專利名稱：預(yù)防和治療疾病的免疫原性組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種預(yù)防和治療疾病的免疫原性組合物及其制備方法，另外還涉及該預(yù)防和治療疾病的免疫原性組合物的用途。
背景技術(shù)：
目前針對(duì)于惡性腫瘤、傳染性疾病、自身免疫病、過敏性疾病、器官移植排斥等疾病的治療尚無特效藥物，多應(yīng)用抗癌藥物、抗病毒藥物、免疫抑制劑等對(duì)上述疾病進(jìn)行對(duì)癥治療，在臨床使用過程中，上述藥物常產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用以及過敏反應(yīng)，并很容易產(chǎn)生耐藥性，給臨床有效治療上述疾病帶來了一定的困難。近年來，對(duì)上述疾病治療藥物的研究重點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)移到生物技術(shù)藥物領(lǐng)域。
特異性抗體的制備對(duì)相關(guān)疾病的診斷、治療和預(yù)防具有重要意義，因而受到國(guó)內(nèi)外生物醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注，已開展了大量的工作并取得了較大的進(jìn)展。在現(xiàn)有技術(shù)中多采用單克隆抗體應(yīng)用于疾病的診斷和生物治療，其中單克隆抗體的制備方法一般包括獲取疾病相關(guān)抗原、免疫小鼠和融合雜交瘤三個(gè)步驟，亦即a)首先利用生化和免疫化學(xué)的方法獲取攜帶有疾病相關(guān)信息的抗原，b)然后將該疾病相關(guān)抗原多次重復(fù)注射入小鼠體內(nèi)，待小鼠發(fā)生特異性免疫反應(yīng)一定時(shí)間后，取出其脾臟并分離出帶有疾病相關(guān)抗原信息的致敏淋巴細(xì)胞，再將該致敏淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合成雜交瘤細(xì)胞，再篩選出針對(duì)于疾病相關(guān)抗原的陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增或接種于小鼠腹腔內(nèi)，即可從培養(yǎng)上清液或小鼠腹水中獲得所需的單克隆抗體。
單克隆抗體作為治療劑的研究也于近年獲得重要進(jìn)展。單抗藥物(monoclonal antibody agents)可應(yīng)用于治療腫瘤、病毒性感染、心血管病以及其它疾患，尤其是用于傳染性疾病的治療，已顯示出良好的應(yīng)用前景。
抗體藥物一般包括兩類，一是抗病原體單克隆抗體(簡(jiǎn)稱單抗)或多克隆抗體(簡(jiǎn)稱多抗)；二是抗病原體單抗或多抗偶聯(lián)物，或稱免疫偶聯(lián)物(immunoconjugate)。免疫偶聯(lián)物分子由單抗或多抗與“彈頭”藥物兩部分構(gòu)成，故稱為導(dǎo)向藥物，又稱為生物導(dǎo)彈或“魔彈”(magic bullets)，與之相對(duì)應(yīng)的治療方法稱為導(dǎo)向治療。單抗或多抗所針對(duì)的靶標(biāo)通常為病原體表面的相關(guān)抗原或特定的受體。用作“彈頭”的物質(zhì)主要有三類，即放射性核素、藥物和毒素，其與單抗或多抗連接分別構(gòu)成放射免疫偶聯(lián)物、化學(xué)免疫偶聯(lián)物和免疫毒素。自80年代以來，對(duì)抗病原體尤其是抗腫瘤單抗藥物進(jìn)行了大量研究，特別是自1997年以來，Rituxan、Herceptin在美國(guó)相繼獲批準(zhǔn)用于臨床腫瘤治療，單抗藥物的研究與開發(fā)有了新的發(fā)展勢(shì)頭，成為生物技術(shù)藥物的新熱點(diǎn)(甄永蘇，單克隆抗體藥物治療腫瘤的研究現(xiàn)狀與展望，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，229-12)。
盡管單抗藥物的臨床研究結(jié)果已為其應(yīng)用于治療腫瘤展示出良好的前景，但仍有許多問題需要進(jìn)一步研究解決(Nguyen DT，Amess JA，Doughty H，et al.IDEC-C2B8 anti-CD20(rituxmab)immunotherapy in patients with low-grade non-Hodgkin′s lymphoma and lymphoproli ferative disordersevaluation of response on 48 patients.Eur J Haematol，1999，6276-82)。單抗藥物存在的問題主要涉及免疫學(xué)和藥理學(xué)兩方面。免疫學(xué)方面的問題關(guān)鍵是人抗鼠Ig抗體(HAMA)反應(yīng)，因?yàn)槎嗄陙碛糜谂R床研究的單抗藥物多數(shù)使用小鼠單抗制備，往往導(dǎo)致HAMA反應(yīng)。此外，病原體在抗原性方面的異質(zhì)性，病原體的抗原性調(diào)變等也能影響單抗藥物的療效。藥理學(xué)方面的問題主要是到達(dá)病原體的藥量不足。單抗藥物在體內(nèi)運(yùn)送過程中受多種因素影響。由于它是異體蛋白，會(huì)被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取，有相當(dāng)數(shù)量將積聚于肝、脾和骨髓；再者就是機(jī)體對(duì)該異體蛋白產(chǎn)生抗體而降低其效力。單抗藥物是大分子物質(zhì)，通過毛細(xì)血管內(nèi)皮層以及穿透病變部位均受到限制。(甄永蘇，單克隆抗體藥物治療腫瘤的研究現(xiàn)狀與展望，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，229-12)。
疾病的免疫治療是利用病原體免疫原進(jìn)行主動(dòng)免疫來激發(fā)、增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病原體的主動(dòng)特異性免疫反應(yīng)。目前所研究的病原體疫苗主要是基因工程疫苗、肽疫苗、核酸疫苗、抗獨(dú)特型抗體疫苗。其中a)病原體基因工程疫苗是通過基因重組技術(shù)，將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞而制備的疫苗。b)肽疫苗是基于在免疫反應(yīng)中抗原在胞漿內(nèi)降解為短肽，最后形成肽-MHC-TCR復(fù)合體最終激發(fā)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)。c)核酸疫苗是由編碼能引起保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原基因片段和載體構(gòu)建而成的，包括DNA疫苗和RNA疫苗，目前研究較多的為DNA疫苗。核酸疫苗能夠同時(shí)刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)許多亞單位疫苗不能誘導(dǎo)的CTL效應(yīng)。d)抗獨(dú)特型抗體疫苗(Ab2疫苗)是根據(jù)抗獨(dú)特型抗體具有模擬抗原及免疫調(diào)節(jié)的雙重作用，同時(shí)能克服機(jī)體免疫抑制，打破免疫耐受故能代替病原體抗原誘發(fā)特異性主動(dòng)免疫反應(yīng)(Bhattacharya CM，Mukerjee S，biddle W，et al.Murine monoclonalanti-idiotype antibldy as a potential netword antigen for human carcinoembryonic antigen.J Immumol，1990，1452758.)。
在上述病原體疫苗免疫治療方法中，由于病原體抗原的抗原性強(qiáng)弱不同，且病原體宿主經(jīng)常處于免疫抑制狀態(tài)，難以激發(fā)有效的抗病原體反應(yīng)。盡管抗獨(dú)特型抗體的研究已取得許多進(jìn)展，但事物總是兩方面的。Ab2疫苗應(yīng)用存在許多困難，因?yàn)榭躬?dú)特型抗體β(Ab2β)雖能模擬小分子多肽抗原，卻難以精確反映大分子蛋白質(zhì)抗原的決定簇，尤其是Ab2β單抗。再者由于病原體抗原極其復(fù)雜，常發(fā)生調(diào)變等，制備廣譜的病原體特異性獨(dú)特型疫苗難度很大。更重要的是目前使用的Ab2β主要來自鼠雜交瘤細(xì)胞，為異種蛋白，能激發(fā)人免疫系統(tǒng)產(chǎn)生人抗鼠Ig抗體(HAMA)，發(fā)生中和反應(yīng)并產(chǎn)生毒性免疫復(fù)合物，而降低療效，嚴(yán)重時(shí)可引起血清病反應(yīng)。
禽類尤其是雞在系統(tǒng)發(fā)育上與哺乳動(dòng)物有很大差異，雞的免疫球蛋白與哺乳動(dòng)物免疫球蛋白在免疫學(xué)特性上也有很大不同。雞的免疫系統(tǒng)能識(shí)別更多的免疫反應(yīng)位點(diǎn)和更多的抗原決定簇，因此雞免疫系統(tǒng)對(duì)哺乳動(dòng)物的蛋白或生物分子能產(chǎn)生具有更高效價(jià)和親和力的特異性抗體。雞免疫系統(tǒng)針對(duì)于外源性蛋白所產(chǎn)生的IgY不僅具有更高的免疫特異性，更重要的是這種特異性IgY主要儲(chǔ)存在雞蛋黃中，因此可利用下蛋母雞作為免疫反應(yīng)器來大量生產(chǎn)具有重要臨床應(yīng)用價(jià)值的抗體藥物。
眾所周知雞蛋作為人類的常用食品和化妝品原料，無論內(nèi)服和外用均對(duì)人體無任何生物毒性和不良作用。因此，利用禽類作為免疫反應(yīng)器來大量生產(chǎn)抗體藥物，并應(yīng)用于疾病的診斷和免疫治療，將具有極廣闊的應(yīng)用前景。以疾病特異性蛋黃抗體IgY為原料制備的免疫藥物和抗獨(dú)特型抗體疫苗(Ab2疫苗)可以很好地解決上述單抗偶聯(lián)物或上述病原體疫苗所存在的HAMA反應(yīng)和異質(zhì)性問題。
授權(quán)中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?3112409.3公開了“一種新型免疫原性復(fù)合物制劑及制備方法”，本發(fā)明由抗原與抗體組建，抗原量多于抗體量，利用抗原抗體復(fù)合物為載體，攜帶抗原，改變抗原提呈形式，增強(qiáng)機(jī)體免疫性。本發(fā)明采用血源純化乙肝表面抗原，很難避免其潛在的感染性。況且該復(fù)合物是一種抗原抗體復(fù)合物，而不是抗原、抗體、抗獨(dú)特性抗體和重組DNA復(fù)合物。
授權(quán)中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?7106291.9公開了“抗原-抗體-重組DNA復(fù)合型疫苗”，本發(fā)明由微生物抗原-抗體與帶有編碼微生物的一種或幾種基因的重組質(zhì)粒DNA制備成復(fù)合型疫苗，通過誘生對(duì)微生物感染處于免疫應(yīng)答低下或免疫耐受者產(chǎn)生應(yīng)答，可顯著提高機(jī)體的特異性體液免疫與細(xì)胞免疫，具有抗原提呈形式多，誘生免疫應(yīng)答速度快，而且用量少，穩(wěn)定性高等特點(diǎn)。本發(fā)明采用基因重組乙肝表面抗原和抗體，再加入乙肝DNA重組質(zhì)粒。該方法需要基因工程技術(shù)，技術(shù)工藝周期長(zhǎng)，難度大，況且該復(fù)合物是一種抗原-抗體-重組DNA復(fù)合物，而不是抗原、抗體、抗獨(dú)特性抗體和重組DNA復(fù)合物。
中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?2113744.7公開了“抗禽類病毒性疫病的復(fù)合卵黃抗體及其制備和應(yīng)用”，是由蛋黃抗腸毒素免疫球蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、溶菌酶和余量的水分、灰分及微量元素組成的蛋白復(fù)合物，而不是抗原、抗體、抗獨(dú)特性抗體和重組DNA復(fù)合物。
中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0125941.5公開了“蛋黃免疫活性蛋白復(fù)合物”，是由具有抗體活性的抗禽流感、新城疫的雞卵黃抗體(抗-ANIgY)組成的抗體復(fù)合物，也不是抗原、抗體、抗獨(dú)特性抗體和重組DNA復(fù)合物。
在現(xiàn)有技術(shù)中，單克隆抗體藥物和疫苗為兩大類相互獨(dú)立的免疫藥物，其中單克隆抗體藥物用于免疫治療，疫苗用于免疫預(yù)防。臨床通常是分別單獨(dú)使用，其中疫苗用于未病先預(yù)防，而單克隆抗體藥物則主要施用于已病患者，但是，在臨床上很難及時(shí)判斷出就診者是未發(fā)病還是已發(fā)病，當(dāng)就診者處于觀察期或疾病處于窗口期時(shí)，是施用疫苗還是施用抗體藥物就變得非常難把握，假如對(duì)未病者施用抗體藥物，不但會(huì)造成浪費(fèi)而且又不能起到預(yù)防的目的；如果對(duì)已病者施用疫苗，不但達(dá)不到預(yù)防的目的而又失去了早期治療的機(jī)會(huì)，因此臨床急需一種能夠真正實(shí)現(xiàn)有病治病未病預(yù)防的復(fù)合型抗體藥物。另外，對(duì)于減毒或滅活病原體疫苗的使用，還會(huì)給患者帶來潛在感染的隱患，再者就是基因重組亞單位疫苗所存在的的免疫作用不完全等問題。因此研制開發(fā)一種既能治病又能防病、安全高效的治療性疫苗已成為生物技術(shù)領(lǐng)域的重大課題。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種預(yù)防和治療疾病的免疫原性組合物，主要是由有效量的抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體、重組DNA和藥用敷料組成。以達(dá)到既能治病又能防病的目的。該預(yù)防和治療疾病的免疫原性組合物用于作為疾病生物預(yù)防和治療劑，能顯著增強(qiáng)機(jī)體對(duì)疾病相關(guān)病原體的特異性體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，且療效確切、快速和全面，適用于作為人類腫瘤、傳染性疾病、自身免疫病、過敏性疾病和器官移植排斥的治療性疫苗以及食品、保健品添加劑；也適用于作為畜禽傳染病的治療性疫苗和畜禽飼料添加劑。
本發(fā)明的另一目的還在于預(yù)防和治療疾病的免疫原性組合物的制備方法。
本發(fā)明的另一目的還在于預(yù)防和治療疾病的免疫原性組合物的用途。
技術(shù)方案本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的一種預(yù)防和治療疾病的免疫原性組合物，主要是由抗原、抗體和重組DNA組成，其特征在于由有效量的抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體、重組DNA和藥用敷料組成，其中抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體是純化或重組的特異性抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體，重組DNA是能夠表達(dá)所述特異性抗原、抗體和抗獨(dú)特型抗體中的任一種或其多種的重組DNA質(zhì)粒。
根據(jù)本發(fā)明，其特征還在于在該免疫原性組合物中各組分重量比分別為抗原 0.001～99％抗體 0.001～99％抗獨(dú)特型抗體 0.001～99％重組DNA0.01～99％藥用敷料 0.01～99％其中以預(yù)防為目的者，抗原+抗獨(dú)特型抗體+重組DNA的量(w/w)＞抗體的量；以治療為目的者，抗體的量(w/w)＞抗原+抗獨(dú)特型抗體+重組DNA的量；以預(yù)防性治療或早期治療為目的者，抗體的量(w/w)＝抗原+抗獨(dú)特型抗體+重組DNA的量。
根據(jù)本發(fā)明，其特征還在于在該免疫原性組合物中還含有特異性抗原(Ag)、抗體(Ab)和抗獨(dú)特型抗體(Ab2)特異性結(jié)合后所形成的免疫復(fù)合物；所述抗獨(dú)特型抗體包括抗獨(dú)特型抗體α(Ab2α)、抗獨(dú)特型抗體β(Ab2β)、抗獨(dú)特型抗體γ(Ab2γ)、抗獨(dú)特型抗體ε(Ab2ε)中的任一種或其組合；所述免疫復(fù)合物包括抗原-抗體復(fù)合物(Ag-Ab)、抗原-抗體-抗獨(dú)特型抗體復(fù)合物(Ag-Ab-Ab2α、Ag-Ab-Ab2β、Ag-Ab-Ab2γ、Ag-Ab-Ab2ε)和抗體-抗獨(dú)特型抗體復(fù)合物(Ab-Ab2α、Ab-Ab2β、Ab-Ab2γAb-Ab2ε)中的任一種或其組合。
根據(jù)本發(fā)明，其特征還在于所述特異性抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體和重組DNA是分別針對(duì)于同一種或同一類疾病相應(yīng)免疫原的動(dòng)物源性或人源性特異性抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體和重組DNA。
根據(jù)本發(fā)明，其特征還在于所述抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體和重組DNA是分別針對(duì)于純化或重組的腫瘤免疫原、傳染性疾病病原體免疫原、自身免疫病免疫原、過敏性疾病免疫原、移植器官免疫原和畜禽傳染病病原體免疫原的動(dòng)物源性或人源性抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體和重組DNA；上述腫瘤免疫原包括純化或滅活的腫瘤抗原或細(xì)胞、通過基因工程技術(shù)重組的腫瘤特異性抗原、多肽或疫苗瘤苗、腫瘤特異性DNA或mRNA及其與相應(yīng)載體組成的重組體、針對(duì)于腫瘤特異性抗原的單克隆或多克隆抗體、針對(duì)于腫瘤特異性抗體的抗獨(dú)特性抗體；以及上述腫瘤免疫原的納米微?；蛑|(zhì)體復(fù)合物；上述傳染性疾病病原體免疫原包括純化或滅活的病原體、純化或重組的病原體抗原、多肽或疫苗、病原體特異性DNA或mRNA及其與相應(yīng)載體組成的重組體、針對(duì)于病原體特異性抗原的單克隆或多克隆抗體、針對(duì)于傳染性疾病病原體特異性抗體的抗獨(dú)特性抗體；以及上述傳染性疾病病原體免疫原的納米微粒或脂質(zhì)體復(fù)合物；上述過敏性疾病免疫原包括純化或重組的變應(yīng)原、多肽、變應(yīng)原特異性DNA或mRNA及其與相應(yīng)載體組成的重組體、針對(duì)于變應(yīng)原的單克隆或多克隆抗體、針對(duì)于變應(yīng)原特異性抗體的抗獨(dú)特性抗體；以及上述過敏性疾病免疫原的納米微?；蛑|(zhì)體復(fù)合物；上述自身免疫病免疫原包括純化或重組抗原、多肽、自身抗原或疫苗、細(xì)胞因子靶向抗原、自身免疫病特異性DNA或mRNA及其與相應(yīng)載體組成的重組體、針對(duì)于自身免疫病特異性抗原和細(xì)胞因子靶向抗原的單克隆或多克隆抗體、針對(duì)于自身抗原和細(xì)胞因子靶向抗原特異性抗體的抗獨(dú)特性抗體；以及上述自身免疫病免疫原的納米微?；蛑|(zhì)體復(fù)合物；所述細(xì)胞因子靶向抗原包括人類白細(xì)胞分化抗原CD、粘附分子、補(bǔ)體、細(xì)胞因子及其受體、免疫球蛋白超家族；所述細(xì)胞因子及其受體包括白細(xì)胞介素(IL)及其受體、集落刺激因子(CSF)及其受體、腫瘤壞死因子(TNF)及其受體、趨化因子及其受體；上述移植器官免疫原包括移植器官供體或移植器官受體的純化或重組抗原、多肽、自身抗原或疫苗、細(xì)胞因子靶向抗原、自身免疫病特異性DNA或mRNA及其與相應(yīng)載體組成的重組體、針對(duì)于自身免疫病特異性抗原和細(xì)胞因子靶向抗原的單克隆或多克隆抗體、針對(duì)于自身抗原和細(xì)胞因子靶向抗原特異性抗體的抗獨(dú)特性抗體；以及上述自身免疫病免疫原的納米微?；蛑|(zhì)體復(fù)合物； 所述細(xì)胞因子靶向抗原包括人類白細(xì)胞分化抗原CD、粘附分子、補(bǔ)體、細(xì)胞因子及其受體、免疫球蛋白超家族；所述細(xì)胞因子及其受體包括白細(xì)胞介素(IL)及其受體、集落刺激因子(CSF)及其受體、腫瘤壞死因子(TNF)及其受體、趨化因子及其受體；上述畜禽傳染病病原體免疫原包括純化或滅活的病原體、純化或重組的病原體抗原、多肽或疫苗、病原體特異性DNA或mRNA及其與相應(yīng)載體組成的重組體、針對(duì)于病原體特異性抗原的單克隆或多克隆抗體、針對(duì)于畜禽傳染病病原特異性抗體的抗獨(dú)特性抗體；以及上述畜禽傳染病病原體免疫原的納米微?；蛑|(zhì)體復(fù)合物；上述抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體是通過分離、純化和基因工程技術(shù)包括噬菌體展示多肽、細(xì)菌表面展示多肽和人工合成多肽中的任一種或其組合途徑獲得的；
根據(jù)本發(fā)明，其特征還在于所述的疾病特異性抗獨(dú)特型抗體(Ab2)是針對(duì)于上述疾病免疫原所對(duì)應(yīng)的特異性抗體(Ab)包括蛋黃抗體IgY的抗獨(dú)特型抗體(Ab2)；所述抗獨(dú)特型抗體(Ab2)包括抗獨(dú)特型抗體α(Ab2α)、抗獨(dú)特型抗體β(Ab2β)、抗獨(dú)特型抗體γ(Ab2γ)和抗獨(dú)特型抗體ε(Ab2ε)中的任一種或其組合。
所述抗獨(dú)特型抗體(Ab2)是針對(duì)于外來抗原的抗體分子(Ab1)可變區(qū)上獨(dú)特型(Id)可刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗Id抗體(Ab2)。其中Ab2α屬半抗原非抑制性Ab2，具有調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)或抑制Ab1克?。籄b2β具有與外來抗原相似的氨基酸排列順序或空間構(gòu)型，它能夠在體內(nèi)模擬始動(dòng)抗原的作用，故被認(rèn)為是外部抗原在機(jī)體免疫系統(tǒng)中的“內(nèi)影像”(internal image)，可抑制Ab1與相應(yīng)抗原的結(jié)合反應(yīng)；Ab2γ屬半抗原非抑制性Ab2，能抑制抗原與Ab1的結(jié)合，具有調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)或抑制帶有相應(yīng)Id克隆細(xì)胞增殖；Ab2ε是一種雙特異性抗體，又稱Epibody，能識(shí)別Ab1骨架區(qū)上的抗原決定簇，同時(shí)又能識(shí)別自身或外來抗原上的表位，更有利于上述疾病的免疫治療。
具有內(nèi)影像特點(diǎn)的抗獨(dú)特型抗體能模擬病原體相關(guān)抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生主動(dòng)免疫應(yīng)答，其應(yīng)答過程極其復(fù)雜，但主要涉及體液免疫和細(xì)胞免疫兩方面。Ab2β作為胸腺依賴抗原(TD)激活輔助T淋巴細(xì)胞亞群(Th1和Th2)，分泌一系列細(xì)胞因子，如Th1細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-γ(INF-γ)、IL-10、TNF和白細(xì)胞介素-2(IL-2)；Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等。Th2細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子影響和促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分化和增殖，產(chǎn)生特異性抗體Ab3，Ab3一部分能與Ab1互相模擬，即具有與抗原結(jié)合性，稱之為抗病原體抗體(Ab1′)?？侫b3的產(chǎn)生已被證實(shí)與微小病原體病灶消退和/或病人病情好轉(zhuǎn)呈正相關(guān)。被激活的Th1細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，如INF-γ可通過影響NK細(xì)胞及T細(xì)胞功能而發(fā)揮抗病原體效應(yīng)，IL-2可促進(jìn)T細(xì)胞生長(zhǎng)、克隆性擴(kuò)增而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，亦可誘導(dǎo)或促進(jìn)多種細(xì)胞毒性細(xì)胞活性，如自然殺傷細(xì)胞(NK)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)、淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)及腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)等，發(fā)揮免疫監(jiān)視及抗病原體效應(yīng)。同時(shí)IL-2還可協(xié)同刺激B細(xì)胞增殖及分泌抗體，與補(bǔ)體及效應(yīng)細(xì)胞相作用，發(fā)揮抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)及補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)抗病原體作用(龔非力等，醫(yī)學(xué)免疫學(xué)，第二版，武漢科學(xué)出版社，2000)。
人體內(nèi)免疫系統(tǒng)是一個(gè)處于自身動(dòng)態(tài)平衡中的系統(tǒng)。在患者體內(nèi)的免疫系統(tǒng)中，抗獨(dú)特型抗體是一個(gè)較關(guān)鍵的系統(tǒng)要素，用人為的方法改變抗獨(dú)特型抗體的質(zhì)量和數(shù)量，必然會(huì)使系統(tǒng)發(fā)生變化，從而在更高的層次上達(dá)到新的平衡。使對(duì)病原體免疫的系統(tǒng)平衡按照理論上預(yù)測(cè)的有利于患者的方向發(fā)展變化，在某種意義上這正是抗獨(dú)特型抗體應(yīng)用的關(guān)鍵所在。
核酸疫苗主要是DNA疫苗可以引發(fā)全面的免疫應(yīng)答反應(yīng)。一方面，核酸疫苗導(dǎo)入宿主體內(nèi)后，被抗原提呈細(xì)胞(APC)攝取，表達(dá)的蛋白質(zhì)被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體復(fù)合物降解為8～10個(gè)氨基酸多肽，多肽被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔上的抗原轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TAP)運(yùn)送進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在那里與MHC-I類分子及β2-微球蛋白形成三聚體，三聚體移出細(xì)胞并定位在細(xì)胞膜上，從而誘導(dǎo)MHC-I限制的抗原特異性的CTL，產(chǎn)生細(xì)胞免疫；另一方面，胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)通過分泌或細(xì)胞裂解釋放入血，并被專職APC內(nèi)吞，在其中被降解為12～18個(gè)氨基酸的多肽，與此同時(shí)，胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的MHC-II類分子(含α，β，γ三鏈)也被高爾基體運(yùn)至內(nèi)體，在體內(nèi)，γ鏈被降解，剩余的MHC-II類分子的α，β鏈與抗原肽結(jié)合成抗原肽-II類分子復(fù)合物而提呈于APC表面，成為CD4+Th細(xì)胞免疫監(jiān)視的靶位，Th細(xì)胞分泌淋巴因子，刺激B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生抗體，誘導(dǎo)了抗原特異性的體液免疫應(yīng)答。
根據(jù)本發(fā)明，其特征還在于所述疾病相應(yīng)免疫原包括腫瘤、傳染性疾病、自身免疫病、過敏性疾病、移植器官特異性的純化或重組抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體、重組DNA、細(xì)胞因子及其受體和組織細(xì)胞中的任一種或其任一組合；所述免疫原是蛋白質(zhì)、多肽、粘多糖、脂多糖、糖蛋白、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞表面受體、核蛋白、DNA、RNA、線粒體、微粒體中的任一種或其組合。
根據(jù)本發(fā)明，其特征還在于所述的疾病相應(yīng)免疫原包括畜禽傳染病病原體特異性純化或重組抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體、重組DNA、細(xì)胞因子及其受體和組織細(xì)胞中的任一種或其組合；所述免疫原是蛋白質(zhì)、多肽、粘多糖、脂多糖、糖蛋白、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞表面受體、核蛋白、DNA、RNA、線粒體、微粒體中的任一種或其組合。
根據(jù)本發(fā)明，其特征還在于在該組合物中還含有藥用輔料；所述藥用輔料包括包衣材料、蛋白穩(wěn)定劑、藥用佐劑、免疫增強(qiáng)劑，其中包衣材料為丙烯酸樹脂、羥丙基甲基纖維素及其衍生物中的任一種或其組合；蛋白穩(wěn)定劑為聚乙二醇、蔗糖、海藻糖中的任一種或其組合；藥用佐劑為氫氧化鋁、表面活性劑、弗氏(Freund)佐劑中的任一種；免疫增強(qiáng)劑為多聚糖、糖肽、糖脂和磷脂中的任一種或其組合，其中脂類包括三棕櫚酰絲氨酰甘油基半胱氨酸(P3CSS)、單棕櫚脂酸、雙棕櫚脂酸、三棕櫚脂酸、棕櫚酰賴氨酸、α-氨基十六烷酸(Had、含線性飽和脂性側(cè)鏈)、月桂酰肽脂中的任一種或其組合；上述脂類是以分子內(nèi)佐劑的形式與所述本發(fā)明中的抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體和重組DNA結(jié)合成復(fù)合物。
根據(jù)本發(fā)明，其特征還在于所述預(yù)防和治療疾病的免疫原性組合物包括腫瘤特異性免疫原性組合物、傳染性疾病病原體特異性免疫原性組合物、自身免疫病特異性免疫原性組合物、過敏性疾病變應(yīng)原特異性免疫原性組合物、移植器官特異性免疫原性組合物中的任一種或其組合。
上述腫瘤特異性免疫原包括甲胎蛋白AFP、癌胚抗原CEA、絨毛膜促性腺激素HCG、前列腺特異性抗原PSA、卵巢腫瘤相關(guān)癌抗原CA125、癌抗原CA15-3、糖鏈抗原CA19-9、鱗狀細(xì)胞癌抗原SCC、組織多肽抗原TPA的純化或重組抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體及其重組DNA中的任一種；所述腫瘤特異性免疫原性組合物包括上述腫瘤抗原的特異性免疫原性組合物，其中癌胚抗原CEA特異性免疫原性組合物是由癌胚抗原CEA、癌胚抗原蛋黃抗體CEA-IgY、CEA-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體、癌胚抗原CEA重組DNA質(zhì)粒和藥用輔料組成，其中各組分重量比分別為CEA抗原 0.01～99％CEA-IgY抗體 0.01～99％CEA-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體 0.01～99％CEA重組DNA質(zhì)粒0.1～99％藥用敷料 0.1～99％上述傳染性疾病特異性免疫原包括艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、結(jié)核、幽門螺桿菌性胃炎、梅毒、淋病等性傳播性疾病、病毒性腸炎、病毒性肺炎、病毒性腦炎、支原體、衣原體肺炎、斑疹傷寒、皰疹、風(fēng)疹、流感及寄生蟲感染性疾病病原體的純化或重組抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體及其重組DNA中的任一種；所述傳染性疾病病原體特異性免疫原性組合物包括上述疾病的病原體特異性免疫原性組合物，其中乙型肝炎病毒特異性免疫原性組合物是由乙肝表面抗原HBsAg、乙肝表面抗原特異性蛋黃抗體IgY、乙肝表面抗體特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體、乙肝表面抗原重組DNA質(zhì)粒和藥用輔料組成，其中各組分重量比分別為乙肝表面抗原HBsAg 0.01～99％乙肝表面抗原特異性蛋黃抗體IgY 0.01～99％乙肝表面抗體特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體0.01～99％乙肝表面抗原重組DNA質(zhì)粒 0.1～99％藥用敷料 0.1～99％上述自身免疫病特異性免疫原包括多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、混合結(jié)締組織病、胰島素依賴性糖尿病、自身免疫性溶血性貧血、甲狀腺功能亢進(jìn)癥、橋本甲狀腺炎、干燥綜合征疾病相關(guān)因子的純化或重組抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體及其重組DNA中的任一種；所述自身免疫病特異性免疫原性組合物包括上述疾病的特異性免疫原性組合物，其中類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的免疫原性組合物是由B淋巴細(xì)胞表面抗原CD20、CD20-IgY、CD20-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體、CD20重組DNA質(zhì)粒和藥用輔料組成，其中各組分重量比分別為CD20抗原 0.01～99％CD20-IgY抗體 0.01～99％
CD20-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體0.01～99％CD20重組DNA質(zhì)粒 0.1～99％藥用敷料 0.1～99％上述過敏性疾病變應(yīng)原特異性免疫原性組合物包括變應(yīng)性鼻炎、過敏性哮喘、特應(yīng)性皮炎、過敏性結(jié)膜炎、過敏性胃腸炎的變應(yīng)原純化或重組抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體及其重組DNA中的任一種；所述過敏性疾病變應(yīng)原特異性免疫原性組合物包括上述疾病的變應(yīng)原特異性免疫原性組合物，其中變應(yīng)性鼻炎免疫原性組合物是由變應(yīng)原塵螨抗原、螨抗體-IgY、螨抗體-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體、螨抗原重組DNA質(zhì)粒和藥用輔料組成，其中各組分重量比分別為螨抗原0.01～99％螨抗體-IgY0.01～99％螨抗體-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體 0.01～99％螨抗原重組DNA質(zhì)粒 0.1～99％藥用敷料 0.1～99％上述移植器官特異性免疫原性組合物包括腎移植、肝移植、心臟移植、胰腺移植、骨髓移植、干細(xì)胞移植中排斥反應(yīng)因子的純化或重組抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體及其重組DNA中的任一種；所述移植器官特異性免疫原性組合物包括上述器官移植排斥反應(yīng)因子特異性免疫原性組合物，其中腎移植特異性免疫原性組合物是由CD154、CD154-IgY、CD154-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體、CD154重組DNA質(zhì)粒和藥用輔料組成，其中各組分重量比分別為CD154抗原 0.01～99％CD154-IgY抗體 0.01～99％CD154-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體 0.01～99％CD154重組DNA質(zhì)粒 0.1～99％藥用敷料 0.1～99％根據(jù)本發(fā)明，其特征還在于所述預(yù)防和治療疾病的免疫原性組合物包括畜禽傳染病病原體特異性免疫原性組合物。
上述畜禽傳染病特異性免疫原包括口蹄疫、瘋牛病、牛瘟、狂犬病、雞新城疫、雞傳染性法氏囊病、禽流感、雞減蛋綜合征、雞馬立克氏病、雞傳染性鼻炎、雞支原體病、雞傳染性喉氣管炎、雞霍亂、雞傷寒、鴨瘟、小鵝瘟、豬瘟、豬紅斑丹毒絲菌感染、豬傳染性胃腸炎、豬囊蟲病、豬肺疫、馬傳染性貧血病、兔瘟、羊脫毛綜合征、魚類暴發(fā)性出血病的病原體純化或重組抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體及其重組DNA中的任一種；所述畜禽傳染病特異性免疫原性組合物包括上述疾病的病原體特異性免疫原性組合物，其中雞新城疫病毒免疫原性組合物是由雞新城疫病毒NDV抗原、NDV-IgY抗體、NDV-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體、NDV抗原重組DNA質(zhì)粒和藥用輔料組成，其中各組分重量比分別為NDV抗原 0.01～99％NDV-IgY抗體 0.01～99％NDV-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體 0.01～99％NDV抗原重組DNA質(zhì)粒0.1～99％藥用敷料 0.1～99％根據(jù)本發(fā)明，其特征還在于在上述免疫原性組合物中還含有免疫偶聯(lián)物；所述免疫偶聯(lián)物包括上述疾病病原體特異性抗體與放射性核素、藥物和毒素以及細(xì)胞因子的偶聯(lián)物中的任一種或其組合其中所述放射性核素包括碘131I、磷32P、鍶89Sr、釔90Y、釤153Sm、錸188Re中的任一種或其組合；所述藥物包括抗癌藥物、抗病毒藥物、抗菌素、免疫調(diào)節(jié)藥物和免疫抑制劑中的任一種或其組合；所述毒素包括包括篦麻籽毒素(RT)、相思子毒素(abrin)、苦瓜毒素(MD)、氧化苦參堿(OXY)、去甲斑蝥素、白喉毒素(DT)、假單胞菌內(nèi)毒素以及綠膿桿菌外毒素(PE)中的任一種或其組合所述細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素、集落刺激因子(CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)、趨化因子中的任一種或其組合；從而使所述免疫原性組合物具有導(dǎo)向或靶向作用。
根據(jù)本發(fā)明，其特征還在于所述的免疫原性組合物是其納米微?；蛑|(zhì)體復(fù)合物。
根據(jù)本發(fā)明，其特征還在于所述免疫原性組合物是任一種藥劑學(xué)上所述的劑型；所述劑型包括注射劑、膠囊、口服液、氣霧劑、貼劑中的任一種劑型。
一種預(yù)防和治療疾病的免疫原性組合物的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)采用蛋白質(zhì)鹽析、柱層析純化疾病特異性抗原或通過基因重組的辦法制備疾病病原體特異性抗原；所述疾病病原體特異性抗原包括人類腫瘤、傳染性疾病、自身免疫病、過敏性疾病、器官移植排斥及畜禽傳染病病原體的純化或重組特異性抗原；即得到該免疫原性組合物組分之一抗原(Ag)；2)通過免疫動(dòng)物制備針對(duì)于上述抗原的單克隆或多克隆抗體；或通過基因重組的辦法制備上述疾病相關(guān)病原體抗原的特異性抗體；即得到該免疫原性組合物組分之一抗體(Ab)；3)以步驟1)制備的疾病相關(guān)病原體特異性抗原為免疫原，多次重復(fù)免疫注射給禽類優(yōu)選是雞，待5-20天后禽類尤其是雞的產(chǎn)蛋中即含有針對(duì)于上述疾病相關(guān)病原體特異性免疫原的蛋黃抗體IgY；所述的免疫原注射量為1-2ml，免疫原量10-500μg/ml+等量不完全弗氏佐劑；4)禽蛋尤其是雞蛋去殼取黃，經(jīng)滅菌處理后，依次進(jìn)行a)用5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液稀釋蛋黃；b)自-20℃到室溫反復(fù)凍融，每分鐘500-1000轉(zhuǎn)低速離心后合并上清液備用；c)向上清液中加入乙醇至終濃度為30-50％，靜置沉淀后，取沉淀備用；d)取沉淀通過進(jìn)一步浸提、萃取、濃縮、純化、冷凍或噴霧干燥，即得到該免疫原性組合物組分之一蛋黃抗體IgY；5)取步驟2)制備的針對(duì)于上述病原體抗原的抗體或步驟4)制備的蛋黃抗體IgY為免疫原，多次重復(fù)免疫注射給禽類優(yōu)選是雞，待5-20天后禽類尤其是雞的產(chǎn)蛋中即含有針對(duì)于上述相應(yīng)抗體包括蛋黃抗體IgY的蛋黃抗獨(dú)特型抗體；所述的免疫原抗體Ab1的注射量為1-2ml，免疫原抗體Ab1的用量為10-2000μg/ml+等量不完全弗氏佐劑；6)重復(fù)步驟4)的過程，即得到該免疫原性組合物組分之一蛋黃抗獨(dú)特型抗體(Ab2)；7)取特異性基因片段經(jīng)過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)后，提取和純化表達(dá)上述疾病特異性抗原、抗體和抗獨(dú)特型抗體的DNA片段，通過酶切后，與相應(yīng)分子克隆載體重組，構(gòu)建成上述疾病特異性抗原、抗體和抗獨(dú)特型抗體的真核表達(dá)質(zhì)粒，即得到該免疫原性組合物組分之一重組DNA；8)根據(jù)實(shí)際需要按重量配比調(diào)制步驟1)所得的抗原、步驟2)所得的抗體或步驟4)所得的蛋黃抗體IgY、步驟6)所得的蛋黃抗獨(dú)特型抗體和步驟7)所得的重組DNA，再輔以可接受量的藥用輔料即得到所述的免疫原性組合物，其中各組分重量比分別為抗原 0.001～99％抗體 0.001～99％抗獨(dú)特型抗體 0.001～99％重組DNA 0.01～99％藥用敷料 0.01～99％9)取步驟8)制備的免疫原性組合物經(jīng)過無菌、安全及毒性試驗(yàn)合格后，再通過相應(yīng)的制劑工藝制備成藥劑學(xué)上相應(yīng)的劑型；所述劑型包括注射劑、膠囊、口服液、氣霧劑、貼劑中的任一種劑型。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其特征還在于包括以下步驟1)提取純化或重組疾病相關(guān)病原體特異性抗原；2)提取純化或重組疾病相關(guān)病原體特異性抗體；3)分別取上述抗原和抗體包括蛋黃抗體IgY作為免疫原，分別連續(xù)或同時(shí)多次重復(fù)免疫注射給禽類優(yōu)選是雞；還可將上述抗原和抗體包括蛋黃抗體IgY按1∶1比例混合后作為免疫原進(jìn)行免疫注射；待5-20天后禽類尤其是雞的產(chǎn)蛋中即同時(shí)含有針對(duì)于上述抗原的蛋黃抗體IgY和針對(duì)于上述抗體包括蛋黃抗體IgY的特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體；4)取上一步驟所得的禽蛋或雞蛋，經(jīng)滅菌處理后，依次進(jìn)行a)用5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液稀釋蛋黃；b)自-20℃到室溫反復(fù)凍融，每分鐘500-1000轉(zhuǎn)低速離心后合并上清液備用；c)向上清液中加入乙醇至終濃度為30-50％，靜置沉淀后，取沉淀備用；d)取沉淀通過進(jìn)一步浸提、萃取、濃縮、純化、冷凍或噴霧干燥；如此一次性提取純化，可同時(shí)得到蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨(dú)特型抗體組合物；5)取特異性基因片段經(jīng)過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)后，提取和純化表達(dá)上述疾病特異性抗原、抗體和抗獨(dú)特型抗體的DNA片段，通過酶切后，與相應(yīng)分子克隆載體重組，構(gòu)建成上述疾病特異性抗原、抗體和抗獨(dú)特型抗體的真核表達(dá)質(zhì)粒，即得到該免疫原性組合物組分之一重組DNA；6)根據(jù)實(shí)際需要按重量配比調(diào)制步驟1)所得的抗原、步驟2)所得的抗體、步驟4)所得的蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨(dú)特型抗體組合物和步驟5)所得的重組DNA，再輔以可接受量的藥用輔料即得到所述的免疫原性組合物，其中各組分重量比分別為抗原0.001～99％抗體0.001～99％抗獨(dú)特型抗體0.001～99％重組DNA 0.01～99％藥用敷料0.01～99％7)取步驟6)制備的免疫原性組合物經(jīng)過無菌、安全及毒性試驗(yàn)合格后，再根據(jù)實(shí)際需要，通過相應(yīng)的制劑工藝制備成藥劑學(xué)上相應(yīng)的劑型；所述劑型包括注射劑、膠囊、口服液、氣霧劑、貼劑中的任一種劑型。
根據(jù)本發(fā)明，預(yù)防和治療疾病的免疫原性組合物的用途，其特征在于應(yīng)用于制備疾病生物預(yù)防和治療劑以及食品、保健品添加劑，特別是應(yīng)用于制備人類惡性腫瘤、傳染性疾病、自身免疫病、過敏性疾病和器官移植排斥的治療性疫苗以及食品、保健品添加劑。
根據(jù)本發(fā)明，預(yù)防和治療疾病的免疫原性組合物的用途，其特征還在于應(yīng)用于制備畜禽傳染病的治療性疫苗和畜禽飼料添加劑。
技術(shù)效果本發(fā)明將抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體和重組DNA有機(jī)巧妙地結(jié)合在一起，既適用于治療又適用于預(yù)防疾病，兼具治病和防病于一身，不但避免了單克隆抗體藥物和減毒活疫苗及基因重組亞單位疫苗之功能單一的缺點(diǎn)，而且有效地解決了鼠源性單抗所產(chǎn)生的HAMA反應(yīng)問題。
更重要的是在本發(fā)明中由于抗原-抗體、抗體-抗獨(dú)特型抗體和抗原-抗體-抗獨(dú)特型抗體免疫復(fù)合物的形成，能夠通過上述免疫復(fù)合物所攜帶的抗原或抗獨(dú)特型抗體，從而改變抗原提呈形式，更有利于抗原的提呈，并增強(qiáng)抗原的免疫原性，強(qiáng)化機(jī)體免疫應(yīng)答，以達(dá)到降低或增加機(jī)體免疫耐受的目的，另外，上述免疫復(fù)合物所攜帶的抗體的中和或消除或耐受靶向抗原的功能同其所攜帶的抗獨(dú)特型抗體的調(diào)節(jié)、抑制、模擬“內(nèi)影像”及雙特異性等功能相得益彰、相互促進(jìn)、相互協(xié)調(diào)、相互增強(qiáng)或降低等多種功能協(xié)同作用，再加上重組DNA的強(qiáng)化和協(xié)同作用以共同達(dá)到防病和治病的雙向目的。
本發(fā)明就是采用上述方法所制備的所述預(yù)防和治療疾病的免疫原性組合物，即疾病特異性抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體、重組DNA和藥用輔料的免疫原性組合物，作為疾病的治療性疫苗而應(yīng)用于上述疾病的特異性免疫預(yù)防和治療。該免疫原性組合物能夠激活或抑制特定的淋巴細(xì)胞〔B細(xì)胞和T細(xì)胞〕，產(chǎn)生相應(yīng)的對(duì)抗疾病病原體的整體免疫作用即體液和細(xì)胞免疫作用，并對(duì)將來的疾病病原體產(chǎn)生記憶反應(yīng)，激活機(jī)體免疫系統(tǒng)甚至重新調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)平衡，調(diào)動(dòng)或協(xié)調(diào)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫作用，產(chǎn)生特異性對(duì)抗上述疾病病原體的抗體或反應(yīng)性淋巴細(xì)胞，來共同消滅或耐受病原體、變應(yīng)原、自身抗原和被移植器官，克服了滅活病原體疫苗的潛在感染問題、基因重組亞單位疫苗的不完全免疫反應(yīng)問題以及免疫抑制劑的毒性問題，以達(dá)到全面、有效、快速預(yù)防和治療上述疾病的目的。
本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)例和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，取得了意想不到的效果，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見實(shí)驗(yàn)例)表明，本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)；1、本發(fā)明服用、攜帶、運(yùn)輸方便，適用于男女、老幼正常人和患者使用。
2、本發(fā)明療效確切、無毒副作用和過敏反應(yīng)，適用于作為人類腫瘤、傳染性疾病、自身免疫病、器官移植排斥的治療性疫苗以及食品、保健品添加劑；也適用于作為畜禽傳染病的治療性疫苗以及畜禽飼料添加劑。
3、本發(fā)明可替代和補(bǔ)充昂貴的抗腫瘤、抗病毒、抗細(xì)菌以及免疫抑制藥物，能有效避免上述藥物的耐藥性及毒副作用。
4、本發(fā)明制備原料包括免疫原、禽類及其蛋黃、飼料、純化設(shè)備及其所用化學(xué)原料來源廣泛易得，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。
5、本發(fā)明制備工藝成熟，純度高且質(zhì)量可靠，易于規(guī)?；瘜?shí)施。
6、本發(fā)明防治功能全面、快速，防病與治病集于一身，克服了抗體藥物和亞單位疫苗的各自的弱點(diǎn)。
7、本發(fā)明有效避免了鼠源性單抗的HAMA反應(yīng)問題。
8、本發(fā)明還具有較好的導(dǎo)向性或靶向性，在一定程度上具有生物導(dǎo)彈的功能。
9、本發(fā)明各組分間協(xié)同作用，相互促進(jìn)、相互增強(qiáng)、相互協(xié)調(diào)，能有效防治上述疾病，且療效全面，應(yīng)用面廣。
10、本發(fā)明中的抗原-抗體、抗體-抗獨(dú)特型抗體、抗原-抗體-抗獨(dú)特型抗體免疫復(fù)合物更有利于抗原和抗獨(dú)特型抗體模擬“內(nèi)影像”抗原性的提呈，并且上述免疫復(fù)合物比單獨(dú)免疫原更能誘生高滴度的抗體產(chǎn)生和淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，從而更有效地誘生體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，以達(dá)到防病和治病的雙向目的。
具體實(shí)施例方式
下面就結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但所述實(shí)施例并不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1傳染性疾病的免疫原性組合物的制備(以乙型肝炎特異性免疫原性組合物為例)一、抗原的來源和制備(以乙肝表面抗原HBsAg為例)HBsAg為自HBsAg陽性血漿分離、純化，經(jīng)胃蛋白酶消化及甲醛滅活的乙型肝炎病毒表面抗原。
重組HBsAg重組乙肝表面抗原疫苗由上海生物制品研究所提供。
二、抗體的來源和制備(以乙肝表面抗體HBsAb為例)鼠源性抗-HBs以上述HBsAg加入2mg/ml氫氧化鋁佐劑，經(jīng)腹腔免疫BALB/c小鼠，加強(qiáng)2周后取血、分離制備成抗血清，其純化抗-HBs效價(jià)為1∶256。
人Fab噬菌體抗-HBs用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出人抗體輕鏈k基因和重鏈Fd基因，將二基因先后克隆入PComb3Hss載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，再用輔助噬菌體感染，構(gòu)建含抗-HBs的人源性噬菌體抗體庫(kù)，進(jìn)一步篩選出針對(duì)于HBsAg的人Fab噬菌體抗體。
蛋黃抗體IgY的制備(以乙肝表面抗原特異性蛋黃抗體IgY為例)1)用具有免疫活性的血源純化乙肝表面抗原或基因重組乙肝表面抗原或乙肝表面抗原疫苗作為免疫原，其中血源純化乙肝表面抗原和基因重組乙肝表面抗原均由北京科衛(wèi)臨床診斷試劑廠提供，重組乙肝表面抗原疫苗由上海生物制品研究所提供；2)取6月齡SPF純系萊航產(chǎn)蛋母雞于標(biāo)準(zhǔn)II級(jí)清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，每只雞于胸腹部多點(diǎn)注射上述乙型肝炎免疫原1ml(免疫原量100μg/ml+等量完全福氏佐劑)，待3周后加強(qiáng)免疫注射2次，待15天后免疫母雞所產(chǎn)的雞蛋中即含有針對(duì)于上述乙型肝炎免疫原的蛋黃抗體IgY；3)取步驟2)獲得的雞蛋10個(gè)去蛋清后的蛋黃液135ml，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝螅尤氲包S勻漿液5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，然后置于冰盒(-20℃)冰凍1小時(shí)，取出于室溫復(fù)融并低速離心(1000r/min)后，收集上清液，再向沉淀物中加入2倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，充分混勻溶解沉淀物，依上法再次凍融收集上清液，如此反復(fù)凍融3次，合并收集各次得到的上清液，加入乙醇至終濃度為50％，3000轉(zhuǎn)/分離心后，取沉淀備用；4)取步驟3)獲得的沉淀物通過進(jìn)一步浸提、萃取、濃縮、純化、冷凍或噴霧干燥，即得到本發(fā)明免疫原性組合物組分之一蛋黃抗體IgY，共得到IgY1.12g，其收率為71％。該蛋黃抗體IgY是針對(duì)于上述乙型肝炎免疫原的。
三、蛋黃抗獨(dú)特型抗體的制備(以乙肝表面抗體特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體為例)1)用具有免疫活性的血源純化乙肝表面抗體或基因重組乙肝表面抗體或上述實(shí)施例1第二條中所制備的乙肝表面抗原特異性蛋黃抗體IgY為免疫原，其中血源純化乙肝表面抗體和基因重組乙肝表面抗體均由北京科衛(wèi)臨床診斷試劑廠提供；2)取6月齡SPF純系萊航產(chǎn)蛋母雞于標(biāo)準(zhǔn)II級(jí)清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，每只雞于胸腹部多點(diǎn)注射上述乙型肝炎免疫原1ml(上述免疫原的用量為500μg+等量完全福氏佐劑)，待3周后加強(qiáng)免疫注射2次，待15天后免疫母雞所產(chǎn)的雞蛋中即含有針對(duì)于上述乙型肝炎免疫原的蛋黃抗獨(dú)特性抗體；3)取步驟2)獲得的雞蛋10個(gè)去蛋清后的蛋黃液155ml，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝螅尤氲包S勻漿液5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，然后置于冰盒(-20℃)冰凍1小時(shí)，取出于室溫復(fù)融并低速離心(1000r/min)后，收集上清液，再向沉淀物中加入2倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，充分混勻溶解沉淀物，依上法再次凍融收集上清液，如此反復(fù)凍融3次，合并收集各次得到的上清液，加入乙醇至終濃度為50％，3000轉(zhuǎn)/分離心后，取沉淀備用；4)取步驟3)獲得的沉淀物通過進(jìn)一步浸提、萃取、濃縮、純化、冷凍或噴霧干燥，即得到本發(fā)明蛋黃抗體組合物組分之一蛋黃抗獨(dú)特型抗體，共得到IgY1.37g，其收率為76％。該蛋黃抗獨(dú)特型抗體是針對(duì)于上述乙型肝炎表面抗體或乙肝特異性蛋黃抗體IgY免疫原的。
四、蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨(dú)特型抗體組合物的制備(以乙型肝炎蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨(dú)特型抗體組合物為例)1)分別取上述實(shí)施例1第一條中的乙肝表面抗原免疫原和上述實(shí)施例1第二條中的乙肝表面抗體包括乙肝蛋黃抗體IgY免疫原等量混合之，成為乙肝表面抗原和乙肝表面抗體包括乙肝蛋黃抗體IgY的混合免疫原；2)取6月齡SPF純系萊航產(chǎn)蛋母雞于標(biāo)準(zhǔn)II級(jí)清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，每只雞于胸腹部多點(diǎn)注射上述乙型肝炎混合免疫原1ml(上述免疫原的用量為1000μg+等量完全福氏佐劑)，待3周后加強(qiáng)免疫注射2次，待15天后免疫母雞所產(chǎn)的雞蛋中即含有針對(duì)于上述乙型肝炎混合免疫原的蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨(dú)特性抗體；3)取步驟2)獲得的雞蛋去蛋清后的蛋黃液160ml，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，加入蛋黃勻漿液5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，然后置于冰盒(-20℃)冰凍1小時(shí)，取出于室溫復(fù)融并低速離心(1000r/min)后，收集上清液，再向沉淀物中加入2倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，充分混勻溶解沉淀物，依上法再次凍融收集上清液，如此反復(fù)凍融3次，合并收集各次得到的上清液，加入乙醇至終濃度為50％，3000轉(zhuǎn)/分離心后，取沉淀備用；4)取步驟3)獲得的沉淀物通過進(jìn)一步浸提、萃取、濃縮、純化、冷凍或噴霧干燥，即得到本發(fā)明蛋黃抗體組合物的主要組分即蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨(dú)特型抗體的混合物，共得到IgY1.32g，其收率為80％。該蛋黃抗體混合物是針對(duì)于上述乙型肝炎表面抗原和乙型肝炎表面抗體包括乙肝特異性蛋黃抗體IgY免疫原的。
五、重組DNA的制備(以乙肝表面抗原重組DNA質(zhì)粒為例)將編碼HBV表面抗原preS2+S片段的基因片段插入到真核細(xì)胞表達(dá)載體pJW4303中，構(gòu)建成真核表達(dá)質(zhì)粒pJW4303/HBV-S2.S重組體，在此稱為乙肝表面抗原重組DNA質(zhì)粒。
六、免疫原性組合物的制備(以乙肝特異性免疫原性組合物I為例)取實(shí)施例1第一條中制備的乙肝表面抗原100mg、實(shí)施例1第二條中制備的特異性蛋黃抗體IgY200mg、實(shí)施例1第三條中制備的乙肝表面抗體特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體100mg和實(shí)施例1第五條中制備的乙肝表面抗原重組DNA質(zhì)粒400mg，將四者充分混合，然后加入等量氫氧化鋁佐劑900mg，充分混勻，再經(jīng)過巴氏滅菌和除熱源處理后即為本發(fā)明乙肝特異性免疫原性組合物I。
七、乙肝表面抗原特異性蛋黃抗體IgY與氧化苦參堿偶聯(lián)物的制備首先取葡聚糖10g，加入200mL蒸餾水后加高碘酸鈉3g，室溫下避光反應(yīng)過夜，使葡聚糖充分氧化為多醛基葡聚糖，蒸餾水充分透析后凍干；注射治療前2小時(shí)內(nèi)取多醛基葡聚糖100mg加入0.15mol/L(pH7.2)的磷酸緩沖液20mL中，加氧化苦參堿100mg，室溫下反應(yīng)24小時(shí)后，再加入已純化的乙肝表面抗原特異性蛋黃抗體IgY100mg，4℃攪拌反應(yīng)24小時(shí)；然后在上述反應(yīng)混合物中加硼氫化鈉2mg，在4℃下還原2小時(shí)，離心后經(jīng)Sephadex G-150層析柱過柱，收集第一峰即可應(yīng)用。
八、乙肝特異性免疫原性組合物II的制備取實(shí)施例1第七條中制備的乙肝表面抗原特異性蛋黃抗體IgY與氧化苦參堿的偶聯(lián)物200mg和上述實(shí)施例1第一條中制備的乙肝表面抗原100mg、實(shí)施例1第三條中制備的乙肝表面抗體特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體100mg、實(shí)施例1第五條中制備的乙肝表面抗原重組DNA質(zhì)粒400mg，將四者充分混合，然后加入分子內(nèi)佐劑棕櫚酰賴氨酸200mg，充分混勻，待反應(yīng)完全后再經(jīng)過巴氏滅菌和除熱源處理后即成為極易穿透細(xì)胞脂質(zhì)膜且具有靶向抗乙肝病毒作用的乙肝特異性免疫原性組合物II。該免疫原性組合物II不僅具有上述實(shí)施例1第六條中所制備的免疫原性組合物I所具備的免疫協(xié)調(diào)和治療作用，而且還具有針對(duì)于乙肝病毒的生物導(dǎo)彈功能，因此對(duì)于乙肝病毒具有更強(qiáng)的特異性殺傷能力。
九、乙肝特異性免疫原性組合物II注射劑的制備按照實(shí)施例1第八條中乙肝特異性免疫原性組合物II的配方組成，取該組合物1.0g，再加入分子內(nèi)佐劑棕櫚酰賴氨酸200mg，再加入藥用敷料海藻糖2.0g，充分混勻，待反應(yīng)完全后再經(jīng)過巴氏滅菌和除熱源處理后，冷凍干燥或干燥處理后裝安培、封口即成為注射劑。
十、乙肝特異性免疫原性組合物II膠囊的制備按照實(shí)施例1第八條中乙肝特異性免疫原性組合物II的配方組成，取該組合物1.0g，再加入分子內(nèi)佐劑棕櫚酰賴氨酸200mg，再加入藥用敷料蔗糖200g、大豆磷脂200g，充分混勻，待反應(yīng)完全后再經(jīng)過巴氏滅菌和除熱源處理后，裝入空心膠囊即成為用于口服的膠囊。
十一、乙肝特異性免疫原性組合物II口服液的制備按照實(shí)施例1第八條中乙肝特異性免疫原性組合物II的配方組成，取該組合物1.0g，再加入分子內(nèi)佐劑棕櫚酰賴氨酸200mg，再加入藥用敷料蔗糖200g，補(bǔ)足重蒸餾水至10ml，充分混勻，待反應(yīng)完全后再經(jīng)過巴氏滅菌和除熱源處理后，裝入口服液瓶并無菌封口即成為口服液。
十二、乙肝特異性免疫原性組合物II氣霧劑的制備按照實(shí)施例1第八條中乙肝特異性免疫原性組合物II的配方組成，取該組合物1.0g，再加入分子內(nèi)佐劑棕櫚酰賴氨酸200mg，再加入藥用敷料氣霧劑溶劑，待反應(yīng)完全后再經(jīng)過巴氏滅菌和除熱源處理后，打壓裝帶噴嘴耐壓氣霧劑瓶中即成為氣霧劑。
十三、乙肝特異性免疫原性組合物II貼劑的制備按照實(shí)施例1第八條中乙肝特異性免疫原性組合物II的配方組成，取該組合物1.0g，再加入分子內(nèi)佐劑棕櫚酰賴氨酸200mg，再加入適量的藥用敷料羥丙基甲基纖維素，充分混勻，待反應(yīng)完全后再經(jīng)過巴氏滅菌和除熱源處理后，涂布于貼劑基質(zhì)載體表面即成為貼劑。
實(shí)施例2惡性腫瘤的免疫原性組合物的制備(以腸癌特異性癌胚抗原CEA的免疫原性組合物為例)一、抗原的來源和制備(以癌胚抗原CEA為例)CEA為自腸癌組織經(jīng)分離、純化的癌胚抗原。
二、抗體的來源和制備(以抗-CEA為例)鼠源性抗-CEA以上述CEA加入2mg/ml氫氧化鋁佐劑，經(jīng)腹腔免疫BALB/c小鼠，加強(qiáng)2周后取血、分離制備成抗血清，其純化抗-CEA效價(jià)為1∶128。
癌胚抗原蛋黃抗體CEA-IgY的制備用具有免疫活性的腸癌組織純化CEA作為免疫原，按照實(shí)施例1第二條中的2)、3)、4)步驟即可獲得癌胚抗原蛋黃抗體CEA-IgY，用157ml蛋黃液共得到CEA-IgY1.52g，其收率為73％。
三、癌胚抗原蛋黃抗體CEA-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體的制備用具有免疫活性的癌胚抗原蛋黃抗體CEA-IgY為免疫原，按照實(shí)施例1第三條中的2)、3)、4)步驟即可獲得癌胚抗原蛋黃抗體CEA-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體，用142ml蛋黃液共得到CEA-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體1.52g，其收率為73％。
四、癌胚抗原特異性蛋黃抗體IgY和其特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體組合物的制備分別取實(shí)施例2第一條中制備的CEA和實(shí)施例2第二條中制備的癌胚抗原蛋黃抗體CEA-IgY等量混合之，成為混合免疫原，按照實(shí)施例1第四條中的2)、3)、4)步驟即可獲得癌胚抗原蛋黃抗體CEA-IgY和其特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體的組合物，用112ml蛋黃液共得到871mg，其收率為64％。
五、重組DNA的制備(以CEA重組DNA質(zhì)粒為例)將人特異表達(dá)的癌胚抗原CEA的cDNA克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體pLXSN中，構(gòu)建成真核表達(dá)重組質(zhì)粒pLXSN-CEA，在此稱為CEA重組DNA質(zhì)粒。
六、癌胚抗原特異性免疫原性組合物I的制備取實(shí)施例2第一條中制備的CEA 100mg、實(shí)施例2第二條中制備的CEA-IgY200mg、實(shí)施例2第三條中制備的CEA-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體100mg和實(shí)施例2第五條中制備的CEA重組DNA質(zhì)粒500mg，將四者充分混合，然后加入氫氧化鋁佐劑500mg，充分混勻，再經(jīng)過巴氏滅菌和除熱源處理后即為癌胚抗原特異性免疫原性組合物I。
七、CEA-IgY與絲裂霉素偶聯(lián)物的制備首先取葡聚糖10g，加入200mL蒸餾水后加高碘酸鈉3g，室溫下避光反應(yīng)過夜，使葡聚糖充分氧化為多醛基葡聚糖，蒸餾水充分透析后凍干；注射治療前2小時(shí)內(nèi)取多醛基葡聚糖100mg加入0.15mol/L(pH7.2)的磷酸緩沖液20mL中，加絲裂霉素100mg，室溫下反應(yīng)24小時(shí)后，再加入已純化的CEA-IgY100mg，4℃攪拌反應(yīng)24小時(shí)；然后在上述反應(yīng)混合物中加硼氫化鈉2mg，在4℃下還原2小時(shí)，離心后經(jīng)Sephadex G-150層析柱過柱，收集第一峰即可應(yīng)用。
八、癌胚抗原特異性免疫原性組合物II的制備取實(shí)施例2第一條中制備的CEA 100mg、實(shí)施例2第七條中制備的CEA-IgY與絲裂霉素的偶聯(lián)物200mg、實(shí)施例2第三條中制備的CEA-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體100mg和實(shí)施例2第五條中制備的CEA重組DNA質(zhì)粒200mg，將四者充分混合，然后加入分子內(nèi)佐劑棕櫚酰賴氨酸400mg，充分混勻，待反應(yīng)完全后再經(jīng)過巴氏滅菌和除熱源處理后即成為極易穿透細(xì)胞脂質(zhì)膜且具有靶向抗癌作用的癌胚抗原特異性免疫原性組合物II。該免疫原性組合物II不僅具有上述實(shí)施例2第六條中所制備的免疫原性組合物I所具有的免疫協(xié)調(diào)和治療作用，而且還具有針對(duì)于癌細(xì)胞的生物導(dǎo)彈功能，因此對(duì)于癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的特異性殺傷能力。
九、癌胚抗原特異性免疫原性組合物II注射劑的制備按照實(shí)施例2第八條中癌胚抗原特異性免疫原性組合物II的配方組成，取該組合物1.0g，再加入藥用敷料海藻糖2.0g，充分混勻，待反應(yīng)完全后再經(jīng)過巴氏滅菌和除熱源處理后，冷凍干燥或干燥處理后裝安培、封口即成為注射劑。
十、癌胚抗原特異性免疫原性組合物II口服液的制備按照實(shí)施例2第八條中癌胚抗原特異性免疫原性組合物II的配方組成，取該組合物1.0 g，再加入藥用敷料蔗糖500g，補(bǔ)足重蒸餾水至10ml，充分混勻，待反應(yīng)完全后再經(jīng)過巴氏滅菌和除熱源處理后，裝入口服液瓶并無菌封口即成為口服液。
實(shí)施例3自身免疫病的免疫原性組合物的制備(以類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎特異性CD20免疫原性組合物為例)一、抗原的來源和制備(以CD20為例)CD20為自人白細(xì)胞經(jīng)分離、純化的CD20抗原。
二、抗體的來源和制備(以抗-CD20為例)鼠源性抗-CD20以上述CD20抗原加入2mg/ml氫氧化鋁佐劑，經(jīng)腹腔免疫BALB/c小鼠，加強(qiáng)2周后取血、分離制備成抗血清，其純化抗-CD20效價(jià)為1∶128。
CD20蛋黃抗體CD20-IgY的制備用具有免疫活性的純化CD20抗原作為免疫原，按照實(shí)施例1第二條中的2)、3)、4)步驟即可獲得蛋黃抗體CD20-IgY，用157ml蛋黃液共得到CD20-IgY1.52g，其收率為76％。
三、蛋黃抗體CD20-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體的制備用具有免疫活性的CD20-IgY為免疫原，按照實(shí)施例1第三條中的2)、3)、4)步驟即可獲得蛋黃抗體CD20-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體，用142ml蛋黃液共得到CD20-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體1.52g，其收率為73％。
四、特異性蛋黃抗體CD20-IgY和其特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體組合物的制備分別取上述實(shí)施例3第一條中制備的CD20和上述實(shí)施例3第二條中制備的蛋黃抗體CD20-IgY等量混合之，成為混合免疫原，按照實(shí)施例1第四條中的2)、3)、4)步驟即可獲得蛋黃抗體CD20-IgY和其特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體的組合物，用112ml蛋黃液共得到895mg，其收率為67％。
五、重組DNA的制備(以CD20重組DNA質(zhì)粒為例)將人CD20分子胞外區(qū)基因片斷插入到真核表達(dá)載體pExSecI的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建pExSecI/CD20重組質(zhì)粒，在此稱為CD20重組DNA質(zhì)粒。
六、CD20免疫原性組合物I的制備取實(shí)施例3第一條中制備的CD20 100mg、實(shí)施例3第二條中制備的CD20-IgY200mg、實(shí)施例3第三條中制備的CD20-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體100mg和實(shí)施例3第五條中制備的CD20重組DNA質(zhì)粒500mg，將四者充分混合，然后加入氫氧化鋁佐劑500mg，充分混勻，再經(jīng)過巴氏滅菌和除熱源處理后即為CD20特異性免疫原性組合物I。
七、CD20-IgY與氧化苦參堿偶聯(lián)物的制備首先取葡聚糖10g，加入200mL蒸餾水后加高碘酸鈉3g，室溫下避光反應(yīng)過夜，使葡聚糖充分氧化為多醛基葡聚糖，蒸餾水充分透析后凍干；注射治療前2小時(shí)內(nèi)取多醛基葡聚糖100mg加入0.15mol/L(pH7.2)的磷酸緩沖液20mL中，加氧化苦參堿100mg，室溫下反應(yīng)24小時(shí)后，再加入已純化的CD20-IgY100mg，4℃攪拌反應(yīng)24小時(shí)；然后在上述反應(yīng)混合物中加硼氫化鈉2mg，在4℃下還原2小時(shí)，離心后經(jīng)Sephadex G-150層析柱過柱，收集第一峰即可應(yīng)用。
八、CD20免疫原性組合物II的制備取上述實(shí)施例3第七條中制備的CD20特異性蛋黃抗體CD20-IgY與氧化苦參堿的偶聯(lián)物100mg和上述實(shí)施例3第一條中制備的CD20抗原50mg、實(shí)施例3第三條中制備的CD20-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體50mg、實(shí)施例3第五條中制備的CD20重組DNA質(zhì)粒100mg，將四者充分混合，然后加入分子內(nèi)佐劑棕櫚酰賴氨酸100mg，充分混勻，待反應(yīng)完全后再經(jīng)過巴氏滅菌和除熱源處理后即成為極易穿透細(xì)胞脂質(zhì)膜且具有靶向治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的免疫原性組合物。該免疫原性組合物II不僅具有上述實(shí)施例3第六條中所制備的免疫原性組合物I所具備的免疫協(xié)調(diào)和治療作用，而且還具有針對(duì)于CD20陽性淋巴細(xì)胞的生物導(dǎo)彈功能，因此對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有更強(qiáng)的免疫治療作用。
九、CD20免疫原性組合物II注射劑的制備按照實(shí)施例3第八條中CD20免疫原性組合物II的配方組成，取該組合物II1.0g，再加入分子內(nèi)佐劑棕櫚酰賴氨酸200mg，再加入藥用敷料海藻糖2.0g，充分混勻，待反應(yīng)完全后再經(jīng)過巴氏滅菌和除熱源處理后，冷凍干燥或干燥處理后裝安培、封口即成為注射劑。
十、CD20-IgY免疫原性組合物II貼劑的制備按照實(shí)施例3第八條中CD20免疫原性組合物II的配方組成，取該組合物II1.0g，再加入藥用敷料羥丙基甲基纖維素2.0g，充分混勻，待反應(yīng)完全后再經(jīng)過巴氏滅菌和除熱源處理后，涂布于貼劑基質(zhì)載體表面即成為貼劑。
實(shí)施例4過敏性疾病的免疫原性組合物的制備(以變應(yīng)性鼻炎塵螨抗原的免疫原性組合物為例)
一、抗原的來源和制備(以螨抗原為例)螨抗原為采用上海醫(yī)大紅旗藥廠生產(chǎn)的螨逸口含免疫劑經(jīng)分離、純化的螨抗原。
二、抗體的來源和制備(以蛋黃抗體螨抗體-IgY為例)螨抗體-IgY的制備用具有免疫活性的純化螨抗原作為免疫原，按照實(shí)施例1第二條中的2)、3)、4)步驟即可獲得螨抗體-IgY，用132ml蛋黃液共得到螨抗體-IgY1.32g，其收率為75％。
三、螨抗體-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體的制備用具有免疫活性的螨抗體-IgY為免疫原，按照實(shí)施例1第三條中的2)、3)、4)步驟即可獲得螨抗體-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體，用112ml蛋黃液共得到螨抗體-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體1.2g，其收率為67％。
四、特異性螨抗體-IgY和其特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體組合物的制備分別取上述實(shí)施例4第一條中制備的螨抗原和上述實(shí)施例4第二條中制備的螨抗體-IgY等量混合之，在加入等量完全佐劑而成為混合免疫原，按照實(shí)施例1第四條中的2)、3)、4)步驟即可獲得螨抗體-IgY和其特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體的組合物，用125ml蛋黃液共得到830mg，其收率為61％。
五、重組DNA的制備(以螨抗原重組DNA質(zhì)粒為例)采用基因重組的方法構(gòu)建能夠表達(dá)螨抗原的重組DNA質(zhì)粒。
六、螨抗原特異性免疫原性組合物的制備取實(shí)施例4第一條中制備的螨抗原100mg、實(shí)施例4第二條中制備的螨抗體-IgY200mg、實(shí)施例4第三條中制備的螨抗體-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體100mg和實(shí)施例4第五條中制備的螨抗原重組DNA質(zhì)粒500mg，將四者充分混合，然后加入氫氧化鋁佐劑500mg，充分混勻，再經(jīng)過巴氏滅菌和除熱源處理后即為螨抗原抗原特異性免疫原性組合物。
七、螨抗原特異性免疫原性組合物注射劑的制備按照實(shí)施例4第六條中螨抗原特異性免疫原性組合物的配方組成，取該組合物1.0g，再加入分子內(nèi)佐劑棕櫚酰賴氨酸100mg，再加入藥用敷料海藻糖2.0g，充分混勻，待反應(yīng)完全后再經(jīng)過巴氏滅菌和除熱源處理后，冷凍干燥或干燥處理后裝安培、封口即成為注射劑。
實(shí)施例5用于器官移植的免疫原性組合物的制備(以腎移植用的免疫原性組合物為例)一、抗原的來源和制備(以CD154抗原為例)CD154抗原為自人白細(xì)胞經(jīng)分離、純化的CD154抗原。
二、抗體的來源和制備(以蛋黃抗體CD154-IgY為例)蛋黃抗體CD154-IgY的制備用具有免疫活性的純化CD154抗原作為免疫原，按照實(shí)施例1第二條中的2)、3)、4)步驟即可獲得蛋黃抗體CD154-IgY，用125ml蛋黃液共得到CD154-IgY1.12g，其收率為74％。
三、CD154-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體的制備用具有免疫活性的CD154-IgY為免疫原，按照實(shí)施例1第三條中的2)、3)、4)步驟即可獲得CD154-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體，用112ml蛋黃液共得到CD154-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體1.2g，其收率為67％。
四、特異性CD154-IgY和其特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體組合物的制備分別取上述實(shí)施例5第一條中制備的CD154抗原和上述實(shí)施例5第二條中制備的CD154-IgY等量混合之，在加入等量完全佐劑而成為混合免疫原，按照實(shí)施例1第四條中的2)、3)、4)步驟即可獲得CD154-IgY和其特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體的組合物，用120ml蛋黃液共得到840mg，其收率為62％。
五、重組DNA的制備(以CD154抗原重組DNA質(zhì)粒為例)采用基因重組的方法構(gòu)建能夠表達(dá)CD154抗原的重組DNA質(zhì)粒。
六、CD154抗原特異性免疫原性組合物的制備取實(shí)施例5第一條中制備的CD154抗原100mg、實(shí)施例5第二條中制備的CD154-IgY200mg、實(shí)施例5第三條中制備的CD154-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體100mg和實(shí)施例5第五條中制備的CD154抗原重組DNA質(zhì)粒500mg，將四者充分混合，然后加入氫氧化鋁佐劑500mg，充分混勻，再經(jīng)過巴氏滅菌和除熱源處理后即為CD154抗原特異性免疫原性組合物。
七、CD154抗原特異性免疫原性組合物注射劑的制備按照實(shí)施例5第六條中CD154抗原特異性免疫原性組合物的配方組成，取該組合物1.0g，再加入分子內(nèi)佐劑棕櫚酰賴氨酸100mg，再加入藥用敷料海藻糖2.0g，充分混勻，待反應(yīng)完全后再經(jīng)過巴氏滅菌和除熱源處理后，冷凍干燥或干燥處理后裝安培、封口即成為注射劑。
實(shí)施例6畜禽傳染病的免疫原性組合物的制備(以新城疫病毒抗原NDV的免疫原性組合物為例)一、抗原的來源和制備(以NDV抗原為例)NDV為自新城疫病毒滅活疫苗經(jīng)分離、純化的NDV抗原，其中雞新城疫病毒滅活疫苗來源于吉林省生物制品廠。
二、抗體的來源和制備(以蛋黃抗體NDV-IgY為例)NDV蛋黃抗體NDV-IgY的制備用具有免疫活性的純化NDV抗原作為免疫原，按照實(shí)施例1第二條中的2)、3)、4)步驟即可獲得蛋黃抗體NDV-IgY，用120ml蛋黃液共得到NDV-IgY1.2g，其收率為73％。
三、蛋黃抗體NDV-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體的制備用具有免疫活性的NDV-IgY為免疫原，按照實(shí)施例1第三條中的2)、3)、4)步驟即可獲得蛋黃抗體NDV-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體，用112ml蛋黃液共得到NDV-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體1.2g，其收率為67％。
四、特異性蛋黃抗體NDV-IgY和其特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體組合物的制備分別取上述實(shí)施例6第一條中制備的NDV和上述實(shí)施例6第二條中制備的蛋黃抗體NDV-IgY等量混合之，在加入等量完全佐劑而成為混合免疫原，按照實(shí)施例1第四條中的2)、3)、4)步驟即可獲得蛋黃抗體NDV-IgY和其特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體的組合物，用130ml蛋黃液共得到890mg，其收率為66％。
五、重組DNA的制備(以NDV重組DNA質(zhì)粒為例)將雞新城疫病毒NDV的HN基因片斷插入到真核表達(dá)載體pIRES1的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建pIRHN重組表達(dá)載體，在此稱為NDV重組DNA質(zhì)粒。
六、NDV免疫原性組合物的制備取實(shí)施例6第一條中制備的NDV 100mg、實(shí)施例6第二條中制備的NDV-IgY200mg、實(shí)施例6第三條中制備的NDV-IgY特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體100mg和實(shí)施例6第五條中制備的NDV重組DNA質(zhì)粒500mg，將四者充分混合，然后加入氫氧化鋁佐劑500mg，充分混勻，再經(jīng)過巴氏滅菌和除熱源處理后即為雞新城疫病毒NDV抗原特異性免疫原性組合物。
七、NDV免疫原性組合物注射劑的制備按照實(shí)施例6第六條中NDV免疫原性組合物的配方組成，取該組合物1.0g，再加入分子內(nèi)佐劑棕櫚酰賴氨酸100mg，再加入藥用敷料海藻糖2.0g，充分混勻，待反應(yīng)完全后再經(jīng)過巴氏滅菌和除熱源處理后，冷凍干燥或干燥處理后裝安培、封口即成為注射劑。
下面就結(jié)合實(shí)驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但所述實(shí)驗(yàn)例并不限制本發(fā)明。
實(shí)驗(yàn)例1免疫原性組合物的性能檢測(cè)一、抗原、蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨(dú)特型抗體的效價(jià)檢測(cè)(以重組乙肝表面抗原及其特異性蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨(dú)特型抗體組合物為例)1)方法原理重組乙肝表面抗原的檢測(cè)采用ELISA雙抗體夾心法；乙型肝炎表面抗原特異性蛋黃抗體IgY的檢測(cè)采用ELISA間接法，即以乙型肝炎表面抗原液包被酶標(biāo)板孔，采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗雞IgY抗體作為二抗；乙型肝炎表面抗體特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體的檢測(cè)采用ELISA雙抗體夾心法，即以乙肝表面抗原特異性蛋黃抗體IgY包被酶標(biāo)板孔，采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的乙肝表面抗原特異性蛋黃抗體IgY作為標(biāo)記抗體。
2)試劑材料a)包被緩沖液(PH9.6碳酸鹽緩沖液)取Na2CO30.16g和NaHCO30.29g，蒸餾水加至100ml；b)稀釋液(PH7.2磷酸鹽緩沖液)取Na2HPO4·12H2O2.9g、KH2PO40.2g、NaCL8.0g和KCL0.2g蒸餾水加至1000ml；c)封閉液取上述稀釋液500ml加入牛血清白蛋白2.5g和Tween-20 0.25ml即可；d)洗滌液取上述稀釋液200ml加入表面活性劑Tween-20 0.1ml即可；e)底物緩沖液(0.1mol/L PH5.0磷酸鹽-檸檬酸緩沖液)取Na2HPO4·12H2O 1.8g和檸檬酸0.52g，蒸餾水加至100ml，4℃存放，用前加H2O2；f)終止液(2.0mol/LH2SO4)取濃硫酸55.5ml加蒸餾水444.5ml即可；g)包被材料血源純化乙肝表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎表面抗體(單克隆抗-HBs)均由北京科衛(wèi)臨床診斷試劑廠提供；鼠抗雞IgY由北京成文免疫化學(xué)研究所提供，其中辣根過氧化物酶標(biāo)記鼠抗雞IgY和單克隆抗-HBs自行按照過碘酸鈉法標(biāo)記。
h)酶標(biāo)反應(yīng)底物用四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。
3)試驗(yàn)設(shè)備酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(國(guó)產(chǎn)Biocell2010型)、37℃水浴箱、48孔或96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板、微量移液器(50μl、100μl)4)間接法ELISA檢測(cè)操作步驟a)取包被材料血源純化乙肝表面抗原(HBsAg)或乙型肝炎表面抗體(單克隆抗-HBs)，用包被液稀釋成100μg/ml，取100μl/孔量分別加入聚苯乙烯酶標(biāo)板孔中，于4℃吸附過夜；b)取上述已包被過夜的酶標(biāo)板，用洗滌液洗3次，每次3分鐘；然后每孔加入200μl封閉液，于4℃封閉過夜；再用洗滌液洗3次，每次3分鐘；待干后備用(如暫時(shí)不用置4℃存放)；c)分別取上述實(shí)施例1第二、三、四條中所制備的乙肝特異性蛋黃抗體IgY、蛋黃抗獨(dú)特型抗體、蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨(dú)特型抗體的混合物，分別進(jìn)行1∶1至1∶4096的比例稀釋，取各種不同的稀釋樣品分別加入各自相應(yīng)的檢測(cè)酶標(biāo)板孔中，每孔100μl，同時(shí)設(shè)立空白、陰性和陽性對(duì)照孔；d)于37℃孵育反應(yīng)1小時(shí)后用洗滌液洗4次，每次5分鐘；e)每孔加入100μl辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗雞IgY抗體(二抗)，37℃孵育反應(yīng)1小時(shí)后用洗滌液洗5次，每次3分鐘；
f)配制底物溶液用前取0.1mol/L PH5.0磷酸鹽-檸檬酸緩沖液7.0ml，加入3％H2O290μl和10mg/ml的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液0.1ml，混勻避光備用；g)加入新配制的底物溶液100μl/孔，保溫15分鐘，然后加入終止液(2.0mol/LH2SO4)50μl/孔以終止反應(yīng)；h)將酶標(biāo)板放入酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀中，波長(zhǎng)450nm，以空白對(duì)照調(diào)零，讀取各孔吸光度(OD)值；i)結(jié)果計(jì)算按照公式P/N≥2.1為陽性，否則P/N≤2.1為陰性，其中P為待測(cè)標(biāo)本OD值，N為陰性對(duì)照OD值。
5)結(jié)果判斷以P/N≥2.1為陽性的最大稀釋度作為其效價(jià)。
6)檢測(cè)結(jié)果按照上述間接法ELISA檢測(cè)操作對(duì)實(shí)施例1中第六條所制備的乙肝特異性免疫原性組合物中各組成成分的效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，其檢測(cè)結(jié)果見表1。
二、重組質(zhì)粒拷貝值(copy/ml)的檢測(cè)用熒光定量PCR(試劑由上海復(fù)星公司提供)方法。用本法對(duì)實(shí)施例1第六條中所制備的乙肝特異性免疫原性組合物I中重組DNA質(zhì)粒的效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，其檢測(cè)結(jié)果見表1。
表1乙肝特異性免疫原性組合物I中各組分效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乙肝表面抗原的效價(jià)為1∶512，乙型肝炎表面抗原特異性蛋黃抗體IgY的效價(jià)為1∶256，乙肝特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體的效價(jià)為1∶128；乙肝特異性重組DNA質(zhì)粒3.8×107copy/ml。
二、免疫原性組合物中重組DNA的鑒定(以乙肝表面抗原重組DNA質(zhì)粒為例)重組質(zhì)粒體外表達(dá)產(chǎn)物的鑒定重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞將生長(zhǎng)期293T細(xì)胞鋪于100mm培養(yǎng)皿，分別取提純的pJW4303/HBV-S2.S及pJW4303(空載對(duì)照質(zhì)粒)約20μg，用磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(一種用于瞬間轉(zhuǎn)染的人胚腎細(xì)胞系)，培養(yǎng)72h(37℃，5％CO2)。
表達(dá)產(chǎn)物的回收將培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液以800r/min，離心5min后收集上清待測(cè)。同時(shí)收集細(xì)胞，用裂解劑裂解，4℃條件下12000r/min，離心1h后取上清待測(cè)。
表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清和細(xì)胞裂解產(chǎn)物上清中的HBsAg和preS2，測(cè)定值以450nm的吸光度A值表示。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞培養(yǎng)液上清中HBsAg的效價(jià)為1∶32、preS2的效價(jià)為1∶16；細(xì)胞裂解產(chǎn)物上清中的HBsAg的效價(jià)為1∶2048、preS2的效價(jià)為1∶512。
三、蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨(dú)特型抗體的鑒定(以乙肝蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨(dú)特型抗體為例)用聚丙烯酰胺凝膠(PADE)電泳(濃縮膠濃度為5％)對(duì)乙型肝炎表面抗原特異性蛋黃抗體IgY和乙型肝炎表面抗體特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體進(jìn)行純度鑒定，電泳中均出現(xiàn)一條電泳帶，其純度≥95％。
用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PADE)電泳，分離膠長(zhǎng)度為8％，濃縮膠濃度為5％，穩(wěn)流10mA電泳5小時(shí)；測(cè)得乙型肝炎表面抗原特異性蛋黃抗體IgY和乙型肝炎表面抗體特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體的分子量均為180KD。
四、免疫原性組合物的穩(wěn)定性試驗(yàn)(以乙肝特異性免疫原性組合物I為例)取上述實(shí)施例1第六條中所制備的乙肝特異性免疫原性組合物I，以10mg/管分裝小試管中，分別于-20℃冰凍、4℃、室溫和37℃保存，其中37℃保存屬于熱破壞性試驗(yàn)。再定期進(jìn)行其效價(jià)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乙肝特異性免疫原性組合物于4℃保存，其穩(wěn)定性至少可保持12個(gè)月以上；于-20℃冰凍保存，其穩(wěn)定性至少可保持6個(gè)月以上；于室溫(20℃)保存，其穩(wěn)定性至少可保持2個(gè)月以上。該免疫原性組合物I以4℃保存穩(wěn)定性最好。
五、免疫原性組合物中特異性復(fù)合物的檢測(cè)(以乙肝特異性免疫原性組合物I為例)用4％的聚乙二醇6000(PEG6000)檢測(cè)上述實(shí)施例1中第六條所制備的乙肝特異性免疫原性組合物I中特異性復(fù)合物的含量將4％PEG6000溶液與1∶100稀釋的待檢免疫原性組合物溶液混合，置4℃冰箱過夜后離心，將沉淀物用4％PEG6000溶液充分洗滌，重新溶解于0.01mol/L的NaOH中，在波長(zhǎng)280nm下測(cè)量溶液的吸光度；也可利用散射比濁法直接測(cè)定PEG沉淀的免疫復(fù)合物；以不同濃度的熱聚合IgG作為參考標(biāo)準(zhǔn)來計(jì)算免疫復(fù)合物的含量。結(jié)果表明乙肝特異性免疫原性組合物I中的免疫復(fù)合物占45％另取上述乙肝特異性免疫原性組合物I經(jīng)瓊脂擴(kuò)散和免疫印跡鑒定含有乙型肝炎表面抗原-蛋黃抗體IgY-蛋黃抗獨(dú)特型抗體的特異性免疫結(jié)合復(fù)合物和乙型肝炎表面抗原特異性蛋黃抗體IgY-蛋黃抗獨(dú)特型抗體的特異性免疫結(jié)合復(fù)合物。
六、免疫原性組合物生物安全性試驗(yàn)(以乙肝特異性免疫原性組合物I為例)毒性實(shí)驗(yàn)用體重18-20g小白鼠10只，每腹腔注射上述實(shí)施例1中第六條所制備的乙肝特異性免疫原性組合物I0.5ml(6.0mg/ml)，連續(xù)觀察7天，小白鼠的體重?zé)o一例減輕，無一例死亡，亦未發(fā)現(xiàn)任何不良反應(yīng)。乙肝特異性免疫原性組合物的毒性實(shí)驗(yàn)表明該免疫原性組合物具有較高的生物安全性。
實(shí)驗(yàn)例2鴨乙型肝炎病毒感染模型的制備用乙型肝炎病毒DNA陽性血清150μl對(duì)15日齡雛鴨進(jìn)行腹腔注射，每隔15天對(duì)鴨血清進(jìn)行乙型肝炎病毒表面抗原(用雙抗體夾心ELISA法)和乙型肝炎病毒DNA(用聚合酶鏈反應(yīng)法)檢測(cè)，以持續(xù)3個(gè)月鴨乙型肝炎病毒表面抗原和乙型肝炎病毒DNA均為陽性作為鴨乙型肝炎病毒感染模型成功建立的標(biāo)志。
實(shí)驗(yàn)例3乙肝特異性免疫原性組合物I的動(dòng)物試驗(yàn)用上述實(shí)施例1中第六條所制備的乙肝特異性免疫原性組合物I對(duì)鴨乙型肝炎病毒感染模型進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，其中鴨血清乙肝表面抗原滴度(IU/ml)和鴨血清乙肝表面抗體滴度(IU/ml)的檢測(cè)用雙夾心ELISA法(試劑均由上海榮盛生物技術(shù)試劑有限公司提供)，鴨血清乙肝DNA拷貝值(copy/ml)的檢測(cè)用熒光定量PCR(試劑由上海復(fù)星公司提供)方法；其實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。
表2實(shí)施例1制備的乙肝特異性免疫原性組合物的動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組用皮下注射乙肝特異性免疫原性組合物I的乙型肝炎病毒感染鴨，在經(jīng)過三周的免疫注射后，用ELISA檢測(cè)感染鴨血清中的乙型肝炎表面抗原，其轉(zhuǎn)陰率為50％；用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)感染鴨血清中的乙型肝炎病毒DNA，其轉(zhuǎn)陰率為50％；用ELISA檢測(cè)感染鴨血清中的乙型肝炎表面抗體，其轉(zhuǎn)陽率為40％。而對(duì)照組(對(duì)感染鴨皮下注射人用重組乙肝疫苗)感染鴨血清中乙型肝炎表面抗原的轉(zhuǎn)陰率僅為10％、乙型肝炎病毒DNA的轉(zhuǎn)陰率僅為20％、乙型肝炎表面抗體的轉(zhuǎn)陽率僅為10％。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明本乙肝特異性免疫原性組合物I的治療作用具有特異性強(qiáng)、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)；該乙肝特異性免疫原性組合物I中的乙肝表面抗原、蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨(dú)特型抗體及其免疫復(fù)合物更有利于抗獨(dú)特型抗體模擬“內(nèi)影像”抗原性的提呈，并且上述乙肝特異性免疫原性組合物I及其免疫復(fù)合物比單純采用乙肝疫苗可誘生更高滴度的抗體產(chǎn)生和淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，從而更有效地誘生體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，以達(dá)到對(duì)抗乙肝病毒保護(hù)肝臟組織細(xì)胞的目的。
實(shí)驗(yàn)例4乙肝特異性免疫原性組合物的臨床初步應(yīng)用結(jié)果通過對(duì)31例乙肝患者(其中慢性乙肝23例，活動(dòng)性乙肝10例，乙肝病毒攜帶者8例)分別給予單獨(dú)藥物(干擾素300萬單位)、實(shí)施例1中第六條所制備乙肝特異性免疫原性組合物I(稱組合物I)和實(shí)施例1中第八條所制備乙肝特異性免疫原性組合物II(稱組合物II)，并進(jìn)行療效觀察和比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乙肝病毒表面抗原HBsAg轉(zhuǎn)陰率組合物8(58.1％)明顯高于組合物6)(38.7％)和單獨(dú)藥物組(9.7％)；乙肝病毒HBeAg轉(zhuǎn)陰率后兩組(54.8％)明顯優(yōu)于單獨(dú)藥物組(12.9％)；乙肝病毒HBVDNA轉(zhuǎn)陰率后兩組(51.6％)明顯優(yōu)于單獨(dú)藥物組(6.5％)；后兩組患者血清ALT、DBIL及TNF-α水平明顯低于單獨(dú)藥物組。表明乙肝表面抗原特異性蛋黃抗體IgY-氧化苦參堿導(dǎo)向治療具有特異性強(qiáng)、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)；本乙肝特異性免疫原性組合物II不僅具有免疫原性組合物I所具備的免疫協(xié)調(diào)和治療作用，能夠產(chǎn)生激活機(jī)體細(xì)胞及體液免疫的雙重作用，而且該免疫原性組合物II還具有針對(duì)于乙肝病毒的生物導(dǎo)彈功能，因此對(duì)于乙肝病毒具有更強(qiáng)的特異性靶向殺傷能力，從而達(dá)到對(duì)抗乙肝病毒保護(hù)肝臟組織細(xì)胞的目的。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防和治療疾病的免疫原性組合物，主要是由抗原、抗體和重組DNA組成，其特征在于由有效量的抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體、重組DNA和藥用敷料組成，其中抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體是純化或重組的特異性抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體；重組DNA是能夠表達(dá)所述特異性抗原、抗體和抗獨(dú)特型抗體中的任一種或其多種的重組DNA質(zhì)粒；其中各組分重量比分別為抗原 0.001～99％抗體 0.001～99％抗獨(dú)特型抗體 0.001～99％重組DNA0.01～99％藥用敷料 0.01～99％
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其特征在于；在該免疫原性組合物中還含有特異性抗原Ag、抗體Ab和抗獨(dú)特型抗體Ab2特異性結(jié)合后所形成的免疫復(fù)合物；所述抗獨(dú)特型抗體包括Ab2α、Ab2β、Ab2γ、Ab2ε中的任一種或其組合；所述免疫復(fù)合物包括抗原-抗體復(fù)合物Ag-Ab、抗原-抗體-抗獨(dú)特型抗體復(fù)合物Ag-Ab-Ab2α、Ag-Ab-Ab2β、Ag-Ab-Ab2γ、Ag-Ab-Ab2ε和抗體-抗獨(dú)特型抗體復(fù)合物Ab-Ab2α、Ab-Ab2β、Ab-Ab2γAb-Ab2ε中的任一種或其組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫原性組合物，其特征在于所述抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體和重組DNA是分別針對(duì)于同一種或同一類疾病相應(yīng)免疫原的動(dòng)物源性或人源性特異性抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體和重組DNA；所述抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體是通過分離、純化和基因工程技術(shù)包括噬菌體展示多肽、細(xì)菌表面展示多肽和人工合成多肽中的任一種或其組合途徑獲得的；所述抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體和重組DNA是針對(duì)于腫瘤免疫原、傳染性疾病病原體免疫原、自身免疫病免疫原、過敏性疾病變應(yīng)原、移植器官免疫原和畜禽傳染病病原體免疫原的動(dòng)物源性或人源性抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體和重組DNA；所述抗獨(dú)特型抗體是針對(duì)于上述免疫原所對(duì)應(yīng)的特異性抗體包括蛋黃抗體IgY的抗獨(dú)特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε中的任一種或其組合物；所述重組DNA是能夠表達(dá)上述疾病特異性抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體的重組DNA；所述免疫原包括惡性腫瘤、傳染性疾病、自身免疫病、過敏性疾病、器官移植排斥和畜禽傳染病病原體特異性的純化或重組抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體、重組DNA、組織細(xì)胞和細(xì)胞因子及其受體；所述免疫原是蛋白質(zhì)、多肽、粘多糖、脂多糖、糖蛋白、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞表面受體、核蛋白、DNA、RNA、線粒體、微粒體中的任一種或其組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫原性組合物，其特征在于所述免疫原性組合物包括腫瘤特異性免疫原性組合物、傳染性疾病病原體特異性免疫原性組合物、自身免疫病特異性免疫原性組合物、過敏性疾病變應(yīng)原特異性免疫原性組合物、移植器官特異性免疫原性組合物中的任一種或其組合；所述免疫原性組合物包括畜禽傳染病病原體特異性免疫原性組合物；所述免疫原性組合物是其納米微粒或脂質(zhì)體復(fù)合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫原性組合物，其特征在于在該免疫原性組合物中還含有藥用輔料；所述藥用輔料包括包衣材料、蛋白穩(wěn)定劑、藥用佐劑、免疫增強(qiáng)劑，其中包衣材料為丙烯酸樹脂、羥丙基甲基纖維素及其衍生物；蛋白穩(wěn)定劑為聚乙二醇、蔗糖、海藻糖；藥用佐劑為氫氧化鋁、表面活性劑、福氏佐劑；免疫增強(qiáng)劑為多聚糖、糖肽、糖脂和磷脂，其中脂類包括三棕櫚酰絲氨酰甘油基半胱氨酸、單棕櫚脂酸、雙棕櫚脂酸、三棕櫚脂酸、棕櫚酰賴氨酸、α-氨基十六烷酸、月桂酰肽脂中的任一種；所述脂類是以分子內(nèi)佐劑的形式與上述免疫原性組合物中的特異性抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體和重組DNA結(jié)合成復(fù)合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫原性組合物，其特征在于在該免疫原性組合物中還含有免疫偶聯(lián)物；所述免疫偶聯(lián)物包括上述疾病病原體特異性抗體與放射性核素、藥物和毒素以及細(xì)胞因子的偶聯(lián)物中的任一種或其組合；其中所述放射性核素包括碘131I、磷32P、鍶89Sr、釔90Y、釤153Sm、錸188Re中的任一種或其組合；所述藥物包括抗癌藥物、抗病毒藥物、抗菌素、免疫調(diào)節(jié)藥物和免疫抑制劑中的任一種或其組合；所述毒素包括包括篦麻籽毒素、相思子毒素、苦瓜毒素、氧化苦參堿、去甲斑蝥素、白喉毒素、假單胞菌內(nèi)毒素以及綠膿桿菌外毒素中的任一種或其組合；所述細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子、趨化因子中的任一種或其組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫原性組合物，其特征在于該免疫原性組合物是任一種藥劑學(xué)上所述的劑型；所述劑型包括注射劑、膠囊、口服液、氣霧劑、貼劑中的任一種劑型。
8.一種預(yù)防和治療疾病的免疫原性組合物的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)采用蛋白質(zhì)鹽析、柱層析純化疾病特異性抗原或通過基因重組的辦法制備疾病病原體特異性抗原；所述疾病病原體特異性抗原包括人類腫瘤、傳染性疾病、自身免疫病、器官移植排斥及畜禽傳染病病原體的純化或重組特異性抗原；即得到該免疫原性組合物組分之一抗原；2)通過免疫動(dòng)物制備針對(duì)于上述抗原的單克隆或多克隆抗體；或通過基因重組的辦法制備上述疾病相關(guān)病原體抗原的特異性抗體；即得到該免疫原性組合物組分之一抗體；3)以步驟1)制備的疾病相關(guān)病原體特異性抗原為免疫原，多次重復(fù)免疫注射給禽類優(yōu)選是雞，待5-20天后禽類尤其是雞的產(chǎn)蛋中即含有針對(duì)于上述疾病相關(guān)病原體特異性免疫原的蛋黃抗體IgY；所述的免疫原注射量為1-2ml，免疫原量10-500μg/ml+等量完全弗氏佐劑；4)禽蛋尤其是雞蛋去殼取黃，經(jīng)滅菌處理后，先用5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液稀釋蛋黃；然后自-20℃到室溫反復(fù)凍融，每分鐘500-1000轉(zhuǎn)低速離心后合并上清液備用；再向上清液中加入乙醇至終濃度為30-50％，靜置沉淀后，取沉淀備用；最后取沉淀通過進(jìn)一步浸提、萃取、濃縮、純化、冷凍或噴霧干燥，即得到該免疫原性組合物組分之一蛋黃抗體IgY；5)取步驟2)制備的針對(duì)于上述病原體抗原的抗體或步驟4)制備的蛋黃抗體IgY為免疫原，多次重復(fù)免疫注射給禽類優(yōu)選是雞，待5-20天后禽類尤其是雞的產(chǎn)蛋中即含有針對(duì)于上述相應(yīng)抗體包括蛋黃抗體IgY的蛋黃抗獨(dú)特型抗體；所述的免疫原抗體Ab1的注射量為1-2ml，免疫原抗體Ab1的用量為10-2000μg/ml+等量完全弗氏佐劑；6)重復(fù)步驟4)的過程，即得到該免疫原性組合物組分之一蛋黃抗獨(dú)特型抗體；7)取特異性基因片段經(jīng)過聚合酶鏈反應(yīng)后，提取和純化表達(dá)上述疾病特異性抗原、抗體和抗獨(dú)特型抗體的DNA片段，通過酶切后，與相應(yīng)分子克隆載體重組，構(gòu)建成上述疾病特異性抗原、抗體和抗獨(dú)特型抗體的真核表達(dá)質(zhì)粒，即得到該免疫原性組合物組分之一重組DNA；8)根據(jù)實(shí)際需要按重量配比調(diào)制步驟1)所得的抗原、步驟2)所得的抗體或步驟4)所得的蛋黃抗體IgY、步驟6)所得的蛋黃抗獨(dú)特型抗體和步驟7)所得的重組DNA，再輔以可接受量的藥用輔料即得到所述的免疫原性組合物，其中各組分重量比分別為抗原0.001～99％抗體0.001 ～99％抗獨(dú)特型抗體0.001～99％重組DNA 0.01～99％藥用敷料0.01～99％9)取步驟8)制備的免疫原性組合物經(jīng)過無菌、安全及毒性試驗(yàn)合格后，再通過相應(yīng)的制劑工藝制備成藥劑學(xué)上相應(yīng)的劑型；所述劑型包括注射劑、膠囊、口服液、氣霧劑、貼劑中的任一種劑型。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于包括以下步驟1)提取純化或重組疾病相關(guān)病原體特異性抗原；2)提取純化或重組疾病相關(guān)病原體特異性抗體；3)分別取上述抗原和抗體包括蛋黃抗體IgY作為免疫原，分別連續(xù)或同時(shí)多次重復(fù)免疫注射給禽類優(yōu)選是雞；還可將上述抗原和抗體包括蛋黃抗體IgY按1∶1比例混合后作為免疫原進(jìn)行免疫注射；待5-20天后禽類尤其是雞的產(chǎn)蛋中即同時(shí)含有針對(duì)于上述抗原的蛋黃抗體IgY和針對(duì)于上述抗體包括蛋黃抗體IgY的特異性蛋黃抗獨(dú)特型抗體；4)取上一步驟所得的禽蛋或雞蛋，經(jīng)滅菌處理后，先用5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液稀釋蛋黃；然后自-20℃到室溫反復(fù)凍融，每分鐘500-1000轉(zhuǎn)低速離心后合并上清液備用；再向上清液中加入乙醇至終濃度為30-50％，靜置沉淀后，取沉淀備用；最后取沉淀通過進(jìn)一步浸提、萃取、濃縮、純化、冷凍或噴霧干燥；如此一次性提取純化，可同時(shí)得到蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨(dú)特型抗體組合物；5)取特異性基因片段經(jīng)過聚合酶鏈反應(yīng)后，提取和純化表達(dá)上述疾病特異性抗原、抗體和抗獨(dú)特型抗體的DNA片段，通過酶切后，與相應(yīng)分子克隆載體重組，構(gòu)建成上述疾病特異性抗原、抗體和抗獨(dú)特型抗體的真核表達(dá)質(zhì)粒，即得到該免疫原性組合物組分之一重組DNA；6)根據(jù)實(shí)際需要按重量配比調(diào)制步驟1)所得的抗原、步驟2)所得的抗體、步驟4)所得的蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨(dú)特型抗體組合物和步驟5)所得的重組DNA，再輔以可接受量的藥用輔料即得到所述的免疫原性組合物，其中各組分重量比分別為抗原 0.001～99％抗體 0.001～99％抗獨(dú)特型抗體 0.001～99％重組DNA0.01～99％藥用敷料 0.01～99％7)取步驟6)制備的免疫原性組合物經(jīng)過無菌、安全及毒性試驗(yàn)合格后，再根據(jù)實(shí)際需要，通過相應(yīng)的制劑工藝制備成藥劑學(xué)上相應(yīng)的劑型；所述劑型包括注射劑、膠囊、口服液、氣霧劑、貼劑中的任一種劑型。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-2或8-9所述的免疫原性組合物的用途，其特征在于應(yīng)用于制備疾病生物預(yù)防和治療劑以及食品、保健品添加劑，特別是應(yīng)用于制備人類惡性腫瘤、傳染性疾病、自身免疫病、過敏性疾病和器官移植排斥的治療性疫苗以及食品、保健品添加劑；應(yīng)用于制備畜禽傳染病的治療性疫苗以及畜禽飼料添加劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種預(yù)防和治療疾病的免疫原性組合物及其制備方法，主要是由特異性抗原、抗體、抗獨(dú)特型抗體、重組DNA和藥用敷料組成。本發(fā)明具有療效確切、特異性強(qiáng)、決定簇廣并能進(jìn)行集約化大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，尤其是能避免HAMA反應(yīng)和異質(zhì)性問題，且無毒副作用、安全性好。適用于作為人類惡性腫瘤、傳染性疾病、自身免疫病、過敏性疾病和器官移植排斥的治療性疫苗以及食品、保健品添加劑；還適用于作為畜禽傳染病的治療性疫苗以及畜禽飼料添加劑。
文檔編號(hào)A61K9/48GK1557487SQ20041000117
公開日2004年12月29日 申請(qǐng)日期2004年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月29日
發(fā)明者郭占軍, 趙華, 郭愛芹, 楊煥云, 趙歧剛, 關(guān)濤, 吳軍英, 趙清秀 申請(qǐng)人:郭占軍