專利名稱：礦化絲蛋白材料及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種礦化絲蛋白材料及其制備方法，尤其是涉及一種可用于骨修復的礦化絲蛋白材料及其制備方法，屬于生物醫(yī)用材料領域。
背景技術：
許多昆蟲如家蠶、柞蠶等及許多種類的蜘蛛都能夠生產大量絲蛋白。絲蛋白除了被用于傳統(tǒng)的紡織原料外，在化妝品、食品、制藥、化工、新材料等領域正被不斷得到開發(fā)和利用。隨著分子生物學和生物技術的進步，研究人員能夠從分子水平上對絲蛋白進行研究，通過轉基因方法經濟、高效的生產絲蛋白成為許多科學家共同的奮斗目標。目前，對蠶絲和蜘蛛絲蛋白的轉基因研究獲得了長足進步，已經基本認識到不同絲蛋白的結構組成規(guī)律，性質和功能上的巨大差異，認識到絲蛋白從基因控制到自組裝原理進行液晶紡絲，涉及了材料科學、生物物理學和分子生物學等眾領域的科學知識，絲蛋白也成為研究分級結構和蛋白質材料的實用模型(David J.Kaplan，Spiderless spider webs.Nature Biotechnology，2002，20239-240)。
絲蛋白是主要是由絲素和絲膠兩種蛋白構成。絲膠蛋白具有較差的生物相容性，以及引發(fā)超敏反應。將絲蛋白在低濃度碳酸鈉、氫氧化鈉等溶液中水煮的方法將其和絲素蛋白分離，也可以在所述溶液中加入表面活性劑以去除絲蛋白中含有的少量蠟質。絲素蛋白則具有良好的生物相容性，同時還具有其它獨特的優(yōu)異性能，如可降解性、較高的機械強度、易加工性能等，這使它在生物醫(yī)用材料領域的研究也引起了廣泛的關注。迄今為止，絲素蛋白已經被用于固定化酶的載體、藥物緩釋載體、隱形眼鏡、人工肌腱與韌帶、人工皮膚、抗凝血材料等，部分研究成果已經進入臨床應用。所以本發(fā)明中所用的絲蛋白材料為脫膠以后獲得的絲素蛋白。
目前臨床骨修復所用到的自體骨和異體骨存在來源短缺、免疫排斥和感染疾病的危險。生物骨組織的主要成分是膠原蛋白和羥基磷灰石。純的羥基磷灰石具有優(yōu)異的生物相容性、骨傳導性和生物活性，已被廣泛用于整形外科手術和齒科手術。但是純的羥基磷灰石脆性大，韌性差，并且易從植入部位脫落，在臨床上限制了它的使用。崔福齋等(納米相鈣磷鹽/膠原/聚乳酸骨復合多孔材料的制備方法，申請?zhí)?0107493.8，公開號CN 1272383A，授權)用仿生方法使膠原蛋白來改善羥基磷灰石的性質，取得了較好的醫(yī)療效果。但由于所用膠原蛋白提純工藝復雜，成本高；由于目前所用膠原蛋白主要來源于動物，存在一定的安全性問題；目前基因工程法生產的重組人膠原蛋白已經問世，但其醫(yī)用安全性、適用效果尚待檢驗。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種可用于骨修復的絲蛋白/鈣磷鹽復合材料，該材料生物相容性好，可誘導骨生長，同時還有價格便宜的特點。
發(fā)明的另一目的是提供一種絲蛋白/鈣磷鹽復合材料的制備方法。
本發(fā)明提出的一種礦化絲蛋白材料，其特征在于該材料中含有機成分和礦物質，所述有機成分為脫膠絲蛋白，所述礦物質為鈣磷鹽晶體。
在上述礦化絲蛋白材料中，所述材料中的絲蛋白來自昆蟲絲、蜘蛛絲或轉基因絲。
在上述礦化絲蛋白材料中，所述昆蟲絲為家蠶絲、野蠶絲、柞蠶絲、天蠶絲、蓖麻蠶絲、樗蠶絲或蓑袋蛾昆蟲絲。
在上述礦化絲蛋白材料中，所述絲蛋白為水溶性絲素蛋白。
在上述礦化絲蛋白材料中，所述鈣磷鹽晶體包含羥基磷灰石。
本發(fā)明提出的一種礦化絲蛋白材料的制備方法，其特征在于所述方法依次包括下列步驟(1)在絲蛋白溶液中滴加含有鈣離子的溶液，使溶液中絲蛋白的質量百分比濃度最終為0.3％-30％，鈣離子的摩爾濃度最終為0.01～2mol/L，滴加過程中需要不斷攪拌；(2)在步驟(1)的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加含有磷酸根離子的水溶液，加入的磷酸根離子與鈣離子的摩爾比為Ca∶P＝1～2∶1；(3)在步驟(2)的溶液中邊攪拌邊調節(jié)pH值為7.4～13；(4)將上述溶液攪拌后靜置，待沉淀與上清分層后，除去上清，離心分離出沉淀，用去離子水反復洗滌去掉可溶性鹽分，使洗滌液呈中性；(5)將沉淀物放入凍干機內冷凍干燥，隨后將干燥物研磨，即得礦化絲蛋白材料。
在上述制備方法中，所述步驟(1)、(2)中，先加入磷酸根離子，再加入鈣離子。
本發(fā)明所制備的復合材料中的鈣磷鹽的成分主要是骨礦的主要成分羥基磷灰石，尺寸達到納米量級，所制備的復合材料具有較好的生物相容性和生物活性。


圖1為本發(fā)明絲蛋白/鈣磷鹽復合材料的XRD圖，其中a商品化的羥基磷灰石；b礦化絲蛋白材料。
圖2為本發(fā)明絲蛋白/鈣磷鹽復合材料的FT-IR，其中圖a絲素蛋白；b礦化絲蛋白材料；c商品化的羥基磷灰石。
圖3為本發(fā)明絲蛋白/鈣磷鹽復合材料的SEM圖。
圖4為本發(fā)明絲蛋白/鈣磷鹽復合材料的SEM圖。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明做進一步說明本發(fā)明中所用的絲蛋白來源可以為昆蟲絲、蜘蛛絲或轉基因絲，昆蟲絲可以為家蠶、野蠶、柞蠶、天蠶、蓖麻蠶、樗蠶、蓑袋蛾昆蟲絲等，使用前要將絲中的絲膠蛋白脫除，發(fā)明中優(yōu)選家蠶絲和柞蠶絲。將脫膠的家蠶絲素蛋白溶于沸騰的質量濃度為40-50％的氯化鈣溶液中或者將脫膠的柞蠶絲溶解于120℃的6-8mol/L的硝酸鈣，都可以使絲素蛋白溶解，然后將溶解的絲素蛋白經過脫鹽、濃縮處理。本發(fā)明所用的絲蛋白即經脫膠處理后的絲素蛋白。
本發(fā)明中所用的含磷酸根離子的溶液為磷酸和磷酸鹽，所用的磷酸鹽可以為磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二氨、磷酸二氫氨；所用的含鈣離子的溶液可以為氫氧化鈣和鈣鹽，鈣鹽可以為硝酸鈣、氯化鈣；所用的堿液可以為堿金屬氫氧化物或氫氧化銨，試驗中一般選用氫氧化鈉。所用試劑均為分析純。
本發(fā)明提出的礦化絲蛋白材料的制備方法主要包括下列步驟(1)在絲蛋白溶液中滴加含有鈣離子的溶液，使溶液中絲蛋白的質量百分比濃度最終為0.3％-20％，鈣離子的摩爾濃度最終為0.01～2mol/L，滴加過程中需要不斷攪拌；(2)上述第一步的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加含有磷酸根離子的水溶液，加入的磷酸根離子的量與加入的鈣離子的量的摩爾比為Ca∶P＝1～2∶1；(3)在上述第二步的溶液中邊攪拌邊緩慢調節(jié)pH值為7.4～13，(4)將溶液攪拌后靜置，待沉淀與上清分層后，除去上清，離心分離出沉淀，用去離子水反復洗滌去掉可溶性鹽分，并洗滌至中性后，放入凍干機內冷凍干燥，隨后將干燥物研磨制得干粉，即為骨修復材料。
實施例11)在調好的濃度為0.9％的500ml絲蛋白溶液中，滴加500ml濃度為0.25mol/L的Ca(OH)2溶液后，繼續(xù)緩慢加入濃度為0.25mol/L的NaH2PO4溶液300ml，滴加的同時用磁力攪拌器混合均勻。
2)將上述體系攪拌、靜置，除去上清，離心分離出沉淀，用去離子水反復洗滌去掉其中的鹽分并達到到中性后，放入凍干機內冷凍干燥，隨后將干燥物研磨制得干粉。
實施例21)在調好的濃度為33％的450ml絲蛋白溶液中，加入25ml濃度為0.2mol/L的CaCl2溶液后，繼續(xù)緩慢滴加濃度為0.2mol/L的Na2HPO4溶液25ml，滴加的同時用磁力攪拌器混合均勻。
2)在上述第一步的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加NaOH溶液，直至pH值穩(wěn)定為7.4。
3)將上述體系攪拌、靜置，除去上清，離心分離出沉淀，用去離子水反復洗滌去掉其中的鹽分并達到到中性后，放入凍干機內冷凍干燥，隨后將干燥物研磨制得干粉。
實施例31)在調好的濃度為10％的100ml絲蛋白溶液中，加入濃度為2mol/L的KH2PO4溶液500ml，繼續(xù)緩慢滴加400ml濃度為5mol/L的Ca(NO3)2溶液后，滴加的同時用磁力攪拌器混合均勻。
2)在上述第一步的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加KOH溶液，直至pH值為8.0。
3)將上述體系攪拌、靜置，除去上清，離心分離出沉淀，用去離子水反復洗滌去掉其中的鹽分并達到到中性后，放入凍干機內冷凍干燥，隨后將干燥物研磨制得干粉。
實施例41)在調好的濃度為25％的450ml絲蛋白溶液中，加入25ml濃度為0.2mol/L的CaCl2溶液后，繼續(xù)緩慢滴加濃度為0.2mol/L的NH3H2PO4溶液25ml，滴加的同時用磁力攪拌器混合均勻。
2)在上述第一步的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加NaOH溶液，直至pH值穩(wěn)定為10.0。
3)將上述體系攪拌、靜置，除去上清，離心分離出沉淀，用去離子水反復洗滌去掉其中的鹽分并達到到中性后，放入凍干機內冷凍干燥，隨后將干燥物研磨制得干粉。
實施例51)調好的濃度為25％的200ml絲蛋白溶液中，加入濃度為2mol/L的K2HPO4溶液500ml，繼續(xù)緩慢滴加300ml濃度為5mol/L的Ca(NO3)2溶液后，滴加的同時用磁力攪拌器混合均勻。
2)在上述第一步的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加KOH溶液，直至pH值為9.0。
3)將上述體系攪拌、靜置，除去上清，離心分離出沉淀，用去離子水反復洗滌去掉其中的鹽分并達到到中性后，放入凍干機內冷凍干燥，隨后將干燥物研磨制得干粉。
實施例61)在調好的濃度為15％的200ml絲蛋白溶液中，加入500ml濃度為0.2mol/L的CaCl2溶液后，繼續(xù)緩慢滴加濃度為0.2mol/L的H3PO4溶液300ml，滴加的同時用磁力攪拌器混合均勻。
2)在上述第一步的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加NaOH溶液，直至pH值達到8.5。
3)將上述體系攪拌、靜置，除去上清，離心分離出沉淀，用去離子水反復洗滌去掉其中的鹽分并達到到中性后，放入凍干機內冷凍干燥，隨后將干燥物研磨制得干粉。
實施例71)調好的濃度為30％的200ml絲蛋白溶液中，加入500ml濃度為1mol/L的CaCl2溶液后，繼續(xù)緩慢滴加濃度為0.7mol/L的NaH2PO4溶液300ml，滴加的同時用磁力攪拌器混合均勻。
2)在上述第一步的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加NaOH溶液，直至pH值達到9.0。
3)將上述體系攪拌、靜置，除去上清，離心分離出沉淀，用去離子水反復洗滌去掉其中的鹽分并達到到中性后，放入凍干機內冷凍干燥，隨后將干燥物研磨制得干粉。
實施例81)在調好的濃度為25％的450ml絲蛋白溶液中，加入25ml濃度為1mol/L的Ca(NO3)2溶液后，繼續(xù)緩慢滴加濃度為1mol/L的KH2PO4溶液25ml，滴加的同時用磁力攪拌器混合均勻。
2)在上述第一步的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加NaOH溶液，直至pH值穩(wěn)定為9.5。
3)將上述體系攪拌、靜置，除去上清，離心分離出沉淀，用去離子水反復洗滌去掉其中的鹽分并達到到中性后，放入凍干機內冷凍干燥，隨后將干燥物研磨制得干粉。
權利要求
1.一種礦化絲蛋白材料，其特征在于該材料中含有機成分和礦物質，所述有機成分為脫膠絲蛋白，所述礦物質為鈣磷鹽晶體。
2.根據權利要求1所述的礦化絲蛋白材料，其特征在于所述材料中的絲蛋白來自昆蟲絲、蜘蛛絲或轉基因絲。
3.根據權利要求1或2所述的礦化絲蛋白材料，其特征在于所述昆蟲絲為家蠶絲、野蠶絲、柞蠶絲、天蠶絲、蓖麻蠶絲、樗蠶絲或蓑袋蛾昆蟲絲。
4.根據權利要求1或2所述的礦化絲蛋白材料，其特征在于所述絲蛋白為水溶性絲素蛋白。
5.根據權利要求1所述的礦化絲蛋白材料，其特征在于所述鈣磷鹽晶體包含羥基磷灰石。
6.一種制備如權利要求1所述的礦化絲蛋白材料的方法，其特征在于所述方法依次包括下列步驟(1)在絲蛋白溶液中滴加含有鈣離子的溶液，使溶液中絲蛋白的質量百分比濃度最終為0.3％-30％，鈣離子的摩爾濃度最終為0.01～2mol/L，滴加過程中需要不斷攪拌；(2)在步驟(1)的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加含有磷酸根離子的水溶液，加入的磷酸根離子與鈣離子的摩爾比為Ca∶P＝1～2∶1；(3)在步驟(2)的溶液中邊攪拌邊調節(jié)pH值為7.4～13；(4)將上述溶液攪拌后靜置，待沉淀與上清分層后，除去上清，離心分離出沉淀，用去離子水反復洗滌去掉可溶性鹽分，使洗滌液呈中性；(5)將沉淀物放入凍干機內冷凍干燥，隨后將干燥物研磨，即得礦化絲蛋白材料。
7.根據權利要求6所述的礦化絲蛋白材料的制備方法，其特征在于所述步驟(1)、(2)中，向絲蛋白溶液離子滴加順序可以改變?yōu)橄燃尤肓姿岣x子，再加入鈣離子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種礦化絲蛋白材料及其制備方法，屬于生物醫(yī)用材料領域。本發(fā)明提出的礦化絲蛋白材料中含有機成分和礦物質，所述有機成分為脫膠絲蛋白，所述礦物質為鈣磷鹽晶體。所述材料的制備方法是首先制備水溶性的脫膠絲蛋白，攪拌狀態(tài)下向此溶液中加入含鈣離子溶液，隨后緩慢注入含磷酸根離子的溶液，調節(jié)反應體系pH值，維持攪拌一定時間后將體系靜置，離心、洗滌，重復此過程使洗脫液至中性，將分離的沉淀真空干燥，即可制得礦化絲蛋白材料。該材料生物相容性好，可誘導骨生長，低成本，其鈣磷鹽晶體尺寸在納米量級。
文檔編號A61L27/00GK1562386SQ20041000345
公開日2005年1月12日 申請日期2004年3月19日 優(yōu)先權日2004年3月19日
發(fā)明者崔福齋, 孔祥東, 張敏 申請人:清華大學