和膜。胺類(lèi)疏水荷正電親和配基包括2～12碳的烴基二胺、帶有乙烯基的不飽和雜環(huán)化合物、帶有環(huán)氧基團(tuán)的季銨鹽及帶有多個(gè)疏水基團(tuán)的季銨鹽。
D.Petsch，T.C.Beeskow等(1997，Journal of Chromatography B.693，79-91.)采用去氧膽酸鈉，或己二胺作為親和配基，以微孔尼龍膜為介質(zhì)，制成親和膜。采用單張親和膜，可以去除緩沖液或牛血清白蛋白中的內(nèi)毒素。但流速低，阻力高，處理量少，不易放大。
由于重組蛋白質(zhì)種類(lèi)較多，其分離純化步驟各不相同，生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)其中的內(nèi)毒素含量要求也有差異，因此去除內(nèi)毒素的方法和效果無(wú)法完全通用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從流感疫苗制劑中去除內(nèi)毒素的方法，用該方法可以達(dá)到既去除內(nèi)毒素，又盡可能減少流感疫苗活性損失的目的。
本發(fā)明提供了一種從流感疫苗制劑中去除內(nèi)毒素的方法，以親和介質(zhì)裝填成層析柱或膜過(guò)濾器，以靜態(tài)吸附或過(guò)濾的方式去除流感疫苗制劑中的內(nèi)毒素，其特征在于所述親和介質(zhì)為聚丙烯。
本發(fā)明從流感疫苗制劑中去除內(nèi)毒素的方法中，親和介質(zhì)可以為聚丙烯絲，直徑為0.13微米-40微米。
本發(fā)明從流感疫苗制劑中去除內(nèi)毒素的方法中，親和介質(zhì)也可以為由聚丙烯絲構(gòu)成的膜片，膜的密度為20g/m2-90g/m2。
本發(fā)明從流感疫苗制劑中去除內(nèi)毒素的方法中，可以用聚丙烯絲裝填層析柱，裝填密度為0.13g/cm3-0.5g/cm3。
本發(fā)明從流感疫苗制劑中去除內(nèi)毒素的方法中，流感疫苗與聚丙烯介質(zhì)的比例最好為20-200毫升/克。
本發(fā)明針對(duì)流感疫苗制劑生產(chǎn)過(guò)程中的內(nèi)毒素，根據(jù)其分子量大小、等電點(diǎn)的范圍、溶液中其它物質(zhì)的含量和種類(lèi)的需要，判斷和選擇了聚丙烯為親和介質(zhì)。
使用聚丙烯絲構(gòu)成的膜，膜在疫苗中浸泡， 流感疫苗與聚丙烯介質(zhì)的比例為20毫升/克，在8度的溫度下，以200rpm的頻率振蕩吸附3小時(shí)，溶液中的內(nèi)毒素濃度從＞8000EU/ml降低到＜150EU/ml，流感疫苗的活性成分回收率為95％以上。
使用聚丙烯絲構(gòu)成的膜，組裝成裝填密度為0.20g/cm3的膜過(guò)濾器，流感疫苗與聚丙烯介質(zhì)的比例為200毫升/克，在7度的溫度下，反復(fù)過(guò)濾吸附2小時(shí)，處理后疫苗溶液的內(nèi)毒素濃度從＞3000EU/ml降低到＜450EU/ml，流感疫苗的有效成分回收率為85％以上。
總之，本發(fā)明的從流感疫苗制劑中去除內(nèi)毒素的方法，可以在不改變疫苗原有性質(zhì)的條件下，有效地去除流感疫苗制劑生產(chǎn)中含有的內(nèi)毒素污染物，保留疫苗中的有效成分?？梢杂糜诹鞲幸呙绲纳a(chǎn)過(guò)程中，提高其生產(chǎn)質(zhì)量。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.
取直徑為0.13微米的聚丙烯絲構(gòu)成的膜，膜的密度為20g/m2，，在8度的溫度下，膜在疫苗中浸泡，流感疫苗與聚丙烯介質(zhì)的比例為20毫升/克，以200rpm的頻率振蕩吸附3小時(shí)，溶液中的內(nèi)毒素濃度從＞8000EU/ml降低到＜150EU/ml，流感疫苗的活性成分回收率為95％以上。
實(shí)施例2.
取直徑為0.26微米的聚丙烯絲構(gòu)成的膜，膜的密度為90g/m2，在8度的溫度下，膜在疫苗中浸泡，流感疫苗與聚丙烯介質(zhì)的比例為200毫升/克，以200rpm的頻率振蕩吸附3小時(shí)，溶液中的內(nèi)毒素濃度從＞5000EU/ml降低到＜1250EU/ml，流感疫苗的活性成分回收率為80％以上。
實(shí)施例3.
取直徑為40微米的聚丙烯絲，組裝成層析柱，裝填密度為0.5g/cm3，在8度的溫度下，絲在疫苗中浸泡，流感疫苗與聚丙烯介質(zhì)的比例為90毫升/克，以0.5ml/min的流速反復(fù)過(guò)濾吸附3小時(shí)，內(nèi)毒素的濃度從430EU/ml降低到250EU/ml，流感疫苗的活性成分回收率為85％以上。
實(shí)施例4.
取直徑為0.13微米的聚丙烯絲構(gòu)成的膜，膜的密度為60g/m2，組裝成膜過(guò)濾器，裝填密度為0.39g/cm3，流感疫苗與聚丙烯介質(zhì)的比例為200毫升/克，在7度的溫度下，以1ml/min的流速反復(fù)過(guò)濾吸附2小時(shí)，處理后疫苗溶液的內(nèi)毒素濃度從＞3000EU/ml降低到＜450EU/ml，流感疫苗的有效成分回收率為85％以上。
實(shí)施例5.
取直徑為0.13微米的聚丙烯絲構(gòu)成的膜，膜的密度為85g/m2，組裝成膜過(guò)濾器的裝填密度為0.13g/cm3，流感疫苗與聚丙烯介質(zhì)的比例為100毫升/克，在7度的溫度下，以1ml/min的流速反復(fù)過(guò)濾吸附2小時(shí)，處理后疫苗溶液的內(nèi)毒素濃度從＞400EU/ml降低到＜100EU/ml，流感疫苗的有效成分回收率為53％以上。
權(quán)利要求
1.一種從流感疫苗制劑中去除內(nèi)毒素的方法，以親和介質(zhì)裝填成層析柱或膜過(guò)濾器，以靜態(tài)吸附或過(guò)濾的方式去除流感疫苗制劑中的內(nèi)毒素，其特征在于所述親和介質(zhì)為聚丙烯。
2.按照權(quán)利要求1所述從流感疫苗制劑中去除內(nèi)毒素的方法，其特征在于所述親和介質(zhì)為聚丙烯絲，直徑為0.13微米-40微米。
3.按照權(quán)利要求2所述從流感疫苗制劑中去除內(nèi)毒素的方法，其特征在于所述介質(zhì)為由聚丙烯絲構(gòu)成的膜片，膜的密度為20g/m2-90g/m2。
4.按照權(quán)利要求2所述從流感疫苗制劑中去除內(nèi)毒素的方法，其特征在于所述層析柱，裝填密度為0.13g/cm3-0.5g/cm3。
5.按照權(quán)利要求1所述的從流感疫苗制劑中去除內(nèi)毒素的方法，其特征在于流感疫苗與聚丙烯介質(zhì)的比例為20-200毫升/克。
全文摘要
一種從流感疫苗制劑中去除內(nèi)毒素的方法，以親和介質(zhì)裝填成層析柱或膜過(guò)濾器，以靜態(tài)吸附或過(guò)濾的方式去除流感疫苗制劑中的內(nèi)毒素，其特征在于所述親和介質(zhì)為聚丙烯。本發(fā)明的從流感疫苗制劑中去除內(nèi)毒素的方法，可以在不改變疫苗原有性質(zhì)的條件下，有效地去除流感疫苗制劑生產(chǎn)中含有的內(nèi)毒素污染物，保留疫苗中的有效成分?？梢杂糜诹鞲幸呙绲纳a(chǎn)過(guò)程中，提高其生產(chǎn)質(zhì)量。
文檔編號(hào)A61P31/16GK1621089SQ200310119269
公開(kāi)日2005年6月1日 申請(qǐng)日期2003年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月26日
發(fā)明者李京華, 邵英光, 叢潤(rùn)滋, 王俊德 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所