專利名稱：在均相體系中大規(guī)模培養(yǎng)t－淋巴細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域涉及體外細(xì)胞培養(yǎng)和分離的人細(xì)胞的大規(guī)模擴(kuò)增。
現(xiàn)有技術(shù)一種抗腫瘤治療方法，是以利用來自體內(nèi)分離的細(xì)胞系或被賦予細(xì)胞毒活性的細(xì)胞為基礎(chǔ)的。
90年代初，從患有稱作TALL的急性T細(xì)胞淋巴母細(xì)胞白血病的兒童體內(nèi)，分離出多種T-淋巴細(xì)胞系。正如O’Connor等人(Blood，1991，771534-1545)和Cesano and Santoli(In Vitro Cell.Dev.Biol.，1992，28648-656)所描述的，它們包括T細(xì)胞系TALL-104、TALL-107、TALL-103/2。它們呈現(xiàn)出如此引人注意的特征，使其現(xiàn)已成功用于動(dòng)物模型和人的腫瘤治療(Cesano等人，Blood 1991，87393-403；Cesano等人，Cancer Res.，1996，563021-3029、US5,272,082；US5,683,690；US5,702,702)。
TALL細(xì)胞系被賦予特異的抗腫瘤細(xì)胞毒活性，并且有效對(duì)抗不同類型的腫瘤這些細(xì)胞的主要特征在于它們是MHC非限制性的(Cesano等人，J.Immunol.，1993，1512943-2957)因而可對(duì)任何患者給藥，不受組織相容性抗原表型的限制。而且，不同于某些類型的細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞，例如TIL和LAK，體內(nèi)給藥后TALL細(xì)胞系不需要淋巴因子的伴隨治療。這是該細(xì)胞的另一優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榱馨鸵蜃拥耐瑫r(shí)給藥具有若干缺點(diǎn)。
另外，TALL淋巴細(xì)胞已在多種腫瘤中試驗(yàn)成功。這正是它們?yōu)槭裁幢徽J(rèn)為是一種值得關(guān)注的治療選擇的原因。但是，正如Cesano等人Cancer Res.，1996 564444-4452和Visonneau等人，Clin.CancerRes.，1997，31789-1797所描述，迄今所用的細(xì)胞擴(kuò)增體系受到限制的，因?yàn)闉檫^繼性免疫療法制備的細(xì)胞來自生長于單個(gè)搖瓶的培養(yǎng)物，盡管用于制備單克隆抗體和重組體蛋白質(zhì)那樣的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)裝置已長期使用。因此，非常希望有適合這種細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)體系。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種方法，該方法以使用均相培養(yǎng)體系為基礎(chǔ)，用于TALL淋巴細(xì)胞的大規(guī)模擴(kuò)增和培養(yǎng)?！按笠?guī)模數(shù)量的TALL淋巴細(xì)胞”代表至少1×109個(gè)細(xì)胞。
具體而言，本發(fā)明方法使用的發(fā)酵罐或均相體系為細(xì)胞工廠，優(yōu)選由數(shù)十個(gè)小室組成?？捎帽景l(fā)明方法擴(kuò)增的淋巴細(xì)胞選自由TALL-104、TALL-107、TALL-103/2組成的組，可任選經(jīng)過遺傳修飾。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種細(xì)胞采樣方法，該方法對(duì)袋子裝填?yuàn)A頭進(jìn)行密封，從而生成至少一個(gè)采樣小室，其中含有足夠采樣數(shù)目的細(xì)胞。
附圖簡要說明

圖1為生長于搖瓶中的TALL細(xì)胞的葡萄糖水平和細(xì)胞濃度說明圖。
用15個(gè)搖瓶的TALL測定了以下參數(shù)細(xì)胞數(shù)/毫升(-◆-)和葡萄糖水平(深色線條)。
發(fā)明詳細(xì)說明本發(fā)明涉及TALL淋巴細(xì)胞的大規(guī)模擴(kuò)增方法，其中在優(yōu)選由單個(gè)發(fā)酵裝置組成的均相體系中培養(yǎng)至少1×109個(gè)細(xì)胞。
TALL(急性T細(xì)胞淋巴母細(xì)胞性白血病)淋巴細(xì)胞是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，來自類淋巴母細(xì)胞白血病兒科患者，包括TALL-104、TALL-107、TALL-103/2細(xì)胞系，正如O’Connor等人在Blood，1991，771534-1545和Cesano和Santoli在In Vitro Cell.Dev.Biol.，1992，28648-656所描述。優(yōu)選的細(xì)胞系為TALL-104。TALL細(xì)胞還可以是經(jīng)過遺傳修飾的。
目前它們?cè)趩蝹€(gè)搖瓶中擴(kuò)增所能達(dá)到的最大值僅為約1×108個(gè)細(xì)胞/T175搖瓶。
因此，迄今制備含有治療有效量的細(xì)胞袋，其包含細(xì)胞數(shù)為105～1012，優(yōu)選1×107～1×1010，更優(yōu)選1×108～2.5×109，涉及大量單個(gè)搖瓶的同時(shí)擴(kuò)增。
根據(jù)本發(fā)明定義，由于每個(gè)搖瓶的培養(yǎng)微環(huán)境不同，所以單個(gè)搖瓶中的培養(yǎng)代表不均一培養(yǎng)體系。因此，根據(jù)FDA指南美國衛(wèi)生部的“工業(yè)指南用于人體細(xì)胞治療和基因治療指南”(CBER，March 1998，PointIII)—建議對(duì)由獨(dú)立體系制備的每批細(xì)胞混合物應(yīng)分別控制—所以用現(xiàn)有技術(shù)方法制備的來源于單個(gè)搖瓶的細(xì)胞代表不同的批次，因而應(yīng)獨(dú)立控制。因此，開發(fā)治療用細(xì)胞，特別是TALL細(xì)胞的均相培養(yǎng)體系，對(duì)批次控制同樣具有巨大的優(yōu)勢。
此外，在大量單個(gè)搖瓶組成的多相體系中擴(kuò)增，由于操作者重復(fù)進(jìn)行手工操作，可能導(dǎo)致較高的污染風(fēng)險(xiǎn)。
TALL細(xì)胞通常懸浮生長，但令人驚奇的是，在已知用于這種細(xì)胞的工業(yè)放大體系中，例如旋轉(zhuǎn)搖瓶或miniPERM，其不能被放大或擴(kuò)增。由于最大的商品化搖瓶(T175)最多只能容許獲得1.5～2×108的TALL細(xì)胞，當(dāng)生產(chǎn)細(xì)胞數(shù)目超過109，例如生產(chǎn)至少2.5×109治療劑量的細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞的分步-擴(kuò)增變得極為復(fù)雜。
申請(qǐng)人意外地發(fā)現(xiàn)，在均相體系中，例如通常用于貼壁依賴性細(xì)胞的細(xì)胞工廠中，可有效培養(yǎng)和擴(kuò)增該細(xì)胞。相反地，傳統(tǒng)用于大規(guī)模培養(yǎng)懸浮細(xì)胞，如具有與TALL細(xì)胞相似生長特性的雜交瘤細(xì)胞的旋轉(zhuǎn)搖瓶或其它發(fā)酵罐卻不適合。
“大規(guī)模生產(chǎn)”是指在均相體系中生產(chǎn)至少1×109個(gè)TALL細(xì)胞。
在本發(fā)明方法中，涉及細(xì)胞數(shù)目的數(shù)據(jù)存在約5％的容許誤差，代表在Burker’s槽內(nèi)測定細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)的可能誤差。例如，1×106個(gè)細(xì)胞事實(shí)上指的是0.95×106～1.05×106的細(xì)胞數(shù)目。測量誤差是可變的，取決于采用的測量方法。
根據(jù)本發(fā)明方法，在細(xì)胞工廠中的TALL擴(kuò)增優(yōu)選先進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，由在同一搖瓶中的一系列體積擴(kuò)增組成(其中搖瓶用作細(xì)胞培養(yǎng)容器)，通過向培養(yǎng)物中連續(xù)加入新鮮的完全培養(yǎng)基，將全部培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入具有更大體積的搖瓶中，最終轉(zhuǎn)至具有最大體積和最大表面積的商品化搖瓶，例如T175搖瓶中。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選特征，進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增直至獲得總數(shù)約3～4×108細(xì)胞，其中約2～2.5×108細(xì)胞用于各細(xì)胞工廠的接種，約1～1.5×108細(xì)胞用于在T175培養(yǎng)瓶中的并行維持。
將細(xì)胞培養(yǎng)物分開，使細(xì)胞濃度值恢復(fù)至最佳接種值，即0.7～1×108細(xì)胞/毫升，在此稱為″傳代″。在此濃度下，細(xì)胞將迅速達(dá)到約2.5×109細(xì)胞/毫升的濃度。
預(yù)擴(kuò)增優(yōu)選在完全培養(yǎng)基中進(jìn)行，更優(yōu)選IMDM，其含有2mM谷氨酰胺、濃度為2～20％，優(yōu)選5％的胎牛血清(FBS)和細(xì)胞因子，優(yōu)選白細(xì)胞介素，更優(yōu)選IL-2或IL-15。優(yōu)選，每隔48～72小時(shí)加入100IU/ml的IL-2。在均相體系中，擴(kuò)增階段用的培養(yǎng)基與預(yù)擴(kuò)增階段相同，但至少部分地將胎牛血清替換成人AB血清。該替換也可在細(xì)胞轉(zhuǎn)入均相細(xì)胞培養(yǎng)體系之前，例如在預(yù)擴(kuò)增階段的最后一代進(jìn)行?？捎闷渌呐囵B(yǎng)基替代IMDM，例如RPMI、Ham’s-F12等等。優(yōu)選無抗生素培養(yǎng)基。
優(yōu)選含2mM谷氨酰胺無抗生素的IMDM培養(yǎng)基，此處稱為“完全培養(yǎng)基”；可向其中補(bǔ)充FBS或人血清。
白細(xì)胞介素，優(yōu)選IL-2或IL-15，每隔48～72小時(shí)加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，至終濃度為50～150 IU/ml，更優(yōu)選100 IU/ml。
細(xì)胞優(yōu)選在包含5～12％CO2，優(yōu)選10％CO2的空氣混合物中，于37℃孵育。所有傳代出現(xiàn)的細(xì)胞或培養(yǎng)基的手工操作均在無菌條件進(jìn)行，例如Biohazard垂直層流罩超靜臺(tái)(class 100)。
根據(jù)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，預(yù)擴(kuò)增培養(yǎng)物始于冷凍MCB[主細(xì)胞庫(Master Cell Bank)]的培養(yǎng)管或小瓶，含有1×107～2×107細(xì)胞/管/毫升，其保存于液氮中，在37℃恒溫水浴中解凍。
在層流罩超靜臺(tái)內(nèi)，向培養(yǎng)小瓶內(nèi)加入8-10倍體積的解凍溶液(含20％FBS的完全I(xiàn)MDM)。離心細(xì)胞(1500轉(zhuǎn)/分，10分鐘)。吸出上清液，向細(xì)胞沉淀中加入10毫升完全培養(yǎng)基，將重懸細(xì)胞轉(zhuǎn)入T25搖瓶內(nèi)。加入用完全培養(yǎng)基稀釋至終濃度約為100IU/ml的IL-2。在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)所得細(xì)胞濃度達(dá)到該細(xì)胞占據(jù)整個(gè)搖瓶表面時(shí)，使細(xì)胞培養(yǎng)物在兩倍體積的培養(yǎng)基中擴(kuò)增(在兩個(gè)T25搖瓶中擴(kuò)增)。為此，加入等體積的新鮮培養(yǎng)基，將培養(yǎng)物分成相等的兩瓶，使其恢復(fù)至最佳細(xì)胞濃度(接種細(xì)胞濃度)，通常為0.7～1×106細(xì)胞/毫升，其中每個(gè)搖瓶的體積與初始體積相當(dāng)。
為保持培養(yǎng)基中最佳的氣體交換，在T25搖瓶中最佳的細(xì)胞培養(yǎng)基體積為7～12毫升，優(yōu)選10毫升；在T75搖瓶中為20～60毫升，優(yōu)選40毫升；在T175搖瓶中為40～200毫升。上述體積為近似值，并被稱為最佳細(xì)胞濃度條件。解凍后，通常3～7天，優(yōu)選5天后，達(dá)到最佳細(xì)胞濃度。大約3天后，將細(xì)胞從T25搖瓶傳至2個(gè)T75搖瓶中；如果T75搖瓶中還有剩余細(xì)胞，將其收集起來；根據(jù)上述指示濃度加入IL-2至新鮮的培養(yǎng)中。
大約3天后，將細(xì)胞從2個(gè)T75搖瓶傳至2個(gè)T175搖瓶中。如果T75搖瓶中有剩余的細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基沖洗收集，至終體積為40ml，并按比例加入IL-2。2-3天后，將細(xì)胞從2個(gè)T175搖瓶傳至4個(gè)20ml的T175搖瓶，立即向其中加入相同體積的完全培養(yǎng)基和成比例的IL-2。大約2天后，將細(xì)胞從4個(gè)T175搖瓶傳至8個(gè)T175搖瓶中。向每個(gè)T175搖瓶中加入約20毫升的完全培養(yǎng)基和成比例的IL-2。大約2天后，向8個(gè)T175搖瓶中加入約40毫升含2％～10％，優(yōu)選4％～6％，更優(yōu)選5％人血清的完全培養(yǎng)基和成比例的IL-2。2天后，向8個(gè)T175搖瓶中加入約80毫升含有成比例的IL-2的完全培養(yǎng)基。
最終的T175搖瓶收獲體積通常為140-180毫升。預(yù)擴(kuò)增階段在約15天后結(jié)束，培養(yǎng)基中細(xì)胞數(shù)為0.9×109～1.1×109(該值通常相當(dāng)于8個(gè)各含160毫升細(xì)胞懸液的T175搖瓶)，培養(yǎng)基含人血清終濃度為2％～5％，優(yōu)選3％～4％；任選的，終濃度為0～5％，優(yōu)選1.5％～3％的胎牛血清(FBS)。
從含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基向含人血清培養(yǎng)基的傳代，優(yōu)選在搖瓶預(yù)擴(kuò)增階段的最后兩代期間進(jìn)行，優(yōu)選T175，優(yōu)選使用含人血清的新鮮培養(yǎng)基連續(xù)稀釋含F(xiàn)BS的培養(yǎng)物。
向細(xì)胞工廠中接種細(xì)胞數(shù)為1.5～2.5×107/室，體積為細(xì)胞工廠最終容積的1/6～1/10，優(yōu)選1/8。接種至最終容積為2升的10-室細(xì)胞工廠時(shí)，接種1.5～2.5×108于體積為200～330ml的培養(yǎng)基中，優(yōu)選230～270毫升，立即加入同體積的新鮮完全培養(yǎng)基，其最多含10％，優(yōu)選5％的人血清和細(xì)胞因子，優(yōu)選白細(xì)胞介素，更優(yōu)選IL-2或IL-15，最優(yōu)選IL-2，終濃度80～120IU/ml，優(yōu)選100IU/ml。
每隔3-5天，優(yōu)選每隔4天，通常為細(xì)胞復(fù)制期間，加入完全培養(yǎng)基，體積相當(dāng)于細(xì)胞工廠內(nèi)所含有的培養(yǎng)基，使細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)增和生長，直至達(dá)最大終體積2升/10-室細(xì)胞工廠，細(xì)胞數(shù)為1.5～2.5×109。在細(xì)胞工廠中擴(kuò)增TALL細(xì)胞需要加入最多含有10％，優(yōu)選3～7％，更優(yōu)選4～6％，最優(yōu)選5％人血清的新鮮培養(yǎng)基。因此，在根據(jù)本發(fā)明的均相培養(yǎng)體系擴(kuò)增階段，優(yōu)選不使用或較少使用胎牛血清。如果有痕量的FBS，其可能出現(xiàn)在本發(fā)明方法的末期，是用含有人血清的培養(yǎng)基連續(xù)稀釋含有FBS培養(yǎng)基的結(jié)果。
簡言之，根據(jù)一般方案方法，無論是在搖瓶中的預(yù)擴(kuò)增階段還是在均相體系中的擴(kuò)增階段，接種液中的細(xì)胞濃度均不低于0.7×106細(xì)胞/毫升(該值相當(dāng)于每隔48～72小時(shí)將細(xì)胞培養(yǎng)物分成2份或3份所達(dá)到的值)，優(yōu)選0.75×106/毫升。相反，在收獲細(xì)胞前不久的最后培養(yǎng)階段，細(xì)胞濃度不超過2×106，優(yōu)選1.5×106/毫升。
根據(jù)本發(fā)明方法，在40-室細(xì)胞工廠中進(jìn)行接種，其最大培養(yǎng)容積為8升，可供總數(shù)約8～10×109細(xì)胞生長于單一均相體系中，按比例計(jì)算出接種細(xì)胞的體積和數(shù)目。
根據(jù)本發(fā)明方法，由均相培養(yǎng)體系至少可生產(chǎn)一個(gè)含有最高治療劑量，即2.5×109細(xì)胞的TALL細(xì)胞袋子(含1×108～2.5×109細(xì)胞的袋子)。因此，根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施例，該方法還包括制備數(shù)目至少為1×109TALL淋巴細(xì)胞的冷凍袋，其特征在于所述TALL細(xì)胞由均相培養(yǎng)體系擴(kuò)增。所用袋子具有可變的體積，因此可含有不同治療劑量的細(xì)胞。優(yōu)選使用冷凍和輸注袋，更優(yōu)選Baxter Cryocyte’s袋。
為制備治療用細(xì)胞袋，將收獲自細(xì)胞工廠的細(xì)胞置于50毫升無菌試管中，按照本領(lǐng)域已知方法，在β粒子加速器(電子回旋加速器)中照射。已經(jīng)證實(shí)該方法可提供與傳統(tǒng)來源如Cs137相同的粒子量。本方法使用電子回旋加速器具有下列優(yōu)點(diǎn)即，它不是放射性的，并能對(duì)溶液產(chǎn)生均勻照射。照射后立刻離心細(xì)胞(1500轉(zhuǎn)/分10分鐘)。此時(shí)抽取細(xì)胞樣品用于質(zhì)量測試。
照射的細(xì)胞與最終的懸浮組份及無菌袋一起，置于層流罩超靜臺(tái)內(nèi)。細(xì)胞重懸于冷凍液中，冷凍液由8～30毫升含Rimso 50(50％DMSO)(20％)和5％人白蛋白(80％)的培養(yǎng)基組成，更優(yōu)選在10～25毫升完全培養(yǎng)基中包含TALL細(xì)胞劑量為1×108～2.5×109。優(yōu)選地，袋中細(xì)胞濃度為106～108細(xì)胞/毫升。冷凍前照射細(xì)胞可于4℃貯存至多24小時(shí)。
通過在顯微鏡下Burker’s槽內(nèi)計(jì)數(shù)，或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知方法，估計(jì)細(xì)胞濃度。在無菌條件下裝袋。
袋子裝滿后立即封口，例如通過熱封口，使裝袋夾頭轉(zhuǎn)變成兩個(gè)，優(yōu)選三個(gè)部分，產(chǎn)生一個(gè)或優(yōu)選兩個(gè)含有細(xì)胞的小室，其中所述細(xì)胞稱為本發(fā)明目的的″可信樣品″。兩個(gè)袋子的夾頭部分含有的細(xì)胞等份是分開的，但來自相同的培養(yǎng)批次。
根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，夾頭小室含有細(xì)胞懸液的體積為0.1～1毫升，優(yōu)選0.3毫升，且細(xì)胞數(shù)目/小室至少可滿足一系列的質(zhì)量和/或無菌控制?？蓮男∈覂?nèi)容易地抽取相當(dāng)于可信樣品的細(xì)胞，而無需打開整個(gè)袋子。
本發(fā)明的其它目的包括，含“可信樣品”的小室、封接袋子夾頭成為一個(gè)或多個(gè)部分的方法、可信樣品袋的形成方法。
用于冷凍和輸注的袋子于-80℃冷凍。
本發(fā)明的另一目的是提供制備數(shù)目至少為1×109的TALL淋巴細(xì)胞冷凍袋的方法，其中所述數(shù)目來自單一的均相培養(yǎng)體系。根據(jù)本發(fā)明方法擴(kuò)增的細(xì)胞，可在從均相培養(yǎng)體系收獲自的細(xì)胞冷凍之前進(jìn)行質(zhì)量控制，意在檢查性質(zhì)穩(wěn)定性，例如免疫標(biāo)記物的百分?jǐn)?shù)和TALL細(xì)胞成品的生物學(xué)活性。根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的細(xì)胞在冷凍后同樣是穩(wěn)定的。
優(yōu)選按照本領(lǐng)域公知方法進(jìn)行質(zhì)量控制，包括以下測定-存活力，優(yōu)選采用臺(tái)盼藍(lán)排除試驗(yàn)測定；必須是80％min；-生物學(xué)活性，優(yōu)選采用細(xì)胞毒性試驗(yàn)測定(腺苷酸激酶測定)，盡管也可使用替代試驗(yàn)；以10/1的比率，靶細(xì)胞K562的裂解必須高于60％；-內(nèi)毒素水平，優(yōu)選采用Lymulus阿米巴狀細(xì)胞裂解物比色試驗(yàn)測定；必須≤0.5 EU/mL；-免疫標(biāo)記物表型，優(yōu)選采用免疫熒光(FACS)進(jìn)行測定，標(biāo)記物即CD3+、CD8+、CD56+的給出值至少必須為90％；-增殖，優(yōu)選采用3H-TdR摻入試驗(yàn)進(jìn)行測定，72小時(shí)后測定的增殖必須至少等于背景值的兩倍或更高。
根據(jù)本發(fā)明方法，均相體系培養(yǎng)細(xì)胞的測量參數(shù)例如免疫標(biāo)記物百分率、生物學(xué)活性，以及代謝標(biāo)記物活性例如細(xì)胞培養(yǎng)基中的葡萄糖水平，與多相體系培養(yǎng)細(xì)胞的測量參數(shù)相比，變化較少。
事實(shí)上，在細(xì)胞工廠均相培養(yǎng)體系中，TALL細(xì)胞表達(dá)的免疫標(biāo)記物的百分比，對(duì)于CD3+和CD56+至少為90％，更優(yōu)選至少95％，最優(yōu)選至少98％；對(duì)于CD8+至少為90％，更優(yōu)選至少93％，比搖瓶中培養(yǎng)的細(xì)胞低。表達(dá)CD56+標(biāo)記物的值，其結(jié)果優(yōu)選至少95％min，優(yōu)選至少97％，在本發(fā)明方法過程中高于多相搖瓶體系培養(yǎng)的細(xì)胞。同時(shí)通過細(xì)胞毒性試驗(yàn)，測定了對(duì)靶細(xì)胞通常優(yōu)選K562的生物學(xué)活性，其高于驗(yàn)收限度，且始終高于對(duì)照的70％，其中對(duì)照由適當(dāng)數(shù)目裂解誘導(dǎo)完全的細(xì)胞組成。根據(jù)本發(fā)明另外的實(shí)施例，本發(fā)明包含TALL淋巴細(xì)胞，優(yōu)選TALL-104，可根據(jù)本發(fā)明方法獲得。
測定的葡萄糖水平也證明，相對(duì)于搖瓶培養(yǎng)的細(xì)胞，根據(jù)本發(fā)明方法在細(xì)胞工廠中培養(yǎng)的細(xì)胞代謝條件更均勻(圖1)事實(shí)上，在搖瓶中測定的葡萄糖濃度為300～400mg/dl，在細(xì)胞工廠的測定值為350～380mg/dl。
根據(jù)一個(gè)簡化的實(shí)施例，本發(fā)明方法包括按照本領(lǐng)域公知方法進(jìn)行的任一TALL細(xì)胞培養(yǎng)物的預(yù)擴(kuò)增階段，包括接種2×107細(xì)胞/室于細(xì)胞工廠中，初始體積為細(xì)胞工廠最終容積的1/10～1/6，和細(xì)胞工廠中的細(xì)胞擴(kuò)增階段，優(yōu)選10-室的細(xì)胞工廠(最終容積約2L)，共約2×108細(xì)胞接種于約250毫升中。
在本方法采用的條件下，優(yōu)化了細(xì)胞工廠大規(guī)模擴(kuò)增階段最小接種濃度與擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束時(shí)最大收獲濃度的比值。事實(shí)上，根據(jù)本發(fā)明方法，在擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束時(shí)細(xì)胞數(shù)目約增大10倍(從1.5～2.5×108細(xì)胞至1.5～2.5×109細(xì)胞)，而體積僅增大8倍。均相培養(yǎng)體系的更多優(yōu)勢在于1)消除細(xì)胞生長的多相性條件；2)減少手工操作次數(shù)因而減少污染可能性；3)減少工時(shí)和人員消耗。
根據(jù)本發(fā)明方法的另一優(yōu)點(diǎn)在于，使用無抗生素培養(yǎng)基，其相對(duì)于多個(gè)搖瓶培養(yǎng)體系，減少了污染風(fēng)險(xiǎn)。
根據(jù)本發(fā)明方法另外的優(yōu)點(diǎn)，是使用優(yōu)選最大濃度為10％的人血清。因此，根據(jù)本發(fā)明方法，通過使用優(yōu)選濃度為4～6％的人血清可獲得良好的細(xì)胞擴(kuò)增。
從而，通過施行細(xì)胞工廠的擴(kuò)增階段，治療用TALL細(xì)胞袋的整個(gè)制備方法得以優(yōu)化，并適合于大規(guī)模應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明TALL擴(kuò)增方法的優(yōu)點(diǎn)可概括如下i)質(zhì)量控制減少至單個(gè)采樣裝置，其對(duì)應(yīng)于單個(gè)生產(chǎn)裝置(細(xì)胞工廠)；相反地，采用數(shù)目多很多的單個(gè)發(fā)酵裝置在不同時(shí)間工作進(jìn)行擴(kuò)增容易增加污染風(fēng)險(xiǎn)，如此達(dá)到的擴(kuò)增污染可能性增加；ii)使用有限數(shù)目的生物反應(yīng)器結(jié)果節(jié)省大約30％時(shí)間，并降低25％成本。
應(yīng)當(dāng)指出，根據(jù)本領(lǐng)域已知的擴(kuò)增這類細(xì)胞的方法，可由35個(gè)T175和體積為2.8L完全培養(yǎng)基，得到2.5×109數(shù)目的細(xì)胞，相當(dāng)于約25個(gè)108細(xì)胞袋或1個(gè)2.5×109細(xì)胞袋。由此可見，采用根據(jù)本發(fā)明方法，可節(jié)約原材料(人血清外，培養(yǎng)基，細(xì)胞因子)高達(dá)約30％。
另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)來自對(duì)成品批次的控制數(shù)目，在本領(lǐng)域已知的多相體系中成品批次，最多含有1×108細(xì)胞，而在本發(fā)明描述的均相體系中生產(chǎn)的成品批次細(xì)胞數(shù)目多10倍。在實(shí)踐中，這意味著控制數(shù)目低10倍。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1.材料搖瓶Falcon，Beckton Dikinson；細(xì)胞工廠產(chǎn)品目錄號(hào)164327或170009，Nunc A/S，丹麥；www.nuncbrand.com；培養(yǎng)基Iscove’s Modified Dulbecco Medium，Biowhittaker 12-722，補(bǔ)充谷氨酰胺；含谷氨酰胺和血清的CM(完全培養(yǎng)基)；胎牛血清Biowhittaker，美國；人血清，AB型，Biowhittaker；IL-2 Proleukin 1，Chiron；生理鹽水磷酸鹽緩沖液，Biowhittaker；
人白蛋白(5％)，F(xiàn)arma Biagini；RIMSO 50，Baxter；用于冷凍和輸注的袋子，Cryocyte Baxter。
2.方法所有細(xì)胞培養(yǎng)均在Biohazard’s層流罩超靜臺(tái)內(nèi)無菌的環(huán)境中進(jìn)行。每次加入或抽取，均用異丙醇或火焰消毒管口入口。
2.1.培養(yǎng)基制備每批血清在56℃恒溫浴中去補(bǔ)體1h。去補(bǔ)體的血清瓶保存于4℃，并在去補(bǔ)體后一個(gè)月內(nèi)使用。
2.2.用于預(yù)擴(kuò)增階段的完全培養(yǎng)基500毫升的IMDM瓶中加入去補(bǔ)體的FBS(50毫升)；標(biāo)明瓶子的批次。完全培養(yǎng)基保存于4℃，使用前加熱至室溫。該完全培養(yǎng)基在制備后一個(gè)月內(nèi)使用。
2.3.用于在細(xì)胞-工廠中放大的完全培養(yǎng)基500毫升IMDM瓶中加入25毫升去補(bǔ)體的人血清AB。該培養(yǎng)基保存于4℃，使用前加熱至室溫。該完全培養(yǎng)基在制備后一個(gè)月內(nèi)使用。
2.4.IL-2的制備白細(xì)胞介素(18×106IU/vial)重懸于20毫升PBS中，得到約9×105IU/ml。所得溶液用0.22um過濾器過濾，分成1毫升的等份裝入小瓶。各等份保存于-80℃。
該溶液(1毫升)用完全培養(yǎng)基稀釋得到104IU/ml的溶液，相應(yīng)于2.2.節(jié)的培養(yǎng)基用于預(yù)擴(kuò)增階段，相應(yīng)于2.3.節(jié)的培養(yǎng)基用于擴(kuò)增階段。將該溶液加入同樣經(jīng)培養(yǎng)基稀釋(1/100)的細(xì)胞懸液中。
2.5.方法控制生物負(fù)載測定用于培養(yǎng)TALL細(xì)胞系的完全培養(yǎng)基中(IMDM+補(bǔ)充血清)的微生物污染。所得培養(yǎng)基經(jīng)孔徑0.45um的膜過濾，用無菌小刀移去濾膜并放入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，用于顯示微生物污染(所用培養(yǎng)基為胰酶消化的大豆瓊脂)。將濾膜置于培養(yǎng)皿中。于20-25℃孵育至少3天后，可檢出霉菌的存在，30-35℃再孵育至少3天，可檢出細(xì)菌的存在。肉眼觀察培養(yǎng)皿，檢查微生物的生長(最多100CFU)。
微生物的監(jiān)控控制用于TALL處理的層流罩超靜臺(tái)，檢查在操作過程中微生物(如果有)是否出現(xiàn)。在操作者處理細(xì)胞(傾倒、裝袋)時(shí)，將TSB瓊脂培養(yǎng)皿暴露于層流罩超靜臺(tái)內(nèi)，操作完成后蓋上蓋子，并于20-25℃孵育至少3天，以檢測霉菌的存在，于30-35℃孵育至少3天以檢測細(xì)菌的存在。在搖瓶手工操作過程中兩例采樣發(fā)現(xiàn)有微生物，而在細(xì)胞工廠手工操作過程中沒有檢測到污染。
實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的解凍和擴(kuò)增制備解凍溶液，由補(bǔ)充有20％FBS的IMDM培養(yǎng)基組成，使用前保存于4℃。
從液氮罐中取出含冷凍細(xì)胞的安瓿，適當(dāng)解凍，然后用解凍培養(yǎng)基稀釋(1∶10)。以低轉(zhuǎn)速離心細(xì)胞10分鐘。沉淀重懸于10毫升完全培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入T25搖瓶，并加入IL-2至濃度為100IU/ml。
細(xì)胞在含10％CO2的環(huán)境中，于37℃孵育5天。
孵育5天后，將細(xì)胞分入(1∶2)含相同濃度白細(xì)胞介素2的新鮮培養(yǎng)基中，維持2天使其長至匯合。從搖瓶中輕輕地移出細(xì)胞，轉(zhuǎn)入含相同濃度(100IU/ml)IL-2、終體積為20ml培養(yǎng)基的T75搖瓶中。約2-3天達(dá)到匯合后，使細(xì)胞再保持2天，然后在含IL-2、終體積為40ml培養(yǎng)基的T175搖瓶擴(kuò)增。兩天后，再加入40毫升白細(xì)胞介素完全培養(yǎng)基；使細(xì)胞再生長2天，將其分入(1∶2)另2個(gè)T175搖瓶中，終體積為80ml/T175。
在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和濃度。然后將細(xì)胞加入5％完全培養(yǎng)基(含人AB血清的IMDM)中至終體積為150ml/搖瓶，按比例加入IL-2。將細(xì)胞分入(1∶2)數(shù)目相同的T175搖瓶中，終體積為150毫升。
實(shí)施例2.TALL細(xì)胞在miniPERM發(fā)酵罐和自旋搖瓶中的動(dòng)態(tài)生長解凍細(xì)胞，在T25中培養(yǎng)擴(kuò)增至數(shù)目為7×105cells/ml，接種于0.5L的自旋搖瓶或miniPERM中。
在T75搖瓶中進(jìn)行對(duì)生長參數(shù)設(shè)置有意義的測定當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到至少1×106/ml時(shí)分開細(xì)胞。為維持較高的細(xì)胞存活力(90％min)和較高的細(xì)胞分裂速度，稀釋的細(xì)胞不低于7×105細(xì)胞/毫升，細(xì)胞生長量不超過2×106/ml。在細(xì)胞濃度最大時(shí)，葡萄糖水平約320～380mg/ml。在T175中，終體積為80毫升時(shí)，得到濃度為1.25×106細(xì)胞/毫升，相當(dāng)于總共約100×106細(xì)胞/搖瓶。要在凍/融期間具有較高生命力，估計(jì)細(xì)胞/管的最小值需高于1.2×107。還觀察到，在對(duì)數(shù)生長期冷凍的細(xì)胞，解凍后9-10天內(nèi)依次到達(dá)對(duì)數(shù)生長期，而冷凍于其它生長周期階段的細(xì)胞呈現(xiàn)較長時(shí)間的滯后(10-12天)。
旋轉(zhuǎn)搖瓶0.5L的旋轉(zhuǎn)搖瓶具有300毫升的工作體積。接種1.5×107細(xì)胞；旋轉(zhuǎn)設(shè)定為3轉(zhuǎn)/分；48小時(shí)后測定細(xì)胞存活力等于50％。120小時(shí)后，所有細(xì)胞死亡。
此外，在MiniPERM(相對(duì)體積而言具有較高的表面積，用于擴(kuò)增懸浮細(xì)胞如雜交瘤細(xì)胞的理想生物反應(yīng)器)中，使用10％CO2，并采用以下特定條件進(jìn)行了3個(gè)擴(kuò)增試驗(yàn)
-在30ml培養(yǎng)基中接種7×107細(xì)胞，10轉(zhuǎn)/分。48小時(shí)后細(xì)胞的存活力下降，4天后所有細(xì)胞死亡。在第二個(gè)試驗(yàn)中，旋轉(zhuǎn)速度減少至5轉(zhuǎn)/分。培養(yǎng)第3天，該細(xì)胞存活力是52％；第6天所有細(xì)胞死亡。在第三個(gè)試驗(yàn)中，接種量降低至3×107細(xì)胞，旋轉(zhuǎn)速度減少至4轉(zhuǎn)/分。雖然在培養(yǎng)第5天所有細(xì)胞死亡，但第2天的細(xì)胞存活力仍較高(80％)；這表明了旋轉(zhuǎn)對(duì)于細(xì)胞存活的重要性。
初步的發(fā)酵試驗(yàn)均表明，在傳統(tǒng)通常用于懸浮或無貼壁依賴性細(xì)胞的大規(guī)模生長條件下，TALL細(xì)胞不能生長。
實(shí)施例3.TALL在細(xì)胞工廠中的大規(guī)模擴(kuò)增按照實(shí)施例1 T175中培養(yǎng)物中得到的細(xì)胞懸液(250ml)，約含0.8×106細(xì)胞/毫升，接種至10-室細(xì)胞工廠中；加入等量的完全培養(yǎng)基。4天后，加入完全培養(yǎng)基(500ml×3次)至總體積為2L。排空細(xì)胞工廠，轉(zhuǎn)入250毫升的無菌管中，離心并用無菌PBS沖洗；再次離心回收管中細(xì)胞。接種8天后，從細(xì)胞工廠中回收的細(xì)胞約2.35×109。
在10-室細(xì)胞工廠典型的生產(chǎn)周期內(nèi)，從單個(gè)MCB(主細(xì)胞庫)的凍存管進(jìn)行了72次接種和擴(kuò)增。
總時(shí)間120天，細(xì)胞培養(yǎng)物總量144升。獲得的細(xì)胞大約為1.44×1011。
表1表示分別由10-室細(xì)胞工廠和40-室細(xì)胞工廠發(fā)酵所獲得的數(shù)據(jù)。
表1 10-室細(xì)胞工廠和40-室細(xì)胞工廠的產(chǎn)量
細(xì)胞工廠中的細(xì)胞與一個(gè)50毫升的無菌管相連，并在已知的β粒子加速器(電子回旋加速器)中進(jìn)行照射。已經(jīng)證實(shí)該方法可提供與傳統(tǒng)來源如Cs137相同的粒子數(shù)。該方法使用電子回旋加速器具有下列優(yōu)點(diǎn)即，它不是放射性的，并能對(duì)溶液產(chǎn)生均勻照射。
細(xì)胞袋的制備照射后立刻離心細(xì)胞(1500轉(zhuǎn)/分10分鐘)。于冷凍前抽取細(xì)胞樣品用于質(zhì)量試驗(yàn)，保存于4℃。
照射細(xì)胞與最終的懸浮組份及無菌袋一起，置于層流罩超靜臺(tái)內(nèi)。根據(jù)治療劑量所需的細(xì)胞數(shù)，將細(xì)胞重懸于冷凍液中，冷凍液由Rimso 50(50％DMSO)(20％)和5％人白蛋白(80％)組成。于顯微鏡下在Burker’s槽中進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，在無菌條件下將袋子裝至適當(dāng)體積。袋子裝滿后，立刻將裝袋夾頭封接成三個(gè)部分；這樣每個(gè)袋子形成一個(gè)可信樣品。
從細(xì)胞工廠＞照射＞裝袋，重復(fù)足夠多次以獲得該批次需要的細(xì)胞數(shù)目。
無菌控制在培養(yǎng)基上和層流罩超靜臺(tái)內(nèi)連續(xù)進(jìn)行生物負(fù)載無菌控制、微生物監(jiān)控和支原體監(jiān)控。
實(shí)施例4.成品控制以及實(shí)驗(yàn)室規(guī)模與大規(guī)模培養(yǎng)之間的比較葡萄糖水平的測定對(duì)收獲細(xì)胞用于袋子制備的15個(gè)搖瓶(從35個(gè)搖瓶中選出，相當(dāng)于細(xì)胞-工廠中的細(xì)胞數(shù))樣品中的葡萄糖水平進(jìn)行了測定。如圖1所示，葡萄糖濃度和細(xì)胞數(shù)目變化很大；相反地，在10-室細(xì)胞工廠中，采集后(6-10天后)葡萄糖呈現(xiàn)相同的值(約380mg/dl)，具有相同的細(xì)胞濃度(2×109/ml)。在搖瓶中得到的不同葡萄糖水平和不同細(xì)胞濃度，指示多相的代謝條件事實(shí)上，培養(yǎng)基中高水平的葡萄糖與細(xì)胞培養(yǎng)物較低的代謝活動(dòng)有關(guān)，而低水平的葡萄糖對(duì)應(yīng)于細(xì)胞培養(yǎng)物較高的代謝活動(dòng)。
成品質(zhì)量控制對(duì)照射細(xì)胞的控制列于表2中。右側(cè)一欄反映該值的容許范圍。
表2
存活力試驗(yàn)裝袋前用100μl臺(tái)盼藍(lán)溶液稀釋100μl細(xì)胞懸液進(jìn)行測定。經(jīng)適當(dāng)稀釋，通過在顯微鏡下Burker’s槽內(nèi)對(duì)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行控制。
生物學(xué)活性使用試劑盒ToxilightTM(BioWhittaker LT07-217)，對(duì)裝袋前的細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞毒性測定。該方法以腺苷酸激酶的生物熒光測定為基礎(chǔ)。當(dāng)失去膜完整性時(shí)細(xì)胞釋放出腺苷酸-激酶，在Mg++存在情況下，將底物ADP轉(zhuǎn)變成ATP，從而容許其測定。通過向多孔微孔板內(nèi)接種105K562靶細(xì)胞進(jìn)行測定；加入根據(jù)發(fā)明方法制備的細(xì)胞，數(shù)量為106、5×105和2.5×105，至T/K(或效應(yīng)細(xì)胞或/靶細(xì)胞)比值分別等于l0.5和2.5。
靶細(xì)胞孵育過夜后，根據(jù)本發(fā)明方法制備的細(xì)胞導(dǎo)致的K562裂解％，始終大于或等于含105超聲裂解的K562細(xì)胞樣品的最大值的70％。
內(nèi)毒素在中性pH，使用LAL生色試驗(yàn)試劑盒，應(yīng)用European Pharmacopoeia，第4版，2002，pp.140-145中描述的方法，對(duì)用上述用夾頭制備的樣品進(jìn)行內(nèi)毒素含量測定。
表型使用獲自Molmed’s質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室的適當(dāng)免疫標(biāo)記物(CD3+、CD8+、CD56+)，通過免疫熒光法(FACS)對(duì)裝袋前的細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行表型測定。
表3-培養(yǎng)于搖瓶和細(xì)胞工廠的TALL細(xì)胞的收獲細(xì)胞表型標(biāo)記物
pre照射前；post照射后；avg平均值。
增殖試驗(yàn)通過測量氚化胸腺嘧啶脫氧核苷的摻入確定沒有TALL增殖。裝袋前取出細(xì)胞懸液樣品，在含有不同濃度完全培養(yǎng)基(IMDM+血清+IL-2)的微孔板內(nèi)孵育4天。加入3H-TdR(2μCi/ml，50μl/孔)。于37℃孵育3hr后，測定放射活性。相應(yīng)于TALL細(xì)胞的cpm必須小于或等于背景值的兩倍。
表3顯示分別培養(yǎng)于搖瓶和細(xì)胞工廠的細(xì)胞批次的有關(guān)增殖數(shù)據(jù)。
表4反映了(對(duì)不同的制備物)培養(yǎng)物照射后出現(xiàn)的免疫標(biāo)記物、細(xì)胞存活力，無菌性和支原體污染(如果有)的有關(guān)測定數(shù)據(jù)。
表4.照射后TALL細(xì)胞標(biāo)記物的測定
權(quán)利要求
1.一種用于TALL淋巴細(xì)胞擴(kuò)增的擴(kuò)增方法，其中在均相培養(yǎng)體系中培養(yǎng)至少1×109個(gè)細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述均相體系為細(xì)胞工廠。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中在均相體系中進(jìn)行擴(kuò)增之前，先在搖瓶中進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增過程直至獲得細(xì)胞數(shù)0.7～1×108。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中接種細(xì)胞濃度至少0.7×106細(xì)胞/毫升，優(yōu)選0.75×106細(xì)胞/毫升，收獲時(shí)濃度低于2×106細(xì)胞/毫升，優(yōu)選低于1×106。
5.權(quán)利要求2所述的方法，其中均相體系為10-室裝置。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中TALL淋巴細(xì)胞選自由選擇性遺傳改變的TALL-104、TALL-107、TALL-103/2細(xì)胞系組成的組。
7.權(quán)利要求所述6的方法，其中TALL為TALL-104淋巴細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞工廠擴(kuò)增階段的完全培養(yǎng)基含有最多10％，優(yōu)選4～6％，更優(yōu)選5％的人血清，可任選濃度為0～10％的胎牛血清，以及濃度為100/IU的白細(xì)胞介素。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中每隔48～90小時(shí)向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入白細(xì)胞介素-2。
10.權(quán)利要求8所述的方法，其中均相體系中的細(xì)胞培養(yǎng)在無抗生素培養(yǎng)基中進(jìn)行。
11.一種用于制備細(xì)胞數(shù)目至少為1×109的TALL淋巴細(xì)胞冷凍袋的方法，其特征在于其包含根據(jù)權(quán)利要求1-10所述的方法。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中沿裝填?yuàn)A頭密封將袋子橫向封接為至少兩個(gè)部分，生成至少一個(gè)含體積為0.1～1毫升細(xì)胞培養(yǎng)物的取樣小室，與袋中含有的培養(yǎng)物在空間上分隔開來，用于質(zhì)量控制。
13.一種在均相培養(yǎng)體系中制備至少1×109治療劑量的TALL淋巴細(xì)胞的方法，其中淋巴細(xì)胞的特征在于，CD3+和CD8+免疫標(biāo)記物的表達(dá)為98％，優(yōu)選≥99％，CD56+標(biāo)記物表達(dá)至少為95％，優(yōu)選≥97％。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中淋巴細(xì)胞為TALL-104。
15.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述淋巴細(xì)胞的特征在于，通過在適當(dāng)靶細(xì)胞中的細(xì)胞毒性試驗(yàn)，測定其生物學(xué)活性至少等于對(duì)照的70％。
16.權(quán)利要求1-10任意一項(xiàng)所述方法可獲得的TALL淋巴細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療用人淋巴細(xì)胞系的大規(guī)模擴(kuò)增方法，由均相培養(yǎng)體系組成。本發(fā)明還涉及治療劑量的均相培養(yǎng)淋巴細(xì)胞的制備。
文檔編號(hào)A61K35/12GK1703506SQ200380100954
公開日2005年11月30日 申請(qǐng)日期2003年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月4日
發(fā)明者西爾維婭·特拉夏蒂, 瑪麗亞·路易莎·諾利, 路易吉·卡韋納吉, 納迪婭·德貝納爾迪 申請(qǐng)人:埃比奧吉恩藥物股份公司