專利名稱：胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞及其制備，屬于干細(xì)胞與組織工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
種子細(xì)胞來源是組織工程和細(xì)胞治療的首要問題。由于自體組織細(xì)胞來源少、擴(kuò)增困難，體外培養(yǎng)時(shí)容易丟失表型，因此近年來人們逐漸把注意力投注在干細(xì)胞上。這些細(xì)胞在體外具有一定的自我更新能力，能在特定的誘導(dǎo)條件下分化為一種、多種，甚至人體所有的細(xì)胞類型，因而顯示了很好的臨床應(yīng)用前景。目前為止分離獲得的干細(xì)胞包括兩種，即胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞具有全能的分化能力和無限的增殖能力，但受倫理學(xué)和本身在分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化和免疫原性等方面人類認(rèn)識(shí)和控制上的不足，短期內(nèi)無法應(yīng)用于臨床。成體干細(xì)胞是從成體的組織中分離獲得的一類干細(xì)胞，這些細(xì)胞具有一定的體外增殖能力，在一定的條件下能在體外或體內(nèi)分化為一種或多種細(xì)胞類型。目前研究最多的是骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，該細(xì)胞取材相對(duì)較為容易。其他組織，包括脂肪、肌肉、神經(jīng)、牙髓等成體組織中也發(fā)現(xiàn)有干細(xì)胞的存在，但取材和分離相對(duì)而言較為困難。并且這些細(xì)胞在取材的時(shí)候都會(huì)對(duì)患者造成創(chuàng)傷，因而不容易被患者接受；體外擴(kuò)增條件也不容易控制、花費(fèi)大。另外一個(gè)不容忽略的問題是，這些細(xì)胞都具有一定的抗原性，異體移植時(shí)會(huì)帶來免疫排斥反應(yīng)問題，因此在臨床應(yīng)用時(shí)會(huì)受到限制?；诖?，尋找一種收獲量大、免疫原性小、而又容易獲得的干細(xì)胞來源更具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
胎盤是胎兒的附屬物，也是一個(gè)暫時(shí)性器官，在胎兒娩出后即完成了歷史使命，通常都被遺棄處理。胎盤本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜，由血管系統(tǒng)、間充質(zhì)成分和滋養(yǎng)細(xì)胞組成。除具有母兒物質(zhì)交換功能外，還是一個(gè)重要的分泌器官，執(zhí)行著極其復(fù)雜的生理功能。近年研究表明，胎盤組織中具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞類似的貼壁細(xì)胞。國(guó)外Jaroscak等(2000年)報(bào)道從凍存的胎盤組織中分離培養(yǎng)出異質(zhì)性貼壁細(xì)胞。國(guó)內(nèi)張毅等報(bào)道采用酶消化法從胎盤組織中獲得貼壁細(xì)胞作為造血干細(xì)胞的支持細(xì)胞。因此，胎盤組織有望成為間充質(zhì)干細(xì)胞的潛在的豐富的來源。目前國(guó)內(nèi)外僅有零星文獻(xiàn)涉及胎盤來源貼壁細(xì)胞的小量分離，主要用于造血支持研究，而對(duì)胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞的規(guī)?；蛛x、純化和擴(kuò)增方法則缺乏的詳細(xì)的技術(shù)資料。本發(fā)明的目的在于公開一種胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞以及從胎盤組織中大規(guī)模獲取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，具體涉及細(xì)胞的分離、純化、鑒定和擴(kuò)增。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是一種胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞及其制備方法。該細(xì)胞取自產(chǎn)后廢棄的健康胎盤組織，該細(xì)胞群具有與骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞類似的生物學(xué)特性，是細(xì)胞治療和組織工程研究與應(yīng)用潛在的細(xì)胞來源。其制備方法如下1)對(duì)新鮮娩出胎盤立即進(jìn)行放血、灌注，以去除血細(xì)胞和組織碎片；2)持續(xù)灌注，或?qū)⑻ケP小葉剪碎，用膠原酶消化，收集細(xì)胞成分；3)采用免疫磁珠吸附法或Percoll密度梯度離心法收集單個(gè)核細(xì)胞；4)采用流式細(xì)胞儀或體外誘導(dǎo)分化法鑒定所獲得細(xì)胞群的表型和細(xì)胞周期特征；5)測(cè)定細(xì)胞倍增時(shí)間和生長(zhǎng)曲線；6)采用常規(guī)的體外誘導(dǎo)體系，體外誘導(dǎo)胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞的能力。
7)將胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞與同種異體的外周血T-淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)，檢測(cè)胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞是否刺激T-淋巴細(xì)胞增殖，是否抑制同種異體樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)，不依賴于分泌因子的通過細(xì)胞機(jī)制產(chǎn)生的T-淋巴細(xì)胞增殖；將胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞注入大鼠皮下，檢測(cè)免疫反應(yīng)情況，以確定該細(xì)胞的免疫原性。
8)采用生物反應(yīng)器對(duì)所獲得的細(xì)胞進(jìn)行規(guī)?；瘮U(kuò)增。
有益效果本發(fā)明從產(chǎn)后廢棄的胎盤組織中提取間充質(zhì)干細(xì)胞。該細(xì)胞取材容易，產(chǎn)量高，體外容易擴(kuò)增，擴(kuò)增過程中能夠保持細(xì)胞表型和多向分化能力。并且，該細(xì)胞群還具有較低的免疫原性，因而是細(xì)胞治療、基因治療，以及骨與軟骨組織工程理想的種子細(xì)胞來源，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1灌注法獲得胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞胎盤娩出后立即置于無菌托盤或容器中，經(jīng)臍動(dòng)脈注入含有抗凝劑和抗生素的平衡鹽溶液，放血，并開始灌注?？鼓齽┛梢允?~100u/mL的肝素，抗生素可以是100u/mL的青鏈霉素。收集灌注液，離心獲得細(xì)胞成分，再將細(xì)胞成分重新懸浮，用密度為1.073g/mL的percoll，以500g離心力離心30分鐘，收獲界面細(xì)胞層，PBS洗滌后接種培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板，或直接用于其它目的。也可以用D7-FIB或NGFR標(biāo)記的免疫磁珠來分離帶有某種特殊標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞。
實(shí)施例2酶消化法獲得胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞胎盤娩出后立即置于無菌托盤或容器中，經(jīng)臍動(dòng)脈注入含有抗凝劑和抗生素的平衡鹽溶液，放血，并開始灌注?？鼓齽┛梢允?~100u/mL的肝素，抗生素可以是100u/mL的青鏈霉素。初步灌注后無菌剪取胎盤小葉，用胰蛋白酶或膠原酶消化胎盤組織，獲得細(xì)胞懸液，再將細(xì)胞懸液過細(xì)胞篩，除去組織碎片和血細(xì)胞，獲得的細(xì)胞重新懸浮，用密度為1.073g/mL的percoll，以500g離心力離心30分鐘，收獲界面細(xì)胞層，PBS洗滌后接種培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板，或直接用于其它目的。也可以用D7-FIB或NGFR標(biāo)記的免疫磁珠來分離帶有某種特殊標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞。
實(shí)施例3胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的方法誘導(dǎo)胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞的表型，如CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、CD166、HLA-DR等。同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞周期，確定處于G0-G1期細(xì)胞的比例。
結(jié)果顯示，經(jīng)過體外誘導(dǎo)后的胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞。流式細(xì)胞以檢測(cè)表明該細(xì)胞CD29、CD44、CD105、CD166陽性，CD34、CD45、HLA-DR陰性。處于G0-G1期的細(xì)胞占95％以上。
權(quán)利要求
1.一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于應(yīng)用灌注法或酶消化法從胎盤組織中分離間充質(zhì)干細(xì)胞。所獲得的細(xì)胞具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的特征，如自我更新能力和多向分化潛力。
2.權(quán)利要求1中所述的胎盤可以是人自然分娩或剖腹產(chǎn)后廢棄的胎盤，也可以是哺乳動(dòng)物的胎盤。產(chǎn)婦或動(dòng)物必須經(jīng)過健康檢查，無遺傳病、感染性疾病，不攜帶病原。胎盤本身必須新鮮，或放血后4℃保存2-24小時(shí)，或冷凍保存后仍有活力，同時(shí)離體后保持清潔無污染。
3.權(quán)利要求1中所述的灌注法是指在胎兒娩出后立即放血，并經(jīng)臍動(dòng)脈插管進(jìn)行灌注。灌注液可以是生理鹽水或PBS類的平衡鹽溶液，也可以是無血清的細(xì)胞培養(yǎng)基。灌注液中添加抗凝劑和抗生素?？鼓齽┛梢允歉嗡亍？股乜梢允乔嗝顾睾玩溍顾?，也可以是慶大霉素。
4.權(quán)利要求1中所述的酶消化法是指應(yīng)用膠原酶I，濃度可以是0.5％-1.5％，或應(yīng)用胰蛋白酶，濃度可以是0.1％-1％，胰蛋白酶中可以加入0.01％-0.02％的EDTA。
5.權(quán)利要求1中所述的胚胎來源的間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志CD29、CD44、CD105、CD166陽性，CD34、CD45、HLA-DR陰性。處于G0-G1期的細(xì)胞占95％以上。細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)的誘導(dǎo)液處理后可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞等細(xì)胞類型。
6.權(quán)利要求1中所述的胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過percoll密度梯度離心法或免疫磁珠分離法得到純化。
7.權(quán)利要求6中所述的percoll的密度可以是1.073g/ml。
8.權(quán)利要求6中所述的免疫磁珠法可以是D7-FIB標(biāo)記，也可以是NGFR標(biāo)記。
9.權(quán)利要求1中所述的胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞可以用于細(xì)胞治療、基因治療，也可以作為種子細(xì)胞用于組織工程。
全文摘要
本發(fā)明涉及胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞及其制備，屬于干細(xì)胞和組織工程領(lǐng)域。胎盤從子宮娩出后立即放血、灌注。然后采用持續(xù)灌注或膠原酶消化法獲得單細(xì)胞懸液，后者經(jīng)密度梯度離心法或免疫磁珠分離法獲得間充質(zhì)干細(xì)胞。所獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞具有與骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞類似的體外增殖潛力和多向分化潛力。該細(xì)胞群還具有免疫原性較低的特點(diǎn)，是組織工程和細(xì)胞治療潛在的種子細(xì)胞來源，具有重要的臨床意義。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1746297SQ20041000953
公開日2006年3月15日 申請(qǐng)日期2004年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月9日
發(fā)明者王常勇, 郭希民, 周曉東, 段翠密, 江紅, 董靈芝, 李晶 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所