專利名稱：含白頭翁總皂甙元組合物的藥物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含白頭翁總皂甙元組合物的藥物及其制備方法和白頭翁總皂甙元組合物在制藥中的應用，屬于醫(yī)藥技術領域。
背景技術：
白頭翁Pulsatilla chinensis(bge.)regel在植物分類學上屬毛茛科植物。近幾年來對白頭翁的水及醇提取液進行了一些藥理研究研究，發(fā)現白頭翁的提取物具有抗菌、抗阿米巴原蟲作用，具殺死陰道滴蟲的作用，及鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛等作用。白頭翁的主要有效成分有白頭翁素及白頭翁皂甙等，白頭翁皂甙元組合物可以由白頭翁藥材中直接提取得到，也可以從白頭翁藥材中提取白頭翁總皂甙，總皂甙再進行水解得到白頭翁總皂甙元提取物。所說的白頭翁總皂甙元組合物至少含有以下四種單體組分所組成3β，23羥基羽扇豆-Δ20(29)-烯-28-酸；3-羥基-23-羥基羽扇豆-Δ20(29)-烯-28-酸；齊暾果酸及長春藤甙遠等。
但到目前為止，尚未見到有將白頭翁總皂甙元制備成藥物的文獻報道，發(fā)明人經過大量的試驗研究證實，白頭翁總皂甙元還具有抗腫瘤和免疫活性調節(jié)作用。在發(fā)現白頭翁總皂甙元新的治療和調節(jié)功能的基礎上，完成了藥用用途的發(fā)明。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供由白頭翁總皂甙元組合物為主要活性成分的藥物。
本發(fā)明的另一個目的是提供含白頭翁總皂甙元組合物的藥物及其制備方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供白頭翁總皂甙元組合物在制備抗腫瘤和免疫活性調節(jié)作用的藥物中的應用。
本發(fā)明的藥物是由白頭翁總甙元組合物為活性成份，以其單一成分或加入任意比例的一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體和/或賦形劑及其他具有協(xié)同作用的成分組成。
本發(fā)明藥物的口服劑型中，白頭翁總甙元組合物的優(yōu)選含量為占總成分重量的50-90％。
本發(fā)明藥物的口服劑型中，白頭翁總甙元組合物的最佳含量為占總成分，60-70％。
本發(fā)明的藥物制備方法是將白頭翁水煮或醇提取，過濾所得的提取液，將濾液加于預先用酸和堿處理的大孔吸附樹脂柱，用去離子水洗柱直到洗出液無顏色，后用乙醇洗脫。收集乙醇洗脫液，并減壓回收，蒸干，將所得濃縮物再用乙醇溶解，放置，并濾過，濾液減壓濃縮干燥，得到黃色粉末狀白頭翁總皂苷。取白頭翁總皂苷，用硫酸或鹽酸加熱水解小時，放冷，過濾或離心，取沉淀，即得白頭翁總甙元組合物，取白頭翁總甙元組合物和醫(yī)藥上可接受的載體和/或賦形劑按選定的比例混合，制成常規(guī)的劑型。
本發(fā)明的白頭翁總甙元組合物在藥物中的應用包括白頭翁總皂甙元組合物在制備抗腫瘤藥物中的應用；白頭翁總皂甙元組合物在制備促進脾NK細胞活性藥物中的應用；白頭翁總皂甙元組合物在制備促進THP-1細胞產生TNFα藥物中的應用；白頭翁總皂甙元組合物在制備能促進IL-8產生的藥物中的應用。
本發(fā)明藥物的服法及用量口服每次白頭翁總皂甙元組合物凈含量50-300mg，每日1-3次。
肌肉注射每次白頭翁總皂甙元組合物凈含量50-200mg，每日1-2次。
本發(fā)明的積極效果在于提供了一種新的，以白頭翁總皂甙元組合物為活性成分的藥物，將該藥物應用于抗腫瘤和免疫活性調節(jié)中，能取得抗腫瘤和免疫活性調節(jié)的良好效果。
以下結合實驗對本發(fā)明的積極效果進一步驗證說明實驗例1白頭翁總甙元組合物抗腫瘤作用研究。
材料和方法動物P388腹水型、S180實體肉瘤、肝癌腫瘤腹水傳代小鼠，均購自吉林省腫瘤研究所。昆明種小白鼠，體重18-22g，雌雄各半，購自長春市綠園區(qū)科新實驗動物養(yǎng)殖場。合格證號吉動質字10-1015。
藥品白頭翁總甙元組合物自制。
方法試驗小組隨機分為對照組(ig蒸餾水20ml.kg-1)，取接種7-10天的荷瘤動物，脫頸椎處死，在無菌條件下，消毒腹部皮膚，抽取乳白色瘤液，以生理鹽水按1∶2比例稀釋，然后給正常動物接種，每只0.2ml，腹水型接種于雌性動物腹腔，實體型接種于雄性動物腋窩皮下，接種后次日開始分組給藥，觀察對腹水型的生命延長率及對實體型的抑瘤率，結果用統(tǒng)計學t檢驗處理。見下表。
表1白頭翁總甙元組合物對動物移植性腫瘤P388的影響

注提取物1為白頭翁總皂甙元組合物除去3β，23羥基羽扇豆-Δ20(29)-烯-28-酸；3-羥基-23-羥基羽扇豆-Δ20(29)-烯-28-酸兩種單體化合物的白頭翁總皂甙元提取物。
*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001以下同略表2白頭翁總甙元組合物對動物稱植性腫瘤S180的影響

提取物1為白頭翁總皂甙元組合物除去3β，23羥基羽扇豆-Δ20(29)-烯-28-酸；3-羥基-23-羥基羽扇豆-Δ20(29)-烯-28-酸兩種單體化合物的白頭翁總皂甙元提取物。
表3白頭翁總甙元組合物對動物移植性腫瘤Hep-A-22的影響

提取物1為白頭翁總皂甙元組合物除去3β，23羥基羽扇豆-Δ20(29)-烯-28-酸；3-羥基-23-羥基羽扇豆-Δ20(29)-烯-28-酸兩種單體化合物的白頭翁總皂甙元提取物.
我們的離體試驗研究證明白頭翁總甙元組合物在100-0.1μg/ml劑量范圍內對人宮頸癌(HeLa)細胞株的增殖均有明顯的抑制作用。在低劑量(0.1μg/ml)時，較4種陽性藥物(硫酸長春新堿；甲氨蝶呤；順鉑；鹽酸阿霉素)的抗癌活性還強。對A549和HepG2等細胞株在本品高劑量時對細胞的增殖有抑制作用。本試驗研究表明白頭翁總甙元組合物(200mgkg-1)和(100mgkg-1)對小鼠S180肉瘤和P388腹水均具有明顯的抑制作用，對Hep-A-22腹水型也有一定的抑制作用。綜上所述，白頭翁總甙元組合物無論在整體或離體條件下，均具有抗腫瘤作用。
實驗例2白頭翁總甙元組合物對腫瘤細胞株增殖的抑制作用。
實驗目的采用MTT比色法，檢測受試藥物對離體癌細胞的增殖抑制作用，比較藥物的抗癌活性。本試驗按照中藥新藥研究指南的規(guī)定，受試樣品分5個劑量組，與不同作用機理的陽性對照藥進行抗癌活性比較。
儀器和試劑Eagle’s MEM培養(yǎng)基(Gibco，USA)；胰蛋白酶(Trypsin)(Gibco，USA)；96孔培養(yǎng)板(Costar，USA)，四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma，USA)；酶標光度計(CliniBio 128C，EC)；胎牛血清(中國醫(yī)學科學院血液研究所，批號200004)；CO2培養(yǎng)箱(SANYO，MCO-175M，Japan)，其余試劑均為國產AR。
陽性對照藥硫酸長春新堿(白色凍干粉)，廣州明興制藥廠；批號010701。甲氨蝶呤(白色凍干粉)淅江萬馬藥業(yè)有限公司；批號010301。順鉑(白色凍干粉)，山東省德州制藥廠，批號010914。鹽酸阿霉素(桔紅色凍干粉)，深圳萬樂藥業(yè)有限公司，批號0111E1。
腫瘤細胞株人宮頸癌細胞株(HeLa，ATCC)購自武漢大學菌種保藏中心。
受試樣品白頭翁總甙元組合物，淡色結晶自制，加入8％二甲基乙酰胺助溶，藥物充分溶解在培養(yǎng)液中，過濾除菌備用。
細胞培養(yǎng)常規(guī)傳代培養(yǎng)。
實驗方法取生長狀態(tài)良好的上述細胞各一瓶，制成細胞懸液，以1×104/孔100μl接種在96孔培養(yǎng)板中，同時加入受試樣品20μl，10倍稀釋成5個不同濃度，陰性對照組加入不含樣品的培養(yǎng)液20μl，溶劑對照組加入與樣品組等體積的含8％二甲基乙酰胺的培養(yǎng)液20μl。陽性對照組加入不同作用機理的抗癌藥物20μl，并稀釋成5個劑量濃度。樣品與細胞在含5％CO2，37℃飽和濕度下孵育48h。加入MTT溶液(1mg/ml)20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，吸棄培養(yǎng)液，加入100％二甲基亞砜100μl，經微量混合振蕩器振蕩10分鐘后，酶標儀測定各孔光密度值(OD)。λ測量＝550nm，λ參考＝620nm。數據經“t”顯著性檢驗。
實驗結果表4.白頭翁總甙元細合物對HeLa細胞株增殖活性的影響x

提取物1為白頭翁總皂甙元組合物除去3β，23羥基羽扇豆-Δ20(29)-烯-28-酸；3-羥基-23-羥基羽扇豆-Δ20(29)-烯-28-酸兩種單體化合物的白頭翁總皂甙元提取物.
各加藥組分別與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表4結果表明，樣白頭翁總甙元組合物對人宮頸癌細胞的增殖有顯著的抑制作用，劑量在0.1μg/ml時對細胞在增殖仍有顯著的抑制作用(P＜0.01)。溶劑對照組在最高濃度時對細胞的增殖有一定抑制作用，濃度降低其抑制作用消失。順鉑在高劑量時，HeLa細胞不能增殖，在1.0μg/ml對細胞的增殖有顯著抑制作用，而0.1μg/ml時抑制作用降低。長春新鹼在高劑量時對細胞增殖有抑制作用，低劑量時作用下降。氨甲蝶呤在不同濃度時，對HeLa細胞的增殖均有抑制作用。
實驗例3白頭翁總甙元組合物對環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下小鼠脾NK細胞活性。
藥品與試劑細胞培養(yǎng)試劑Eagle MEM培養(yǎng)基(Gibco，UAS)胰蛋白酶(Gibco，USA)胎牛血清(中國醫(yī)學科學院血液研究所提供)；曲拉通(TritonX-100，Sigma)；還原型輔酶I(CoI，NADH，Sigma)；丙酮酸鈉(上海生化試劑廠)；環(huán)磷酰胺(CY，上海第十二制藥廠)。陽性對照藥人參莖葉皂苷，黃色粉沫，純度為95％，由白求恩醫(yī)科大學提供。
實驗設備與材料CO2培養(yǎng)箱(SANYO，MCO-175M，Japan)；超凈工作臺(CJ-1，蘇州長橋凈化設備廠)；紫外線光度計(TU-1221，北京瑞利分析儀器廠)自動酶標光度計(clincbio，EC-128C)倒置顯微鏡(CK40-F200，日本奧林巴斯公司)；96孔培養(yǎng)板(Costar，USA)離心機(LD5-2A，北京醫(yī)用離心機廠)。
動物、細胞株
昆明種小白鼠，封閉群，實驗動物購于國家動管會認證頒發(fā)實驗動物合格證的單位大連市藥品檢定所動物實驗基地購進。
白血病細胞株(K562，購于上海細胞生物研究所)。
小鼠纖維母細胞系(L-929，衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所提供)。
小鼠脾臟NK細胞，自備。
實驗方法(一)、實驗分組實驗分六組，每組10只小鼠，雌雄各半。生理鹽水組每只小鼠每天腹腔注射生理鹽水0.2ml，連續(xù)15天；環(huán)磷酰胺組(CY)每只小鼠每5天腹腔注射環(huán)磷酰胺30mg.Kg-1，共3次；白頭翁總甙元組合物環(huán)磷酰胺同上給藥，同時每天腹腔注射白頭翁總甙元組合物10mg.Kg-1和5mg.Kg-12個劑量組，連續(xù)15天；人參莖葉皂苷組環(huán)磷酰胺同上給藥，同時每天腹腔注射人參莖葉皂苷5mg.Kg-1，連續(xù)15天；溶劑對照組環(huán)磷酰胺同上給藥，同時每天腹腔注射等體積助溶劑二甲基乙酰胺(800μl/Kg)，連續(xù)15天。各加藥組給藥體積均為0.2ml。
(二)、小鼠脾細胞的制備方法1、小鼠眼球放血，拉頸處死，浸75％C2H5OH1分鐘。
2、無菌取脾，放置在無血清的MEM培養(yǎng)液中。
3、將脾剪成小塊，放置在培養(yǎng)皿中，注射器芯研磨至單個細胞，過200目尼龍網，1000rpm離心5分鐘。
4、棄上清液，輕輕叩松細胞沉淀。
5、加6ml雙蒸水輕輕振蕩30秒。
6、加2ml雙倍生理鹽水(3.6％NaCl)。
7、1500rpm離心2分鐘，加紅細胞洗滌液，再濾過一次。
8、離心后用EagleMEM制備成脾細胞懸液，1×107細胞/ml；L929配成2×105細胞/ml。
(三)、白頭翁總甙元組合物對小鼠脾NK細胞殺傷活性的影響—MTT法測定1、把靶細胞(L929)細胞懸液加入96孔平底培養(yǎng)板中，0.1ml/孔，37℃，5％CO2，至少培養(yǎng)1小時。
2、待靶細胞成一單層細胞，每孔加0.1ml效應細胞(效靶比10∶1)，每個樣品5孔，靶細胞對照孔加培養(yǎng)液0.1ml。
3、混合后的細胞，放置37℃，5％CO2，孵育48小時。
4、棄上清，用生理鹽水(37℃)輕輕灌滿各孔，反復3次，濾紙吸于各孔。
5、每孔加入MTT孵育4小時，終止反應，100％二甲基亞砜。
6、酶標儀492nm測OD值，參考波長450nm。
(四)、白頭翁總甙元組合物對小鼠脾NK細胞活性的影響—胞漿乳酸脫氫酶(LDH)釋放法1、各實驗組脾細胞為效應細胞，每管取效應細胞0.1ml(1×106細胞/管)，加靶細胞(YAC-1)懸液0.1ml(2.0×105細胞/管)加小牛血清0.1ml，補加1640培養(yǎng)液至1ml，每組設5個平行樣。
2、自然釋放管YAC-1細胞懸液0.1ml，小牛血清0.1ml，補加培養(yǎng)液0.8ml。
3、最大釋放管YAC-1細胞懸液0.1ml，小牛血清0.1ml，1％Triton-1000.8ml。
上述各試驗組置37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中，飽和濕度孵育18h，1000r/min離心5min，取全部上清。加LDH反應液3ml，用分光光度計以340nm，32℃恒溫測定吸光度值，每15s測1次共2min。
實驗結果表5.白頭翁總甙元組合物對小鼠脾NK細胞殺傷活性的影響—MTT法。

各加藥組與模型組比較*P＜0.05，***P＜0.001.
結果表明白頭翁總甙元組合物和人參莖葉皂苷對小鼠脾NK細胞殺傷活性與模型組比較有顯著性差異。
表6.白頭翁總甙元組合物對小鼠脾NK細胞活性的影響—胞漿乳酸脫氫酶(LDH)釋放法

各加藥組與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01.***P＜0.001結果表明白頭翁總甙元組合物5-10mg/Kg對小鼠脾NK細胞殺傷活性與模型組比較差異顯著，5mg/Kg作用更明顯(P＜0.001)。人參莖葉皂苷與模型組比較差異顯著(P＜0.01)。
實驗結論白頭翁總甙元組合物對環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下小鼠脾NK細胞活性影響，采用MTT法和胞漿乳酸脫氫酶(LDH)釋放法兩種實驗方法。實驗結果表明白頭翁總甙元組合物對免疫功能低下小鼠脾NK細胞活性有明顯促進作用(P＜0.05，P＜0.001)，兩種方法結果一致。白頭翁總甙元組合物能提高免疫功能低下小鼠細胞免疫功能，在免疫低下性疾病(如腫瘤)的治療中有重要意義。
具體實施例方式
實施例1取白頭翁1kg加適量的水，加熱煮沸三次，(每次40分鐘)。收集并合并所得的水提液，過濾，將濾液加于預先用酸和堿處理的大孔吸附樹脂柱，用去離子水洗柱直到洗出液無顏色，后用70％乙醇洗脫。收集70％乙醇洗脫液，并減壓回收，蒸干，將所得濃縮物用70％乙醇溶解，放置，并濾過，濾液減壓濃縮干燥，得到黃色粉末狀白頭翁總皂苷。取白頭翁總皂苷，用10％的硫酸或鹽酸80℃加熱水解8小時，放冷，過濾或離心，取沉淀，即得白頭翁總甙元組合物，取白頭翁總甙元組合物1000克，與500克藥用淀粉充分混勻，裝入膠囊，每粒0.3克。
實施例2取白頭翁1kg加適量的水，加熱煮沸三次，(每次40分鐘)。收集并合并所得的水提液，濃縮之相對密度為1.20，加乙醇至醇濃度為70％，或用85％乙醇提取，濾過，回收乙醇至無醇味，將藥液加于預先用酸和堿處理的大孔吸附樹脂(例AB-8中國天津南開大學化學)柱，用去離子水洗柱直到洗出液無顏色，后用80％乙醇洗脫。收集80％乙醇洗脫液，并減壓回收，蒸干，得到黃色粉末狀白頭翁總皂苷，取白頭翁總皂苷，用15％的硫酸或鹽酸70℃加熱水解9小時，放冷，過濾或離心，取沉淀，即得取白頭翁總甙元組合物，取白頭翁總甙元組合物1500克，與500克藥用淀粉充分混勻，裝入膠囊，每粒0.3克。
實施例3取白頭翁1kg加適量的85％乙醇，加熱回流，(每次40分鐘)。收集提取液，減壓回收乙醇至無醇味，放冷，過濾或離心，取沉淀，即得取白頭翁總甙元組合物，取白頭翁總甙元組合物2000克，與500克藥用淀粉充分混勻，裝入膠囊，每粒0.3克。
實施例4白頭翁總皂甙元制取同實施例1，取白頭翁總皂甙元100g，用85％乙醇溶解制成5％的白頭翁總皂甙元溶液，用活性炭脫色，濾過，減壓濃縮干燥，加注射用水及助溶劑制成5％的水溶液，用微孔濾膜(φ0.20μm)濾過至澄明，滅菌，無菌分裝，每瓶10ml，封口，即得。
實施例5白頭翁總皂甙元制取同實施例1，取白頭翁總皂甙元500g，藥用淀粉500g，用80％乙醇濕法制粒，整粒，裝2#膠囊，每粒0.2g。其它項目應符合中華人民共和國藥典2000年版膠囊項下。
實施例6白頭翁總皂甙元制取同實施例1，取白頭翁總皂甙元1000g，藥用淀粉500g，糊精1000g，50乙醇適量制粒，整粒，干燥，壓片。每片0.25g。其它項目應符合中華人民共和國藥典2000年版片劑項下，口服，一次1-3片，一日1-3次。
實施例7白頭翁總皂甙元制取同實施例1，取白頭翁總皂甙元100g，用75％乙醇溶解制成5％的白頭翁總皂苷溶液，用活性炭脫色，濾過，減壓濃縮干燥，加注射用水及助溶劑制成每ml含20mg白頭翁總皂苷的水溶液，用微孔濾膜(φ0.20μm)濾過至澄明，滅菌，無菌分裝于西林瓶中，每瓶5ml，置冷凍干燥機中冷凍干燥，即得。服法用量為肌注；每日1-2次，每次5ml。
權利要求
1.含白頭翁總皂甙元組合物的藥物，其特征是由白頭翁總甙元組合物為活性成份，以其單一成分或加入任意比例的一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體和/或賦形劑及其他具有協(xié)同作用的成分組成。
2.根據權利要求1的含白頭翁總皂甙元組合物的藥物，其特征是口服劑型中白頭翁總甙元組合物占總成分重量的50-90％。
3.根據權利要求1的含白頭翁總皂甙元組合物的藥物，其特征是口服劑型中白頭翁總甙元組合物占總成分重量的60-70％。
4.含白頭翁總皂甙元組合物的藥物的制備方法，其特征是將白頭翁水煮提取或醇提取，過濾所得的提取液，將濾液加于預先用酸和堿處理的大孔吸附樹脂柱，用去離子水洗柱直到洗出液無顏色，后用乙醇洗脫。收集乙醇洗脫液，并減壓回收，蒸干，將所得濃縮物再用乙醇溶解，放置，并濾過，濾液減壓濃縮干燥，得到黃色粉末狀白頭翁總皂苷。取白頭翁總皂苷，用硫酸或鹽酸加熱水解，放冷，過濾或離心，取沉淀，即得白頭翁總甙元組合物，取白頭翁總甙元組合物和醫(yī)藥上可接受的載體和/或賦形劑按選定的比例混合，制成常規(guī)的劑型。
5.白頭翁總皂甙元組合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
6.白頭翁總皂甙元組合物在制備促進脾NK細胞活性藥物中的應用。
7.白頭翁總皂甙元組合物在制備促進THP-1細胞產生TNF α藥物中的應用。
8.白頭翁總皂甙元組合物在制備能促進IL-8產生的藥物中的應用。
全文摘要
含白頭翁總皂甙元組合物的藥物及其制備方法和用途，屬于藥物領域。本發(fā)明的藥物由白頭翁總甙元組合物為活性成份，以其單一成分或加入任意比例的一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體和/或賦形劑及其他具有協(xié)同作用的成分組成。本發(fā)明藥物的制備方法是將白頭翁水煮提取或醇提取，將濾液經大孔吸附樹脂柱，用去離子水洗柱到洗出液無顏色，用乙醇洗脫。收集洗脫液，減壓回收，蒸干，再用乙醇溶解，減壓濃縮干燥，得白頭翁總皂苷。用硫酸或鹽酸加熱水解，取沉淀，得白頭翁總甙元組合物，與醫(yī)藥上可接受的載體和/或賦形劑按選定的比例混合，制成常規(guī)的劑型。用其作為抗腫瘤和免疫活性調節(jié)藥物，能取得抗腫瘤和免疫活性調節(jié)的良好效果。
文檔編號A61P35/00GK1754540SQ200410011119
公開日2006年4月5日 申請日期2004年9月28日 優(yōu)先權日2004年9月28日
發(fā)明者徐東銘 申請人:徐東銘