專利名稱：抗病毒的核苷衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗病毒療法領(lǐng)域，尤其涉及用于治療丙型肝炎病毒(HCV)介導(dǎo)的疾病的核苷衍生物。本發(fā)明提供了新的化合物、包含這些化合物的藥用組合物以及在單獨(dú)療法或組合療法中采用所述化合物來(lái)治療或預(yù)防HCV介導(dǎo)的疾病的方法。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)是全世界大部分慢性肝病的原因，在工業(yè)化國(guó)家中有70％的慢性肝炎病例由丙型肝炎病毒引起。在全球估計(jì)丙型肝炎地比例為平均3％(0.1％至5.0％)；估計(jì)在全世界有1.7億的慢性攜帶者。因此一直需要有有效的抗HCV治療劑。
式I化合物(R1＝R2＝R3＝H)左旋韋林(levovirin)(1-(3S，4R-二羥基-5S-羥甲基-四氫呋喃-2S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺)是核苷類似物，并且是抗病毒化合物利巴韋林的對(duì)映異構(gòu)體。與利巴韋林不同，左旋韋林沒(méi)有可檢測(cè)的抗病毒活性；然而，左旋韋林可通過(guò)增加抗病毒Th1細(xì)胞因子的表達(dá)來(lái)刺激免疫反應(yīng)。與利巴韋林相同，左旋韋林在小鼠肝炎模型中降低血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的水平。(R.Tam等人，J.Med.Chem.2000 441276-1283；M.Assenmacher等人，Eur.J.Immunol.1998 281534-1543)。左旋韋林似乎沒(méi)有與利巴韋林相關(guān)的毒性。
雖然核苷衍生物常常具有高水平的生物活性，但是它們的治療應(yīng)用通常受到欠佳的物理性質(zhì)和限制核苷吸收量的不佳的藥代動(dòng)力學(xué)和生物利用度的阻礙?？诜o藥后僅有約15％的左旋韋林被全身吸收。因此，需要有生物利用度改善的治療劑。前藥是吸收不好的化合物的生物可逆化學(xué)衍生物，它是優(yōu)化物理性質(zhì)以改善藥物傳送的一種途徑。(W.N.Chapman和C.J.H.Porter，Adv.Drug Deliv.1996 19149-169；D.Fleisher等人，Adv.Drug Eeliv 1996 19115-130)。前藥設(shè)計(jì)的一個(gè)途徑是，制備化學(xué)衍生物以優(yōu)化油/水分配系數(shù)或其它使穿過(guò)粘膜的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)的物理性質(zhì)。選擇這樣的衍生物該衍生物是細(xì)胞質(zhì)、血液或血清中存在的非特異性酶的底物，在該化合物被吸收后能裂解修飾基團(tuán)并轉(zhuǎn)化為生物活性的母體分子。理想的口服前藥應(yīng)當(dāng)對(duì)胃液和腸食糜穩(wěn)定，可被有效地轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)腸膜，并且在被胃腸道吸收后可迅速轉(zhuǎn)化為母體藥物。因此，“核苷前藥”可能能防止母體核苷發(fā)生如活性、生物利用度或穩(wěn)定性的問(wèn)題。
另一途徑利用非特異性主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)以使前藥穿過(guò)膜。設(shè)計(jì)分子的前藥部分以使之被主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)識(shí)別，并在轉(zhuǎn)運(yùn)完成后裂解。已經(jīng)提議將非特異性肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PepT1和PepT2用于改善吸收不好的藥物的生物利用度。(P.Balimane等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1998 250246-251；K.Sawada等人，J.Pharmacol Exp.Ther.1999 291(2)705-709；I.Rubio-Aliaga和H.Daniel，Trends Pharmacol.Sci.2002 23(9)434-40)。
IIaR′＝H；R″＝HIIbR′＝H；R″＝Val-HHcR′＝CH2OH；R″＝HIIdR′＝CH2OH；R″＝Val-H
阿昔洛韋IIa的纈氨酸酯IIb(伐昔洛韋)的吸收性質(zhì)改善，這已經(jīng)被提議是經(jīng)肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白攝取的結(jié)果。(Balimane，出處同上；M.E.Ganapathy等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1998 246470-75；P.J.Sinko和P.V.Balimane，Biopharm.Drug Dispos.1998 19209-17；R.L.de Vrueh等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.1998 2861166-70)。Mitsuru Sugara等人(J.Pharm.Sci.2000 89(6)781-89)提出更昔洛韋IIc的纈氨酸酯纈更昔洛韋IId的轉(zhuǎn)運(yùn)改善可歸因于PepT1和PepT2轉(zhuǎn)運(yùn)體系。WO 01/68034 A2(G.Wang等人)公開對(duì)左旋韋林的糖和三唑部分進(jìn)行生物可逆性修飾以提高藥物的生物利用度和治療感染、侵染、贅生物或自身免疫性疾病。WO 00/23454(A.K.Ganguly等人)公開將利巴韋林衍生物與α干擾素共同施用于慢性丙型肝炎患者。
雖然利用有效吸收的前藥提供了改善左旋韋林生物利用度的途徑，但是利用這些化合物同樣需要左旋韋林衍生物具有使活性成分的有效制備和配制成為可能的物理性質(zhì)。左旋韋林前藥應(yīng)具有足夠的熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性，并且是不吸濕的。與制劑化學(xué)有關(guān)的性質(zhì)包括粒徑、多晶型物、晶癖和鹽形式。這些性質(zhì)影響水溶解度、溶出性質(zhì)、與制劑中其它組分的相容性、給藥途徑以及生物藥劑學(xué)性質(zhì)。因此，理想的核苷藥物候選者必須具有使其有效制備和配制成為可能的物理性質(zhì)、使其傳送至吸收位點(diǎn)成為可能的藥學(xué)性質(zhì)，以及允許其被轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)識(shí)別和攝取并在攝取完成后被轉(zhuǎn)化為所需母體化合物的化學(xué)性質(zhì)。
發(fā)明詳述
現(xiàn)已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)左旋韋林的若干種疏水性氨基酸酯鹽酸鹽和一系列中性單-、二-和三-酰基衍生物具有必要的物理和化學(xué)性質(zhì)，并且生物利用度改善。
本發(fā)明涉及式I的核苷化合物
其中，R1、R2和R3獨(dú)立地選自氫、C1-10?；?、C1-10烷氧羰基和COR4，其中COR4是氨基酸或二肽，以及所述化合物的水合物、溶劑化物、包合物和酸加成鹽；
治療由丙型肝炎病毒(HCV)介導(dǎo)的疾病的方法，該方法包括給予哺乳動(dòng)物治療有效量的式I化合物；以及涉及包含治療有效量的式I化合物和至少一種可藥用載體的藥用組合物，任選含有賦形劑。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是其中R1、R2和R3如上定義的式I核苷化合物。
在另一實(shí)施方案中，提供了如下定義的式I化合物其中R1、R2和R3中之一是COR4，R4是CH(R5)NH3+Cl-或吡咯烷-2-基，R5是天然存在的疏水性氨基酸的側(cè)鏈或是C1-6直鏈或支鏈烷基，以及R1、R2和R3中的其它基團(tuán)獨(dú)立地選自氫、C1-10?；虲1-10烷氧羰基。
在另一實(shí)施方案中，提供了如下定義的式I化合物其中R1是COR4，R4是CH(R5)NH3+Cl-或吡咯烷-2-基，R5是天然存在的疏水性氨基酸的側(cè)鏈或C1-6直鏈或支鏈烷基，且R2和R3獨(dú)立地選自氫、C1-10?；虲1-10烷氧羰基。
在另一實(shí)施方案中，提供了如下定義的式I化合物其中R1是COR4，R4是CH(R5)NH3+Cl-，R5選自CH(CH3)2和CH(CH3)CH2CH3，且R2和R3均為氫。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供了如下定義的式I化合物的酸加成鹽其中R1、R2和R3中之一是COR4，R4是CH(R5)NH2，R5是纈氨酸的側(cè)鏈，且R1、R2和R3中的其它基團(tuán)獨(dú)立地選自氫。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供了如下定義的式I化合物的酸加成鹽其中R1是COR4，R4是纈氨酸的側(cè)鏈，且R2和R3均為氫。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了如下定義的式I化合物的鹽酸鹽其中R1是COR4，R4是L-纈氨酸的側(cè)鏈，且R2和R3均為氫。
本發(fā)明的化合物的優(yōu)選代表是2S-氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯鹽酸鹽。
在另一實(shí)施方案中，提供了如下定義的式I化合物其中R1是COR4，R4是CH(R5)NH3+Cl-，R5是CH3，且R2和R3均為氫。
在另一實(shí)施方案中，提供了如下定義的式I化合物其中R1、R2和R3是C1-10?；駽1-10烷氧羰基。
該化合物的優(yōu)選代表是丙酸3S，4S-雙-丙酰氧基-5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-四氫呋喃-2S-基甲酯。
在另一實(shí)施方案中，提供了如下定義的式I化合物其中R1是C1-10?；駽1-10烷氧羰基，且R2和R3均為氫。
在另一實(shí)施方案中，提供了如下定義的式I化合物其中R1是氫，且R2和R3獨(dú)立地是C1-10酰基或C1-10烷氧羰基。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了下述化合物異丁酸2S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-5S-羥甲基-4S-異丁酰氧基-四氫呋喃-3S-基酯；或2，2-二甲基丙酸4S-(2，2-二甲基丙酰氧基)-5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-2S-羥甲基-四氫呋喃-3S-基酯.
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是式II的核苷化合物
其中，R1、R2和R3獨(dú)立地選自氫、C1-10?；?、C1-10烷氧羰基和COR4，其中COR4是氨基酸或二肽；R6是C1-10?；灰约八龌衔锏乃衔?、溶劑化物、包合物以及酸加成鹽。
以式I或式II為特征的本發(fā)明的化合物可在療法中使用，尤其在由丙型肝炎病毒介導(dǎo)的疾病的療法中使用。
以式I或式II為特征的本發(fā)明的化合物可以以治療有效量施用于哺乳動(dòng)物，通常劑量為0.1至300mg/kg患者體重/天，優(yōu)選1至100mg/kg患者體重/天，更優(yōu)選1至50mg/kg患者體重/天。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，以式I或式II化合物為特征的本發(fā)明的化合物可與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑或抗病毒劑如干擾素、白介素、腫瘤壞死因子、集落刺激因子、抗炎藥或逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑組合施用。
所述干擾素可以是化學(xué)衍生的干擾素，例如PEG-干擾素-α-2a(PEGASYS)或PEG-干擾素-α-2b(PEG-INTRON)。
蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到連接聚合物和蛋白質(zhì)的新方法學(xué)在不斷發(fā)展，當(dāng)連接聚合物和干擾素的新方法所產(chǎn)生化合物與左旋韋林前藥共同施用來(lái)治療由HCV介導(dǎo)的疾病時(shí)，該化合物落在本發(fā)明范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供如下的藥用組合物該組合物包含治療有效量的式I和式II化合物和至少一種可藥用載體，任選含有賦形劑。定義
如本文所用的短語(yǔ)“一個(gè)(種)”實(shí)體指一個(gè)(種)或多個(gè)(種)該實(shí)體；例如，一種化合物指一種或多種化合物或者至少一種化合物。照此，術(shù)語(yǔ)“一個(gè)(種)”、“一個(gè)(種)或多個(gè)(種)”和“至少一個(gè)(種)”在本文中可互換使用。
短語(yǔ)“如上定義”指在發(fā)明詳述中給出的第一個(gè)定義。
如本文所用的術(shù)語(yǔ)“烷基”指含1至12個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烴基。術(shù)語(yǔ)“低級(jí)烷基”指含1至6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烴基。代表性的低級(jí)烷基包括甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基或戊基。
術(shù)語(yǔ)“?；敝甘絉-C(O)-的有機(jī)基團(tuán)，其在形式上是通過(guò)除去羥基由有機(jī)酸衍生；術(shù)語(yǔ)“C1-12酰基”指其中R為含1-12個(gè)碳原子的烷基或芳基的?；?；如本文所用的術(shù)語(yǔ)“低級(jí)酰基”指其中R為C1-6直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基的?；Ｈ绫疚乃玫男g(shù)語(yǔ)“芳?；敝钙渲蠷是芳基的酰基。
如本文所用的術(shù)語(yǔ)“烷氧基”指其中“烷基”部分如上定義的式R-O-的有機(jī)基團(tuán)，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基、庚氧基，包括它們的異構(gòu)體。如本文所用的“低級(jí)烷氧基”指其中“低級(jí)烷基”如前定義的烷氧基。
如本文所用的術(shù)語(yǔ)“烷氧羰基”指式R-O-C(O)-的有機(jī)基團(tuán)，其中R-O-是如本文所定義的烷氧基。
如本文所用的術(shù)語(yǔ)“天然存在的氨基酸”指天然存在的氨基酸的L-異構(gòu)體。天然存在的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、組氨酸、天門冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、γ-羧基谷氨酸、精氨酸、鳥氨酸和賴氨酸。除非具體說(shuō)明，本申請(qǐng)中所指的所有氨基酸均是L-型。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“疏水性氨基酸”指甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和脯氨酸。
堿性式I化合物可與無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸形成可藥用鹽，其中無(wú)機(jī)酸例如是氫鹵酸(例如鹽酸和氫溴酸)、硫酸、硝酸和磷酸等，有機(jī)酸例如是乙酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸、馬來(lái)酸、蘋果酸、水楊酸、檸檬酸、甲磺酸和對(duì)甲苯磺酸等。
如本文所用的術(shù)語(yǔ)“溶劑化物”指還包括化學(xué)計(jì)量或非化學(xué)計(jì)量的溶劑的本發(fā)明的化合物或其鹽，其中所述溶劑通過(guò)非共價(jià)分子間力結(jié)合。優(yōu)選的溶劑是揮發(fā)性的，無(wú)毒，和/或痕量施用于人時(shí)是可接受的。
如本文所用的術(shù)語(yǔ)“水合物”指還包括化學(xué)計(jì)量或非化學(xué)計(jì)量的水的本發(fā)明的化合物或其鹽，其中水通過(guò)非共價(jià)分子間力結(jié)合。
如本文所用的術(shù)語(yǔ)“包合物”指其中含有空間(如通道)的晶格形式的本發(fā)明的化合物或其鹽，在空間中可捕獲客分子(如溶劑或水)。
如本文所用的術(shù)語(yǔ)“免疫調(diào)節(jié)劑”指有助于或能夠修飾或調(diào)節(jié)免疫功能的治療劑。其能使免疫調(diào)整、調(diào)節(jié)或增強(qiáng)。
如本文所用的術(shù)語(yǔ)“干擾素”指能干擾細(xì)胞的病毒傳染以及抑制正常和轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和調(diào)整免疫系統(tǒng)的蛋白質(zhì)家族。干擾素的四種主要抗原型(α、β、γ和ω)根據(jù)它們生成的細(xì)胞源來(lái)定義。I型干擾素(干擾素(α、β和ω))彼此競(jìng)爭(zhēng)性地與I型干擾素受體細(xì)胞結(jié)合，因此共享該多亞單位細(xì)胞表面受體的至少一部分組分，而II型干擾素(干擾素γ)受體則是不同的實(shí)體。天然存在的干擾素和重組干擾素可在組合療法中與本發(fā)明的化合物一起施用。干擾素的契合序列已經(jīng)在美國(guó)專利US4,897,471(Y.Stabinsky)中有描述。
如本文所用的術(shù)語(yǔ)“化學(xué)衍生的干擾素”指與聚合物共價(jià)連接的干擾素分子，所述聚合物改變干擾素的物理和/或藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。該聚合物非限制性的名單包括聚醚均聚物如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)、聚氧乙烯化多元醇、其共聚物和嵌段共聚物，其前提是可維持嵌段共聚物的水溶解度。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道將聚合物與干擾素連接的眾多途徑(例如參見A.Kozlowski和J.M.Harris J.Control.Release 2001 72(1-3)217-24；C.W.Gilbert和M.Park-Cho，美國(guó)專利US5,951,974)。用于本專利的化學(xué)衍生的IFNα的非限制性名單包括PEG-干擾素-α-2a(PEGASYS)和PEG-干擾素-α-2b(PEGINTRONTM)。
縮寫
本申請(qǐng)中使用下列縮寫，它們具有下述所列出的含義
THF四氫呋喃
DMFN，N-二甲基甲酰胺
CBZ芐氧羰基
PyBOP六氟磷酸(苯并三唑-1-基-氧基)三吡咯烷基鏻
IPA異丙醇
DMAP4-N，N-二甲基氨基吡啶
DIPEAN，N-二異丙基乙胺
TEA三乙胺
DEAD偶氮二甲酸二乙酯
PTLC制備薄層色譜法
TsOH對(duì)甲苯磺酸一水合物
命名法
一般而言，本申請(qǐng)所采用的命名法基于AUTONOMTM(第4.0版)，其為生成IUPAC系統(tǒng)命名法的Beilstein Institute計(jì)算機(jī)化系統(tǒng)。
本發(fā)明的化合物的實(shí)例
給出隨后的實(shí)施例和制備以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更清楚地理解和實(shí)施本發(fā)明。它們不應(yīng)當(dāng)理解為是對(duì)本發(fā)明的范圍的限制，而僅僅是其解釋或示例。表1中的化合物是左旋韋林的單-、二-和三-?；苌锏膶?shí)例。表2中的化合物舉例說(shuō)明N-?；笮f林衍生物。表3中的化合物舉例說(shuō)明其中一個(gè)或多個(gè)羥基被保護(hù)的合成中間體和含有與2’，3’羥基所形成的縮酮或縮醛的酰化化合物。
表1
?；笮f林衍生物
表2
?；疦-?；笮f林衍生物
表3
被保護(hù)的合成中間體
1質(zhì)譜(M+H)+
2(M+Na)+
3熔點(diǎn)(℃)
化合物的制備
式I化合物可通過(guò)有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域已知的多種概括方法和核苷類似物合成的具體方法來(lái)制備。合成原料可容易地自商業(yè)獲得，或者是已知的，或者本身可通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)來(lái)制備。給出隨后的實(shí)施例(見下文)以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更清楚地理解和實(shí)施本發(fā)明。它們不應(yīng)當(dāng)理解為是對(duì)本發(fā)明的范圍的限制，而僅僅是其解釋和示例。制備核苷類似物的綜述見下列出版物
A M Michelson“核苷化學(xué)與核苷”(The Chemistry of Nucleosides andNucleotides)，Academic出版社，紐約1963；
L Goodman“核酸化學(xué)中的基本原則”(Basic Principles in NucleicAcid Chemistry)Ed P O P Ts’O，Academic出版社，紐約1974，第1卷，第2章；
“核酸化學(xué)中的合成方法”(Synthetic Procedures in Nucleic acidChemistry)Ed W W Zorbach和R S Tipson，Wiley，紐約，1973，第1和2卷；
H.Vorbrüggen和C.Ruh-Pohlenz(eds)“核苷合成手冊(cè)”(Handbook ofNucleoside Synthesis)Wiley，紐約，2001。
已經(jīng)努力確保所用數(shù)字(如量、溫度)的準(zhǔn)確性，但是應(yīng)當(dāng)考慮允許有實(shí)驗(yàn)誤差和偏差，包括校準(zhǔn)差異和數(shù)字的四舍五入等。
配制和施用
式I化合物的制劑可采用制劑領(lǐng)域已知的方法制備。給出隨后的實(shí)施例(見下文)以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更清楚地理解和實(shí)施本發(fā)明。它們不應(yīng)當(dāng)理解為是對(duì)本發(fā)明的范圍的限制，而僅僅是其解釋和示例。
雖然本發(fā)明的核苷衍生物對(duì)于穿過(guò)胃腸粘膜遞送是最佳的，但是當(dāng)通過(guò)其它給藥途徑施用時(shí)這些化合物也是有效的，所述其它給藥途徑包括持續(xù)(靜脈滴注)、局部、胃腸道外、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、透皮(其可含有滲透促進(jìn)劑)、口腔、經(jīng)鼻和栓劑施用的途徑?？诜┯每梢允瞧瑒?、包衣片劑、糖衣丸、硬和軟明膠膠囊、溶液劑、乳劑、糖漿劑或懸浮劑的形式。
對(duì)于藥用制劑的制備，核苷衍生物及其可藥用鹽可采用無(wú)治療活性的無(wú)機(jī)或有機(jī)賦形劑配制成片劑、包衣片劑、糖衣丸、硬和軟明膠膠囊、溶液劑、乳劑或懸浮劑。式I化合物可與可藥用載體混和配制。例如，本發(fā)明的化合物可以以藥理學(xué)可接受的鹽的形式經(jīng)口服施用。因?yàn)楸景l(fā)明的化合物大多數(shù)是水溶性的，因此它們可以在生理鹽水溶液(如緩沖至pH為約7.2-7.5)中經(jīng)靜脈內(nèi)施用。常規(guī)的緩沖劑如磷酸鹽、碳酸氫鹽或檸檬酸鹽可用于該組合物。適于片劑、包衣片劑、糖衣丸和硬明膠膠囊的賦形劑例如是乳糖、玉米淀粉及其衍生物、滑石粉以及硬脂酸或其鹽。如果需要的話，片劑或膠囊可采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包腸溶衣或制成緩釋。適于軟明膠膠囊的賦形劑例如是植物油、蠟、脂肪、半固態(tài)和液態(tài)多元醇。適于注射溶液的賦形劑例如是水、鹽水、醇、多元醇、甘油或植物油。適于栓劑的賦形劑例如是天然和硬化油、蠟、脂肪、半液態(tài)或液態(tài)多元醇。適于腸內(nèi)使用的溶液和糖漿劑的賦形劑例如是水、多元醇、蔗糖、轉(zhuǎn)化糖和葡萄糖。藥用制劑還可含有防腐劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、矯味劑、用于調(diào)整滲透壓的鹽、緩沖劑、掩蔽劑或抗氧化劑。藥用制劑還可含有本領(lǐng)域已知的其它治療活性藥物。適宜的藥用載體、賦形劑以及它們的配制在Remington的“藥學(xué)科學(xué)與實(shí)踐”(The Science and Practice ofPharmacy，1995，E.W.Martin編輯，Mack出版公司，第19版，伊斯頓，賓夕凡尼亞州)一書中有描述。在實(shí)施例13-15中描述了含有本發(fā)明的化合物的代表性藥用制劑。
制劑領(lǐng)域的普通技術(shù)人員還可利用前藥形式的有利的物理和藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，其中前藥形式將本發(fā)明的化合物遞送至宿主生物體或患者的靶向位點(diǎn)，以使化合物的預(yù)期效力最大。熟練的制劑科學(xué)家可在說(shuō)明書的教導(dǎo)范圍內(nèi)改變制劑，以提供眾多用于特定給藥途徑的制劑，而不會(huì)使本發(fā)明的組合物不穩(wěn)定或減弱它們的治療活性。
具體而言，通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)中所熟知的較小改變(形成鹽、酯化等)，可容易地對(duì)該化合物進(jìn)行修飾，以使它們?cè)谒蚱渌苊街械娜芙舛雀?。在本領(lǐng)域的普通技術(shù)中同樣熟知的是改變具體化合物的給藥途徑和劑量方案，以控制該化合物的藥代動(dòng)力學(xué)，從而在患者中達(dá)到最大有益作用。
劑量可以在較寬范圍內(nèi)變化，并且在每一具體病例中當(dāng)然可根據(jù)個(gè)體需求進(jìn)行調(diào)節(jié)。對(duì)于口服施用，約0.01至約100mg/kg體重/天的日劑量在單獨(dú)療法和/或組合療法中應(yīng)當(dāng)是適宜的。優(yōu)選的日劑量為約0.1至約300mg/kg體重，更優(yōu)選為1至約100mg/kg體重，最優(yōu)選為1.0至約50mg/kg體重/天。典型的制劑可含有約5％至約95％的活性化合物(w/w)。日劑量可作為單劑量或者以分開的劑量、通常是每天1至5個(gè)劑量的形式施用。
藥用制劑優(yōu)選是單位劑量形式。在該形式中，制劑被細(xì)分為含適宜量活性組分的單位劑量。單位劑量形式可以是包裝制劑，在該包裝中含有分開的大量制劑，如小包的片劑、膠囊以及裝入小瓶或安瓿中的粉末。同樣，單位劑量形式本身可以是膠囊、片劑、扁囊劑或錠劑，或者也可以是包裝形式的適宜數(shù)量的任何這些劑型。
核苷衍生物或其藥物可用于單獨(dú)療法或組合療法中，即治療可與一種或多種其它治療活性物質(zhì)組合，所述活性物質(zhì)例如是免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑如干擾素、白介素、腫瘤壞死因子或集落刺激因子、抗炎藥和/或抗病毒劑。當(dāng)治療為組合療法時(shí)，所述活性物質(zhì)可與核苷衍生物共同或依次施用。如此，如本文所用的共同施用包括在同一時(shí)間或不同時(shí)間施用藥物。
本文所指的治療包括預(yù)防丙型肝炎介導(dǎo)的疾病和治療已患有的病癥，本文所指的治療動(dòng)物包括治療人及其它哺乳動(dòng)物。此外，如本文所用的治療丙型肝炎病毒(HCV)感染還包括治療或預(yù)防與丙型肝炎病毒(HCV)感染相關(guān)或由其介導(dǎo)的疾病或病癥，或者它們的臨床癥狀。
實(shí)施例1
1-(6S-羥甲基-2，2-二甲基-四氫-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]間二氧雜環(huán)戊烯-4S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(3，R’＝R”＝CH3)。
將左旋韋林(1，1.0g，4.1mmol，Roche Carolina)懸浮在32mL無(wú)水丙酮∶2，2-二甲氧基丙烷的2∶1混和物中。將溶液在N2和冰浴下攪拌，滴加7滴濃高氯酸。將反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?小時(shí)以上。加入1M氫氧化鈉溶液中和混合物，蒸發(fā)得殘余物。殘余物經(jīng)色譜法(硅膠；5％-10％甲醇/二氯甲烷)純化，得到0.72g(62％)1-(6S-羥甲基-2，2-二甲基-四氫-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]間二氧雜環(huán)戊烯-4S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(化合物41(3，R’＝R”＝CH3)；(M+H)+＝285；mp＝95.1-98℃)。
實(shí)施例2
1-(6S-羥甲基-2-苯基-四氫-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]間二氧雜環(huán)戊烯-4S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(3；R’＝H，R”＝Ph)。
將左旋韋林(6.00g，24.5mmol，Roche Carolina)懸浮在60mL苯甲醛中。將氯化鋅(5.70g，41.8mmol，Aldrich Chemical)加入攪拌的混合物中。4小時(shí)后，將反應(yīng)混合物滴加至1升快速攪拌的乙醚中。將所形成的沉淀過(guò)濾，用乙醚沖洗，然后溶解在350mL乙酸乙酯和650mL冷的2M氫氧化鈉溶液中。分層，水層用乙酸乙酯另外萃取兩次。所合并的乙酸乙酯層用鹽水洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，并蒸發(fā)至固體。將固體用乙醚研磨，經(jīng)硅膠色譜法(2％-7％甲醇/二氯甲烷)純化，得到4.4g(54％)1-(6S-羥甲基-2-苯基-四氫-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]間二氧雜環(huán)戊烯-4S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(化合物42(3，R’＝Ph，R”＝H)；(M+H)+＝333；mp＝150-153℃)。
實(shí)施例3
1-(3R-羥基-5，5，7，7-四異丙基-四氫-1，4，6，8-四氧雜-5，7-二硅雜-3αS，9αS-環(huán)戊二烯并環(huán)辛烯-2S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺。
于0℃向左旋韋林(3.75g，15.4mmol)在30mL DMF中的攪拌漿狀物中加入30mL吡啶、TEA(5.35mL，38.4mmol)和1，3-二氯-1，1，3，3-四異丙基-二硅氧烷(6.15mL，19.2mmol)。使反應(yīng)物反應(yīng)以溫?zé)嶂潦覝?，并攪?4小時(shí)。所得溶液在1N HCl和乙酸乙酯之間分配。有機(jī)層用鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，并真空濃縮。殘余物經(jīng)色譜法(25％丙酮/氯仿)純化，得到3.96g(53％)1-(3R-羥基-5，5，7，7-四異丙基-四氫-1，4，6，8-四氧雜-5，7-二硅雜-3αS，9αS-環(huán)戊二烯并環(huán)辛烯-2S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(化合物43)。
實(shí)施例4
1-(3S，4R-二羥基-5S-三異丙基硅烷氧基甲基-四氫呋喃-2S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺
在室溫下，向左旋韋林(1，9.22g，37.8mmol)在75mL DMF中的攪拌漿狀物中加入咪唑(2.80g，41.1mmol)和三異丙基甲硅烷基氯(8.1mL，38mmol)。將懸浮液加熱至50℃溶解固體，并維持該溫度6小時(shí)。將溶液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，在400mL乙酸乙酯和500mL水之間分配。有機(jī)層(漿狀)用200mL水洗滌三次，濾除沉淀。有機(jī)層濾液經(jīng)MgSO4干燥并真空濃縮。濾渣在150mL甲醇中重結(jié)晶；母液與有機(jī)濃縮液合并并進(jìn)一步重結(jié)晶。收集四批結(jié)晶，得到10.47g(69％)1-(3S，4R-二羥基-5S-三異丙基硅烷氧基甲基-四氫呋喃-2S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺，為白色結(jié)晶固體(化合物44；(M+Na)+＝423；mp＝174.6-175.7℃)。
方法A——三取代類似物的制備
實(shí)施例5
異丁酸3S，4S-雙-異丁酰氧基-5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)四氫呋喃-2S-基甲酯(2；R1＝CH(CH3)2)
在氮?dú)庀?，向左旋韋林(0.46g，1.88mmol)在8mL THF中的攪拌漿狀物中加入TEA(1.31mL，9.40mmol)和異丁酸酐(1.41mL，8.48mmol)。反應(yīng)容器裝有指形冷凝管(cold finger attachment)，于65℃加熱24小時(shí)。反應(yīng)物在乙酸乙酯和飽和NaHCO3水溶液之間分配。有機(jī)層用鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，濃縮。殘余物經(jīng)硅膠色譜法(3％甲醇/二氯甲烷)純化，得到0.278g(33％)異丁酸3S，4S-雙-異丁酰氧基-5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)四氫呋喃-2S-基甲酯，為粘性固體。MS(化合物26(2，R＝CH(CH3)2；(M+Na)+＝477)。
采用適宜酸酐，按照類似方式，制備下述化合物2，2-二甲基丙酸3S，4S-雙-(2，2-二甲基丙酰氧基)-5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-四氫呋喃-2S-基甲酯(化合物27；18％)；苯甲酸3S，4S-雙-苯甲酰氧基-5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-四氫呋喃-2S-基甲酯(化合物25；66％)；乙酸3S，4S-雙-乙酰氧基-5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-四氫呋喃-2S-基甲酯(化合物1；65％；(M+H)+＝371)；澄清油狀的丙酸3S，4S-雙-丙酰氧基-5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-四氫呋喃-2S-基甲酯(化合物2；52％；(M+H)+＝413)；澄清油狀的丁酸3S，4S-雙-丁酰氧基-5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-四氫呋喃-2S-基甲酯(化合物20；20％；(M+H)+＝455)。
實(shí)施例6
碳酸2S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-4S-乙氧羰基氧基-5S-乙氧羰基氧基甲基-四氫呋喃-3S-基酯乙酯
將左旋韋林(1，0.5g，2.04mmol，Roche Carolina)懸浮在3mL DMF和1.5mL吡啶中。冰浴下攪拌混合物，將氯甲酸乙酯(0.78mL，8.19mmol)分三批歷經(jīng)15分鐘緩慢加入。反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?小時(shí)以上。加入甲醇并將反應(yīng)物攪拌10分鐘。蒸發(fā)后，將殘余物加入乙酸乙酯和飽和氯化銨溶液中。分層，水層用乙酸乙酯萃取一次。所合并的乙酸乙酯層用鹽水洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，并濃縮。將泡沫狀殘余物的甲醇/水溶液經(jīng)色譜法(3-4％甲醇/二氯甲烷)和冷凍干燥而純化，得到固態(tài)的碳酸2S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-4S-乙氧羰基氧基-5S-乙氧羰基氧基甲基-四氫呋喃-3S-基酯乙酯(化合物24，74％，(M+H)+＝461)。
采用適宜的氯甲酸烷基酯，按照類似方式，制備下述化合物碳酸2S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-4S-丙氧羰基氧基-5S-丙氧羰基氧基甲基-四氫呋喃-3S-基酯丙酯(化合物32，47，(M+H)+＝503)。
方法B——5’-單?；苌锏闹苽?
實(shí)施例7
2S-氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯；該化合物含有甲苯-4-磺酸(4R1＝CH(NH2)CH(CH3)2)。
將1-(6S-羥甲基-2-苯基-四氫-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]間二氧雜環(huán)戊烯-4S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(0.49g，1.47mmol)溶于5mL無(wú)水DMF中。依次加入N-CBZ-L-纈氨酸(0.44g，1.77mmol，Aldrich Chemical)、PyBOP(0.84g，1.62mmol，Nova Biochem)和DIPEA(0.51mL，2.94mmol)。攪拌18小時(shí)后，加入乙酸乙酯和飽和氯化銨溶液。分層，水層用乙酸乙酯萃取一次。所合并的乙酸乙酯層用水、飽和碳酸氫鈉溶液和鹽水洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥。蒸發(fā)溶劑，殘余物經(jīng)色譜法(硅膠；梯度為2％-5％甲醇/二氯甲烷)純化，得到520mg(62％)泡沫狀的2S-芐氧羰基氨基-3-甲基-丁酸6S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)2-苯基-四氫-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]間二氧雜環(huán)戊烯-4S-基甲酯(M+H)+＝566。
將2S-芐氧羰基氨基-3-甲基-丁酸6S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-2-苯基-四氫-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]間二氧雜環(huán)戊烯-4S-基甲酯(0.49g，0.87mmol)溶于5mL甲醇中，該甲醇中含有0.36g 20％在碳上的氫氧化鈀(50wt％水)。加入TsOH(0.165g，0.87mmol)，將反應(yīng)容器與充有氫氣的氣囊連接。容器通入H2氣體并于35℃攪拌4.5小時(shí)。然后將混合物經(jīng)CELITE床過(guò)濾，并用更多甲醇沖洗。溶劑蒸發(fā)后，將殘余物溶于水中并冷凍干燥，得到0.44g(98％)2S-氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯，該化合物含有甲苯-4-磺酸(化合物4；(M+H)+＝344；m.p.＝110-114.5℃)；
采用適宜的羧酸，按照上述兩步序列，獲得下述化合物2S-氨基-丙酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯，該化合物含有甲苯-4-磺酸(化合物7；98％；(M+H)+＝316；m.p.＝108-120℃)；2S-氨基-3-苯基-丙酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯，該化合物含有甲苯-4-磺酸(化合物8；91％；(M+H)+＝392；m.p.＝114-136℃)；2S-氨基-4-甲基-戊酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯，該化合物含有甲苯-4-磺酸(化合物9；95％；(M+H)+＝358；m.p.＝112-123℃)；2S-氨基-3S-甲基-戊酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯，該化合物含有甲苯-4-磺酸(化合物10；91％；(M+H)+＝358；m.p.＝101.8-110.8℃)；2-甲基-丙酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯(化合物12；94％；(M+H)+＝315；m.p.＝169-171.2℃)；2-氨基-乙酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯，該化合物含有甲苯-4-磺酸(化合物13；91％；(M+H)+＝302；m.p.＝89.3-96.4℃)；2-甲基-氨基-乙酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯，該化合物含有甲苯-4-磺酸(化合物14；83％；(M+H)+＝316；m.p.＝69.4-86.3℃)。
實(shí)施例8
2S-氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯，鹽酸鹽(4R1＝CH(NH2)CH(CH3)2)。
將左旋韋林(1，350mg，1.43mmol)在9.5mL THF中的懸浮液用L-Val-CBZ(360mg，1.43mmol)和三苯膦(600mg，2.29mmol)處理。反應(yīng)物于室溫?cái)嚢瑁⒌渭覦EAD(0.28mL，1.8mmol)。反應(yīng)物于室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，并將所得懸浮液濃縮，進(jìn)行色譜法(PTLC，7％MeOH/CH2CL2)，得到白色固態(tài)的2S-芐氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯(16％)。MSMH+＝478(其它核苷的Mitsunobu偶聯(lián)參見Wei，Y.；Pei，D.Bioorg.Med.Chem.Lett.2000，10(10)，1073)。
向2S-芐氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯(170mg，0.35mmol)與50mg 10％Pd/碳的混合物中加入甲醇(10mL)和1M HCl(0.7mL)。在氫氣氛(約1atm，氣囊)下將所得懸浮液攪拌30分鐘，并將反應(yīng)物經(jīng)CELITE墊過(guò)濾。濃縮濾液，用水稀釋并冷凍干燥，得到2S-氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯鹽酸鹽，為灰黃色吸濕性固體(化合物5，75％，(M+H)+＝344)。從稀HCl/IPA中重結(jié)晶，得到白色結(jié)晶固體；mp154-156℃)。
采用適宜的羧酸，按照上述兩步序列，獲得下述化合物2R-氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯，該化合物含有甲苯-4-磺酸(化合物6；90％；(M+H)+＝344)。
實(shí)施例9
2，2-二甲基-丙酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯(4R1＝C(CH3)3)。
向1-(6S-羥甲基-2-苯基-四氫-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]間二氧雜環(huán)戊烯-4S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(0.24g，0.72mmol)在3mL 1∶1 DMF/吡啶的溶液中加入2，2-二甲基丙酸酐(0.36mL，1.8mmol)和DMAP(0.04g，0.36mmol)。所得溶液于室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，在50mL乙酸乙酯和飽和NH4Cl溶液之間分配。水層用第二份乙酸乙酯萃取，所合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，并濃縮。殘余物進(jìn)行色譜法(PTLC，5％MeOH/CH2CL2)，獲得澄清油狀的2，2-二甲基-丙酸6S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-2-苯基-四氫-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]-間二氧雜環(huán)戊烯-4S-基甲酯(95％)。
向2，2-二甲基-丙酸6S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-2-苯基-四氫-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]-間二氧雜環(huán)戊烯-4S-基甲酯(0.37g，0.88mmol)與50％濕的10％Pd(OH)2/C(300mg)的混合物中加入甲醇(6mL)。將所得懸浮液于40℃和氫氣氛(約1atm，氣囊)下攪拌6小時(shí)，反應(yīng)物經(jīng)CELITE墊過(guò)濾。濃縮濾液，將所得油溶于1.5mL MeOH和10mLCH2Cl2中，然后加入3mL己烷至溶液剛開始變渾濁。過(guò)濾所沉淀的白色固體，得到2，2-二甲基-丙酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯(化合物11；70％；(M+H)+＝329；m.p139-141.6℃)。
采用適宜的羧酸酐，按照上述兩步序列，獲得下述化合物庚酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯(化合物31；70％)；丙酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯(化合物36；70％)。
實(shí)施例10
辛酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯(4R1＝C7H15)。
將1-(6S-羥甲基-2-苯基-四氫-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]-間二氧雜環(huán)戊烯-4S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(0.25g，0.75mmol)溶于1mL DMF和0.5mL吡啶中。在冰浴下攪拌反應(yīng)溶液并滴加辛酰氯(0.16mL，0.94mmol)。然后將反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?4小時(shí)。濃縮后，將殘余物在乙酸乙酯和飽和氯化銨溶液之間分配。分層，水層用乙酸乙酯萃取一次。所合并的乙酸乙酯層用鹽水洗滌，并經(jīng)硫酸鈉干燥。蒸發(fā)溶劑后，殘余物在硅膠上經(jīng)色譜法純化，以5％甲醇/二氯甲烷為洗脫劑，獲得0.2g(58％)辛酸6S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-2-苯基-四氫-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]-間二氧雜環(huán)戊烯-4S-基甲酯；(M+H)+＝459。如上所述，在化合物4的制備(見上文)中不加入TsOH，使苯亞甲基氫解，獲得102mg(64％)辛酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯，為結(jié)晶固體(乙酸乙酯-甲醇)(化合物34；(M+H)+＝371；m.p.＝154.4-155.8℃)。
采用適宜?；?，按照上述方法，制備下述化合物壬酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯(化合物35；82％；(M+H)+＝385；m.p.＝155-157.1℃)。
實(shí)施例11
碳酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯異丙酯(4R1＝O-i-C3H7)。
將1-(6S-羥甲基-2-苯基-四氫-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]-間二氧雜環(huán)戊烯-4S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(0.3g，0.90mmol)溶于2.4mL無(wú)水DMF∶吡啶的1∶1混合物中。反應(yīng)物置于冰/鹽浴上并攪拌，同時(shí)歷經(jīng)20分鐘緩慢加入氯甲酸異丙酯(Aldrich，1M甲苯溶液)。移去冰/鹽浴并將反應(yīng)物攪拌5小時(shí)，之后加入1mL甲醇并將反應(yīng)物攪拌5分鐘以上。蒸發(fā)反應(yīng)物，殘余物加入乙酸乙酯和飽和氯化銨溶液中。分層，水層用乙酸乙酯萃取。所合并的乙酸乙酯層用鹽水洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，并蒸發(fā)得殘余物。殘余物在硅膠上經(jīng)色譜法純化，以5％甲醇/二氯甲烷洗脫，獲得150mg(40％)碳酸6S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-2-苯基-四氫-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]-間二氧雜環(huán)戊烯-4S-基甲酯異丙酯(M+H)+＝419。如化合物4中所述，在沒(méi)有TsOH的存在下，使碳酸6S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-2-苯基-四氫-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]間二氧雜環(huán)戊烯-4S-基甲酯異丙酯去保護(hù)，獲得碳酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯異丙酯(化合物16；92％；(M+H)+＝329；m.p.＝46-59℃)。
實(shí)施例12
1-(2S-氨基-3-甲基-丁?；?-吡略烷-2S-甲酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯，鹽酸鹽(4R1＝Pro-Val-H)。
將1-(6S-羥甲基-2-苯基-四氫-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]-間二氧雜環(huán)戊烯-4S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(0.35g，1.05mmol)溶于3.5mL無(wú)水DMF中。依次加入CBZ-NH-Val-Pro-OH(0.45g，1.32mmol，Bachem)、PyBOP(0.68g，1.32mmol，Nova Biochem)和DIPEA(0.27mL，1.58mmol)。于35℃攪拌18小時(shí)后，加入乙酸乙酯和飽和氯化銨溶液。分層，水層用乙酸乙酯萃取一次。所合并的乙酸乙酯層用水、飽和碳酸氫鈉溶液和鹽水洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥。蒸發(fā)溶劑，殘余物用2％甲醇/二氯甲烷經(jīng)硅膠色譜法純化。濃縮純化的級(jí)分，得到370mg(53％)玻璃狀的1-(2S-芐氧羰基氨基-3-甲基-丁?；?-吡咯烷-2S-甲酸6S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-2-苯基-四氫-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]-間二氧雜環(huán)戊烯-4S-基甲酯(M+H)+＝663。
如化合物4(見上文)中所述，用HCl/乙醚(Aldrich，1M溶液)替換對(duì)甲苯磺酸，使苯亞甲基保護(hù)基團(tuán)氫解，得到1-(2S-氨基-3-甲基-丁?；?-吡咯烷-2S-甲酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯鹽酸鹽(化合物18；79％；(M+H)+＝441；m.p.＝146-149℃)。
按照類似方法制備下述化合物的兩種異構(gòu)體2-(吡咯烷-2S-甲酰氨基)-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯，該化合物含有甲苯-4-磺酸(化合物23，異構(gòu)體1；88％；(M+H)+＝441；m.p.＝76-92℃；化合物33，異構(gòu)體2；92％；(M+H)+＝441；m.p.＝120-136℃)。
方法C——二?；苌锏闹苽?
實(shí)施例13
丁酸4S-丁酰氧基-5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-2S-羥甲基-四氫呋喃-3S-基酯(7R1＝C3H7)。
向1-(3S，4R-二羥基-5S-三異丙基硅烷氧基甲基-四氫呋喃-2S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(0.40g，1.00mmol)在3.3mL THF中的攪拌漿狀物中加入TEA(0.48mL，3.46mmol)和正丁酸酐(0.49mL，2.97mmol)。反應(yīng)容器裝有指形冷凝管，在氮?dú)庀掠?5℃加熱17小時(shí)。反應(yīng)物在乙酸乙酯和飽和碳酸氫鈉水溶液之間分配。有機(jī)層用鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，并濃縮。殘余物經(jīng)硅膠色譜法(20％丙酮/氯仿)純化，得到47g(88％)澄清油狀的丁酸4S-丁酰氧基-5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-2S-三異丙基硅烷氧基甲基-四氫呋喃-3S-基酯。
在室溫下，向丁酸4S-丁酰氧基-5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-2S-三異丙基硅烷氧基甲基-四氫呋喃-3S-基酯(0.47g，0.88mmol)在5mL乙腈中的攪拌溶液中加入2.5mL的1N H2SO4。16小時(shí)后，加入30mL飽和NaHCO3水溶液，產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取。有機(jī)層用鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，并濃縮。將所得殘余物溶于甲醇中，用乙醚沉淀出產(chǎn)物，得到18g(53％)丁酸4S-丁酰氧基-5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-2S-羥甲基-四氫呋喃-3S-基酯，為白色結(jié)晶固體。(化合物30；(M+Na)+＝407；m.p.＝135.3-135.9℃)。
按照上述方法，但使用適宜酸酐，獲得下述化合物異丁酸2S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-5S-羥甲基-4S-異丁酰氧基-四氫呋喃-3S-基酯(化合物17；38％；(M+Na)+＝407；m.p.＝179.0-179.6℃)；丙酸4S-丙酰氧基-5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-2S-羥甲基-四氫呋喃-3S-基酯(化合物19；27％；(M+H)+＝357；m.p.＝154.2-155.6℃)；2，2-二甲基丙酸4S-(2，2-二甲基丙酰氧基)-5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-2S-羥甲基-四氫呋喃-3S-基酯(化合物15；57％)；苯甲酸4S-苯甲酰氧基-5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-2S-羥甲基-四氫呋喃-3S-基酯(化合物28；67％)。
實(shí)施例14
2S-氨基-3-甲基-丁酸4S-(2S-氨基-3-甲基-丁酰氧基)-5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-2S-羥甲基-四氫呋喃-3S-基酯二鹽酸鹽(7R1＝CH(NH2)-i-C3H7)。
在室溫下，向1-(3S，4R-二羥基-5S-三異丙基硅烷氧基甲基-四氫呋喃-2S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(0.47g，1.16mmol)在6mL THF中的攪拌漿狀物中加入4S-異丙基-2，5-二氧代噁唑烷-3-甲酸芐酯(0.77g，2.79mmol)和8滴TEA。使反應(yīng)物攪拌16小時(shí)，加入100mL飽和NaHCO3水溶液使之淬滅，并用三份100mL乙酸乙酯萃取。合并有機(jī)層，用鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，并濃縮。所得薄層經(jīng)硅膠色譜法(15％丙酮/氯仿)純化，得到0.53g(53％)澄清油狀的2S-芐氧羰基氨基-3-甲基-丁酸4S-(2S-芐氧羰基氨基-3-甲基-丁酰氧基)-5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-2S-三異丙基硅烷氧基甲基-四氫呋喃-3S-基酯。
向通入氬氣的2-芐氧羰基氨基-3-甲基-丁酸4-(2-芐氧羰基氨基-3-甲基-丁酰氧基)-5-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-2-羥甲基-四氫呋喃-3-基酯(0.32g，0.46mmol)在10mL乙醇中的攪拌溶液中加入鹽酸(.6mL，1.81mmol)和0.20g 10％Pd/C。將反應(yīng)容器抽成真空并充入氫氣(～1atm)三次，攪拌6小時(shí)。懸浮液經(jīng)CELITE過(guò)濾，濾液濃縮。將殘余物溶于甲醇/二氯甲烷(1∶10)溶液中，用己烷沉淀出產(chǎn)物，得到0.09g(38％)2S-氨基-3-甲基-丁酸4S-(2S-氨基-3-甲基-丁酰氧基)-5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-2S-羥甲基-四氫呋喃-3S-基酯二鹽酸鹽，為白色結(jié)晶固體(化合物3；(M+Cl)-＝477；m.p.＝202.0-205.0℃)。
實(shí)施例15
2，2-二甲基-丙酸2S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-5S-(2，2-二甲基-丙酰氧基甲基)-4S-羥基-四氫呋喃-3S-基酯(9R1＝C(CH3)3)。
向1-(3R-羥基-5，5，7，7-四異丙基-四氫-1，4，6，8-四氧雜-5，7-二硅雜-3αS，9αS-環(huán)戊二烯并環(huán)辛烯-2S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(0.92g，1.88mmol)在7mL 1∶1 DMF/吡啶中的攪拌漿狀物中加入DMAP(0.12g，0.94mmol)和2，2-二甲基丙酸酐(0.95mL，4.69mmol)，反應(yīng)物攪拌24小時(shí)。將反應(yīng)混合物在乙酸乙酯和飽和氯化銨水溶液之間分配。有機(jī)層用鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，并濃縮，得到澄清油狀的2，2-甲基-丙酸2S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-5，5，7，7-四異丙基-四氫-3αS，9αS-1，4，6，8-四氧雜-5，7-二硅雜-環(huán)戊二烯并環(huán)辛烯-3S-基酯(99％)。
在室溫下，向2，2-甲基-丙酸2S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-5，5，7，7-四異丙基-四氫-3αS，9αS-1，4，6，8-四氧雜-5，7-二硅雜-環(huán)戊二烯并環(huán)辛烯-3S-基酯(0.48g，0.92mmol)在5mL乙腈中的攪拌溶液中加入2.5mL 1N H2SO4。2小時(shí)后，加入30mL飽和NaHCO3水溶液，產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取。有機(jī)層用鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，并濃縮，得到2，2-二甲基-丙酸2S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-4S-(3-羥基-1，1，3，3-四異丙基二硅氧烷基氧基)-5S-羥甲基-四氫呋喃-3S-基酯(71％)。
向2，2-二甲基-丙酸2S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-4S-(3-羥基-1，1，3，3-四異丙基二硅氧烷基氧基)-5S-羥甲基-四氫呋喃-3S-基酯(0.38g，0.65mmol)在2.6mL 1∶1 DMF/吡啶中的攪拌漿狀物中加入DMAP(0.40g，33mmol)和2，2-二甲基丙酸酐(0.33mL，1.63mmol)，反應(yīng)物攪拌24小時(shí)。將反應(yīng)物在乙酸乙酯和飽和氯化銨水溶液之間分配。有機(jī)層用鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，并濃縮，所得殘余物經(jīng)色譜法(15％丙酮/氯仿)純化，得到2，2-二甲基-丙酸2S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-4S-(3-羥基-1，1，3，3-四異丙基-1，3-二硅氧烷基氧基)-5S-(2，2-二甲基-丙酰氧基甲基)-四氫呋喃-3S-基酯(54％)。
在室溫下，向2，2-二甲基-丙酸2S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-4S-(3-羥基-1，1，3，3-四異丙基-1，3-二硅氧烷基氧基)-5S-(2，2-二甲基-丙酰氧基甲基)-四氫呋喃-3S-基酯(0.24g，0.35mmol)在5mL乙腈中的攪拌溶液中加入2.5mL 1N H2SO4。72小時(shí)后，加入30mL飽和NaHCO3水溶液，產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取。有機(jī)層用鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，并濃縮，殘余物經(jīng)制備HPLC純化，得到2，2-二甲基-丙酸2S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-5S-(2，2-二甲基-丙酰氧基甲基)-4S-羥基-四氫呋喃-3S-基酯(化合物29，15％，(M+H)+＝413)。
方法D——混和?；苌?br> 實(shí)施例16
2S-氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3S，4S-雙-異丁酰氧基-四氫呋喃-2S-基甲酯；該化合物含有甲苯-4-磺酸(8R1＝i-Pr，R2＝CH(NH2)CH(CH3)CH3)。
在室溫下，向異丁酸2S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-5S-羥甲基-4S-異丁酰氧基-四氫呋喃-3S-基酯(見上文實(shí)施例13，化合物17，0.50g，1.29mmol)在6mL THF中的攪拌漿狀物中加入4S-異丙基-2，5-二氧代-噁唑烷-3-甲酸芐酯(0.43g，1.55mmol)和0.3mL TEA。使反應(yīng)物攪拌12小時(shí)，用100mL飽和NaHCO3水溶液使之淬滅，并用三份100mL乙酸乙酯萃取。所合并的萃取液用鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，并濃縮。殘余物經(jīng)色譜法(硅膠；35％乙酸乙酯/己烷)純化，獲得0.52g(65％)2S-芐氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3S，4S-雙-異丁酰氧基-四氫呋喃-2S-基甲酯；(M+H)+＝484。
向通入氬氣的2S-芐氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3S，4S-雙-異丁酰氧基-四氫呋喃-2S-基甲酯(0.52g，0.84mmol)在10mL甲醇中的攪拌溶液中加入對(duì)甲苯磺酸(0.16g，0.84mmol)和0.15g 10％Pd/C。將反應(yīng)容器抽成真空并通入氫氣(約1atm)三次，攪拌3小時(shí)。然后漿狀物經(jīng)CELITE過(guò)濾，所得濾液濃縮，溶于甲醇/二氯甲烷(1∶10)溶液中，并用己烷沉淀，得到0.18g(33％)含甲苯-4-磺酸的2S-氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3S，4S-雙-異丁酰氧基-四氫呋喃-2S-基甲酯化合物，為黃色固體(化合物22；(M+Na)+＝506；m.p.＝72.0-76.0℃)。
按照上述方法，采用丙酸4S-丙酰氧基-5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-2S-羥甲基-四氫呋喃-3S-基酯，得到2S-芐氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3S，4S-雙丙酰氧基-四氫呋喃-2S-基甲酯(77％；(M+H)+＝456)，使其去保護(hù)，得到2S-氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3S，4S-雙-丙酰氧基-四氫呋喃-2S-基甲酯，該化合物含有甲苯-4-磺酸(化合物21；46％)。
方法E——N-酰基類似物的制備
實(shí)施例17
丁酸5S-(3-丁?；被柞；?[1，2，4]三唑-1-基)-4S-丁酰氧基-2S-丁酰氧基甲基-四氫呋喃-3S-基酯
向左旋韋林(1，0.48g，2.0mmol)在7mL THF中的攪拌漿狀物中加入TEA(1.65mL，11.8mmol)、正丁酸酐(1.97mL，10.8mmol)和DMAP(0.24g，2.0mmol)。反應(yīng)容器于60℃加熱24小時(shí)。將溶液在乙酸乙酯和飽和NaCO3水溶液之間分配，有機(jī)層用鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，并濃縮。殘余物經(jīng)色譜法(35％乙酸乙酯/己烷)純化，得到丁酸5S-(3-丁?；被柞；?[1，2，4]三唑-1-基)-4S-丁酰氧基-2S-丁酰氧基甲基-四氫呋喃-3S-基酯(化合物39；71％，(M+Na)+＝547)。
按照上述方法還可制備丙酸5S-(3-丙?；被柞；?[1，2，4]三唑-1-基)-4S-丙酰氧基-2S-丙酰氧基甲基-四氫呋喃-3S-基酯(化合物37；95％，(M+H)+＝469)。
按照上述方法，采用適宜被保護(hù)的中間體，制備下述化合物丁酸5S-(3-丁?；被柞；?[1，2，4]三唑-1-基)-4S-丁酰氧基-2S-羥甲基-四氫呋喃-3S-基酯(化合物38；35％，(M+Na)+＝477)和1-(3S，4R-二羥基-5S-羥甲基-四氫呋喃-2S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酸丁?；０?化合物40，58％，(M+H)+＝315)。
實(shí)施例18
Caco分析法
有關(guān)Caco分析法的概述參見S.Yee的“體外穿過(guò)Caco-2細(xì)胞(結(jié)腸)的滲透性可預(yù)測(cè)在人體內(nèi)(小腸)的吸收——是事實(shí)還是神話”(Pharm.Res.14(6)763-766(1997))和Yamashita等人的“藥物穿過(guò)Caco-2單層滲透的分析與預(yù)測(cè)藥物體內(nèi)吸收的聯(lián)系”(Pharm.Res.14(4)486-491(1997))。對(duì)于具體的技術(shù)方面可參見Grass，G.M.和Sweetana，S.A.的“采用新的擴(kuò)散池來(lái)體外測(cè)定胃腸組織的滲透性”(Pharm.Res.5(6)372-376(1988))；Rubas等人的“人結(jié)腸上皮(Caco-2)細(xì)胞系與家兔、猴和犬的結(jié)腸的滲透性質(zhì)的比較以及人的藥物吸收”(Pharm.Res.10(1)113-117(1993))。
孵育培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件
將多次傳代(108-120)的Caco-2細(xì)胞在含有高葡萄糖和L-谷酰胺的Dulbecco’s改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(Gibco/生命技術(shù)公司，目錄號(hào)11965-084)中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有10％胎牛血清、1X L-谷酰胺(Gibco/生命技術(shù)公司，目錄號(hào)25030-081)、1X青霉素-鏈霉素(Gibco/生命技術(shù)公司，目錄號(hào)15140-122)和1X非必需氨基酸(Gibco/生命技術(shù)公司，目錄號(hào)11140-019)。于37℃和5％CO2下，將細(xì)胞維持在T225cm2的處理組織培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Cell Culture Flask Tissue Culture Treated)(Costar，目錄號(hào)3001)中。對(duì)于轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞以7.1×104個(gè)細(xì)胞/孔鋪在帶有插入物(inserts)的12孔覆蓋膠原的PTFE膜聚苯乙烯板(Costar，目錄號(hào)3493，直徑為12mm，孔徑為0.4um，無(wú)菌，處理組織培養(yǎng))上。每3天喂養(yǎng)細(xì)胞，于37℃和5％CO2下維持21天，以使緊密連接的極化單層形成完全。
儲(chǔ)備液和工作溶液
Kreb’s-Henseleit碳酸氫鹽緩沖液，PH6.5和7.4
試劑
蒸餾水(玻璃蒸餾或Nanopure)
Kreb’s-Henseleit碳酸氫鹽緩沖混和物(粉末，SIGMA#K-3753)
二水氯化鈣(MW＝147.0)
碳酸氫鈉(MW＝84.01)
將Kreb’s-Henseleit碳酸氫鹽緩沖混和物溶于約900mL水中。待緩沖混和物溶解后，加入0.373g二水氯化鈣。待二水氯化鈣溶解后，加入2.1g碳酸氫鈉，在碳酸氫鈉溶解后，加入適量水至1000mL，然后經(jīng)0.2μm濾器除菌過(guò)濾，儲(chǔ)存在冰箱中。
測(cè)試/標(biāo)準(zhǔn)化合物溶液
制備測(cè)試化合物在DMSO中的5mg/ml儲(chǔ)備液，于4℃儲(chǔ)存。用Kreb’s-Henseleit碳酸氫鹽緩沖液(pH6.5)將所需量的5mg/ml儲(chǔ)備液稀釋至10mL，使?jié)舛葹?00μM。然后將1mL的100μM溶液進(jìn)一步稀釋至5mL，使?jié)舛葹?0μM。使用該20μM測(cè)試溶液作為初始劑量供給溶液(D0)。臨用前將藥物溶液溫?zé)嶂?7℃。
分析步驟
1.預(yù)溫?zé)峋彌_液、工作溶液和三塊含有緩沖液的12孔板，每塊板有12個(gè)插入物。使用裝有“筷式”電極的millicell-ERS(Millipore，貝德福德，MA)檢測(cè)TEER。由于TEER受溫度影響，因此該操作應(yīng)在細(xì)胞為約37℃時(shí)進(jìn)行。僅使用那些TEER高于300歐姆的插入物。
2.倒出培養(yǎng)基，并用溫?zé)酜reb’s-Henseleit碳酸氫鹽緩沖液洗滌每個(gè)插入物一次。
3.向細(xì)胞單層的頂側(cè)加0.5mL Kreb’s-Henseleit緩沖液(pH6.5)，向底外側(cè)室加1.25mL Kreb’s-Henseleit緩沖液(pH7.4)。細(xì)胞在37℃和5％CO2的孵育箱內(nèi)平衡至少30分鐘。
4.除去頂側(cè)的緩沖液，替換以0.5mL的20μM測(cè)試溶液。
5.然后將細(xì)胞在37℃和5％CO2下孵育。
6.在30、60和90分鐘的時(shí)間點(diǎn)，將插入物移至新的平板，該板接收側(cè)含有1.25mL溫?zé)嵝迈r的Kreb’s-Henseleit緩沖液(pH7.4)。
7.收集所有板的培養(yǎng)基作為接收樣品。
8.在60分鐘轉(zhuǎn)運(yùn)研究后，在孔的頂側(cè)加入熒光黃(0.05mL×1000μM)。在轉(zhuǎn)運(yùn)研究結(jié)束時(shí)(90分鐘)，測(cè)量接收側(cè)樣品的熒光。
在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，收集供給側(cè)的樣品溶液作為D90樣品。
由30(假設(shè)為0ng/mL)和60分鐘時(shí)的樣品數(shù)據(jù)計(jì)算測(cè)試物質(zhì)的dC/dt。根據(jù)下述公式計(jì)算表觀滲透系數(shù)(Papp)
其中dQ表示接收側(cè)化合物含量的變化，dC表示接收側(cè)化合物濃度的變化，V表示接受溶液的體積(cm3)，A表示插入物的表面積(cm2)，C0表示藥物的初始濃度，dC/dt表示接受側(cè)溶液在90分鐘的孵育期內(nèi)藥物濃度的變化，即，接受溶液中藥物濃度對(duì)時(shí)間的斜率(μg/cm3/秒)。
表4.所選擇化合物的Caco-2細(xì)胞分析滲透率
實(shí)施例19
口服施用組合物
成分 ％wt./wt.
活性成分 20.0％
乳糖 79.5％
硬脂酸鎂 0.5％
將成分混和，分裝入膠囊，每粒膠囊含有約100mg；一粒膠囊近似于一個(gè)全天劑量。
實(shí)施例20
口服施用組合物
成分 ％wt./wt.
活性成分 20.0％
硬脂酸鎂 0.5％
交聯(lián)羧甲纖維素鈉 2.0％
乳糖 76.5％
PVP(聚乙烯吡咯烷酮) 1.0％
將成分混和，并采用溶劑如甲醇制粒。然后將制劑干燥，并采用適宜壓片機(jī)制成片劑(含有約20mg活性化合物)。
實(shí)施例21
口服施用組合物
成分 量
活性化合物 1.0g
富馬酸 0.5g
氯化鈉 2.0g
尼泊金甲酯 0.15g
尼泊金丙酯 0.05g
粒狀糖25.5g
山梨醇(70％溶液) 12.85g
Veegum K(Vanderbilt Co.) 1.0g
矯味劑0.035mL
著色劑0.5mg
蒸餾水適量至100mL
將成分混合，形成口服施用懸浮液。
如果適當(dāng)?shù)脑?，在上述說(shuō)明書、隨后的權(quán)利要求書或附圖
中所公開的以具體形式或者實(shí)施所公開的功能或者方法或操作(所述方法或操作實(shí)現(xiàn)所公開的結(jié)果)的方式表示的特征可分別或任意組合，用于以多種形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
為了清楚和便于理解，已經(jīng)通過(guò)舉例說(shuō)明和示例的方法詳細(xì)描述了上述發(fā)明。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是，可在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)進(jìn)行改變和變通。因此，應(yīng)當(dāng)理解，上述說(shuō)明書用于舉例說(shuō)明而非用于限制本發(fā)明。因此，本發(fā)明的范圍不應(yīng)當(dāng)參考上述說(shuō)明書來(lái)確定，而應(yīng)當(dāng)參考所附的權(quán)利要求以及這些權(quán)利要求所表述的等同物的全部范圍來(lái)確定。
本申請(qǐng)所引用的所有專利、專利申請(qǐng)和出版物在此處為所有目的而全文引入作為參考，如同每個(gè)專利、專利申請(qǐng)或出版物逐一列出一樣。
權(quán)利要求
1.式I化合物，
其中，R1、R2和R3獨(dú)立地選自氫、C1-10?；?、C1-10烷氧羰基和COR4，其中COR4是氨基酸或二肽，
以及所述化合物的水合物、溶劑化物、包合物和酸加成鹽。
2.權(quán)利要求1所述的化合物，其中R1、R2和R3中之一是COR4，R4是CH(R5)NH3+Cl-或吡咯烷-2-基，R5是天然存在的疏水性氨基酸的側(cè)鏈或者是C1-6直鏈或支鏈烷基，以及R1、R2和R3中的其它基團(tuán)獨(dú)立地選自氫、C1-10?；虲1-10烷氧羰基。
3.權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中R1是COR4，R4是CH(R5)NH3+Cl-或吡咯烷-2-基，且R2和R3獨(dú)立地選自氫、C1-10?；虲1-10烷氧羰基。
4.權(quán)利要求1至3所述的化合物，其中R1是COR4，R4是CH(R5)NH3+Cl-，R5選自CH(CH3)2和CH(CH3)CH2CH3，且R2和R3均為氫。
5.權(quán)利要求1至4所述的化合物，其中R1是COR4，R4是CH(R5)NH3+Cl-，R5是CH(CH3)2，且R2和R3均為氫。
6.權(quán)利要求1至5所述的化合物，其中該化合物是2S-氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羥基-四氫呋喃-2S-基甲酯鹽酸鹽。
7.權(quán)利要求1的化合物，其中R1、R2和R3獨(dú)立地是C1-10?；駽1-10烷氧羰基。
8.權(quán)利要求1或7所述的化合物，其中該化合物是丙酸3S，4S-雙-丙酰氧基-5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-四氫呋喃-2S-基甲酯。
9.權(quán)利要求1或7所述的化合物，其中R1是C1-10?；駽1-10烷氧羰基氫，且R2和R3均為氫。
10.權(quán)利要求1或7所述的化合物，其中R1是氫，且R2和R3獨(dú)立地是C1-10?；駽1-10烷氧羰基。
11.權(quán)利要求1或7所述的化合物，其中該化合物是異丁酸2S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-5S-羥甲基-4S-異丁酰氧基-四氫呋喃-3S-基酯；或2，2-二甲基丙酸4S-(2，2-二甲基丙酰氧基)-5S-(3-氨基甲?；?[1，2，4]三唑-1-基)-2S-羥甲基-四氫呋喃-3S-基酯。
12.式II化合物，
其中，R1、R2和R3獨(dú)立地選自氫、C1-10?；?、C1-10烷氧羰基和COR4，其中COR4是氨基酸或二肽；R6是C1-10酰基，
以及所述化合物的水合物、溶劑化物、包合物和酸加成鹽。
13.權(quán)利要求1至12所述的化合物，用于在療法中使用。
14.權(quán)利要求1至12所述的化合物，用于在由丙型肝炎病毒介導(dǎo)的疾病的療法中使用。
15.權(quán)利要求1至12的化合物在制備用于在療法使用的藥物中的用途。
16.權(quán)利要求1至12的化合物在制備用于在由丙型肝炎病毒介導(dǎo)的疾病的療法中使用的藥物中的用途。
17.藥用組合物，該組合物包含治療有效量的權(quán)利要求1至12的化合物和至少一種可藥用載體，以及任選含有賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療丙型肝炎病毒感染的包括式(I)和式(II)化合物的核苷衍生物、含有這些化合物的藥用組合物，以及在單獨(dú)療法或組合療法中采用所述化合物來(lái)治療或預(yù)防丙型肝炎病毒介導(dǎo)的疾病的方法。
文檔編號(hào)A61K31/724GK1742018SQ20038010797
公開日2006年3月1日 申請(qǐng)日期2003年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月10日
發(fā)明者R·T·亨德里克斯, E·R·漢弗萊斯, J·A·馬丁, A·普林斯, K·薩爾馬 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司