專利名稱：具有抗微生物涂層的生物醫(yī)學(xué)裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有涂層的裝置。具體而言，本發(fā)明提供了在表面上形成合成陽(yáng)離子肽抗微生物涂層的生物醫(yī)學(xué)裝置。
背景技術(shù)：
眾所周知適用于人體中和人體上的裝置。在決定所述裝置整體功效中，上述裝置表面的化學(xué)成分起關(guān)鍵作用。此外，已知提供具有抗微生物表面的上述裝置是有利的。
業(yè)已開發(fā)了多種殺菌和抑菌涂層。例如，諸如多粘菌素、萬古霉素和四環(huán)素的陽(yáng)離子抗生素業(yè)已作為涂層用于接觸透鏡。此外，金屬螯合劑、取代和未取代的多元酚、氨基苯酚、乙醇、酸和胺衍生物以及季銨業(yè)已作為抗微生物劑用于接觸透鏡。US5,472,703公開了某些作為抗微生物劑用于接觸透鏡的脂質(zhì)化合物。
然而，這些已知抗微生物涂層的使用具有不利之處。使用抗生素涂層時(shí)，可產(chǎn)生抗抗生素的微生物。螯合劑無法對(duì)付許多粘附于所述裝置的細(xì)菌。某些現(xiàn)有技術(shù)的涂層，例如苯酚衍生物和甲酚，可產(chǎn)生眼毒性或過敏反應(yīng)。季銨化合物由于其刺激性而問題重重。因此，需要安全且有效的抗微生物涂層以克服至少一部分這些不利之處。
美國(guó)系列號(hào)09/516,636公開了魚精蛋白、蜂毒肽、殺菌肽A(cecropin A)、乳鏈菌肽或它們的組合物可作為表面涂層以減少細(xì)菌粘附于裝置表面和/或降低粘附于裝置的細(xì)菌的生長(zhǎng)。遺憾的是，業(yè)已發(fā)現(xiàn)那些肽在一定濃度下具有毒性或具有有限程度的抗微生物活性。
Subbalakshmi等。，F(xiàn)EBS Letters，448，62-66頁(yè)(1999)公開了蜂毒肽C-末端15個(gè)氨基酸殘基，保留了其抗細(xì)菌活性，但溶血活性大大降低。Juwadi等公開了將蜂毒肽C-末端置于合成肽的N-末端以減少對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞毒性(Juwadi等.，J.Am.Chem.Soc.，vol.118，8989-8997頁(yè)(1996))。但是，C-末端肽的抑菌程度卻減少了，且抑制那些細(xì)菌所需肽的數(shù)量增加了(Subbalakshmi等.，F(xiàn)EBS Letters，448，62-66頁(yè)(1999))。
也已公開了陽(yáng)離子肽混合物。例如，已經(jīng)合成了包含作為陽(yáng)離子部分的賴氨酸的合成肽(Mor等.，J.Biol.Chem，vol.269，31635-31641頁(yè)(1994))，以及魚精蛋白與蜂毒肽混合物(Aliwarga等.，Clim.Exp.Ophthalmol.，vol.29，157-160頁(yè)(2001))。
也已經(jīng)合成了在單分子中摻入源自不同陽(yáng)離子活性部分的合成肽。例如，公開了通過將殺菌肽A與蜂毒肽組合制備的系列肽，最大程度地保留了它們的抗菌功效(Boman等.，F(xiàn)EBS Letters，vol.259，103-106頁(yè)(1989))。也合成了殺菌肽A和蜂毒肽的雜合體，并披露了在由細(xì)菌引起的角膜炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭心軠p少感染和炎癥病癥(Nos-Barbera等.，Cornea，vol.259，101-106頁(yè)(1996))。但是，蜂毒肽仍保留著其毒性區(qū)，預(yù)計(jì)可能誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒性。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了相對(duì)于水，各種肽對(duì)綿羊紅細(xì)胞的溶胞％。
發(fā)明詳述和優(yōu)選的實(shí)施方案本發(fā)明提供了具有抗微生物涂層的生物醫(yī)學(xué)裝置和用于生產(chǎn)該生物醫(yī)學(xué)裝置的方法。本發(fā)明預(yù)料不到的發(fā)現(xiàn)是某些合成肽可用于提供生物醫(yī)學(xué)裝置的抗微生物涂層。特別是，本發(fā)明的合成抗微生物肽，在肽中任何位置包含蜂毒肽的15-26片斷，即片斷ASEQ ID NO.1和魚精蛋白的1-17片斷，即片斷BSEQ ID NO.2。所述肽還可包含第三個(gè)片斷C，其可以是任何不抑制所述肽抗微生物活性或不誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒性的連接基團(tuán)，其包括0至約10個(gè)氨基酸的間隔區(qū)。本文定義的氨基酸指具有化學(xué)式-HN-(CR1R2)n-CO-的任何結(jié)構(gòu)，其中n是1-21的整數(shù)，R1和R2獨(dú)立地選自H、具有1-4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基、具有1-2個(gè)碳原子的直鏈或支鏈羥基、具有1-3個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷硫基、具有1-3個(gè)碳原子的氨基甲酰基、具有1-3個(gè)碳原子的羧基、具有1-4個(gè)碳原子和1-3個(gè)氮原子的伯氨基和仲氨基、芐基、苯酚、苯基吲哚和N，N-吡咯。優(yōu)選地，n是1-10的整數(shù)，R1和R2中至少之一是H，另一選自如上。所述抗微生物合成肽的A、B和C片斷可按任意順序排列并可部分或全部重復(fù)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述A和B片斷位于末端位置，在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述合成抗微生物肽具有分子式ACB或BCA，且C包含至多5個(gè)氨基酸。
本發(fā)明也包括本文所例證的那些肽的保守變異的合成抗微生物肽。于此使用的術(shù)語“保守變異”表示其中至少一個(gè)氨基酸為其它生物學(xué)上相似殘基所取代的多肽。保守變異的例子包括一種疏水殘基的取代，例如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸為其它氨基酸所取代，或一種極性殘基為其它殘基所取代，例如精氨酸為賴氨酸、谷氨酸為天冬氨酸或谷氨酰胺為天冬酰胺所取代等等。中性親水氨基酸可為一種其它氨基酸所取代，所述其它氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸。
具體而言，本發(fā)明的一個(gè)發(fā)現(xiàn)是蜂毒肽、魚精蛋白和它們的混合物當(dāng)作為表面涂層時(shí)，減少了細(xì)菌在裝置表面的粘附，降低了粘附于裝置的細(xì)菌的生長(zhǎng)，或兩者皆大于約40％。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種生物醫(yī)學(xué)裝置，包含至少一個(gè)表面，基本上由至少一個(gè)表面組成，和由至少一個(gè)表面組成，所述表面包含覆蓋有效量的至少一種合成抗微生物肽，基本上由覆蓋有效量的至少一種合成抗微生物肽組成，和由覆蓋有效量的至少一種合成抗微生物肽組成。還在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種用于制造生物醫(yī)學(xué)裝置的方法，包括將生物醫(yī)學(xué)裝置的至少一個(gè)表面與覆蓋有效量的至少一種合成抗微生物肽接觸，基本上由將生物醫(yī)學(xué)裝置的至少一個(gè)表面與覆蓋有效量的至少一種合成抗微生物肽接觸組成，和由將生物醫(yī)學(xué)裝置的至少一個(gè)表面與覆蓋有效量的至少一種合成抗微生物肽接觸組成。仍在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中。提供了另一種用于制造生物醫(yī)學(xué)裝置的方法，包括將生物醫(yī)學(xué)裝置的至少一個(gè)表面與覆蓋有效量的至少一種合成抗微生物肽接觸，基本上由將生物醫(yī)學(xué)裝置的至少一個(gè)表面與覆蓋有效量的至少一種合成抗微生物肽接觸組成，和由將生物醫(yī)學(xué)裝置的至少一個(gè)表面與覆蓋有效量的至少一種合成抗微生物肽接觸組成。亦在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種用于制造生物醫(yī)學(xué)裝置的方法，包括添加至少一種可聚合的合成抗微生物肽至反應(yīng)混合物中并聚合所述反應(yīng)混合物以形成生物醫(yī)學(xué)裝置，基本上由添加至少一種可聚合的合成抗微生物肽至反應(yīng)混合物中并聚合所述反應(yīng)混合物以形成生物醫(yī)學(xué)裝置組成，和由添加至少一種可聚合的合成抗微生物肽至反應(yīng)混合物中并聚合所述反應(yīng)混合物以形成生物醫(yī)學(xué)裝置組成。
“生物醫(yī)學(xué)裝置”指設(shè)計(jì)用于人組織或流體中或其上的任何裝置。這些裝置的例子包括但不限于導(dǎo)管、植入物(包括但不限于心臟瓣膜)、支架、流體收集袋(fluid collection bags)、傳感器、水凝膠繃帶、輸液管、抗生素載體、診斷和治療劑和眼科裝置。在某些實(shí)施方案中，導(dǎo)管是優(yōu)選的醫(yī)學(xué)裝置。一類優(yōu)選的生物醫(yī)學(xué)裝置包括眼科裝置，特別是接觸透鏡。
如本文所用，術(shù)語“透鏡”和“眼科裝置”指放在眼內(nèi)或眼上的裝置。這些裝置可提供光學(xué)校正、傷口護(hù)理、藥物遞送、功能性診斷或可以是化妝品。術(shù)語透鏡包括但不限于軟接觸透鏡、硬接觸透鏡、眼內(nèi)透鏡、覆蓋透鏡、眼內(nèi)插入物和光學(xué)插入物。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生物醫(yī)學(xué)裝置是一種眼科透鏡，包括，但不限于接觸透鏡或眼內(nèi)透鏡。更優(yōu)選所述裝置是接觸透鏡，最優(yōu)選是軟接觸透鏡。
如本文所用，術(shù)語“肽”或“多肽”指多肽的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)，其為本領(lǐng)域眾所周知且已為本領(lǐng)域教科書和其它出版物所描述，本文中使用的該術(shù)語指包含兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的任何肽或蛋白質(zhì)，所述氨基酸在直鏈中彼此通過肽鍵連接。如本文所用，該術(shù)語指短鏈，例如在本領(lǐng)域中其也通常稱為肽、寡肽和寡聚體，以及較長(zhǎng)的鏈，在本領(lǐng)域中其通常指蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有許多類型。應(yīng)當(dāng)理解多肽經(jīng)常包含除了20種氨基酸外的氨基酸，所述20種氨基酸通常稱為20種天然存在的氨基酸，而且在特定多肽中許多氨基酸，包括末端氨基酸可通過天然加工，如加工和其它翻譯后修飾，或通過本領(lǐng)域眾所周知的化學(xué)修飾技術(shù)得到修飾。即使在多肽中天然存在的常見修飾由于數(shù)量眾多而無法在此窮舉，但它們?cè)诨A(chǔ)教科書和更詳細(xì)的專論中得到充分描述，也在大量的研究文獻(xiàn)充分描述，為本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知。在可用于本發(fā)明多肽的已知修飾中，一些例證性命名為乙?；Ⅴ；DP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價(jià)連接、血紅素部分的共價(jià)連接、核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)連接、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價(jià)連接、磷脂酰肌醇的共價(jià)連接、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基、共價(jià)交聯(lián)形成、胱氨酸形成、焦谷氨酸，5-氧(代)脯氨酸形成、甲?；?、γ-羧化、糖基化、糖基磷脂酰肌醇錨形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白酶解加工、磷酸化、異戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸鹽化、轉(zhuǎn)移核糖核酸介導(dǎo)的添加氨基酸至蛋白質(zhì)，例如精氨?；捅樵诘鞍谆?。上述修飾為本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知且已非常詳細(xì)地描述于科學(xué)文獻(xiàn)。幾種特別常見的修飾，如糖基化、脂質(zhì)連接、硫酸鹽化、谷氨酸殘基的γ-羧化、羥基化和ADP-核糖基化在基礎(chǔ)教科書中描述最多，例如在PROTEINS--STRUCTURE AND MOLECULARPROPERTIES，第2版.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York(1993)中?？色@得許多關(guān)于該主題的詳細(xì)綜述，例如，POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OFPROTEINS，B.C.Johnson，編.，Academic Press，New York(1983)中，Wold，F(xiàn).，Posttranslational Protein ModificationsPerspectives andProspects，1-12頁(yè)；Seifter等.，(1990)，Meth.Eir.zymol.182，626-646和Rattan等.，“Protein SynthesisPosttranslational Modifications andAging”，(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.663，48-62所提供的那些。應(yīng)當(dāng)理解，如眾所周知和上文提及，多肽并不總是完全線性的。例如，多肽(線性和非線性)可產(chǎn)生自轉(zhuǎn)譯后事件的結(jié)果，包括天然加工事件和通過人為操作所帶來的非天然產(chǎn)生的事件?？赏ㄟ^非轉(zhuǎn)譯天然加工和最好通過全合成方法合成環(huán)狀、支化和支化環(huán)狀肽?？稍诙嚯牡娜魏挝恢眠M(jìn)行修飾，包括肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羥基端。事實(shí)上，共價(jià)修飾能封閉多肽中的氨基或羥基基團(tuán)，或兩者皆封閉，這種情況在天然存在和合成多肽中經(jīng)常見到，上述修飾也可發(fā)生在本發(fā)明的多肽中。例如，在蛋白酶解加工之前，大腸桿菌或其它細(xì)胞表達(dá)多肽的氨基端殘基幾乎總是N-甲酰甲硫氨酸。在肽翻譯后修飾過程中，NH2-末端的甲硫氨酸殘基可缺失。因此，本發(fā)明考慮到了本發(fā)明蛋白質(zhì)包含甲硫氨酸和無甲硫氨酸氨基端變體的使用。所述發(fā)生在多肽中的修飾經(jīng)常隨著其獲得方式而改變。例如，對(duì)于通過在宿主中表達(dá)克隆基因獲得的多肽而言，大部分的修飾種類和程度應(yīng)取決于宿主細(xì)胞翻譯后修飾能力和所述多肽氨基酸序列中存在的修飾信號(hào)。例如，眾所周知在細(xì)菌宿主中通常不發(fā)生糖基化，例如在大腸桿菌中。于是，當(dāng)期望糖基化時(shí)，多肽應(yīng)當(dāng)在使蛋白質(zhì)糖基化的宿主中表達(dá)，通常是真核細(xì)胞。昆蟲細(xì)胞經(jīng)常進(jìn)行與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相同的翻譯后糖基化，因此，業(yè)已開發(fā)了用于有效表達(dá)具有天然糖基化型等特性的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)的昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。類似的考慮也應(yīng)用于其它修飾。應(yīng)當(dāng)理解在給定多肽一些位點(diǎn)上相同類型修飾的程度可以是相同的或不同的。同樣，給定多肽可包含許多種修飾。通常來說，如本文所用，術(shù)語多肽包括了所有上述修飾，特別是那些存在于通過在宿主細(xì)胞中表達(dá)多核苷酸重組合成多肽過程中的修飾。
如本文所用，“Melimine”指包含SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽。
其中T是蘇氨酸、L是亮氨酸、I是異亮氨酸、S是絲氨酸、W是色氨酸、K是賴氨酸、N是天冬酰胺、R是精氨酸、Q是谷氨酰胺、P是脯氨酸、V是纈氨酸。如本文所用，L-melimine包含以天然形式存在的上述氨基酸序列。氨基酸光學(xué)異構(gòu)體進(jìn)行自發(fā)的非酶消旋化。對(duì)于每一種氨基酸而言，在給定溫度或pH(貯藏條件)下該速率不同，但D異構(gòu)體較L異構(gòu)體更快。如本文所用，分別在pH為7和約25℃的溫度下，L-或D-肽可包含約99％L或D異構(gòu)體。
L-氨基酸是生物系統(tǒng)中天然存在形式，因此D-異構(gòu)體更能抗酶解并可具有增強(qiáng)的持久性。該特性可通過使用立體異構(gòu)體混合物而得到開發(fā)，對(duì)于特定應(yīng)用可產(chǎn)生期望水平的活性和存活力。所以，對(duì)于期望長(zhǎng)期持久性的應(yīng)用而言，優(yōu)選使用具有優(yōu)勢(shì)(大于約50％和優(yōu)選大于約70％)D異構(gòu)體的立體異構(gòu)混合物。在期望更強(qiáng)抗菌活性的地方，優(yōu)選使用具有優(yōu)勢(shì)(大于約50％和優(yōu)選大約約70％)L異構(gòu)體的立體異構(gòu)混合物。
如本文所用，“Protattin”指包含SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽。
對(duì)于本發(fā)明目的而言，通常所使用的陽(yáng)離子肽是基本上純化的。
如本文所用，術(shù)語“基本上純化的”指蛋白質(zhì)或其生物活性部分基本上不含細(xì)胞物質(zhì)或來自獲得所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞或組織來源的其它污染蛋白質(zhì)，或當(dāng)化學(xué)合成時(shí)基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)。所述術(shù)語“基本上不含細(xì)胞物質(zhì)”包括在蛋白質(zhì)制備中，從細(xì)胞的細(xì)胞成分中分離蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)分離自或重組產(chǎn)生自所述細(xì)胞。因而，基本上不含細(xì)胞物質(zhì)的蛋白質(zhì)包括在蛋白質(zhì)制備中具有小于約30％、20％、10％或5％(干重)的異種蛋白質(zhì)(在本文中也稱為“污染蛋白質(zhì)”)。當(dāng)通過重組生產(chǎn)所述蛋白質(zhì)或其生物活性部分時(shí)，也優(yōu)選基本上不含有培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基所占的蛋白制備物體積小于20％、10％或5％。當(dāng)通過化學(xué)合成生產(chǎn)所述蛋白質(zhì)時(shí)，優(yōu)選基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)藥品，即分離自化學(xué)前體或涉及所述蛋白質(zhì)合成的其它化學(xué)藥品。因此，上述蛋白質(zhì)制備物除了感興趣的多肽外，具有小于約30％、20％、10％、5％(干重)的化學(xué)前體或化合物。
使用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)可合成在本發(fā)明中有用的合成抗微生物肽?；蛘?，在體外翻譯和/或轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中可合成在本發(fā)明中有用的合成抗微生物肽。
合成抗微生物肽亦可使用常規(guī)固相肽和溶液肽合成方法進(jìn)行合成。上述方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知。下面描述了使用固相合成技術(shù)制備一種合成抗微生物肽的合成路線，但不限于，本發(fā)明該方法的范圍?？稍谌魏魏线m的合成樹脂上進(jìn)行所述合成反應(yīng)。合適的樹脂包括不溶的交聯(lián)聚苯乙烯樹脂等等。一般使用芴基甲氧基羰基等基團(tuán)保護(hù)氨基酸，并用N-羥基苯并三唑活化，以及但非必要，使用二異丙基碳二亞胺(DIC)以促進(jìn)偶聯(lián)。使用但不限于三氟乙酸或氨從樹脂上裂解完成合成的肽，并通過反相高效液相色譜(HPLC)純化產(chǎn)物，和/或在候選物從水/乙腈混合物中凍干形成干粉后通過透析純化產(chǎn)物。
在本發(fā)明中有用的合成抗微生物肽也可使用體外翻譯和/或轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)生產(chǎn)。該方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。例如，在多種無細(xì)胞系統(tǒng)中編碼Melimine或Protattin的合成mRNA可有效地翻譯，所述無細(xì)胞系統(tǒng)包括但不限于麥芽提取物和網(wǎng)狀細(xì)胞提取物。或者，在諸如TNTT7偶聯(lián)的網(wǎng)狀紅細(xì)胞裂解物系統(tǒng)的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)中，包含Melimine或Protattin編碼序列的合成DNA在T7啟動(dòng)子的控制下可有效地轉(zhuǎn)錄并翻譯，所述TNT T7偶聯(lián)的網(wǎng)狀紅細(xì)胞裂解物系統(tǒng)可購(gòu)自Promega?？赏ㄟ^本文所述的方法純化產(chǎn)物多肽。
L-melimine、protattin或它們的組合可吸附在生物醫(yī)學(xué)裝置的聚合物表面。所述合成抗微生物肽可在任何表面使用，但最方便用于具有負(fù)電荷的表面上。
或者，所述合成抗微生物肽可用丙烯?；虍惗∠；倌芑?，所述基團(tuán)可添加到單體混合物中，接著反應(yīng)形成生物醫(yī)學(xué)裝置，在形成該裝置的大多數(shù)聚合物中，以及在該裝置表面上具有合成抗微生物肽。
或者，所述合成抗微生物肽可鍵合到聚合物表面?？赏ㄟ^直接反應(yīng)或優(yōu)選通過使用偶聯(lián)劑的反應(yīng)達(dá)到該目的。例如，直接反應(yīng)可通過使用反應(yīng)試劑活化表面聚合物或合成抗微生物肽中的基團(tuán)，使之分別與肽或聚合物上官能團(tuán)起反應(yīng)，且不摻入偶聯(lián)劑而得到完成。例如，一種或多種合成抗微生物肽上的胺或醇或硫醇基團(tuán)可與該聚合物上的異硫氰酸酯、酰疊氮、N-羥基琥珀酰亞胺酯、五氟苯氧酯、磺酰氯、醛、乙二醛環(huán)氧化物、碳酸酯、芳基鹵、亞氨酸酯、甲苯磺酸酯或酐基直接反應(yīng)。
在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，可使用偶聯(lián)劑。用于偶聯(lián)裝置表面陽(yáng)離子肽或蛋白質(zhì)的偶聯(lián)劑包括，但不限于，N，N′-羰基二咪唑，碳二亞胺，例如1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(“EDC”)、雙環(huán)己基碳二亞胺、1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉代乙基)碳二亞胺、二異丙基碳二亞胺或它們的混合物。所述碳二亞胺也可用于與N-羥基琥珀酰亞胺或N-羥基磺基琥珀酰亞胺形成能與胺反應(yīng)形成酰胺的酯。
氨基通過形成席夫堿也可偶聯(lián)至所述聚合物，所述席夫堿可為諸如氰基硼氫化鈉等的試劑還原形成水解穩(wěn)定的胺鍵。具有該用途的偶聯(lián)劑包括，但不限于，N-羥基琥珀酰亞胺酯，例如二硫代雙(琥珀酰亞胺基丙酸酯)、3，3′-二硫代雙(磺基琥珀酰亞胺基丙酸酯)、二琥珀酰亞胺基辛二酸酯、雙(磺基琥珀酰亞胺)辛二酸酯、二琥珀酰亞胺基酒石酸酯等；亞氨酸酯，包括，但不限于，己二酰亞胺酸二甲酯；二氟苯衍生物、包括但不限于，1，5-二氟-2，4-二硝基苯；溴官能化醛，包括但不限于戊二醛(gluteraldehyde)以及雙環(huán)氧化物，包括但不限于1，4-丁二醇二環(huán)氧甘油醚。取決于裝置表面所存在的官能團(tuán)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可認(rèn)識(shí)到許多其它偶聯(lián)劑也可使用。
本領(lǐng)域技術(shù)人員也可認(rèn)識(shí)到，如果裝置表面并不包含合適的反應(yīng)活性基團(tuán)，上述合適的基團(tuán)可通過任何常規(guī)的有機(jī)合成方法摻入到聚合物中。或者，可通過將包含反應(yīng)活性基團(tuán)的聚合單體添加至用于形成所述聚合物的單體混合物中以導(dǎo)入反應(yīng)活性基團(tuán)。
不受限制，其上可吸附或鍵合合成抗微生物肽的聚合物表面實(shí)例是由苯乙烯和取代的苯乙烯、乙烯、丙烯、丙烯酸酯和異丁烯酸酯、N-乙烯基內(nèi)酰胺、丙烯酰胺和異丁烯酰胺、丙烯腈、丙烯酸和異丁烯酸的聚合物和共聚物、以及聚氨基甲酸酯類、聚酯、聚二甲基硅氧烷和它們的混合物所構(gòu)成的表面。上述聚合物可包括水凝膠和硅酮水凝膠。優(yōu)選使用甲基丙烯酸2-羥基乙酯的(″HEMA″)輕度交聯(lián)聚合物和共聚物?！拜p度交聯(lián)”意指所述聚合物具有足夠低的交聯(lián)度使之在室溫下柔軟且具彈性。通常來說，輕度交聯(lián)聚合物每約100個(gè)重復(fù)單體單位具有約0.1至約1個(gè)交聯(lián)分子。合適的輕度交聯(lián)HEMA聚合物和共聚物的實(shí)例包括但不限于，etafilcon A以及甘油異丁酸酯與HEMA的共聚物。也優(yōu)選使用硅酮水凝膠，特別是那些親水單體，例如N，N-二異丁烯酰胺。
在一個(gè)用于制造本發(fā)明裝置方法的實(shí)施方案中，將所述要被覆蓋的表面以任何方便的方式與L-melimine、protattin或它們的組合接觸。優(yōu)選涂層包含L-melimine。例如，所述裝置可置于L-melimine溶液和該醫(yī)學(xué)裝置所放置的溶劑中?；蛘?，首先用偶聯(lián)劑處理所述裝置表面，然后將該表面置于所選擇的合成抗微生物肽溶液中。再或者，所述合成抗微生物肽可單獨(dú)與聚合物表面起反應(yīng)。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明合成抗微生物肽的游離NH2基與包含反應(yīng)活性COOH基的聚合物表面結(jié)合。
在本發(fā)明中適合使用的溶劑是那些能溶解所選擇的合成抗微生物肽的，所述合成抗微生物肽例如L-melimine、protattin單體或組合物。優(yōu)選的覆蓋方法在水、醇或其混合物中進(jìn)行。EDC在水溶液中有效，因此其是優(yōu)選的偶聯(lián)劑。
偶聯(lián)劑可單獨(dú)使用，也可與能穩(wěn)定所形成的任何反應(yīng)活性中間體的試劑組合使用。舉例來說，EDC可與作為穩(wěn)定劑的N-羥基琥珀酰亞胺一起使用。此外，應(yīng)需要調(diào)節(jié)pH。優(yōu)選pH調(diào)節(jié)到約6.5至于約8.0，更優(yōu)選調(diào)節(jié)到約7.0至約7.5。
或者，可將潛反應(yīng)活性組分添加至單體混合物中，其中所選擇的單體不具有合適的羧酸官能團(tuán)。合適的潛反應(yīng)活性組分包括，但不限于，具有通式R-CO-L的酯化合物，其中R包含能進(jìn)行陽(yáng)離子、陰離子或自由基聚合的基團(tuán)，以及L是離去基團(tuán)。合適的R基團(tuán)包括能進(jìn)行自由基和/或陽(yáng)離子聚合的單價(jià)基團(tuán)，其包含至多20個(gè)碳原子。優(yōu)選的R基團(tuán)包含自由基反應(yīng)活性基團(tuán)、例如丙烯酸酯、苯乙烯基、乙烯基、乙烯醚、C1-6烷基丙烯酸酯、丙烯酰胺、C1-6烷基丙烯酰胺、N-乙烯基內(nèi)酰胺、N-乙烯基酰胺、C2-12鏈烯基、C2-12鏈烯基苯基、C2-12鏈烯基萘基或C2-6鏈烯基苯基C1-6烷基，或陽(yáng)離子反應(yīng)活性基團(tuán)，例如乙烯醚或環(huán)氧化物基團(tuán)及其混合物。特別優(yōu)選的R基團(tuán)包括異丁烯酸酯、丙烯酰氧基、異丁烯酰胺、丙烯酰胺及其混合物。
合適的L基團(tuán)在反應(yīng)條件下是穩(wěn)定的，保護(hù)羧酸酯基團(tuán)，在涂層條件下容易離去。合適的L基團(tuán)包括烷基酯、苯酯、羥基對(duì)-硝基芳基、對(duì)硝基苯酯、N-羥胺衍生物和甲苯磺酸酯，所有這些可以是取代的或非取代的。優(yōu)選的L基團(tuán)包括叔丁基酯、2，4，5-三氯苯酯、五氟苯酯、N-羥基琥珀酰亞胺酯、N-羥基-氧代二氫苯并三嗪衍生物、1-羥基苯并三唑酯及它們的組合。優(yōu)選的合適的L基團(tuán)包括五氟苯酯、甲苯磺酸酯和N-羥基琥珀酰亞胺酯及它們的混合物。優(yōu)選的潛反應(yīng)活性化合物包括五氟異丁烯酸酯和N-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺及它們的混合物等。
使用有效量的所選擇偶聯(lián)劑或反應(yīng)活性組分進(jìn)行偶聯(lián)，其中所述有效量是足以將合成抗微生物肽偶聯(lián)至裝置表面的量。所使用的偶聯(lián)劑的精確量取決于表面的化學(xué)性質(zhì)和所選擇的試劑。一般來說，基于涂層溶液重量，使用約0.01至約10重量百分比，優(yōu)選約0.01至約5.0，更優(yōu)選約0.01至約1重量百分比的偶聯(lián)劑。涂層溶液指合成抗微生物肽和一種或多種溶劑、偶聯(lián)劑、緩沖液等。典型地，每一透鏡所使用的涂層溶液的量在約1ml至約10ml，優(yōu)選約1ml至約5ml，更優(yōu)選約1ml至約2ml。
在本發(fā)明方法中，所使用的諸如L-melimine、protattin或其組合的合成抗微生物肽的覆蓋有效量指這樣一種量，即當(dāng)抗微生物肽與表面接觸時(shí)足以覆蓋該表面以致賦予該表面所需抗微生物特性的量?？刮⑸锾匦灾刚掣皆诒砻娴募?xì)菌數(shù)量及其生長(zhǎng)能力明顯減少，大于約50％。一般來說，在接觸透鏡上與透鏡接觸的合成抗微生物肽量為每一透鏡約1μg至約10mg，優(yōu)選約10μg至約1mg。每一透鏡產(chǎn)生的涂層量為約50至約1000μg。在使用L-melimine化合物情況下， 所使用的L-melimine的量?jī)?yōu)選為約250μg/透鏡至約1000μg/透鏡。
溫度和壓力并不是本發(fā)明方法的關(guān)鍵因素，本發(fā)明方法可方便地在室溫和常壓下進(jìn)行。
所使用的接觸時(shí)間應(yīng)當(dāng)是足以覆蓋表面至所需程度的時(shí)間長(zhǎng)度。優(yōu)選的接觸時(shí)間為約60秒至約24小時(shí)。
在接觸后，用水或緩沖鹽水溶液洗滌表面以除去未反應(yīng)的合成抗微生物肽及溶劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到用于生產(chǎn)通過本發(fā)明方法要被覆蓋的表面的聚合物可包含其它單體和添加劑。例如，可使用紫外吸收單體、反應(yīng)活性著色劑、加工助劑等等。
本發(fā)明將通過考慮如下非限制性實(shí)施例得到進(jìn)一步闡明。
實(shí)施例1為評(píng)價(jià)溶液中陽(yáng)離子蛋白質(zhì)/肽抗菌效果，銅綠假單胞菌6294(Psudomonas aeruginosa6294)和金黃色葡萄球菌31(Staphylacoccusaureus 31)細(xì)胞在大豆胰蛋白胨肉湯(TSB)中于35℃培養(yǎng)18小時(shí)。接著通過離心收獲細(xì)胞，并在磷酸鹽緩沖液(PBS；NaCl8g/l；KCl0.2g/l；Na2HPO41.15g/l；KH2PO40.2g/l)中洗滌兩次。然后將細(xì)胞重懸浮在PBS中，在660nm處調(diào)節(jié)OD值為0.1。將1mg/ml陽(yáng)離子肽連續(xù)稀釋，并將稀釋液添加到96孔微量滴定板的孔中或5ml的一次性試管中。對(duì)照物是不含肽的細(xì)菌。在35℃下溫育細(xì)菌18小時(shí)，并在660nm處測(cè)量濁度。無混濁試管所對(duì)應(yīng)的肽稀釋度被認(rèn)為是最小抑制濃度(“MIC”)。
表1
抑制細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的最小濃度值表示為μg/mlR＝抗性，肽最高濃度＝1000μg/Ml；ND＝未測(cè)定S.a.31是金黃色葡萄球菌31(S.aureus 31)S.a.CK5是金黃色葡萄球菌CK5(S.aureus CK5)
P.a6294是銅綠假單胞菌6294(P.aeruginosa6294)P.a15442是銅綠假單胞菌15442(P.aeruginosa15442)表1中數(shù)據(jù)顯示當(dāng)使用常規(guī)方法測(cè)量試管溶液時(shí)，溶液中對(duì)金黃色葡萄球菌(S.Aureus)起作用的Melimine具有MIC為60-250μg/ml，而銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)對(duì)該肽的抗性高達(dá)1000μg/ml(所使用的最高濃度)。
實(shí)施例2為了進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，從廠商的管形瓶中取出EtafilconA透鏡，在1mlPBS中洗滌三次，干燥，接著將500μg L-Melimine移液至該接觸透鏡上(melimine在蒸餾水中溶解并在接觸透鏡上空氣干燥)，在通風(fēng)櫥中在室溫下覆蓋過夜。用于每種菌株的透鏡數(shù)量示于表2括號(hào)中。透鏡在PBS中與0.5ml的1×108細(xì)菌細(xì)胞/ml在水合10分鐘，所述將包括革蘭氏陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌(S.Aureus)和革蘭氏陰性的銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)添加到透鏡上。在室溫下溫育10分鐘或5小時(shí)后，透鏡在PBS中洗滌三次以除去不粘附或粘附松散的細(xì)菌。然后，使用組織勻漿器及1ml PBS均質(zhì)化處理透鏡直至其分解(約1-2分鐘)。接著根據(jù)Miles和Misra技術(shù)制備連續(xù)稀釋液，并將等分試樣(20μL)置于營(yíng)養(yǎng)瓊脂上。在37℃下溫育過夜后，測(cè)定仍存活的細(xì)菌，在計(jì)算透鏡表面積(約310mm2)后結(jié)果以每平方毫米的菌落形成單位數(shù)來表示?；谂c粘附在對(duì)照透鏡上的每平方毫米菌落形成單位數(shù)比較來計(jì)算效果，所述對(duì)照透鏡在細(xì)菌粘附測(cè)試前不覆蓋陽(yáng)離子蛋白質(zhì)/肽。結(jié)果如表2所示。
表2
在10分鐘和5小時(shí)暴露后，L-Melimine能明顯減少水凝膠聚合物上的細(xì)菌數(shù)量。該數(shù)據(jù)顯示對(duì)于所測(cè)試的菌株而言，覆蓋有500μgL-Melimine的透鏡粘附在水凝膠聚合物上的微生物數(shù)量減少了至少約80％。
實(shí)施例3如上所述，除了將L-melimine濃度改變?yōu)?25μg、250μg或500μg/透鏡外，將購(gòu)自Johnson & Johnson的商標(biāo)名為ACUVUE的Etafilcon透鏡如實(shí)施例2所示進(jìn)行浸泡。在在水凝膠聚合物吸收L-Melimine后，將透鏡與PBS再水合，并暴露于金黃色葡萄球菌(S.Aureus)或銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)中10分鐘或5小時(shí)，如實(shí)施例2所述。在暴露完成后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Miles和Misra平板計(jì)數(shù)測(cè)定法評(píng)估聚合物上微生物數(shù)量。
表3
測(cè)試用透鏡數(shù)示于()中表3結(jié)果顯示，隨著L-Melimine濃度的減少，被抑制的微生物數(shù)量也相應(yīng)減少。
實(shí)施例4在蒸餾水中制備包含L-Protattin的母液(50mg/ml)。在通風(fēng)櫥中，在室溫下將500μg母液吸附在由EtafilconA所制成的接觸透鏡上，就像L-melamine在實(shí)施例2中那樣，吸附18小時(shí)。隨后的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟如上實(shí)施例2所述，測(cè)量仍存活的細(xì)菌數(shù)量。結(jié)果示于下表4中。
表4
測(cè)試用透鏡數(shù)示于()中表4數(shù)據(jù)顯示使用Protattin肽能減少粘附在水凝膠聚合物上的微生物數(shù)量。但是，與實(shí)施例2中的L-Melimine數(shù)據(jù)比較，L-Melimine是優(yōu)選的氨基酸序列，因?yàn)槠漭^Protattin在減少細(xì)菌在接觸透鏡上的粘附和集群上更有效，特別是在數(shù)小時(shí)后。
實(shí)施例5進(jìn)行熱穩(wěn)定性研究以評(píng)估L-Melimine暴露于高壓滅菌后是否改變其防止細(xì)菌生長(zhǎng)的能力。
將細(xì)菌(銅綠假單胞菌6294和金黃色葡萄球菌31)在TSB中35℃培養(yǎng)18小時(shí)，接著在PBS中洗滌兩次。然后將細(xì)菌重懸浮在PBS中，在660nm處調(diào)節(jié)光密度至0.1。L-Melimine在PBS中溶解，濃度為1000μg/ml，并在121℃下高壓滅菌15分鐘。接著將相等體積的細(xì)菌懸浮液和L-Melimine混合并在35℃下溫育至多72小時(shí)。對(duì)照物是不進(jìn)行高壓滅菌的L-Melimine。在24、48和72小時(shí)后，除去細(xì)菌/L-Melimine溶液的等分試樣，使用標(biāo)準(zhǔn)的Miles和Misra平板計(jì)數(shù)測(cè)定法對(duì)仍存活的細(xì)菌計(jì)數(shù)。表5A和5B顯示了結(jié)果。
表5A在溶液中Melimine抗銅綠假單胞菌6294的熱穩(wěn)定性
測(cè)試用透鏡數(shù)示于()中表5B在溶液中Melimine抗金黃色葡萄球菌31的熱穩(wěn)定性
測(cè)試用透鏡數(shù)示于()中所有的標(biāo)準(zhǔn)偏差皆為1或更小。L-Melimine的高壓滅菌處理并不導(dǎo)致活性的任何減少。
實(shí)施例6如實(shí)施例1所述培養(yǎng)細(xì)菌(肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)和粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens))。如實(shí)施例2所述制備接觸透鏡，并將其在細(xì)菌溶液中浸泡10分鐘。在吸附完成后，如實(shí)施例2所述對(duì)透鏡進(jìn)行處理，并與沒有用L-melimine處理的對(duì)照透鏡比較以測(cè)量細(xì)菌減少％。結(jié)果示于下表6中。
表6
測(cè)試用透鏡數(shù)示于()中表6數(shù)據(jù)顯示L-Melimine能減少肺炎鏈球菌和粘質(zhì)沙雷氏菌在接觸透鏡上的粘附。在產(chǎn)生有害結(jié)果時(shí)，已從接觸透鏡上分離到這些細(xì)菌。
實(shí)施例7將三只接觸透鏡(Etafilcon A)在0.1M pH5.0的醋酸鈉緩沖液中洗滌兩次，然后重懸于2ml 0.1M pH5.0的醋酸鈉緩沖液中，在該緩沖液中1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(″EDC″)終濃度為2mg/ml，在室溫下反應(yīng)15分鐘。然后將接觸透鏡在pH7.4PBS中洗滌三次。接著將接觸透鏡重懸于1mg/ml的L-Melimine PBS溶液中，并在37℃下攪拌溫育兩小時(shí)。然后將接觸透鏡在PBS中洗滌四次，并使用Cole和Ralston(1994)開發(fā)的方法定量結(jié)合的肽。在37℃下，使用過濾的溶有0.025％考馬斯染色劑的10％醋酸和10％異丙醇染色接觸透鏡2-24小時(shí)。在37℃下，在10％醋酸和10％異丙醇中對(duì)透鏡脫色。接著在25％吡啶中抽提透鏡過夜。使用25％吡啶作為空白對(duì)照物，在分光光度計(jì)中A600處分析抽提液。通過將抽提物與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較來確定L-Melimine的量，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過移取已知數(shù)量的L-Melimine至半干燥丙烯酰胺凝膠上并如上所述進(jìn)行抽提而建立的，該方法從凝膠中抽提出所有的肽。使用本實(shí)施例的方法大約有18μg/透鏡的Melimine結(jié)合到接觸透鏡上。
如實(shí)施例2所述，將透鏡暴露于細(xì)菌(在35℃于銅綠假單胞菌10分鐘)并對(duì)其分析。該透鏡顯示了66±3％的細(xì)菌吸附減少率。
實(shí)施例8對(duì)接觸透鏡進(jìn)行涂覆并干燥(如實(shí)施例2所述)，所用的D-Melimine濃度為250μg/透鏡或500μg/透鏡。就像L-melimine那樣，D-melimine是通過標(biāo)準(zhǔn)的肽合成技術(shù)(如Fmoc)使用D-氨基酸所制備的。如實(shí)施例2所述方法進(jìn)行細(xì)菌吸附抑制的測(cè)定。
表7-L-melimine減少％
表8-D-melimine減少％
于10分鐘及250μg/透鏡時(shí)，L-和D-Melimines對(duì)金黃色葡萄球菌幾乎不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上可測(cè)量的活性(表7和8)。此外，與L-Melimine比較，D-對(duì)映異構(gòu)體在250μg/透鏡下抗銅綠假單胞菌的活性沒有差異。在500μg/透鏡濃度下，L-對(duì)映異構(gòu)體顯示了抗銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的活性，而D-對(duì)映異構(gòu)體顯示了對(duì)銅綠假單胞菌統(tǒng)計(jì)學(xué)上一致的活性。
實(shí)施例9為了進(jìn)行體外細(xì)胞毒性測(cè)試，在PBS中制備L-Melimine溶液(500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml和62.5μg/ml)。接著以1∶3比例將溶液稀釋于組織培養(yǎng)液(EMEM)中，并將稀釋后的組織培養(yǎng)液添加至鼠L929細(xì)胞，培養(yǎng)48小時(shí)。在鹽水中漂洗細(xì)胞，然后在室溫下使用0.25％胰島素3-5分鐘來收獲細(xì)胞。接著，將1ml鹽水添加至細(xì)胞和胰島素混合物中，將500μl等分試樣添加至19.5ml鹽水中并在庫(kù)爾特粒度儀中對(duì)細(xì)胞重復(fù)計(jì)數(shù)三次。將結(jié)果與未受擾培養(yǎng)物以及陽(yáng)性(細(xì)胞毒性)對(duì)照物進(jìn)行比較。以未存活細(xì)胞的百分率(100-樣本中細(xì)胞數(shù)目/未受擾細(xì)胞中細(xì)胞數(shù)目×100)來表示結(jié)果。此外，檢測(cè)肽溶解綿羊紅細(xì)胞的能力。將綿羊紅細(xì)胞在PBS中洗滌并重懸。將不同濃度的肽添加至紅細(xì)胞中并在37℃下溫育4小時(shí)。使用蒸餾水獲得100％溶胞結(jié)果，而使用PBS獲得0％溶胞結(jié)果。在離心除去完整的紅細(xì)胞后，通過測(cè)量釋放至PBS中的血紅蛋白量來測(cè)定溶胞結(jié)果。
表9
發(fā)現(xiàn)L-Melimine在500μg/ml處具有邊際細(xì)胞毒性，而在所有其它濃度處沒有細(xì)胞毒性(表9)。如圖1所示，蜂毒肽引起紅細(xì)胞廣泛溶血，而所有其它肽/蛋白質(zhì)引起更少溶血。L-Melimine所導(dǎo)致的溶血量在所有肽/蛋白質(zhì)中最小。這些結(jié)果顯示Melimine可用于接觸透鏡，而不引起眼的不良反應(yīng)。
實(shí)施例10對(duì)L-Melimine進(jìn)行評(píng)估以確定其對(duì)銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的潛在誘導(dǎo)抗性。在暴露于L-Melimine前，如實(shí)施例1所述測(cè)定兩種菌株的MICs。在實(shí)施例1中銅綠假單胞菌在1mg/ml時(shí)具抗性，因此當(dāng)與銅綠假單胞菌溫育時(shí)將用于測(cè)定L-Melimine MIC的起始濃度提高到15mg/ml，使用實(shí)施例1的方法結(jié)果測(cè)定的MIC為4mg/ml。對(duì)于實(shí)施例10而言，將約25％的MIC用作為亞抑菌濃度，其示于下表10欄2中。將細(xì)菌在TSB中培養(yǎng)過夜。并以1∶100比例接種于新鮮的TSB中并溫育過夜，所述TSB包含亞抑菌濃度的L-Melimine。接著在新鮮TSB中將來自包含亞抑菌濃度肉湯培養(yǎng)基的細(xì)菌(表9，欄2)與相同濃度的L-Melimine再溫育。連續(xù)重復(fù)30天。傳代后，測(cè)定最后一次傳代細(xì)菌的MIC。任何MIC的增加將表明細(xì)菌可能變成有抗性的。
表10
在傳代全程中銅綠假單胞菌的MIC沒有改變，顯示了對(duì)Melimine不可能有抗性。在傳代全程中金黃色葡萄球菌的MIC實(shí)際上減少了，表明該菌株的亞抑菌濃度更易受該肽的影響。沒有跡象表明任一細(xì)菌對(duì)L-Melimine具潛在抗性。因此，本發(fā)明提供了具有抗菌活性陽(yáng)離子肽，且沒有跡象表明在傳代全程中具抗菌抗性。因此，用這些肽涂覆或處理的醫(yī)學(xué)裝置應(yīng)適合于重復(fù)或長(zhǎng)期使用，并具有所需的抗菌活性。
實(shí)施例11評(píng)價(jià)L-Melimine以測(cè)定其在眼淚中所能保留的活性。如下所述將L-Melimine在眼淚存在下溫育。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板中打孔，接著接種細(xì)菌(銅綠假單胞菌6294或金黃色葡萄球菌31)。將從正常受試人處收集的眼淚(10μl)添加至孔中并使之在室溫下為瓊脂吸收15分鐘。然后添加L-Melimine，濃度為125μg/孔。將營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板在35℃下溫育過夜，溫育后，測(cè)量抑制區(qū)并用毫米(mm)來表示。結(jié)果示于下表11中。
表11
當(dāng)在眼淚中時(shí)，L-Melimine活性沒有明顯增加或減少，表明眼淚并不干擾該肽的活性。
實(shí)施例12在室溫及氮?dú)夥障?，向放置有干燥吸收器的干燥容器中添?0.0g(0.277 mol)的雙(二甲氨基)甲基硅烷、13.75ml的1M TBACB(386.0gTBACB溶于1000ml無水THF)溶液、61.39g(0.578mol)的對(duì)二甲苯、154.28g(1.541mol)的甲基丙烯酸甲酯(相對(duì)于引發(fā)劑為1.4當(dāng)量)、1892.13(9.352mol)甲基丙烯酸2-(三甲基甲硅烷氧基)乙酯(相對(duì)于引發(fā)劑為8.5當(dāng)量)和4399.78g(61.01mol)的THF的溶液。向裝備有熱電偶和冷凝器的干燥三頸圓底燒瓶中充滿上述于干燥吸收器中所配制的混合物，所有三頸都通氮?dú)狻?br> 將反應(yīng)混合物冷卻至15℃，邊攪動(dòng)邊用氮?dú)馇逑础Ｔ谌芤哼_(dá)到15℃后，將191.75 g(1.100mol)的1-三甲基甲硅烷氧基-1-甲氧基-2-甲基丙烯(1當(dāng)量)注射入反應(yīng)器中。使反應(yīng)放熱至約62℃，接著將30ml0.40M TBACB溶液(154.4g TBACB溶于11ml無水THF中)按計(jì)量加入至反應(yīng)的全部殘留物中。在反應(yīng)溫度達(dá)到30℃時(shí)開始計(jì)量，添加467.56g(2.311mol)甲基丙烯酸2-(三甲基甲硅烷氧基)乙酯(相對(duì)于引發(fā)劑為2.1當(dāng)量)、3636.6.g(3.463mol)正丁基單異丁烯酰氧基丙基-聚二甲基硅氧烷(相對(duì)于引發(fā)劑為3.2當(dāng)量)、3673.84g(8.689mol)的TRIS(相對(duì)于引發(fā)劑為7.9當(dāng)量)和20.0g雙(二甲氨基)甲基硅烷的溶液。
使混合物放熱至約38-42℃，隨后冷卻至30℃。在當(dāng)時(shí)，添加10.0g(0.076mol)雙(二甲氨基)甲基硅烷、154.26g(1.541mol)甲基丙烯酸甲酯(相對(duì)于引發(fā)劑為1.4當(dāng)量)和1892.13g(9.352mol)甲基丙烯酸2-三甲基甲硅烷氧基)乙酯(相對(duì)于引發(fā)劑為8.5當(dāng)量)的溶液，并使混合物再次放熱至約40℃.在反應(yīng)溫度降至約30℃時(shí)，添加2加侖THF以減少粘度。向混合物中添加439.69g水、740.6g甲醇和8.8g(0.068mol)二氯乙酸的溶液并將混合物回流4.5小時(shí)以對(duì)HEMA上的保護(hù)基團(tuán)去保護(hù)。接著除去揮發(fā)物并加入甲苯以幫助除去水，直至水蒸汽溫度達(dá)到110℃為止。
將反應(yīng)燒瓶維持在約110℃并加入443g(2.201mol)TMI和5.7g(0.010mol)二丁基錫二月桂酸酯?；旌衔锲鸱磻?yīng)直至通過IR監(jiān)測(cè)到異氰酸酯峰出現(xiàn)。減壓蒸發(fā)甲苯直至產(chǎn)生灰白色的、無水蠟狀反應(yīng)活性單體。將該大分子單體置于丙酮中，以重量單位計(jì)為約2∶1的丙酮對(duì)大分子單體。24小時(shí)后，加入水以沉淀出大分子單體并將其過濾，使用真空干燥箱于45-60℃干燥20-30小時(shí)。
實(shí)施例13通過添加示于表12中的100份組分以形成反應(yīng)混合物，根據(jù)表12中所示數(shù)量具有20份3，7-二甲基-3-辛醇。特別地，以如下順序?qū)⒋蠓肿訂误w、Norbloc 7966、稀釋劑、TEGDMA、HEMA、DMA、TRIS和mPDMS添加至琥珀燒瓶中。這些組分在170-300rpm和50-55℃下混合90-180分鐘。在混合時(shí)，加入HEMA藍(lán)并將這些組分進(jìn)一步混合20-75分鐘(在170-300rpm，50-55℃下)。還在混合中，添加PVP并再攪拌混合物20-140分鐘(在170-300rpm，50-55℃下)。最后，在連續(xù)混合中添加CGI1850(Irgacure1850)。
表12
將異丁烯酸五氟苯基酯(OPfp)(0.5重量％)添加至反應(yīng)混合物中。劇烈混合反應(yīng)混合物約10分鐘(或均勻混合直至溶液澄清為止)并接著脫氣，或高真空直至反應(yīng)混合物中沒有氣泡可見(約20分鐘)。將該反應(yīng)混合物置于熱塑性接觸透鏡模具中，并使用Philips TL20W/03T熒光燈在N2氣氛中于50℃照射約50分鐘。在Dowanol DPMA(DPMA，購(gòu)自Aldrich)中脫模。用DPMA洗滌透鏡5次。每次洗滌持續(xù)約120分鐘。將透鏡單獨(dú)置于含有2mL溶液的管形瓶中，該溶液含有2.5mg/mL melimine和溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的0.05重量％的N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)。使用灰色丁基阻聚劑對(duì)管形瓶(包含透鏡和溶液)進(jìn)行阻聚，然后于37℃在培養(yǎng)箱/振蕩器中溫育18小時(shí)，以100rpm持續(xù)搖動(dòng)。
溫育后，從每個(gè)管形瓶中除去溶劑。然后，向每個(gè)管形瓶中添加大約9mL新鮮的DMF溶劑。1小時(shí)后，除去溶劑并再次添加相同體積的新鮮DMF溶劑。該過程總共重復(fù)4次，每次間隔1小時(shí)。在第四次溶劑交換后，在室溫下將透鏡直接置于DI水中，并洗滌4次，每次間隔1小時(shí)。在第四次洗滌后，在室溫下將透鏡置于包裝溶液中1小時(shí)，然后在121℃高壓滅菌30分鐘。測(cè)量透鏡特性，示于下表13中。
實(shí)施例14除了添加至包含melimine涂層溶液的偶聯(lián)添加劑和melimine涂層溶液的濃度改變外，重復(fù)實(shí)施例13。因此，如實(shí)施例13所準(zhǔn)確描述，將在DPMA溶劑中脫模及洗滌后的透鏡分別置于含3mL 5mg/mL N-羥基苯并三唑(HOBt)DMF溶液的管形瓶中。使用標(biāo)刻度的移液器，向每個(gè)管形瓶中添加50μL的二異丙基碳二亞胺(DIC)。在室溫下20-60分鐘后，使用標(biāo)刻度的Eppendorf移液器將1mL的3mg/mLmelimine DMF溶液添加至每個(gè)管形瓶中，所述DMF溶液包含0.5重量％的N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)。使用灰色丁基阻聚劑對(duì)管形瓶阻聚。接著于37℃在培養(yǎng)箱/振蕩器中溫育透鏡約19小時(shí)，以100rpm持續(xù)搖動(dòng)。
溫育后，從每個(gè)管形瓶中除去溶劑。然后，向每個(gè)管形瓶中添加大約9mL新鮮的DMF溶劑。1小時(shí)后，除去溶劑并再次添加相同體積的新鮮DMF溶劑。該過程總共重復(fù)4次，每次間隔1小時(shí)。在第四次溶劑交換后，在室溫下將透鏡直接置于DI水中，并洗滌4次，每次間隔1小時(shí)。在第四次洗滌后，在室溫下將透鏡置于包裝溶液中1小時(shí)，然后在121℃高壓滅菌30分鐘。測(cè)量透鏡特性，示于下表13中。標(biāo)準(zhǔn)偏差示于括號(hào)中。
表13
實(shí)施例15將實(shí)施例13和14所制備的透鏡從管形瓶中取出，并在5mLPBS中洗滌3次，每次5分鐘。無涂層及具有相同襯底(substrate)配方的透鏡作為對(duì)照，在35℃下將四只透鏡暴露于細(xì)菌(銅綠假單胞菌或金黃色葡萄球菌)，暴露時(shí)間如下表14所示，如實(shí)施例2所述進(jìn)行分析。
表14
實(shí)施例16-19除了melimine涂層溶液濃度和洗滌程序改變外，重復(fù)實(shí)施例14。因此，如實(shí)施例14所準(zhǔn)確描述，在DPMA溶劑中脫模及洗滌后的透鏡分別置于含3mL 5mg/mL N-羥基苯并三唑(HOBt)DMF溶液的管形瓶中。使用標(biāo)刻度的移液器，向每個(gè)管形瓶中添加50μL的二異丙基碳二亞胺(DIC)。在室溫下約60分鐘后，使用標(biāo)刻度的Eppendorf移液器將1mL列于表15不同濃度的melimine涂層DMF溶液添加至每個(gè)管形瓶中，所述DMF溶液包含0.05重量％的N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)。使用灰色丁基阻聚劑對(duì)管形瓶阻聚。接著于37℃在培養(yǎng)箱/振蕩器中溫育透鏡約19小時(shí)，以100rpm持續(xù)搖動(dòng)。
溫育后，將透鏡轉(zhuǎn)移至含300mL新鮮DMF和磁力攪拌器的400mL燒杯中。透鏡在DMF中攪拌1小時(shí)。該過程重復(fù)多于3次(總共4次)。在第四次溶劑交換后，將300mL DI水添加至燒杯中，并用DI水洗滌透鏡共4次。在第四次洗滌后，將透鏡置于含包裝溶液的管形瓶中。然后在121℃下高壓滅菌30分鐘。測(cè)量透鏡特性，示于下表15中。標(biāo)準(zhǔn)偏差示于括號(hào)中。
表15
N/M表示未測(cè)量。
實(shí)施例20將實(shí)施例16-19所制備的透鏡從管形瓶中取出，并在5mLPBS中洗滌3次，每次5分鐘。無涂層及具有相同襯底配方的透鏡作為對(duì)照，在35℃下將四只透鏡暴露于細(xì)菌(銅綠假單胞菌或金黃色葡萄球菌)，暴露時(shí)間如下表16所示，如實(shí)施例2所述進(jìn)行分析。標(biāo)準(zhǔn)偏差示于括號(hào)中。
表16
實(shí)施例21向裝備有磁力攪拌器和容有0.60g melimine的100mL圓低燒瓶中添加50mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)。在25℃及氮?dú)庀?，攪拌均相溶?0分鐘。向溶液中添加N，N-二異丙基乙胺(DIPEA，33μL)。接著仍在氮?dú)庀拢瑢⑷芤褐糜诒≈胁嚢琛?0分鐘后，向溶液中添加異丁烯酰氯(19μL)。將溶液降至室溫并通過質(zhì)譜法監(jiān)測(cè)。約20小時(shí)后，在室溫下向溶液中添加多于19μL的異丁烯酰氯并攪拌溶液。再過約20小時(shí)，將DMF從燒瓶中蒸發(fā)，殘留物溶于DI水中并使用透析管(苯甲?；睦w維素透析管，截留分子量2,000，購(gòu)自Sigma)對(duì)2×4L的DI水透析。對(duì)透析部分冷凍干燥得到約250mg的異丁烯酰化melimine，為蓬松的白色粉末。
實(shí)施例22將異丁烯酰化的melimine(實(shí)施例21，74.9mg)添加至3.12g的DMA中，在40℃下對(duì)混合物進(jìn)行超聲處理直至全部melimine都溶解(約1小時(shí))。該melimine/DMA溶液被用于制備反應(yīng)混合物。通過添加示于表17中的100份組分形成反應(yīng)混合物，根據(jù)表17中所示數(shù)量具有20份3，7-二甲基-3-辛醇。特別地，以如下順序?qū)⒋蠓肿訂误w、Norbloc 7966、稀釋劑、TEGDMA、HEMA、melimine/DMA溶液、TRLS和mPDMS添加至琥珀燒瓶中。這些組分在170-300 rpm和50-55℃下混合90-180分鐘。在混合時(shí)，加入HEMA藍(lán)并將這些組分進(jìn)一步混合20-75分鐘(在170-300rpm，50-55℃下)。還在混合中，添加PVP并再攪拌混合物20-140分鐘(在170-300rpm，50-55℃下)。最后，在連續(xù)混合中添加CGI1850(Irgacure 1850)。
表17
將反應(yīng)混合物在高真空下脫氣直至在反應(yīng)混合物中沒有氣泡可見(約20分鐘)。將該反應(yīng)混合物置于熱塑性接觸透鏡模具中，并使用Philips TL20W/03T熒光燈在N2氣氛中于50℃照射約60分鐘。照射后，打開模具將透鏡在60％異丙醇/水中脫模，接著在IPA/DI中瀝濾以除去所有殘留的單體和稀釋劑。將透鏡轉(zhuǎn)移至含包裝溶液的管形瓶中，并在121℃下高壓滅菌30分鐘。測(cè)量透鏡特性，示于表18中。
表18
實(shí)施例23將實(shí)施例22所制備的透鏡從管形瓶中取出，并在5mL PBS中洗滌3次，每次5分鐘。具有相同襯底配方但不含有異丁烯?；膍elimine的透鏡作為對(duì)照。在35℃下將四只透鏡暴露于細(xì)菌(銅綠假單胞菌或金黃色葡萄球菌)，暴露時(shí)間如下表19所示，如實(shí)施例2所述進(jìn)行分析。
表19
實(shí)施例24向裝備有磁力攪拌器和容有3.00g melimine的500mL圓低燒瓶中添加120mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)。在25℃及氮?dú)庀?，攪拌均相溶液約5分鐘。向溶液中添加N，N-二異丙基乙胺(DIPEA，170μL)。接著仍在氮?dú)庀?，將溶液置于冰浴中并攪拌?0分鐘后，向溶液中添加異丁烯酰氯(95μL)。將溶液降至室溫。約20小時(shí)后，反應(yīng)結(jié)束通過質(zhì)譜法監(jiān)測(cè)。約20小時(shí)后，在室溫下向溶液中添加多于19μL的異丁烯酰氯并攪拌溶液。將DMF從燒瓶中蒸發(fā)，殘留物溶于約10mLDI水中并使用透析管(苯甲酰化的纖維素透析管，截留分子量2,000，購(gòu)自Sigma)對(duì)3×4L的DI水透析。對(duì)透析部分冷凍干燥得到約940mg的異丁烯酰化melimine，為蓬松的白色粉末。
實(shí)施例25-27重復(fù)實(shí)施例22，使用了實(shí)施例24的異丁烯酰化melimine，數(shù)量如下表20所示。測(cè)量透鏡特性，示于表20。標(biāo)準(zhǔn)偏差示于括號(hào)中。
表20
實(shí)施例28將實(shí)施例25-27所制備的透鏡從管形瓶中取出，并在5mLPBS中洗滌3次，每次5分鐘。具有相同襯底配方但不含有異丁烯酰化的melimine的透鏡作為對(duì)照。在35℃下將四只透鏡暴露于細(xì)菌(銅綠假單胞菌或金黃色葡萄球菌)，暴露時(shí)間如下表21所示，如實(shí)施例2所述進(jìn)行分析。標(biāo)準(zhǔn)偏差示于括號(hào)中。
表2權(quán)利要求
1.一種裝置，包含生物醫(yī)學(xué)裝置，其至少一個(gè)表面包含覆蓋有效量的至少一種合成抗微生物肽。
2.權(quán)利要求1的裝置，其中所述裝置選自導(dǎo)管、植入物、支架、流體收集袋、傳感器、水凝膠繃帶、輸液管、抗生素載體、診斷和治療劑和眼科裝置。
3.權(quán)利要求1的裝置，其中生物醫(yī)學(xué)裝置是一種眼科裝置。
4.權(quán)利要求1的裝置，其中至少一種合成抗微生物肽包含以任意順序排列的三個(gè)片斷A、B和C，其中片斷A是具有序列SEQ ID NO.1的肽；片段B是具有序列SEQ ID NO.2的肽；和片斷C是至多10個(gè)氨基酸的連接基團(tuán)，其不抑制肽的抗微生物活性或不誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒性，其包括0至約10個(gè)氨基酸的間隔區(qū)。
5.權(quán)利要求4的裝置，其中片斷C具有化學(xué)式-HN-(CR1R2)n-CO-，其中n是1-21的整數(shù)，R1和R2獨(dú)立地選自H、具有1-4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基、具有1-2個(gè)碳原子的直鏈或支鏈羥基、具有1-3個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷硫基、具有1-3個(gè)碳原子的氨基甲?；⒕哂?-3個(gè)碳原子的羧基、具有1-4個(gè)碳原子和1-3個(gè)氮原子的伯氨基和仲氨基、芐基、苯酚、苯基吲哚以及N，N-吡咯。
6.權(quán)利要求5的裝置，其中n是1-10的整數(shù)，R1和R2中至少之一是H。
7.權(quán)利要求4的裝置，其中A和B片斷位于末端位置，片斷C包含至多5個(gè)氨基酸。
8.權(quán)利要求1的裝置，其中至少一個(gè)表面包含覆蓋有效量的melimine、protattin及它們混合物。
9.權(quán)利要求8的裝置，其中所述melimine是L-melimine。
10.權(quán)利要求8的裝置，其中所述melimine是D-melimine。
11.權(quán)利要求1的裝置，其中表面還包含選自下列的聚合物水凝膠、硅酮水凝膠、甲基丙烯酸2-羥基乙酯的聚合物和共聚物以及它們的混合物。
12.權(quán)利要求11的裝置，其中聚合物是水凝膠。
13.權(quán)利要求11的裝置，其中聚合物是硅酮水凝膠。
14.權(quán)利要求11的裝置，其中聚合物是甲基丙烯酸2-羥基乙酯的聚合物和共聚物。
15.權(quán)利要求14的裝置，其中甲基丙烯酸2-羥基乙酯的共聚物是甲基丙烯酸2-羥基乙酯的輕度交聯(lián)的共聚物。
16.權(quán)利要求1-15的裝置，其中所述裝置是接觸透鏡。
17.一種制造裝置的方法，包括將生物醫(yī)學(xué)裝置的至少一個(gè)表面與覆蓋有效量的至少一種抗微生物肽接觸的步驟。
18.權(quán)利要求17的方法，其中至少一種合成抗微生物肽包含以任意順序排列的三個(gè)片斷A、B和C，其中片斷A是具有序列SEQ ID NO.1的肽；片段B是具有序列SEQ ID NO.2的肽；和片斷C是至多10個(gè)氨基酸的連接基團(tuán)，其不抑制肽的抗微生物活性或不誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒性，其包括0至約10個(gè)氨基酸的間隔區(qū)。
19.權(quán)利要求17的方法，其中片斷C具有化學(xué)式-HN-(CR1R2)n-CO-，其中n是1-21的整數(shù)，R1和R2獨(dú)立地選自H、具有1-4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基、具有1-2個(gè)碳原子的直鏈或支鏈羥基、具有1-3個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷硫基、具有1-3個(gè)碳原子的氨基甲酰基、具有1-3個(gè)碳原子的羧基、具有1-4個(gè)碳原子和1-3個(gè)氮原子的伯氨基和仲氨基、芐基、苯酚、苯基吲哚以及N，N-吡咯。
20.權(quán)利要求17的方法，其中n是1-10的整數(shù)，R1和R2中至少之一是H。
21.權(quán)利要求17的方法，其中A和B片斷位于末端位置，片斷C包含至多5個(gè)氨基酸。
22.權(quán)利要求17的方法，其中至少一個(gè)表面包含覆蓋有效量的melimine、protattin及它們混合物。
23.權(quán)利要求17的方法，其中生物醫(yī)學(xué)裝置是接觸透鏡。
24.權(quán)利要求23的方法，還包括將至少一個(gè)表面與偶聯(lián)有效量的偶聯(lián)劑接觸的步驟。
25.權(quán)利要求22的方法，其中所述melimine包含L-melimine。
26.權(quán)利要求17的方法，還包括將所述合成抗微生物肽結(jié)合至所述裝置的步驟。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述結(jié)合步驟是通過將所述裝置中的反應(yīng)活性基團(tuán)與所述合成抗微生物肽中的反應(yīng)活性基團(tuán)直接反應(yīng)，或?qū)⑺鲅b置和合成抗微生物肽與偶聯(lián)劑反應(yīng)來進(jìn)行的。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述結(jié)合步驟是通過與至少一種偶聯(lián)劑反應(yīng)來進(jìn)行的，所述至少一種偶聯(lián)劑選自N，N′-羰基二咪唑、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺、雙環(huán)己基碳二亞胺、1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉代乙基)碳二亞胺、二異丙基碳二亞胺和它們的混合物以及N-羥基琥珀酰亞胺酯、亞氨酸酯、二氟苯衍生物、溴官能化醛、雙環(huán)氧化物以及它們的混合物。
29.權(quán)利要求26的方法，還包括將至少一種潛在反應(yīng)活性組分引入形成所述裝置的反應(yīng)混合物的步驟。
30.一種方法，包括形成一種反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含透鏡形成組分以及至少一種包含丙烯酰基或異丁烯?；暮铣煽刮⑸镫模酆纤龇磻?yīng)混合物以形成一種生物醫(yī)學(xué)裝置。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述裝置選自導(dǎo)管、植入物、支架、流體收集袋、傳感器、水凝膠繃帶、輸液管、抗生素載體、診斷和治療劑和眼科裝置。
32.權(quán)利要求30的方法，其中生物醫(yī)學(xué)裝置是一種眼科裝置。
33.權(quán)利要求30的方法，其中所述裝置是接觸透鏡。
全文摘要
本發(fā)明提供了具有抗微生物涂層的生物醫(yī)學(xué)裝置。所述裝置一個(gè)或多個(gè)表面上覆蓋了陽(yáng)離子肽、陽(yáng)離子蛋白質(zhì)或它們的混合物以賦予所述表面抗微生物特性。
文檔編號(hào)A61L31/16GK1751251SQ200380109847
公開日2006年3月22日 申請(qǐng)日期2003年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月19日
發(fā)明者M·維爾科克斯, E·休姆, N·科爾, Y·阿利瓦加, D·扎尼尼 申請(qǐng)人:莊臣及莊臣視力保護(hù)公司