專利名稱：治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對于治療或預(yù)防需要增強骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生或促進(jìn)骨形成的疾病，例如骨質(zhì)疏松癥和骨折等有效的(醫(yī))藥品、食品、飲料或飼料。
背景技術(shù)：
在骨組織中，骨形成和骨吸收一般是一面保持一定平衡，一面反復(fù)進(jìn)行的。該過程調(diào)節(jié)著骨強度和血液中的鈣濃度。一般認(rèn)為在骨形成中，成骨細(xì)胞起主要作用；在骨吸收中，破骨細(xì)胞起主要作用，當(dāng)由于某種原因使骨形成和骨吸收的平衡受到破壞時，會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。骨質(zhì)疏松癥大致可以分為以雌激素分泌降低為主要原因的閉經(jīng)后的骨質(zhì)疏松癥和以年齡增長為主要原因的老年性骨質(zhì)疏松癥。除此之外，眾所周知的還有因糖尿病和甲狀腺功能亢進(jìn)等內(nèi)分泌·代謝疾病和施用類固醇等藥物，消化系統(tǒng)·肝臟疾病，缺乏維生素C，不運動(不動性)，卵巢摘除，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等為主要原因的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。
目前作為骨質(zhì)疏松癥的治療藥物，使用雌激素劑、降鈣素、二膦酸鹽等主要通過阻礙骨吸收而抑制骨量降低的藥物。但是存在如下缺點，使用雌激素劑治療時導(dǎo)致乳腺癌和子宮癌、心臟疾病的可能性增大，副作用較大；使用降鈣素則容易產(chǎn)生耐藥性，不能口服；二膦酸鹽的的吸收率低，殘留性高，會導(dǎo)致骨代謝的過度鈍化。為了達(dá)到激活骨代謝的目的，還使用了維生素D3制劑，但是與其它藥物相比，治療效果低，而患高鈣癥等的副作用大。這些現(xiàn)有骨質(zhì)疏松癥治療劑不能使已經(jīng)缺失的骨恢復(fù)到原有的狀態(tài)，作為真正的骨質(zhì)疏松癥治療劑，很難說它們能夠充分滿足要求。
與骨形成有密切關(guān)系的細(xì)胞是成骨細(xì)胞。成骨細(xì)胞，與軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、腱細(xì)胞等都是以共同的間質(zhì)干細(xì)胞為起源，在分化過程中，經(jīng)過前成骨細(xì)胞形成成熟的成骨細(xì)胞。成骨細(xì)胞在成熟過程中，產(chǎn)生以作為骨構(gòu)成成分的膠原為主的大量胞外基質(zhì)，還表達(dá)堿性磷酸酶，引起磷酸鈣向基質(zhì)中沉淀。就這樣一部分成骨細(xì)胞被埋在鈣化的基質(zhì)中，進(jìn)一步分化成骨細(xì)胞。
人的骨量在20～30歲呈現(xiàn)出最大值，以后逐漸減少。隨著年齡增加，骨組織中的成骨細(xì)胞數(shù)量減少，同時由間葉系干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化能力也降低。相反，可以說來源于間葉系干細(xì)胞的脂肪細(xì)胞數(shù)量隨著年齡的增加而增殖。因此從預(yù)防、治療骨質(zhì)疏松癥的觀點考慮，也可以認(rèn)為在骨成長期增加成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞的量以及在老年期和閉經(jīng)期以后，更有選擇性地促進(jìn)間葉系干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，增強骨形成也是有效的。
最近，對于促進(jìn)骨形成的藥物一直進(jìn)行著開發(fā)研究，公開了通過使用苯并吡喃衍生物(例如參照特開平7-291983號公報)、苯基取代羥環(huán)戊烯酮類似物(例如參照特開平11-43460號公報)、前列腺素A1類似物(例如參照特開平11-43461號公報)、苯并噻吩(ベンゾチエピン)衍生物(例如參照特開2000-109480號公報)、色酮衍生物(例如參照特開2001-139571號公報)促進(jìn)骨形成的作用。但是，對其有效性、安全性的評定還不充分，尚未達(dá)到實用階段。
人們發(fā)現(xiàn)在骨基質(zhì)中含有誘導(dǎo)骨形成的蛋白性因子，并將其定名為骨形成蛋白質(zhì)(bone morphogenetic protein，以下稱為BMP)。在很長一段時間內(nèi)，對其本質(zhì)的了解是不明確的，但是克降了4種BMP基因，以此為契機，當(dāng)前已經(jīng)了解到有十幾種分子種超越種群廣泛存在于動物之中。BMP作用于前成骨細(xì)胞，可以誘導(dǎo)堿性磷酸酶活性、對甲狀旁腺激素的應(yīng)答性、產(chǎn)生骨鈣素、提高膠原合成并向成骨細(xì)胞分化。BMP是根據(jù)具有多分化能力的未分化間葉系細(xì)胞的分化階段，分別向軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞分化的。BMP可以抑制成肌細(xì)胞向肌肉分化，而轉(zhuǎn)變?yōu)橄虺晒羌?xì)胞分化。同時還了解到BMP中具有由成骨細(xì)胞誘導(dǎo)胰島素樣增殖因子等二次增殖因子的誘導(dǎo)活性。通過把BMP與載體一起皮下或肌肉內(nèi)給藥可以誘導(dǎo)骨形成。目前已經(jīng)確認(rèn)了在重組人BMP中BMP-2、-4、-5、-6、-7中具有單獨誘導(dǎo)骨形成的活性。其中，重組人BMP-2具有很強的骨形成活性，在大鼠、羊、狗、猴子等的骨缺失模型中可以使缺失組織恢復(fù)。同時還有對于BMP-4、BMP-5參與骨折治愈過程，BMP-6參與軟骨內(nèi)骨化的報導(dǎo)；BMP-12中具有形成韌帶、肌腱的活性，BMP-13中具有形成軟骨的活性，這些都是眾所周知的。一般認(rèn)為老齡動物和高齡人中，骨基質(zhì)中的BMP量降低，成骨細(xì)胞對BMP的敏感性降低，由此而提出了BMP與老年性骨質(zhì)疏松癥有關(guān)系的觀點。
BMP不僅對骨形成起著重要作用，而且在發(fā)育過程中也起著很重要的作用，BMP-2、-4、-7、-8、-11等參與背腹軸的形成和中胚層形成、心臟形成、腎臟形成、眼形成、精子形成等有關(guān)系。剔除BMP的動物顯示致死性或重癥障礙。這樣眾所周知BMP對于機體是必須的，并且具有多種生理活性。
由于BMP顯示前述各種作用，所以對把BMP本身直接作為蛋白制劑，用于治療骨質(zhì)疏松癥和骨折等進(jìn)行了嘗試。但是由于BMP是蛋白質(zhì)，所以給藥方法有局限性以及出現(xiàn)耐受性等就成了問題。同時BMP受體在多種組織中廣泛表達(dá)，所以當(dāng)進(jìn)行全身給藥時，有可能對骨以外的其它組織產(chǎn)生影響。由于存在這些缺點，要把BMP本身作為治療藥物實現(xiàn)應(yīng)用還存在著種種限制。但是可以認(rèn)為如果不是從外部施用BMP，而是能夠任意在所需要的組織部位增強BMP的產(chǎn)生，則對于治療、預(yù)防骨質(zhì)疏松癥和骨折等必需增強BMP產(chǎn)生的疾病是有效的。近年來提出了含有2種芳香族系的特定化合物(例如參照WO 97/15308號的小冊子。)和ネバスタチン、洛伐他汀、普伐他汀和辛伐他汀等他汀類化合物(例如參照WO 98/25460號的小冊子)具有增強BMP-2產(chǎn)生的活性。另外也提出了ヘリオキサンチン(例如參照特開平8-245386號公報)和縮合噻吩衍生物(例如參照特開平9-15113號公報)具有增強BMP作用的活性。但是對于這些物質(zhì)的安全性、有效性的評定還不充分，尚未達(dá)到實用階段。
近年來也進(jìn)行了把BMP用于骨再生治療的開發(fā)研究，同時也進(jìn)行了把BMP與載體的復(fù)合體和植入材料配合埋在骨折處的方法而獲得治療效果的嘗試。但是由于要在機體內(nèi)引入大量的BMP，在安全性和經(jīng)濟性方面都會出現(xiàn)問題。同時也考慮了通過使用可以增強BMP產(chǎn)生或促進(jìn)骨形成的物質(zhì)替代BMP來避免這些缺點，但是還不了解確切的具有實用意義的方法。
這樣雖然考慮了通過促進(jìn)骨形成、增強BMP產(chǎn)生可以治療或預(yù)防相關(guān)的各種疾病，但是尚未了解不顯示毒性和副作用，而根據(jù)需要確實能夠適當(dāng)增強BMP產(chǎn)生的物質(zhì)、方法等。
發(fā)明公開本發(fā)明的目的在于開發(fā)可以簡單攝取的、適合作為食品材料和醫(yī)藥品材料的、具有增強骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生作用或促進(jìn)骨形成作用的組合物，并提供使用該組合物的(醫(yī))藥品、食品、飲料或飼料。
也就是本發(fā)明涉及[1]需要增強骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生或促進(jìn)骨形成的疾病的治療劑或預(yù)防劑，其特征是含有選自(a)酸性糖，(b)聚丙烯酸，(c)綠原酸和(d)綠原酸的氧化處理物中的至少一種化合物作為有效成分，[2]根據(jù)前述[1]中所述的治療劑或預(yù)防劑，其中，酸性糖是選自酸性多糖、酸性寡糖、酸性單糖以及它們的分解物中的至少一種酸性糖，[3]根據(jù)前述[1]中所述的治療劑或預(yù)防劑，其中，酸性糖是從巖藻依聚糖(フコィダン)、肝素、硫酸葡聚糖、硫酸軟骨素B、果膠酸、來源于藍(lán)藻類(スピルリナ)的酸性多糖，巖藻依聚糖分解物，角叉菜聚糖λ，角叉菜聚糖κ，角叉菜聚糖ι，低分子肝素，硫酸乙酰肝素以及來源于小球藻(クロレラ)的酸性多糖中的至少一種酸性糖，[4]骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生增強劑或骨形成促進(jìn)劑，其特征是含有選自(a)酸性糖，(b)聚丙烯酸，(c)綠原酸和(d)綠原酸的氧化處理物中的至少一種化合物作為有效成分，[5]根據(jù)前述[4]中所述的骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生增強劑或骨形成促進(jìn)劑，其中，酸性糖是選自酸性多糖、酸性寡糖、酸性單糖以及它們的分解物中的至少一種酸性糖，[6]根據(jù)前述[4]中所述的骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生增強劑或骨形成促進(jìn)劑，其中，酸性糖是選自巖藻依聚糖、肝素、硫酸葡聚糖、硫酸軟骨素B、果膠酸、來源于藍(lán)藻類的酸性多糖，巖藻依聚糖分解物，角叉菜聚糖λ，角叉菜聚糖κ，角叉菜聚糖ι，低分子肝素，硫酸乙酰肝素以及來源于小球藻的酸性多糖中的至少一種酸性糖，[7]用于增強骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生或促進(jìn)骨形成的食品、飲料或飼料，其特征是含有選自(a)酸性糖，(b)聚丙烯酸，(c)綠原酸和(d)綠原酸的氧化處理物中的至少一種化合物作為有效成分，[8]根據(jù)前述[7]中所述的用于增強骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生或促進(jìn)骨形成的食品、飲料或飼料，其中，酸性糖是選自酸性多糖、酸性寡糖、酸性單糖以及它們的分解物中的至少一種酸性糖，[9]根據(jù)前述[7]中所述的用于增強骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生或促進(jìn)骨形成的食品、飲料或飼料，其中，酸性糖是選自巖藻依聚糖、肝素、硫酸葡聚糖、硫酸軟骨素B、果膠酸、來源于藍(lán)藻類的酸性多糖，巖藻依聚糖分解物，角叉菜聚糖λ，角叉菜聚糖κ，角叉菜聚糖ι，低分子肝素，硫酸乙酰肝素以及來源于小球藻的酸性多糖中的至少一種酸性糖，[10]需要增強骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生或促進(jìn)骨形成的疾病的治療劑或預(yù)防劑，其特征是含有來源于藻類的提取物作為有效成分，[11]骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生增強劑或骨形成促進(jìn)劑，其特征是含有來源于藻類的提取物作為有效成分，和[12]用于增強骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生或促進(jìn)骨形成的食品、飲料或飼料，其特征是含有來源于藻類的提取物作為有效成分。
附圖的簡單說明

圖1是表示來源于北海道函館產(chǎn)海帶(ガゴメ)的巖藻依聚糖的DEAE-Cellulofine A-800柱洗脫圖形的圖。
實施本發(fā)明的最佳方案本說明書中的“增強BMP產(chǎn)生的作用”和“增強BMP產(chǎn)生的活性”分別是指導(dǎo)致增強BMP產(chǎn)生和增強BMP產(chǎn)生的功能，其意義沒有特別嚴(yán)格的區(qū)別?！霸鰪姟卑ㄅc本發(fā)明涉及的有效成分作用前相比，在作用后目的物質(zhì)量增加的狀態(tài)，同時還包括通過使本發(fā)明涉及的有效成分作用而使目的物質(zhì)發(fā)生的狀態(tài)(誘導(dǎo))。另外，在本說明書中，作為有效成分列舉的所有物質(zhì)，在本發(fā)明中均可以單獨使用，或者是混合2種或2種以上使用。
作為本發(fā)明中所使用的有效成分，可以使用選自(a)酸性糖，(b)聚丙烯酸，(c)綠原酸和(d)綠原酸的氧化處理物中的至少一種化合物。作為酸性糖只要是具有酸性基團的糖，則沒有特別限定，例如可以使用選自酸性多糖、酸性寡糖、酸性單糖以及它們的分解物中的至少一種酸性糖。
作為酸性多糖，只要是具有增強BMP產(chǎn)生的作用或促進(jìn)骨形成的作用即可，沒有特別的限定，可以列舉來源于藻類的酸性多糖，來源于動物的酸性多糖，來源于魚類的酸性多糖，來源于植物的酸性多糖，來源于微生物的酸性多糖，合成酸性多糖。
作為來源于藻類的酸性多糖，例如有來源于褐藻類的硫酸化多糖，如含有硫酸化巖藻糖的多糖，可以列舉如巖藻依聚糖、硫酸化巖藻半乳聚糖(フコガラクタン)(G-巖藻依聚糖)、硫酸化巖藻葡糖甘露聚糖(フコグルクロノマンナン)、葡糖木糖藻聚糖(グルロノキシロフカン)、馬尾藻糖(サルガツサン)、葡糖甘露糖半乳聚糖(グルクロノマンノガラクタン)、木糖巖藻糖(キシロフコグルクロナン)、アスコフイラン、葡糖半乳糖藻聚糖(グルクロノガラクトフカン)、硫酸化葡糖藻聚糖(グルクロノフカン)。
作為上述的原料，例如可以使用北海道函館產(chǎn)海帶、標(biāo)準(zhǔn)海帶(マ昆布)、類海帶海菜(トロロ昆布)、巖藻(ヒバマタ)、海蘊(モズク)、沖繩海蘊(オキナワモズク)、裙帶菜、クロメ、黑海帶(アラメ)、褐藻海草(カジメ)、巨藻(レッソニア)、ニグレセンス、挪威產(chǎn)海藻(アスコフィラム)、ノドッサム等海帶目、ながもつも目、巖藻目等的褐藻類。
作為來源于藻類的酸性多糖，可以使用來源于紅藻類的酸性多糖，例如來源于草料(マクサ)、發(fā)菜(オゴノリ)、巨藻(ジャィアントケルプ)、プテロクラディア、カピラセア的酸性多糖和角叉菜聚糖λ，角叉菜聚糖κ，角叉菜聚糖ι等。作為來源于藍(lán)藻類的酸性多糖，例如來源于藍(lán)藻類的酸性多糖；來源于綠藻類的酸性多糖，例如來源于小球藻的酸性多糖；還可以使用來源于藻類的硫酸鼠李聚糖(ラムナソ)作為本發(fā)明的酸性多糖。另外磷酸化多糖類，例如核酸也包括在本發(fā)明的酸性多糖內(nèi)。
作為本發(fā)明中所使用的酸性多糖，例如可以列舉作為含有硫酸化巖藻糖的多糖的前面敘述過的巖藻依聚糖，但是只要是以硫酸化巖藻糖作為構(gòu)成成分的多糖，并且是具有增強BMP產(chǎn)生作用或促進(jìn)骨形成作用的多糖，則對其來源沒有特別限定，可以使用來源于棘皮動物，例如海參、海膽、海星等的巖藻依聚糖。作為含有巖藻依聚糖的海參，例如有特開平4-91027號公報中所公開的海參，并用該公報中所公開的方法，用海參制備巖藻依聚糖。
例如可以用北海道函館產(chǎn)海帶制備巖藻依聚糖，把該巖藻依聚糖分離為含有葡糖醛酸的巖藻依聚糖(稱為U-巖藻依聚糖)和不含葡糖醛酸的巖藻依聚糖(稱為F-巖藻依聚糖)，可以分別使用這兩種巖藻依聚糖作為本發(fā)明有效成分，還可以用北海道函館產(chǎn)海帶制備硫酸化巖藻半乳聚糖使用。
U-巖藻依聚糖和F-巖藻依聚糖，可以通過在用北海道函館產(chǎn)海帶制備巖藻依聚糖后，使用陰離子交換樹脂、表面活性劑等進(jìn)行分離。來源于北海道函館產(chǎn)海帶的U-巖藻依聚糖和F-巖藻依聚糖的存在比率(重量比)約為1∶2，U-巖藻依聚糖含有巖藻糖、甘露糖、半乳糖、葡糖醛酸等，硫酸含量約為20重量％，F(xiàn)-巖藻依聚糖含有巖藻糖和半乳糖，硫酸含量約為50重量％。兩種物質(zhì)的分子量均以大約20萬為中心分布(第18次糖質(zhì)シンポジゥム要旨，第159頁，1996年)。
例如把由北海道函館產(chǎn)海帶制備的巖藻依聚糖溶液加入到DEAE-Cellulofine A800柱中后，用含有NaCl的緩沖液，通過濃度梯度法洗脫，可以分離出U-巖藻依聚糖和F-巖藻依聚糖。圖1示出其一個例子。也就是圖1是表示對U-巖藻依聚糖和F-巖藻依聚糖進(jìn)行分離的圖，圖中的前一個峰是U-巖藻依聚糖，后一個峰是F-巖藻依聚糖。
另外，作為本發(fā)明中所使用的巖藻依聚糖，也可以通過已知的方法分別制備來源于巖藻的巖藻依聚糖、來源于海蘊的巖藻依聚糖，來源于沖繩海蘊的巖藻依聚糖、來源于裙帶菜的巖藻依聚糖，來源于巨藻的巖藻依聚糖，來源于挪威產(chǎn)海藻的巖藻依聚糖，來源于其它藻類的巖藻依聚糖，用于本發(fā)明。
作為來源于魚類的酸性多糖，例如可以列舉來源于軟骨魚類，例如來源于鯊魚的硫酸軟骨素；作為來源于植物的酸性多糖，可以列舉來源于蘋果、檸檬、柑桔的果膠酸和果膠等；作為來源于微生物的多糖，可以列舉來源于大腸桿菌的多聚乙酰神經(jīng)氨(糖)酸，來源于枯草桿菌的糖酸磷壁酸質(zhì)(ティカン)，來源于酵母的磷酸甘露聚糖、磷酸半乳聚糖；作為來源于動物的酸性多糖，可以列舉肝素、低分子肝素、硫酸軟骨素、硫酸乙酰肝素、軟骨素、硫酸角質(zhì)素、透明質(zhì)酸、多核糖磷酸等等。
作為本發(fā)明使用的合成酸性多糖，只要是具有增強BMP產(chǎn)生作用或促進(jìn)骨形成作用的多糖即可，并沒有特別限定。到目前為止作為(醫(yī))藥品使用的酸性多糖都是適宜的。作為該合成酸性多糖，可以列舉合成硫酸化多糖，如葡聚糖硫酸鈉。該化合物是通過對用腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides van Tieghem)得到的蔗糖發(fā)酵生產(chǎn)的葡聚糖的部分分解物進(jìn)行硫酸化而得到的硫酸酯的鈉鹽。
另外本發(fā)明中，作為合成硫酸化多糖，可以使用如葡聚糖、硫酸葡聚糖、糊精、環(huán)糊精、纖維素、淀粉、甘露聚糖、木聚糖、藻酸、果膠、果膠酸、果聚糖、阿拉伯糖(アラビナン)、殼質(zhì)、茁霉多糖、木糖葡聚糖(キシログルカン)、淀粉等的硫酸化物。還可以使用如硫酸呋喃核糖(リボフラナン硫酸)、硫酸呋喃木糖(キシロフラナン硫酸)、硫酸蘑菇多糖(レソチナン)、硫酸凝乳糖(カ一ドラン硫酸)、硫酸甘露吡喃糖(マンノピラナン硫酸)等合成硫酸化多糖和含有棕櫚?；牧蛩徇秽颂?リボフラナン硫酸)等合成硫酸化烷基多糖。對于合成硫酸化烷基多糖中所含的烷基的結(jié)構(gòu)沒有特別的限定，作為其碳原子數(shù)，只要有1～50左右即可。還可以通過對硫酸化多糖或其分解物進(jìn)行硫酸化，制備高硫酸化硫酸化多糖或高硫酸化分解物。這些硫酸化多糖、高硫酸化硫酸化多糖、高硫酸化分解物，分別可以用已知的方法進(jìn)行制備，其分解物也可以用已知的方法進(jìn)行制備而用于本發(fā)明中。還可以使用市場上出售的硫酸葡聚糖、硫酸化纖維素，也可以使用這些合成硫酸化多糖等的鹽等。
本發(fā)明中當(dāng)使用硫酸化多糖作為酸性多糖時，硫酸化多糖的硫酸含量(或者是硫酸根數(shù))，只要是可以表達(dá)BMP產(chǎn)生增強作用或骨形成促進(jìn)作用，則沒有特別的限定。酸性多糖的分解物也包括寡糖和單糖，例如可以使用巖藻糖-2-硫酸、葡糖-2-硫酸。這些硫酸化單糖，硫酸化寡糖、硫酸化多糖，可以用它們的一般合成方法進(jìn)行制備?？梢园阎苽湮铩⒕莆镉糜诒景l(fā)明中。本發(fā)明中的所謂寡糖的定義是由2個～10個單糖連接起來的糖化合物，所謂多糖的定義是由11個或11個以上單糖連接起來的糖化合物。
本發(fā)明具有BMP產(chǎn)生增強作用或骨形成促進(jìn)作用的酸性多糖的分解物，例如硫酸化多糖、巖藻依聚糖的分解物，可以通過酶學(xué)方法、化學(xué)方法、物理方法等已知方法進(jìn)行制備，選擇使用所需要的具有BMP產(chǎn)生增強作用或骨形成促進(jìn)作用的分解物。
所謂分解物，其分子量取決于作為分解對象的酸性多糖，但是優(yōu)選使用對酸性多糖進(jìn)行分解而得到的分子量大致范圍優(yōu)選為200～10萬，更優(yōu)選1000～3萬的分解物。
作為本發(fā)明中使用的酸性多糖分解物的優(yōu)選制備方法，有酸分解法，通過對相應(yīng)酸性多糖進(jìn)行酸分解，可以制備具有BMP產(chǎn)生增強作用或骨形成促進(jìn)作用的分解物。
本發(fā)明中所使用的酸性多糖的酸分解條件，只要是能夠生成具有促進(jìn)骨形成作用或增強BMP產(chǎn)生作用的分解物(以下稱為本發(fā)明分解物)的條件，則沒有特別限定。
例如通過把酸性多糖溶解或懸浮在酸的水溶液等中，使其反應(yīng)，生成本發(fā)明的分解物。還可以通過在反應(yīng)時進(jìn)行加熱，縮短生成本發(fā)明分解物所需要的時間。
對于溶解或懸浮酸性多糖的酸的種類，沒有特別限定，可以使用鹽酸、硫酸、硝酸等無機酸，檸檬酸、甲酸、乙酸、乳酸、蘋果酸、抗壞血酸等有機酸，還可以使用陽離子交換樹脂、陽離子交換纖維、陽離子交換膜等固體酸。
對酸的濃度也沒有特別限定，優(yōu)選以0.0001～5當(dāng)量，更優(yōu)選以0.01～1當(dāng)量左右的濃度使用。同時對反應(yīng)溫度也沒有特別限定，可優(yōu)選設(shè)定為0～200℃，更優(yōu)選設(shè)定為20～130℃。
對反應(yīng)時間也沒有特別限定，可優(yōu)選設(shè)定在幾秒～幾天。酸的種類和濃度、反應(yīng)溫度以及反應(yīng)時間可以根據(jù)本發(fā)明中所用的分解物的生成量、分解物的聚合度進(jìn)行適當(dāng)選擇。例如在制備巖藻依聚糖分解物的過程中，使用檸檬酸、乳酸、蘋果酸等有機酸，可以在酸的濃度為數(shù)10mM～數(shù)M；加熱溫度為50～110℃，優(yōu)選70～95℃；加熱時間為數(shù)分鐘～24小時的范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)選擇，制備本發(fā)明的分解物。作為巖藻依聚糖的酸分解物，例如有來源于北海道函館產(chǎn)海帶的巖藻依聚糖的酸分解物，該分解物可以作為具有BMP產(chǎn)生增強作用或骨形成促進(jìn)作用的食物纖維使用。
本發(fā)明的分解物，可以以BMP產(chǎn)生增強作用或骨形成促進(jìn)作用為指標(biāo)進(jìn)行分級，例如用凝膠過濾法、利用分子量分級膜的分級方法對酸分解物進(jìn)行分子量分級。
作為凝膠過濾法的例子，如使用CellulofineGCL-300，可以制備分子量超過25000、分子量超過10000～25000、分子量超過5000～10000、分子量在5000以下的任意分子量的組分；使用CellulofineGCL-25，可以把分子量在5000以下的組分制備成分子量超過3000～5000、分子量超過2000～3000、分子量超過1000～2000、分子量超過500～1000、分子量在500以下的任意分子量的組分。
還可以利用超濾膜在工業(yè)上進(jìn)行分子量分級，例如通過使用ダイセル公司制造的FE10-FUSO382，可以制備分子量在30000以下的組分；通過使用同一系列的FE-FUS-T653，可以制備分子量在6000以下的組分；進(jìn)一步通過使用納米級過濾膜，可以得到分子量在500以下的組分，還可以通過組合使用這些凝膠過濾法和分子量分級法制備任意分子量的組分。
本發(fā)明中能夠使用的具有BMP產(chǎn)生增強作用或骨形成促進(jìn)作用的酸性多糖的分解物，例如作為巖藻依聚糖的分解物，可以列舉下述通式(1)所示的化合物， (式中，R是H或SO3H，并且至少一個R是SO3H)。
下述通式(2)所示的化合物，
(式中，R是OH或OSO3H，并且至少一個R是OSO3H)。
下述通式(3)所示的化合物， (式中，R是OH或OSO3H，至少一個R是OSO3H)。
這些化合物可以通過特開2003-199596、WO 97/26896號小冊子、WO 00/50464號小冊子中所公開的方法進(jìn)行制備。本說明書中化合物結(jié)構(gòu)式中的“·H”表示結(jié)合在糖的異頭碳上的處于α位和β位的氫原子。具有由通式(1)、通式(2)、通式(3)所示化合物的重復(fù)結(jié)構(gòu)的硫酸化多糖以及寡糖也可以作為本發(fā)明具有BMP產(chǎn)生增強作用的硫酸化糖使用。
另外在有機酸存在的條件下，對來源于北海道函館產(chǎn)海帶的巖藻依聚糖進(jìn)行加熱處理，可以得到葡糖醛酸和甘露糖的聚合物，該聚合物也可以作為本發(fā)明的具有增強BMP產(chǎn)生作用或促進(jìn)骨形成作用的酸性多糖使用。并且通過調(diào)整加熱處理條件、加熱時間可以制備任意聚合度的聚合物。
作為酸性寡糖，可以優(yōu)選列舉硫酸化寡糖；此外作為酸性單糖，可以優(yōu)選列舉硫酸化單糖。這些硫酸化寡糖或硫酸化單糖，除了可以使用市場上出售的物質(zhì)以外，還可以以各種寡糖、單糖作為原料，用已知的方法進(jìn)行硫酸化而制備。還可以優(yōu)選使用它們的鹽。這些糖或其鹽，既可以單獨使用，也可以混合2種或2種以上使用。此外作為酸性寡糖或酸性單糖的分解物，可以與前述酸性多糖分解物同法獲得。作為酸性單糖，只要是具有BMP產(chǎn)生增強作用或骨形成促進(jìn)作用，則沒有特別限定，例如硫酸化葡萄糖、硫酸化半乳糖、硫酸化木糖、硫酸化2-脫氧-葡萄糖、硫酸化塔羅糖以及硫酸化甘露糖。而且硫酸化多糖、硫酸化寡糖、硫酸化單糖的脂肪酸衍生物等也包括在本發(fā)明的酸性多糖、酸性寡糖、酸性單糖之中。
本發(fā)明中所用的酸性糖中還包括其鹽。作為本發(fā)明中所使用的酸性糖的鹽，可以列舉如堿金屬鹽、堿土類金屬鹽、有機堿鹽，可以列舉與鈉、鉀、鎂、銨，還有二乙醇胺、乙二胺等形成的鹽。這些鹽，可以通過用已知方法把本發(fā)明中所使用的酸性糖的硫酸根和羧基變換成鹽而獲得，作為這些鹽，優(yōu)選可藥用鹽。
本發(fā)明中，作為酸性糖，優(yōu)選使用選自酸性多糖、酸性寡糖、酸性單糖以及它們的分解物中的至少一種化合物，更具體地，可以優(yōu)選使用選自巖藻依聚糖、肝素、硫酸葡聚糖、硫酸軟骨素(特別是硫酸軟骨素B)、果膠酸、來源于藍(lán)藻類的酸性多糖、巖藻依聚糖分解物、角叉菜聚糖λ、角叉菜聚糖κ、角叉菜聚糖ι、低分子肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸角質(zhì)素、藻酸、果膠、透明質(zhì)酸以及來源于小球藻的酸性多糖中的至少一種化合物，其中作為巖藻依聚糖、其分解物的上述通式(1)所示的化合物、來源于藍(lán)藻類的酸性多糖、來源于小球藻的酸性多糖，都是從具有長期食用歷史的海藻類而獲得的酸性多糖，所以安全性高，不用擔(dān)心負(fù)作用的問題，當(dāng)然可以通過口服攝取。特別是來源于北海道函館產(chǎn)海帶的巖藻依聚糖，其增強BMP-2產(chǎn)生的活性高，安全性也高，在本發(fā)明中可以最優(yōu)選采用。
對作為本發(fā)明中所采用的聚丙烯酸，沒有特別的限定，例如可以使用市場上出售的聚丙烯酸，對于其分子量，也沒有特別的限定，只要具有本發(fā)明的BMP產(chǎn)生增強作用或骨成形促進(jìn)作用即可。例如可以使用平均分子量為5000～1000000的聚丙烯酸。
對作為本發(fā)明中所使用的綠原酸，沒有特別限定，可以使用市場上出售的綠原酸或者是用各種植物通過已知方法制備的綠原酸。綠原酸是茜草科(アカネ科)、菊科和茄科植物等各種雙子葉植物的果實和葉子之中含有的成分，即使是用任意植物制備的綠源酸，只要是具有本發(fā)明的BMP產(chǎn)生增強作用或骨形成促進(jìn)作用，也都可用于本發(fā)明。
對本發(fā)明中所使用的綠原酸的氧化處理物沒有特別限定，例如可以使用通過使上述綠原酸發(fā)生氧化反應(yīng)而得到的處理物。作為氧化反應(yīng)，例如可以使上述綠原酸與氧接觸進(jìn)行氧化、使用氧化劑進(jìn)行氧化、使用氧化酶進(jìn)行氧化，或者是進(jìn)行電化學(xué)氧化的方法進(jìn)行氧化反應(yīng)。所有的氧化都可以按照已知的方法進(jìn)行。例如，通過與氧接觸進(jìn)行氧化時，可以通過泵對溶解在水溶液中的綠原酸送入空氣來進(jìn)行氧化。用氧化劑進(jìn)行氧化時，作為氧化劑，可以優(yōu)選使用過氧化氫、臭氧、銀、銅、鐵、鎳、錳、鈷、鉻等進(jìn)行氧化。使用氧化酶進(jìn)行氧化時，作為氧化酶，可以使用酪氨酸酶、過氧化物酶等進(jìn)行氧化。而且用氧化酶進(jìn)行氧化時，還包括前面所列舉的采用含有氧化酶的微生物進(jìn)行的氧化。進(jìn)行電化學(xué)氧化時，例如可以采用鉑、氧化鉛、碳、石墨、氧化鉑等作為電極的陽極氧化反應(yīng)進(jìn)行氧化。
雖然對于經(jīng)氧化處理所得到的組合物的結(jié)構(gòu)尚不明確，但是可以推測綠原酸僅僅被氧化，或者是被聚合以聚合物的形式而存在。
這些有效成分，可以單獨使用，也可以混合2種或2種以上使用。而且對列舉的這些酸性多糖的分解物和鹽也沒有特別限定，只要是具有BMP產(chǎn)生增強作用或骨形成促進(jìn)作用均可使用。
本發(fā)明中對于作為來源于藻類的提取物，沒有特別限定，只要是具有增強BMP產(chǎn)生的作用或促進(jìn)骨形成的作用即可。例如只要是褐藻類、藍(lán)藻類、紅藻類、綠藻類等前面敘述的作為酸性多糖原料的藻類，則沒有特別限定，均可使用。特別可以優(yōu)選使用北海道函館產(chǎn)海帶等的褐藻類、小球藻和藍(lán)藻類。本發(fā)明中所謂的提取物，是使用提取溶劑，經(jīng)進(jìn)行提取操作工序所得到的物質(zhì)。提取可以采用已知的方法按照以下操作進(jìn)行。例如將原料進(jìn)行粉碎或切細(xì)后，使用溶劑用間歇或連續(xù)的方式進(jìn)行提取。對于作為獲得提取物過程中所使用的提取溶劑，沒有特別限定，可以列舉水、氯仿、乙醇、甲醇、異丙醇等醇類，丙酮、甲乙酮等酮類，乙酸甲酯、乙酸乙酯等親水性或親油性溶劑。這些溶劑，根據(jù)需要可以單獨使用，也可以進(jìn)行適當(dāng)混合作為混合溶劑使用。優(yōu)選以鈣鹽的水溶液作為溶劑使用。提取溶劑的量，可以根據(jù)需要適當(dāng)進(jìn)行確定，通常相對于原料優(yōu)選按重量計算使用0.1～100倍量的提取溶劑。提取溫度也可以根據(jù)需要適當(dāng)進(jìn)行確定，用水進(jìn)行提取時，優(yōu)選提取溫度為4～130℃，更優(yōu)選25～100℃。當(dāng)溶劑中含有乙醇時，優(yōu)選的提取溫度范圍是4～60℃。提取時間，可以考慮提取效率進(jìn)行確定，通常優(yōu)選在設(shè)定原料、提取溶劑和提取溫度時，考慮使提取時間范圍優(yōu)選達(dá)到數(shù)秒鐘～數(shù)天，更優(yōu)選5分鐘～24小時。對于提取時的壓力，沒有特別限定，可以根據(jù)需要適當(dāng)確定，例如可以在常壓下、加壓下或者是通過抽濾的減壓下進(jìn)行。提取操作，可以一面攪拌，一面進(jìn)行；也可以靜止進(jìn)行。同時根據(jù)需要還可以反復(fù)進(jìn)行數(shù)次提取。通過以上操作，可以得到來源于藻類的提取物(以下稱為本發(fā)明的提取物)。對于提取物，根據(jù)需要還可以進(jìn)行過濾、離心分離、濃縮、超濾、分子篩等處理，制備具有增強BMP產(chǎn)生作用或促進(jìn)骨形成作用的成分得以濃縮的提取物。而且本發(fā)明中，要作為有效成分而使用的前述酸性多糖等來源于藻類的提取物或濃縮提取物的BMP產(chǎn)生增強作用或骨形成促進(jìn)作用，可以通過后面將要敘述的實施例1或6中所述的方法進(jìn)行簡單的測定。本發(fā)明中也可以使用含有2種或2種以上用不同提取方法得到的提取物。
本發(fā)明中，通過用已知的方法對來源于藻類的提取物進(jìn)行分級而得到的組分以及通過反復(fù)數(shù)次進(jìn)行分級操作所得到的組分也包括在本發(fā)明的提取物之中。作為上述分級的方法，可以列舉提取、分步沉淀、柱色譜、薄層色譜等方法。以增強BMP產(chǎn)生的作用或促進(jìn)骨形成的作用作為指標(biāo)，還可以通過進(jìn)一步對所得組分進(jìn)行精制，對增強BMP產(chǎn)生的物質(zhì)或促進(jìn)骨形成的物質(zhì)進(jìn)行分離。
本發(fā)明中，對來源于藻類的提取物的形狀沒有特別限定，只要是具有增強BMP產(chǎn)生的作用或促進(jìn)骨形成的作用即可。可以是粉狀、固體狀、液體狀的任意形狀。還可以用已知方法對該具有任意形狀的提取物的處理物進(jìn)行造粒，得到粒狀的固體物作為本發(fā)明的來源于藻類的提取物使用。對于作為造粒的方法，沒有特別限定，如有旋轉(zhuǎn)造粒、攪拌造粒、流化床造粒、氣流造粒、擠出造粒、壓縮成型造粒、粉碎造粒、噴射造?；驀婌F造粒等。還可以使粉狀提取物溶解于液體，如水和乙醇等中以液態(tài)，作為本發(fā)明的提取物使用。
作為本發(fā)明的提取物，特別優(yōu)選與藻類本身相比，以高濃度和/或高純度含有可以增強BMP產(chǎn)生的物質(zhì)或促進(jìn)骨形成的物質(zhì)，如酸性多糖、酸性寡糖、酸性單糖或它們的分解物。這里所謂高濃度是指每單位重量本發(fā)明提取物中增強BMP產(chǎn)生的物質(zhì)或促進(jìn)骨形成物質(zhì)的重量多于每單位重量原料藻類中增強BMP產(chǎn)生的物質(zhì)或促進(jìn)骨形成的物質(zhì)的重量。另外所謂高純度是指與原料藻類相比，該物質(zhì)中增強BMP產(chǎn)生的物質(zhì)或促進(jìn)骨形成的物質(zhì)的含有比率高。
本發(fā)明涉及的有效成分中，如后面將要敘述的，沒有發(fā)現(xiàn)其毒性。同時也不必?fù)?dān)心會產(chǎn)生副作用。因此可以安全并切實地進(jìn)行疾病的治療或預(yù)防。因此含有該有效成分的本發(fā)明的治療劑、預(yù)防劑、食品、飲料或飼料對于治療或預(yù)防需要增強BMP產(chǎn)生或促進(jìn)骨形成的疾病是有效的。
本發(fā)明中作為BMP，可以列舉如BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14、BMP-15等，特別優(yōu)選的例子為BMP-2、BMP-4或BMP-7。此外對于測定有無BMP產(chǎn)生增強作用的方法沒有特別的限定，但可以通過后面實施例1中所述的方法進(jìn)行簡單的測定。
可以認(rèn)為BMP是強力促進(jìn)骨、軟骨、韌帶、肌腱等形成的因子，作用于前成骨細(xì)胞，并促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化，參與骨的發(fā)育、成長、修復(fù)、骨折的治愈過程。同時通過BMP作用于未分化的間葉系細(xì)胞，根據(jù)分化階段還可以分別向軟成骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞分化，廣泛參與來源于間葉系細(xì)胞的成熟和增殖。而且，BMP在個體發(fā)育過程中對背腹軸和中胚層形成等也起著重要作用。在BMP中，BMP-2、-4、-7的骨形成活性特別強，重組人BMP-2作用于骨缺損動物，可以使骨缺損恢復(fù)。
BMP是只作用于具有敏感性的細(xì)胞的高選擇性蛋白質(zhì)。而且由BMP引起的從未分化間葉系細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化方向上的特異性強，不會向成骨細(xì)胞以外的不需要的細(xì)胞分化。因此，具有增強BMP產(chǎn)生作用的本發(fā)明的有效成分沒有副作用的危險，非常適宜作為(醫(yī))藥品或功能性食品材料使用。
本發(fā)明中所謂的促進(jìn)骨形成的作用，只要是促進(jìn)骨和軟骨形成的作用，則沒有特別限定，例如可以列舉促進(jìn)由間葉系干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的作用、促進(jìn)由未分化間葉系細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的作用、促進(jìn)由前成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞分化的作用、促進(jìn)骨基質(zhì)形成的作用、使骨基質(zhì)鈣化的作用、促進(jìn)由成骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的作用、誘導(dǎo)軟骨內(nèi)骨化的作用等。同時，對測定有無促進(jìn)骨形成的作用的方法沒有特別限定，可以通過后面將要敘述的實施例6中所述的方法，例如作為促進(jìn)由間葉系干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的作用，進(jìn)行簡單的測定。這里的“促進(jìn)”中包括“誘導(dǎo)”。
本發(fā)明中，作為需要增強BMP產(chǎn)生或促進(jìn)骨形成的疾病，可以列舉如骨質(zhì)疏松癥(例如慢性骨質(zhì)疏松癥、閉經(jīng)后由激素平衡異常而引起的骨質(zhì)疏松癥、由糖尿病或類固醇藥物等副作用而引起的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥等)、骨折、再次骨折、骨缺損、骨形成不全癥、骨軟化癥、骨貝切特病、強直性脊髓炎、慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、變形性關(guān)節(jié)炎、軟骨影響的變形性關(guān)節(jié)癥、牙周病、牙周疾病中的牙周組織缺損、牙根·牙槽缺損、牙槽嵴形成、腭裂的修復(fù)等等。
本發(fā)明的治療劑，由于可以增強BMP產(chǎn)生或促進(jìn)骨形成，所以對于前述疾病，能夠發(fā)揮治療效果。同時本發(fā)明的預(yù)防劑，由于通過本發(fā)明有效成分的作用，可以增強骨、軟骨和牙齒，所以能夠?qū)τ谇笆黾膊“l(fā)揮預(yù)防效果。
本發(fā)明的治療劑或預(yù)防劑，也可以作為多發(fā)性骨髓瘤、肺癌、乳腺癌等外科手術(shù)后的骨組織修復(fù)劑使用。本發(fā)明的治療劑或預(yù)防劑，也可以用于再生醫(yī)療領(lǐng)域中的骨再生目的。具體是本發(fā)明的治療劑或預(yù)防劑，可用于使人造骨和人造牙根的活化穩(wěn)定化，還可以從患病之前的或患有疾病的患者生物體內(nèi)取得細(xì)胞，在體外使本發(fā)明的治療劑或預(yù)防劑對其產(chǎn)生作用，并形成再生骨組織，然后再回置于患者的體內(nèi)。
作為本發(fā)明的治療劑或預(yù)防劑，可以列舉使本發(fā)明涉及的前述有效成分與已知的(醫(yī))藥用載體組合并制成制劑的治療劑或預(yù)防劑。例如可以同時與阻礙骨吸收的藥物，如雌激素、降鈣素、活化型維生素D3、雙膦酸鹽等一起使用。
本發(fā)明的治療劑或預(yù)防劑的制備，可以通過把前述有效成分與在可藥用的液體狀或固體狀的載體配合在一起進(jìn)行，根據(jù)需要可以添加溶劑、分散劑、乳化劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、賦形劑、粘結(jié)劑、崩解劑、潤滑劑等，制成片劑、顆粒劑、散劑、粉末制劑、膠囊劑等固體形態(tài)的制劑，常規(guī)溶液劑、懸浮劑、乳化劑等液體形態(tài)的制劑。也可以作為在使用之前通過添加適當(dāng)載體形成液體劑型的干燥制品，除此之外，還可以作為外用制劑使用。
作為醫(yī)藥用載體，可以根據(jù)治療劑或預(yù)防劑的給藥形式和劑型進(jìn)行適當(dāng)選擇。當(dāng)作為由固體組合物組成的口服制劑時，可以制成片劑、丸劑、膠囊劑、散劑、細(xì)顆粒劑、顆粒劑等，可以利用如淀粉、乳糖、白糖、甘露糖醇、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無機鹽等作為載體。另外當(dāng)制備口服制劑時，還可以配合粘結(jié)劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑、助流劑、矯味劑、著色劑、香料等。例如當(dāng)作為片劑或丸劑時，根據(jù)需要還可用蔗糖、明膠、羥丙基纖維素等的糖衣或用胃溶性或腸溶性物質(zhì)的薄膜進(jìn)行包被。當(dāng)作為由液體組合物組成的口服制劑時，能制成可藥用的乳劑、溶液劑、懸浮劑、糖漿劑等等，可以使用精制水、乙醇等作為載體。還可以根據(jù)需要添加如濕潤劑、助懸劑、甜味劑、調(diào)味劑、防腐劑等等。
另一方面，作為非口服制劑時，可以按照一般方法，使本發(fā)明的前述成分溶解或懸浮在作為稀釋劑的注射用蒸餾水、生理食鹽水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等中，根據(jù)需要還可以添加殺菌劑、穩(wěn)定劑、等滲調(diào)節(jié)劑、止痛劑等。還可以制備固體組合物，在使用前將其溶解在無菌水或無菌注射用溶劑中使用。
作為外用制劑，包括經(jīng)皮施用的或經(jīng)粘膜(口腔內(nèi)、鼻腔內(nèi))施用的固體、半固體或液體狀態(tài)的制劑，還包括栓劑等。例如，乳劑、洗劑等乳劑，外用酊劑、經(jīng)粘膜施用的溶液劑等液體制劑，油性軟膏、親水性軟膏等軟膏劑，薄膜劑、貼劑、糊劑等經(jīng)皮施用的或經(jīng)粘膜施用的貼敷劑等等。
以上各種制劑，可以分別利用已知的醫(yī)藥用載體，適當(dāng)用一般常規(guī)方法制備。這些制劑中有效成分的含量，需要考慮其施用形式和施用方法等，只要是能夠以后面將要敘述的施用量范圍，施用該有效成分的量，則沒有特別限定，均可優(yōu)選。作為本發(fā)明有效成分的含量，通常在0.0001重量％或以上，優(yōu)選范圍是0.001～80重量％、更優(yōu)選范圍是0.01～70重量％左右。本說明書中，關(guān)于使用本發(fā)明的提取物作為有效成分時，在醫(yī)藥、食品、飲料、或飼料中的含量，以及有效成分的施用量，均用換算為本發(fā)明提取物的干燥重量表示。
本發(fā)明的治療劑或預(yù)防劑，可以采用對應(yīng)于制劑形態(tài)的適當(dāng)給藥途徑進(jìn)行給藥。對于給藥方法，也沒有特別限定，可以采用內(nèi)用、外用、注射等給藥途徑。注射劑可以靜脈、肌肉、皮下、皮內(nèi)等方式注射，當(dāng)為外用劑時，例如可以通過適當(dāng)?shù)慕o藥方法施用栓劑。
本發(fā)明治療劑或預(yù)防劑的給藥量是不一定的，可以根據(jù)其制劑形態(tài)、給藥方法、使用目的以及該治療劑或預(yù)防劑的給藥對象患者的年齡、體重、癥狀態(tài)進(jìn)行適當(dāng)設(shè)定。通常制劑中所含前述有效成分的給藥量，例如當(dāng)使用來源于北海道函館產(chǎn)海帶的巖藻糖作為有效成分時，沒有特別限定。但是對于人(例如成人)，每天的給藥量為0.0001μg～2000mg/kg體重，優(yōu)選0.001μg～1000mg/kg體重，更優(yōu)選0.01μg～100mg/kg體重。當(dāng)然給藥量要根據(jù)各種情況而變化，所以有時的給藥量少于上述給藥量范圍也是可以的，有時超過上述用量范圍也是有必要的。在所需要的給藥量范圍之內(nèi)，在一天內(nèi)可以一次給藥，也可以分幾次給藥。對于給藥時間也沒有特別限定。另外本發(fā)明的治療劑或預(yù)防劑，除了可以直接口服以外，還可以添加到任意飲料食品中，以進(jìn)行日常攝取。
另外，本發(fā)明還可以提供含有前述有效成分的BMP產(chǎn)生增強劑或骨形成促進(jìn)劑。作為該BMP產(chǎn)生增強劑或骨形成促進(jìn)劑，可以是前述有效成分本身，也可以是含有前述有效成分的組合物。BMP產(chǎn)生增強劑或骨形成促進(jìn)劑可以是將前述有效成分和能夠用于與該有效成分具有相同用途的其它成分等配合，按照上述治療劑或預(yù)防劑的制備方法制備成通常使用的試劑形態(tài)。該BMP產(chǎn)生增強劑或骨形成促進(jìn)劑中前述有效成分的含量，只要是考慮到該BMP產(chǎn)生增強劑或骨成形促進(jìn)劑的給藥方法、使用目的，能夠發(fā)揮本發(fā)明所期待效果的量即可，沒有特別限定。本發(fā)明有效成分的含量通常是0.01～100重量％左右。另外，對該BMP產(chǎn)生增強劑或骨形成促進(jìn)劑的使用量也沒有特別限定，只要是能夠發(fā)揮本發(fā)明所期待效果的量即可。特別是施用于機體時，只要是能夠在前述治療劑或預(yù)防劑中有效成分的給藥量范圍之內(nèi)給藥有效成分的量則均可優(yōu)選。本發(fā)明的BMP產(chǎn)生增強劑或骨形成促進(jìn)劑可用于需要增強BMP產(chǎn)生或促進(jìn)骨形成的疾病。
本發(fā)明的BMP產(chǎn)生增強劑或骨形成促進(jìn)劑，也可以使其包含在植入物內(nèi)使用。通過這種方法，例如在骨折時，使用這種植入物，可以促進(jìn)骨結(jié)合，因此可以加速骨折的治愈或植入物與骨組織的整合。這里的植入物是指在外科手術(shù)過程中，至少部分導(dǎo)入到體內(nèi)的器具，可對如關(guān)節(jié)、骨骼、牙齒、韌帶或肌腱等的斷裂或損傷部位使用。而且植入物可以永久地留在體內(nèi)，也可以被機體再吸收。這里，本發(fā)明的BMP產(chǎn)生增強劑或骨形成促進(jìn)劑，可以使其包含在植入物的內(nèi)部，也可以將其涂敷在植入物的表面而使其含有該增強劑或促進(jìn)劑。對植入物中本發(fā)明BMP產(chǎn)生增強劑或骨形成促進(jìn)劑的含量沒有特別限定，通常為0.01～80重量％左右。
本發(fā)明的BMP產(chǎn)生增強劑或骨形成促進(jìn)劑，也可以使其含在牙膏中使用。由于本發(fā)明的BMP產(chǎn)生增強作用或骨形成促進(jìn)作用，該牙膏可以促進(jìn)牙齒的再次鈣化。對牙膏中本發(fā)明的BMP產(chǎn)生增強劑或骨形成促進(jìn)劑的含量沒有特別限定，一般為0.01～80重量％左右。
本發(fā)明的BMP產(chǎn)生增強劑或骨形成促進(jìn)劑，還可以用于篩選與骨有關(guān)的疾病的藥物。本發(fā)明的BMP產(chǎn)生增強劑或骨形成促進(jìn)劑還可用于有關(guān)骨物理變化的功能性研究。
本發(fā)明還提供含有前述有效成分的用于增強BMP產(chǎn)生或促進(jìn)骨形成的食品、飲料或飼料。這里，所謂的含有是指含有、添加和/或稀釋的意思。本發(fā)明的食品、飲料或飼料，由于其增強BMP產(chǎn)生作用或促進(jìn)骨形成作用的原因，對于需要增強BMP產(chǎn)生或促進(jìn)骨形成的疾病的癥狀改善或預(yù)防是非常適用的。因此，本發(fā)明的食品或飲料也非常適合于關(guān)注骨健康、關(guān)注骨密度的人群食用。
本說明書中的食品、飲料或飼料中，所謂的“含有”是指食品、飲料或飼料中含有本發(fā)明中所使用的有效成分的形式；所謂“添加”是指在食品、飲料或飼料的原料中添加本發(fā)明中所使用的有效成分的形式；所謂“稀釋”是指在本發(fā)明所使用的有效成分中添加食品、飲料或飼料原料的形式。
對于本發(fā)明的食品、飲料或飼料的制備方法，沒有特別限定，只要按照如混合、烹調(diào)、加工等一般食品、飲料或飼料的加工方法即可，可以用這些方法制備，并且所得食品、飲料或飼料中含有具有增強BMP產(chǎn)生作用或促進(jìn)骨形成作用的本發(fā)明涉及的前述有效成分即可。
對于本發(fā)明的食品或飲料，沒有特別限定，例如可以列舉含有本發(fā)明涉及的前述有效成分構(gòu)成的谷物加工制品(小麥粉加工制品、淀粉類加工制品、預(yù)混合加工制品、面類制品、通心粉類、面包類、餡類、蕎麥類、麥麩、米粉、粉絲、包裝餅等)，油脂加工品(可塑性油脂、油炸食品用油、色拉油、蛋黃醬類、調(diào)味品類等)，大豆加工制品(豆腐類、豆醬類、納豆等)，肉食加工制品(火腿、臘肉、壓制火腿、香腸類等)，水產(chǎn)品(冷凍魚糜、魚糕制品、圓筒狀魚卷、方餅、油炸魚丸子、氽魚丸子、壽司(すじ)、魚肉火腿、魚肉香腸、干松魚、魚子加工制品、水產(chǎn)罐頭、用調(diào)料煮的海味等)，乳制品(原料乳、乳脂、酸奶、黃油、干酪、煉乳、奶粉、冰淇淋等)，蔬菜·果實類加工品(糖果料類、果醬類、咸菜類、果實飲料、蔬菜飲料、混合飲料等)，糕點類(口香糖、糖塊、巧克力、餅干類、點心面包類、蛋糕、糕餅、成酥脆餅干等)，醇類飲料(日本酒、中國酒、葡萄酒、成士忌、燒酒、伏特加、白蘭地、杜松子酒、老姆酒、啤酒、清涼醇類飲料、果酒、利口酒等)，嗜好飲料(綠茶、紅茶、烏龍茶、咖啡、清涼飲料、乳酸飲料等)，調(diào)味品(醬油、調(diào)味汁、醋、料酒等)，罐頭·瓶裝罐頭·袋裝罐頭食品(牛肉蓋飯、小鍋燴飯、紅小豆大米飯、咖喱飯以及其它各種烹調(diào)好的食品)，半干燥或濃縮食品(豬肝醬、其它的糊狀食品、蕎麥面條·面條的調(diào)味汁、濃縮湯類等)，干燥食品(速食面類、速食咖喱飯、速溶咖啡、粉末果汁、粉末湯、速食豆醬湯、烹調(diào)好的食品、烹制好的飲料、烹調(diào)好的湯等)，冷凍食品(雞素?zé)?、蒸雞蛋羹、鰻魚的烤魚片、漢堡牛排、燒麥、餃子、各種濃肉湯、水果雞尾酒等)，固體食品、液體食品(湯等)，香辣料類等農(nóng)·林產(chǎn)加工品，畜產(chǎn)加工品，水產(chǎn)加工品等等。另外作為本發(fā)明的食品，特別優(yōu)選口香糖、糖類。因為這種食品要在口腔內(nèi)咀嚼一定時間，如果使這些食品中含有本發(fā)明的有效成分，則通過本發(fā)明有效成分所發(fā)揮的效果，可以更有效地發(fā)揮牙周組織的再生效果，促進(jìn)牙齒再次鈣化的效果。
本發(fā)明的食品或飲料中，可以含有、添加和/或稀釋1種或多種前述有效成分。只要含有發(fā)揮增強BMP產(chǎn)生的作用或促進(jìn)骨形成作用的必要量，則對其形狀沒有特別限定，也包括片狀、顆粒狀、膠囊狀等形狀的可以通過口服而攝取的形狀。
對本發(fā)明的食品或飲料中前述有效成分的含量沒有特別限定，可以從其功能和活性發(fā)揮的角度進(jìn)行適當(dāng)選擇，例如當(dāng)使用來源于北海道函館產(chǎn)海帶的巖藻依聚糖作為有效成分時，雖然沒有特別限定，但是每100重量％食品中的有效成分含量為0.0001重量％或以上，優(yōu)選0.001～50重量％，更優(yōu)選0.006～10重量％。每100重量％飲料中的有效成分含量為0.0001重量％或以上，優(yōu)選0.001～50重量％，更優(yōu)選0.006～10重量％。本發(fā)明的食品或飲料，當(dāng)食品中含有的有效成分是以來源于北海道函館產(chǎn)海帶的巖藻作為有效成分時，人(例如成人)每天的攝取量只要達(dá)到0.0001μg～2000mg/kg體重，優(yōu)選達(dá)到0.001μg～1000mg/kg體重，更優(yōu)選達(dá)到0.01μg～100mg/kg體重即可。當(dāng)然攝取量要根據(jù)各種條件而變化，所以有時攝取量可以低于上述攝取量范圍，或者有時攝取量超過上述攝取量范圍也是必要的。
本發(fā)明還提供含有、添加和/或稀釋前述有效成分的具有BMP產(chǎn)生增強作用或骨形成促進(jìn)作用的生物用飼料，作為本發(fā)明的另一種方案是提供生物飼養(yǎng)方法，該飼養(yǎng)方法的特征是對生物施用前述有效成分。作為本發(fā)明的又一種方案是提供生物飼養(yǎng)劑，該飼養(yǎng)劑的特征是含有前述有效成分。
在這些發(fā)明中，所謂的生物是指如養(yǎng)殖動物、寵物動物等，作為養(yǎng)殖動物可以列舉家畜、實驗動物、家禽、魚類、甲殼類或貝類。作為飼料可以例舉保持和/或改進(jìn)健康狀況用的飼料。作為生物飼養(yǎng)劑，可以列舉浸漬用劑、飼料添加劑、飲料用添加劑。
根據(jù)這些發(fā)明，在前面所列舉的適合采用這些發(fā)明的生物中，由于本發(fā)明中所用前述有效成分的BMP產(chǎn)生增強作用或骨形成促進(jìn)作用，可以期待顯示與本發(fā)明前述治療劑和預(yù)防劑所產(chǎn)生的相同效果。也就是可以期待發(fā)揮治療或預(yù)防該生物體中需要增強骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生或促進(jìn)骨形成的疾病的效果。
本發(fā)明中所使用的前述有效成分，例如以來源于北海道函館產(chǎn)海帶的巖藻依聚糖作為有效成分時，對象生物每天的攝取量，只要以0.0001μg～2000mg/kg體重，優(yōu)選以0.001μg～1000mg/kg體重，更優(yōu)選以0.01μg～100mg/kg體重的量攝取即可。當(dāng)然施用量要根據(jù)各種條件而變化，例如當(dāng)使用本發(fā)明的提取物時，還要根據(jù)所用溶劑的用量等而變化，所以有時施用量可以低于上述施用量范圍，或者有時施用量超過上述施用量范圍也是必要的。例如可以將該有效成分添加混合到用于對象生物的人工配合飼料的原料中，或者是與人工配合飼料的粉末原料混合后再添加混合到其它原料中使用的方法施用。另外對于前述有效成分在飼料中的含有量沒有特別限定，可以根據(jù)需要進(jìn)行適當(dāng)設(shè)定，例如當(dāng)使用來源于北海道函館產(chǎn)海帶的巖藻依聚糖作為有效成分時，雖然沒有特別限定，但是每100重量％飼料中的有效成分含量為0.0001重量％或以上，優(yōu)選0.001～50重量％，更優(yōu)選0.006～10重量％。
對于本發(fā)明飼料的制備方法沒有特別限定，同時其配合也可以按照一般飼料的情況進(jìn)行，只要制備的飼料中含有具有BMP產(chǎn)生增強作用或骨形成促進(jìn)作用的本發(fā)明涉及的前述有效成分即可。
對于可以使用本發(fā)明的生物也沒有特別限定，作為養(yǎng)殖動物，可以列舉馬、牛、豬、羊、山羊、駱駝、騾子(ラマ)等家畜，小鼠、大鼠、豚鼠、兔子等實驗動物，雞、鴨、火雞、鴕鳥等家禽，作為寵物有狗、貓等等，本發(fā)明可廣泛用于各種動物。
通過使生物攝取含有具有增強BMP產(chǎn)生作用或促進(jìn)骨形成作用的本發(fā)明中所使用的前述有效成分的飼料，或把對象生物浸漬在含有具有增強BMP產(chǎn)生作用或促進(jìn)骨形成作用的本發(fā)明中所使用的前述有效成分的液體(例如添加有浸漬用劑的水浴等)中，可以使家畜、實驗動物、家禽、寵物動物等的健康狀況保持在良好水平，或改進(jìn)其健康狀況。這些就構(gòu)成了本發(fā)明生物飼養(yǎng)方法的一個方案。
本發(fā)明中所使用的前述有效成分，即使以發(fā)揮其作用為標(biāo)準(zhǔn)的有效量進(jìn)行施用，也沒有發(fā)現(xiàn)毒性。例如通過口服給藥時，即使一次對小鼠施用1g/kg體重的來源于北海道函館產(chǎn)海帶的巖藻依聚糖，也沒有發(fā)現(xiàn)死亡例。另外，即使一次對大鼠口服給藥前述有效成分1g/kg體重，也沒有發(fā)現(xiàn)死亡例。
實施例以下列舉實施例更具體地說明本發(fā)明，但是本發(fā)明并不受這些實施例的任何限定。實施例中的％，只要沒有特別說明，表示重量％。
參考例1(1)對北海道函館產(chǎn)海帶進(jìn)行充分干燥后，用自由粉碎機(奈良機械制作所制造)對干燥物20kg進(jìn)行粉碎。在900升自來水中加入氯化鈣二水合物(日本曹達(dá)公司制造)7.3kg使其溶解，接著混合北海道函館產(chǎn)海帶粉碎物20kg。吹入水蒸氣對其進(jìn)行40分鐘升溫，使液體溫度由12℃升高至90℃，接著在攪拌下于90～95℃下保溫1小時。接著進(jìn)行冷卻，得到冷卻物1100升。接著使用固液分離裝置ウエストフアリアセパレ一タ一公司制造的CAN型)對冷卻物進(jìn)行固液分離，制備約900升的固液分離上清液。使用ダィセル公司制造的FE10-FC-FUS0382(組分分子量為3萬)把固液分離上清360升液濃縮至20升。接著加入自來水20升，再次濃縮到20升，反復(fù)進(jìn)行5次這樣的操作，進(jìn)行脫鹽處理，制備來源于北海道函館產(chǎn)海帶的提取液25升。對1升該提取液進(jìn)行冷凍干燥，得到來源于北海道函館產(chǎn)海帶的巖藻依聚糖干燥物13g。
(2)把參考例1-(1)中所述的巖藻依聚糖干燥物7g溶解于含有50mM的氯化鈉和10％乙醇的20mM的咪唑緩沖液(pH為8.0)700ml中，通過離心分離除去不溶物。用相同的緩沖液對DEAE-Cellulofine A-800柱(Φ11.4cm×48cm)進(jìn)行平衡處理，添加離心分離上清后，用相同的緩沖液進(jìn)行洗脫，從氯化鈉的50mM開始，以1.95M的濃度梯度進(jìn)行洗脫(1級分250ml)。用苯酚硫酸法和咔唑硫酸法求出總糖量以及糖醛酸的含量，按照洗脫順序分別得到級分43～49，級分為50～55，級分為56～67的組分，然后通過電析滲對這些組分進(jìn)行脫鹽后冷凍干燥，分別由級分43～49制備I組分(340mg)，由級分50～55制備II組分(870mg)，由級分56～67制備III組分(2.64g)。圖1示出了來源于北海道函館產(chǎn)海帶的巖藻依聚糖的DEAE-CellulofineA-800柱洗脫圖形。圖1中，縱坐標(biāo)表示用咔唑硫酸法測得的在530nm處的吸光度(圖中的黑圓點)、用苯酚硫酸法測得的在480nm處的吸光度(圖中的空白圓點)以及導(dǎo)電率(mS/cm圖中的空白方塊)，橫坐標(biāo)表示級分的編號。
參考例2(1)在加入(分注)由含有葡糖0.25％、蛋白胨1.0％、酵母提取物0.05％的人造海水(ジャマリンラボラトリ一公司制造)(pH為8.2)構(gòu)成的培養(yǎng)基600ml滅菌過(120℃，20分鐘)的2升三角燒瓶中，接種交替單胞菌(アルテロモナス)sp.SN-1009(CCRC910070)，在25℃下培養(yǎng)26小時，作為種培養(yǎng)液。把由含有蛋白胨1.0％、酵母提取物0.02％、下述參考例2-(2)中所述的硫酸化多糖0.2％以及消泡劑(信越化學(xué)工業(yè)公司制造，KM70)0.01％的人造海水(pH為8.0)構(gòu)成的培養(yǎng)基20升加入到30升容量的發(fā)酵罐中，在120℃下進(jìn)行20分鐘滅菌處理。冷卻后，接種上述種培養(yǎng)液600ml并進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件24℃，24小時，通氣量10升/分鐘，攪拌速度250轉(zhuǎn)/分鐘。培養(yǎng)結(jié)束后，對培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，得到菌體和培養(yǎng)上清。通過使用安裝有排阻分子量為(排除分子量)1萬的中空纖維的超濾機對所得培養(yǎng)上清進(jìn)行濃縮后，進(jìn)行85％的飽和硫酸銨鹽析，通過離心分離收集生成的沉淀，對于含1/10濃度人造海水的20mM的TRIS鹽酸緩沖液(pH8.2)進(jìn)行充分透析，制備600ml選擇性地作用于硫酸化多糖的末端型(エンド型)硫酸化多糖分解酶液體。
(2)用安裝有孔徑為1mm篩網(wǎng)的切刀式粉碎機(カツタ一ミル)(增幸產(chǎn)業(yè)公司制造)對干燥的北海道函館產(chǎn)海帶2kg進(jìn)行粉碎，把所得到的海帶碎片懸浮在20升的80％乙醇中，在25℃下攪拌3小時，用濾紙過濾后對殘渣進(jìn)行充分清洗，把所得殘渣懸浮在加熱到95℃的40升含50mM氯化鈉的20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5)中，一面偶爾進(jìn)行攪拌，一面在95℃下處理2小時，提取硫酸化多糖。對提取液中的懸浮物進(jìn)行過濾，制備過濾液后，再用3.5升的100mM氯化鈉溶液對過濾殘渣進(jìn)行清洗，再得到濾液，將兩濾液合并后，把溫度降低至30℃，添加3000U的藻酸裂解酶(ナガセ生化學(xué)工業(yè)公司制造)后，再添加乙醇4升，在25℃下攪拌24小時。接著進(jìn)行離心分離，用具有排阻分子量為10萬的中空纖維的超濾機對所得上清進(jìn)行濃縮，使之達(dá)到4升，再用含有10％乙醇的100mM的氯化鈉繼續(xù)進(jìn)行超濾，直至著色性物質(zhì)不透過為止。通過離心分離，除去非過濾液中生成的沉淀，把該上清降低至5℃，用0.5N鹽酸將pH調(diào)節(jié)至2.0后，通過離心分離除去生成的蛋白質(zhì)等沉淀，再迅速用1N氫氧化鈉將所得上清的pH調(diào)節(jié)至8.0。接著用安裝有排阻分子量為10萬的中空纖維的超濾機進(jìn)行超濾，通過20mM氯化鈉(pH8.0)完全進(jìn)行溶劑置換后，再次將pH調(diào)節(jié)至8.0，離心分離后，進(jìn)行冷凍干燥，制備大約95g的硫酸化多糖。
(3)用安裝有孔徑為1mm篩網(wǎng)的切刀式粉碎機對干燥的北海道函館產(chǎn)海帶2kg進(jìn)行粉碎，把所得到的海帶碎片懸浮在20升的80％乙醇中，在25℃下攪拌3小時，用濾紙過濾后對殘渣進(jìn)行充分清洗，把所得殘渣懸浮在含有30ml在上述參考例2-(1)中制備的末端型硫酸化多糖分解酶液體、10％乙醇、100mM氯化鈉、50mM氯化鉀以及50mM咪唑的20升緩沖液(pH8.2)中，在25℃下攪拌48小時，用網(wǎng)眼直徑為32μm的不銹鋼濾網(wǎng)對該懸浮液進(jìn)行過濾，用含有50mM氯化鈣的10％乙醇對該殘渣進(jìn)行清洗。再把該殘渣懸浮在10升的含有50mM氯化鈣的10％乙醇中，攪拌3小時后，用不銹鋼濾網(wǎng)過濾，清洗。然后再以相同條件對該殘渣進(jìn)行懸浮后，攪拌16小時，用直徑為32μm的不銹鋼濾網(wǎng)過濾、清洗。然后將這樣得到的濾液和清洗液集中起來，用安裝有排阻分子量為3000的中空纖維的超濾機進(jìn)行超濾，分離成過濾液和非過濾液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器把該過濾液濃縮至約3升后，進(jìn)行離心分離得到上清，用安裝有排阻分子量為300的膜的電滲析器對所得的上清進(jìn)行脫鹽處理，在該溶液中，添加乙酸鈣，使其達(dá)到0.1M。通過離心分離除去生成的沉淀。把得到的該上清添加到事先用50mM乙酸鈣進(jìn)行平衡處理的DEAE-Cellulofine(樹脂量4升)中，用50mM的乙酸鈣以及50mM的氯化鈉進(jìn)行充分清洗后，以50mM～800mM的氯化鈉梯度進(jìn)行洗脫。這時以分離量為500ml/柱進(jìn)行洗脫。通過乙酸纖維素膜電泳法[Analytical Biochemistry，第37卷，第197～202頁(1970)]對分離組分進(jìn)行分析的結(jié)果表明，氯化鈉濃度大約為0.4M時洗脫的硫酸化糖(級分編號在63附近)是均勻的。于是首先把級分編號為63的液體濃縮至150ml后，添加氯化鈉，使其濃度達(dá)到4M，再加入到預(yù)先用4M氯化鈉進(jìn)行平衡處理的苯基-Cellulofine(樹脂量為200ml)中，用4M氯化鈉進(jìn)行充分清洗。收集非吸附性硫酸化糖組分，通過安裝有排阻分子量為300的膜的電滲析器進(jìn)行脫鹽處理，得到脫鹽液505ml，把所得脫鹽液中的40ml添加到用含有10％乙醇的0.2M氯化鈉進(jìn)行平衡處理的Cellulofine GCL-90的柱(4.1cm×87cm)中，進(jìn)行凝膠過濾，以每級分為9.2ml進(jìn)行分離。通過苯酚硫酸法[AnalyticalChemistry，第28卷，第350頁(1956)]對所有級分的總糖量進(jìn)行分析。
結(jié)果表明硫酸化糖形成一個峰，該峰的中間部分集中了級分編號為63～70的部分，通過安裝有排阻分子量為300的膜的電滲析器進(jìn)行脫鹽處理后，進(jìn)行冷凍干燥，得到112mg下述通式(4)所示化合物的干燥品，以下把該化合物稱為7-12SFd-F。
參考例3把干燥的藍(lán)藻粉末(銷售(株)スピルリナ研究所)20g放入到勻化器(日本精機公司制造)中，加入400ml丙酮，以8000rpm的轉(zhuǎn)速勻化10分鐘。用濾紙對勻化物進(jìn)行過濾，得到殘渣。與前述操作一樣，對殘渣反復(fù)進(jìn)行3次丙酮清洗，得到丙酮清洗的殘渣。與用丙酮清洗一樣，用90％乙醇對丙酮清洗殘渣反復(fù)清洗4次，用80％乙醇反復(fù)清洗4次，得到乙醇清洗殘渣。在乙醇清洗殘渣中加入600ml含100mM氯化鈉和10％乙醇的30mM磷酸緩沖液(pH7.0)，在室溫下攪拌18小時。以10000rpm轉(zhuǎn)速對該混合物進(jìn)行40分鐘的離心分離，得到上清。用濾紙過濾除去混入在上清中的不溶物，得到粗提取物(濾液)。用安裝有排阻分子量為1萬的中空纖維的超濾裝置對所得到的粗提取物進(jìn)行濃縮，使其達(dá)到300ml，一面添加2升含10％乙醇的100mM氯化鈉，一面進(jìn)行超濾。然后，將溶劑換成含10％乙醇和50mM氯化鈉的10mM咪唑鹽酸緩沖液(pH7.0)，得到藍(lán)藻的高分子組分240ml。
把藍(lán)藻高分子組分添加到經(jīng)含有10％乙醇和50mM氯化鈉的10mM咪唑鹽酸緩沖液(pH7.0)平衡處理的DEAE-Cellulofine A-800柱(φ3×14.2cm)中，用相同緩沖液360ml對柱進(jìn)行清洗后，用0.05M(200ml)至2M(200ml)的氯化鈉進(jìn)行梯度洗脫。洗脫液以10ml/柱進(jìn)行分離。在級分中，把級分No.14至30的定名為藍(lán)藻類酸性多糖組分-I(SSP-I)，把級分No.69至77的定名為藍(lán)藻類酸性多糖組分-II(SSP-II)，把級分No.78至83的定名為藍(lán)藻類酸性多糖組分-III(SSP-III)，把級分No.84至99的定名為藍(lán)藻類酸性多糖組分-IV(SSP-IV)。使SSP-I、SSP-II、SSP-III以及SSP-VI對蒸餾水進(jìn)行充分透析，冷凍干燥，分別是200mg、260mg、100mg和60mg。
參考例4把干燥的小球藻粉末20g放入到勻化器(日本精機公司制造)中，加入400ml丙酮，以8000rpm的轉(zhuǎn)速勻化10分鐘。用濾紙對勻化物進(jìn)行過濾，得到殘渣。進(jìn)行與前述相同的操作，對殘渣反復(fù)進(jìn)行3次丙酮清洗，得到丙酮清洗的殘渣。與用丙酮清洗一樣，用90％乙醇對丙酮清洗殘渣反復(fù)清洗4次，用80％乙醇反復(fù)清洗4次，得到乙醇清洗殘渣。
在乙醇清洗殘渣中加入600ml含100mM氯化鈉和10％乙醇的30mM磷酸緩沖液(pH7.0)，在室溫下攪拌18小時。以10000rpm轉(zhuǎn)速對該混合物進(jìn)行40分鐘的離心分離，得到上清。用濾紙過濾除去混入在上清中的不溶物，得到粗提取物(濾液)。用安裝有排阻分子量為1萬的中空纖維的超濾裝置對所得到的粗提取物進(jìn)行濃縮，使其達(dá)到310ml.，一面添加3升含10％乙醇的100mM氯化鈉，一面進(jìn)行超濾。然后，將溶劑換成含10％乙醇和50mM氯化鈉的10mM咪唑鹽酸緩沖液(pH7.0)，得到小球藻高分子組分203ml。
把小球藻高分子組分添加到經(jīng)含有10％乙醇和50mM氯化鈉的10mM咪唑鹽酸緩沖液(pH7.0)進(jìn)行平衡處理的DEAE-Cellulofine A-800柱(φ3×14.2cm)中，用相同的緩沖液297ml對柱進(jìn)行清洗后，用0.05M(200ml)至2M(200ml)的氯化鈉進(jìn)行梯度洗脫。洗脫液以10ml/柱進(jìn)行分離。在洗脫組分中，把級分No.63至68的定名為小球藻硫酸化多糖組分-I(CPS-I)，把級分No.69至75的定名為小球藻硫酸化多糖組分-II(CPS-II)。使CSP-I和CSP-II對蒸餾水進(jìn)行充分透析，冷凍干燥，分別是140mg和200mg。
參考例5把綠原酸溶解在100mM碳酸鈉緩沖液(pH9)中，使?jié)舛冗_(dá)到100mM。通過蠕動移液泵向該溶液中通入空氣12小時，制備綠原酸的氧化處理物。
實施例1使人骨肉瘤細(xì)胞株Hu09懸浮在含有10％胎牛血清(バイオウィタカ公司制造)的DMEM培養(yǎng)基(バイオウィタカ公司制造)中，使之達(dá)到1×105細(xì)胞/ml。以0.1ml/孔接種在96孔平皿上，進(jìn)行無菌培養(yǎng)。培養(yǎng)2天后，換成新的培養(yǎng)基中。在其中加入用參考例1-(1)得到的來源于北海道函館產(chǎn)海帶的巖藻依聚糖作為試樣，培養(yǎng)48小時。接著用酶免疫測定法(BMP-2 ImmunoassayGT公司制造)對培養(yǎng)液中骨形成蛋白質(zhì)-2(BMP-2)的濃度進(jìn)行測定。對照是不添加試樣，以該細(xì)胞培養(yǎng)液中的BMP-2濃度(細(xì)胞的BMP-2產(chǎn)生量)作為100％，表示增強BMP-2產(chǎn)生的活性。試樣的添加量如表1所示。該結(jié)果表明，用參考例1-(1)得到的來源于北海道函館產(chǎn)海帶的巖藻依聚糖濃度依存性地增強BMP-2的產(chǎn)生。把該結(jié)果出示在表1中。
表1 來源于北海道函館產(chǎn)海帶的巖藻依聚糖對BMP-2產(chǎn)生的增強作用

表中，對照的BMP-2產(chǎn)生量為0.120ng/ml。
實施例2用與實施例1相同的方法，對在參考例1-(1)中制備的來源于北海道函館產(chǎn)海帶的巖藻依聚糖，在參考例1-(2)中制備的巖藻依聚糖I組分、巖藻依聚糖II組分、巖藻依聚糖III組分，在參考例2-(3)中制備的7-12SFd-F、在參考例3中制備的藍(lán)藻類酸性多糖組分SSP-I、III、IV和肝素(和光純藥公司制造)，硫酸葡聚糖(シグマ公司制造)，硫酸軟骨素B(生化學(xué)工業(yè)公司制造)，果膠酸(ナカライテスク公司制造)的BMP-2產(chǎn)生增強活性進(jìn)行了研究。試樣的添加量如表2、3所示。結(jié)果表明來源于北海道函館產(chǎn)海帶的巖藻依聚糖、巖藻依聚糖I組分、巖藻依聚糖II組分、巖藻依聚糖III組分、7-12SFd-F、藍(lán)藻類酸性多糖組分SSP-I、III、IV，肝素，硫酸葡聚糖，硫酸軟骨素B，果膠酸對BMP產(chǎn)生的增強作用與其濃度有依賴關(guān)系。把該結(jié)果出示在表2、3中。
表2

表中，來源于北海道函館產(chǎn)海帶的巖藻依聚糖，巖藻依聚糖I組分，巖藻依聚糖II組分，巖藻依聚糖III組分、SSP-I、III、IV，肝素，硫酸葡聚糖的對照BMP-2產(chǎn)生量為0.110ng/ml。
表3

表中，7-12SFd-F的對照BMP-2產(chǎn)生量為0.201ng/ml，硫酸軟骨素B、果膠酸的對照BMP-2產(chǎn)生量為0.130ng/ml。
實施例3用與實施例1相同的方法，對角叉菜聚糖λ(シグマ公司制造)，角叉菜聚糖κ(シグマ公司制造)，角叉菜聚糖ι(シグマ公司制造)、低分子肝素、(CELSUS LABORATORIES公司制造)的BMP-2產(chǎn)生增強活性進(jìn)行了研究。試樣的添加量如表4所示。結(jié)果表明角叉菜聚糖λ，角叉菜聚糖κ，角叉菜聚糖ι，低分子肝素對BMP-2產(chǎn)生的增強作用與其濃度有依賴關(guān)系。把該結(jié)果出示在表4中。
表4

表中，角叉菜聚糖λ，角叉萊聚糖κ，角叉菜聚糖ι的對照的BMP-2產(chǎn)生量為0.083ng/ml，低分子肝素的對照的BMP-2產(chǎn)生量為0.070ng/ml。
實施例4用與實施例1相同的方法對聚丙烯酸(平均分子量為5000、250000、1000000和光純藥公司制造)的BMP-2產(chǎn)生增強活性進(jìn)行了研究。試樣的添加量如表5所示。結(jié)果表明聚丙烯酸(平均分子量為5000、250000、1000000)對BMP-2產(chǎn)生的增強作用與其濃度有依賴關(guān)系。把該結(jié)果出示在表5中。
表5

表中，對照的BMP-2產(chǎn)生量為0.046ng/ml。
實施例5用與實施例1相同的方法對綠原酸(東京化成工業(yè)公司制造)和在參考例5中制備的綠原酸的氧化處理物的BMP-2產(chǎn)生增強活性進(jìn)行了研究。試樣的添加量如表6所示。結(jié)果表明綠原酸、綠原酸的氧化處理物對BMP-2產(chǎn)生的增強作用與其濃度有依賴關(guān)系。把該結(jié)果出示在表6中。
表6

表中，對照的BMP-2產(chǎn)生量為0.041ng/ml。
實施例6使小鼠胚細(xì)胞株C3H10T1/2懸浮在含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，使之達(dá)到3×104細(xì)胞/ml。以0.1ml/孔接種在96孔平皿上，進(jìn)行無菌培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后，換成新培養(yǎng)基。往其中加入硫酸乙酰肝素、參考例4得到的小球藻硫酸化多糖組分CSP-1、CSP-1I作為試樣，培養(yǎng)7天。接著以細(xì)胞中堿性磷酸酶活性的增加作為指標(biāo)，測定C3H10T1/2細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化情況。用PBS對細(xì)胞清洗1次，添加反應(yīng)基質(zhì)液(100mM二乙醇胺緩沖液pH10.0，2mM氯化鎂，1mM對硝基苯磷酸)100μl在37℃下反應(yīng)30分鐘。接著添加0.2N的氫氧化鈉100μl終止反應(yīng)，通過在405nm的吸光度測定游離的對硝基苯磷酸量，對照是不添加試樣，以對照的堿性磷酸酶活性作為100％，表示添加試樣時的堿性磷酸酶活性。該活性表示誘導(dǎo)分化成成骨細(xì)胞的活性。試樣的添加量如表7所示。進(jìn)行2組試驗，取其平均值。結(jié)果表明硫酸乙酰肝素、CSP-I、CSP-II、誘導(dǎo)分化成成骨細(xì)胞與其濃度有依賴關(guān)系。把該結(jié)果出示在表7中。
表7

產(chǎn)業(yè)上的實用性通過本發(fā)明可以提供含有選自(a)酸性糖，(b)聚丙烯酸，(c)綠原酸和(d)綠原酸的氧化處理物中的至少一種化合物或來源于藻類的提取物作為有效成分的，治療或預(yù)防需要增強BMP產(chǎn)生或促進(jìn)骨形成的疾病用的(醫(yī))藥品，BMP產(chǎn)生增強劑或骨形成促進(jìn)劑，用于增強BMP產(chǎn)生或促進(jìn)骨形成的食品，飲料或飼料。該(醫(yī))藥品可用作治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥和骨折等與骨相關(guān)的疾病的治療劑或預(yù)防劑。同時BMP產(chǎn)生增強劑或骨形成促進(jìn)劑還可以作為治療骨折和治療牙齒的植入物和牙膏的成分使用。并且該制劑還可用于對于骨的功能進(jìn)行研究，對治療與骨有關(guān)的疾病的藥物進(jìn)行篩選。此外，該食品或飲料，還可以通過作為日常食品和飲料進(jìn)行攝取，來改善需要增強BMP產(chǎn)生或促進(jìn)骨形成的疾病的癥狀等。
權(quán)利要求
1.需要增強骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生或促進(jìn)骨形成的疾病的治療劑或預(yù)防劑，其特征是含有選自(a)酸性糖，(b)聚丙烯酸，(c)綠原酸和(d)綠原酸的氧化處理物中的至少一種化合物作為有效成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的治療劑或預(yù)防劑，其中，酸性糖是選自酸性多糖、酸性寡糖、酸性單糖以及它們的分解物中的至少一種酸性糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的治療劑或預(yù)防劑，其中，酸性糖是選自巖藻依聚糖、肝素、硫酸葡聚糖、硫酸軟骨素B、果膠酸、來源于藍(lán)藻類的酸性多糖、巖藻依聚糖分解物、角叉菜聚糖λ、角叉菜聚糖κ、角叉菜聚糖ι、低分子肝素、硫酸乙酰肝素以及來源于小球藻的酸性多糖中的至少一種酸性糖。
4.骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生增強劑或骨形成促進(jìn)劑，其特征是含有選自(a)酸性糖，(b)聚丙烯酸，(c)綠原酸和(d)綠原酸的氧化處理物中的至少一種化合物作為有效成分。
5.根據(jù)權(quán)利要求4中所述的骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生增強劑或骨形成促進(jìn)劑，其中，酸性糖是選自酸性多糖、酸性寡糖、酸性單糖以及它們的分解物中的至少一種酸性糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求4中所述的骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生增強劑或骨形成促進(jìn)劑，其中，酸性糖是選自巖藻依聚糖、肝素、硫酸葡聚糖、硫酸軟骨素B、果膠酸、來源于藍(lán)藻類的酸性多糖、巖藻依聚糖分解物、角叉菜聚糖λ、角叉菜聚糖κ、角叉菜聚糖ι、低分子肝素、硫酸乙酰肝素以及來源于小球藻的酸性多糖中的至少一種酸性糖。
7.用于增強骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生或促進(jìn)骨形成的食品、飲料或飼料，其特征是含有選自(a)酸性糖，(b)聚丙烯酸，(c)綠原酸和(d)綠原酸的氧化處理物中的至少一種化合物作為有效成分。
8.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的用于增強骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生或促進(jìn)骨形成的食品、飲料或飼料，其中，酸性糖是選自酸性多糖、酸性寡糖、酸性單糖以及它們的分解物中的至少一種酸性糖。
9.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的用于增強骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生或促進(jìn)骨形成的食品、飲料或飼料，其中，酸性糖是選自巖藻依聚糖、肝素、硫酸葡聚糖、硫酸軟骨素B、果膠酸、來源于藍(lán)藻類的酸性多糖，巖藻依聚糖分解物，角叉菜聚糖λ，角叉菜聚糖κ，角叉菜聚糖ι，低分子肝素，硫酸乙酰肝素以及來源于小球藻的酸性多糖中選擇的至少一種酸性糖。
10.需要增強骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生或促進(jìn)骨形成的疾病的治療劑或預(yù)防劑，其特征是含有來源于藻類的提取物作為有效成分。
11.骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生增強劑或骨形成促進(jìn)劑，其特征是含有來源于藻類的提取物作為有效成分。
12.增強骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生用的或促進(jìn)骨形成用的食品、飲料或飼料，其特征是含有來源于藻類的提取物作為有效成分。
全文摘要
本發(fā)明可以提供治療或預(yù)防需要增強骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生或促進(jìn)骨形成的疾病的治療劑或預(yù)防劑；骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生增強劑或骨形成的促進(jìn)劑，用于增強骨形成蛋白質(zhì)產(chǎn)生或促進(jìn)骨形成的食品、飲料或飼料，其特征在于含有選自(a)酸性糖，(b)聚丙烯酸，(c)綠原酸和(d)綠原酸的氧化處理物中的至少一種化合物或來源于藻類的提取物作為有效成分。
文檔編號A61P43/00GK1720040SQ20038010522
公開日2006年1月11日 申請日期2003年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月5日
發(fā)明者大野木宏, 杉山勝美, 佐川裕章, 加藤郁之進(jìn) 申請人:寶生物工程株式會社