專(zhuān)利名稱(chēng)：來(lái)自牛樟芝菌絲體的新混合物和化合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來(lái)自牛樟芝(Antrodia Camphorata)菌絲體的新混合物與化合物及其用途。本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的化合物的組合物或菌絲體。
背景技術(shù)：
在臺(tái)灣，牛樟芝(Polyporaceae，Aphyllophorales)的子實(shí)體作為中藥是眾所周知的。它僅生長(zhǎng)在臺(tái)灣地方性常綠Cinnamomun kanehirai(Hay)(Lauraceae)心材壁內(nèi)層。它很罕見(jiàn)且未被栽培出來(lái)。該子實(shí)體已經(jīng)被用來(lái)治療食物與藥物中毒、腹瀉、腹痛、高血壓、皮膚疥癬和肝癌。至今幾乎沒(méi)有報(bào)導(dǎo)生物活性研究。
在臺(tái)灣，牛樟芝又叫作牛樟菇，最近報(bào)導(dǎo)其為特征如下的新真菌種出現(xiàn)于子實(shí)體中的其擔(dān)孢子的圓柱型，虛軟的淀粉體骨架菌絲，苦味和亮黃棕色倒生至帽型(pileate)擔(dān)子果，以及純培養(yǎng)物中的厚垣孢子與anthroconidia。該新真菌種的生長(zhǎng)極為緩慢，并局限于以地方性樹(shù)木品種Cinnamomum kanehirai Hay(Lauraceae)為唯一宿主。牛樟芝的詳細(xì)描述與分類(lèi)學(xué)位置見(jiàn)述于Wu，S.-H.等人，Antrodiacinnamomea(牛樟芝)，New combination of a medicinal fungus inTaiwan，Bot.Bull.Acad.Sin.38273-275。
在臺(tái)灣民間醫(yī)藥中，認(rèn)為牛樟芝的子實(shí)體具有某些醫(yī)療效果。依照傳統(tǒng)方法將子實(shí)體磨制成干燥粉末或與其它草藥燉煮后口服，用來(lái)治療因中毒、腹瀉、腹痛、高血壓、皮膚疥癬和肝癌所引起的癥狀。然而至今幾乎沒(méi)有藥理學(xué)或臨床研究出現(xiàn)在文獻(xiàn)中。因?yàn)榫哂袊?yán)格的宿主特異性并且在自然中稀少，以及人工栽培失敗之故，“牛樟芝”在臺(tái)灣的價(jià)格十分昂貴。近年來(lái)，具高品質(zhì)的該真菌子實(shí)體已被販?zhǔn)壑翗O高的價(jià)錢(qián)，約是每千克15000美元。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供來(lái)自牛樟芝菌絲體的新混合物。
本發(fā)明的另一目的是提供來(lái)自牛樟芝菌絲體的新化合物。
本發(fā)明的再一目的是提供包含本發(fā)明的化合物的新組合物。
本發(fā)明的再一目的是提供包含本發(fā)明的化合物的新的牛樟芝菌絲體。


圖1顯示化合物2的HMBC相關(guān)。
圖2顯示本發(fā)明的化合物。
圖3顯示本發(fā)明的化合物4及5的NOE(核歐沃豪斯效應(yīng))相關(guān)。
圖4a-d顯示本發(fā)明的化合物3的試驗(yàn)結(jié)果。
圖5a-c顯示ACM(牛樟芝菌絲體粉末)水萃取物的試驗(yàn)結(jié)果。
圖6a-f顯示ACM乙醇萃取物的試驗(yàn)結(jié)果。
圖7a-e顯示本發(fā)明的化合物1的試驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供下式的化合物
其中X為N或O；R1為C1-10烷氧基、C2-10鏈烯氧基或C2-10炔氧基；R2為H、C1-10烷基、C2-10鏈烯基或C2-10炔基；且R3不存在，或?yàn)镠或羥基；條件是如果X為O，則R3不存在。
在本發(fā)明的化合物中，優(yōu)選R1為C2-6鏈烯氧基或C2-6炔氧基；更優(yōu)選R1為經(jīng)C1-6烷基取代的C2-6鏈烯氧基，而最優(yōu)選R1為經(jīng)甲基取代的丁烯氧基。在本發(fā)明的化合物中，優(yōu)選R2為C1-6烷基，最優(yōu)選R2為異丁基。
因此，本發(fā)明的優(yōu)選化合物為3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2，5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2，5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2，5-二酮、3R*，4S*-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮，或3R*，4R*-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮。
本發(fā)明的更優(yōu)選的化合物為3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2，5-二酮或3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2，5-二酮。
本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的化合物為3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2，5-二酮。
本發(fā)明亦提供來(lái)自牛樟芝菌絲體的混合物，其包含本發(fā)明的化合物。本發(fā)明的混合物制備自牛樟芝菌絲體的水或有機(jī)溶劑萃取物。該有機(jī)溶劑包括但不限于醇(如CH3OH、C2H5OH或C3H7OH)、酯(如乙酸乙酯)、烷(如己烷)及鹵代烷(如CH3Cl、C2H2Cl2)。優(yōu)選的有機(jī)溶劑為乙醇或不引起人的任何副作用的含乙醇的溶劑。本發(fā)明的混合物可減低收縮壓或增加高密度脂蛋白。此外，相同的混合物具有中樞膽堿能激動(dòng)、保肝、抗炎或抗腫瘤活性。詳言之，本發(fā)明的混合物可抑制選自肝、腸、骨、血、淋巴及乳房的細(xì)胞或組織的腫瘤。接受本發(fā)明的混合物的受試者包括但不限于人、哺乳動(dòng)物、小鼠、大鼠、馬、豬、雞、鴨、狗與貓。
本發(fā)明亦提供包含本發(fā)明的化合物的組合物。本發(fā)明的組合物可減低收縮壓或增加高密度脂蛋白。此外，本發(fā)明的組合物具有中樞膽堿能激動(dòng)、保肝、抗炎或抗腫瘤活性。詳言之，本發(fā)明的組合物可抑制選自肝、腸、骨、血、淋巴及乳房的細(xì)胞或組織的腫瘤。接受本發(fā)明的組合物的受試者包括但不限于人、哺乳動(dòng)物、小鼠、大鼠、馬、豬、雞、鴨、狗與貓。
本發(fā)明亦提供包含本發(fā)明的化合物的牛樟芝(Antrodia)菌絲體。優(yōu)選的菌絲體其至少1％原菌絲體的重量為本發(fā)明的化合物1-5的總重。最優(yōu)選的菌絲體其至少3％原菌絲體的重量為本發(fā)明的化合物1-5的總重。依先前深層液體發(fā)酵(submerged liquid fermentation)制備牛樟芝菌絲體，深層液體發(fā)酵如T.L.M.Stamford等人，F(xiàn)ood Science“Protein enrichment of cashew wastes for animal feeds”，來(lái)自http//www.unu.edu/unupress/food/8F101e/8F101E0b.htm。
實(shí)施例下列實(shí)施例是非限制性的，且僅代表本發(fā)明的各種態(tài)樣及特征。
一般實(shí)驗(yàn)程序以Yanagimoto小型熱臺(tái)熔點(diǎn)測(cè)定器測(cè)量熔點(diǎn)，且未校正。以JascoDIP-360自動(dòng)旋光儀測(cè)量旋光性。以Shimadzu UV-2200自記分光光度計(jì)測(cè)量紫外光譜。以Jasco FT/IR-230紅外分光計(jì)測(cè)量紅外光譜。以Varian Unity Plus 500光譜儀測(cè)量1H-和13C-NMR譜。以JeolJMS-AX 505 HAD質(zhì)譜儀在70eV的電離電壓下測(cè)量EIMS和HR-EIMS。采用BW-820MH(正相)和Chromatorex-ODS DM1020T(反相)(Fuji Silysia)的硅膠進(jìn)行柱色譜。
萃取與分離在回流下，將來(lái)自臺(tái)灣善笙生物科技股份有限公司，2001年10月的牛樟芝菌絲體粉末(60克)用氯仿萃取3小時(shí)，萃取三次。對(duì)氯仿萃取物(5.3克)進(jìn)行硅膠色譜，以正己烷-丙酮(19∶1-14∶6)和氯仿-甲醇(1∶1)洗脫，得到九個(gè)部分(Fr.1-9)。對(duì)第二部分進(jìn)行硅膠色譜，得到化合物1(8.7毫克)。對(duì)第四部分進(jìn)行正相與反相硅膠色譜，得到化合物2(13.6毫克)。對(duì)第五部分進(jìn)行硅膠色譜，以正己烷-丙酮(8∶2)洗提，得到麥角甾醇過(guò)氧化物(35.8毫克)。對(duì)第六部分進(jìn)行組合的正相及反相硅膠柱色譜，得到化合物3(14.6毫克)。對(duì)第七部分進(jìn)行柱色譜，得到化合物4和5(4∶1)的混合物，隨后對(duì)4和5的混合物進(jìn)行制備HPLC分離[柱Tosoh TSK-gel ODS-80TM(21.5×300毫米)，流動(dòng)相含有0.1％TFA的甲醇-水(70∶30)]。
3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-呋喃-2，5-二酮(化合物1)黃色油；UV(MeOH)λmax(logε)227(4.1)，258(3.9)，275(3.8)，355(3.4)nm；IR(CHCl3)νmax1763cm-1，1H-NMR表1；13C-NMR表2；EIMS m/z 314[M]+(100)，246(100)，131(100)；HR-EIMS m/z314.1523(C19H22O4的計(jì)算值314.1518)。
3-異丁基4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2，5-二酮(2)黃色針狀結(jié)晶(正己烷-乙酸乙酯)；mp 110-111℃；UV(甲醇)λmax(logε)230(4.3)，272(3.5)，355(3.7)nm；IR(CHCl3)νmax1724cm-1；1H-NMR表1；13C-NMR表2；EIMS m/z 313[M]+(8)，245(100)，203(77)，131(28)；HR-EIMS m/z 313.1681(C19H23NO3的計(jì)算值313.1678)。
化合物2的X-射線晶體學(xué)由正己烷-乙酸乙酯結(jié)晶而獲得黃色針狀結(jié)晶，經(jīng)選出后供數(shù)據(jù)收集。晶體數(shù)據(jù)C19H23NO3；Mr＝313.40；大小0.15×0.02×0.02毫米；三斜晶空間群P1(#2)，a＝6.3505(5)，b＝12.205(1)，c＝12.560(2)，α＝64.623(7)°，β＝75.358(4)°，γ＝84.681(5)°，V＝850.9(2)3，Z＝2，Dcalc＝1.223g/cm3，μ(MoKα)＝0.82cm-1，F(xiàn)000＝336.00。于93K下放射，以具有石墨單色的Mo-Kα(λ＝0.71069)的Rigaku RAXIS-RAPID影象板衍射計(jì)進(jìn)行測(cè)量。在采集的8950個(gè)反射中，4745個(gè)為獨(dú)特的(Rint＝0.108)；合并相等反射。以直接法(SHELXS86)解析晶體結(jié)構(gòu)并以全矩陣最小二承方精算。非均質(zhì)地(anisotropically)精算非氫原子。氫原子被包括在內(nèi)但不精算。最終指數(shù)R＝0.074，Rw＝0.099，而GOF(Guest Observer Facility，客體觀察設(shè)施)＝1.06。最終差值傅立葉圖的最大與最小峰分別對(duì)應(yīng)于0.83及-0.89e-/3。
3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2，5-二酮(化合物3)黃色油；UV(MeOH)λmax(logε)232.5(4.3)，296(3.7)，374(3.7)nm；IR(CHCl3)νmax1717cm-1；1H-NMR表1；13C-NMR表2；EIMS m/z 329[M]+(12)，261(100)，131(50)；HR-EIMS m/z329.1637(C19H23NO4的計(jì)算值329.1627)。
3R*，4S*-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮(4)無(wú)色油；[α]D23+2.5°(c 0.2，甲醇)；UV(甲醇)λmax(logε)225(4.3)，275(3.3)，283(3.2)nm；IR(CHCl3)νmax1715cm-1；1H-NMR表1；13C-NMR表2；EIMS m/z 331[M]+(2)，263(67)，207(66)，191(30)，179(40)，133(64)，69(100)；HR-EIMS m/z331.1747(C19H25NO4的計(jì)算值331.1783)。
3R*，4R*-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮(5)無(wú)色油；[α]D23+3.0°(c 0.2，MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)227(4.3)，275(3.4)、283(3.3)nm；IR(CHCl3)νmax1715cm-1；1H-NMR表1；13C-NMR表2；EIMS m/z 331[M]+(1)，263(45)，207(50)，191(75)，179(30)，133(100)，69(92)；HR-EIMS m/z331.1766(C19H25NO4的計(jì)算值331.1783)。
麥角固醇過(guò)氧化物無(wú)色針狀結(jié)晶(正己烷-丙酮)；mp 165-169℃(lit2mp 171-174℃)。
細(xì)胞毒性測(cè)定采用sulforhodamin B(SRB)進(jìn)行法體外LLC腫瘤細(xì)胞測(cè)定。以Probit法計(jì)算50％生長(zhǎng)抑制(ED50)。
結(jié)果與討論對(duì)牛樟芝菌絲體的氯仿萃取物重復(fù)進(jìn)行正相及反相硅膠色譜，以獲得五種新的馬來(lái)酸和琥珀酸衍生物(化合物1-5)與麥角固醇過(guò)氧化物。
表1化合物1-5的1H-NMR譜數(shù)據(jù)(δppm，J＝Hz)(500MHz，CDCl3)

表2化合物1-5的13C-NMR譜數(shù)據(jù)(δppm)(125MHz，CDCl3)

a)歸屬是可互換的。
新化合物的結(jié)構(gòu)如下確定化合物2為黃色針狀結(jié)晶，mp 110-111℃，由HR-EIMS分析其分子式為C19H23NO3。紅外光譜在1724cm-1顯示二酰亞胺羰基吸收。13C-NMR譜顯示在脂肪族區(qū)有四個(gè)甲基碳、兩個(gè)亞甲基碳與一個(gè)次甲基碳信號(hào)，以及一個(gè)苯環(huán)、一個(gè)烯基和兩個(gè)羰基碳。1H-NMR譜顯示在δ0.90、2.06和2.51有異丁基部分，在δ1.76、1.81、4.56和5.50有3-甲基2-丁烯氧基部分，并且在6.95和7.50有對(duì)位取代的苯部分，該對(duì)位取代的苯部分由1H-1H COSY(冷卻同步加速器)和HMQC(異核多量子相關(guān))實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步支持。通過(guò)HMBC觀察到長(zhǎng)范圍相關(guān)，如圖1所示?；诜肿邮脚c13C-NMR譜，推斷此化合物含有另外的CHNO原子，包括多于一個(gè)羰基碳。因此，推測(cè)該不清楚的部分為馬來(lái)酰亞胺基。然后通過(guò)X-射線分析確定此結(jié)構(gòu)為3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2，5-二酮。
化合物1的分子式由HR-EIMS分析為C19H22O4。紅外光譜顯示在1763cm-1處有酸酐的羰基吸收。化合物1的1H-NMR譜與化合物2的類(lèi)似，顯示有異丁基部分、3-甲基2-丁烯氧基部分、對(duì)位取代的苯環(huán)的存在。HMBC譜表明化合物1具有與化合物2部分相同的結(jié)構(gòu)(圖1)，其中根據(jù)分子式推斷馬來(lái)酸酐的存在。因此，確定化合物1為3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2，5-二酮。
化合物3的分子式由HR-EIMS分析為C19H23NO4。紅外光譜顯示在1717cm-1處有羰基吸收，可歸屬為羥基二酰亞胺。1H-和13C-NMR譜也與化合物1和2的類(lèi)似，顯示有異丁基部分、3-甲基2-丁烯氧基部分、對(duì)位取代的苯環(huán)的存在。在HMBC實(shí)驗(yàn)中，證明化合物3具有部分結(jié)構(gòu)與化合物2相同(圖1)?；衔?比化合物2多含有一個(gè)氧原子，因此，確定此化合物為3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2，5-二酮。
由HR-EIMS分析出化合物4和5有相同的Rf值與相同的分子式(C19H25NO4，實(shí)測(cè)值分別為331.1747和331.1766)，然而它們可以通過(guò)制備HPLC分離。二化合物的紅外光譜顯示在1715cm-1處有羥基二酰亞胺羰基吸收。在1H-和13C-NMR譜中，二化合物均顯示有異丁基部分、3-甲基2-丁烯氧基部分、對(duì)位取代的苯環(huán)的存在，但異丁基亞甲基質(zhì)子顯示多重峰而非如化合物1-3是二重峰。1H-1H COSY譜顯示該亞甲基連接于-CH-CH-單元上?；衔?和5的13C-NMR譜顯示兩個(gè)額外的sp3碳信號(hào)，代替在化合物1-3中發(fā)現(xiàn)的sp2碳信號(hào)。因此，化合物4和5不是N-羥基馬來(lái)酰亞胺，而是N-羥基琥珀酰亞，于琥珀酰亞胺環(huán)的C-3和C-4位具有立體中心?；衔?和5由H-3和H-4之間的偶合常數(shù)(化合物4和5分別為4.0與8.0Hz)確定分別為反式與順式異構(gòu)體。在化合物4的NOESY(核歐沃豪斯效應(yīng))譜中沒(méi)有觀察到H-3和H-4之間的NOE，而在化合物5的NOESY譜中則觀察到明顯的NOE。化合物4和5的旋光性分別為+2.5°和+3.0°，而它們的CD譜顯示在任何波長(zhǎng)均無(wú)卡滕效應(yīng)，表明化合物4和5均為外消旋混合物。使用手性柱，用幾種溶劑系統(tǒng)通過(guò)HPLC拆分這些外消旋混合物并未成功。目前，我們無(wú)法明確推斷這些化合物是光學(xué)活性化合物還是消旋混合物。因此，它們的相對(duì)結(jié)構(gòu)分別確定為3R*，4S*-和3R*，4R*-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮。
根據(jù)Aquveque等人的報(bào)告第二次分離這些類(lèi)型的來(lái)自天然的馬來(lái)酸和琥珀酸衍生物。
使用LLC(Lewis肺癌)細(xì)胞系研究氯仿萃取物與分離的化合物的細(xì)胞毒活性(表3)。氯仿萃取物顯示中等細(xì)胞毒作用，其ED50值為26.7微克/毫升。馬來(lái)酸化合物1和4不具細(xì)胞毒活性，而發(fā)現(xiàn)化合物2和3對(duì)于LLC細(xì)胞系具細(xì)胞毒性，其ED50值低于氯仿萃取物的。
表3來(lái)自牛樟芝菌絲體的氯仿萃取物與化合物1-4對(duì)LLC細(xì)胞系的50％生長(zhǎng)抑制(ED50)值

a)陽(yáng)性對(duì)照ACM(牛樟芝菌絲體粉末)的腫瘤測(cè)定A.細(xì)胞系粘附細(xì)胞MCF-7人乳腺癌HT-29人結(jié)腸腺癌KATO III人胃腺癌
SW480人結(jié)腸腺癌SW620人結(jié)腸腺癌HepG2人肝腺腫瘤懸浮細(xì)胞EL4小鼠淋巴瘤B.樣品化合物1、化合物3、ACM乙醇萃取物、ACM水萃取物C.測(cè)定方法計(jì)算ED50(有效劑量的50％抑制)粘附細(xì)胞MTT(甲基噻唑基四唑鎓)法對(duì)于MCF-7、HT-29、KATO III、SW480、HepG2，3天確定細(xì)胞。SW620 4天。
懸浮細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)法；EL4細(xì)胞計(jì)數(shù)5天。
D.結(jié)果計(jì)算y＝m Ln(x)+b實(shí)例

使用X(10、30、50ppm)與Y值得到相關(guān)曲線y＝-0.2643Ln(x)+1.5321ED50＝exp(0.97/2-1.5321)/(-0.2643)樣品制備與樣品描述A.ACM(牛樟芝菌絲體粉末)的水萃取物1.將1克ACM加入裝有40毫升RO H2O的250毫升燒杯中，室溫下將燒杯置于超聲水浴中，持續(xù)20分鐘。
2.在45℃下攪拌水浴45分鐘。
3.將燒杯置于超聲水浴中再持續(xù)20分鐘。
4.于3000rpm下將樣品離心15分鐘。
5.收集上清液，并用培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)稀釋。
B.測(cè)定樣品濃度1.蒸發(fā)盤(pán)秤重(W1)。
2.將10毫升水萃取物加入蒸發(fā)盤(pán)內(nèi)3.將蒸發(fā)盤(pán)置入烘箱內(nèi)以除去水分(W2)樣品重/毫升＝(W2-W1)/10C.ACM(牛樟芝菌絲體粉末)乙醇萃取物1.將100毫升95％乙醇加入裝有20克ACM的500毫升燒杯中，并在室溫下攪拌10分鐘。
2.以Advantec 1號(hào)濾紙過(guò)濾懸浮液，并收集濾液。
3.以旋轉(zhuǎn)式真空蒸發(fā)儀濃縮濾液，除去乙醇。
D.化合物1來(lái)自ACM的純化合物E.化合物3來(lái)自ACM的純化合物MTT測(cè)定法1.細(xì)胞增殖后棄去舊培養(yǎng)基，然后以磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗細(xì)胞一次。
2.以胰蛋白酶-EDTA沖洗細(xì)胞。
3.于1200rpm下離心5分鐘，然后棄去上清液。
4.以10毫升培養(yǎng)基懸浮團(tuán)粒。
5.將100微升細(xì)胞懸浮液與100微升臺(tái)盼藍(lán)混合，以計(jì)算存活細(xì)胞。
6.在96孔盤(pán)的每孔中加入1×104個(gè)細(xì)胞/100微升培養(yǎng)基，將盤(pán)于37℃下在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。
7.棄去舊培養(yǎng)基，以PBS清洗細(xì)胞一次。
8.在每孔中加入100微升樣品，將盤(pán)于37℃下在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
9.在第3、4和5天以PBS清洗細(xì)胞一次。
10.在每孔中加入57微升MTT(0.88毫克/毫升)。
11.4小時(shí)后棄去MTT，并以PBS清洗細(xì)胞一次。
12.每孔加入50微升DMSO。
13.以ELISA儀在OD545下讀取結(jié)果。
細(xì)胞計(jì)數(shù)法(EL4細(xì)胞系)1.細(xì)胞增殖后通過(guò)離心棄去舊培養(yǎng)基。
2.以新鮮培養(yǎng)基將團(tuán)粒再懸浮。
3.將100微升細(xì)胞懸浮液與100微升臺(tái)盼藍(lán)混合，以計(jì)算存活細(xì)胞。
4.制備含有1×105個(gè)細(xì)胞/毫升樣品的不同濃度的樣品。
5.于96孔盤(pán)的每孔中放入100微升樣品，將盤(pán)于37℃下在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
6.在第3、4和5天計(jì)算存活細(xì)胞。
PBSNaCl 8克KCl 0.2克Na2HPO41.4克KH2PO40.2克體積調(diào)為1升 PH7.4結(jié)果與討論ACM于細(xì)胞系的ED50

詳細(xì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下本發(fā)明的化合物3HepG2(圖4a)，EL4(圖4b)，HT-29(圖4c)和Kato III(圖4d)。
ACM水萃取物HepG2(圖5a)，SW620(圖5b)和EL4(圖5c)。
ACM乙醇萃取物HT-29(圖6a)，SW480(圖6b)，SW620(圖6c)，EL4(圖6d)，HepG2(圖6e)和Kato III(圖6f)。
本發(fā)明的化合物1MCF-7(圖7a)，EL4(圖7b)，HT-29(圖7c)，SW620(圖7d)和HepG2(圖7e)。
以上結(jié)果證明，本發(fā)明的化合物與ACM萃取物對(duì)各種類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞具有抑制作用。
通過(guò)高效液相色譜法分析來(lái)自ACM乙醇萃取物的所有新化合物(1、2和3)目的為了測(cè)量來(lái)自ACM乙醇萃取物的所有新化合物(1、2和3)的量，采用高效液相色譜法作為我們的常規(guī)質(zhì)量控制程序。
制備ACM乙醇萃取物樣品1)、以電子天平精確秤重樣品粉末20.000(克)，置入含有100毫升95％乙醇的刻度實(shí)驗(yàn)瓶中，其瓶蓋勿旋緊。
2)、將上述步驟的樣品瓶置于超聲水浴中10分鐘。
3)、將液體樣品倒入離心管中，隨后將那些樣品在6500rpm條件下離心5分鐘，以除去粗顆粒。
4)、以advantec 1號(hào)濾紙過(guò)濾液體層。
5)、以旋轉(zhuǎn)式真空蒸發(fā)儀濃縮過(guò)濾液，直至出現(xiàn)粘稠、不含乙醇的淡黃色液體。
6)、重復(fù)步驟1至5三次，并收集所有萃取產(chǎn)物(總ACM乙醇萃取物＝4.60克)，計(jì)算收率。
2690型Water HPLC的應(yīng)用1)、柱反相C18
2)、流動(dòng)相甲醇、水、乙腈3)、注射體積20微升4)、檢測(cè)光電二極管陣列檢測(cè)儀996于波長(zhǎng)254nm下測(cè)量5)、準(zhǔn)備于10毫升乙醇中的1.000(克)ACM乙醇萃取物樣品，以進(jìn)行HPLC分析*結(jié)果根據(jù)HPLC分析，含有純化合物1、2和3的萃取產(chǎn)物顯示于下表4中。
表4

因此，化合物1、2和3的總重為ACM樣品重量的5.92％。
ACM乙醇萃取物的試驗(yàn)材料與設(shè)備1.試驗(yàn)物質(zhì)和給模式所有體內(nèi)試驗(yàn)皆以口服于2％Tween 80載體中1000毫克/千克的初始劑量試驗(yàn)物質(zhì)給予。每個(gè)試驗(yàn)的觀察時(shí)間描述于方法中。
2.動(dòng)物使用由臺(tái)灣泛球藥理研究所提供的雄性或雌性ICR小鼠、Wistar-Okamoto衍生系雄性自發(fā)性低血壓大鼠(SHR)、Wistar與Long Evans衍生系大鼠。動(dòng)物飼養(yǎng)空間如下29×18×13厘米空間飼養(yǎng)10只小鼠，45×23×21厘米空間飼養(yǎng)6只大鼠，45×23×21厘米空間飼養(yǎng)3只豚鼠。小鼠和大鼠飼養(yǎng)在APECR籠子內(nèi)。由國(guó)立臺(tái)灣大學(xué)動(dòng)物中心提供的重21±2克，6-8周大的C57BL/6J免疫活性雄性小鼠亦在本研究中使用。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)在獨(dú)立通風(fēng)的籠架(IVC架，36小型隔離系統(tǒng))。每個(gè)籠子予以高壓滅菌，并含有5只小鼠(在26.7×20.7×14厘米的空間內(nèi))。在使用前所有動(dòng)物均于控溫(21°-23℃)及控濕(60％-70％)環(huán)境中，在實(shí)驗(yàn)室中，于12小時(shí)光照周期下保持至少一周。提供標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)飼料(LabDiet Rodent Diet與Guinea Pig Diet，PMI Nutrition International，美國(guó))與自來(lái)水自由進(jìn)食。
3.細(xì)胞系與培養(yǎng)基鼠黑素瘤細(xì)胞，B16-F0(ATCC CRL-6322)購(gòu)自American TypeCulture Collection，并以Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(GIBCO，美國(guó))作為細(xì)胞培養(yǎng)基。將腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)于37℃并含有5％CO2的空氣中。
4.化學(xué)藥品一般蒸餾水(自制)，二甲基亞砜(DMSO，Merck，德國(guó))，等張氯化鈉溶液(信東化學(xué)工業(yè)股份有限公司，臺(tái)灣)，硫酸鎂(MgSO4·7H2O，Wako，日本)，甲氯滅酸鈉(Sigma，美國(guó))，甲基纖維素(Signa，美國(guó))，氫氧化鈉(NaOH，Wako，日本)，磷酸鹽緩沖鹽水(Sigma，美國(guó))和Tween 80(Wako，日本)。
試劑Glicose-HA測(cè)定試劑盒(Wako，日本)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測(cè)定試劑盒(Wako，日本)，天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測(cè)定試劑盒(Wako，日本)，T-膽固醇-HA與HDL測(cè)定試劑盒(Wako，日本)，Hemolynac 3 Hemolys(Nihon Koden，日本)，Isotonic 3 Diluent(NihonKoden，日本)。
5.設(shè)備一般使用動(dòng)物箱(信德，臺(tái)灣)，250毫升與1000毫升燒杯(Kinmax，美國(guó))，一次性注射器(1毫升，Top Corporation，日本)，不銹鋼鑷子(klappencker，德國(guó))，鼠秤(mouse scale)#Z-40(Taconic，美國(guó))，口服喂食注射筒(Natsune，日本)，皮下注射針23G×1”(Top Corporation，日本)，pH計(jì)(Suntex，美國(guó))，鼠秤500克±2克(Chien-chun，臺(tái)灣)，玻璃注射器1毫升、2毫升和5毫升(Mitsuba，日本)，以及不銹鋼剪刀(Klappencker，德國(guó))。
方法與結(jié)果1.膽堿能激動(dòng)，中樞/外周(Lippmann W和Pugsley TA，Arch IntPharmacodyn.227324，1977)。
將測(cè)試物質(zhì)口服給予3只重150±20克的Wistar衍生系雄性或雌性大鼠組。在隨后的30-60分鐘內(nèi)，記錄累積測(cè)量的出現(xiàn)超過(guò)10秒咀嚼行為(口和/或舌運(yùn)動(dòng))的動(dòng)物數(shù)目，以及出現(xiàn)唾液分泌的動(dòng)物數(shù)目。觀察到3只大鼠中的2只或更多(≥2)的陽(yáng)性反應(yīng)表示可能有中樞膽堿能活性和外周膽堿能活性。
表5膽堿能激動(dòng)結(jié)果，中樞/外周，在大鼠中

載體與測(cè)試物質(zhì)以口服(PO)給予，而陽(yáng)性對(duì)照化合物腹膜內(nèi)注射(IP)給予。在隨后的30-60分鐘的時(shí)間內(nèi)，記錄累積測(cè)量的出現(xiàn)超過(guò)10秒鐘咀嚼行為(口和/或舌運(yùn)動(dòng))的動(dòng)物數(shù)目，以及出現(xiàn)唾液分泌的動(dòng)物數(shù)目。觀察到3只大鼠中的2只或更多(≥2)的陽(yáng)性反應(yīng)表示可能有膽堿能活性或外周膽堿能活性。
2.心血管、血壓和心率(SHR 0、1、2、4小時(shí))(Yen TT等人，Life Sci.22359，1978)使用3只重250±20克的Wistar-Okamoto衍生系自發(fā)性高血壓雄性鼠(SHR)組；平均收縮壓為200±20mmHg，心率為400±30次/分鐘。血壓與心率通過(guò)tail cuff法在控溫環(huán)境(32±1℃)下，于口服給予測(cè)試物質(zhì)或載體之前(0時(shí))和之后1、2、4小時(shí)間接紀(jì)錄。當(dāng)每次于間隔時(shí)間測(cè)量后與0時(shí)相比，收縮壓下降10％或更多(≥10％)，或心率下降20％或更多(≥20％)，則認(rèn)為是顯著的。
表6大鼠中心血管、血壓結(jié)果(SHR 0、1、2、4小時(shí))

表7心血管、心率結(jié)果(SHR 0、1、2、4小時(shí))

使用收縮壓為200±20mmHg與心率為400±50mmHg次/分鐘的SHR。血壓是經(jīng)由vial tail cuff法于口服給予測(cè)試物質(zhì)或載體后0時(shí)和1、2、4小時(shí)作間接紀(jì)錄。當(dāng)每次測(cè)量時(shí)間點(diǎn)與在括號(hào)中給出的0時(shí)的相比，血壓下降10％或更多(≥10％)，或心率下降20％或更多(≥20％)，則視為是顯著的。
載體 10ml/kg0時(shí)229mmHg與403mmHg次/分鐘當(dāng)作100％。
ACM-乙醇萃取物 1000mg/kg 0時(shí)223mmHg與452mmHg次/分鐘當(dāng)作100％。
可樂(lè)定 0.1mg/kg 0時(shí)228mmHg與379mmHg次/分鐘當(dāng)作100％。
表8在大鼠中的心血管、血壓結(jié)果(SHR 0、1、2、4小時(shí))

表9心血管、心率結(jié)果(SHR 0、1、2、4小時(shí))

使用收縮壓為200±20mmHg與心率為400±50mmHg次/分鐘的SHR。血壓是經(jīng)由vial tail cuff法于口服給予測(cè)試物質(zhì)或載體(之前)0時(shí)和之后1、2、4小時(shí)作間接紀(jì)錄。每個(gè)測(cè)量時(shí)間點(diǎn)與在括號(hào)中給出的0時(shí)相比，血壓下降10％或更多(≥10％)，或心率下降20％或更多(≥20％)，則視為是顯著的。
載體 10ml/kg 0時(shí)220mmHg與410mmHg次/分鐘當(dāng)作100％。
ACM-乙醇萃取物300mg/kg 0時(shí)205mmHg與446mmHg次/分鐘當(dāng)作100％。
可樂(lè)定0.1mg/kg 0時(shí)235mmHg與417mmHg次/分鐘當(dāng)作100％。
3.膽固醇、血清(總HDL、總量/HDL比)，飲食誘發(fā)的(Schurr PE等人，Atherosclerosis Drug Discovery.Plenum，New York，pp.215-229，1976)。
給重量為22±2克的5只ICR衍生系雄性小鼠組喂食高脂食物(g/100g椰子油，8；膽固醇，1.0；膽酸，0.3；豬油，2；標(biāo)準(zhǔn)食物88.7)7天以引發(fā)高膽固醇血癥。在第5、6、7天口服給予測(cè)試物質(zhì)。經(jīng)整夜禁食后，從每只小鼠獲得血清用來(lái)測(cè)定總膽固醇(總量)、高密度脂蛋白(HDL)和總量/HDL的改變百分比。與以載體治療的對(duì)照動(dòng)物相比，血清總量下降20％或更多(≥20％)，或血清HDL上升20％或更多(≥20％)，或總量/HDL下降40％或更多(≥40％)，視為是顯著的。
表10在小鼠中由飲食引起的膽固醇(總量/HDL，總量/HDL比)結(jié)果

在喂食高膽固醇食物后的第5、6、7天口服(PO)給予載體、測(cè)試物質(zhì)或?qū)φ贞?yáng)性化合物。在第三次給藥后二十四小時(shí)，將整夜禁食的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死，以評(píng)估血清總膽固醇(總量)和高密度脂蛋白(HDL)。血清總量下降20％或更多(≥20％)，或血清HDL上升20％或更多(≥20％)，或總量/HDL比下降40％或更多(≥40％)，則認(rèn)為是顯著的。
4.肝損傷，D-半乳糖胺(Wrobel J等人，J.Med Chem 411084，1998)。
使用重量為200±20克的5只Wistar衍生系雄性大鼠組。每只動(dòng)物以單一注射D-半乳糖胺(500mg/kg，IP)治療。在D-半乳糖胺給藥之前0.5小時(shí)與之后4小時(shí)和8小時(shí)口服給予測(cè)試物質(zhì)，在24小時(shí)后處死動(dòng)物。血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平以HITACHI自動(dòng)分析儀(7050型)測(cè)量，通過(guò)最優(yōu)化的UV法來(lái)測(cè)量。與以載體治療的對(duì)照動(dòng)物相比，ALT或AST活性下降30％或更多(≥30％)，則表明顯著的保護(hù)。
表11肝損傷的結(jié)果，半乳糖胺，在大鼠中

在半乳糖胺一次給藥(500mg/kg，IP)之前0.5小時(shí)與之后4小時(shí)和8小時(shí)口服給予測(cè)試物和載體，在半乳糖胺注射24小時(shí)后處死大鼠，并測(cè)定ALT和AST值。與載體組相比，ALT和AST下降≥30％視為是顯著的。
5.炎癥，角叉菜聚糖(Winter CA等人，Proc Soc Exp Biol Med.111544，1962)重量為150±20克的3只Long Evans衍生系雄性或雌性組，在研究前先禁食整晚。在右后爪接受注射角叉菜聚糖(0.1毫升1％內(nèi)置(intraplantar)懸浮液)1小時(shí)前口服給予測(cè)試物質(zhì)。后爪水腫作為炎癥的量度，在給予角叉菜聚糖3小時(shí)后使用帶有水槽(直徑25毫米)的器官充滿(mǎn)度測(cè)量器紀(jì)錄。后爪水腫下降30％或更多(≥30％)表明顯著的抗炎活性。
表12炎癥結(jié)果，角叉菜聚糖，在大鼠中

表13炎癥結(jié)果，角叉菜聚糖，在大鼠中

在右后爪(R.P.)注射角叉菜聚糖(0.1毫升1％內(nèi)置(intraplantar)懸浮液)前1小時(shí)給予整夜禁食大鼠測(cè)試物質(zhì)和載體；左后爪(L.P.)則不注射。括號(hào)中所示的后爪水腫下降30％或更多(≥30％)表明顯著的急性抗炎活性。
6.腫瘤，同源黑素瘤B16-F0細(xì)胞(Farrugia CA和Groves MJ.，Anticancer Research 191027-1032，1999)使用5只無(wú)特殊病原體的(SPF)、免疫活性(6-8周大)的C57BL/6J雄性小鼠組，其飼養(yǎng)于無(wú)特殊病原體的(SPF)環(huán)境下的動(dòng)物隔離間(IVC架)內(nèi)。將與C57BL/6J小鼠同源的B16-F0鼠黑素瘤活細(xì)胞(ATCC CRL-6322，0.2毫升內(nèi)有1.0×105個(gè)細(xì)胞)皮下注射入實(shí)驗(yàn)小鼠的背側(cè)。腫瘤接種后24小時(shí)開(kāi)始治療，每日以口服管飼方式給予測(cè)試化合物21天，或者當(dāng)出現(xiàn)明顯毒性癥狀時(shí)減少天數(shù)。自第1天至第22天監(jiān)測(cè)小鼠的體重、腫瘤大小與存活。此外監(jiān)控實(shí)驗(yàn)小鼠的存活，直至研究后第45天結(jié)束。
根據(jù)長(zhǎng)橢球公式來(lái)評(píng)估腫瘤重量(毫克)長(zhǎng)(毫米)×[寬(毫米)]2×0.5，假設(shè)比重為1，π為3。化合物治療的動(dòng)物中的腫瘤生長(zhǎng)以T/C(治療/對(duì)照)×100％來(lái)計(jì)算；T/C值≤42％，則表明顯著的抗腫瘤活性。T/C(治療/對(duì)照)的平均存活時(shí)間≥125％亦視為具有顯著的抗腫瘤活性。
表14腫瘤，同源黑素瘤B16-F0細(xì)胞結(jié)果

表15腫瘤，同源黑素瘤B16-F0細(xì)胞結(jié)果

腫瘤細(xì)胞植入24小時(shí)后，每天給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物載體與測(cè)試物質(zhì)，總共21次給藥。同時(shí)，對(duì)照化合物，絲裂霉素以IP方式每周給予兩次，總共6次給藥。腫瘤大小每周測(cè)量與紀(jì)錄兩次，為期22天。以T/C(重量/對(duì)照)×100計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制。T/C值≤42％視為具有顯著的抗腫瘤活性。
表16腫瘤，同源黑素瘤B16-F0細(xì)胞的結(jié)果

腫瘤細(xì)胞植入24小時(shí)后，每天給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物載體與測(cè)試物質(zhì)，總共21次給藥。同時(shí)，對(duì)照化合物，絲裂霉素以IP方式每周給予兩次，總共6次給藥。腫瘤大小每周測(cè)量與紀(jì)錄兩次，為期22天。使用斯氏t檢驗(yàn)確定測(cè)試化合物與載體對(duì)照組之間的體重變化的顯著性差異。
表17腫瘤，同源黑素瘤B16-F0細(xì)胞結(jié)果

a若動(dòng)物于45天后并未死亡，則其存活期當(dāng)作45天。
監(jiān)測(cè)治療小鼠的存活至45天研究期，或至實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡為止。T/C(治療/對(duì)照)的平均存活時(shí)間≥125％亦視為具有顯著的抗腫瘤活性。
討論依照自定標(biāo)準(zhǔn)，口服(PO)給予ACM-乙醇萃取物，在以下小鼠與大鼠測(cè)定中導(dǎo)致顯著活性在大鼠中1000毫克/千克的中樞膽堿能激動(dòng)；最小和不顯著的激動(dòng)在300毫克/千克下可見(jiàn)；在1000毫克/千克下對(duì)外周膽堿性神經(jīng)沒(méi)有顯著的激動(dòng)或拮抗(表5)。
在自發(fā)性高血壓(SH)大鼠中，于1000毫克/千克下，收縮壓減少(于1、2和4小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)觀察，與0時(shí)的100％相比，分別為16％、12％和20％)，且伴有心率中度但不顯著的下降(表6和7)；300毫克/千克的劑量并未導(dǎo)致收縮壓和心率的顯著變化(表8和9)。
在1000毫克/千克下，在飲食誘發(fā)的小鼠中增加高密度脂蛋白(HDL，比載體對(duì)照多39％)(表10)；相關(guān)的總膽固醇(總量)未顯著改變，而HDL/總量比顯著下降至接近31％；300毫克/千克的劑量并未造成總量、HDL和HDL/總量比顯著改變。
對(duì)半乳糖胺誘發(fā)的大鼠肝損傷，在1000毫克/千克×3下可見(jiàn)保肝作用(與載體對(duì)照相比，ALT下降44％而AST下降57％)；在300毫克/千克×3下可見(jiàn)ALT 20％的中度下降而AST下降28％(表11)。
在1000毫克/千克下對(duì)角叉菜聚糖誘發(fā)的大鼠爪水腫的抗炎作用(與載體對(duì)照相比45％抑制)(表12)；更低的300毫克/千克水平?jīng)]有顯著活性(與載體相比3％抑制，表13)。
在1000毫克/千克下，于第8、11和15天在C57BL/6J小鼠同源黑素瘤B16-F0細(xì)胞中的抗腫瘤活性(表14和15)，以及動(dòng)物存活時(shí)間的延長(zhǎng)(表17)；動(dòng)物體重未顯著改變(表16)。
本發(fā)明的ACM、ACM-乙醇萃取物和化合物3的測(cè)試使用九組，每組5只ICR衍生系雄性小鼠(重22±2克)。每只動(dòng)物以單一劑量的四氯化碳(CCl4，于50％橄欖油中，0.1毫升/千克，PO)激發(fā)免疫反應(yīng)。在四氯化碳激發(fā)之前30分鐘與之后4和8小時(shí)口服給予測(cè)試物質(zhì)，劑量為300和1000毫克/千克的ACM，或劑量為30、100和300毫克/千克的本發(fā)明的化合物3；而在四氯化碳之前1天(每天兩次)和30分鐘以及之后4和8小時(shí)對(duì)口服給予的300和1000毫克/千克ACM乙醇萃取物進(jìn)行預(yù)處理。于四氯化碳后24小時(shí)處死動(dòng)物。使用HITACHI自動(dòng)分析儀(7050型)以最優(yōu)化的UV法測(cè)量丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平。與載體相比，ALT或AST水平下降30％或更多(≥30％)，表明對(duì)肝損傷有顯著的保護(hù)作用。
結(jié)果表18測(cè)定肝損傷，四氯化碳，在小鼠中


討論評(píng)價(jià)了本發(fā)明的ACM、ACM-乙醇萃取物和化合物3對(duì)由四氯化碳誘發(fā)的ICR小鼠的肝損傷的可能保護(hù)活性。在四氯化碳激發(fā)之前0.5小時(shí)和之后4和8小時(shí)，將測(cè)試物質(zhì)，劑量為300和1000毫克/千克的ACM-乙醇，和劑量為30、100和300毫克/千克的本發(fā)明的化合物3口服給予試驗(yàn)動(dòng)物。對(duì)于300和1000毫克/千克的ACM乙醇萃取物，在四氯化碳之前1天進(jìn)行兩次治療(9:00AM和16:00PM)(b.i.d.)，并接著在四氯化碳激發(fā)之前0.5小時(shí)與之后4小時(shí)和8小時(shí)進(jìn)行治療(總計(jì)5次給藥)。通過(guò)相對(duì)于載體治療的動(dòng)物而言的血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的增加來(lái)確定肝損傷的程度。劑量為1000毫克/千克×3的ACM與劑量為300毫克/千克×3的本發(fā)明的化合物3導(dǎo)致，相對(duì)于載體治療的動(dòng)物而言，ALT(46％和41％)和AST(36％和33％)的顯著減少。同時(shí)劑量為300和1000毫克/千克×5的ACM-乙醇萃取物也導(dǎo)致ALT(36％和34％)以及AST(25％和20％)的顯著減少。
同時(shí)測(cè)試水飛薊素(100毫克/千克×3，IP)顯示相對(duì)于載體治療組，ALT(31％)和AST(31％)的顯著減少。
得出結(jié)論，本發(fā)明的ACM、ACM-乙醇萃取物和化合物3，在小鼠四氯化碳模型中具有顯著的保肝活性。
盡管已對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的描述及例示詳細(xì)至足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員制造并使用之，但是在不背離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)與范圍的前提下，各種替代、改變與改進(jìn)應(yīng)是明顯的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，本發(fā)明適于達(dá)到目的，并得到本文所述及其固有的結(jié)果及優(yōu)點(diǎn)。細(xì)胞系、胚胎、動(dòng)物及其制造過(guò)程和方法代表優(yōu)選的實(shí)施方案，是示例性的，并非欲限制發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)想到對(duì)其的修改及其它用途。這些修改均涵蓋在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)并由權(quán)利要求的范圍定義。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地知道，在不背離本發(fā)明的范圍與實(shí)質(zhì)的前提下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行變更與修改。
說(shuō)明書(shū)中提到的所有專(zhuān)利及著作均表示本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的水平。就像每件單個(gè)著作被具體和單個(gè)地指明引入作為參考一樣，所有專(zhuān)利及著作均引入作為參考。
本文示例性地描述的本發(fā)明可在沒(méi)有具體公開(kāi)在本文中的一個(gè)或多個(gè)元素、一個(gè)或多個(gè)限制下得到施行。所采用的術(shù)語(yǔ)及表達(dá)僅為說(shuō)明性而非限制性術(shù)語(yǔ)，且非欲用這些術(shù)語(yǔ)及表達(dá)來(lái)排除任何所示及所述或其部分特征的等價(jià)物，而是認(rèn)為在要求保護(hù)的發(fā)明范圍內(nèi)各種改變是可能的。因此，應(yīng)理解，雖然已通過(guò)優(yōu)選實(shí)施方案及任選的特征具體描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可能采用本文所公開(kāi)的構(gòu)思的改變和變體，認(rèn)為這些修改與變體在由所附權(quán)利要求定義的發(fā)明范圍內(nèi)。
其它實(shí)施方案在所附權(quán)利要求中說(shuō)明。
權(quán)利要求
1.下式的化合物 其中X為N或O；R1為C1-10烷氧基、C2-10鏈烯氧基或C2-10炔氧基；R2為H、C1-10烷基、C2-10鏈烯基或C2-10炔基；且R3不存在，或?yàn)镠或羥基；條件是如果X為O，則R3不存在。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R1為C2-6鏈烯氧基或C2-6炔氧基。
3.權(quán)利要求2的化合物，其中C2-6鏈烯氧基經(jīng)C1-6烷基取代。
4.權(quán)利要求1的化合物，其中R2為異丁基。
5.權(quán)利要求1的化合物，其為3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2，5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2，5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2，5-二酮、3R*，4S*-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮，或3R*，4R*-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮。
6.來(lái)自牛樟芝菌絲體的混合物，其制備自牛樟芝菌絲體的水或有機(jī)溶劑萃取物。
7.權(quán)利要求6的混合物，其中該有機(jī)溶劑為醇、酯、烷或鹵代烷。
8.權(quán)利要求7的混合物，其中該醇為乙醇。
9.權(quán)利要求6的混合物，其中該化合物為3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2，5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2，5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2，5-二酮、3R*，4S*-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮，或3R*，4R*-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮。
10.權(quán)利要求6的混合物，其減低收縮壓或增加高密度脂蛋白。
11.權(quán)利要求6的混合物，其具有中樞膽堿能激動(dòng)、保肝、抗炎或抗腫瘤活性。
12.權(quán)利要求11的混合物，其中腫瘤來(lái)自選自肝、腸、骨、血、淋巴及乳房的細(xì)胞或組織。
13.包含下式的化合物的組合物 其中X為N或O；R1為C1-10烷氧基、C2-10鏈烯氧基或C2-10炔氧基；R2為H、C1-10烷基、C2-10鏈烯基或C2-10炔基；且R3不存在，或?yàn)镠或羥基；條件是如果X為O，則R3不存在。
14.權(quán)利要求13的組合物，其中該化合物為3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2，5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2，5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2，5-二酮、3R*，4S*-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮，或3R*，4R*-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮。
15.權(quán)利要求14的組合物，其中該化合物為3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2，5-二酮或3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2，5-二酮。
16.權(quán)利要求13的組合物，其減低收縮壓或增加高密度脂蛋白。
17.權(quán)利要求13的組合物，其具有中樞膽堿能激動(dòng)、保肝、抗炎或抗腫瘤活性。
18.權(quán)利要求13的組合物，其中腫瘤來(lái)自選自肝、腸、骨、血、淋巴及乳房的細(xì)胞或組織。
19.牛樟芝菌絲體，其包含權(quán)利要求1的化合物。
20.權(quán)利要求19的菌絲體，其中該化合物為3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2，5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2，5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2，5-二酮、3R*，4S*-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮，或3R*，4R*-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2，5-二酮。
全文摘要
本發(fā)明涉及來(lái)自牛樟芝(Antrodia Camphorata)菌絲體的新混合物及馬來(lái)酸與琥珀酸衍生物，及其醫(yī)藥用途。本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的化合物的組合物或菌絲體。
文檔編號(hào)A61P3/06GK1666982SQ20041000804
公開(kāi)日2005年9月14日 申請(qǐng)日期2004年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月10日
發(fā)明者服部征雄, 許嘉欽 申請(qǐng)人:善笙生物科技股份有限公司