專利名稱：用植物表達的重組蛋白免疫魚類的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及在轉基因植物中表達魚疾病抗原，并涉及其用作疫苗的用途。
背景技術：
在過去十幾年中，轉基因植物已被成功用于表達多種有用蛋白。例如，在植物中生產蛋白酶已得以實現(見美國專利第6,087,558號)；同時還有在植物中生產抑肽酶(美國專利第5,824,870號)；以及親和素(美國專利第5,767,379號)。已在植物中成功生產的蛋白包括多種哺乳動物細菌和病毒病原體抗原，例如病毒疫苗(美國專利第6,136,320號)、傳染性腸胃炎和肝炎疫苗(美國專利第5,914,123號和第6,034,298號)。這些專利以及在此引用的所有文獻均作為參考文獻列入此處。
許多由此得到的多肽在小鼠(Mason等.(1998)Vaccine 161336-1343；Wigdorovitz等.(1999)Virology155347-353)和人(Kapusta等.(1999)FASEB J.131796-1799)中誘導出與原始病原體相當的免疫原性反應。經口遞送后，這些食用疫苗具有免疫原性，且能夠誘導保護。用基本飲食添加表達重組大腸桿菌(Escherichia coli)熱敏感性腸毒素B亞基(LtB)的玉米飼喂小鼠達到良好的劑量依賴性IgG和IgA應答(Streatfield等，“基于植物的疫苗-獨特優(yōu)勢”，Vaccine(2001)192742-2748)。一些最早研發(fā)的食用疫苗技術包括利用轉基因馬鈴薯表達肝炎、TGEV和諾沃克病毒(Norwalk virus)抗原以及其它多種病毒抗原。(參見，例如Thanavala等(1995)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.923358-3361；美國專利第6,136,320號；美國專利第6,034,298號；美國專利第5,914,123號；美國專利第5,612,487號；以及美國專利第5,484,719號；Mason等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.935335-5340；“口蹄疫VP1蛋白”(Wigdorovitz等(1999)Virology 255347-353)。
利用轉基因植物生產疫苗與傳統(tǒng)的疫苗生產方法相比，具有多種潛在的好處。第一，通常構建的轉基因植物僅僅表達病原體或毒素的一個小的抗原性部分，這排除了抗原對整個機體產生感染或內在毒性的可能性，并降低了可能的副作用。第二，已知的人或動物病原體不能感染植物，因此可不考慮病毒或朊病毒污染的問題。第三，在轉基因作物中生產免疫原依賴于既定的技術來播種、收獲、儲存、運輸和加工植物，這些技術與通常用于糧食作物的技術相同，這使轉基因植物成為大規(guī)模疫苗生產的一種非常經濟的方法。第四，在植物的天然蛋白貯藏區(qū)室中表達免疫原使其穩(wěn)定性最佳，對冷藏的需要減少到最小，并且使運輸和貯存成本較低。第五，通過在單一疫苗中混合多種轉基因植物株系的種子，使制備多成分疫苗成為可能。第六，當免疫原在通常食用的糧食作物如谷物中表達時，直接經口施用是可能的，這導致食用疫苗的產生。
以經口疫苗遞送作初次免疫和加強免疫是目前水產業(yè)最受歡迎的方法，因為該方法適于大量免疫所有大小的魚；與注射遞送相比，對魚的壓力小，其中所述注射需要觸摸魚；而且因為該方法誘導黏膜免疫。然而，經口遞送的成本效益已成為使該方法工業(yè)化的一個主要障礙，尤其對于較大的魚來說。據報道，經口抗原遞送的效果受限于魚的消化系統(tǒng)對抗原的破壞和吸收。
發(fā)明人發(fā)現轉基因植物能夠提供一種理想的體系用于經濟生產經口接種魚的抗原。
發(fā)明簡述根據本發(fā)明的一方面，提供了植物來源的重組氨基酸序列用于生產預防或治療魚疾病的藥物的用途，其中當給魚施用該氨基酸序列時，在魚中產生抗原性或免疫原性反應。優(yōu)選該重組氨基酸序列是能夠引發(fā)魚疾病或病理的生物體的抗原。
根據本發(fā)明的一方面，用核苷酸序列轉化植物，該核苷酸序列編碼的氨基酸序列當給魚施用時，在魚中產生抗原性或免疫原性反應。
根據本發(fā)明的進一方面，該氨基酸序列的表達優(yōu)選定向于植物的種子。
另一方面，本發(fā)明提供了植物細胞表達來源的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列對于引起魚疾病或病理的生物體是內源的。
另一方面，本發(fā)明提供了適于經口遞送至魚的組合物，其包含植物來源的重組氨基酸序列，特別是這樣的植物來源重組氨基酸序列，該序列是引起魚疾病或病理的生物體的抗原。
又一方面，本發(fā)明提供了免疫魚抵抗疾病的方法，其包括給魚施用包含植物來源的重組氨基酸序列的組合物，其中所述氨基酸序列是能夠引起魚疾病或病理的生物體的抗原。
附圖簡述

圖1顯示大麥α淀粉酶序列融合于編碼成熟親和素蛋白的序列(SEQID NO1)。
圖2為pPHI5158質粒圖譜。
圖3顯示玉米優(yōu)化的pat序列(SEQ ID NO2)。
圖4為PGN7101質粒圖譜。
圖5A為玉米密碼子優(yōu)化的LtB核苷酸序列(SEQ ID NO3)。
圖5B為BAASSLtB核苷酸序列(SEQ ID NO4)。
圖6為IPNV VP2核苷酸序列(SEQ ID NO5)。
圖7為BAASSVP2核苷酸序列(SEQ ID NO6)。
圖8為IPNV VP3核苷酸序列(SEQ ID NO7)。
圖9為BAASSVP3核苷酸序列(SEQ ID NO8)。
圖10為PGN9084質粒圖譜。
圖11為PGN9111質粒圖譜。
圖12為在種子中表達的VP2和VP3蛋白的Western印跡，種子由NVA產生。
圖13為在種子中表達的VP2和VP3蛋白的Western印跡，種子由NVB產生。
圖14為顯示接種后0周(第一個柱)和8周(第2個柱)時魚平均重量的圖。同時顯示了標準誤細線。
圖15為顯示大西洋鮭魚在注射或飼喂玉米表達的重組親和素(A)或LtB(B)后8周，由ELISA測得的平均抗體反應圖。細線代表平均標準誤。每組取樣的動物數量(N)已示出。
對優(yōu)選實施例的詳細說明這里使用的術語“魚”是指長須鯨、甲殼水生動物和其它水生動物。長須鯨包括所有脊椎魚，該脊椎魚可以是硬骨魚或軟骨魚。接受本發(fā)明疫苗的主要候選長須鯨種類為鮭科魚，包括鮭魚和鱒魚種，特別是銀大馬哈魚(Oncorhynchus kisutch)、河鱒(Salvelinus fontinalis)、褐鱒(Salmotrutta)、大鱗鮭魚(Oncorhynchus tshawytscha)、櫻鮭(Oncorhyncusmasou)、細鱗大麻哈魚(Oncorhynchus gorbuscha)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、北極嘉魚(Salvelinus alpinus)和大西洋鮭魚(salerno salar)。然而，其它易感傳染病的任何魚也可受益，例如觀賞魚種類、錦鯉、金魚、鯉魚、鯰魚、鯡魚、海鯉、鱸魚、梭子魚、大比目魚、黑線鱈、羅非魚、大菱鲆、狼魚等。
甲殼水生動物的例子包括但不限于蛤、龍蝦、蝦、螃蟹和牡蠣。其它養(yǎng)殖的水生動物包括但不限于鰻魚、魷魚和章魚。
“植物來源”的重組氨基酸序列是通過遺傳工程在轉基因植物中表達的氨基酸序列，該序列不是這種植物的內源序列。
本發(fā)明的氨基酸序列給魚施用時，在魚中產生抗原性或免疫原性反應。
已經給魚施用了引發(fā)魚病害的生物體抗原以及編碼這類抗原的核苷酸序列，魚所受的處理方式有注射、浸泡、噴灑、在魚食中直接添加疫苗、或基因轉移至魚的細胞中。例如，美國專利第6,462,027號描述了一種用分離的、不傳染的多核苷酸接觸水生動物的方法，其中所述多核苷酸編碼免疫原。美國專利第6,180,614號描述了通過轉染方式將DNA質粒導入魚，該質粒編碼基于抗原的疫苗。其啟動子能夠在魚中引導表達。該專利說明書指出細菌表達的重組蛋白能形成包涵體，這樣蛋白的回收量就比較低或者沒有。該說明書進一步指出誘導免疫應答可能需要抗原蛋白的正確糖基化和折疊，關于這點，他們說在除動物細胞以外的細胞中可能無法達到。但是，本發(fā)明的發(fā)明者卻發(fā)現在植物中生產正確加工的抗原性氨基酸序列是可能的，該抗原性氨基酸序列給魚施用后可引發(fā)抗原性或免疫原性反應。
許多在魚中產生抗原性或免疫原性反應的氨基酸序列(也稱作“抗原”)的編碼序列已經以及正在測序，這是因為人們對應用這些基因來生產疫苗有極大的興趣。雖然以下列出了特定的實施例來說明本發(fā)明應用某些抗原的原理，但本發(fā)明并不局限于任何具體的抗原。相反，可以應用在魚中產生抗原性或免疫原性反應的任何氨基酸序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，使用了一種引發(fā)魚病害的生物體抗原。這種抗原用于誘導或加強免疫，編碼這種抗原的相應的核苷酸序列在本發(fā)明中是有用的。在這些已分離序列的大量例子中的幾個例子包括在美國專利第6,471,964號中描述的編碼傳染性鮭魚貧血癥病毒(ISAV)結構蛋白-1的cDNA，以及在如下文獻中討論的序列Tucker等(2000)“用基因槍導入報告基因和組織病理學方法評價用于牙鲆Paralichthys olivaceus魚苗的DNA疫苗的可能性”Vaccine 19(7-8)801-809；Corbeil等(1999)“使用DNA疫苗評價紅鱒魚Oncorhynchusmykiss中傳染性造血組織壞死病毒(IHNV)N、P、M、NV、G蛋白的保護性免疫原性”Dis.Aquat.Organ 39(1)29-26；Nusbaum等(2002)“用斑點叉尾鲴皰疹病毒(IHV-1)的早期和晚期轉錄本對斑點叉尾鲴進行DNA接種所誘導的保護免疫性”Vet Immunol.Immunopathol 84(3-4)151-168；Clark等(1992)“Ichtyophthirius multifiliis的寄生性纖毛蟲表面抗原基因的發(fā)育表達”Proc.Natl.Acad.Sci..89(14)6363-6367；以及Sato等(2000)“在養(yǎng)殖鯡魚苗中表達YAV蛋白和接種疫苗預防病毒性腹水”Biosci.Biotechnol.Biochem.64(7)1494-1497。
本發(fā)明的方法可應用的病原體種類的例子包括，且不局限于病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)、傳染性胰臟壞死病毒(IPNV)、傳染性造血組織壞死病毒(IHNV)、鮭魚胰腺病痛毒(SPDV)、引發(fā)鯉春病毒血癥的病毒、草魚出血病病毒、野田病毒科病毒例如神經壞死病毒或黃帶擬鲹神經壞死病毒、傳染性鮭魚貧血病毒(ISAV)、Aeromonis salmonicida、鮭腎桿菌Renibacterium salmonainarum)、耶爾森菌屬的種(Yersinia spp.)、巴斯德菌屬的種(Pasteurella spp.)(包括海 發(fā)光菌(Photobacteriumdamselae))、弧菌屬的種(Vibrio spp.)(包括V.anguillarum和V.ordalii)、愛德華菌屬的種(Edwardsiella spp.)(包括鲇魚愛德華桿菌(E.ictaluri)和遲鈍愛德華桿菌(E.tarda))、Piscirickettsia salmonis(鮭魚立克次氏體敗血病的原因)、虹彩病毒、心肌病綜合征病毒、Taura綜合征病毒、斑節(jié)對蝦病毒、蝦苗黃頭癥病毒、蝦苗白點病病毒和鏈球菌屬的種(Streptococcispp.)。
能在本發(fā)明中應用的產生魚病害的已知抗原的其它例子包括IPNVVP2和VP3蛋白、IHNV G蛋白、VHSV G蛋白、野田病毒外殼蛋白、WO 01/10469中公開的ISAV抗原、WO 99/58639中公開的SPDV抗原、WO 01/68865中公開的P.salmons抗原和在WO 01/09340中公開的白點病毒抗原。許多魚病原體抗原的核苷酸和氨基酸序列已知，并能通過Genbank數據庫和其它來源獲得。
本發(fā)明的氨基酸序列或抗原是“引發(fā)魚病害的生物體”的氨基酸序列或抗原，是魚病原的氨基酸序列或抗原(或其衍生物)，其通過重組DNA技術在植物細胞中表達，如下所述。實施本發(fā)明應用的“抗原”可以是全長的抗原性蛋白，該蛋白來源于病毒、細菌、真茵、寄生蟲、原生動物等，在魚中引發(fā)疾??；或者也可構建上述蛋白的免疫原性部分、片段或衍生物。氨基酸序列的“衍生物”是在氨基酸序列水平上或三維水平上(即與參照序列具有大致相同的形狀和構型的分子)與參照序列相關的序列。衍生物包括同源序列、突變體、模擬物、模擬表位、類似物、單體形式和功能等同物，這些衍生物是直接從生物體獲得或合成產生的，能夠在魚中誘導抗原性或免疫原性反應。具體而言可以是由氨基酸替換(用天然或合成的氨基酸)、缺失、倒位、插入和添加得到的衍生物。
該抗原，不論是氨基酸序列還是蛋白，都是“目的抗原”。“目的基因”是指核苷酸序列，該序列編碼目的抗原或選擇標記的多肽或蛋白。通過優(yōu)化用于植物的密碼子，目的基因可被優(yōu)化用于植物轉錄和翻譯(見下述討論)。
一般而言，構建上述重組基因可用的方法任選地包括多種增強表達的修飾，具體細節(jié)可各異。然而，常規(guī)采用的方法包括PCR擴增，或設計合成重疊且互補的人工合成寡核苷酸，上述寡核苷酸退火連接在一起，從而產生具有方便克隆的限制性位點的基因。對于分子生物學家來說，所用方法是標準方法，Sambrook等，分子克隆，實驗手冊，冷泉港實驗室出版社，第二版(1989)。
一旦某基因被遺傳工程操作以包含特定性狀，例如包含特定目的定位序列后，即將該基因用標準方法置于表達載體中。選擇適當的表達載體取決于將表達載體導入宿主細胞的方法。一個典型的表達載體包含編碼細菌復制起點的原核DNA元件和抗生素抗性基因，它們使表達載體能夠在細菌宿主中生長和篩選；用于插入外源DNA序列的克隆位點，其中所述外源DNA序列在本文中將編碼目的抗原；控制外源基因的轉錄起始的真核DNA元件，例如啟動子；以及控制轉錄本加工的DNA元件，例如轉錄終止/多聚腺苷酸化序列。表達載體也可包含該載體最終整合至植物染色體所需要的序列。
在一個優(yōu)選實施方案中，表達載體還含有編碼選擇標記的基因，該基因功能性連接于控制轉錄起始的啟動子?！肮δ苄赃B接”理解為目的基因(在這里是編碼選擇標記的基因)在啟動子下游，以正確的方向和正確的閱讀框排列，這樣mRNA正確轉錄和翻譯，從而產生目的多肽或蛋白。關于植物表達載體和報告基因的概括描述，參見Gruber等(1993)“植物轉化載體”，見植物分子生物學和生物技術方法，CRC出版社，89-119頁。在一個實施方案中，選擇標記基因是編碼草銨膦(glufosinate)抗性的DNA，在另一個實施方案中，是在CaMV 35S啟動子控制下的膦絲菌素乙酰轉移酶(“pat”)或玉米密碼子優(yōu)化的pat基因。該基因賦予對雙丙氨膦的抗性(Gordon-Kamm(1990)The Plant Cell 2603；Uchimiya等(1993)Bio/Technology 11835；以及Anzai等(1989)Mol.Gen.Gen.219492)。
“啟動子”是指足以引導轉錄的最小序列。在本發(fā)明中也包括啟動子元件，這些元件足以使依賴于啟動子的基因表達成為可控制的細胞類型特異表達、組織特異表達、或受外界信號或試劑誘導地表達；這些元件可以位于基因的5’或3’區(qū)。雖然可以用目的結構基因的內源啟動子來對基因進行轉錄調控，但是啟動子通常是一段外源調控序列。用于控制抗原性蛋白和選擇基因表達的啟動子元件分別可以是植物相容的任一啟動子。啟動子可以是植物基因啟動子，例如泛素啟動子(歐洲專利申請?zhí)?342926)；核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基(ssRUBISCO)啟動子(Coruzzi等，EMBOJ.，31671，1984；Broglie等，Science，224838，1984)；或根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)誘導癌的質粒啟動子，例如胭脂堿合成酶和章魚堿合成酶啟動子(在根癌農桿菌誘導癌的質粒上，且具有植物活性)；或病毒啟動子，例如花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S啟動子(Brisson等，Nature，310511，1984；Odell等，Nature，313810，1985)、玄參花葉病毒35S啟動子(Gowda等，J.Cell Biochem.，13D301，1989)或TMV外殼蛋白啟動子(Takamatsu等，EMBO J.6307，1987。也可參見Kay等(1987)“CaMV 35S啟動子序列加倍形成植物基因的強增強子?！盨cience 236199-1302和歐洲專利申請EP-A-342 926?；蛘呖梢允褂弥参飭幼?，例如甘露堿合成酶啟動子(Velten等，EMBO J.，32723，1984)；熱休克啟動子，例如大豆hspl 7.5-E或hspl 7.3-B(Gurley等，Mol.Cell.Biol.，6559，1986；Severin等，Plant Mol.Biol.，15827，1990)；或乙醇誘導的啟動子(Caddick等，Nature Biotech.，16177，1998)。見國際專利申請?zhí)朩O 91/19806，可找到適于在本發(fā)明中應用的闡述植物啟動子的綜述。在本發(fā)明的一個實施方案中，編碼氨基酸的DNA在PGNpr6啟動子的轉錄控制下(WO01/94394)。這是一個泛素樣啟動子。
在一個優(yōu)選實施方案中，提供了組織特異的啟動子來將DNA轉錄優(yōu)選地定位于種子。一個這樣的啟動子是球蛋白啟動子。這是玉米球蛋白-1基因啟動子，由Belanger F.C.和Kriz A.L.描述(1991)“玉米球蛋白-1基因的等位基因多態(tài)性分子基礎”Genetics 129863-972。該啟動子也可在Genbank數據庫中以登錄號L22344找到。另一個例子是菜豆蛋白啟動子。見Bustos等(1989)“利用在法國菜豆B-菜豆蛋白基因上游發(fā)現的一段A/T豐富的順式作用序列調節(jié)轉基因煙草中B-葡糖苷酸酶的表達”The PlantCell(1)839-853。
表達載體也可任選地包含位于啟動子和目的基因之間的信號序列。信號序列是這樣的核苷酸序列，也可能是其對應的氨基酸序列，細胞用該信號序列來引導目的蛋白或多肽在真核細胞內或真核細胞外的特定位置翻譯和定位。植物信號序列的一個例子是大麥α-淀粉酶分泌信號(Rogers，(1985)J.Biol Chem 260，3731-3738)。許多信號序列是本領域已知的。參見，例如Becker等(1992)，Plant Mol.Biol.2049；Close，P.S.，(1993)碩士學位論文，愛荷華州立大學；Knox，C.(1987)等，“大麥兩個分化的α-淀粉酶基因的結構和組織”，Plant Mol.Biol.93-17；Lerner等(1989)PlantPhysiol.91124-129；Fontes等(1991)，Plant Cell 3483-496；Matsuoka等(1991)，Proc.Natl.Acad.Sci.88834；Gould等(1989)，J.Cell.Biol.1081657；Creissen等(1991)，Plant J.2129；Kalderon等(1984)“一小段氨基酸序列能進行特異核定位”Cell 39499-509；以及Steifel等(1990)“一個玉米細胞壁羥脯氨酸豐富的糖蛋白基因在葉和根維管束分化早期的表達”Plant Cell 2785-793。
在一個實施方案中，植物的選擇標記和目的基因可功能性連接于同一個啟動子。在另一個實施方案中，植物的選擇標記和目的基因可功能性連接于不同的啟動子。而在第三和第四實施方案中，表達載體可包含兩個或多個目的基因，這些基因可連接于相同或不同的啟動子。
顯然，對于本領域的技術人員來說，構建體的啟動子、選擇標記、信號序列和其它組分都可有許多變化。
根據本發(fā)明，生產了這樣的轉基因植物，其所包含的含有上述元件的DNA分子被整合至其基因組中，這樣植物能表達目的基因，從而產生目的抗原。轉基因植物可適為常規(guī)栽培用作動物飼料的物種，例如玉米(Zeamays)、卡諾拉油菜(canola)(歐洲油菜(Brassica napus)、蕪菁(Brassicarapa ssp.))、苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、黑麥(Secalecereale)、高梁(Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、向日葵(Helianthusannuus)、小麥(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、番茄(Lycopersicon esculentum)和豌豆(Lathyrus spp.)?；蛘?，轉基因植物可以是通常不食用的物種，例如煙草(Nicotiana tabacum)、棉花(Gossypium hirsutum)、茶(Camellia sinensis)、亞麻(Linum)、劍麻(龍舌蘭屬(Agave spp.)、萬年蘭屬(Furcraea spp.))、松樹、冷杉和雪松。為產生這樣的轉基因植物，可將包含基因的表達載體導入原生質體、完整組織如未成熟胚和分生組織、愈傷組織或分離的細胞中。優(yōu)選地，將表達載體導入完整組織中。培養(yǎng)植物組織的普通方法可以是，例如Miki等(1993)“外源DNA導入植物的步驟”，見植物分子生物學和生物技術方法，Glick等主編，CRC出版社，67-68頁，以及Phillips等(1988)“細胞/組織培養(yǎng)和離體操作”，見玉米和玉米改良第三版，Sprague等主編，美國農學學會，345-387頁所提供的方法。在DNA分子中摻入選擇標記可以篩選轉化體。
對于本領域的技術人員來說，將表達載體導入植物組織可用的方法多種多樣，取決于所選的植物。轉化多種植物的方法已為人們所熟知，文獻中均有描述。見，例如Miki等，見上；Klein等(1992)Bio/Technology 1026；和Weisinger等(1988)Ann.Rev.Genet.22421-477。例如，DNA構建體可以導入植物細胞的基因組DNA，應用的技術可以是，例如微轟擊粒子介導傳遞(Klein等(1987)Nature 32770-73)；電穿孔(Fromm等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.825824)；聚乙二醇(PEG)沉淀(Paszkowski等(1984)Embo.J.32717-272)；直接基因轉移(WO 85/01856和EP-A-275 069)；離體原生質體轉化(美國專利第4,684,61l號)以及顯微注射植物細胞原生質體或胚性愈傷組織(Crossway，(1985)Mol.Gen.Genetics 202179-185)。植物組織與根癌農桿菌共培養(yǎng)是另一種選擇，此時DNA構建體被置于一個雙元載體系統(tǒng)中(Ishida等(1996)“根癌農桿菌介導的玉米(Zea mays L.)高效轉化”，Nature Biotechnology 14745-750)。當植物細胞被細菌感染時，根癌農桿菌宿主的致毒功能將引導構建體插入植物細胞DNA。見，例如Horsch等(1984)Science 233496-498和Fraley等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.804803。
轉化卡諾拉油菜的標準方法由Moloney等描述(1989)“利用農桿菌載體高效轉化歐洲油菜”，Plant Cell Reports 8238-242。玉米轉化由Fromm等(1990)Bio/Technology 8833和Gordon-Kamm等描述，見上。農桿菌主要應用于雙子葉植物，但某些單子葉植物例如玉米也可用農桿菌轉化。見，例如，美國專利第5,550,318號。水稻轉化見Hiei等(1994)“農桿菌介導的水稻(Oryza sativs L.)高效轉化和T-DNA邊界的序列分析”The PlantJournal 6(2)271-282，Christou等(1992)Trends in Biotechnology 10239和Lee等(1991)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 886349。小麥可用與轉化玉米或水稻類似的技術轉化。高梁轉化見Casas等(1997)“微轟擊粒子轟擊未成熟花序得到的轉基因高梁植株”，In vitro cellular and developmentalbiology，Plant.3392-100和Wan等(1994)Plant Physiology.10437。大豆轉化在許多出版物中均有描述，包括美國專利第5,015,580號。
在一個優(yōu)選方法中，基本按照前述Ishida的農桿菌轉化方法和在美國專利5,591,616中描述的方法，做了一些變化，發(fā)明人發(fā)現這些變化能夠提高所獲得的轉化體數量。Ishida的方法使用了玉米A188變種，該變種在培養(yǎng)中產生類型I愈傷組織。在一個優(yōu)選實施方案中，使用了HiII玉米品系，該品系在培養(yǎng)中起始類型II胚性愈傷組織。雖然Ishida建議當使用bar或pat基因篩選時用膦絲菌素篩選，另一個優(yōu)選實施方案使用雙丙氨膦代替?？偟膩碚f，正如在‘616專利中列出的，以及在下述更詳細概括的，脫分化通過在脫分化誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)植物外植體不少于7天而獲得，將正在脫分化和脫分化后的組織與含有目的基因的農桿菌接觸。培養(yǎng)的組織可以是例如愈傷組織、不定胚樣組織和懸浮細胞。在本優(yōu)選實施方案中，農桿菌懸浮液的細胞群體為106～1011個細胞/mL，將其與組織接觸3～10分鐘，或將組織與農桿菌一起連續(xù)培養(yǎng)不少于7天。農桿菌可以包含質粒pTOK162，在該質粒的T區(qū)邊界序列之間帶有目的基因，或目的基因在含有另一質粒的農桿菌中存在。毒性區(qū)可來源于Ti質?；騌i質粒的毒性區(qū)。在Ishida操作方法中所用的細菌株系為LBA4404，該菌株含有40kb超雙元質粒，該質粒包含源于超毒性A281菌株的三個Vir基因座。該質粒具有四環(huán)素抗性?？寺≥d體與該超雙元質粒共整合。因為該克隆載體具有大腸桿菌特異復制起點，而沒有農桿菌復制起點，它如果不與超雙元質粒共整合，則在農桿菌中不能存活。因為LBA4404菌株不是高毒性的，在沒有超雙元質粒的條件下應用有限，發(fā)明人在另外一個實施方案中已發(fā)現EHA101菌株是優(yōu)選的。它是源于超毒性A281菌株的一個卸甲輔助菌株。來源于LBA4404親本的共整合超雙元/克隆載體被分離得到并電穿孔轉化至EHA101，篩選壯觀霉素抗性。該質粒被分離以確認所得EHA101包含該質粒。EHA101包含帶有卡那霉素抗性的卸甲pTi質粒。Hood E E，Helmer G L，Fraley R T，Chilton M D(1986)“根癌農桿菌A281的超毒性由pTiBo542的位于T-DNA外的區(qū)域編碼”J Bacteriol 1681291-1301。
此外，所述的Ishida操作方法提供在平板上新鮮培養(yǎng)農桿菌、將細菌從平板上刮下、重懸于如在‘616專利中所述的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，與玉米胚一起培養(yǎng)。該培養(yǎng)基包含4.3g MS鹽、0.5mg煙酸、0.5mg維生素B6氫氯化物、1.0ml維生素B1氫氯化物、酪蛋白水解物、1.5mg 2，4-D、68.5g蔗糖和36g葡萄糖，pH為5.8。在一個更優(yōu)選的方法中，細菌在1mL培養(yǎng)基中生長過夜，次日轉化時再接種至10mL新鮮培養(yǎng)基中。細菌生長至對數期，在密度不超過OD600＝0.5時收獲，優(yōu)選范圍為0.2～0.5。然后將細菌離心去除培養(yǎng)基，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中重懸。因為使用的是HiII，所以使用了HiII優(yōu)選的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基由Armstrong，C.I.和Green C.E.(1985)進行了非常詳細的描述“建立和保持松散的胚性玉米愈傷組織及涉及L-脯氨酸”Planta 154207-214。重懸培養(yǎng)基與上述相同。所有其它HiII培養(yǎng)基如Armstrong等所述。結果是植物細胞重新分化和再生為植株。重新分化有時指脫分化，但前面一術語更加精確的描述了這樣一個過程細胞開始于具有一種形式和特性，將其置于使其喪失特性的培養(yǎng)基上，然后開始“重新編程”來具有一個新的特性。這樣盾片細胞變成了胚性愈傷組織。
優(yōu)選選擇氨基酸序列的最高表達量，這有助于確定在轉化的植物細胞、轉基因植物中和組織特異性表達的表達水平。一種這樣的方法是檢測目的抗原的表達占總可溶性蛋白的百分比。一種標準的分析方法是Bradford分析，該方法對于本領域的技術人員是熟知的(Bradford，M.(1976)Anal.Biochem.72248)。也應該檢測重組氨基酸序列的生化活性，并將其與野生型標準株相比。
目的基因的表達水平可通過目的基因在轉基因植物染色體上的穩(wěn)定維持而增強。使用連鎖基因，即除草劑抗性基因在物理距離上靠近目的基因，將可以在轉基因植物群體中保持選擇壓力，且可以保持那些轉基因植物不丟失目的基因。
用根據本發(fā)明的轉基因植物可以以工業(yè)產量生產氨基酸序列。這樣，上述的篩選和繁殖技術產生大量用常規(guī)方式收獲的轉基因植物。表達重組氨基酸序列的植物種子可用于工業(yè)加工，或可以提取氨基酸序列。當使用種子本身時，例如，可以將種子磨成面粉，然后用于工業(yè)加工?？赏ㄟ^已知方法完成生物材料提取。任何生產系統(tǒng)的下游加工是指經過產品合成后的所有單位操作，在本例中是在轉基因種子中生產蛋白(Kusnadi等(1997)Biotechnology and bioengineering.56473-484)。種子的加工為將整個種子磨成細粉或者將其分成幾部分，以及將胚與外殼和胚乳分離。如果使用胚，通常用己烷提取液對胚進行脫脂，并將殘留的壓碎胚磨成粗粉或細粉。在一些例子中，直接使用胚或者提取氨基酸序列(見，例如WO 98/39461)。通常提取液制成特定pH的液體緩沖液，以增強重組氨基酸序列提取，并減少天然種子蛋白的提取。隨后可進行后續(xù)的氨基酸序列濃縮或提純。
在又一個實施方案中，一旦轉化已經發(fā)生，可以用植物育種將基因導入其它植物。這可由任何本領域已知的植物育種方法達到，例如將上述轉基因植物與另一植物異花授粉，從后續(xù)子代中篩選表達該氨基酸序列的植物。在此使用的植物育種方法對于本領域的技術人員是熟知的。植物育種方法的討論參見Poehlman(1987)大田作物育種，AVI Publication Co.，Westport Conn.。許多在本方法中有用的糧食作物均通過利用植物授粉方法的技術育種。自花授粉植物是指一朵花的花粉轉移至同一朵花或同株植物的另一朵花。異花授粉植物是指花粉來源于不同植株的花。例如，蕓苔屬植物通常自交不育，只能通過異花授粉，除非通過發(fā)現突變體或通過遺傳干涉而獲得自交親和。自花授粉物種，例如水稻、燕麥、小麥、大麥、豌豆、菜豆、大豆、煙草和棉花，它們的雄性和雌性植株在解剖學上是雌雄同株的。在自然授粉過程中，一朵花的雄性生殖器官給同一朵花的雌性生殖器官授粉。玉米(Zea mays L.)可以通過自花授粉和異花授粉兩種技術育種。玉米在同一植株上有位于雄穗的雄花和位于耳穗的雌花。它可以自花或異花授粉。
授粉可以通過任何方法，包括但不限于人工、風或昆蟲授粉，或雄性可育與雄性不育植株的機械接觸。對于大多數植物物種來說，大規(guī)模生產雜交種子優(yōu)選利用風或種子授粉。可以對授粉過程進行更嚴格的控制，通過使用多種方法使一個植物群雄性不育，而另一個成為雄性可育花粉的供體。這可以通過人工去雄、細胞質雄性不育、或通過多種熟練育種者所熟知的方法控制雄性不育。更為復雜的雄性不育體系的例子包括下述Brar等，美國專利第4,654,465號和第4,727,219號以及Albertsen等，美國專利第5,859,341號和第6,013,859號。
可以使用回交方法將基因導入植物。該方法已使用了幾十年來將性狀導入植物。描述該方法的一個例子以及其它植物育種方法學已為人們熟知，且能在參考文獻中找到，例如植物育種方法學，Neal Jensen主編，JohnWiley & Sons，Inc.(1988)。在一個典型的回交方法中，原始的目的變種(輪回親本)與攜帶預轉移的單個目的基因的第二變種(非輪回親本)雜交。然后將這次雜交所得的子代再次與輪回親本雜交，該過程反復重復，直至獲得一個植株，其中輪回親本的基本所有目的形態(tài)和生理特征都在該轉換的植株上再現，此外還有非輪回親本的單個轉移基因。
將植物來源的重組氨基酸序列施用給魚的優(yōu)選方法是經口服，任選地可將重組氨基酸序列與常規(guī)飼料混合。其它施用方法包括浸泡、腹膜內注射和肌內注射。
轉基因植物組織可以直接給魚喂飼，或與其它物質混合后給魚喂飼，或提取出來后給魚施用。
疫苗的經口遞送形式包含重組氨基酸序列與一種或多種賦形劑以及任選地與一種或多種營養(yǎng)成分的任一組合。此處應用的賦形劑可包括二氧化硅、粘合劑、乳劑、表面活性物質、脂肪酸、脂肪、油等以及任何其它制備組合物所必需的添加劑。
典型的魚飼料可包含多種營養(yǎng)源，例如可代謝的能源(碳水化合物)、蛋白源、脂肪源、以及任選地纖維、維生素和礦物質。飼料的準確組分取決于所涉及魚的類型，特別是該魚是否食肉。工業(yè)規(guī)模生產的飼料可以方便地以模壓或擠壓的飼料丸的形式提供。植物來源的重組氨基酸序列可以摻入飼料，取代一種更普通的蛋白源(例如魚粉、血粉、玉米麩、大豆粉等)。或者可以將植物來源的重組氨基酸序列粘附于預制的魚飼料表面。
植物來源的重組氨基酸序列可被腸溶包衣用于經口遞送。腸溶包衣保護疫苗免受蛋白酶和胃中相對較低的pH值的影響。這使疫苗能夠達到后腸和淋巴組織，這使疫苗對魚的保護最為有效。腸溶包衣一般包含不受酸性pH影響但當通過腸內較高pH環(huán)境時溶解的聚合體包衣。
在一個優(yōu)選實施方案中，該植物來源的重組氨基酸序列以轉基因植物材料例如植物種子、葉片、果實、莖、塊莖等形式，投喂給魚，優(yōu)選轉基因植物材料不與任何其它飼料混合。在另一個實施方案中，在喂魚前，該植物來源的重組氨基酸序列與預制的魚飼料直接進行物理(可逆地)混合。
為避免不必要的提取步驟，優(yōu)選將植物來源的重組氨基酸序列以未提純(天然)形式投喂給魚。這表示不對該來源植物的食用部分進行特殊處理或加工來提取或濃縮重組氨基酸序列。
疫苗的有效劑量可根據受試對象的大小和物種、以及施用的方式而變化。最佳劑量可通過獸醫(yī)或水產專家的反復試驗而確定。疫苗每單位劑量可包含范圍約1～1000μg，優(yōu)選范圍約10～200μg，更優(yōu)選范圍約50～100μg的重組氨基酸序列。
本發(fā)明的疫苗可以預防或治療為目的給魚施用。該疫苗能夠誘導長期保護，預防目標傳染病?！伴L期”保護對魚來說是指接種后長于7天的保護性免疫應答，更優(yōu)選為長于20天，最優(yōu)選長于70天的保護性免疫應答。
實施例1親和素轉化植物以及表達水平的檢測在植物中表達親和素的質粒的構建親和素轉化玉米的質粒構建如美國專利第5,767,379號所述，作為參考文獻列入此處。雞卵白親和素cDNA由Gope ML.等(1987)報道，Nuc.Acids Res.153595-3606。利用優(yōu)選的玉米密碼子使用表(GCG，編匯者Mike Cherry，斯坦福大學)，將氨基酸序列反向翻譯成核苷酸序列。依據該計算機產生的合成序列，設計了重疊、互補、具有相容限制性位點末端的寡核苷酸，然后寡核苷酸退火連接產生玉米的優(yōu)化基因。所用序列在′379專利中列出，作為參考文獻列入此處。同樣，用玉米優(yōu)選的密碼子合成了(使用重疊且互補的核苷酸)大麥α-淀粉酶信號序列(Rogers，(1985)J.Biol Chem 260，3731-3738)。這兩個基因片段的相容限制性位點被連接在一起，大麥α-淀粉酶信號序列在親和素基因的5’端，并以正確的閱讀框排列，這樣在翻譯時使用正確的密碼子以產生目的抗原。得到的大麥α-淀粉酶信號序列/親和素(見圖1(SEQ ID NO1)作為BamHI/EcoRI片段被克隆進pGEM3Zf+載體，該載體是Promega公司的產品(Madison，WI)，以產生質粒pPHI5142。包含大麥α-淀粉酶信號序列/親和素區(qū)的BamHI/HpaI片段被分離，克隆至一個以pBlueScript SK+(Stratagene，LaJolla，CA)為骨架的衍生質粒。在這個質粒中，信號序列/親和素基因片段以正確的方向插入到玉米泛素5’區(qū)和馬鈴薯蛋白酶抑制劑II(PinII)轉錄終止子區(qū)域之間(An等，(1989年1月)Plant Cell 1115-122)，玉米泛素5’區(qū)包括玉米泛素啟動子(UBI1ZM)、第一外顯子和第一內含子。所得質粒為pPHI5168(圖2)。與該質粒共轉化的是pPHI610質粒，pPHI610包含源于吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因(見上文及White J.(1990)Nucleic Acids Res 181062)，其中bar基因連接于雙35S啟動子(例如Friz，S.E。J.Cell Sci 98545-550)、pPHI610還包含玉米醇脫氫酶基因的內含子(Callis J.等，Genes and Development 11183-1200)和PinII終止子(An G.等(1989)Plant Cell 1115-122)。這些構建體和所用步驟在上述′379專利中進行了充分描述。注意′379專利描述的實驗中，使用了bar基因，而在此描述的其它實驗中則使用了玉米的優(yōu)化pat基因。圖3列出了玉米的優(yōu)化pat基因序列(SEQ ID NO2)。
轉化和組織培養(yǎng)以生產表達親和素的植物將“HiII”玉米植物單一未成熟胚來源的已建立的愈傷組織系(Armstrong CL，Green CE，Phillips RL(1991)Maize Gen.Coop.Newsletter，6592-93)用氨能粒子加速裝置PDS1000(Bio-Rad，Hercules，CA)進行粒子轟擊介導的轉化。HiII是研究中常用的玉米品系，原因是它易于轉化。根據Tomes等操作步驟(Tomes DT，Ross MC，Songstad DD(1995)植物細胞組織和器官培養(yǎng)基本方法.Springer-Verlag，Berlin，Heidelberg.第197-213頁)，呈現出松散的II型胚性形態(tài)的組織在與等摩爾數的親和素基因(pPHI5168)和bar篩選標記基因(PHP610)共轉化前過710m篩。根據Register等的方法(Register J.C.-III等(1994)，Plant Mol.Biol.25951-961)，表達bar基因的轉化體在雙丙氨膦(3mgl-1)的存在下篩選。用ELISA篩選所選出的克隆來鑒定同時表達親和素基因的共轉化體。由表達親和素的克隆再生許多植株(T0代)，轉移至溫室，用于分析葉組織中親和素的表達。T1代種子通過異型雜交得到，雜交以T0代植株作母本，未轉化近交系(PHN46；見美國專利第5,567,861號)作父本。
用ELISA檢測玉米中的親和素下列步驟用于檢測種子中親和素的表達。將種子磨成粉，用含有0.05％Tween-20的10mM PBS pH7.0(PBST)提取?？偟鞍子肂radford微量滴定分析法定量(Bradford，M.M.1976.一種利用蛋白染料結合原理定量微克級蛋白的快速而敏感的方法，Anal.Biochem.72248-254)。ELISA是一種典型的三明治類型，其中微量滴定平板用兔抗親和素抗體包被，親和素在4℃結合過夜，平板與山羊抗親和素抗體(Vector Labs，Burlingame，CA)反應，然后用抗山羊堿性磷酸酶結合物(Jackson Immunoresearch，WestGrove，PA)反應。堿性磷酸酶用對硝基苯磷酸鹽檢測，用SpectroMax platereader(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在405nm處讀數。
實施例2LtB轉化植物與表達檢測LtB序列及其導入植物在美國專利第6,194,560號中描述，其序列和方法在本實驗中使用，并作為參考文獻列入此處。這里所用載體與′560專利中所述的載體在某些方面不同。這里用的是PGN7101，如圖4所示。合成了人源的大腸桿菌株系的LtB基因(Leong等(1985)人源和豬源的大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位順反子的核苷酸序列比較，Infect Immun.Apr；48(1)73-7)，并優(yōu)化了用于玉米的密碼子使用，見圖5A(SEQ ID NO3)?？缭皆摶虻墓押塑账嵬嘶疬B接，產物用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增。利用PCR的方法，將編碼大麥α-淀粉酶分泌信號(BAASS)的寡核苷酸序列加到LtB的N末端，得到的整個BAASSLtB序列片段插入到載體骨架中，得到質粒PGN5431。該BAASSLtB序列如圖5B所示(SEQ ID NO4)。使用限制性酶NcoI和HpaI將BAASSLtB序列從PGN5431上切掉，然后連接到PGN2774載體的相應限制性位點，得到中間載體PGN7020。在該中間載體中，BAASSLtB位于命名為PGNpr1(野生型玉米聚合泛素-1)的泛素調節(jié)體系玉米組成型啟動子和非翻譯前導序列的3′，并位于馬鈴薯蛋白酶抑制劑II轉錄終止子(PinII)的5′端。使用限制性酶NheI和NotI將該BAASSLtB表達盒(啟動子、前導序列、BAASSLtB和Pin II序列)從PGN7020上切下，連接到植物轉化載體PGN3770的相應位點。最終的BAASSLtB轉化載體命名為PGN7101，包含根癌農桿菌Ti質粒來源的右邊界和左邊界序列、以及綠色產色鏈霉菌(Streptomyces viridichromogenes)的pat基因，該pat基因賦予草銨膦抗性。
實施例3IPNV轉化植物與表達檢測傳染性胰臟壞死病毒(IPNV)感染軟體動物、甲殼動物和多種魚類，特別是鮭魚。IPNV感染可對鮭魚養(yǎng)殖具有破壞性影響，因為魚在魚苗或三齡鮭階段死亡，以及存活種群的生長減低。已有多種嘗試來產生預防該病毒的有效疫苗。到目前為止，只有注射的滅活病毒能夠起到保護作用，而這種疫苗價格昂貴不適于實用。該病毒的主要結構和免疫原性蛋白VP2和VP3利用上述方法在玉米中得以表達。
VP2和VP3的核苷酸序列最初分別從質粒pUK-NVP2和pUK-NVP3獲得。這兩個質粒的蛋白序列來源于一種與N1菌株親緣關系接近的挪威IPNV菌株。在該基因序列的5′和3′端進行了一些核苷酸修飾來優(yōu)化玉米的密碼子使用。
用聚合酶鏈式反應(PCR)，在pUK-NVP2的VP2序列的5’端退火一段pUK-NVP2上VP2基因所沒有的、編碼5′VP2序列并具有進行了核苷酸變化以優(yōu)化密碼子的寡核苷酸序列。利用PCR的方法，在pUK-NVP2的VP2序列的3’端加上一段這樣的寡核苷酸序列和馬鈴薯蛋白酶抑制劑II轉錄終止子序列(PinII)(An等，Plant Cell(1989)1115-122)，其中所述寡核苷酸序列編碼在VP2的3’端優(yōu)化密碼子的核苷酸變化。這兩個PCR片段同利用限制性酶SacII和BbsI從pUK-NVP2上切下的內部VP2片段連接在一起，得到質粒PGNK5676，該質粒包含完整的VP2核苷酸序列(SEQ IDNO5)，如圖6所示。利用PCR在恢復的VP2基因的N末端加入編碼大麥α-淀粉酶分泌信號(BAASS)的寡核苷酸序列。PCR得到的片段被置于載體骨架中，得到質粒PGNK5443，該質粒含有BAASSVP2核苷酸序列(SEQ ID NO6)，如圖7所示。
利用PCR，在pUK-NVP3的VP3序列的5’端和3’端均退火這樣的寡核苷酸，這些寡核苷酸編碼進行了玉米密碼子優(yōu)化的核苷酸變化。PCR片段插入載體骨架得到質粒PGNK5581，該質粒含有部分優(yōu)化的VP3序列(SEQ ID NO7)，如圖8所示。利用PCR的方法，將一段編碼BAASS的寡核苷酸序列加到VP3的N末端。該PCR片段插入載體骨架，得到質粒PGNK5330，該質粒含有BAASSVP3序列(SEQ ID NO8)，如圖9所示。
構建了兩個獨立的植物轉化載體，每個載體都含有VP2和VP3基因。第一個構建體包含BAASSVP2和BAASSVP3序列，每一序列都在獨立的表達盒上，所述表達盒包含玉米種子的優(yōu)化啟動子(命名為PGNpr2)以及PinII終止子。用限制性酶NcoI和PacI將BAASSVP2序列從PGNK5443上切下。該片段與用HindIII和NcoI切下的PGNpr2片段一起連接到PGN9004植物轉化載體的HindIII和PacI酶切位點，該載體包含PinII終止子、根癌農桿菌Ti質粒來源的右邊界和左邊界序列、以及綠色產色鏈霉菌的pat基因，其中pat基因賦予草銨膦抗性。該質粒命名為PGNK5461。按相似的方法，用NcoI和PacI將BAASSVP3序列從PGNK5330上切下。該片段與HindIII/NcoI PGNpr2片段一起連接到PGN9004的HindIII和PacI位點，得到質粒PGNK5335。利用限制性酶AscI和PacI將BAASSVP2表達盒從PGNK5461上切下，其中所述表達盒含有PGNpr2啟動子、BAASS、VP2和PinII終止子。利用限制性酶HindIII和MluI將BAASSVP3表達盒從PGNK5335上切下，其中所述表達盒含有PGNpr2啟動子、BAASS、VP3和PinII終止子。這兩個片段連接到PGN9004的HindIII和PacI限制性位點，得到最終的植物轉化載體，該載體包含BAASSVP2和BAASSVP3表達盒。這個構建體命名為PGN9084(圖10)，其設計為蛋白質被轉運到細胞壁，主要在種子中積累。然后根據改良的Ishia方法進行植物轉化，如上所述。轉化PGN9084得到的植株命名為NVA。
第二個植物轉化載體同樣包含VP2和VP3，VP2和VP3在各自獨立的表達盒中處于PGNpr2啟動子和PinII終止子的控制下，但沒有大麥α-淀粉酶分泌信號(BAASS)。用限制性酶BbsI和BstBI將VP2序列的5’部分直至BstBI限制性位點(包含此位點)從PGNK5573上切下。該片段和HindIII/NcoI PGNpr2片段連接至PGNK5461的HindIII和BstBI位點，得到質粒PGNK5676，該質粒含有VP2表達盒。用限制性酶NcoI和PacI將VP3序列從PGNK5581上切下。該片段和HindIII/NcoI PGNpr2片段連接至PGN9004的HindIII和PacI位點，得到含有VP3表達盒的質粒PGNK5681。用限制性酶AscI和PacI將VP2表達盒從PGNK5676上切下。用HindIII和MluI酶將VP3表達盒從PGNK5681上切下。這兩個片段連接到PGN9004的HindIII和PacI酶切位點，得到最終的植物轉化載體，包含VP2和VP3表達盒。這個構建體命名為PGN9111(圖11)，其設計為蛋白質被轉運到胞質，主要在種子中積累。轉化PGN9111得到的植株命名為NVB。
使用抗IPNV全病毒的多克隆抗體進行Western印跡分析表明，VP2和VP3蛋白在NVA和NVB種子中均表達。在Western印跡膜上，NVA種子中表達的VP2和VP3蛋白比在IPNV全病毒中發(fā)現的相應天然蛋白略大(圖12)。第一泳道為蛋白分子量標記，第2-4泳道是IPNV全病毒的純化物，第5泳道是玉米種子提取物對照，陰性對照，第6-11泳道是不同NVA種子的提取物，第12泳道是IPNV全病毒的未純化物。(注釋，全病毒的純化處理在點樣孔上部產生彌散。)因為VP2和VP3蛋白由BAASS靶向NVA種子的細胞壁，所以預計這些蛋白將被糖基化。不愿受限于理論，這兩種蛋白的大小均增加可能表明蛋白在植物體內進行了糖基化。在Western印跡中，NVB種子中表達的VP2和VP3蛋白與IPNV全病毒標準株相比，均為預期大小(圖13)。第一泳道為蛋白分子量標記，第2泳道是NVA種子提取物，第3-9泳道是不同NVB種子的提取物，第10-12泳道是IPNV全病毒未純化物，上樣量逐一增加。
因為這些蛋白在植物細胞的胞質中表達，預想沒有蛋白修飾發(fā)生。
VP2和VP3在NVA種子中的表達量用Western印跡來估測。種子提取物的VP2和VP3蛋白條帶的強度由點密度測量方法測量，然后與全病毒已知量的條帶比較。使用這種方法計算得到，VP2在NVA T2代種子中的表達為0.1％TSP(總可溶性蛋白)，而VP3在NVA T2代種子中的表達為0.3％TSP。VP2在NVB種子中的表達水平用ELISA方法測定。ELISA是一種典型的三明治類型，其中微量滴定平板用綿羊抗IPNV全病毒抗血清包被，植物提取物中的IPNV蛋白在4℃結合過夜，平板與AS1小鼠抗VP2單克隆抗體反應，然后與連接有堿性磷酸酶的綿羊抗小鼠IgG反應。堿性磷酸酶用對硝基苯磷酸二鈉鹽(pNpp)檢測，用光吸收酶標儀在405nm處讀數。使用這種方法，VP2在NVB T1代種子中的表達定量為在最高的單個種子中0.17％TSP。
實施例4親和素和LtB飼喂研究為在魚中評價這項新技術，設計本實驗來確定口服含有玉米表達的重組標記蛋白的食物是否能在鮭魚中誘導體液免疫應答。每天給大西洋鮭魚飼喂約占體重2％的食物，用含有兩種劑量的未經純化的玉米表達LtB(占食物的5％或10％)或雞卵白親和素(占食物的10％或20％)的食物飼喂5天、12天常規(guī)食物和5天處理的食物。同時也用純化的LtB和親和素對魚進行腹膜內注射，作為陽性對照。
檢測了魚的生長、重組蛋白在魚糞中的持續(xù)性和體液免疫應答。比較了不同LtB劑量及不同親和素劑量下魚的抗體應答，以前已表明LtB能夠在小鼠中生產強烈的抗體應答，而親和素在小鼠中是一個較弱的抗原。
每條大西洋鮭魚重約20g。共有11個處理組，包括多個陰性和陽性對照組(表1)。A和B陽性對照組，每組由10條魚組成，以油為佐劑進行腹膜內注射。A組每條魚接受4μg LtB蛋白的單次注射，B組每條魚接受20μg親和素的單次注射，上述兩種蛋白均為從玉米表達系統(tǒng)中純化的重組蛋白。其余9組各包含35條魚，C組至G組為陰性對照。C組接受商業(yè)魚食丸。D組接受包含5％非轉基因玉米胚的魚食丸。E組接受10％非轉基因玉米胚的魚食丸。F組接受含10％非轉基因玉米粉的魚粉丸。G組接受含20％非轉基因玉米粉的魚食丸。在實驗組中，H組接受含5％LtB轉基因玉米胚的魚食丸，而I組接受含10％LtB玉米胚的魚食丸。J組接受含10％轉基因親和素玉米粉的魚食丸，而K組接受含20％親和素玉米粉的魚食丸。
表1
*每條魚腹膜內(ip)注射0.1mL PBS，PBS中含有以油為佐劑的4μg純化的重組Lt-B(A組)，或20μg親和素(B組)。
魚在10℃下培養(yǎng)。飼喂后2、4、7、14和21天，從9個限定飲食的實驗組C-K，各處死5條魚用ELISA法檢測重組蛋白在魚糞中的持續(xù)性。在8周時，全部11個組，每組處死10條魚稱重，用ELISA法測定血清中的特異抗體。
ELISA檢測魚糞中的標記蛋白ELISA是一種典型的三明治類型，其中微量滴定平板用兔抗親和素或抗LtB的抗體4℃包被過夜。魚糞樣品用PBST稀釋，加入孔中，平板在4℃培養(yǎng)過夜以使親和素或LtB蛋白結合。平板與山羊抗親和素抗體(Vector Labs，Burlingame，CA)或小鼠生物素化LtB抗體反應，然后與抗山羊堿性磷酸酶結合物(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)或ExtraAvidin-堿性磷酸酶(Sigma-Aldrich Canada Ltd.，Oakdale，ON)反應。堿性磷酸酶用對硝基苯磷酸鹽(Pierce，分銷商MJS Biolynx Inc.，Brockville，ON，Canada)檢測，用平板讀數儀(BioTek Instruments Inc.，Vermont)在405nm處讀數。
ELISA檢測魚血清中的抗親和素和抗LtB的特異抗體用三明治式ELISA法檢測魚血清中的特異抗體。平板加樣孔用純化的LtB或純化的玉米表達的親和素4℃包被過夜，加入魚血清的PBST-1％BSA兩倍稀釋液，然后將平板在17℃培養(yǎng)過夜，使魚抗體結合。向平板中加入一級抗體即抗大西洋鮭魚單克隆抗體Ig(Cedarlane Laboratories Ltd.，ON，Canada)、然后加入堿性磷酸酶標記的抗小鼠Ig二級抗體(Cedarlane)，上述抗體均在PBST-1％BSA中稀釋。加入對硝基苯磷酸鹽底物(Pierce)后，用微量滴定板讀數儀(BioTek Instruments)在405nm處讀吸光度。在稀釋終點計算抗體效價。
在飼料中加入表達兩種標記蛋白的玉米粉不影響魚的生長，如圖14所示。在魚糞中，兩種標記蛋白在延長的一段時間內，至少在停止飼喂處理飼料后的21天可檢測到，如表2所示。
表2飼喂后的天數
經口施用標記蛋白誘導體液免疫應答。在接種后8周，只有陰性對照組的魚沒有可檢測到的特異血清抗體應答。飼喂未純化的玉米表達標記蛋白的魚所產生的抗體應答與注射以油為佐劑的純蛋白的魚一樣強，如圖15所示。
實施例5IPNV飼喂研究在本實施例中，將進行所述飼喂含有傳染性胰臟壞死病病毒VP2和VP3蛋白的玉米的方法，預期在動物的糞便和器官中會有病毒蛋白存在并產生了免疫反應。當魚在接受毒力病毒的攻擊后，預期經口施用玉米表達的IPNV蛋白會產生保護。
魚將被分成7組，加標記用以識別。陽性對照組A由注射誘導免受IPNV的保護性商業(yè)疫苗的魚組成，而陰性對照組B將被飼喂商業(yè)飼料丸。其余的組用含有或不含表達的IPNV蛋白的玉米胚飼料飼喂5天，用常規(guī)飼料飼喂12天，用含有玉米胚的飼料飼喂5天，如表3所列。玉米胚加入飼料中的百分比(玉米g/飼料g)為10％和20％。
接種疫苗后4周，所有的魚將在咸水中馴化幾天，然后在流動的咸水中培養(yǎng)，周圍溫度為9-12℃。轉移到咸水后在5周，魚將與IPNV共生進行攻擊試驗。首次用作實驗的魚將被注射活的IPNV，然后加入到含有已接種的魚的水槽中。將對每日的死亡率監(jiān)測五周。以周為單位，從接種后1周到5周和攻擊試驗進行時，將組C至組G每組取5條魚處死，取魚的糞便和器官檢測IPNV蛋白的持續(xù)性和分布。在攻擊試驗中處死的魚，包括組A和組B的5條魚，將同樣被采血，用ELISA法檢測血清中的抗體。
權利要求
1.植物來源的重組氨基酸序列在生產用于治療性或預防性治療魚的藥物中的用途，其中當給魚施用時，該重組氨基酸序列產生抗原性或免疫原性反應。
2.如權利要求1所述的用途，其中所述氨基酸序列是在魚中引發(fā)疾病或病理的生物體的抗原。
3.如權利要求1或2所述的用途，其中藥物用于經口施與魚。
4.如權利要求3所述的用途，其中將藥物制劑為用于經口遞送給魚。
5.如權利要求4所述的用途，其中所述藥物為食用飼料丸形式。
6.如前述權利要求任意一項中所述的用途，其中所述藥物包含轉基因植物材料。
7.如前述權利要求任意一項中所述的用途，其中所述重組氨基酸序列是IPNV的VP2或VP3蛋白、或其任一具有免疫原性的部分。
8.如權利要求7所述的用途，其中所述重組氨基酸序列由摻入任一SEQ ID No.5、6、7或8的DNA序列編碼。
9.如前述權利要求任意一項中所述的用途，其中所述魚是鮭科魚。
10.如前述權利要求任意一項中所述的用途，其中所述重組氨基酸序列來源于玉米(Zea mays)。
11.一種魚飼料，其包含植物來源的重組氨基酸序列。
12.如權利要求11所述的飼料，其中所述重組氨基酸序列是引發(fā)魚疾病或病理的生物體的抗原。
13.如權利要求11或12所述的飼料，其中所述重組氨基酸序列包含于植物組織中，任選地包含于種子組織中。
14.如權利要求12或13所述的飼料，其中所述重組氨基酸序列是IPNV的VP2或VP3蛋白、或其任一具有免疫原性的部分。
15.如權利要求11-14任一項所述的飼料，該飼料還包含至少一種營養(yǎng)物或賦形劑。
16.制備魚用口服疫苗制劑的方法，該方法包括將植物來源的重組氨基酸序列或包含所述氨基酸序列的轉基因植物材料與一種或多種賦形劑和任選地與一種或多種營養(yǎng)物混合。
17.包含編碼氨基酸序列的核苷酸序列的植物細胞，當給魚施用時其中所述氨基酸序列產生抗原性或免疫原性反應。
18.如權利要求17所述的植物細胞，其中所述氨基酸序列是引發(fā)魚疾病或病理的生物體的抗原。
19.經人工設計以表達編碼氨基酸序列的核苷酸序列的轉基因植物或轉基因植物材料，當給魚施使用時其中所述氨基酸序列產生抗原性或免疫原性反應。
20.權利要求19所述的轉基因植物的種子。
21.免疫魚而使其抗病的方法，其包括給魚施用包含植物來源的重組氨基酸序列的組合物，其中所述氨基酸序列是引起魚疾病或病理的生物體的抗原。
22.如權利要求21所述的方法，其中組合物經口施與魚。
23.一種飼喂魚的方法，其包括給魚飼喂包含編碼氨基酸序列的核苷酸序列的植物或來自所述植物的植物材料，當給魚施用時，其中所述氨基酸序列在所述魚中產生抗原性或免疫原性反應。
24.如權利要求23所述的方法，其中所述氨基酸序列是引起魚疾病或病理的生物體的抗原。
25.給魚施用抗原性或免疫原性氨基酸序列的方法，該方法包括用編碼所述氨基酸序列的核苷酸序列轉化植物，給魚施用該氨基酸序列，從而在所述魚中產生抗原性或免疫原性反應。
26.如權利要求25所述的方法，其中所述氨基酸序列是引發(fā)魚疾病或病理的生物體的抗原。
27.如權利要求25或26所述的方法，其中所述氨基酸序列經口施與魚。
28.通過在植物細胞中表達而獲得的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列對引發(fā)魚疾病或病理的生物體而言是內源的。
全文摘要
產生了表達氨基酸序列的植物，當給魚施用時所述氨基酸序列產生抗原性或免疫反應。在一個實施方案中，氨基酸序列為來自IPNV的抗原，其中所述IPNV為引發(fā)魚病害的生物體?？蓪⒅参锝M織喂飼魚，或將植物組織與其他物質混合并喂飼魚，或提取植物組織并施與魚。
文檔編號A61K39/12GK1738903SQ200380108726
公開日2006年2月22日 申請日期2003年12月12日 優(yōu)先權日2002年12月13日
發(fā)明者K·貝福斯, L·M·布特蘭德 申請人:諾瓦提斯公司, 普羅地基因公司