專利名稱：人同源盒基因lhx4在制備嗜鉻細胞瘤治療藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因的用途，具體的說涉及人同源盒基因LHX4在制備嗜鉻細胞瘤治療藥物中的用途。
背景技術(shù)：
同源盒基因(homeobox gene)是1983年在瑞士Gehring實驗室發(fā)現(xiàn)的一類基因，它們因在其基因外顯子3′端共同具有一段長180個堿基對、高度保守的同源盒序列而得名，同源盒基因的表達產(chǎn)物是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，是發(fā)育的主控基因，在胚胎的發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮重要作用。由這段序列所翻譯出的蛋白質(zhì)更具保守性，并富含堿性氨基酸，因此稱為同源盒區(qū)(homeodomain)。LIM同源盒基因(LIM homeobox gene)屬于同源盒基因家族，它不僅具有同源盒結(jié)構(gòu)，而且含有兩個富含半胱氨酸和組氨酸的LIM結(jié)構(gòu)域。LIM結(jié)構(gòu)域的名稱是由LIM家族中三個基因Lin-11(線蟲)、Isl-1(鼠)和Mec-3(線蟲)名稱的首字母縮寫而成。LIM同源盒轉(zhuǎn)錄因子(LIMhomeodomain transcription factor，LIM-HD)是指LIM同源盒基因的蛋白質(zhì)表達產(chǎn)物，大多表達在神經(jīng)系統(tǒng)，具有早期特征的的形成及后期調(diào)控組織特異性基因的表達等功能，因而這些基因決定脊柱和非脊柱動物發(fā)育中組織和細胞特異性分化。
LHX4基因(LIM homeobox gene 4)屬于LIM同源盒基因家族，主要是在胚胎發(fā)育期的神經(jīng)組織中表達，是機體胚胎發(fā)育過程中運動神經(jīng)元分化和分類的一個重要調(diào)控基因。1994年，美國Hung Li等人依據(jù)同源盒區(qū)最保守的氨基酸序列“KIWFQNRR”設(shè)計了一個含有編碼同源盒序列羧基端14個氨基酸序列的基因克隆，然后用這段基因序列去篩選小鼠胚胎cDNA文庫后得到一個1196bp的cDNA陽性克隆。這個克隆含有一段編碼170個氨基酸的翻譯區(qū)，它的位置從3′poly-A一直延伸到homeobox的5′端，因而它與LHX3有較高的同源性而命名為LHX4(Li Hung，Witte DP，Branford WW et al.Gsh-4encodes a LIM-type homeodomain is expressed in the developing central nervoussystem and is required for early postnatal survival.The EMBO J，1994，132876-2885)。
由于LHX4基因在小鼠出生后表達水平極度降低或消失，且LHX4基因敲除后的小鼠死亡，無法進一步研究該基因在神經(jīng)發(fā)育調(diào)控之外的功能作用(1.Li，H.，Witte，D.P.，Banford，W. W.，et al.Gsh-4 encodes a LIM-typehomeodomain，is expressed in the developing central nervous system and isrequired for early postnatal survival.The EMBO J，1994，132876-2885；2.SinghG，Kaur S，Stock JL et al.Identification of 10 murine homeobox genes.Proc.NatlAcad.Sci.USA，1991，8810706-10710)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了人同源盒基因LHX4在制備嗜鉻細胞瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明根據(jù)已經(jīng)報道的人同源盒基因LHX4基因序列，如序列表中序列1所示(參見專利申請00133460.3)，和含有人同源盒基因LHX4全長CDS的質(zhì)粒(NIH Genbank登錄號為AF179849)，利用人LHX4基因cDNA序列為探針，在成人多組織表達Array膜(multiple tissue expression array，MTE array)上通過放射性雜交的方法，研究了LHX4基因在成人不同組織中的表達情況，結(jié)果顯示全腦、大腦皮層、脊髓和胎腦有雜交信號出現(xiàn)。其中以胎腦信號最強。其余由強到弱依次為脊髓、全腦和大腦皮層，而人體其他組織中則沒有雜交信號出現(xiàn)。
他人和本發(fā)明的發(fā)明人都用實驗證明，LHX4是軀體運動神經(jīng)元發(fā)育和分化過程中發(fā)揮重要作用，是調(diào)節(jié)運動神經(jīng)元發(fā)育分化和軸突投射模式形成的一類重要轉(zhuǎn)錄因子(Sharma K，Sheng HZ，Lettier K et al.LIM homeoboxfactors Lhx3and LHX4 assign subtype identities for motor neurons.Cell，1998，95817-828；Thor S and Thomas JB.The Drosophila islet gene governs axonpathfinding and neurotransmitter identity.Neuron，1997，18397-407)。
盡管基因敲除是目前非常有效的基因功能研究手段，但由于LHX4基因敲除后的胎鼠因肺不擴張而死亡，無法進一步研究成年動物LHX4基因的功能。本發(fā)明采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將人LHX4基因CDS導入可誘導為神經(jīng)元的PC12(嗜鉻細胞瘤)細胞中，在細胞、分子水平從形態(tài)及功能等方面研究LHX4基因在靶細胞中所起的作用，與此同時，又將LHX4基因CDS反向克隆入具有篩選標志的表達載體啟動子下游，以構(gòu)建反義LHX4 RNA表達載體，再將重組質(zhì)粒導入靶細胞，可在靶細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出大量的反義LHX4 RNA片段，與靶細胞中內(nèi)源性LHX4基因轉(zhuǎn)錄出的正義LHX4 RNA互補結(jié)合，從而起到封閉LHX4基因翻譯表達的作用，用于分析LHX4基因產(chǎn)物的功能以及缺乏LHX4基因所致的病理性改變。
PC12細胞是來源于大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤克隆細胞株，在體外經(jīng)NGF定向誘導可向神經(jīng)細胞分化(Suzuki A，Tsutomi Y.Bcl-2 accelerates theneuronal differentiationnew evidence approaching to the biofunction of bcl-2 inthe neuronal system.Brain Res 1998，801(1-2)59-66)。我們將正、反義LHX4基因通過逆轉(zhuǎn)錄病毒分別導入靶細胞PC12后，以細胞基因組DNA為模板，PCR擴增證明轉(zhuǎn)導的正、反義LHX4基因已分別整合在靶細胞基因組DNA上。進而分別以正、反義LHX4基因轉(zhuǎn)染后靶細胞RNA為模板，采用RT-PCR方法檢測細胞內(nèi)LHX4 mRNA的表達水平，證實上述靶細胞中已轉(zhuǎn)錄出正、反義LHX4 RNA序列。正義LHX4基因轉(zhuǎn)染組細胞中的LHX4基因表達較空載體轉(zhuǎn)染組中有明顯增強，而反義LHX4基因轉(zhuǎn)染組細胞中的LHX4基因表達明顯被抑制。
導入正義LHX4基因的PC12嗜鉻細胞瘤靶細胞，細胞形態(tài)與空載體轉(zhuǎn)染組沒有明顯區(qū)別，但體外細胞增殖能力較其它轉(zhuǎn)染組明顯降低，細胞經(jīng)NGF誘導后，長出突起的細胞數(shù)量也明顯多于其它轉(zhuǎn)染組，而且細胞突起生長快、突起長度長，從而提示我們，高表達的LHX4基因可能具有促進PC12嗜鉻細胞瘤細胞向神經(jīng)分化的作用，且LHX4基因高表達后可能導致LHX4基因調(diào)控的某些下游基因的表達發(fā)生變化，從而有助于PC12靶細胞在神經(jīng)誘導分化中的突起生成；而轉(zhuǎn)染反義LHX4基因的PC12靶細胞，其細胞中的LHX4基因表達被有效封閉，體外培養(yǎng)時，可明顯觀察到該實驗組細胞的返祖現(xiàn)象——細胞增殖旺盛，貼壁性降低，多形成細胞團生長，具有類似腫瘤細胞的培養(yǎng)特性，經(jīng)NGF誘導后，該實驗組的細胞中能形成突起的細胞數(shù)較少，生長突起所需的時間長，細胞增殖速度仍明顯大于正義LHX4基因和空載體轉(zhuǎn)染組，細胞貼壁性也明顯降低，從而提示，LHX4基因表達部分封閉后的細胞中LHX4基因及其所調(diào)控的某些下游基因表達降低可能抑制PC12細胞向神經(jīng)誘導分化，并可能使PC12進一步去分化，從而增強PC12細胞的體外增殖能力。
上述研究結(jié)果表明，同源盒LHX4基因具有抑制PC12嗜鉻細胞瘤細胞體外增殖，以及促進PC12嗜鉻細胞瘤細胞向神經(jīng)分化和軸突生長的作用?？梢杂糜谥苽涫茹t細胞瘤基因治療藥物或肽類藥物。


圖1為Promega柱純化法回收純化探針(L200bp Ladder，A純化的LHX4探針)。
圖2為MTE Array膜與人LHX4 cDNA探針雜交結(jié)果。
圖3為pLXIN-正義LHX4重組質(zhì)粒酶切及PCR鑒定電泳圖譜，其中1.pLXIN質(zhì)粒/BamH I；2.pLXIN-正義LHX4重組質(zhì)粒/BamH I；3.DNA Marker；4.PCR鑒定擴增出重組質(zhì)粒中的LHX4片段；
5.pLXIN-正義LHX4重組質(zhì)粒/BamH I+Hpa I圖4為pLXIN-反義LHX4重組質(zhì)粒酶切及PCR鑒定電泳圖譜1.DNA Marker；2.pLXIN質(zhì)粒/BamH I；3.pLXIN-反義LHX4重組質(zhì)粒/BamH I；4.pLXIN-反義LHX4重組質(zhì)粒/BamH I+Hpa I；5.PCR鑒定擴增出重組質(zhì)粒中的LHX4片段；圖5為陽性克隆細胞中neo基因的PCR擴增結(jié)果，其中1.空載體感染后的PC12嗜鉻細胞瘤細胞；2.pLXIN-正義LHX4感染后的PC12細胞；3.pLXIN-反義LHX4感染后的PC12細胞；4.無病毒感染的PC12細胞；5.DNA Marker；圖6為陽性克隆細胞中LHX4基因表達的PCR鑒定結(jié)果，其中1.DNA Marker；2.空載體感染后的PC12嗜鉻細胞瘤細胞；3.pLXIN-正義LHX4感染后的PC12細胞；4.pLXIN-反義LHX4感染后的PC12細胞；圖7為轉(zhuǎn)染空載體和正、反義LHX4基因的PC12細胞生長曲線圖**與空載體比較，p＜0.01；++與反義LHX4比較，p＜0.01圖8為LHX4基因?qū)φT導PC12嗜鉻細胞瘤細胞神經(jīng)元突起生長的影響(NGF誘導9天)其中1為空載-PC12細胞的神經(jīng)元誘導后細胞形態(tài)；2為正義LHX4-PC12細胞的神經(jīng)元誘導后細胞形態(tài)；3為反義LHX4-PC12細胞的神經(jīng)元誘導后細胞形態(tài)。
具體實施例方式
實施例一 人同源盒基因LHX4在成人不同組織中的表達一.材料主要儀器HEAR hybrid雜交爐(Heraeus公司)，掃描儀(Kodak公司)。
主要試劑Huamn Ubiquitin Control cDNA Probes(Clontech公司，5ng/μl)，ExpressHyb雜交液(Clontech公司)，鮭精DNA(10mg/ml，ssDNA，GIBCO-BRL公司)，C0t-1DNA(1mg/ml，Gibrco公司)，20×SSC(pH7.0)，20％SDS(Sigma公司)，洗膜液12×SSC，1％SDS，洗膜液20.1×SSC，0.5％SDS，玻璃奶純化試劑盒(原平公司)，PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Promega公司)，EX Taq PCR系統(tǒng)(TaKaRa公司)。
雜交膜MTE Arrary膜(Multiple Tissue Expression Arrary，Clontech公司)放射自顯影α-32P dCTP(北京亞輝公司)，X光片(Kodak公司)，X光片壓片盒(汕頭醫(yī)學實驗儀器廠)，D-72顯影液，定影液(浙江嘉興市南湖攝影儀器廠)。
二.方法1.探針的制備和純化1.1.PCR法擴增探針(1).設(shè)計引物上游引物Primer1見序列表中序列4，下游引物Primer2見序列表中序列5。
(2).PCR擴增體系為TaKaRa公司Ex Taq PCR系統(tǒng)PCR buffer 2μl，DNTP 2μl，primer1 1μl，primer2 1μl，Ex Taq 0.5μl，模板0.5μl，ddH2O 13μl，共20μl。擴增條件為94℃3min，94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，30個循環(huán)，72℃10min，4℃保存。
1.2.探針的純化對PCR擴增后的產(chǎn)物用Promega柱純化的方法進行純化(1).50μl PCR擴增產(chǎn)物中加入100μl純化緩沖液(direct purificationbuffer)，充分混勻。
(2).再加入1ml PCR純化樹脂(wizard PCR preps DNA purificationresin)，混勻。
(3).將上述液體全部加入5ml注射器中，并裝好小柱子(Wizard PCRpurification Spin Column)。將注射器緩慢推下使所有液體通過小柱子。
(4).卸下注射器，加入2ml 80％的異丙醇，裝好小柱子并將注射器緩慢推下使所有液體通過小柱子。
(5).將小柱子裝入1.5ml Eppendorf管中，8000rpm離心1分鐘，使異丙醇徹底從小柱子上去除。
(6).將小柱子換入到干凈的Eppendorf管中，并從頂部加入30μl的ddH2O，靜置1分鐘，然后12000rpm離心20秒，回收液體。
(7).將所回收的液體取2μl進行瓊脂糖電泳，以檢測回收的效果。
1.3.探針的標記采用隨機引物標記試劑盒標記(Prime-a-Gene Labeling System，Promega)，操作步驟同Promega公司操作手冊。用于標記的DNA來源于PCR擴增的片段。
(1).25ng的DNA，用水補足30μl，98℃變性4分鐘，快速放到冰上。
(2).依次向管中加入以下試劑5×標記緩沖液10μl，dNTP混合物(無dCTP)2μl(終濃度為每種20μM)，10mg/ml BSA 2μl(終濃度為400μg/ml)。
(3).將1，2兩管混勻，然后加入〔α-32P〕dCTP 5μl(終濃度為50μCi，3,000/mmol)，Klenow酶(5U/μl)1μl(終濃度為100U/ml)。
室溫標記1小時，取1μl按下述方法測定標記效率，剩余的探針98℃變性5分鐘后加入雜交液中。將1μl標記產(chǎn)物稀釋500倍，取5μl按三氯乙酸沉淀法測定標記效率。探針的比活度一般約為1×108～1×109cpm/μg.。
1.4.MTE Array膜與特異性探針的雜交(1).準備ExpressHyb雜交液和鮭精DNA50-60℃預(yù)熱15ml ExpressHyb雜交液；98℃變性1.5mg鮭精DNA 5分鐘，并迅速置于冰浴中；將上述預(yù)熱好的ExpressHyb雜交液與變性后的鮭精DNA混勻。
(2).將MTE Array膜放入雜交管中并加入10ml步驟(1)中準備好的雜交液。
(3).保持65℃，連續(xù)震蕩中持續(xù)預(yù)雜60分鐘。
(4).將標記好的探針中加入30μg C0t-1DNA，150μg鮭精DNA和50μl 20×SSC，使總體積達到200μl.
(5).將上述步驟(4)中準備好的探針98℃變性5分鐘，然后68℃30分鐘(6).將步驟(5)中準備好的探針混合液加入剩下的5ml雜交液中，并確保兩種溶液能夠充分混合。
(7).從進行MTE Array預(yù)雜的雜交管中棄去預(yù)雜液，加入步驟(6)中準備好的雜交液，并盡量去除氣泡并使雜交液全面覆蓋膜。
(8).65℃持續(xù)震蕩雜交過夜(6-12小時)。
(9).雜交完畢后，到掉雜交液。
(10).加入200ml洗膜液1，65℃持續(xù)震蕩洗膜20分鐘。重復這一過程4次。
(11).然后加入200ml 55℃預(yù)熱的洗膜液2，55℃持續(xù)震蕩洗膜20分鐘。重復這一過程2-3次，洗膜的程度可用mintor來檢測。
(12).洗膜完畢后，將膜置于3M的濾紙上，去掉多余的水分，但不要使膜干。并將膜包入塑料薄膜中。
(13).將步驟1中處理好的膜與X光片一同置入壓片盒中，-70℃壓片7天。
(14).x光片顯影，分析結(jié)果。
三、結(jié)果1.探針的制備和純化以人LHX4基因的質(zhì)粒為模板，經(jīng)過PCR擴增和純化后，得到人LHX4 cDNA表達序列全長，以其做為MTE Array膜雜交的探針(結(jié)果見圖1)。
2.雜交及結(jié)果分析經(jīng)過多次反復雜交后，我們得到較為穩(wěn)定的雜交結(jié)果，并將雜交信號的位置與MTE Array膜上不同組織RNA的位置相比較，發(fā)現(xiàn)有雜交信號出現(xiàn)的位置依次是全腦，大腦皮層，脊髓，胎腦。其中尤以胎腦信號最強，其次信號由強到弱依次為脊髓，全腦，大腦皮層(結(jié)果見圖2)。
上述結(jié)果表明，我們所克隆到的人LHX4 cDNA全長序列在神經(jīng)組織具有特異性表達，而且這種表達主要局限在成人的神經(jīng)系統(tǒng)，但在成人神經(jīng)系統(tǒng)各組織的表達程度均明顯低于胎腦中的表達。由此我們可以推測人LHX4基因的表達并不止局限在胚胎組織中，在成人的神經(jīng)組織中也有特異性的表達。
實施例三 人同源盒LHX4基因轉(zhuǎn)染對PC12嗜鉻細胞瘤細胞體外增殖和分化的影響一、材料和方法1、質(zhì)粒、細胞株pLXIN逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體，6.1Kb，具有氨芐青霉素和新霉素抗性，購自生物試劑公司。SC712質(zhì)粒，本室首次克隆的含人同源盒基因LHX4全長CDS的質(zhì)粒，NIH Genbank登錄號AF179849。PC12細胞株，雄性大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤克隆的細胞株。膜上有NGF受體，在50ng/ml的NGF誘導9日后可分化為成熟的多巴胺能交感神經(jīng)元。
2、正、反義LHX4逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒(pLXIN-正義LHX4和pLXIN-反義LHX4)的構(gòu)建采用限制性內(nèi)切酶位點分析軟件，分析LHX4全長基因的限制性內(nèi)切酶位點，并根據(jù)pLXIN表達載體的多克隆位點，選擇適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶——HpaI和BamHI；設(shè)計含有所需酶切位點的LHX4基因CDS的正、反義PCR擴增引物，以PCR擴增方法，獲取LHX4基因的CDS片段(pLXIN-正義LHX4引物P1見序列表中序列6，P2見序列表中序列7；pLXIN-反義LHX4引物P1見序列表中序列8，P2見序列表中序列9)。酶切表達載體pLXIN和正、反義LHX4基因CDS，回收定量后，用T4DNA連接酶將線性化pLXIN分別與已酶切的正、反義LHX4基因CDS片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α菌株感受態(tài)細胞，氨芐青霉素抗性LB平板長出的菌落擴增后，提取質(zhì)粒DNA并酶切及PCR擴增鑒定，獲得pLXIN-正義LHX4和pLXIN-反義LHX4重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達質(zhì)粒。
3、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝經(jīng)15％胎牛血清、100U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的DMEM常規(guī)培養(yǎng)的PA317細胞，轉(zhuǎn)染前24hrs接種于35mm培養(yǎng)皿，轉(zhuǎn)染時，分別取待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒(pLXIN、pLXIN-正義LHX4和pLXIN-反義LHX4)各2μg，依據(jù)DOTAP基因轉(zhuǎn)染試劑操作步驟，轉(zhuǎn)染PA317細胞24hrs后，棄去含轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)液，每皿各加入2ml完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48hrs，細胞1∶5傳代，在含有G418(1mg/ml)的DMEM培養(yǎng)液中選擇培養(yǎng)，直到出現(xiàn)抗性克隆。
4、細胞基因組DNA提取和外源基因整合鑒定病毒包裝細胞經(jīng)500g離心后，使用細胞基因組DNA提取試劑盒，分別提取轉(zhuǎn)有pLXIN空載體、正義和反義LHX4基因的PA317-pLXIN空載體、PA317-正義LHX4和PA317-反義LHX4的基因組DNA，適當TE溶解后，紫外分光光度計A260定量。取適量細胞基因組DNA作為模板，分別使用neo基因引物(P1見序列表中序列10，P2見序列表中序列11，擴增片段為433bp)和正義、反義LHX4基因引物進行PCR擴增(98℃預(yù)變性5min，94℃60s，56℃50s，72℃60s，30個循環(huán)后72℃延伸10min)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，以鑒定病毒包裝細胞中是否有外源基因的整合。
5、PC12嗜鉻細胞瘤細胞體外培養(yǎng)(Greene LA and Tischler AS.Establishment of a noradrenergic clonal line of rat adrenal pheochromocytomacells which respond to nerve growth factor.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1976，732424-2428)PC12細胞培養(yǎng)于5％胎牛血清、10％馬血清、85％RPMI 1640培養(yǎng)液中(2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氫鈉，4.5g/L葡萄糖，10mMHEPES，1.0mM丙酮酸鈉)，37℃5％CO2。
6、包裝細胞病毒上清感染PC12嗜鉻細胞瘤靶細胞分別將含有pLXIN空載體、正義和反義LHX4基因的包裝細胞混合克隆病毒上清，在無菌條件下，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后分裝1ml/管，-80℃保存?zhèn)溆?。將PC12靶細胞培養(yǎng)至對數(shù)期，按3×105接種于35mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24hrs后，用無血清、無雙抗DMEM培養(yǎng)液洗細胞兩次后，分別加入已過濾的混合克隆包裝細胞上清1ml，37℃培養(yǎng)3hrs，其間每隔30min輕搖1次，之后補加1ml含雙倍血清的DMEM培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)，上述感染重復3次后，細胞按1∶5傳代至含有G418(1mg/ml)的DMEM培養(yǎng)液中選擇培養(yǎng)，直到出現(xiàn)抗性克隆。
7、細胞總RNA提取和外源基因表達的RT-PCR檢測取對數(shù)生長期的細胞(1×106)，使用TRIZOL試劑分別提取導入pLXIN空載體、正義和反義LHX4基因的PC12靶細胞總RNA，使用AMV逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，分別將2μg細胞總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA。取2μl合成的cDNA作為模板，PCR上、下游引物0.5μl(50pmol)、4×dNTP(400μmol)、TaKaRa Ex TaqTM酶0.5U，擴增條件為94℃預(yù)變性3min后，按94℃ 40s，60℃ 30s，72℃ 30s進行33個循環(huán)，72℃延伸10min。LHX4基因PCR引物，P1見序列表中序列2；P2見序列表中序列3；LHX4基因擴增片段長度為512bp。三磷酸甘油脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照，PCR引物，P1見序列表中序列12，P2見序列表中序列13；擴增片段長度為309bp。
8、細胞生長曲線測定對數(shù)生長期細胞，胰蛋白酶消化，吹打至單細胞懸液，計數(shù)后，細胞接種于96孔板中，(1.0×104細胞/孔)，共種植五塊板，采用MTT法，分別于0，48，96，120，144h時間點檢測細胞增殖，每個時間點樣本和空白各設(shè)8孔。檢測前于待測標本中每孔加MTT 20μl，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2小時后取出，小心吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 100μl，微量搖勻器搖勻5min，采用EL311SX型酶聯(lián)免疫檢測儀于595nm處檢測光吸收值，繪制細胞生長曲線。
9、PC12嗜鉻細胞瘤細胞誘導為神經(jīng)元的方法正常培養(yǎng)的PC12細胞，接種到35mm培養(yǎng)皿中，PC12細胞常規(guī)培養(yǎng)體系中加入NGF(25ng/ml)，37℃5％CO2培養(yǎng)誘導，倒置顯微鏡下觀察、計數(shù)，圖象分析儀檢測突起長度，所有數(shù)據(jù)以X±s表示，采用SAS軟件進行單因素多水平設(shè)計方差分析。
二、結(jié)果1、正、反義LHX4基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建根據(jù)LHX4基因CDS限制性內(nèi)切酶位點分析結(jié)果和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXIN的多克隆位點，設(shè)計含有BamH I和Hpa I酶切位點的LHX4基因CDS的正義、反義PCR擴增引物，以含有LHX4全長基因CDS的SC712質(zhì)粒為模板，PCR擴增獲取LHX4基因的CDS片段約1200bp。使用BamH I和HpaI分別雙酶切上述獲得的正義、反義LHX4基因CDS PCR擴增產(chǎn)物后，分別將其插入pLXIN逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，轉(zhuǎn)化受體菌后，挑取陽性克隆，快速提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)單、雙酶切和PCR擴增鑒定，構(gòu)建pLXIN-正義LHX4和pLXIN-反義LHX4逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(圖3，4)。
2、正、反義LHX4基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝、受體細胞的感染和篩選在DOTAP轉(zhuǎn)染試劑介導下，將重組質(zhì)粒pLXIN-正義LHX4、pLXIN-反義LHX4和pLXIN空載體分別導入PA317細胞中，經(jīng)G418篩選兩周后，出現(xiàn)G418抗性克隆。待各皿克隆長大后，分別收集PA317細胞包裝的正、反義LHX4和pLXIN空載體混合克隆的病毒上清，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，感染靶細胞PC12，用G418篩選出陽性克隆。
3、外源基因片段在靶細胞中整合的PCR鑒定使用針對載體上的neo基因和插入的正、反義LHX4基因CDS而設(shè)計的PCR引物，從陽性克隆細胞的基因組DNA中，分別擴增出neo基因的433bp和正、反義LHX4CDS片段約1200bp(圖5)。電泳結(jié)果證實，外源基因片段已經(jīng)整合到經(jīng)G418選擇的抗性克隆PC12靶細胞的基因組DNA中，而無外源基因病毒感染的對照組PC12細胞的PCR鑒定為陰性。
4、RT-PCR方法檢測感染后PC12陽性細胞mRNA中LHX4基因表達分別從轉(zhuǎn)染pLXIN-正義LHX4、pLXIN-反義LHX4和pLXIN空載體后挑選出的陽性克隆細胞中提取細胞總RNA，再以此RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的cDNA，又以轉(zhuǎn)錄出的cDNA為模板，用鑒定組織中LHX4基因表達的LHX4 PCR引物進行PCR擴增，擴增出512bp的LHX4基因片段(圖6)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pLXIN-正義LHX4的PC12細胞中已轉(zhuǎn)錄表達出高水平的LHX4基因，較空載體轉(zhuǎn)染組表達增強32.7％，而轉(zhuǎn)染pLXIN-反義LHX4的PC12細胞中LHX4基因的轉(zhuǎn)錄較空載體轉(zhuǎn)染組被封閉約28.3％。
5、正義、反義LHX4基因轉(zhuǎn)染對PC12嗜鉻細胞瘤細胞體外增殖的影響采用MTT法，測定轉(zhuǎn)基因后各組細胞增殖狀態(tài)的變化。如圖7所示，與轉(zhuǎn)導空載體pLXIN的對照組PC12細胞相比，轉(zhuǎn)染pLXIN-正義LHX4的PC12陽性克隆細胞的增殖受到一定程度的抑制，相反，轉(zhuǎn)染pLXIN-反義LHX4的PC12細胞的增殖狀況卻有明顯的增強。
6、正、反義LHX4基因轉(zhuǎn)染對PC12細胞神經(jīng)誘導后軸突生長的影響采用經(jīng)典方法(Biocca S et al.A macromolecular structure favouringmicrotubule assembly in NGF-differentiated pheochromocytoma cells(PC12).EMBO J.1983，2643-648)，分別對正、反義LHX4基因轉(zhuǎn)染的PC12嗜鉻細胞瘤細胞和空載體轉(zhuǎn)染的PC12細胞進行神經(jīng)誘導，在相同的誘導時間和條件下，比較上述不同轉(zhuǎn)染組細胞經(jīng)NGF誘導后的細胞形態(tài)和軸突生長狀態(tài)。結(jié)果顯示，NGF誘導9天時，轉(zhuǎn)染空載體的PC12細胞，有少數(shù)細胞有軸突生長；而轉(zhuǎn)染正義LHX4的PC12細胞中長出突起的細胞數(shù)量明顯增多，而轉(zhuǎn)染反義LHX4的PC12細胞經(jīng)NGF誘導后，長出突起的細胞數(shù)較少，且細胞大多聚集在一起形成細胞團，貼壁性明顯減弱，細胞團中心的細胞脫落形成環(huán)狀(圖8)。統(tǒng)計學分析各組NGF誘導后長出突起的細胞計數(shù)表明，三個轉(zhuǎn)染組之間存在明顯差異(表1)。同時觀察NGF誘導后的細胞突起生長狀態(tài)時發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染正義LHX4的PC12細胞經(jīng)誘導后細胞長出的突起長度最長，與空載體轉(zhuǎn)染組及反義LHX4轉(zhuǎn)染組之間均存在明顯差異，而誘導后細胞突起長度在空載體轉(zhuǎn)染組和反義LHX4轉(zhuǎn)染組之間并無顯著性差異(表2)。
表1不同轉(zhuǎn)染組細胞NGF誘導后有突起細胞計數(shù)

**與空載體比較，p＜0.01；++與反義LHX4比較，p＜0.01表2不同轉(zhuǎn)染組細胞NGF誘導后的神經(jīng)元突起生長

**與空載體比較，p＜0.01；++與反義LHX4比較，p＜0.01
序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所<120>人同源盒基因LHX4在制各嗜鉻細胞瘤治療藥物中的應(yīng)用<130>
<160>13<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2021<212>DNA<213>
<400>1gacgtcgcat gctcccggcc gccatggcgg ccgcgggaat tcgattggtg gcgacgactc 60ctggagcccg tcagtatcgg cggaattcgc ggccgcgtcg accggagagc gagatcaaag120ggattggaaa cagactgggg actggcgggg ggagggggcc ggccagcctg tggagtcctc180cctgagaagc ggagggcccg gcttccaccg tgactccagc ggcctgcttg gggttttaat240tattattttg aaatttctga atcgagctag agcgagagag cgagagatct ccgtagactg300cgactcgctg gctttcgctc cgagatgatg cagagtgcga ctgtccccgc ggaaggggct360gtcaaggggc tcccggagat gctaggtgtg ccgatgcaac agattcccca gtgcgctggc420tgcaaccagc acatcctgga caagttcatc ctgaaggtcc tggacagaca ctggcacagc480tcctgcctca agtgtgcaga ctgccagatg cagctggcgg acaggtgctt ctccagggct540gggagcgtct actgcaagga ggacttcttc aagcgcttcg gcacaaaatg cacggcctgc600cagcagggta tccccccaac ccaggtggtc cgcaaggccc aggactttgt ctaccacctg660cactgctttg cttgcatcat ctgcaaccgg cagctggcca cgggggacga attctacctc720atggaggacg ggcggctggt gtgcaaggaa gactacgaga cagccaagca gaacgatgac780tcagaggctg gagctaagcg gccccggacc accatcacag ccaagcagct ggagacatta840aagaatgcat acaagaactc ccccaagcct gcccggcacg tgagggagca gctgtcctca900gagacaggcc tggacatgag ggtcgtacag gtttggtttc agaacagaag ggccaaagag960aaacgcctga agaaggatgc agggcggcac cgctgggggc agttctataa gagcgtcaag 1020aggagccggg gcagcagcaa gcaggagaag gagagctctg cagaggactg tggggttagt 1080gacagtgagc tgagcttccg agaggatcaa attctctcag aacttggcca caccaatagg 1140atttatggca acgtggggga cgttacaggc ggacagttaa tgaatgggag cttctccatg 1200gacgggacag gacaatccta tcaggacttg agggatggga gcccctatgg aatcccccag 1260
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<400>2gccatcgctg gggccagttc 20<210>3<211>19<212>DNA<213>
<400>3ctaaaaagga ggatggtcc 19<210>4<211>21<212>DNA<213>
<400>4atgatgcaga gtgcgactgt c 21<210>5<211>20<212>DNA<213>
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<400>6aattcgttaa catgaacatg atgcagagtg cgact35<210>7<211>27<212>DNA<213>
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<400>8cgcggatcca tgatgcagag tgcgact 27<210>9<211>30<212>DNA<213>
<400>9ttcgttaact taaaaaggag gatgatccat 30<210>10<211>25<212>DNA<213>
<400>10tccatcatgg ctgatgcaat gcggc 25<210>11<211>26<212>DNA<213>
<400>11gatagaaggc gatgcgctgc gaatcg 26
<210>12<211>20<212>DNA<213>
<400>12tccctcaaga ttgtcagcaa 20<210>13<211>20<212>DNA<213>
<400>13agatccacaa cggatacat t20
權(quán)利要求
1.人同源盒基因LHX4在制備嗜鉻細胞瘤治療藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中的人同源盒基因LHX4具有序列表中序列1所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于LHX4基因能抑制嗜鉻細胞瘤細胞體外增殖，促進嗜鉻細胞瘤細胞向神經(jīng)元分化和軸突生長。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所說的藥物為基因治療藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了人同源盒基因LHX4在制備嗜鉻細胞瘤治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將人LHX4基因轉(zhuǎn)導入嗜鉻細胞瘤細胞PC12，LHX4基因具有抑制PC12細胞體外增殖，以及促進PC12細胞向神經(jīng)元分化和軸突生長的作用，可用于制備嗜鉻細胞瘤治療藥物。
文檔編號A61P35/00GK1714870SQ200410009289
公開日2006年1月4日 申請日期2004年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月1日
發(fā)明者葛學銘, 范明, 呂藝, 劉淑紅, 吳燕, 劉濤 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所