專利名稱：針對腫瘤壞死因子的抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對抗原腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factoralpha)(以下簡稱TNFα)的抗體，以及此類抗體的用途。更具體地，本發(fā)明涉及針對抗原TNFα的完全人源單克隆抗體以及此類抗體的用途。本發(fā)明還涉及可以表達(dá)此類抗體的雜交瘤或其他細(xì)胞系。此類抗體可用于診斷和治療與TNFα的活性和/或過量產(chǎn)生有關(guān)的疾病。
背景技術(shù)：
TNFα已證明涉及傳染性疾病、免疫紊亂、自身免疫病理、移植物抗宿主疾病(GVHD)、瘤形成(neoplasia)/癌癥和與癌癥有關(guān)的惡病質(zhì)。參見Feldman M.，2002 Nat.Rev.Immunol.，2364。具體而言，TNFα水平在革蘭氏陰性敗血癥(sepsism)、內(nèi)毒素休克(參見Michie等，1989 Br.J.Surg.76670)、克羅恩氏病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中受到顯著誘導(dǎo)。TNFα涉及到如此廣泛的適應(yīng)癥，表明開發(fā)針對這種炎癥細(xì)胞因子的特異生物療法的重要性。
幾位研究人員報(bào)道了針對TNFα的單克隆抗體的特性，所述抗體在體外中和TNFα的活性。參見Liang CM等，1986，Biochem.Biophys Res.Commun.，137847，和Meager A等，1987 Hybridoma6305。這些抗體中的一部分被用作繪制人類TNFα表位圖譜，開發(fā)酶免疫測定，幫助重組TNFα的純化。參見Fendly BM等，1987Hybridoma，6359；Hirai M等，1987 J.Immunol Methods，9657；Moller A等，1990 Cytokine，2162；Bringman TS和Aggarwal BB，1987，Hybridoma，6489。遺憾的是，由于這些研究中所生成的抗體來源于非人類物種并且缺乏對TNFα的特異性，所以不能用作治療人類患者的治療性中和TNFα的抗體。
TNFα的中和抗血清或單克隆抗體已在非人類哺乳動(dòng)物體中顯示出功效即消除不利的病理生理事件，并在實(shí)驗(yàn)性內(nèi)毒素血癥中致死測試之后防止死亡。這些效果已在嚙齒動(dòng)物和非人類靈長類模型系統(tǒng)中得到證實(shí)。參見Beutler B等，1985 Science，229869；Tracey KJ等，1987 Nature，330662；Mathison JC等，1988 J.Clin.Invest.，811925；Shimamoto Y等，1988，Immunol.Lett.，17311；Opal SM等，1990，J.Infect.Dis.，1611148；Silva AT等，1990，J.Infect.Dis.，162454；Hinshaw LB等，1990，Circ.Shock，30279。
目前存在幾種形式的中和抗體，F(xiàn)eldman對此作了綜述。參見Feldman M，2002，Nat.Rev.Immunol.，2364。如綜述中所述，已花費(fèi)了大量的精力來構(gòu)建中和抗體，該中和抗體可以產(chǎn)生用于人類長期給藥的治療適用的抗體。目前，抗體/TNFR融合(fclg/TNFR)蛋白(Enbrel)已經(jīng)顯示出一定的實(shí)用性，但缺點(diǎn)是在血清中的半衰期短，導(dǎo)致頻繁給藥(例如，每周兩次)。長期治療用的針對TNFα的中和治療性抗體只要其本身不具有免疫原性，就會(huì)克服半哀期的問題(每3～4周注射一次)。另有人試圖構(gòu)建具有如下所需特性的TNFα的中和抗體即免疫原性低或無免疫原性，并具有其內(nèi)源對應(yīng)物(counterpart)特有的半衰期，但未獲得成功。所述抗體的例子包括鼠/人嵌合體如英夫利昔單抗(Infliximab，cA2或Remicade)，以及人源化抗體CDP571或阿達(dá)木單抗(Adalimumab，D2E7或Humira)。這些代表了為構(gòu)建與其人類對應(yīng)物極為相似的中和治療抗體所作的努力。
遺憾的是，由于所述藥物固有的潛在免疫原性、較短的半衰期和/或?qū)NFα較弱的親合力/親和力，它們的全部潛能或許并沒有實(shí)現(xiàn)。這些嵌合抗體引起的宿主免疫應(yīng)答能夠?qū)е聦⒖贵w從循環(huán)中清除，使得重復(fù)給藥由于缺少功效而不適于治療。這些問題最終降低了患者的治療效果。使用例如上述抗體或其片段還可能在擴(kuò)增(scale-up)和制造過程中遇到其他問題。
因此，由于以上原因，本領(lǐng)域需要為臨床指示群體(clinicallyindicated population)中的患者提供其它選擇，所述臨床指示群體中TNFα是引起某一特定疾病病理生理學(xué)的原因。用于長期給藥的完全人源、高親和力、中和單克隆抗體，或其片段，提供非免疫原性治療方案所需的特性，其半衰期適用于頻率較低的給藥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的實(shí)施方案涉及與腫瘤壞死因子-α特異性結(jié)合的人源單克隆抗體，該抗體具有氨基酸序列為“Ser Tyr Asp Met His”的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)。這里所述的抗體還可以包括氨基酸序列為“Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser ValLys Gly”的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)，氨基酸序列為“Glu ValGlu Ser Ala Met Gly Gly Phe Tyr Tyr Asn Gly Met Asp Val”的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)，包括SEQ ID NO70所示的氨基酸序列的重鏈氨基酸，以及包括SEQ ID NO74所示的氨基酸序列的重鏈氨基酸。
其它的實(shí)施方案包括人源單克隆抗體，該抗體具有氨基酸序列為“Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ile Asp Leu Gly”的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)。此處所述抗體還可以包括氨基酸序列為“Ala Ala SerThr Leu Gln Ser”的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)，氨基酸序列為“LeuGln His Lys Ser Tyr Pro Leu Thr”的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)，包括如SEQ ID NO72所示的氨基酸序列的輕鏈氨基酸。
其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與腫瘤壞死因子-α特異性結(jié)合的人源單克隆抗體，并且包括氨基酸序列為“Arg Ala Ser Gln GlyIle Arg Ile Asp Leu Gly”的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)，氨基酸序列為“Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser”的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)，氨基酸序列為“Leu Gln His Lys Ser Tyr Pro Leu Thr”的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)。
另外的實(shí)施方案包括人源單克隆抗體，該抗體具有氨基酸序列為“Ser Tyr Asp Met His”的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)，氨基酸序列為“Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp SerVal Lys Gly”的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)，氨基酸序列為“GluVal Glu Ser Ala Met Gly Gly Phe Tyr Tyr Asn Gly Met Asp Val”的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)。
其他實(shí)施方案中，本發(fā)明包括與腫瘤壞死因子-α特異性結(jié)合的人源單克隆抗體，并且包括VH3-33重鏈基因，或其保守性變體。此處所述抗體還可以包括A30VK1輕鏈基因。
本發(fā)明另外的實(shí)施方案包括與腫瘤壞死因子-α特異性結(jié)合的人源單克隆抗體，其中所述抗體包括與典范類(canonical class)1相對應(yīng)的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)。本發(fā)明提供的抗體還可以包括與典范類3相對應(yīng)的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)，與典范類2相對應(yīng)的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)，與典范類1相對應(yīng)的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)，以及與典范類1相對應(yīng)的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)。
其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與腫瘤壞死因子-α特異性結(jié)合的人源單克隆抗體，并且包括氨基酸序列為“Arg Asn Tyr Met Ser”的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)。抗體可以進(jìn)一步包括氨基酸序列為“Val Ile Tyr Ser Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val LysGly”的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)，氨基酸序列為“Gly Glu GlyGly Phe Asp Tyr”的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)，以及氨基酸序列如SEQ ID NO50所示的重鏈氨基酸。
本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，人源單克隆抗體可以包括氨基酸序列為“Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala”的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)，氨基酸序列為“Gly Ala Ser Ile Arg Ala Thr”的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)，氨基酸序列為“Gln Gln Tyr Asn TyrTrp Trp Thr”的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)，以及包括如SEQ IDNO52所示的氨基酸序列的輕鏈氨基酸。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括與腫瘤壞死因子-α特異性結(jié)合的人源單克隆抗體，并且具有氨基酸序列為“Arg Ala Ser GlnSer Val Ser Ser Asn Leu Ala”的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)，氨基酸序列為“Gly Ala Ser Ile Arg Ala Thr”的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)，氨基酸序列為“Gln Gln Tyr Asn Tyr Trp Trp Thr”的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)，氨基酸序列為“Arg Asn Tyr Met Ser”的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)，氨基酸序列為“Val Ile Tyr Ser GlyAsp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly”的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)，以及氨基酸序列為“Gly Glu Gly Gly Phe Asp Tyr”的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與腫瘤壞死因子-α特異性結(jié)合的人源單克隆抗體，并且具有VH3-53重鏈基因，或其保守性變體。此處所述抗體還可以包括L2VK3輕鏈基因。
另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括與腫瘤壞死因子-α特異性結(jié)合的人源單克隆抗體，其中所述抗體包括與典范類1相對應(yīng)的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)。這里的抗體還可以包括與典范類1相對應(yīng)的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)，與典范類2相對應(yīng)的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)，與典范類1相對應(yīng)的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)，以及與典范類3相對應(yīng)的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)。
本發(fā)明還提供檢測患者樣品中腫瘤壞死因子-α(TNFα)水平的方法，該方法包括將抗TNFα的抗體與患者的生物樣品接觸，檢測所述樣品中所述抗體與TNFα的結(jié)合水平。在更具體的實(shí)施方案中，生物樣品為血液。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種組合物，該組合物包括一種抗體或其功能片段，以及可藥用的載體。
本發(fā)明更進(jìn)一步的實(shí)施方案包括有效治療患有腫瘤疾病動(dòng)物的方法，包括選擇需要治療腫瘤疾病的動(dòng)物，向所述動(dòng)物給藥治療有效劑量的與腫瘤壞死因子-α(TNFα)特異性結(jié)合的完全人源單克隆抗體。
可治療的腫瘤疾病包括乳癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和前列腺癌。
本發(fā)明另外的方法涉及有效治療免疫介導(dǎo)的炎性疾病。這些方法包括，選擇需要治療炎性疾病的動(dòng)物，向所述動(dòng)物給藥治療有效劑量的完全人源單克隆抗體，其中所述抗體與腫瘤壞死因子-α(TNFα)特異性結(jié)合。可治療的免疫介導(dǎo)的炎性疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血管球性腎炎、動(dòng)脈粥樣硬化、牛皮癬、再狹窄(restenosis)、自身免疫性疾病、克羅恩氏病、移植物抗宿主反應(yīng)、敗血癥休克、惡病質(zhì)、厭食、強(qiáng)直性脊柱炎和多發(fā)性硬化。
本發(fā)明另外的實(shí)施方案包括在動(dòng)物中抑制腫瘤壞死因子-α(TNFα)誘導(dǎo)的凋亡的方法。這些方法包括，選擇需要治療TNFα誘導(dǎo)的凋亡的動(dòng)物，向所述動(dòng)物給藥治療有效劑量的完全人源單克隆抗體，其中所述抗體與TNFα特異性結(jié)合。
本發(fā)明另外的實(shí)施方案包括抗體在制備治療動(dòng)物腫瘤疾病藥物中的用途，其中所述單克隆抗體與腫瘤壞死因子(TNFα)特異性結(jié)合?？芍委煹哪[瘤疾病可包括乳癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和前列腺癌。
本發(fā)明抗體另外的用途有制備有效治療動(dòng)物免疫介導(dǎo)的炎性疾病的藥物，其中所述單克隆抗體與腫瘤壞死因子(TNFα)特異性結(jié)合?？芍委煹拿庖呓閷?dǎo)的炎性疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血管球性腎炎、動(dòng)脈粥樣硬化、牛皮癬、再狹窄、自身免疫病、克羅恩氏病、移植物抗宿主反應(yīng)、敗血癥休克、惡病質(zhì)、厭食和多發(fā)性硬化。
在另外的實(shí)施方案中，此處所述抗體可以用于制備有效治療動(dòng)物中腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的凋亡的藥物，其中所述單克隆抗體與腫瘤壞死因子(TNFα)特異性結(jié)合。
此處所述的本發(fā)明實(shí)施方案涉及與TNFα結(jié)合并且影響TNFα功能的單克隆抗體。其他實(shí)施方案涉及完全人源抗TNFα抗體和抗TNFα抗體制劑，從治療角度看具有如下所需性能，包括與TNFα的強(qiáng)結(jié)合親和力，在體外和體內(nèi)中和TNFα的能力，以及抑制TNFα誘導(dǎo)的凋亡的能力。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，此處所述抗體以很高的親和力(Kd)與TNFα結(jié)合。例如，人、兔、鼠、嵌合的或人源化的抗體與TNFα結(jié)合的Kd值能小于，但不限于，10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13或10-14M，或者其中的任何數(shù)量級或數(shù)值。此處所述兔源抗體R014，測定的親和力在10-13(fM)數(shù)量級內(nèi)。抗體299V.1和299V.2顯示的親和力在10-13或低數(shù)值的10-12(M)數(shù)量級內(nèi)。親和力和/或親合力量度可以使用KinExA_和/或BIACORE_測定，如本發(fā)明所述。
因此，此處所述的一個(gè)實(shí)施方案包括與TNFα結(jié)合的分離抗體，或抗體的片段。如本領(lǐng)域所公知的，抗體最好是例如單克隆、嵌合和/或完全人源抗體。本發(fā)明此處所述的實(shí)施方案還提供產(chǎn)生這些抗體的細(xì)胞。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是與TNFα結(jié)合的完全人源抗體，并且包括一重鏈氨基酸序列，該序列具有如表31-34所示序列之一的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。需指出的是，CDR的測定可易于由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員實(shí)現(xiàn)。例如參見，Kabat等，Seq uences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，NIH Publication 91-3242，馬里蘭州貝賽斯達(dá) ，第1～3卷。
而另一實(shí)施方案是與TNFα結(jié)合的抗體，并且包括一輕鏈氨基酸序列，該序列具有包括如表32和34所示序列之一的CDR。在某些實(shí)施方案中，抗體為完全人源單克隆抗體。
再一實(shí)施方案是與TNFα結(jié)合的抗體，并且包括一重鏈氨基酸序列，該序列具有如表31和33所示的序列之一；同時(shí)包括一輕鏈氨基酸序列，該序列具有如表32和34所示的CDR序列之一。在某些實(shí)施方案中，抗體為完全人源單克隆抗體。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是與TNFα的其他家族成員，包括但不限于TNFβ，結(jié)合的完全人源抗體。再一實(shí)施方案是與本發(fā)明的完全人源抗體交叉競爭結(jié)合TNFα的抗體。
應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實(shí)施方案不限于任何具體形式的抗體或者產(chǎn)生或生產(chǎn)方法。例如，抗TNFα抗體可以是全長抗體(比如，具有完好的人源Fc區(qū))或者一個(gè)抗體片段(例如，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab’或F(ab’)2)。另外，抗體可以由分泌此抗體的雜交瘤生產(chǎn)，或者由編碼此抗體的單基因或多基因轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的重組生成的細(xì)胞生產(chǎn)。
本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括編碼任何本文所述抗體的分離核酸分子，具有編碼抗TNFα抗體的分離核酸分子的載體，或經(jīng)任何此類核酸分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。另外，本發(fā)明的一實(shí)施方案是通過在一定條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞來生產(chǎn)抗TNFα抗體的方法，此條件下核酸分子表達(dá)以產(chǎn)生抗體，然后回收此抗體。
再一實(shí)施方案包括通過使用人源TNFα或其片段，以及一個(gè)或多個(gè)直向同源序列或其片段使哺乳動(dòng)物產(chǎn)生免疫，從而生產(chǎn)高親和力抗體的方法。
其他實(shí)施方案是基于與TNFα特異性結(jié)合的分離抗體的產(chǎn)生和識(shí)別。TNFα在腫瘤性疾病中表達(dá)水平提高，比如在腫瘤和其他炎性疾病中。抑制TNFα的生物活性可以防止發(fā)炎和其他預(yù)期效應(yīng)，包括TNFα誘導(dǎo)的凋亡。
本發(fā)明另一實(shí)施方案包括利用本文所述方法制備的抗體檢測患者樣品中TNFα水平來診斷疾病或病癥的方法。在一實(shí)施方案中，患者樣品為血液或血清。另外的實(shí)施方案中，提供了識(shí)別危險(xiǎn)因子、診斷疾病和判斷病期的方法，該方法涉及使用抗TNFα抗體識(shí)別TNFα的過量表達(dá)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案包括診斷細(xì)胞中與TNFα表達(dá)相關(guān)的病癥的方法，具體先將細(xì)胞與抗TNFα的抗體接觸，然后檢測TNFα的存在。優(yōu)選的疾病包括但不限于腫瘤性疾病，其包括但不限于腫瘤、癌癥，比如乳癌、卵巢癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、直腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、前列腺癌和膀胱癌。在另一實(shí)施方案中，抗TNFα的抗體可以用于診斷炎性疾病，包括但不限于動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄、自身免疫性疾病，免疫介導(dǎo)的炎性疾病(IMID)，包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、葡萄膜炎(例如兒童和血清陰性)、狼瘡，以及由免疫復(fù)合物介導(dǎo)的其他疾病，比如天皰瘡和腎小球腎炎、先天性甲狀腺功能亢進(jìn)(CH)、遲發(fā)型過敏反應(yīng)(DTH)比如接觸性過敏、肉樣瘤病、貝堤特氏病、慢性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、成人史提爾氏病、原發(fā)性干燥癥、硬皮病、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、SAPHO綜合癥、原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)、肉樣瘤病、骨髓發(fā)育不良癥候群、Wegener綜合癥和其他血管炎、血液腫瘤、耳蝸前庭紊亂、巨噬細(xì)胞活化綜合癥、哮喘、間質(zhì)性肺疾病、丙型肝炎、肺纖維癥、誘導(dǎo)排卵、骨髓發(fā)育不良癥候群、克羅恩氏病、移植物抗宿主反應(yīng)、敗血癥休克、惡病質(zhì)、厭食和多發(fā)性硬化?？贵w可以診斷的其他疾病公開在頒給Salfeld等的美國專利6,090,382，頒給Barbanti等的美國專利5,436,154中。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一化驗(yàn)試劑盒，用來在哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞中檢測TNFα或TNFα家族成員以識(shí)別腫瘤疾病或炎性疾病。試劑盒包括可與TNFα結(jié)合的抗體，以及顯示抗體與TNFα反應(yīng)的裝置，如果有TNFα存在的話?？贵w優(yōu)選單克隆抗體。在一實(shí)施方案中，與TNFα結(jié)合的抗體被標(biāo)記。在另一實(shí)施方案中，抗體為未標(biāo)記的一次抗體，試劑盒還包括檢測此一次抗體的裝置。在一實(shí)施方案中，此裝置包括標(biāo)記的二次抗體，即抗免疫球蛋白?？贵w優(yōu)選使用選自熒光染料、酶、放射性核素和不透輻射材料的標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括藥物組合物，該組合物含有與可藥用的載體或稀釋劑混合的有效量的抗TNFα的抗體。在另一實(shí)施方案中，抗TNFα的抗體或其片段與治療劑結(jié)合。治療劑可以是，例如，一種毒素或一種放射性同位素。這些抗體優(yōu)選用于治療的疾病，包括例如腫瘤、癌癥，比如乳癌、卵巢癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、直腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、前列腺癌和膀胱癌，還有其他炎性疾病，包括但不限于動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄、自身免疫性疾病，免疫介導(dǎo)的炎性疾病(IMID)，包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、葡萄膜炎(例如兒童和血清陰性)、狼瘡，以及由免疫復(fù)合物介導(dǎo)的其他疾病，比如天皰瘡和腎小球腎炎、先天性甲狀腺功能亢進(jìn)(CH)、遲發(fā)型過敏反應(yīng)(DTH)比如接觸性過敏、肉樣瘤病、貝堤特氏病、慢性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、成人史提爾氏病、原發(fā)性干燥癥、硬皮病、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、SAPHO綜合癥、原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)、肉樣瘤病、骨髓發(fā)育不良癥候群、Wegener綜合癥和其他血管炎、血液腫瘤、耳蝸前庭紊亂、巨噬細(xì)胞活化綜合癥、哮喘、間質(zhì)性肺疾病、丙型肝炎、肺纖維癥、誘導(dǎo)排卵、骨髓發(fā)育不良癥候群、克羅恩氏病、移植物抗宿主反應(yīng)、敗血癥休克、惡病質(zhì)、厭食和多發(fā)性硬化?？贵w可以治療的其他疾病公開在頒給Salfeld等的美國專利6,090,382，頒給Barbanti等的美國專利5,436,154中。
另一實(shí)施方案包括通過向患者給藥有效量的抗TNFα的抗體，治療患者與TNFα表達(dá)有關(guān)的疾病或病癥的方法。該方法可在體內(nèi)進(jìn)行，患者優(yōu)選為人類患者。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法涉及治療腫瘤、癌癥，比如乳癌、卵巢癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、直腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、前列腺癌和膀胱癌。其他實(shí)施方案中，炎性疾病包括但不限于動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄、自身免疫性疾病，免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病(IMID)，包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、葡萄膜炎(例如兒童和血清陰性)、狼瘡，以及由免疫復(fù)合物介導(dǎo)的其他疾病，比如天皰瘡和腎小球腎炎、先天性甲狀腺功能亢進(jìn)(CH)、遲發(fā)型過敏反應(yīng)(DTH)比如接觸性過敏、肉樣瘤病、貝堤特氏病、慢性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、成人史提爾氏病、原發(fā)性干燥癥、硬皮病、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、SAPHO綜合癥、原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)、肉樣瘤病、骨髓發(fā)育不良癥候群、Wegener綜合癥和其他血管炎、血液腫瘤、耳蝸前庭紊亂、巨噬細(xì)胞活化綜合癥、哮喘、間質(zhì)性肺疾病、丙型肝炎、肺纖維癥、誘導(dǎo)排卵、骨髓發(fā)育不良癥候群、克羅恩氏病、移植物抗宿主反應(yīng)、敗血癥休克、惡病質(zhì)、厭食和多發(fā)性硬化?？贵w可以治療的其他疾病公開在頒給Salfeld等的美國專利6,090,382，頒給Barbanti等的美國專利5,436,154中。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一件產(chǎn)品，其中包括一個(gè)容器。該容器包括含有抗TNFα的抗體的組合物，以及藥品說明書或標(biāo)簽，用以說明該組合物可用于治療以TNFα的過量表達(dá)為特征的腫瘤疾病或炎性疾病。
在一些實(shí)施方案中，向患者給藥抗TNFα的抗體后，再給藥清除劑(clearing agent)以除去血液中過量的循環(huán)抗體。
在一些實(shí)施方案中，可以修飾抗TNFα的抗體以提高其固定補(bǔ)體和參與補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)的能力。在一實(shí)施方案中，可以通過例如氨基酸替換，修飾抗TNFα的抗體，以改變從身體中的清除效果。還有，另一些的氨基酸替換可以減慢抗體從身體中的清除。
另一實(shí)施方案是抗TNFα的抗體在制備治療疾病，比如腫瘤疾病和炎性疾病的藥物中的用途。在一實(shí)施方案中，腫瘤性疾病包括腫瘤和癌癥，比如乳癌、卵巢癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、直腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、前列腺癌和膀胱癌。在另一實(shí)施方案中，炎性疾病包括但不限于動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄、自體免疫性疾病，免疫介導(dǎo)的炎性疾病(IMID)，包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、葡萄膜炎(例如兒童和血清陰性)、狼瘡，以及由免疫復(fù)合物介導(dǎo)的其他疾病，比如天皰瘡和腎小球腎炎、先天性甲狀腺功能亢進(jìn)(CH)、遲發(fā)型過敏反應(yīng)(DTH)比如接觸性過敏、肉樣瘤病、貝堤特氏病、慢性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、成人史提爾氏病、原發(fā)性干燥癥、硬皮病、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、SAPHO綜合癥、原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)、肉樣瘤病、骨髓發(fā)育不良癥候群、Wegener綜合癥和其他血管炎、血液腫瘤、耳蝸前庭紊亂、巨噬細(xì)胞活化綜合癥、哮喘、間質(zhì)性肺疾病、丙型肝炎、肺纖維癥、誘導(dǎo)排卵、骨髓發(fā)育不良癥候群、克羅恩氏病、移植物抗宿主反應(yīng)、敗血癥休克、惡病質(zhì)、厭食和多發(fā)性硬化?？贵w可以治療的其他疾病公開在頒給Salfeld等的美國專利6,090,382，頒給Barbanti等的美國專利5,436,154中。


圖1的柱狀圖說明了在人類WM266細(xì)胞中，由不同雜交瘤來源的人源抗TNFα結(jié)合抗體中和TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的效果。該圖使用半胱氨酸蛋白酶(caspase)活性作為TNFα誘導(dǎo)的凋亡的量度。
圖2的散點(diǎn)圖比較了一定濃度范圍內(nèi)B細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的抗體和對照抗體(4.17IgG2)與抗TNFα限制性抗原結(jié)合的能力。三角形代表B細(xì)胞培養(yǎng)上清液克隆，方塊代表Bar抗體(4.17IgG2)。對應(yīng)點(diǎn)在Bar抗體曲線之上的B細(xì)胞培養(yǎng)上清液克隆被歸作具有潛在高親和力的一類。
圖3是在人類MCF-7細(xì)胞中，對不同XENOMAX_B細(xì)胞培養(yǎng)上清液抑制TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的效率進(jìn)行比較的代表性柱狀圖。
圖4所示的代表性散點(diǎn)圖對人類MCF-7細(xì)胞上，XENOMAX_B細(xì)胞培養(yǎng)上清液中和TNFα誘導(dǎo)的凋亡的計(jì)算效能進(jìn)行了比較。三角形代表B細(xì)胞培養(yǎng)上清液的效能，而方塊代表Bar對照抗體3.2IgG2的效能。
圖5是使用ELISA法將抗TNF試劑與大腸桿菌表達(dá)的可溶性人源TNF結(jié)合的線狀圖。
圖6是使用ELISA法將抗TNF試劑與大腸桿菌表達(dá)的可溶性獼猴TNF結(jié)合和交叉反應(yīng)的線狀圖。
圖7所示的代表性線狀圖表示用來計(jì)算IC50值的中和抗TNFα抗體的滴定曲線的一個(gè)實(shí)例?？筎NFα試劑與100pg/ml TNFα在37℃下預(yù)溫育1小時(shí)。中和作用使用MCF-7細(xì)胞進(jìn)行，并且作為碘化丙錠和Heochst 33342染色的比例探測。
圖8所述的代表線狀圖表示用來計(jì)算IC50值的中和抗TNFα試劑的滴定曲線的一個(gè)實(shí)例?？筎NFα抗體與100pg/ml TNFα在37℃下預(yù)溫育18小時(shí)。中和作用使用MCF-7細(xì)胞進(jìn)行，并且作為碘化丙錠和Heochst 33342染色的比例探測。
圖9是顯示抗TNFα中和的IC50平均值的柱狀圖。中和和IC50值的計(jì)算按照圖8的說明進(jìn)行。
圖10是顯示抗TNFα中和的IC50平均值的柱狀圖。中和實(shí)驗(yàn)在人類WM266細(xì)胞上進(jìn)行，測定半胱氨酸蛋白酶活性作為TNFα誘導(dǎo)的凋亡的量度?？贵wIC50值的計(jì)算按照圖7的說明進(jìn)行。
圖11是使用ELISA法測量的抑制TNF誘導(dǎo)的IL-8的全血檢測的線狀圖。滴定曲線用來計(jì)算IC50值。
圖12是使用抗TNF試劑對TNFα誘導(dǎo)的肝衰竭的體內(nèi)抑制作用的代表性線狀圖。通過測定血清酶丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的活性來確定TNFα和D-GalN誘導(dǎo)的肝損傷的程度。滴定曲線用來計(jì)算IC50值。
圖13是使用抗TNF試劑對TNFα誘導(dǎo)的IL-6的體內(nèi)抑制作用的代表性線狀圖，由ELISA法測定。滴定曲線用來計(jì)算IC50值。
具體實(shí)施例方式
本文所述發(fā)明的實(shí)施方案涉及與TNFα結(jié)合的單克隆抗體。在某些實(shí)施方案中，抗體與TNFα結(jié)合并且影響TNFα的功能。另外的實(shí)施方案提供完全人源抗TNFα抗體和抗TNFα抗體制品，該制品從治療角度看具有如下所需性能，包括與TNFα的強(qiáng)結(jié)合親和力，在體外中和TNFα的能力，在體內(nèi)抑制TNFα誘導(dǎo)的肝損傷的能力，以及在體內(nèi)抑制TNFα誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6的能力。
因此，本發(fā)明的實(shí)施方案包括與TNFα結(jié)合的分離抗體，或這些抗體的片段。如本領(lǐng)域所公知的，抗體最好是完全人源單克隆抗體。本發(fā)明的實(shí)施方案還提供了可產(chǎn)生這些抗體的細(xì)胞。
另外，本發(fā)明的實(shí)施方案提供利用這些抗體作為診斷工具或用于治療疾病。例如，本發(fā)明的實(shí)施方案提供抑制TNFα表達(dá)的方法和抗體，所述TNFα表達(dá)與下列疾病有關(guān)傳染病、免疫紊亂、自身免疫病、移植物抗宿主疾病(GVHD)、瘤形成、癌癥有關(guān)的惡病質(zhì)、革蘭氏陰性敗血癥、內(nèi)毒素性休克、克羅恩氏病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎?？贵w優(yōu)選用于治療癌癥，比如乳癌、卵巢癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、直腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、前列腺癌和膀胱癌，還有其他炎性疾病，包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎小球性腎炎、動(dòng)脈粥樣硬化、牛皮癬、器官移植、再狹窄和自身免疫病。與此治療相關(guān)，提供了包括本文所述抗體在內(nèi)的數(shù)種產(chǎn)品。另外，還提供了具有本文所述抗體的化驗(yàn)試劑盒，以識(shí)別腫瘤和炎性疾病。
另外，本文所述核酸、其片段和其變體可以用于，例如，非限制性的實(shí)例有，(a)指導(dǎo)作為重組或異源基因產(chǎn)物合成的相應(yīng)編碼的蛋白質(zhì)、多肽、片段和變體的生物合成，(b)作為檢測和定量本文公開的核酸的探針，(c)作為制備反義(antisense)分子等的序列模板。這些用途將在下文中詳細(xì)敘述。
而且，本文所述蛋白質(zhì)和多肽，及其片段和變體，可以用于如下方式包括，(a)用作免疫原以激發(fā)抗TNFα抗體的產(chǎn)生，(b)在所述抗體的免疫原性檢測中用作捕捉抗原(capture antigen)，(c)作為篩選可以與本文所述的TNFα多肽結(jié)合的物質(zhì)的靶，以及(d)用作TNFα特異性抗體的靶，使得用此抗體進(jìn)行治療可影響由所述靶介導(dǎo)的分子和/或細(xì)胞的功能。
與抗TNFα抗體有關(guān)的更多實(shí)施方案、特性等將在下面詳細(xì)說明。
序列表典型的人源抗TNFα抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)核苷酸和氨基酸序列在序列表中提供，其內(nèi)容總結(jié)在表1中。
表1









定義除非另有定義，本文所使用的科技術(shù)語的含義與本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。另外，除非上下文另有要求，單數(shù)形式的術(shù)語包括其復(fù)數(shù)，復(fù)數(shù)形式的術(shù)語也包括其單數(shù)。一般地，本文所述細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)和寡核苷酸或多核苷酸化學(xué)，以及雜交有關(guān)的術(shù)語和技術(shù)，都是本技術(shù)領(lǐng)域公知的和通常使用的。重組DNA、寡核苷酸合成、組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化(例如電穿孔、脂轉(zhuǎn)染(lipofection))均使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。酶促反應(yīng)和純化技術(shù)根據(jù)制造商的說明書或本領(lǐng)域常規(guī)方法或本文所述的進(jìn)行操作。上述技術(shù)和方法一般按照本領(lǐng)域所公知的，以及本說明書通篇引用和討論的多篇一般和具體文獻(xiàn)中記載的常規(guī)方法進(jìn)行操作。參見例如Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))。本文記載的分析化學(xué)、有機(jī)合成化學(xué)、藥物化學(xué)和制藥化學(xué)有關(guān)的術(shù)語、實(shí)驗(yàn)室方法和技術(shù)均為本領(lǐng)域公知的和通常使用的?；瘜W(xué)合成、化學(xué)分析、藥品的制備、配方和遞送以及患者治療均使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。
根據(jù)本公開文本所使用的下列術(shù)語，除非另有說明，按照以下意思理解術(shù)語“TNFα”指細(xì)胞因子，腫瘤壞死因子-α(Pennica，D等，1984，Nature 312724-729)。本領(lǐng)域中，TNFα也被稱為惡液質(zhì)素(cachectin)。
當(dāng)涉及抗體時(shí)，術(shù)語“中和”是指抗體消除或顯著減少它所結(jié)合的靶抗原的效應(yīng)物功能的能力。因此，“中和”抗TNFα的抗體能夠消除或顯著減少效應(yīng)物功能，比如TNFα的活性。
本文使用的術(shù)語“分離多核苷酸”是指基因組、cDNA或合成源的多核苷酸，或其某種組合，依據(jù)其來源，“分離多核苷酸”(1)與“分離多核苷酸”天然存在于其中的另一個(gè)多核苷酸的全部或部分沒有關(guān)聯(lián)，(2)有效連接到與其無天然連接的另一多核苷酸，或者(3)不作為較大序列的一部分天然存在。
本文使用的術(shù)語“分離蛋白質(zhì)”是指cDNA、重組RNA或合成來源的，或其某種形式的組合的蛋白質(zhì)，依據(jù)其來源或起源，“分離蛋白質(zhì)”(1)不與自然界中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)有關(guān)聯(lián)，(2)不含有相同來源的其他蛋白質(zhì)，如不含有鼠蛋白(murine protein)，(3)在另一不同物種的細(xì)胞中表達(dá)，或(4)在自然界中不存在。
本文使用的“多肽”作為一個(gè)通用術(shù)語，是指天然蛋白、片段或多肽序列的類似物。所以，天然蛋白、片段和類似物是多肽屬的幾種。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的多肽包括人源重鏈免疫球蛋白分子和人源κ輕鏈免疫球蛋白分子，以及由包括重鏈免疫球蛋白分子，輕鏈免疫球蛋白分子，如κ輕鏈免疫球蛋白分子(反之亦然)，以及其片段和類似物相結(jié)合形成的抗體分子。
本文提到某對象時(shí)使用的術(shù)語“天然存在”是指該對象可以在自然界中發(fā)現(xiàn)的事實(shí)。例如，一段多肽或多核苷酸序列，存在于生物有機(jī)體(包括病毒)中，可以從天然源中分離，并且沒有在實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)過人類或某他途徑有意地修飾，這樣的多肽或多核苷酸序列就是天然存在的。
本文使用的術(shù)語“有效連接”是指所述各元件的位置關(guān)系，可使它們以預(yù)期方式發(fā)揮功能。例如，一段控制序列“有效連接”到一段編碼序列，其連接方式可以在與控制序列相容的條件下實(shí)現(xiàn)編碼序列的表達(dá)。
本文使用的術(shù)語“控制序列”是指影響與之相連的編碼序列的表達(dá)和加工所必須的多核苷酸序列。控制序列的性質(zhì)因宿主有機(jī)體的不同而不同；原核生物中，控制序列一般包括啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列；真核生物中，控制序列一般包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語“控制序列”旨在至少包括其存在對表達(dá)和加工起重要作用的所有元件，并且還可以包括其存在是有益的附加元件，例如，前導(dǎo)序列和融合配偶體序列(fusion partner sequence)。
本文使用的術(shù)語“多核苷酸”是指長度為至少10個(gè)堿基的多聚體形式的核苷酸，它可以是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或修飾形式的所述兩種核苷酸中的任一種。該術(shù)語包括單鏈和雙鏈形式的DNA。
本文使用的術(shù)語“寡核苷酸”包括由天然存在的和非天然存在的寡核苷酸鍵連接起來的天然存在的和經(jīng)過修飾的核苷酸。寡核苷酸是多核苷酸的亞組(subset)，通常包括不超過200個(gè)堿基的長度。寡核苷酸優(yōu)選為10到60個(gè)堿基長度，最優(yōu)選12、13、14、15、16、17、18、19、或20到40個(gè)堿基長度。寡核苷酸通常為單鏈，如用于探針；但寡核苷酸也可以為雙鏈，如用于構(gòu)建基因突變體。寡核苷酸可以為正義或反義寡核苷酸。
本文使用的術(shù)語“天然存在的核苷酸”包括脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文使用的術(shù)語“經(jīng)過修飾的核苷酸”包括具有修飾或替代的糖基的核苷酸等。本文使用的術(shù)語“寡核苷酸鍵”包括如下寡核苷酸鍵，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoraniladate、磷酰胺酯(phosphoroamidate)等。參見例如，LaPlanche等Nucl.Acids Res.149081(1986)；Stec等，J.Am.Chem.Soc.1066077(1984)；Stein等Nucl.Acids Res.163209(1988)；Zon等Anti-Cancer Drug Design6539(1991)；Zon等Oligonucleotides and AnaloguesA PracticalApproach，87-108頁(F.Eckstein編輯，Oxford University Press，英國牛津市(1991))；Stec等的美國專利5,151,510；Uhlmann和PeymanChemical Reviews 90543(1990)。如果需要，寡核苷酸可以包括檢測標(biāo)記。
本文使用的術(shù)語“選擇性雜交”是指可檢測到的特異性結(jié)合。多核苷酸、寡核苷酸和其片段與核酸鏈選擇性雜交，其雜交和洗滌的條件應(yīng)使可檢測到的與非特異性核酸結(jié)合的可測量的量達(dá)到最小。如本領(lǐng)域所公知和本文所討論的，可使用非常嚴(yán)格的條件獲得選擇性雜交的條件。一般地，多核苷酸、寡核苷酸、或抗體片段和所研究的核酸序列之間的核酸序列的同源性(homology)為至少80％，更一般地，優(yōu)選將同源性提高到至少85％，90％，95％，99％和100％。
如果兩段氨基酸序列部分或完全相同，那么它們是“同源的”。例如85％同源性表示當(dāng)兩段序列以最大匹配的方式比對時(shí)，有85％的氨基酸是相同的。最大匹配時(shí)允許存在間隔(匹配的兩段序列中任一段上)；間隔長度優(yōu)選5或更小，更優(yōu)選2或更小。另一種優(yōu)選情形，兩條蛋白序列(或來源于蛋白的至少大約30氨基酸長度的多肽序列)使用帶有突變數(shù)據(jù)矩陣、間隔罰分設(shè)置值等于或大于6的程序ALIGN時(shí)，如果它們的比對分?jǐn)?shù)大于5(標(biāo)準(zhǔn)差單元)，本文中稱之為同源。參見Dayhoff，M.O.，Atlas of Protein Sequenceand Structure，101-110頁(第5卷，National Biomedical ResearchFoundation(1972))和該卷的增補(bǔ)本2，1-10頁。當(dāng)使用ALIGN程序?qū)啥涡蛄谢蚱洳糠诌M(jìn)行最優(yōu)比對時(shí)，如果它們的氨基酸有多于或等于50％相同時(shí)，它們即為更優(yōu)選的同源。
本文使用的術(shù)語“相應(yīng)的”表示一段多核苷酸序列與基準(zhǔn)多核苷酸序列的全部或部分同源(即相同，但沒有嚴(yán)格的進(jìn)化關(guān)系)，或者一段多肽序列與基準(zhǔn)多肽序列相同。
與之不同的是，本文使用術(shù)語“互補(bǔ)的”表示其互補(bǔ)序列與基準(zhǔn)多核苷酸序列的全部或部分同源。舉例說明，核苷酸序列“TATAC”與基準(zhǔn)序列“TATAC”相應(yīng)，與基準(zhǔn)序列“GTATA”互補(bǔ)。
下列術(shù)語用于描述兩條或多條多核苷酸或氨基酸序列之間的序列關(guān)系“基準(zhǔn)序列”“對比窗(comparison window)”“序列相同(sequence identity)”“序列相同百分率(percentage ofsequence identity)”和“基本相同(substantial identity)”?！盎鶞?zhǔn)序列”是用作序列比較基礎(chǔ)的規(guī)定序列。基準(zhǔn)序列可以是較長序列的亞組，比如序列表中所示全長cDNA或基因序列的片段，或者可以包括完整的cDNA或基因序列。一般地，基準(zhǔn)序列至少在18核苷酸或6氨基酸長度，經(jīng)常至少24核苷酸或8氨基酸長度，更經(jīng)常至少48核苷酸或16氨基酸長度。既然兩段多核苷酸或氨基酸序列中的各段都可以(1)包括一段在所述兩分子之間相似的序列(即完整多核苷酸或氨基酸序列的一部分)，并且(2)還包括一段在兩段多核苷酸或氨基酸序列之間不同的序列，兩(或多)個(gè)分子之間的序列比較一般通過在“對比窗”內(nèi)比較所述兩個(gè)分子的序列進(jìn)行，以便識(shí)別和比較部分區(qū)域的序列相似性。本文使用的“對比窗”是指至少大約18個(gè)連續(xù)的核苷酸或大約6個(gè)氨基酸這一概念上的片段，其中多核苷酸序列或氨基酸序列與基準(zhǔn)序列上的至少大約18個(gè)連續(xù)的核苷酸或6個(gè)氨基酸序列相比較，并且其中與基準(zhǔn)序列(它不包括插入或缺失)比較，多核苷酸序列在對比窗中的部分可以包括20％或更少的插入、缺失、替換等(如間隔)以使兩段序列最優(yōu)比對。用于與對比窗比對的序列的最優(yōu)比對可以使用以下算法進(jìn)行局部同源算法(local homology algorithm)，Smith和WatermanAdv.Appl.Math.2482(1981)，同源比對算法(homology alignmentalgorithm)，Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48443(1970)，尋求相似性方法(search for similarity method)，Pearson和LipmanProc.Natl.Acad.Sci.(美國)852444(1988)，這些算法的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)(Wisconsin Genetics軟件包版本7.0中的GAP、BEST FIT、FASTA和TFASTA，(Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)，GENEWORKSTM，或MACVECTOR_軟件包)，或者人工比對(by inspection)，然后選擇通過以上方法產(chǎn)生的最優(yōu)比對(即在對比窗中產(chǎn)生最高同源百分率)。
術(shù)語“序列相同”是指兩段多核苷酸或氨基酸序列在對比窗內(nèi)相同(即基于單個(gè)核苷酸或單個(gè)氨基酸殘基順次比較)。術(shù)語“序列相同百分率”按照如下方法計(jì)算在對比窗內(nèi)比較兩段最優(yōu)比對的序列，確定兩段序列中出現(xiàn)相同的核酸堿基(如A、T、C、G、U或I)或氨基酸殘基的位置的數(shù)量，得出匹配位置數(shù)，匹配位置數(shù)除以對比窗的總位置數(shù)(即對比窗的大小)，結(jié)果再乘以100即得到序列相同百分率。本文使用的術(shù)語“基本相同”表示多核苷酸或氨基酸序列的一種特性，其中多核苷酸或氨基酸包括一段至少85％序列相同的序列，優(yōu)選至少90～95％序列相同，更優(yōu)選至少99％序列相同，以上結(jié)果是在對比窗內(nèi)至少18個(gè)核苷酸(6氨基酸)位置上，更經(jīng)常至少24～48個(gè)核苷酸(8～16氨基酸)位置上與基準(zhǔn)序列比較得出的，其中序列相同百分率是通過在對比窗內(nèi)比較基準(zhǔn)序列與某一序列計(jì)算得到的，該序列可以包括總計(jì)為基準(zhǔn)序列的20％或以下的缺失或插入。基準(zhǔn)序列可以是更長序列的亞組。
本文引用的20種常規(guī)氨基酸及其縮寫遵循常規(guī)使用方式。參見Immunology--A Synthesis(第二版，E.S.Golub和D.R.Gren編輯，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))。20種常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(如D-氨基酸)，非天然氨基酸如α-，α-雙取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸，以及其他非常規(guī)氨基酸也可以是本發(fā)明的多肽的適宜組分。非常規(guī)氨基酸的例子包括4-羥基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基賴氨酸、ε-N-乙酰賴氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、σ-N-甲基精氨酸，以及其他類似氨基酸和亞氨基酸(如4-羥基脯氨酸)。本文所用的多肽表示方法中，左手方向?yàn)榘被┒朔较?，右手方向?yàn)轸然┒朔较?，與標(biāo)準(zhǔn)用法和慣例一致。
類似地，除非另有說明，單鏈多核苷酸序列的左手端為5′端；雙鏈多核苷酸序列的左手方向?yàn)?′方向。新生RNA轉(zhuǎn)錄物5′到3′延伸的方向?yàn)檗D(zhuǎn)錄方向；DNA鏈上序列和RNA相同，且在RNA轉(zhuǎn)錄物5′端5′的序列區(qū)稱作“上游序列”；DNA鏈上序列和RNA相同的，且在RNA轉(zhuǎn)錄物3′端3′的序列區(qū)稱作“下游序列”。
當(dāng)涉及多肽時(shí)，術(shù)語“基本相同”是指兩段多肽序列，當(dāng)它們最優(yōu)比對時(shí)，比如使用GAP或BESTFIT程序以默認(rèn)間隔權(quán)重比對時(shí)，共有至少80％的序列相同，優(yōu)選至少90％的序列相同，更優(yōu)選至少95％的序列相同，最優(yōu)選至少99％的序列相同。優(yōu)選地，不相同的殘基位置是由于保守性氨基酸替換引起的。保守性氨基酸替換是指側(cè)鏈相似的殘基之間的可替換性。例如，具有脂肪族側(cè)鏈的一組氨基酸為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族-羥基側(cè)鏈的一組氨基酸為絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側(cè)鏈的一組氨基酸為天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香側(cè)鏈的一組氨基酸為苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的一組氨基酸為賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有含硫側(cè)鏈的一組氨基酸為半胱氨酸和蛋氨酸。優(yōu)選的保守性氨基酸替換組為纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
如本文所討論，抗體或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中微小變異被認(rèn)為包含在本發(fā)明之內(nèi)，只要氨基酸序列的變異同本文所述的抗體或免疫球蛋白分子相比，保持至少75％序列相同，更優(yōu)選至少80％、90％、95％，最優(yōu)選99％序列相同。特別地，考慮保守性氨基酸替換。保守性替換是發(fā)生在具有相關(guān)側(cè)鏈的同一氨基酸家族內(nèi)的替換。正常編碼的氨基酸一般分為以下幾個(gè)家族(1)酸性＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性＝賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)無極性＝丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；以及(4)無電荷極性＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。更優(yōu)選的家族為絲氨酸與蘇氨酸為脂肪族-羥基家族；天冬酰胺和谷氨酰胺為含酰胺家族；丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸為脂肪家族；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸為芳香家族。例如有理由相信，亮氨酸同異亮氨酸或纈氨酸、天冬氨酸同谷氨酸、蘇氨酸同絲氨酸的單獨(dú)替換，或者氨基酸同其結(jié)構(gòu)相近的氨基酸的類似替換不會(huì)對所生成分子的結(jié)合功能或性質(zhì)有較大影響，特別是替換沒有涉及到框架位點(diǎn)內(nèi)的氨基酸時(shí)。氨基酸改變是否產(chǎn)生功能性肽，可易于通過測試多肽衍生物的特異活性檢測。本文對檢測方法作詳細(xì)描述?？贵w或免疫球蛋白分子的片段或類似物可易于由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員制備。優(yōu)選地，片段或類似物的氨基和羧基末端位于功能區(qū)的近邊界處?？梢酝ㄟ^比較公共或?qū)Ｓ行蛄袛?shù)據(jù)庫中的核苷酸和/或氨基酸序列數(shù)據(jù)來識(shí)別結(jié)構(gòu)和功能區(qū)域。優(yōu)選地，使用計(jì)算機(jī)比較法來識(shí)別存在于結(jié)構(gòu)和/或功能已知的其他蛋白中的序列基序(sequence motif)或預(yù)測的蛋白構(gòu)象區(qū)域。識(shí)別出折疊成已知三維結(jié)構(gòu)的蛋白序列的方法已經(jīng)公知。Bowie等Science 253164(1991)。所以，以上例子說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以識(shí)別用于確定與本文所述抗體一致的結(jié)構(gòu)和功能區(qū)域的序列基序和結(jié)構(gòu)構(gòu)象。
優(yōu)選的氨基酸替換是能夠(1)降低蛋白分解敏感性，(2)降低氧化敏感性，(3)改變形成蛋白復(fù)合物的結(jié)合親和力，(4)改變結(jié)合親和力，以及(4)賦予或改變其類似物其他物理化學(xué)或功能性質(zhì)的替換。類似物可以包括序列不同于天然存在的肽序列的各種突變蛋白質(zhì)。例如，單個(gè)或多個(gè)氨基酸替換(優(yōu)選保守性氨基酸替換)可以發(fā)生于天然存在的序列(優(yōu)選在形成分子間接觸的區(qū)域之外的多肽部分)中。保守性氨基酸替換應(yīng)該基本不改變親代序列(parentsequence)的結(jié)構(gòu)特性(例如，替換氨基酸應(yīng)該不會(huì)破壞親代序列中存在的螺旋，或破壞親代序列特征性的其他類型的二級結(jié)構(gòu))。本領(lǐng)域已識(shí)別的多肽二級和三級結(jié)構(gòu)的例子記載在Proteins，Structuresand Molecular Principles(Creighton編輯，W.H.Freeman andCompany，紐約(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze編輯，Garland Publishing，紐約州紐約市(1991))；和Thornton等Nature 354105(1991)。
本文使用的術(shù)語“多肽片段”是指一段多肽，其氨基末端和/或羧基末端缺失，但其余氨基酸序列同起源于，例如，全長cDNA序列的天然存在的序列中的相應(yīng)位置相同。片段通常有至少5、6、8或10氨基酸長度，優(yōu)選至少14氨基酸長度，更優(yōu)選至少20氨基酸長度，通常至少50氨基酸長度，以及更優(yōu)選至少70氨基酸長度。本文使用的術(shù)語“類似物”是指包括至少25個(gè)氨基酸片段的多肽，其與導(dǎo)出(deduced)的氨基酸序列的一部分基本相同，并且至少具備下列性質(zhì)之一(1)在適宜的結(jié)合條件下，與TNFα特異結(jié)合，(2)阻止與TNFα正確結(jié)合的能力，或(3)抑制TNFα活性的能力。通常，相對于天然存在的序列，多肽類似物包含保守性氨基酸替換(或插入或缺失)。類似物通常為至少20氨基酸長度，優(yōu)選至少50氨基酸長度或更長，并且經(jīng)常可與全長的天然存在的多肽長度相等。
肽類似物通常作為與其模板肽有相似性質(zhì)的非肽藥物在制藥工業(yè)上使用。這些類型的非肽化合物被稱為“肽模仿劑(peptide mimetics)”或“擬肽物(peptidomimetics)”。Fauchere，J.Adv.Drug Res.1529(1986)；Veber和Freidinger TINS 392頁(1985)；和Evans等J.Med.Chem.301229(1987)。這些化合物通常借助計(jì)算機(jī)化的分子模型開發(fā)。與治療有效的肽結(jié)構(gòu)相似的肽模仿劑可用于產(chǎn)生等效的治療或預(yù)防效果。一般地，擬肽物在結(jié)構(gòu)上與范例多肽(paradigm polypeptide，即具有生化性質(zhì)或藥理活性的多肽)，例如人源抗體相似，但其一個(gè)或多個(gè)肽鍵可任選地由下列鍵替換，所述鍵選自--CH2NH--、--CH2S--、--CH2-CH2--、--CH＝CH--(順式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和-CH2SO--，使用的方法已為本領(lǐng)域所公知。可以使用同型D-氨基酸系統(tǒng)地替換共同序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如D-賴氨酸代替L-賴氨酸)以生產(chǎn)更穩(wěn)定的肽。另外，包含共同序列或基本相同的共同序列變異體的約束肽(constrained peptide)也可用本領(lǐng)域公知方法合成(Rizo和Gierasch Ann.Rev.Biochem.61387(1992))；例如，加入內(nèi)半胱氨酸殘基能夠形成分子內(nèi)二硫橋鍵，可使肽環(huán)化。
“抗體”或“抗體肽”是指完整的抗體，或與完整的抗體競爭特異結(jié)合的其結(jié)合片段。結(jié)合片段通過重組DNA技術(shù)，或通過酶或化學(xué)方法切割完整的抗體產(chǎn)生。結(jié)合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和單鏈抗體。除了“雙特異性”或“雙功能”抗體外的抗體可理解為其各結(jié)合位點(diǎn)相同。過量的抗體使與反受體結(jié)合的受體數(shù)量減少至少大約20％、40％、60％或80％，更經(jīng)常地在85％以上(根據(jù)體外競爭結(jié)合測試所得數(shù)據(jù))時(shí)，抗體顯著地抑制受體與反受體的結(jié)合。
術(shù)語“表位(epitope)”包括任何可與免疫球蛋白或T細(xì)胞受體特異結(jié)合的蛋白決定簇。表位決定簇通常由具有化學(xué)活性的分子表面基團(tuán)組成，如氨基酸或糖基側(cè)鏈，并且通常具有特異的三維結(jié)構(gòu)特性，以及特異的電荷特性。當(dāng)離解常數(shù)≤1μM，優(yōu)選≤100nM，最優(yōu)選≤10nM時(shí)，就可以說，抗體與抗原特異結(jié)合。
本文使用的術(shù)語“試劑”是指化學(xué)化合物、化學(xué)化合物的混合物、生物大分子、或生物材料制成的提取物。
有關(guān)TNFα多肽的“活性的”或“活性”是指具有天然TNFα多肽的生物或免疫活性的TNFα多肽部分。此處使用的“生物的”是指由天然TNFα多肽的活性引起的生物功能。優(yōu)選的TNFα生物活性包括，例如，TNFα誘導(dǎo)的凋亡。
本文所述的“哺乳動(dòng)物”為可以看作哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物。優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物為人類。
使用酶，即木瓜蛋白酶(papain)消化抗體，可產(chǎn)生兩相同的抗原結(jié)合片段即“Fab”片段，以及無抗原結(jié)合活性但可以結(jié)晶的“Fc”片段。使用酶，即胃蛋白酶消化抗體，會(huì)產(chǎn)生F(ab’)2片段，該片段中抗體分子的兩臂保持相連，并且包括雙抗原(two-antigen)結(jié)合位點(diǎn)。F(ab’)2片段可與抗原交聯(lián)。
本文使用的“Fv”是指同時(shí)保留抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體的最小片段。
本文使用的“Fab”是指包含輕鏈恒定區(qū)和重鏈CH1區(qū)的抗體片段。
術(shù)語“mAb”是指單克隆抗體。
描述XENOMAX_抗體序列時(shí)采用如下方式編碼“AB”指抗體，“TNFα”指抗體的結(jié)合特異性，“X”是指源自XENOMOUSE_，“G1”是指IgG1同種型或者“G2”是指IgG2同種型，最后三位數(shù)字是指抗體來源的單細(xì)胞編號，例如AB-TNFα-XG1-015。
術(shù)語“SC”是指單細(xì)胞，一個(gè)特定的源自XENOMAX_的抗體可表示為SC后跟三位數(shù)字，或者只有三位數(shù)字，表示抗體來源的單細(xì)胞編號。
描述雜交瘤細(xì)胞來源的抗體序列時(shí)采用如下方式編碼“AB”指抗體，“TNFα”指抗體的結(jié)合特異性，“X”是指源自XENOMOUSE_，“G1”是指IgG1同種型或者“G2”是指IgG2同種型，“K”是指κ，“L”是指λ。最后三位數(shù)字是指抗體來源的克隆，例如AB-TNFα-XG2K-4.17。
本文使用的“脂質(zhì)體”是指有助于遞送藥物的微小泡囊，所述藥物可以包括本發(fā)明的TNFα多肽，或者哺乳動(dòng)物的此TNFα多肽的抗體。
本文使用的“標(biāo)記”或“標(biāo)記的”是指為多肽添加可檢測部分，例如，放射性同位素示蹤、熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記或者生物素標(biāo)記。放射性同位素或者放射性核素可以包括3H、14C，15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I，熒光標(biāo)記可以包括羅丹明(rhodamine)、鑭系熒光物質(zhì)(lanthanide phosphor)或者FITC，酶標(biāo)記可以包括辣根過氧物酶(horseradish peroxidase)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、螢光酶(luciferase)、堿性磷酸酶(alkalinephosphatase)。
本文使用的術(shù)語“治療藥劑或藥物”是指正確給藥至患者時(shí)產(chǎn)生所需治療效果的化學(xué)化合物或組合物。本文使用的其他化學(xué)術(shù)語與本領(lǐng)域的常規(guī)用法一致，示例可以參見The McGraw-Hill Dictionary ofChemical Terms(Parker，S.編輯，McGraw-Hill，圣弗朗西斯科(1985))。
本文使用的“基本純凈”是指目標(biāo)種類為存在的主要種類(即，以摩爾數(shù)計(jì)，它在組合物中的含量比其他任何一種都多)，優(yōu)選地，基本純化的組分是指其中目標(biāo)種類占所存在的全部大分子種類的至少約50％(以摩爾數(shù)計(jì))的組合物。一般地，基本純凈的組合物應(yīng)占組合物中所存在的全部大分子種類的約80％以上，更優(yōu)選85％、90％、95％、以及99％以上。最優(yōu)選地，目標(biāo)種類純化到基本同質(zhì)的程度(使用常規(guī)檢測方法在組合物中檢測不到雜質(zhì)類)，此時(shí)組合物主要由單一大分子種類組成。
術(shù)語“患者”包括人類和獸類個(gè)體。
術(shù)語“SLAM_”是指“選擇性淋巴細(xì)胞抗體方法(SelectedLymphocyte Antibody Method)”(Babcook等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，i937843-7848(1996)，和Schrader，美國專利5,627,052)。
術(shù)語“XENOMAX_”是指用于XENOMOUSE_動(dòng)物時(shí)，使用“選擇性淋巴細(xì)胞抗體方法”(Babcook等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，i937843-7848(1996))。
抗體結(jié)構(gòu)已知基本的抗體結(jié)構(gòu)單元包括一個(gè)四聚體。各四聚體由兩對相同的多肽鏈組成，每對具有一條“輕”鏈(大約25kDa)和一條“重”鏈(大約50-70kDa)。各鏈的氨基末端部分包括由大約100到110或更多氨基酸組成的可變區(qū)，主要負(fù)責(zé)抗體識(shí)別。各鏈的羧基末端部分形成恒定區(qū)，主要負(fù)責(zé)效應(yīng)物功能。來自人類的輕鏈可分為κ和λ輕鏈。重鏈可分為μ、δ、γ、α或ε，分別定義抗體的同種型IgM、IgD、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈內(nèi)部，可變區(qū)和恒定區(qū)由約12或更多氨基酸組成的“J”區(qū)連接，重鏈還包括約10或更多氨基酸組成的“D”區(qū)。大體參見，F(xiàn)undamental Immunology第7章(Paul，W.編輯，第2版.Raven Press，紐約(1989)).各輕/重鏈對的可變區(qū)形成抗體的結(jié)合位點(diǎn)。
所以，完整的抗體具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。除了在雙功能或雙特異性抗體中之外，這兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是相同的。
所有鏈均顯示出大體相同的結(jié)構(gòu)，即相對保守的骨架區(qū)(FR)連接三個(gè)高變區(qū)，后者也被稱為互補(bǔ)決定區(qū)或CDR。各對兩條鏈上的CDR沿骨架區(qū)排列，使之可與特異表位結(jié)合。從N-末端到C-末端，輕鏈和重鏈都包括區(qū)域FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3和FR4。氨基酸在各區(qū)域上的分配與下列文獻(xiàn)中的定義一致KabatSequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutesof Health，馬里蘭州貝賽斯達(dá)(1987 and 1991))，或Chothia & Lesk J.Mol.Biol.196901-917(1987)；Chothia等Nature 342878-883(1989)。
雙特異性或雙功能抗體是人工雜化的抗體，具有兩不同的重/輕鏈對和兩個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)。雙特異性抗體可通過多種方法制備，包括雜交瘤細(xì)胞的融合或Fab’片段的連接。參見，例如，Songsivilai & Lachmann Clin.Exp.Immunol.79315-321(1990)，Kostelny等J.Immunol.1481547-1553(1992)。相對于制備常規(guī)抗體，制備雙特異性抗體的勞動(dòng)強(qiáng)度更大，并且產(chǎn)量和純度一般較低。只有單一結(jié)合位點(diǎn)的片段形式(如Fab，F(xiàn)ab’和Fv)中不存在雙特異性抗體。
人源抗體和抗體的人源化人源抗體避免了與具有鼠源或大鼠源可變區(qū)和/或恒定區(qū)的抗體相關(guān)的一些問題。鼠源或大鼠源蛋白的存在導(dǎo)致抗體迅速清除，或使患者產(chǎn)生針對抗體的免疫應(yīng)答。為了避免使用鼠源或大鼠源抗體，可將人源抗體功能引入嚙齒動(dòng)物中，使嚙齒動(dòng)物體產(chǎn)生完全人源抗體，以此即可獲得完全人源抗體。
產(chǎn)生完全人源抗體的方法之一是使用小鼠XENOMOUSE_品系，其已被改造成包含245kb和190kb大小的人源重鏈基因座和κ輕鏈基因座的胚系結(jié)構(gòu)片段。參見Green等Nature Genetics 713-21(1994)。XENOMOUSE_品系可從Abgenix，Inc.(Fremont，加利福尼亞州)獲得。
XENOMOUSE_的生產(chǎn)在以下文獻(xiàn)中有進(jìn)一步的討論和描述以下美國專利申請，包括1990年1月12日提交的No.07/466,008、1990年11月8日提交的No.07/610,515、1992年7月24日提交的No.07/919,297、1992年7月30日提交的No.07/922,649、1993年3月15日提交的No.08/031,801、1993年8月27日提交的No.08/112,848、1994年4月28日提交的No.08/234,145、1995年1月20日提交的No.08/376,279、1995年4月27日提交的No.08/430,938、1995年6月5日提交的No.08/464,584、1995年6月5日提交的No.08/464,582、1995年6月5日提交的No.08/463,191、1995年6月5日提交的No.08/462,837、1995年6月5日提交的No.08/486,853、1995年6月5日提交的No.08/486,857、1995年6月5日提交的No.08/486,859、1995年6月5日提交的No.08/462,513、1996年10月2日提交的No.08/724,752和1996年12月3日提交的No.08/759,620以及美國專利包括No.6,162,963、No.6,150,584、No.6,114,598、No.6,075,181和No.5,939,598和日本專利No.3 068 180 B2、No.3 068 506 B2和No.3 068507 B2。參見Mendez等Nature Genetics 15146-156(1997)和Green和Jakobovits J.Exp.Med.188483-495(1998)。另外參見1996年6月12日授權(quán)公開的歐洲專利EP 0 463 151 B1、1994年2月3日公開的國際專利申請WO 94/02602、1996年10月31日公開的國際專利申請WO 96/34096、1998年6月11日公開的WO 98/24893、2000年12月21日公開的WO 00/76310。以上引用的各專利、專利申請的公開內(nèi)容。
在另一種方法中，其他人，包括GenPharm International，Inc.使用“微基因座(minilocus)”方法。在微基因座方法中，模擬外源Ig基因座是通過包含來自Ig基因座的片段(單個(gè)基因)實(shí)現(xiàn)的。這樣，一個(gè)或多個(gè)VH基因、一個(gè)或多個(gè)DH基因、一個(gè)或多個(gè)JH基因、一個(gè)μ恒定區(qū)、以及第二個(gè)恒定區(qū)(優(yōu)選γ恒定區(qū))形成一個(gè)構(gòu)建體以插入動(dòng)物體內(nèi)。這種方法記載在頒給Surani等的美國專利5,545,807和頒給Lonberg和Kay的美國專利5,545,806、No.5,625,825、No.5,625,126、No.5,633,425、No.5,661,016、No.5,770,429、No.5,789,650、No.5,814,318、No.5,877,397、No.5,874,299和6,255,458，頒給Krimpenfort和Berns的美國專利5,591,669和6,023.010、頒給Berns等的美國專利5,612,205、No.5,721,367和No.5,789,215和頒給Choi和Dunn的美國專利5,643,763和GenPharm International的美國專利申請包括1990年8月29日提交的No.07/574,748、1990年8月31日提交的No.07/575,962、1991年12月17日提交的No.07/810,279、1992年3月18日提交的No.07/853,408、1992年6月23日提交的No.07/904,068、1992年12月16日提交的No.07/990,860、1993年4月26日提交的No.08/053,131、1993年7月22日提交的No.08/096,762、1993年11月18日提交的No.08/155,301、1993年12月3日提交的No.08/161,739、1993年12月10日提交的No.08/165,699、1994年3月9日提交的No.08/209,741。另外參見歐洲專利0 546 073B1、國際專利申請WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884和美國專利5,981,175。進(jìn)一步參見Taylor等，1992，Chen等，1993，Tuaillon等，1993，Choi等，1993，Lonberg等，(1994)，Taylor等，(1994)，和Tuaillon等，(1995)，F(xiàn)ishwild等，(1996)。
Kirin也驗(yàn)證了從小鼠中產(chǎn)生人源抗體的方法，通過微細(xì)胞融合，大片段染色體或整條染色體被導(dǎo)入小鼠中。見歐洲專利申請No.773288和No.843 961。
人抗鼠抗體(HAMA)應(yīng)答使業(yè)界開發(fā)出嵌合的或者其他形式的人源化的抗體。雖然嵌合抗體具有人源恒定區(qū)和鼠源可變區(qū)，但預(yù)期可觀察到某種人抗嵌合抗體(HACA)應(yīng)答，特別是在長期或多倍劑量使用抗體的情形下。所以，期望提供針對TNFα的完全人源抗體，以消除HAMA或HACA應(yīng)答的影響和/或效果。
抗體療法如本文所述，TNFα抗體的功能對其至少一部分作用模式來說顯得非常重要。所謂功能，意思是，舉例說明，TNFα抗體與TNFα作用時(shí)的活性。因此，就某方面來講，有關(guān)產(chǎn)生抗體作為針對TNFα的治療候選物就很期望抗體能夠固定補(bǔ)體，參與CDC。有多種功能相同的同種型抗體，包括但不限于鼠源IgM，鼠源IgG2a，鼠源IgG2b，鼠源IgG3，人源IgM、人源IgG1和人源IgG3。應(yīng)該注意的是，產(chǎn)生的抗體無需在一開始就具有某種同種型，而是抗體產(chǎn)生時(shí)可具有任何同種型，并于其后使用本領(lǐng)域公知的常規(guī)技術(shù)轉(zhuǎn)換同種型。這些技術(shù)包括使用直接重組技術(shù)(direct recombinant technique，參見例如美國專利4,816,397)，細(xì)胞間融合技術(shù)(cell-cell fusion technique，參見例如美國專利5,916,771和No.6,207,418)，以及其他技術(shù)。
在細(xì)胞間融合技術(shù)中，制備具有任一所需同種型重鏈的一株骨髓瘤或其他細(xì)胞系并制備具有輕鏈的另一株骨髓瘤或其他細(xì)胞系。然后使這些細(xì)胞融合，便可分離出表達(dá)完整抗體的細(xì)胞系。
舉例來說，本文討論的TNFα抗體為人源抗TNFα的IgG2抗體。如果此抗體具有所需的同TNFα分子的結(jié)合能力，它就可以容易地轉(zhuǎn)換同種型，生成人源IgM，人源IgG1，或人源IgG3同種型，同時(shí)仍然具有相同的可變區(qū)(它限定了抗體的特異性和部分親和力)。這些分子即可固定補(bǔ)體，參與CDC。
因此，由于產(chǎn)生的候選抗體具有如上所討論的所需“結(jié)構(gòu)”屬性，經(jīng)過同種型轉(zhuǎn)換，它們通?？删哂兄辽倌撤N目標(biāo)“功能”屬性。
其他療法的設(shè)計(jì)和生成依據(jù)本發(fā)明，基于生成的和鑒定的與TNFα有關(guān)的抗體的活性，設(shè)計(jì)除抗體部分以外的其他治療方式也比較容易。所述方式包括但不限于，高級抗體療法，如雙特異性抗體、免疫毒素和放射性同位素標(biāo)記療法，生成多肽療法和基因療法，特別是內(nèi)抗體(intrabody)、反義療法和小分子。
隨著以補(bǔ)體固定為所需屬性的高級抗體療法的產(chǎn)生，通過使用例如雙特異性抗體、免疫毒素，或放射性同位素標(biāo)記藥物，或許可以回避細(xì)胞殺傷對補(bǔ)體的依賴。
例如，就雙特異性抗體而言，生成的雙特異性抗體可以包括(i)連接在一起的兩個(gè)抗體，一個(gè)對TNFα有特異性，另一個(gè)對第二種分子有特異性，(ii)單個(gè)抗體，其中一條鏈對TNFα有特異性，另有第二條鏈對第二種分子有特異性，(iii)單鏈抗體，同時(shí)對TNFα和另一種分子有特異性。這些雙特異性抗體可以使用公知的技術(shù)制備；例如，有關(guān)(i)和(ii)，參見例如Fanger等Immunol Methods 472-81(1994)以及Wright和Harris，supra.，有關(guān)(iii)，參見例如Traunecker等Int.J.Cancer(增補(bǔ)本)751-52(1992)。各情況下，使第二特異性針對重鏈活化受體，包括但不限于，CD16或CD64(參見例如Deo等18127(1997))或CD89(參見例如Valerius等Blood 904485-4492(1997))。依據(jù)上述方法制備的雙特異性抗體極有可能殺死表達(dá)TNFα的細(xì)胞。
關(guān)于免疫毒素，可以使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)修飾抗體，使之用作免疫毒素。參見例如Vitetta Immunol Today 14252(1993)。另外參見美國專利5,194,594。有關(guān)放射性同位素標(biāo)記的抗體的制備，也可使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)容易地制備出此種經(jīng)過修飾的抗體。參見例如Junghans等Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686(第二版，Chafner和Longo編輯，Lippincott Raven(1996))。另外參見美國專利4,681,581、No.4,735,210、No.5,101,827、No.5,102,990(RE 35,500)、No.5,648,471和No.5,697,902。各免疫毒素和放射性同位素標(biāo)記的分子都有可能殺死表達(dá)TNFα的細(xì)胞。
抗體制備本文所述抗體，通過使用XENOMOUSE_技術(shù)制備，下文將有敘述。這些小鼠能夠產(chǎn)生人源免疫球蛋白分子和抗體，而不能產(chǎn)生鼠源免疫球蛋白分子和抗體。實(shí)現(xiàn)此目標(biāo)所采用的技術(shù)在本文背景技術(shù)部分所列的專利、專利申請和參考文獻(xiàn)中已經(jīng)公開。然而特別地，轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)小鼠及其產(chǎn)生的抗體的優(yōu)選的實(shí)施方案公開在1996年12月3日提交的美國專利申請系列號08/759,620和1998年6月11日公開的國際專利申請WO 98/24893以及2000年12月21日公開的國際專利申請WO 00/76310。另外參見Mendez等Nature Genetics 15146-156(1997)。
通過使用此技術(shù)，已經(jīng)制備了針對多種抗原的完全人源單克隆抗體。基本上，用目標(biāo)抗原(如TNFα)使小鼠的XENOMOUSE_品系免疫，就可從小鼠中回收表達(dá)抗體的淋巴細(xì)胞(如B細(xì)胞)，將此回收的細(xì)胞系同骨髓型細(xì)胞系融合，即制備出無限生長的雜交瘤細(xì)胞系。這些雜交瘤細(xì)胞系經(jīng)過篩選和選擇，識(shí)別出可分泌對目標(biāo)抗原有特異性的抗體的雜交瘤細(xì)胞系。本文提供的方法制備的是可分泌針對TNFα的特異性抗體的多種雜交瘤細(xì)胞系。本文還提供此類細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體的鑒定，包括這些抗體的重鏈和輕鏈的核苷酸和氨基酸序列分析。
或者，如果不與骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，那么，從經(jīng)過免疫的小鼠XENOMOUSE_品系分離出的回收細(xì)胞，進(jìn)一步篩選其針對初始抗原的反應(yīng)性，初始抗原優(yōu)選為TNFα蛋白。此篩選包括使用TNFα蛋白進(jìn)行ELISA，用與目標(biāo)抗原結(jié)合的已知抗體進(jìn)行競爭實(shí)驗(yàn)，體外中和TNFα誘導(dǎo)的凋亡和在體外結(jié)合表達(dá)全長TNFα的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞。然后使用TNFα特異性溶血蝕斑試驗(yàn)分離出分泌目標(biāo)抗體的單個(gè)B細(xì)胞(Babcook等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，i937843-7848(1996))。用于裂解的靶細(xì)胞優(yōu)選為包被有TNFα抗原的綿羊紅細(xì)胞(SRBC)。在可分泌目標(biāo)免疫球蛋白的B細(xì)胞培養(yǎng)物和補(bǔ)體存在的條件下，蝕斑的形成表明靶細(xì)胞有特異性的、TNFα介導(dǎo)的裂解。蝕斑中央可分離出單個(gè)抗原特異性漿細(xì)胞，并且從單個(gè)漿細(xì)胞中可分離出編碼抗體特異性的遺傳信息。使用逆轉(zhuǎn)錄酶PCR，可克隆出編碼所分泌抗體的可變區(qū)的DNA。此克隆DNA可進(jìn)一步插入合適的表達(dá)載體，優(yōu)選載體盒(vector cassette)如pcDNA，更優(yōu)選含有免疫球蛋白重鏈和輕鏈恒定區(qū)的pcDNA載體。然后將生成的載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，優(yōu)選CHO細(xì)胞中，并在常規(guī)營養(yǎng)基中培養(yǎng)，營養(yǎng)基可改良為適于誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增編碼目標(biāo)序列的基因。本文所述為分離可產(chǎn)生TNFα特異性抗體的多種單個(gè)漿細(xì)胞。然后分離出編碼抗TNFα的抗體特異性的遺傳物質(zhì)，將其導(dǎo)入合適的表達(dá)載體，并將載體轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞中。
一般地，由以上提到的細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體具有完全人源IgG1或IgG2重鏈和人源κ輕鏈?？贵w具有高親和力，當(dāng)在固相和溶液相中測量時(shí)，其Kd值通常在約10-9到約10-13M之間。
應(yīng)該注意的是，抗TNFα的抗體可以在除雜交瘤細(xì)胞系以外的其他細(xì)胞系中表達(dá)。編碼特定抗體的序列可用于轉(zhuǎn)化合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)化可以使用將多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞的任何已知方法進(jìn)行，包括例如，將多核苷酸包入病毒(或病毒載體)再用病毒(或載體)轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞，或者使用本領(lǐng)域公知的轉(zhuǎn)染方法，如以下文獻(xiàn)中所示美國專利4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455。使用的轉(zhuǎn)化方法取決于待轉(zhuǎn)化的宿主。將異源多核苷酸導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法已為本領(lǐng)域所公知，包括葡聚糖(dextran)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、聚凝胺(polybrene)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、在脂質(zhì)體中封裝多核苷酸、以及將DNA直接微注射至核中。
可作為表達(dá)宿主使用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系已為本領(lǐng)域所公知，包括可由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)獲得的許多永生細(xì)胞系，包括但不限于中國倉鼠卵巢(Chinesehamster ovary，CHO)細(xì)胞、人宮頸癌傳代細(xì)胞(HeLa cell)、幼倉鼠腎細(xì)胞(baby hamster kidney，BHK)、猴腎細(xì)胞(monkey kidneycells，COS)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(human hepatocellular carcinoma cell，如Hep G2)，以及很多其他細(xì)胞系。通過確定哪株細(xì)胞系表達(dá)水平高并且產(chǎn)生的抗體具有基本的TNFα結(jié)合性質(zhì)，來選擇特別優(yōu)選的細(xì)胞系。
抗TNFα抗體可用于檢測患者樣品中的TNFα，因此也可用于診斷如本文所述的疾病狀態(tài)。此外，基于它們顯著中和TNFα活性的能力(如以下實(shí)施例所示)，抗TNFα抗體對由TNFα引起的綜合癥和疾病有治療效果。在具體的實(shí)施方案中，本文所述的抗體和方法涉及治療的由TNFα引起的綜合癥包括發(fā)熱、肌肉疼痛、嗜睡、頭痛、惡心和發(fā)炎。其他的實(shí)施方案包括使用本文所述抗體和方法治療惡病質(zhì)、厭食、風(fēng)濕性疾病如關(guān)節(jié)炎，炎性疾病如克羅恩氏病，自體免疫疾病如牛皮癬、移植物抗宿主反應(yīng)和敗血癥休克。
治療用藥和制劑本文所述的具有生物活性的抗TNFα抗體可用于無菌藥物制品或制劑，用于降低血清TNFα水平，因此可有效治療一些病理疾病，如血清TNFα水平異常升高?？筎NFα抗體優(yōu)選具有足夠的親和力以將TNFα有效抑制在目標(biāo)治療范圍內(nèi)，并且優(yōu)選具有足夠長的作用時(shí)間，從而不用頻繁用藥。延長作用時(shí)間可實(shí)現(xiàn)頻率更低并且更方便的用藥方案，通過腸胃外途徑如皮下或肌肉注射。
抗體制劑用于體內(nèi)給藥時(shí)必須是無菌的。這一點(diǎn)易于實(shí)現(xiàn)，比如，在凍干和重建(reconstitution)之前或之后使用除菌濾膜過濾。抗體一般以凍干形式或在溶液中保藏。治療抗體組合物一般存放在帶有無菌取藥口的容器內(nèi)，如靜脈溶液包(intravenous solution bag)或小瓶，帶有可提取制劑的適配器，比如可穿過皮下注射器針頭的塞子。
抗體給藥途徑與已知方法一致，如通過靜脈、腹膜、大腦、肌肉、眼內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、吸入或損傷區(qū)途徑注射或輸液，或者使用下文所述的緩釋系統(tǒng)。本抗體優(yōu)選通過輸液或彈丸注射(bolus injection)連續(xù)給藥。
治療所用的抗體的有效劑量依賴于，比如，治療目標(biāo)、給藥的途徑和患者的病情。因此，治療學(xué)家優(yōu)選滴定確定劑量并根據(jù)要求修改給藥途徑，以獲得最佳治療效果。一般情況下，臨床醫(yī)師將給藥抗體直至達(dá)到實(shí)現(xiàn)所需效果的劑量。這種治療方法的進(jìn)行易于由常規(guī)檢測方法或本文所述的檢測方法監(jiān)控。
本文所述的抗體，可以同可藥用的載體制備成混合物。這種藥物組合物可通過靜脈或鼻或肺給藥，優(yōu)選為液體或粉末氣霧劑(凍干)。組合物還可根據(jù)需要腸胃外給藥或皮下給藥。當(dāng)全身給藥時(shí)，治療組合物應(yīng)該無菌、無熱原，并且在可用于腸胃外的溶液中，并適當(dāng)考慮到pH值、等滲壓性和穩(wěn)定性。這些條件均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。簡言之，本文所述的用于保存或給藥的化合物的藥用制劑，其制備方法為，將具有所需純度的化合物同生理可用的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合。這些物質(zhì)在使用劑量和濃度上對接受者是無毒的，包括緩沖液如TRIS HCL、磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽和其他有機(jī)酸鹽；抗氧化劑如抗壞血酸；小分子量(小于約10個(gè)殘基)肽如聚精氨酸，蛋白如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物包括纖維素及其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；平衡離子如鈉和/或非離子表面活性劑如TWEEN、PLURONICS或聚乙二醇。
注射用的無菌組合物可根據(jù)常規(guī)制藥方法配制，如RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy(第20版，Lippincott Williams &Wilkens Publishers(2003))。例如，可能需要將活性化合物溶解或懸浮于賦形劑中，如水或天然存在的植物油如芝麻油、花生油或棉花子油或合成脂肪賦形劑如油酸乙酯等。緩沖液、防腐劑、抗氧化劑等可以根據(jù)公認(rèn)的制藥慣例添加。
適宜的緩釋制品的例子包括含有所述多肽的固體疏水聚合物的半透性基質(zhì)，其中所述基質(zhì)是成型品(shaped article)、涂膜(film)或微膠囊形式的。緩釋基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(如聚(甲基丙烯酸-2-羥乙基酯)記載于Langer等，J.Biomed Mater.Res.，(1981)15167-277和Langer，Chem.Tech.，(1982)1298-105，或聚乙烯醇、聚交酯(美國專利3,773,919，EP 58,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等，Biopolymers，(1983)22547-556)、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯(Langer等，supra)，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球)以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)。
聚合物例如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能夠釋放分子長達(dá)100天以上，而一些水凝膠釋放蛋白質(zhì)的周期較短。當(dāng)封裝的蛋白質(zhì)長時(shí)間停留在體內(nèi)時(shí)，它們可能會(huì)因?yàn)樵?7℃下暴露在水分中而變性或聚集，導(dǎo)致失去生物活性和可能改變免疫原性。根據(jù)所涉及的機(jī)制，可以設(shè)計(jì)合理的策略以保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是通過二硫化物的互換(disulfide interchange)而形成分子間S-S鍵，那么可以通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍干、控制含水量、使用適當(dāng)?shù)奶砑觿?、以及開發(fā)特殊的聚合物基質(zhì)組合物實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定。
緩釋組合物還包括懸浮在適宜制劑中的抗體結(jié)晶制品，該制劑能在懸浮液中保持結(jié)晶。當(dāng)皮下注射或腹膜內(nèi)注射這些制品時(shí)，會(huì)產(chǎn)生緩釋效果。其他組合物還包括脂質(zhì)體包裹的抗體。包含這種抗體的脂質(zhì)體使用公知方法制備美國專利DE 3,218,121；Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1985)823688-3692；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1980)774030-4034；歐洲專利EP 52,322；EP 36,676；EP88,046；EP 143,949；142,641；日本專利申請83-118008；美國專利4,485,045和4,544,545；以及歐洲專利EP 102,324。
抗體制劑針對給定病人的劑量由主治醫(yī)生考慮多種已知的可以改變藥物作用的因素決定，包括疾病的嚴(yán)重程度和種類、體重、性別、飲食、時(shí)間以及給藥途徑，其他藥物以及其他有關(guān)的臨床因素。治療有效劑量既可以使用體外方法也可以使用體內(nèi)方法測定。
本文所述的治療使用的抗體有效劑量依賴于例如治療目標(biāo)、給藥途徑和患者病情。因此，治療學(xué)家優(yōu)選滴定測定劑量并按要求修改給藥途徑以獲得最佳的治療效果。根據(jù)如上所述的因素，典型的每日劑量可以在大約0.001mg/kg到至多100mg/kg或更多的范圍內(nèi)。一般地，臨床醫(yī)師將給藥治療抗體，直至達(dá)到實(shí)現(xiàn)所需效果的劑量。此療法的進(jìn)行易于通過常規(guī)檢測手段或本文所述方法監(jiān)控。
應(yīng)理解根據(jù)本文所述的組合物和方法給藥的治療實(shí)體可與摻入制劑中的適當(dāng)?shù)妮d體、賦形劑，以及其他試劑一起給藥，以提高轉(zhuǎn)移、傳遞和耐受性等等。這些制劑包括例如粉劑、糊劑、膏劑、膠凍劑、蠟劑、油劑、脂劑、含有脂類(陽離子或陰離子)的小囊(如LipofectinTM)、DNA綴合物、無水吸附糊劑、水包油和油包水乳化液、乳化聚乙二醇(不同分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠劑，以及包含聚乙二醇的半固體混合物。根據(jù)本發(fā)明制得的任何上述混合物都可以適用于醫(yī)治和治療，只要制劑中的活性成分不因該制劑而失活，以及該制劑在生理上是相容的并且耐受給藥途徑。參見Baldrick P.″Pharmaceutical excipient developmentthe need for preclinicalguidance.″Regul.Toxicol.Pharmacol.32(2)210-8(2000)，Wang W.″Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.″Int.J.Pharm.203(1-2)1-60(2000)，Charman WN″Lipids，lipophilicdrugs，and oral drug delivery-some emerging concepts.″J PharmSci.89(8)967-78(2000)，Powell等″Compendium of excipients forparenteral formulations″PDA J Pharm Sci Technol.52238-311(1998)以及其中的引文，以獲得與劑型、賦形劑和載體有關(guān)的、藥物化學(xué)家熟知的更多信息。
預(yù)期本文所述的抗體在治療由TNFα引起的癥狀和疾病中具有治療效果。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和方法涉及治療由TNFα引起的癥狀，包括發(fā)燒、肌肉酸痛、嗜睡、頭痛、惡心和炎癥。其它的實(shí)施方案，包括使用本發(fā)明的抗體和方法治療惡病質(zhì)，厭食，風(fēng)濕性疾病例如關(guān)節(jié)炎，炎性疾病例如克羅恩氏病，自身免疫性疾病例如牛皮癬、移植物抗宿主反應(yīng)和敗血癥休克。
實(shí)施例提供以下實(shí)施例，包括進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)和獲得的結(jié)果，是出于說明目的，不得解釋為對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1
抗原制備用于免疫XENOMOUSE_動(dòng)物的TNFα-KLH抗原的制備從R&D系統(tǒng)(Minneapolis，MN目錄號210-TA/CF)獲得重組人源TNFα。用于免疫XENOMOUSE_動(dòng)物的TNFα-KLH抗原通過以下步驟制取將人源TNF-α(200μg)(R&D)與50μg鑰孔血藍(lán)素(KLH；Pierce，Rockford，伊利諾伊州)混合，加蒸餾水至終體積為165μl。加入250μl交聯(lián)緩沖液(conjugation buffer)(0.1M MES，0.9MNaCl，pH 4.7)，再加入25μl 10mg/mL的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，Pierce，Rockford，伊利諾伊州)儲(chǔ)備溶液以使TNFα和KLH交聯(lián)。交聯(lián)溶液室溫下放置2小時(shí)，未反應(yīng)的EDC使用PBS pH 7.4通過1kDa的過濾器(Centrifugal filter；Millipore，Bedford，馬塞諸塞州)離心過濾除去。
用于免疫XENOMOUSE_動(dòng)物的TNFα-TCE抗原的制備人源TNFα與通用T細(xì)胞表位(TCE)(J.Immunol 1992148(5)1499)框內(nèi)融合作為融合蛋白重組生產(chǎn)，用于免疫XENOMOUSE_動(dòng)物。
人源TNFα從人類外周血單核細(xì)胞(PBMC)克隆得到。從純化的hPBMC分離mRNA，再通過反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。人源TNFα使用PCR進(jìn)行特異性擴(kuò)增，并與來自破傷風(fēng)(Tetanus)毒素的通用T細(xì)胞表位(TCE)符合讀框地克隆進(jìn)表達(dá)載體pGEX(AmershamPharmacia)。融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，使用Glutathione Sepharosebeads(目錄號17-0756-01，Amersham Pharmacia)純化，使用凝血酶(Sigma)裂解，使用制造商(Amersham Pharmacia)所述的方法洗脫。
實(shí)施例2抗體產(chǎn)生免疫通過順次免疫XENOMOUSE_小鼠(XENOMOUSE_XMG2L3或3B-3L3 Abgenix，Inc.Fremont，加利福尼亞州)獲得針對人TNFα的人源單克隆抗體。
為了產(chǎn)生雜交瘤，一群XMG2L3和3B-L3 XENOMOUSE_小鼠在腳墊部單獨(dú)使用TNFα或同時(shí)使用TNFα和CPG免疫。起初每只小鼠使用與TITERMAX GOLD_(Sigma，Oakville，俄勒岡州)以體積比1∶1混合的10μg抗原免疫。隨后每只小鼠使用與鋁佐劑(alum)(Sigma，Oakville，俄勒岡州)混合并經(jīng)過夜吸收的10μg抗原進(jìn)行4次強(qiáng)化，然后注射一次混合于TITERMAX GOLD_中的TNFα，注射一次鋁佐劑，然后每只小鼠使用10μg溶于PBS的TNFα進(jìn)行最后一次強(qiáng)化。
接受TNFα和CPG的一群小鼠首先如上所述使用TNFα和TITERMAX GOLD_免疫，接下來的6次強(qiáng)化使用如前所述的經(jīng)鋁佐劑吸收的TNFα，以及CPG。最后一次強(qiáng)化使用溶于PBS的TNFα，以及CPG。特別地，動(dòng)物在第0、3、9、16、21、25、30和35天免疫。動(dòng)物在第28和39天采血獲得血清，用于如下所述的收獲選擇。
為了由XENOMAX_產(chǎn)生mAb，一群XMG2 XENOMOUSE_小鼠用TNFα從腳墊部(FP)免疫，或者用TNFα-KLH(如實(shí)施例1制備)在尾基部通過皮下注射和腹膜內(nèi)(intraperitoneum)(BIP)免疫，或者用TNFα-TCE(如實(shí)施例1制備)在尾基部通過皮下注射并腹膜內(nèi)免疫。TNFα腳墊免疫中，每只小鼠最初使用與TITERMAXGOLD_以體積比1∶1混合的2μg抗原免疫。隨后每只小鼠使用與鋁佐劑(Sigma，Oakville，俄勒岡州)混合并經(jīng)過夜吸收的2μg抗原進(jìn)行四次強(qiáng)化，再注射一次溶于TITERMAX GOLD_的TNFα，一次鋁佐劑，然后每只小鼠使用2μg溶于PBS的TNFα進(jìn)行最后一次強(qiáng)化。特別地，動(dòng)物在第0、3、7、10、14、17、21和24天免疫。這些動(dòng)物在第19天進(jìn)行采血獲得血清，以進(jìn)行如下所述的收獲選擇。
每只小鼠最初的BIP免疫分別使用2或5μg的TNFα-KLH或TNFα-TCE，上述物質(zhì)與完全弗氏佐劑(CFA，Sigma，Oakville，俄勒岡州)以體積比1∶1混合。隨后每只小鼠先分別用與不完全弗氏佐劑(IFA，Sigma，Oakville，俄勒岡州)以體積比1∶1混合的2或5μg抗原強(qiáng)化，然后每只小鼠使用溶于PBS的抗原進(jìn)行最后一次強(qiáng)化。這些動(dòng)物在第0、14、28、42、56和第75或93(最后一次強(qiáng)化)天免疫。這些動(dòng)物在第63天進(jìn)行采血獲得血清，以進(jìn)行如下所述的收獲選擇。
為了通過SLAM法產(chǎn)生兔源抗hTNFα單克隆抗體，一群新西蘭白兔按如下方法免疫。首次強(qiáng)化使用以體積比1∶1經(jīng)完全弗氏佐劑(CFA)乳化的250μg TNFα-TCE，沿兔背部的四個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行皮下注射。接下來進(jìn)行3次免疫，經(jīng)由后肢肌內(nèi)注射以體積比1∶1由不完全弗氏佐劑(IFA)乳化的125μg TNFα-TCE。每次強(qiáng)化相隔21天。這些動(dòng)物在第四次免疫之前進(jìn)行采血以進(jìn)行血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，見表9。
選擇收獲的動(dòng)物抗hTNFα的抗體滴度由ELISA測定。用hTNFα包被CostarLabcoat通用結(jié)合聚苯乙烯(Universal Binding Polystyrene)96孔板(Corning，Acton，馬塞諸塞州)上，4度下過夜。去掉含有未結(jié)合的TNFα的溶液，將板用紫外線(365nm)處理4分鐘(4000微焦)。使用蒸餾水將板洗5次。從TNFα免疫的動(dòng)物中，或從未處理的XENOMOUSE_動(dòng)物中獲得的XENOMOUSE_血清進(jìn)行滴定測試，所述血清用2％的牛乳/PBS先以1∶100的比例稀釋后分為兩份，再以1∶2的比例稀釋。最后一孔留空。使用蒸餾水將板洗5次。加入羊抗人IgG Fc特異性辣根過氧化酶(HRP，Pierce，Rockford，伊利諾伊州)綴合的抗體，至終濃度為1μg/mL，室溫下放置1小時(shí)。使用蒸餾水將板洗5次。板上加入TMB顯色底物(Gaithersburg，馬里蘭州)培養(yǎng)30分鐘，加入1M磷酸停止ELISA反應(yīng)。每個(gè)XENOMOUSE_動(dòng)物的具體滴度通過450nm的光密度測定，列入表2到8中。滴度代表血清稀釋度的倒數(shù)，因此數(shù)值越大，對hTNFα的體液免疫應(yīng)答就越強(qiáng)烈。
兔源抗TNFα滴度按以上方法測定，但是為了檢測主要抗體，使用羊抗兔IgG重鏈和輕鏈特異性辣根過氧化酶(HRP，Pierce，Rockford，IL)試劑代替抗人試劑，見表9。
表2FP，3B-3L3小鼠，hTNFαG1 kλ


選擇表2中所有的XENOMOUSE_動(dòng)物收獲和產(chǎn)生雜交瘤。
表3FP，3B-3L3小鼠，hTNFα+CpGG1 kλ

選擇表3中所有的XENOMOUSE_動(dòng)物收獲和產(chǎn)生雜交瘤。
表4FP，XMG2L3小鼠，hTNFαG2 kλ


選擇表4中所有的XENOMOUSE_動(dòng)物收獲和產(chǎn)生雜交瘤。
表5FP，XMG2L3小鼠，hTNFα+CpGG2 kλ

選擇表5中所有的XENOMOUSE_動(dòng)物收獲和產(chǎn)生雜交瘤。
表6FP，XMG2小鼠，hTNFαIgG2/K


根據(jù)表6的血清學(xué)數(shù)據(jù)，選擇XENOMOUSE_動(dòng)物(0651-2，0651-3，0651-5和0651-9)進(jìn)行XENOMAX_收獲。
表7BIP，XMG2小鼠，hTNFα-KLHIgG2/K

根據(jù)表7的血清學(xué)數(shù)據(jù)，選擇XENOMOUSE_動(dòng)物(O797-4，O797-6，O797-7和O797-10)進(jìn)行XENOMAX_收獲。
表8BIP，XMG2小鼠，hTNFα-TCEIgG2/K


根據(jù)表8的血清學(xué)數(shù)據(jù)，選擇XENOMOUSE_動(dòng)物(O796-2，O796-4，O796-7，O796-8和O796-10)進(jìn)行XENOMAX_收獲。
表9

從兔IPI-5收獲血液，以通過SLAM方法制備兔單克隆抗體。
實(shí)施例3產(chǎn)生抗人TNFα抗體通過雜交瘤產(chǎn)生抗hTNFα抗體淋巴細(xì)胞回收，B細(xì)胞分離、融合以及產(chǎn)生雜交瘤經(jīng)過免疫的小鼠使用頸椎脫臼法處死，從各群中收集淋巴結(jié)并合并。分離淋巴樣細(xì)胞是通過在DMEM中研磨以使細(xì)胞從組織中分離，并懸浮在DMEM中。細(xì)胞計(jì)數(shù)，按每一億個(gè)淋巴細(xì)胞0.9mLDMEM的量加入細(xì)胞團(tuán)中，以使細(xì)胞緩慢但完全地重新懸浮(resuspend)。每一億個(gè)細(xì)胞中加入100μL CD90+磁珠，將細(xì)胞與磁珠4℃下保溫15分鐘以使細(xì)胞標(biāo)記。磁性標(biāo)記的細(xì)胞懸液包含多達(dá)108個(gè)陽性細(xì)胞(或總數(shù)多達(dá)2×109個(gè)細(xì)胞)，將此懸液裝載在LS+柱上，并以DMEM洗滌。收集所有的流出液作為CD90陰性部分(大部分細(xì)胞為B細(xì)胞)。
P3骨髓瘤細(xì)胞和富含B細(xì)胞的淋巴結(jié)細(xì)胞以1∶1(骨髓瘤∶淋巴結(jié))的比例結(jié)合，裝入50mL錐形管中的DMEM培養(yǎng)液中。結(jié)合細(xì)胞800xg(2000rpm)離心5～7分鐘，立即將上清液從產(chǎn)生的細(xì)胞團(tuán)中去除。在細(xì)胞中加入2到4mL鏈霉蛋白酶溶液(CalBiochem，目錄號53702；0.5mg/mL溶于PBS)使細(xì)胞團(tuán)緩慢地重新懸浮。酶處理過程不能超過2分鐘，加入3～5mL FBS終止反應(yīng)。加入足量ECF溶液使總體積達(dá)到40mL，混合物800xg(2000rpm)離心5～7分鐘。去除上清液，用少量ECF溶液使細(xì)胞團(tuán)緩慢地重新懸浮，再加入足量ECF溶液使總體積達(dá)到40mL。細(xì)胞混合均勻，計(jì)數(shù)，800xg(2000rpm)離心5～7分鐘。去除上清液，使細(xì)胞重新懸浮在少量的ECF溶液中。再加入足量的ECF溶液，將濃度調(diào)整到2×106細(xì)胞/mL。
將細(xì)胞放入電細(xì)胞融合(Electro-Cell-Fusion，ECF)發(fā)生器(Model ECM2001，Genetronic，Inc.，San Diego，加利福尼亞州)，按照制造商的說明書進(jìn)行融合。電細(xì)胞融合之后，將細(xì)胞懸液在無菌條件下小心地從融合室中取出，轉(zhuǎn)移到無菌的試管中，試管中裝有相同體積的DMEM雜交瘤培養(yǎng)基。細(xì)胞在37℃下保溫15～30分鐘，然后400xg(1000rpm)離心5分鐘。使細(xì)胞緩慢地重新懸浮于少量1/2HA培養(yǎng)基(一瓶購自Sigma，目錄號A9666的50X HA培養(yǎng)基和一升雜交瘤培養(yǎng)基)，使用更多1/2HA培養(yǎng)基將體積作適當(dāng)調(diào)整(按照每個(gè)96孔板5×106個(gè)B細(xì)胞以及每個(gè)孔200μL的標(biāo)準(zhǔn))。將細(xì)胞混合均勻，移入96孔板中生長。在第7天或第10天，去掉一半培養(yǎng)基，細(xì)胞中再加入1/2HA培養(yǎng)基。
使用ELISA法對備選抗體進(jìn)行選擇培養(yǎng)14天后，在雜交瘤上清液中篩選TNFα特異性單克隆抗體。ELISA板(Fisher，目錄號12-565-136)包被以50μL/孔的于包覆緩沖液(Coating Buffer)(0.1M碳酸鹽緩沖液，pH9.6，NaHCO38.4g/L)中的TNFα(2μg/mL)，在4℃放置過夜。放置后使用洗滌緩沖液(Washing Buffer)(0.05％Tween 20溶于PBS)將板沖洗3次。每孔加入200μL封閉緩沖液(Blocking Buffer)(0.5％BSA、0.1％Tween20、0.01％硫柳汞溶于1×PBS)，板在室溫下放置1小時(shí)。然后，用洗滌緩沖液將板沖洗3次。加入50μL/孔的雜交瘤上清液，以及陽性對照和陰性對照，將板在室溫下放置2小時(shí)。
放置后，用洗滌緩沖液將板沖洗3次。加入100μL/孔羊抗huIgGfc-HRP檢測抗體(Caltag，目錄號H10507)，羊抗hIgκ-HRP(Southern Biotechnology，目錄號2060-05)和羊抗hIgλ(SouthernBiotechnology，目錄號2070-05)，將板在室溫下保溫1小時(shí)。保溫后，用洗滌緩沖液將板沖洗3次。加入100μl/孔TMB(BioFX Lab.目錄號TMSK-0100-01)，顯色大約10分鐘(直到陰性對照孔剛剛開始顯色)，然后加入50μl/孔終止溶液(TMB終止溶液)(BioFX Lab.目錄號STPR-0100-01)，將板放在酶免疫分析儀(ELISA plate reader)上在波長450nm讀數(shù)。陽性孔的數(shù)目列入表10。
表10

使用Luminex對抗TNFα雜交瘤上清液進(jìn)行次級篩選以測定同種型和輕鏈?zhǔn)褂肔uminex平臺(tái)基于熒光珠技術(shù)，可同時(shí)運(yùn)行多項(xiàng)檢測。Luminex分析儀能在不同編碼的微球體上確定正信號事件。這就實(shí)現(xiàn)了單獨(dú)包覆各個(gè)珠，然后將不同包覆的微球體混合在一起，然后一步檢測與各不同微球體相結(jié)合的抗體。為了確定抗體的同種型，微球體的包覆方式應(yīng)當(dāng)使每個(gè)珠只能與特定的重鏈或輕鏈同種型特異結(jié)合。然后將微球體混合在一起，加入各抗體的雜交瘤上清液。保溫20分鐘后，沖洗微球體，使用熒光標(biāo)記的二次抗體檢測結(jié)合的抗體。使用Luminex分析儀分析微球體。表10顯示不同融合組中發(fā)現(xiàn)的各同種型的數(shù)目。
檢測雜交瘤抗TNFα抗體對TNFα誘導(dǎo)的凋亡的中和能力檢測了47種抗TNFα的雜交瘤抗體中和TNFα誘導(dǎo)的人類WM266.4細(xì)胞凋亡的生物效應(yīng)的能力。首先通過在Swell-Gel蛋白A(Pierce)上純化的方法從各雜交瘤上清液中富集IgG，然后洗脫、中和并定量。20,000個(gè)WM266.6細(xì)胞種植在96孔板上的完全培養(yǎng)基(RPMI1640/10％FBS/Gln/P/S)中，并在37℃/10％CO2條件下溫育過夜。去除培養(yǎng)基，在不含血清的培養(yǎng)基(RPMI1640/Gln/P/S)中加入50μL測試抗體和TNFα(室溫下預(yù)溫育30分鐘)。50μL環(huán)己亞胺(cyclohexamide)板在以下最終實(shí)驗(yàn)條件下如上溫育過夜V＝100μl，環(huán)己亞胺＝6μg/mL，TNFα＝600pg/mL＝11.4pM(三聚體形式)，實(shí)驗(yàn)抗體濃度如所述方式變動(dòng)。每孔中加入100μL半胱氨酸蛋白酶緩沖液和0.3μL半胱氨酸蛋白酶底物(APO-ONE，Promega)。
使用Victor Wallac分析儀測定半胱氨酸蛋白酶活性，激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長530nm。圖1提供了源于雜交瘤的抗體中和凋亡的例子。圖1的柱狀圖表示在人類WM 266.4細(xì)胞中不同TNFα抗體中和凋亡的效果。對照(陽性)表示只有環(huán)己亞胺時(shí)TNFα對凋亡的誘導(dǎo)。另一對照表示6nM鼠抗hTNFα抗體(R&D)對凋亡的抑制。Y軸表示半胱氨酸蛋白酶3/7活性的相對量，代表TNFα誘導(dǎo)的凋亡的程度。如圖1所示，抗體，包括3.2、3.7和4.17，在3nM可有效中和TNFα誘導(dǎo)的凋亡。
加入碘化丙錠(PI)中和凋亡的試驗(yàn)進(jìn)一步檢測47種抗hTNFα雜交瘤抗體上清液中和TNFα誘導(dǎo)的人類MCF-7細(xì)胞凋亡的生物效應(yīng)的能力。96孔板使用無酚紅的DMEM+10％FCS以5000細(xì)胞/孔，200μl/孔種植。細(xì)胞在37℃+5％CO2條件下保溫過夜。各板上在凋亡培養(yǎng)基(無酚紅的DMEM中2.5％FCS，5μg/mL CHX)中，TNFα濃度恒定為100pg/mL(三聚體則為1.9pM)的條件下滴定分析雜交瘤抗體(如實(shí)施例2所述以捕捉ELISA試驗(yàn)定量，并且與標(biāo)準(zhǔn)對照抗體曲線對比)三次，并與兔014對照抗體比較，兔014對照抗體從10μg/mL到最終濃度0.005ng/mL(滴定比1∶5)。同時(shí)包括只有TNFα的六孔板和只有凋亡培養(yǎng)基的六個(gè)孔。TNFα+/-中和抗體在37℃+5％CO2條件下預(yù)保溫1小時(shí)。然后將200μL抗體移入細(xì)胞中，在37℃+5％CO2條件下保溫過夜。
細(xì)胞使用0.5μg/mL PI和2.5μg/mL Heochst 33342染色1小時(shí)。數(shù)出死亡細(xì)胞數(shù)(PI+ve)，除以總細(xì)胞數(shù)(Heochst+ve)，得到凋亡百分率。以Heochst 33342染色后，碘化丙錠吸收與總細(xì)胞數(shù)的比值來衡量雜交瘤來源的、人抗TNFα結(jié)合抗體中和TNFα誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的能力。SLAM法生成的兔mAb，R014，以及各種其他人源mAb，包括3.2、4.17和3.7，均可有效中和TNFα誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞的凋亡。
同種型轉(zhuǎn)換和IgG2雜交瘤4.17和3.2的表達(dá)從雜交瘤4.17和3.2提取mRNA。利用反轉(zhuǎn)錄酶PCR以產(chǎn)生cDNA。利用PCR特異性擴(kuò)增編碼可變重鏈和輕鏈的cDNA。可變重鏈區(qū)克隆進(jìn)入IgG1表達(dá)載體。這種載體是通過將人IgG1恒定區(qū)克隆進(jìn)入pcDNA3.1+/Hygro(Invitrogen，Burlington，ON)的多克隆位點(diǎn)產(chǎn)生的。可變輕鏈區(qū)克隆進(jìn)入IgK表達(dá)載體或Igλ。這種載體是通過將人IgK或Igλ恒定區(qū)克隆進(jìn)入pcDNA3.1+/Neo(Invitrogen，Burlington，ON)的多克隆位點(diǎn)產(chǎn)生的。然后重鏈和輕鏈表達(dá)載體共同脂轉(zhuǎn)染進(jìn)入60mm培養(yǎng)皿的70％匯合的人胚腎293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可在24到72小時(shí)內(nèi)分泌重組抗體，該重組抗體與原始漿細(xì)胞有相同的特異性。從人胚腎293細(xì)胞中汲取上清液(3mL)，使用夾心ELISA法(sandwich ELISA)特異性檢測到人源IgG，表明有完整的抗體分泌。特異性采用ELISA法將重組抗體與TNFα結(jié)合來評定。
由XENOMAX_產(chǎn)生抗hTNFα抗體培養(yǎng)和選擇B細(xì)胞收獲動(dòng)物中的B細(xì)胞并培養(yǎng)。分離分泌TNFα特異性抗體的細(xì)胞，如Babcook等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，937843-7848(1996)所述。使用ELISA法識(shí)別主要的TNFα特異性孔。來自XENOMOUSE_動(dòng)物的大約1800萬個(gè)B細(xì)胞培養(yǎng)在480個(gè)96孔板上，500或150個(gè)細(xì)胞/孔，根據(jù)TNFα對細(xì)胞進(jìn)行篩選以識(shí)別抗原特異性孔。3,825個(gè)孔表現(xiàn)出顯著高于背景的OD值，代表性例子列入表11。兔B細(xì)胞也根據(jù)其分泌抗TNFα抗體的能力進(jìn)行篩選，陽性者按如下所述進(jìn)一步分析。
表11

抗原特異性抗體濃度的標(biāo)準(zhǔn)化利用ELISA方法，可將上清液中抗原特異性抗體的濃度標(biāo)準(zhǔn)化。利用已知濃度的抗目標(biāo)(TNFα)抗體平行滴定，可以生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，上清液中抗原特異性抗體的量可以與標(biāo)準(zhǔn)比較，以得到濃度數(shù)值，見下表12。
表12

*去掉ELISA分析儀線性區(qū)之外的數(shù)據(jù)點(diǎn)。
限制性抗原試驗(yàn)限制性抗原分析是根據(jù)親和力將B細(xì)胞培養(yǎng)上清液中制備的抗原特異性抗體相對于所有其他抗原特異性抗體劃分等級。在抗原包被極低的情況下，平衡時(shí)僅有親和力最高的抗體才能結(jié)合至任何水平可檢測到的抗原。(見，例如，PCT公開文本W(wǎng)O/03048730A2題目“IDENTIFICATION OF HIGH AFFINITY MOLECULES BYLIMITED DILUTION SCREENING”公開于2003年6月12日)。
在96孔培養(yǎng)板上，于室溫下將生物素化(Biotinylated)TNFα以三種濃度，即1ng/mL、0.1ng/mL和0.01ng/mL結(jié)合至鏈親和素(streptavidin)板1小時(shí)。各板使用蒸餾水沖洗5次，然后在板中加入45μL 1％的牛乳/PBS，以及0.05％的疊氮化鈉，然后各孔加入5μL的B細(xì)胞上清液。室溫下在攪拌器上攪拌18小時(shí)，再用蒸餾水將板沖洗5次。向各孔中加入50μL 1μg/mL的Gt抗人(Fc)-HRP。室溫下經(jīng)過1小時(shí)，再用蒸餾水將板沖洗5次，然后在各孔中加入50μL的TMB底物。各孔中加入50μL 1M磷酸終止反應(yīng)，板在波長450nm讀數(shù)，結(jié)果列入表13。
表13

限制性抗原分析制備B細(xì)胞培養(yǎng)上清液，其抗原特異性抗體的濃度范圍為10ng/mL到1000ng/mL。限制性抗原分析產(chǎn)生的結(jié)果與4.17雜交瘤來源的抗體滴定相比較。在這個(gè)試驗(yàn)中，許多抗體不能夠產(chǎn)生可檢測的結(jié)合，然而也有許多孔，包括401A7和433F4，在所有濃度下測得的O.D.值均明顯高于其他培養(yǎng)上清液和重組抗體(表13)。結(jié)合衡量特異性抗體濃度的高抗原數(shù)據(jù)(詳細(xì)內(nèi)容見上)和限制性抗原輸出，進(jìn)一步分析其余的克隆。這樣，就可以在如圖2所示的濃度范圍內(nèi)比較B細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的抗體和對照抗體。圖2為在一定濃度范圍內(nèi)比較B細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的抗體和對照抗體(4.17IgG2)的抗TNFα限制性抗原結(jié)合的點(diǎn)圖。三角形表示B細(xì)胞培養(yǎng)上清液克隆，方塊表示Bar抗體(4.17IgG2)。對應(yīng)點(diǎn)在Bar抗體曲線之上的B細(xì)胞培養(yǎng)上清液克隆歸于具有潛在高親和力的一類。
加入碘化丙錠(PI)中和凋亡的試驗(yàn)對來自腳墊免疫小鼠的B細(xì)胞培養(yǎng)孔上清液中識(shí)別的所有1455種抗hTNFα抗體進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)，以檢測它們中和TNFα誘導(dǎo)的人類MCF-7細(xì)胞凋亡的生物效應(yīng)的能力。另外，在對從BIP免疫動(dòng)物識(shí)別出的所有2,370種抗hTNFα進(jìn)行限制性抗原分析之后，對動(dòng)力學(xué)等級(kinetic ranking)最高的145種抗體進(jìn)一步分析它們中和TNFα的活性。96孔板上使用無酚紅DMEM+10％FCS以5000細(xì)胞/孔、200μL/孔種植MCF-7細(xì)胞。板在37℃+5％CO2條件下保溫過夜。各板上B細(xì)胞培養(yǎng)抗體上清液在凋亡培養(yǎng)基(無酚紅的DMEM中2.5％FCS，5μg/mL CHX)中，TNFα濃度恒定為100pg/mL(三聚體則為1.9pM)的條件下，與最有效的中和抗TNFα雜交瘤抗體，4.17和3.2和/或兔014對照一起分析。同時(shí)包括含有于凋亡培養(yǎng)基中的TNFα的平行(replicate)孔和只有凋亡培養(yǎng)基的孔作為對照。TNFα+/-試樣在37℃+5％CO2條件下預(yù)保溫1小時(shí)。200μL TNFα+/-移入細(xì)胞，并在37℃+5％CO2條件下保溫過夜。
使用0.5μg/mL PI和2.5μg/mL Heochst 33342將細(xì)胞染色1小時(shí)。數(shù)出死細(xì)胞數(shù)(PI+ve)，除以總細(xì)胞數(shù)(Heochst+ve)，得到凋亡百分率。圖3為一示例，是在人類MCF-7細(xì)胞中，對不同的XENOMAX_B細(xì)胞培養(yǎng)上清液抑制TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的效率進(jìn)行比較的代表性柱狀圖。許多B細(xì)胞培養(yǎng)孔上清液顯示出中和TNFα誘導(dǎo)的凋亡的能力。這些上清液包括164C7、179B1、401A7、410B1、439A3和460A12。
多克隆溶液中抗hTNFα抗體中和TNFα誘導(dǎo)的凋亡的效能檢測利用多克隆B細(xì)胞培養(yǎng)上清液中抗原特異性抗體的外推濃度，可計(jì)算出中和TNFα誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞凋亡的表觀效能。對標(biāo)準(zhǔn)抗目標(biāo)試劑作平行實(shí)驗(yàn)，此處為雜交瘤來源的抗體3.2IgC2，就可以建立效能柱狀圖，并且尋找潛在效能高于標(biāo)準(zhǔn)的抗體。
對中和TNFα誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞凋亡的計(jì)算效能進(jìn)行比較，例子顯示于圖4。圖4顯示了對XENOMAX_B細(xì)胞培養(yǎng)上清液中和TNFα誘導(dǎo)的人類MCF-7細(xì)胞凋亡的計(jì)算效能進(jìn)行比較的點(diǎn)圖。三角形代表B細(xì)胞培養(yǎng)上清液的效能，而方塊代表Bar抗體，3.2IgG2的效能。許多B細(xì)胞培養(yǎng)上清液在低抗TNFα抗體濃度時(shí)，與3.2對照標(biāo)準(zhǔn)曲線相比，可更強(qiáng)地中和TNFα誘導(dǎo)的凋亡，表明其具有更強(qiáng)的效能。
兔抗體抑制TNFα結(jié)合p55(TNFα受體I)兔抗TNFα中和抗體的發(fā)現(xiàn)是通過檢測來自B細(xì)胞培養(yǎng)上清液的抗體是否能夠抑制TNFα與其p55受體結(jié)合。接下來進(jìn)行如下步驟。96孔微量滴定板以TNFα包被，過夜。第二天，將板沖洗，溫育+/-抗TNFα抗體1小時(shí)。然后將生物素-p55加入板中，過1小時(shí)后用水沖洗，使用鏈親和素-HRP檢測結(jié)合的p55。然后按照以上所述的ELISA方法將板沖洗和顯色。抑制p55結(jié)合的抗體稱為中和的，見表14。
表14


TNFα特異性溶血蝕斑試驗(yàn)使用幾種專門的試劑進(jìn)行此項(xiàng)試驗(yàn)。這些試劑按如下方法制備。
綿羊紅細(xì)胞(SRBC)的生物素化SRBC以25％原液保存在RPMI培養(yǎng)基中。為獲得250μL綿羊紅細(xì)胞沉淀，取1.0mL SRBC放入新的微量離心管(eppendorf tube)中。SRBC在微量離心機(jī)中以8000rpm(6800rcf)的脈沖旋轉(zhuǎn)沉淀，除掉上清液，沉淀重新懸浮于1.0mL pH為8.6的PBS中，重復(fù)離心。洗滌循環(huán)重復(fù)2次，SRBC沉淀轉(zhuǎn)入一支15mL的falcon管中，加入pH8.6的PBS至體積為5mL。在一支單獨(dú)的50mL falcon管中，在45mL pH8.6的PBS中加入2.5mg硫代NHS生物素。生物素完全溶解后，立即加入5mL SRBC，將管在室溫下旋轉(zhuǎn)1小時(shí)。SRBC在3000rpm離心5分鐘，去除上清液。生物素化SRBC移入微量離心管，換用pH7.4的PBS按如上所述沖洗3次，然后在15mL falcon管中加入免疫細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI 1640)至體積為5mL(5％B-SRBC原液)。原液4℃下保存?zhèn)溆谩?br> 以鏈親和素(SA)包被B-SRBC取1mL 5％B-SRBC原液，放入新的微量離心管中。B-SRBC細(xì)胞按如上方法洗3次，重新懸浮于1.0mL pH7.4的PBS中，終濃度為5％(v/v)。加入10μL 10mg/mL的鏈親和素儲(chǔ)備溶液(CalBiochem，San Diego，加利福尼亞州)，將管在室溫下混勻和旋轉(zhuǎn)20分鐘。重復(fù)沖洗步驟，SA-SRBC重新懸浮于1mL pH7.4的PBS中(5％(v/v))。
以人源TNFα包被SA-SRBCSA-SRBC以10μg/mL的生物素化TNFα包被，在室溫下混勻和旋轉(zhuǎn)20分鐘。SRBC使用1.0mL pH7.4的PBS按如上方法洗2次。TNFα包被的SRBC重新懸浮于RPMI(+10％FCS)中，終濃度為5％(v/v)。
以免疫熒光法(IF)檢測TNFα-SRBC的質(zhì)量將10μL 5％的SA-SRBC和10μL 5％的TNFα包被的SRBC分別加入到單獨(dú)的含40μL PBS的1.5mL新微量離心管中。將對照人源抗TNFα抗體加入各SRBC試樣中，濃度為45μg/mL。將管在室溫下旋轉(zhuǎn)25分鐘，然后將細(xì)胞用100μL PBS洗3次。細(xì)胞重新懸浮于50μLPBS中，與40μg/mL的結(jié)合于Alexa488(Molecular Probes，Eugene，OR)的羊抗人IgG Fc抗體共同溫育。將管在室溫下旋轉(zhuǎn)25分鐘，然后使用100μL PBS沖洗，細(xì)胞重新懸浮于10μL PBS中。取10μL染色的細(xì)胞，滴于干凈的玻璃載玻片上，上面蓋上玻璃蓋玻片，在熒光下觀察，以0～4中的任意數(shù)值計(jì)分。
制備漿細(xì)胞收獲單個(gè)微培養(yǎng)孔的內(nèi)容物，所述內(nèi)容物經(jīng)過前面多種檢測已識(shí)別出其含有分泌目標(biāo)免疫球蛋白的B細(xì)胞克隆。利用100-1000μL的微量吸管，加入37℃RPMI(10％FCS)回收孔中的內(nèi)容物。通過吹吸使細(xì)胞重新懸浮，然后轉(zhuǎn)移到新的1.5mL的微量離心管中(終體積大約為500-700μL)。細(xì)胞使用微量離心機(jī)在室溫下以2500rpm(660rcf)離心1分鐘，將管旋轉(zhuǎn)180度，以2500rpm再次離心1分鐘。去除冷凍培養(yǎng)基，免疫細(xì)胞重新懸浮于100μL RPMI(10％FCS)中，然后離心。重復(fù)使用RPMI(10％FCS)洗滌，細(xì)胞重新懸浮于60μL RPMI(10％FCS)中，保存于冰塊上備用。
蝕斑試驗(yàn)預(yù)先準(zhǔn)備載玻片(2×3英寸)，在邊緣涂上硅樹脂(silicone)室溫下過夜使其固化。使用前，用大約5μL SigmaCoat(Sigma，Oakville，ON)處理載玻片，在玻璃表面涂抹均勻，干燥后用力擦拭。在60μL細(xì)胞試樣中，加入TNFα包被的SRBC(5％v/v原液)、在RPMI(10％FCS)中制備的4x豚鼠(guinea pig)補(bǔ)體(Sigma，Oakville，ON)原液、以及4x增強(qiáng)血清原液(在RPMI(10％FCS)中1∶150)各60μL。將混合物(10-15μL)滴于準(zhǔn)備好的載玻片上，上面覆蓋以未稀釋的石蠟油。載玻片在37℃溫育至少45分鐘。
蝕斑實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用TNFα包被的綿羊紅細(xì)胞識(shí)別孔中的抗原特異性漿細(xì)胞(見表15)。
表15

重組抗TNFα抗體的表達(dá)單個(gè)的漿細(xì)胞分離后，提取mRNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄酶PCR操作，以產(chǎn)生編碼可變重鏈和輕鏈的cDNA。克隆人源可變重鏈區(qū)，轉(zhuǎn)換同種型進(jìn)入IgG1表達(dá)載體。該載體通過將人源IgG1的恒定區(qū)克隆進(jìn)入pcDNA3.1+/Hygro(Invitrogen，Burlington，ON)的多克隆位點(diǎn)而產(chǎn)生。人源可變輕鏈區(qū)克隆進(jìn)入IgK表達(dá)載體。這些載體通過將人源IgK的恒定區(qū)克隆進(jìn)入pcDNA3.1+/Neo(Invitrogen，Burlington，ON)的多克隆位點(diǎn)而產(chǎn)生。然后重鏈和輕鏈表達(dá)載體共同脂轉(zhuǎn)染進(jìn)入60mm培養(yǎng)皿的70％匯合的人胚腎293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可在24到72小時(shí)內(nèi)分泌重組抗體，該重組抗體與原始漿細(xì)胞有相同的特異性。從人胚腎293細(xì)胞中汲取上清液(3mL)，使用夾心ELISA法特異性檢測到人源IgG，表明有完整的抗體分泌(表16)。特異性采用ELISA法將重組抗體與TNFα結(jié)合來評定。
表16

按如下步驟進(jìn)行分泌ELISA實(shí)驗(yàn)。對照板以2mg/mL羊抗人IgGH+L包被過夜作為結(jié)合板，將hTNFα包被在Costar Labcoat通用結(jié)合聚苯乙烯96孔板，保持4℃過夜。用蒸餾水將板沖洗5次。從未稀釋的微脂轉(zhuǎn)染上清液中選7孔以1∶2滴定重組抗體。用蒸餾水將板沖洗5次。加入羊抗人IgG Fc特異性、HRP綴合的抗體至終濃度為1μg/mL，室溫下放置1小時(shí)，以進(jìn)行分泌實(shí)驗(yàn)和兩項(xiàng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)。用蒸餾水將板洗5次。板中加入TMB顯色30分鐘，加入1M磷酸終止ELISA反應(yīng)。各ELISA板在450nm處測定各個(gè)孔的光密度。
兔源抗體基因按如上方式獲取、克隆和表達(dá)，但須克隆進(jìn)入包含兔IgG1重鏈恒定區(qū)或κ恒定區(qū)的載體。將細(xì)胞從孔7A4(表14)上分離、克隆并表達(dá)為完全兔源抗體，R014(AB-TNFα-R014)。
重組抗TNFα抗體的純化為進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，重鏈和輕鏈表達(dá)載體(2.5μg各鏈/培養(yǎng)皿)脂轉(zhuǎn)染進(jìn)入10個(gè)100mm的培養(yǎng)皿中，其中有70％匯合的人胚腎293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在37℃下溫育4天，取上清液(6mL)，然后補(bǔ)入6mL新鮮培養(yǎng)基。第7天，取出上清液并與最初取出的上清液合并(10個(gè)板共有120mL)。使用蛋白A瓊脂糖凝膠(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)親和色譜法從上清液中純化出各種抗體(1mL)?？贵w使用500mcL的0.1M甘氨酸(pH2.5)從蛋白A柱中洗脫。洗脫物在pH7.4的PBS中透析并過濾殺菌。使用非還原SDS-PAGE分析抗體，測定純度和產(chǎn)量。同時(shí)在OD250處使用紫外分析測定濃度。
實(shí)施例4抗TNFα抗體與跨膜TNFα結(jié)合可溶性和膜結(jié)合的TNFα均可與TNFα受體相互作用，引起TNFα促炎癥效應(yīng)(pro-inflammatory effect)。因此，除了可溶性TNFα分子外，確定299v2和263是否能夠與膜結(jié)合的TNFα有效結(jié)合非常重要。為此，使用TNFα轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞以及活化的T細(xì)胞。
測定抗TNFα試劑與在CHO細(xì)胞表面表達(dá)的跨膜突變TNFα的結(jié)合。具體地說，測定純化的、量化的IgG2κ和λ雜交瘤抗體，以及同種型轉(zhuǎn)換的雜交瘤和XENOMAX_來源的IgG1重組抗體與在中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)表面表達(dá)的跨膜TNFα結(jié)合的能力。TNFα的cDNA在多個(gè)位置產(chǎn)生突變，以防止TNFα從細(xì)胞表面分裂。然后將cDNA克隆進(jìn)入表達(dá)載體。將CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染，對穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行藥物選擇，以產(chǎn)生DTNFα細(xì)胞系。滴定抗TNFα抗體和依那西普(Etanercept，重組人TNF受體融合蛋白)，并加入DTNFαCHO細(xì)胞，冰上放置1或18小時(shí)。使用冷的PBS洗滌細(xì)胞，二級生物素化抗兔或人IgG在冰上再保溫10分鐘，洗滌，加入三級SA-PE標(biāo)記的抗體，在冰上再放置10分鐘。使用熒光活化細(xì)胞分選(FACS)在不同抗體濃度下測定結(jié)合和染色曲線。
低濃度下，人源抗體，以及嵌合的英夫利昔單抗(Infliximab)和兔R014，與細(xì)胞上跨膜形式的TNFα結(jié)合，而依那西普則明顯表現(xiàn)較低的結(jié)合信號。299v2、263、英夫利昔單抗、阿達(dá)木單抗和依那西普在DTNF-CHO細(xì)胞上以0.1μg/mL的濃度在4℃下溫育18小時(shí)。對于單克隆抗體，299v2和阿達(dá)木單抗的染色程度明顯比263和英夫利昔單抗低。結(jié)果數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)c介導(dǎo)的效應(yīng)，例如抗體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)和抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)應(yīng)該可以在表達(dá)跨膜TNFα的細(xì)胞中觀察到。許多產(chǎn)生的抗體可能比英夫利昔單抗和依那西普具有更強(qiáng)的Fc介導(dǎo)的效應(yīng)。這可能特別有利于治療細(xì)胞表面TNFα起主要病理生理作用的疾病，比如克羅恩氏病或牛皮癬。
為了治療主要發(fā)病狀態(tài)可能由可溶形式的TNFα介導(dǎo)的疾病適應(yīng)癥，可能需要具有低Fc介導(dǎo)的效應(yīng)物功能的抗體。這可以通過將抗TNFα抗體表達(dá)為IgG2或IgG4同種型來實(shí)現(xiàn)。
同時(shí)還測定了抗TNFα試劑與活化PBMC的結(jié)合。PBMC從正常供體中分離，與抗CD3抗體共同溫育以活化T細(xì)胞。T細(xì)胞活化說明膜結(jié)合TNFα有表面TNFα表達(dá)。在不同濃度下再次測定抗TNFα試劑與膜結(jié)合的TNFα結(jié)合的能力，方法是使用FACS分析，根據(jù)光散射對淋巴細(xì)胞進(jìn)行″門控制″(gating)，以及使用與PE結(jié)合的抗人IgG二級抗體。染色結(jié)果數(shù)據(jù)表明，所有的單克隆抗體，299v2、263、英夫利昔單抗和阿達(dá)木單抗均能在T細(xì)胞活化后將淋巴細(xì)胞染色，而依那西普卻不能。如果T細(xì)胞不活化，抗TNFα抗體均無法使淋巴細(xì)胞染色。
實(shí)施例5表位分箱(binning)實(shí)驗(yàn)抗TNFα抗體的表位圖譜以下記敘了繪制抗TNFα抗體的表位圖譜的方法。利用人和小鼠TNFα來構(gòu)建和表達(dá)嵌合TNFα蛋白。表17提供了人和小鼠TNFα的比對。
表17人 VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANA小鼠LRSSSQNSSDKPVAHVVANHQVEEQLEWLSQRANA人 LLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCP小鼠LLANGMDLKDNQLVVPADGLYLVYSQVLFKGQGCP人 STHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRE小鼠DY-VLLTHTVSRFAISYQEKVNLLSAVKSPCPKD人 TPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINR小鼠TPEGAELKPWYEPIYLGGVFQLEKGDQLSAEVNL人 PDYLDFAESGQVYFGIIALSEQ ID NO265小鼠PKYLDFAESGQVYFGVIALSEQ ID NO266利用人源和鼠源TNFα-a基因共有的限制酶切位點(diǎn)來構(gòu)建框內(nèi)融合的TNFα嵌合蛋白。制成7種構(gòu)建體人源TNFα、小鼠、TNFαH/MBglI、M/H BglI、H/M HincII、H/M PvuII、M/H PvuII。所有蛋白的表達(dá)和分泌，均在使用針對人源和鼠源TNFα的多克隆抗體進(jìn)行ELISA試驗(yàn)中可檢測到的水平上。嵌合TNFα蛋白氨基酸連接點(diǎn)位于BgII-36/37、HincII-90/92、PvUII-124/126。后兩種情況中的一個(gè)氨基酸差異是由于在鼠源TNFα序列中位置73缺少一個(gè)組氨酸殘基。通過ELISA將抗TNFα抗體與這些蛋白結(jié)合的例子列入表18。
表18


為了確定不同抗體的結(jié)合位點(diǎn)，通過位點(diǎn)定向誘變使許多hTNFα殘基發(fā)生突變。通過ELISA法篩選一組結(jié)合抗體。人源殘基在位置27，31和131被鼠源殘基替換。位置73的組氨酸缺失，一實(shí)例列入表19。
表19


如表19所示，兔014、4.17、SC291、SC299和SC313的結(jié)合位點(diǎn)位于人源TNFα的前36個(gè)氨基酸殘基中。已經(jīng)表明氨基酸31-35參與受體識(shí)別和激發(fā)生物應(yīng)答(Jones，E.Y.，Stuart，D.I.，和Walker，NPC.，(1992)，Tumor Necrosis FactorsStructure，F(xiàn)unction andMechanism of Action(Aggarwal，B.B.，和Vilcek，J.，編輯)93-127頁，Marcel Dekker，Inc.，紐約)。引入Arg31這一非保守性變化以進(jìn)一步繪制表位圖譜。位置31的單個(gè)氨基酸變化表明可以完全阻止SC291，SC299和SC313的結(jié)合，而mAb 4.17只失去80％的結(jié)合活性，需要再在位置27發(fā)生變化才能阻止4.17的活性。
MAb 3.2的結(jié)合位點(diǎn)位于殘基1到91之間。盡管Gln27和Arg31的置換不會(huì)影響它結(jié)合人源TNFα，但是N-末端似乎是結(jié)合活性所必需的。Mab 3.7的表位位于殘基36到157之間。
使用單克隆抗體SC250、SC263、SC269、SC282、SC283和英夫利昔單抗均不能中和嵌合體。所有這些抗體對人源TNFα具有高度特異性，它們的表位是一組殘基，位于TNFα多肽上不同的、且不相鄰的位置。Gln27、Arg31、His73和Arg131都不涉及中和結(jié)合位點(diǎn)。
表20總結(jié)了對299v2、263、依那西普、英夫利昔單抗和阿達(dá)木單抗繪制的更多表位圖譜的結(jié)果。如表20所示，299v2、依那西普和阿達(dá)木單抗可以結(jié)合包含人源TNF氨基酸1到氨基酸36之間區(qū)域的嵌合蛋白，而263和英夫利昔單抗不與任何嵌合蛋白結(jié)合。所有抗TNF抗體都與人源TNF結(jié)合，但是都不與鼠源TNF結(jié)合。這些結(jié)果表明，299v2、依那西普和阿達(dá)木單抗的結(jié)合區(qū)域很可能包含在TNF的前36個(gè)氨基酸中，而263和英夫利昔單抗的結(jié)合區(qū)域分散在整個(gè)分子上。所有抗TNF抗體都與蛋白變性敏感區(qū)結(jié)合，表明它們的結(jié)合區(qū)具有構(gòu)象。
表20

進(jìn)一步分析TNFα受體p75-hFc和p55-hFc(R&D，目錄號372-RI-050和372-RI/CF)結(jié)合TNFα蛋白的情況，如表21所示。
表21


實(shí)施例6抗獼猴TNFα的結(jié)合交叉反應(yīng)性與人源和猴源可溶性重組TNFα結(jié)合同時(shí)還測定了抗TNFα抗體結(jié)合可溶性重組TNFα的能力。人源和猴源(獼猴(cynomolgous macaque))TNFα以GST融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)。由ELISA測定結(jié)合性。299v2、263、依那西普、英夫利昔單抗和阿達(dá)木單抗(″抗TNFα抗體″)在96孔板中溫育過夜，所述96孔板包被以0.5μg/mL人源GST-TNFα、2μg/mL猴源GST-TNFα和10μg/mL GST。使用HRP綴合的羊抗人IgG抗體檢測結(jié)合抗體。結(jié)果顯示，所有抗TNFα抗體以類似的劑量應(yīng)答與人源TNFα結(jié)合(圖5)。抗TNFα抗體與猴源TNFα的結(jié)合不同。299v2、依那西普和阿達(dá)木單抗與獼猴TNFα以相似的方式結(jié)合，而263和英夫利昔單抗似乎不與獼猴TNFα結(jié)合(圖6)。
實(shí)施例7動(dòng)力學(xué)分析使用KinExA_和BIACORE_技術(shù)測定抗TNFα抗體的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。KinExA_方法包括溶液中測定平衡狀態(tài)的表觀親和力(foramalaffinity)數(shù)據(jù)。為了測定各種人源抗TNFα抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，進(jìn)行兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，各重復(fù)三次。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中均滴定已知濃度的抗原，每種抗原滴定液中加入不同濃度的抗體，并且達(dá)到結(jié)合平衡。為了測定人源TNFα的Kd值，使用三聚體(52.5kDa)，見表22，或三單體(17.5kDa)，見表23，的摩爾TNFα結(jié)合位點(diǎn)濃度來計(jì)算Kd。使用對偶曲線分析(dual curve analysis)來分析結(jié)果。兔R014抗體動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)測定基本采用上述方法，然而，未知抗原濃度法改用已知抗體濃度以計(jì)算Kd值。另外，為了排除可能的親合效果(avidity effect)，使用木瓜蛋白酶裂解產(chǎn)生Fab碎片，重復(fù)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析(見表24)。
使用BIACORE_產(chǎn)品的資料文件中所述的方法，還可以從其有關(guān)數(shù)據(jù)計(jì)算出其它的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。締合速率常數(shù)(ka)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)動(dòng)力學(xué)計(jì)算得到的表示抗體與目標(biāo)抗原的結(jié)合強(qiáng)度(程度)的數(shù)值。離解速率常數(shù)(kd)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)動(dòng)力學(xué)計(jì)算得到的表示此單克隆抗體與目標(biāo)抗原的解離強(qiáng)度(程度)的數(shù)值。離解速率常數(shù)(kd)值除締合速率常數(shù)(ka)值得到離解常數(shù)(Kd)，見表25。
表22

*本實(shí)驗(yàn)中使用與依那西普(Enbrel)相似的p75-hFc構(gòu)建體(R&D系統(tǒng))。使用依那西普可得到類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未列出)。
**每個(gè)實(shí)驗(yàn)的誤差在6～7％之間。
表23

*本實(shí)驗(yàn)中使用與依那西普(Enbrel)相似的p75-hFc構(gòu)建體(R&D系統(tǒng))。使用依那西普可得到類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未列出)。
**每個(gè)實(shí)驗(yàn)的誤差在6～7％之間。
表24

表25

對299v2與獼猴TNFα的結(jié)合親和力也進(jìn)行了測定，因?yàn)樵贓LISA實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這種抗體可與猴源TNFα結(jié)合。KinExA法也用來測定反映這種結(jié)合親和力的Kd值。299v2結(jié)合猴源TNFα的親和力為626pM，將TNFα看作單體，因此比與人源TNFα的親和力大約低200倍。
實(shí)施例8體外抗hTNFα抗體特性在人MCF-7細(xì)胞中抑制TNFα誘導(dǎo)的凋亡使用如前所述的方法大量培養(yǎng)、純化和定量IgG2κ和λ雜交瘤。使用如前所述的方法表達(dá)、純化和定量同種型轉(zhuǎn)換的雜交瘤和XENOMAX_來源的IgG1重組抗體。進(jìn)一步測定抗體中和TNFα誘導(dǎo)的人類MCF-7細(xì)胞凋亡的生物效應(yīng)的能力。96孔板使用無酚紅的DMEM+10％FCS以5000細(xì)胞/孔、200μL/孔種植MCF-7細(xì)胞。板在37℃+5％CO2條件下溫育過夜。在各個(gè)板上，對各種抗體進(jìn)行滴定實(shí)驗(yàn)，終濃度為0.005ng/ml到10μg/mL。抗TNF試劑在凋亡培養(yǎng)基(無酚紅的DMEM中有2.5％FCS，5μg/mL CHX)中稀釋，三倍或多達(dá)六倍，TNFα的恒定濃度為100pg/mL(作為三聚物為1.9pM)。還包括凋亡培養(yǎng)基中只有TNFα的6孔板和只有凋亡培養(yǎng)基的6孔板。TNFα+/-中和抗體在37℃+5％CO2條件下預(yù)溫育1小時(shí)或18小時(shí)。將200μL TNFα+/-中和抗體加入到細(xì)胞中，在37℃+5％CO2條件下溫育過夜。
細(xì)胞用0.5μg/mL PI和2.5μg/mL Heochst 33342染色1小時(shí)。數(shù)出死細(xì)胞數(shù)(PI+ve)，除以總細(xì)胞數(shù)(Heochst+ve)，得到凋亡百分率。使用MCF-7細(xì)胞檢測中和，并作為碘化丙錠和Heochst 33342染色的比例探測。圖7和圖8以線狀圖的形式提供中和抗體滴定曲線的實(shí)例，該曲線可通過四參數(shù)曲線擬合導(dǎo)出IC50值。
表26所示結(jié)果為體外抑制TNF誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞凋亡的不同實(shí)驗(yàn)，在抗體與TNF預(yù)溫育1小時(shí)或18小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)所獲數(shù)據(jù)的平均值。較長的18小時(shí)預(yù)溫育時(shí)間可使親和力差異更加容易地被觀察到，因?yàn)榭贵w-抗原結(jié)合反應(yīng)更接近平衡狀態(tài)。299v2在所有完全人源單克隆抗體和英夫利昔單抗中，顯示出最低的IC50值。同時(shí)還觀察到在親和力和中和效能之間有強(qiáng)相關(guān)性。
表26

抗TNFα中和凋亡的IC50平均值的例子顯示于柱狀9中。如圖9所示，所有抗體均為TNFα誘導(dǎo)的凋亡的有效中和劑。特別地，抗體299v2表現(xiàn)出比英夫利昔單抗，阿達(dá)木單抗或依那西普更強(qiáng)的平均效能。
表27顯示兔R014單克隆抗體與TNF預(yù)溫育1小時(shí)后，TNF誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞凋亡的抑制。
表27

*實(shí)驗(yàn)次數(shù)抑制TNFα誘導(dǎo)的人類WM 266.4細(xì)胞的凋亡按如上所述大量培養(yǎng)、純化和定量IgG2κ和λ雜交瘤。使用如上所述的方法表達(dá)、純化和定量同種型轉(zhuǎn)換的雜交瘤和XENOMAX_來源的IgG1重組抗體。進(jìn)一步測定抗體中和TNFα誘導(dǎo)的人類WM266.4細(xì)胞凋亡的生物效應(yīng)的能力。20,000 WM266.6細(xì)胞種植在96孔板中的完全培養(yǎng)基(RPMI1640/10％FBS/Gln/P/S)中，并在37℃/10％CO2條件下溫育過夜。去掉培養(yǎng)基，將50μL實(shí)驗(yàn)抗體加TNFα(室溫下預(yù)保溫30分鐘)加入無血清培養(yǎng)基(RPMI1640/Gln/P/S)。50mL環(huán)己亞胺板在以下最終實(shí)驗(yàn)條件下如上保溫過夜V＝100ml，環(huán)己亞胺＝6μg/mL，TNFα＝600pg/mL＝11.4pM(三聚體形式)。實(shí)驗(yàn)抗體濃度如所述方式變動(dòng)。每孔中加入100μL半胱氨酸蛋白酶緩沖液和0.3μL半胱氨酸蛋白酶底物(APO-ONE，Promega)。使用VictorWallac分析儀測定半胱氨酸蛋白酶活性；激發(fā)波長485nm；發(fā)射波長530nm。圖10顯示抗體中和凋亡能力的例子。圖10為顯示抗TNFα中和的IC50平均值的柱狀圖。在人類WM266細(xì)胞中進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)，測定半胱氨酸蛋白酶活性作為TNFα誘導(dǎo)的凋亡的指標(biāo)。按圖7中簡要敘述的方法計(jì)算抗體IC50值。
一對照組顯示TNFα和環(huán)己亞胺單獨(dú)誘導(dǎo)的凋亡。其他的對照組包括兔014抗體，以及英夫利昔單抗和p75-hFc(R&D)，它們作為依那西普的替代物。圖中顯示半胱氨酸蛋白酶活性作為TNFα誘導(dǎo)的凋亡的量度。從圖10中可以看出，SC299V1和SC299V2抗體彼此十分相似，并且除了R014以外，263以及或許234比英夫利昔單抗和p75-hFc更有效。4.17 IgG2、SC282和3.2 IgG2比p75-hFc更有效。圖10還說明，所有抗體均為TNFα誘導(dǎo)的凋亡的有效中和劑。
抑制人全血中TNFα誘導(dǎo)的IL-8的產(chǎn)生人全血培養(yǎng)物可復(fù)制出臨床相關(guān)的天然存在的條件，該條件可能不存在于細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物體內(nèi)。全血培養(yǎng)用來評定抗TNFα抗體中和TNFα誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-8的效能。全血通過靜脈穿刺法從正常供體中獲取，收集在EDTA管中，種植于96孔板中?？筎NFα抗體在RPMI培養(yǎng)基中稀釋，并與全血混合。使用不相關(guān)的人源IgG1抗體作為對照。然后加入TNFα(最終濃度100pg/ml，將TNFα看作三聚體相應(yīng)為1.9pM)。板在37℃下溫育6小時(shí)。溫育后，培養(yǎng)物中加入Triton X-100至終濃度為0.5％(v/v)，以使細(xì)胞裂解。使用ELISA法測定產(chǎn)生的IL-8。為了表示結(jié)果，在IgG1對照存在的條件下由TNFα誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-8的量設(shè)為100％。表28報(bào)道了使用抑制曲線(圖11)計(jì)算出的抗TNFα抗體的IC50值。299v2和依那西普替代物顯示出最低的IC50值和最高的效能。
表28

*本實(shí)驗(yàn)中使用與依那西普(Enbrel)相似的p75-hFc構(gòu)建體(R&D系統(tǒng))。使用依那西普可得到類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未列出)。
抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性對抗TNFα抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以測定其支持由PBMC(主要是NK細(xì)胞)介導(dǎo)的殺傷TNFα轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的能力。簡單地說，從正常供體獲得人PBMC，以一定濃度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行重新懸浮，以便當(dāng)加入到效應(yīng)物細(xì)胞中時(shí)，能夠產(chǎn)生1∶100的效應(yīng)物/靶細(xì)胞比。同時(shí)，將穩(wěn)定表達(dá)膜結(jié)合TNFα的TNFα轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，使用膜染料PKH-26進(jìn)行標(biāo)記。然后將CHO細(xì)胞種植于96孔培養(yǎng)皿中三份，加入或者不加5μg/mL抗體。溫育30分鐘，加入效應(yīng)物細(xì)胞，37℃下過夜發(fā)生ADCC反應(yīng)。此時(shí)，合并這三份試樣，根據(jù)廠商的說明書使用染料TOPO-3染色，然后使用FACS分析。計(jì)算PKH-26和TOPO-3雙陽性細(xì)胞(殺死的靶細(xì)胞)數(shù)與PKH-26單陽性細(xì)胞(存活的靶細(xì)胞)數(shù)的比率，并以百分率的形式表述結(jié)果。結(jié)果說明單克隆抗體具有支持ADCC作用的能力，與作為依那西普替代物的p75-hFc相比具有顯著差異(表29)。
補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性同時(shí)還檢測抗TNFα抗體固定補(bǔ)體并從而介導(dǎo)殺傷TNFα轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的能力。簡單地說，CHO細(xì)胞以12500/孔種植于96孔板中兩份，加入5μg/mL抗體。冰上溫育3小時(shí)，加入兔源補(bǔ)體至終濃度為10％，室溫下進(jìn)行CDC反應(yīng)30分鐘。此時(shí)，細(xì)胞用0.5μg/mLPI和2.5μg/mL Heoehst 33342染色1小時(shí)，并用計(jì)數(shù)器(Autoscope)計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。以如上所述的TNFα誘導(dǎo)的凋亡試驗(yàn)中的方法計(jì)算和表述結(jié)果。與ADCC作用情況一樣，結(jié)果說明單克隆抗體具有激發(fā)CDC作用的能力，與作為依那西普替代物的p75-hFc相比具有差異(表29)。
表29

**本實(shí)驗(yàn)中使用與依那西普(Enbrel)相似的p75-hFc構(gòu)建體(R&D系統(tǒng))。
實(shí)施例9體內(nèi)抗hTNFα抗體的表征抑制小鼠體內(nèi)TNFα誘導(dǎo)的肝損傷為了測試抗人TNFα抗體是否能夠中和體內(nèi)人TNFα，研究了小鼠中抗人TNFα抗體預(yù)防由施用人TNFα和D-半乳糖胺誘導(dǎo)的肝損傷的能力(Lehmann V等，J.Exp.Med.，1987165(3)657-63)。施用TNFα和D-GalN可誘導(dǎo)急性肝損傷，與LPS和D-GalN誘導(dǎo)的肝損傷很相似，特征是大量肝細(xì)胞程序化死亡，最終導(dǎo)致休克和死亡。D-GalN處理后使小鼠對脂多糖(LPS)以及鼠源TNFα的致死效應(yīng)的敏感度提高100-1000倍(Lehmann V等，J.Exp.Med.，1987165(3)657-63)。由LPS和D-GalN誘導(dǎo)的程序化肝損傷已經(jīng)證明依賴于內(nèi)源產(chǎn)生的TNFα(Leist M等，Am.J Pathol.，1995，146(5)1220-34.)。還已經(jīng)證明這種肝損傷專門依賴通過p55受體分泌的TNFα信號(NowakM等，Am.J.Physiol.2000，278(5)R1202-9)，說明D-GalN同時(shí)也使對人源TNFα的致死效應(yīng)敏化，其中人源TNFα在小鼠中只與p55受體結(jié)合。通過測定血清酶丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的活性來確定hTNFα和D-GalN誘導(dǎo)的肝損傷的程度。
實(shí)驗(yàn)按照所述步驟進(jìn)行。從Charles River Laboratories購得的8到10周齡的Balb/c雌性小鼠，體重大約20克。每組使用8到10只小鼠。在預(yù)備試驗(yàn)中確定給藥劑量和途徑，以及測定血清中ALT水平的時(shí)間。小鼠注射D-GalN(Sigma)(900mg/kg，腹膜內(nèi)注射)，90分鐘后注射人TNF(R&D系統(tǒng))(1μg/小鼠，靜脈注射)。靜脈注射1μg/小鼠的TNF導(dǎo)致循環(huán)水平的TNF在19nM(將TNF看作三聚體)。TNF/GalN給藥6小時(shí)后使用商業(yè)診斷試劑盒(Sigma)通過測定ALT來衡量肝細(xì)胞損傷程度。為了比較299v2、263、依那西普、阿達(dá)木單抗和英夫利昔單抗在體內(nèi)抑制TNFα的能力，進(jìn)行劑量-應(yīng)答實(shí)驗(yàn)，先注射抗TNF試劑(1-10i.v.μg/鼠)，90分鐘后注射TNF(1μg/鼠，靜脈注射)。對照組小鼠在注射TNF之前先注射鹽水。數(shù)據(jù)以對照組的百分比表示，并繪制中和曲線(圖12)。使用四參數(shù)擬合曲線計(jì)算IC50值。表30顯示由不同實(shí)驗(yàn)得到的不同抗TNF試劑的IC50平均值。
抑制小鼠體內(nèi)TNFα誘導(dǎo)的IL-6產(chǎn)生作為檢測抗TNFα抗體抑制體內(nèi)TNFα能力的另一種方法，可將抗TNFα抗體用于阻止由人源TNFα誘導(dǎo)小鼠中的IL-6產(chǎn)生。TNFα引發(fā)多種急性生物反應(yīng)，包括誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6(Benigni等，J.Immunol.1575563，1996)。每組使用8到10只小鼠。如在最初的時(shí)程實(shí)驗(yàn)中所得結(jié)果，小鼠注射人源TNFα引起血清中IL-6水平急劇增長，注射后2小時(shí)達(dá)到峰值。根據(jù)針對TNFα給藥劑量和途徑而進(jìn)行的另一項(xiàng)預(yù)備實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，小鼠采用靜脈注射1μg/鼠的人源TNFα。施用TNFα2小時(shí)后，使用商業(yè)ELISA試劑盒(R&D系統(tǒng))測量IL-6水平。注射抗TNFα抗體(1-10i.v.μg/鼠)，90分鐘后再注射TNFα(1μg/鼠，靜脈注射)，以進(jìn)行劑量-應(yīng)答實(shí)驗(yàn)。對照組小鼠在注射TNFα之前先注射鹽水。數(shù)據(jù)以對照組的百分比表示，并繪制中和曲線(圖13)。使用四參數(shù)擬合曲線計(jì)算IC50值。表30顯示由不同實(shí)驗(yàn)得到的不同抗TNFα抗體的IC50平均值。
表30

實(shí)施例10抗TNFα抗體結(jié)構(gòu)分析對表1中所示抗體的可變重鏈和可變輕鏈進(jìn)行測序，以得到其DNA序列。所有抗TNFα抗體的完全序列信息均列入隨同本說明書遞交的序列表中，包括核苷酸和氨基酸序列。
表31中將各種XENOMAX_來源的抗體重鏈區(qū)與特定種系的重鏈區(qū)作比較。表32中將各種XENOMAX_來源的抗體輕鏈區(qū)與特定種系的輕鏈區(qū)作比較。表33中將各種雜交瘤來源的抗體重鏈區(qū)與特定種系的重鏈區(qū)作比較。表34中將各種雜交瘤來源的抗體輕鏈區(qū)與特定種系的輕鏈區(qū)作比較。
取樣品，參照中國藥典2000年版二部附錄“藥物穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則”，按市售包裝，長期留樣試驗(yàn)(置于25℃±2℃，相對濕度60％±10％)條件下放置，并分別于3、6、9、12個(gè)月取樣分析，以及加速試驗(yàn)(30℃±2℃，相對濕度75％±10％)條件下放置，并分別于1、2、3、6個(gè)月末取樣分析。主要從樣品的性狀、均勻性、油水分離現(xiàn)象(有無分層)、含量等方面進(jìn)行考察，結(jié)果分別表3和4。
表3 本發(fā)明阿米卡星軟膏長期留樣試驗(yàn)結(jié)果




表32.Xenomax輕鏈分析




表33.雜交瘤重鏈分析AB-TNFα-XG2













表34.雜交瘤輕鏈分析AB-TNFα-XG2K








實(shí)施例11測定抗體的典范類對于各免疫球蛋白鏈的高變區(qū)，Chothia等使用術(shù)語″典范類″來描述抗體結(jié)構(gòu)(J Mol Biol.1987年8月20日；196(4)901-17)。對多種免疫球蛋白的Fab和VL片段的原子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以找出其氨基酸序列與其抗原結(jié)合位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。Chothia等發(fā)現(xiàn)，只有相對較少的殘基，通過堆積、氫鍵或呈現(xiàn)獨(dú)特的_、ψ或ω構(gòu)象的能力，主要形成高變區(qū)的主鏈構(gòu)象。這些殘基發(fā)現(xiàn)存在于高變區(qū)內(nèi)位點(diǎn)和保守性β-折疊結(jié)構(gòu)區(qū)。通過對具有未知結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白的序列進(jìn)行分析，Chothia等發(fā)現(xiàn)許多免疫球蛋白具有大小與已知結(jié)構(gòu)之一相似的高變區(qū)，另外在形成保守性構(gòu)象的位點(diǎn)含有相同的殘基。
這些發(fā)現(xiàn)表明，這些高變區(qū)具有與已知結(jié)構(gòu)的高變區(qū)近似的構(gòu)象。對于五種高變區(qū)，全部構(gòu)象似乎限于相對少數(shù)的不連續(xù)結(jié)構(gòu)類中。這些高變區(qū)常見的主鏈構(gòu)象被稱為″典范類″。Chothia等(Nature.1989年12月21-28日；342(6252)877-83)和其他人(Martin，等，J Mol Biol.1996年11月15日；263(5)800-15)的進(jìn)一步研究證實(shí)，在六種抗體高變區(qū)中至少五種，只存在少數(shù)幾種主鏈構(gòu)象。
分析上述各抗體，以確定各抗體互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的典范類。已知的是，只有抗體重鏈的CDR1和CDR2以及抗體輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3確定了典范類。下表(35和36)總結(jié)了分析結(jié)果。典范類數(shù)據(jù)的形式為*HCDR1-HCDR2-LCDR1-LCDR2-LCDR3，其中″HCDR″指重鏈CDR，″LCDR″指輕鏈CDR。因此，例如典范類為1-3-2-1-5是指一抗體，其HCDR1落入典范類1，其HCDR2落入典范類3，其LCDR1落入典范類2，其LCDR2落入典范類1，其LCDR3落入典范類5。
當(dāng)抗體氨基酸與定義某典范類的氨基酸有70％或更多相同時(shí)，即將該抗體歸屬于該典范類。當(dāng)相同性低于70％時(shí)，典范類歸屬以星號(″*″)標(biāo)出，表明是根據(jù)各CDR長度和總體數(shù)據(jù)而估計(jì)的最適合的典范類。確定各抗體的氨基酸可以在例如以上引用的Chothia等的文章中發(fā)現(xiàn)。
表35




實(shí)施例12通過表達(dá)和與TNF-α表位結(jié)合實(shí)驗(yàn)對抗TNF-α抗體進(jìn)行功能區(qū)分析測序/分箱結(jié)果免疫球蛋白鏈的可變(V)區(qū)由多個(gè)種系DNA片段編碼，在B細(xì)胞個(gè)體發(fā)育期間連接成為功能性可變區(qū)(VHDJH或VKJK)。詳細(xì)研究了TNFα抗體應(yīng)答的分子和遺傳多樣性。這些實(shí)驗(yàn)揭示了幾個(gè)針對抗TNFα的特異性點(diǎn)。分析65個(gè)TNFα特異性抗體，發(fā)現(xiàn)13個(gè)種系VH基因，抗體中有54個(gè)來自VH3家族，其中34個(gè)使用VH3-33基因片段。頻率最高的基因，即VH3-33種系基因，在分析的65個(gè)抗體中的34個(gè)中均有表達(dá)，并且僅限于兩個(gè)不同的箱(bin)，所述箱與結(jié)合所涉及的輕鏈類型(κA30對L2或λ)有明顯聯(lián)系。分箱和功能性抗體選擇表明，特定箱中的抗體表達(dá)相同的IgVH，某些情況下表達(dá)相同的VHDJH重排。而且還發(fā)現(xiàn)，H和L鏈對在箱內(nèi)保守。這些發(fā)現(xiàn)表明，對于任何給定的表位，只有少數(shù)種系的成員用于形成相應(yīng)的互補(bǔ)位(paratope)，對于各抗原表位，有限數(shù)量的L和H鏈可配對形成特異性互補(bǔ)位。
人源TNFα的生物相關(guān)表位的位置是通過人源TNFα特異性單克隆抗體的表達(dá)，以及其與一組嵌合人/鼠TNFα分子的結(jié)合實(shí)驗(yàn)來確定。上述抗體落在4個(gè)大分箱組中，并與對hTNFα生物活性起關(guān)鍵作用的幾個(gè)位點(diǎn)有聯(lián)系。TNFα的N-末端區(qū)發(fā)現(xiàn)涉及受體結(jié)合。
在第一組抗體中，抗體通過直接結(jié)合TNFα受體結(jié)合區(qū)來中和TNFα活性，所述抗體全部識(shí)別分泌的TNFα分子中前36個(gè)殘基中的序列。結(jié)果顯示兩種受體結(jié)合相同的N-末端區(qū)。Van Ostade等((1993)nature，361266-269)報(bào)道P75受體結(jié)合區(qū)定域在分子基部的環(huán)上，位置29和32的單個(gè)氨基替換可降低與p75受體的結(jié)合活性。第一組中的抗體(VH3-33/JH6b與κ鏈A30/JK4偶聯(lián))都具有典范類1-3-2-1-1。在有Lys11和Arg31時(shí)，所有實(shí)驗(yàn)抗體均顯示與前36殘基結(jié)合。表達(dá)與λ輕鏈偶聯(lián)的VH3-33/Jh6b抗體則顯示不同的特異性。
Van Ostade等((1991)EMBO 10827-836)通過無規(guī)突變誘變和定向誘變證實(shí)，氨基酸32-34、84-91、117-119和143-148等四個(gè)區(qū)的完整性對保持生物活性非常重要。使用與L2κ鏈偶聯(lián)的VH3-33/JH4b抗體顯示可識(shí)別TNFα分子中不同的非連續(xù)區(qū)域。這些抗體對人源TNFα具有高度特異性，它們的表位是位于TNF多肽上不同的、非鄰接位置的一組殘基。
第三組抗體包括使用與λ輕鏈偶聯(lián)的VH3-33抗體，如單克隆抗體3.2。這組抗體的結(jié)合位點(diǎn)位于殘基1到91之間。盡管替換Gln27和Arg31并不影響結(jié)合人源TNFα，但N-末端對結(jié)合活性顯得非常重要。在下表36中提供結(jié)果。
表36



實(shí)施例13抗TNFα抗體和抗體綴合物在治療關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用為了驗(yàn)證抗TNFα抗體在治療人類關(guān)節(jié)炎患者時(shí)的體內(nèi)作用效果，人類患者每隔一定時(shí)間就注射一次有效量的抗TNFα抗體?；颊咴谥委熯^程中定期接受檢查以確定其關(guān)節(jié)炎是否好轉(zhuǎn)。
與使用對照抗體治療的關(guān)節(jié)炎患者相比，使用抗TNFα抗體治療的關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)炎癥狀，包括炎癥水平減輕?？梢允褂玫膶φ湛贵w包括與抗TNFα受試抗體同種型相同的抗體，并且這些抗體可能無法結(jié)合TNFα抗原。
實(shí)施例14抗TNFα抗體作為診斷試劑的用途在試樣中檢測TNFα抗原可以開發(fā)在試樣中檢測TNFα抗原的酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)。實(shí)驗(yàn)中，微量滴定板(比如96孔微量滴定板或384孔微量滴定板)的孔使用針對抗原的一次完全人源單克隆抗體吸附幾小時(shí)。固定的抗體作為針對任何存在于試樣中的抗原的捕捉抗體。將孔沖洗并以牛乳蛋白或白蛋白等阻斷劑處理，以防止分析物的非特異性吸附。
隨后，使用可能含有抗原的試樣或者含有標(biāo)準(zhǔn)量抗原的溶液處理滴定孔。該試樣可以是，例如，從懷疑為具有病理診斷意義的一定循環(huán)抗原水平的個(gè)體上取得的血清試樣。
沖洗掉試樣或標(biāo)準(zhǔn)溶液之后，使用生物素綴合物標(biāo)記的二次完全人源單克隆抗TNFα抗體處理滴定孔。標(biāo)記的抗TNFα抗體用作檢測抗體。沖洗掉多余的二次抗體之后，使用與親和素結(jié)合的辣根過氧化酶(HRP)和適當(dāng)?shù)娘@色底物處理滴定孔。從標(biāo)準(zhǔn)試樣得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，與之相比即可確定試樣中抗原的濃度。
這種ELISA實(shí)驗(yàn)為檢測試樣中的TNFα抗原提供了高特異性、高靈敏度的方法。
檢測患者體內(nèi)TNFα抗原濃度夾心ELISA法被開發(fā)出來用以定量檢測人血清中TNFα水平。夾心ELISA法中兩種完全人源單克隆抗TNFα抗體可識(shí)別TNFα分子上的不同表位。該ELISA法以如下步驟進(jìn)行以50μL含2μg/mL捕捉抗TNFα抗體的包被緩沖液(0.1M NaHCO3，pH9.6)包被ELISA板(Fisher)。4℃下溫育過夜之后，使用200μL封閉緩沖液(0.5％BSA，0.1％Tween 20，0.01％硫柳汞溶于PBS)25℃下將板處理1小時(shí)。使用0.05％Tween 20的PBS溶液(洗滌緩沖液，WB)將板沖洗三次。正常或患者血清(Clinomics，Bioreclaimation)在含50％人血清的封閉緩沖液中稀釋。板在4℃下與血清試樣溫育過夜，使用WB沖洗，然后在25℃下與100μL/孔的生物素化檢測抗TNFα抗體溫育1小時(shí)。沖洗，板與HRP-鏈親和素溫育15分鐘，如上沖洗，再以100μL/孔的鄰苯二胺的雙氧水溶液(Sigma顯影液)處理以顯示顏色。加入50μL/孔的H2SO4(2M)終止反應(yīng)，使用ELISA分析儀在492nm讀數(shù)。通過使用四參數(shù)曲線擬合程序?qū)Ρ燃兓疶NFα抗原的稀釋液，可計(jì)算出血清試樣中TNFα抗原的濃度。
等同物以上所寫說明書被認(rèn)為足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明。以上敘述和實(shí)施例詳述了本發(fā)明特定的優(yōu)選實(shí)施方案，記載了發(fā)明者認(rèn)為的最佳方式。然而應(yīng)該注意到，不管前文敘述有多詳細(xì)，本發(fā)明可有多種途徑實(shí)施，本發(fā)明應(yīng)該根據(jù)所附權(quán)利要求書及其任何等同物解釋。
序列表<110>阿布格尼克斯公司J.S.巴布科克J.S.康O.富爾德L.格林X.馮S.克萊坎普M.哈克-弗蘭德肖P.拉塞納斯萬米C.皮戈特M.L.梁R.李K.曼丘倫喬R.法吉尼G.森諾迪J.S.巧娟<120>針對腫瘤壞死因子的抗體及其用途<130>ABGENIX.073VPC<140>未知<141>2003-12-02<150>60/430729<151>2002-12-02<160>320<170>Windows版FastSEQ，版本4.0<210>1<211>384<212>DNA<213>人<400>1caggtgcagt tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggaacatct attacagtgg gagcacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagat 300agtaaccaat ataactggaa cgacgaggtc tacgactacg gtttggacgt ctggggccaa 360gggaccacgg tcaccgtgtc ctca384<210>2<211>128<212>PRT<213>人<400>2Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly20 25 30Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu35 40 45Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser50 55 60Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe65 70 75 80Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr85 90 95Cys Ala Arg Asp Ser Asn Gln Tyr Asn Trp Asn Asp Glu Val Tyr Asp100 105 110Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120 125<210>3<211>321<212>DNA<213>人<400>3gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240gaagattttg caacttatta ctgtctacaa cataataatt accctctcac tttcggcgga 300gggaccaagg tggagatcaa a 321<210>4<211>107
<212>PRT<213>人<400>4Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp20 25 30Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Asn Tyr Pro Leu85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>5<211>375<212>DNA<213>人<400>5caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatgaca ttcactgggt ccgccaggct 120ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtat taaatactat 180gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240ctacaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaggag 300cagctcgtcc ggggagggta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360gtcaccgtct cctca 375<210>6<211>125<212>PRT<213>人<400>6Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30
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<221>變體<222>98<223>Xaa＝任何氨基酸<400>280Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser100 105<210>281<211>109<212>PRT<213>人<400>281Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser100 105<210>282
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<211>109<212>PRT<213>人<400>296Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser100 105<210>297<211>108<212>PRT<213>人<400>297Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn20 25 30Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser100 105<210>298
<211>109<212>PRT<213>人<400>298Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr20 25 30Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser100 105<210>299<211>109<212>PRT<213>人<400>299Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser100 105<210>300
<211>108<212>PRT<213>人<400>300Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn20 25 30Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser100 105<210>301<211>109<212>PRT<213>人<400>301Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser100 105<210>302
<211>109<212>PRT<213>人<400>302Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser100 105<210>303<211>109<212>PRT<213>人<400>303Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser100 105<210>304
<211>111<212>PRT<213>人<400>304Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln1 5 10 15Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly20 25 30Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu35 40 45Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser85 90 95Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105 110<210>305<211>107<212>PRT<213>人<400>305Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp20 25 30Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Leu85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>306
<211>107<212>PRT<213>人<400>306Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Phe85 90 95Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105<210>307<211>107<212>PRT<213>人<400>307Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp20 25 30Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>308
<211>107<212>PRT<213>人<400>308Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Ile85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys100 105<210>309<211>110<212>PRT<213>人<400>309Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln1 5 10 15Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn20 25 30Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu35 40 45Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln65 70 75 80Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu85 90 95Ser Ala Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105 110<210>310
<211>107<212>PRT<213>人<400>310Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Ile85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys100 105<210>311<211>110<212>PRT<213>人<400>311Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln1 5 10 15Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn20 25 30Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu35 40 45Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln65 70 75 80Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu85 90 95Ser Ala Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105 110<210>312
<211>107<212>PRT<213>人<400>312Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Trp85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>313<211>107<212>PRT<213>人<400>313Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>314
<211>107<212>PRT<213>人<400>314Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Phe85 90 95Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105<210>315<211>110<212>PRT<213>人<400>315Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln1 5 10 15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn20 25 30Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu35 40 45Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln65 70 75 80Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu85 90 95Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105 110<210>316
<211>108<212>PRT<213>人<400>316Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His85 90 95Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105<210>317<211>108<212>PRT<213>人<400>317Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln1 5 10 15Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala20 25 30Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu65 70 75 80Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ser Ser Gly Asn His85 90 95Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105<210>318
<211>107<212>PRT<213>人<400>318Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Ile85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys100 105<210>319<211>108<212>PRT<213>人<400>319Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His85 90 95Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105<210>320
<211>111<212>PRT<213>人<400>320Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln1 5 10 15Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly20 25 30Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu35 40 45Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser85 90 95Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105 110
權(quán)利要求
1.一種與腫瘤壞死因子-α特異性結(jié)合的人源單克隆抗體，包括具有氨基酸序列″Ser Tyr Asp Met His″的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源單克隆抗體，包括具有氨基酸序列″Val IleTrp Ser Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly″的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人源單克隆抗體，包括具有氨基酸序列″GluVal Glu Ser Ala Met Gly Gly Phe Tyr Tyr Asn Gly Met Asp Val″的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源單克隆抗體，包括包含如SEQ ID NO70所示氨基酸序列的重鏈氨基酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源單克隆抗體，包括包含如SEQ ID NO74所示氨基酸序列的重鏈氨基酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源單克隆抗體，包括具有氨基酸序列″ArgAla Ser Gln Gly Ile Arg Ile Asp Leu Gly″的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人源單克隆抗體，包括具有氨基酸序列″AlaAla Ser Thr Leu Gln Ser″的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的人源單克隆抗體，包括具有氨基酸序列″LeuGln His Lys Ser Tyr Pro Leu Thr″的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人源單克隆抗體，包括包含如SEQ ID NO72所示氨基酸序列的輕鏈氨基酸。
10.一種與腫瘤壞死因子-α特異性結(jié)合的人源單克隆抗體，包括具有氨基酸序列″Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ile Asp Leu Gly″的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的人源單克隆抗體，包括具有氨基酸序列“AlaAla Ser Thr Leu Gln Ser”的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的人源單克隆抗體，包括具有氨基酸序列“LeuGln His Lys Ser Tyr Pro Leu Thr”的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的人源單克隆抗體，包括具有氨基酸序列“SerTyr Asp Met His”的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的人源單克隆抗體，包括具有氨基酸序列“ValIle Trp Ser Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly”的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的人源單克隆抗體，包括具有氨基酸序列″GluVal Glu Ser Ala Met Gly Gly Phe Tyr Tyr Asn Gly Met Asp Val″的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)。
16.一種與腫瘤壞死因子-α特異性結(jié)合的人源單克隆抗體，包括VH3-33重鏈基因，或其保守性變體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的人源單克隆抗體，包括A30VK1輕鏈基因。
18.一種與腫瘤壞死因子-α特異性結(jié)合的人源單克隆抗體，其中，抗體包括與典范類1對應(yīng)的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的人源單克隆抗體，其中，所述抗體包括與典范類3對應(yīng)的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的人源單克隆抗體，其中，所述抗體包括與典范類2對應(yīng)的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的人源單克隆抗體，其中，所述抗體包括與典范類1對應(yīng)的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的人源單克隆抗體，其中，所述抗體包括與典范類1對應(yīng)的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)。
23.一種與腫瘤壞死因子-α特異性結(jié)合的人源單克隆抗體，包括具有氨基酸序列″Arg Asn Tyr Met Ser″的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的人源單克隆抗體，包括具有氨基酸序列″ValIle Tyr Ser Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly″的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的人源單克隆抗體，包括具有氨基酸序列″GlyGlu Gly Gly Phe Asp Tyr″的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)。
26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的人源單克隆抗體，包括包含如SEQ ID NO50所示氨基酸序列的重鏈氨基酸。
27.根據(jù)權(quán)利要求23所述的人源單克隆抗體，包括具有氨基酸序列″ArgAla Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala″的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的人源單克隆抗體，包括具有氨基酸序列″GlyAla Ser Ile Arg Ala Thr″的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的人源單克隆抗體，包括具有氨基酸序列″GlnGln Tyr Asn Tyr Trp Trp Thr″的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)。
30.根據(jù)權(quán)利要求23所述的人源單克隆抗體，包括包含如SEQ ID NO52所示氨基酸序列的輕鏈氨基酸。
31.一種與腫瘤壞死因子-α特異性結(jié)合的人源單克隆抗體，包括具有氨基酸序列″Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala″的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的人源單克隆抗體，包括具有氨基酸序列″GlyAla Ser Ile Arg Ala Thr″的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的人源單克隆抗體，包括具有氨基酸序列″GlnGln Tyr Asn Tyr Trp Trp Thr″的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的人源單克隆抗體，包括具有氨基酸序列″ArgAsn Tyr Met Ser″的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的人源單克隆抗體，包括具有氨基酸序列″ValIle Tyr Ser Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly″的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的人源單克隆抗體，包括具有氨基酸序列″GlyGlu Gly Gly Phe Asp Tyr″的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)。
37.一種與腫瘤壞死因子-α特異性結(jié)合的人源單克隆抗體，包括VH3-53重鏈基因，或其保守性變體。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的人源單克隆抗體，包括L2VK3輕鏈基因。
39.一種與腫瘤壞死因子-α特異性結(jié)合的人源單克隆抗體，其中，抗體包括與典范類1對應(yīng)的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的人源單克隆抗體，其中，所述抗體包括與典范類1對應(yīng)的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的人源單克隆抗體，其中，所述抗體包括與典范類2對應(yīng)的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的人源單克隆抗體，其中，所述抗體包括與典范類1對應(yīng)的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的人源單克隆抗體，其中，所述抗體包括與典范類3對應(yīng)的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)。
44.一種在患者樣品中，檢測腫瘤壞死因子-α(TNFα)水平的方法，包括，將權(quán)利要求1或23中所述的抗TNFα抗體與采自患者的生物樣品接觸，檢測所述抗體與所述樣品中的TNFα之間的結(jié)合水平。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中生物樣品為血液。
46.一種組合物，包括權(quán)利要求1或23所述的抗體，或其功能性片段，和可藥用的載體。
47.一種對患有腫瘤疾病的動(dòng)物進(jìn)行有效治療的方法，包括選擇需要治療腫瘤疾病的動(dòng)物；和向所述動(dòng)物給藥治療有效劑量的權(quán)利要求1或23的完全人源單克隆抗體，其中所述抗體與腫瘤壞死因子-α(TNFα)特異性結(jié)合。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述腫瘤疾病選自乳癌，卵巢癌，膀胱癌，肺癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，胃癌，子宮內(nèi)膜癌，腎癌，結(jié)腸癌，胰腺癌和前列腺癌。
49.一種有效治療免疫介導(dǎo)的炎性疾病的方法，包括選擇需要治療炎性疾病的動(dòng)物；和向所述動(dòng)物給藥治療有效劑量的權(quán)利要求1或23所述的完全人源單克隆抗體，其中所述抗體與腫瘤壞死因子-α(TNFα)特異性結(jié)合。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述免疫介導(dǎo)的炎性疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，血管球性腎炎，動(dòng)脈粥樣硬化，牛皮癬，再狹窄，自身免疫病，克羅恩氏病，移植物抗宿主反應(yīng)，敗血癥休克，惡病質(zhì)，厭食，強(qiáng)直性脊柱炎和多發(fā)性硬化。
51.一種在動(dòng)物中抑制腫瘤壞死因子-α(TNFα)誘導(dǎo)的凋亡的方法，包括選擇需要對TNFα誘導(dǎo)的凋亡進(jìn)行治療的動(dòng)物；和向所述動(dòng)物給藥治療有效劑量的權(quán)利要求1或23所述的完全人源單克隆抗體，其中所述抗體與TNFα特異性結(jié)合。
52.權(quán)利要求1或23所述的抗體在制備治療動(dòng)物腫瘤疾病的藥物中的用途，其中所述單克隆抗體與腫瘤壞死因子(TNFα)特異性結(jié)合。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的用途，其中所述腫瘤疾病選自乳癌，卵巢癌，膀胱癌，肺癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，胃癌，子宮內(nèi)膜癌，腎癌，結(jié)腸癌，胰腺癌和前列腺癌。
54.權(quán)利要求1或23所述的抗體在制備有效治療動(dòng)物免疫介導(dǎo)的炎性疾病的藥物中的用途，其中所述單克隆抗體與腫瘤壞死因子(TNFα)特異性結(jié)合。
55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的用途，其中所述免疫介導(dǎo)的炎性疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，血管球性腎炎，動(dòng)脈粥樣硬化，牛皮癬，再狹窄，自身免疫病，克羅恩氏病，移植物抗宿主反應(yīng)，敗血癥休克，惡病質(zhì)，厭食和多發(fā)性硬化。
56.權(quán)利要求1或23所述的抗體在制備有效治療動(dòng)物腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的凋亡的藥物中的用途，其中所述單克隆抗體與腫瘤壞死因子(TNFα)特異性結(jié)合。
全文摘要
針對抗原TNFα的抗體及此抗體的用途。特別是針對抗原TNFα的完全人源單克隆抗體。編碼以下序列的核苷酸序列和含有以下序列的氨基酸序列免疫球蛋白分子的重鏈和輕鏈，特別是與跨越框架區(qū)和/或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的鄰近重鏈和輕鏈序列相應(yīng)的序列，具體是從FR1到FR4或從CDR1到CDR3。表達(dá)這些免疫球蛋白分子和單克隆抗體的雜交瘤或其他細(xì)胞系。
文檔編號A61K39/395GK1745101SQ200380109456
公開日2006年3月8日 申請日期2003年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月2日
發(fā)明者J·S·巴布科克, J·S·康, O·富爾德, L·格林, X·馮, S·克萊坎普, M·哈克-弗蘭德肖, P·拉塞納斯萬米, C·皮戈特, M·L·梁, R·李, K·曼丘倫喬, R·法吉尼, G·森諾迪, J·S·巧娟 申請人:阿布格尼克斯公司