專利名稱：重組1型單純皰疹病毒及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子病毒基因工程領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種重組1型單純皰疹病毒，同時(shí)還涉及重組1型單純皰疹病毒的制備方法，還涉及重組1型單純皰疹病毒在抗腫瘤中的用途。
背景技術(shù)：
病毒感染敏感宿主細(xì)胞并在其內(nèi)大量復(fù)制，最終導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡。若病毒選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)害，則病毒可能成為高效殺腫瘤制劑。以毒攻毒是祖國(guó)醫(yī)學(xué)的經(jīng)典策略。隨著病毒學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞和分子生物學(xué)理論的發(fā)展與技術(shù)的進(jìn)步，利用基因工程方法改造病毒，使其選擇性地殺死腫瘤細(xì)胞，已經(jīng)成為可能。
許多病毒基因組中存在凋亡誘發(fā)基因和凋亡抑制基因，且處于相對(duì)平衡狀態(tài)。正是由于凋亡誘發(fā)基因的存在，病毒才導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；另一方面，正是由于凋亡抑制基因的存在，病毒在細(xì)胞中才得以復(fù)制，產(chǎn)生子代病毒，感染周圍的細(xì)胞。從整體上看，缺失凋亡抑制基因的病毒感染正常細(xì)胞僅能誘發(fā)細(xì)胞凋亡而不能抑制細(xì)胞凋亡，因而細(xì)胞死亡，病毒不能復(fù)制，不會(huì)對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重危害。由于腫瘤細(xì)胞呈無(wú)限增殖狀態(tài)或“凋亡抑制”狀態(tài)，它能支持缺失凋亡抑制基因的病毒的復(fù)制，因此這種病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)能選擇性增殖，進(jìn)而裂解殺死腫瘤細(xì)胞[Nurse，1997]。
已發(fā)現(xiàn)的病毒凋亡抑制基因有腺病毒(Adenovirus)的E1B[Rao，1992]、單純皰疹病毒(HSV)的icp34.5[Chou，1992]、痘病毒的CrmA[Datta，1997]、人巨細(xì)胞病毒(HCMV)的IE1、IE2[Zhu，1995]、人乳頭瘤病毒(HPV)的E6[Xu，1995]等基因。根據(jù)上述理論，缺失這些基因的病毒都可望用于腫瘤的生物治療。
1996年10月，Science報(bào)道了美國(guó)ONYX制藥公司的Bischoff等人用缺失凋亡抑制基因E1B55K的腺病毒治療腫瘤的研究。這種腺病毒在正常細(xì)胞中不復(fù)制，但能在癌細(xì)胞中復(fù)制并最終裂解殺滅癌細(xì)胞。將這種腺病毒注入荷人宮頸癌的裸鼠瘤體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)所有腫瘤尺寸均顯著減小，60％的實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤完全消退[Bischoff，1996]。1997年11月，Science又報(bào)道了一期臨床試驗(yàn)結(jié)果32例受試頭頸癌患者中，12例腫瘤尺寸明顯減小，減小幅度可達(dá)90％，未發(fā)現(xiàn)任何毒副作用。用其他腫瘤進(jìn)行的安全性實(shí)驗(yàn)和用頭頸癌進(jìn)行的二期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行之中。據(jù)報(bào)道，在二期臨床中，由于1例患者死亡，故以后的開(kāi)發(fā)工作停止。
隨著分子生物學(xué)、病毒學(xué)、免疫學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展和交叉滲透，基因治療研究突飛猛進(jìn)。基因治療作為一種全新的疾病治療手段，將極大程度地改變?nèi)祟惣膊≈委煹臍v史進(jìn)程?；蛑委熡锌赡苈氏热〉猛黄频氖前l(fā)病機(jī)制明確的遺傳病的治療，如囊性纖維變性[Marshall，1995]。值得探索的研究是感染性疾病，如艾滋病和腫瘤的基因治療。腫瘤患者數(shù)量繁多，缺乏有效的治療手段，預(yù)后極差，對(duì)基因治療提出了迫切要求，而且腫瘤基因治療的倫理學(xué)問(wèn)題較少，因此腫瘤基因治療的研究成為備受關(guān)注的熱點(diǎn)。
上世紀(jì)初，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤患者在感染病毒或接種病毒疫苗后，腫瘤偶爾會(huì)消退，由此產(chǎn)生了用病毒治療腫瘤的設(shè)想。幾十年來(lái)，流行性腮腺炎病毒(Mumps virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、流感病毒(Influenza virus)和麻疹病毒(Measlesvirus)等三十多種野生型病毒(既未經(jīng)基因工程改造)曾先后用于治療腫瘤，結(jié)果大多是相似的治療初期，腫瘤明顯消退，但隨著治療的繼續(xù)深入，腫塊恢復(fù)生長(zhǎng)，由于這類野生型病毒都能感染正常細(xì)胞，因而均伴隨有病毒感染和病毒感染引起的免疫反應(yīng)帶來(lái)的毒副作用[Sinkovics J and Horvath J，1993]。在經(jīng)歷了多次失敗后，人們逐漸放棄了對(duì)野生型病毒治療模式的探索[Sinkovics J and Horvath J，1993]。
二十世紀(jì)九十年代，隨著分子生物學(xué)、腫瘤學(xué)及病毒學(xué)本身的發(fā)展，腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制，細(xì)胞與病毒間的作用機(jī)制，信號(hào)傳導(dǎo)通路，凋亡抑制與誘發(fā)機(jī)制等逐漸被闡明，這一思路重新成為研究熱點(diǎn)。人們開(kāi)始有目的地選擇和改造一些病毒，例如改造人呼腸孤病毒(Reovirus)，單純皰疹病毒(Herpes simplex virus)，腺病毒(adenovirus)，細(xì)小病毒(Parvovirus)等，使它們能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，并進(jìn)一步殺滅腫塊，但對(duì)正常細(xì)胞不能造成裂解性感染。這一類病毒，被稱為條件性復(fù)制病毒或選擇性復(fù)制病毒(Conditional replicative viruses)，或溶瘤病毒(Oncolyticviruses)。然而它們制備方法復(fù)雜，且不能直觀檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種重組1型單純皰疹病毒，該病毒靶向性強(qiáng)，安全性好，可選擇性地感染腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒害作用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種制備重組1型單純皰疹病毒的方法，該方法簡(jiǎn)單易行，而且檢測(cè)直觀明了。
本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一種重組1型單純皰疹病毒在抗腫瘤方面的應(yīng)用，作為抗腫瘤藥物，靶向性強(qiáng)，安全性好，提高了抗腫瘤效果。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施重組1型單純皰疹病毒Simplexvirus Herps simplexvirus 1 rHSV-1Δ34.5/lacZ(A Herpes Simplex Virus Type I with an Diplex Inactive icp34.5)，保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號(hào)CCTCC No.V200402，保藏日2004年4月1日。一種制備重組1型單純皰疹病毒的步驟如下1)β-半乳糖苷酶(lacZ)表達(dá)盒的獲得與純化猴病毒40(SV40)啟動(dòng)子(1bp-419bp)控制著載體pSV-β-Galactosidase(購(gòu)自promega公司)上的lacZ基因(710bp-3755bp)的表達(dá)，pSV-β-Galactosidase上含有1個(gè)PolyA序列(4021bp-4156bp)；SV40啟動(dòng)子上游(6814bp)和lacZ編碼序列的近3′末端(3701bp)各含有1個(gè)EcoRI位點(diǎn)，lacZ表達(dá)盒下游則含有1個(gè)BamHI位點(diǎn)(4151bp)；故用BamHI、EcoRI消化，DE81膜回收大片段，獲得LacZ表達(dá)盒(4160bp)，其中含有SV40(啟動(dòng)子)-lacZ-polyA.
2)中間載體IpFL的構(gòu)建載體pFastBac1(購(gòu)自Gibco公司)用EcoRI/BamHI雙酶切消化，與EcoRI/BamHI雙酶切消化的lacZ表達(dá)盒連接，構(gòu)建中間載體pFL，該中間載體pFL的lacZ表達(dá)盒上游具有載體自身的1個(gè)Not1位點(diǎn)。
3)中間載體IIpBL的構(gòu)建BamHI/XhoI酶切中間載體IpFL以切下lacZ表達(dá)盒；BamHI/XhoI酶切質(zhì)粒pBluescript-M13；將lacZ表達(dá)盒與線性pBluescript-M13連接，以構(gòu)建中間載體IIpBL，使lacZ表達(dá)盒下游也獲得載體本身的1個(gè)NotI位點(diǎn)；于是，lacZ表達(dá)盒上下游均帶有NotI位點(diǎn)。
4)轉(zhuǎn)移載體pIL的構(gòu)建質(zhì)粒p4789(由芝加哥大學(xué)Roizman B教授饋贈(zèng))帶有完整的HSV-1的icp34.5基因(編號(hào)M33699)(SEQ ID NO.1)及其側(cè)翼序列；NotI酶切質(zhì)粒p4789，以切去icp34.5基因第262位密碼子(262bp)到終止子(1084bp)長(zhǎng)823bp的序列；NotI酶切中間載體IIpBL，獲得lacZ表達(dá)盒，并連接到經(jīng)NotI酶切的質(zhì)粒p4789上，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pIL。該轉(zhuǎn)移載體pIL中的icp34.5基因被NotI酶切缺失824bp并被lacZ表達(dá)盒插入雙重滅活。
5)重組病毒的獲得轉(zhuǎn)移載體pIL與野生單純皰疹病毒F株(wt-HSV-F)(由芝加哥大學(xué)B.Roizman教授惠贈(zèng))共轉(zhuǎn)染敘利亞倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系(BHK21細(xì)胞)(由湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院龔鎮(zhèn)奎研究員饋贈(zèng))，經(jīng)過(guò)同源重組，獲得被NotI酶切缺失的icp34.5基因和lacZ表達(dá)盒插入雙重滅活的重組1型單純皰疹病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ。用0.2mL病毒上清感染含Xga1軟瓊脂培養(yǎng)基的BHK21細(xì)胞，挑出藍(lán)斑，進(jìn)行有限稀釋，再接種BHK21細(xì)胞，重復(fù)進(jìn)行多次空斑純化。
構(gòu)建程序包括將含有l(wèi)acZ表達(dá)盒的質(zhì)粒載體pSV-β-Galactosidase用BamHI完全消化，EcoRI不完全消化(因?yàn)閘acZ中還含有一個(gè)EcoRI位點(diǎn))并回收含有SV40啟動(dòng)子的4160bp的完整lacZ表達(dá)盒，插入到同樣用BamHI/EcoRI雙酶切的轉(zhuǎn)座載體pFastBac1中，構(gòu)建成中間載體IpFL；將含有l(wèi)acZ表達(dá)盒的載體pFL用BamHI/XhoI雙酶切并回收完整的lacZ表達(dá)盒，插入到同樣用BamHI/XhoI雙酶切的質(zhì)粒載體pBluescript-M13中，構(gòu)建成中間載體IIpBL；用NotI酶切p4789除去icp34.5基因從第262個(gè)密碼子(262bp)到終止(1084bp)密碼的823bp序列，但保留其左右側(cè)翼序列，用NotI酶切pBL并回收完整的lacZ表達(dá)盒，將lacZ表達(dá)盒用T4DNA連接酶連接到用NotI酶切的p4789質(zhì)粒載體中，構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體pIL。提取野生型HSV(wtHSV)DNA，與轉(zhuǎn)移載體pIL共轉(zhuǎn)染敘利亞倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系BHK21細(xì)胞，由于轉(zhuǎn)移載體pIL上插入lacZ表達(dá)盒失活的icp34.5基因保留有左右側(cè)翼序列，左翼650bp右翼1500bp，其與wtHSV的icp34.5基因左右側(cè)翼序列同源，經(jīng)過(guò)同源重組，等位雙交換，獲得含有缺失的icp34.5基因并被lacZ表達(dá)盒插入失活的重組單純皰疹病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ的上清，用病毒上清感染含Xga1軟瓊脂培養(yǎng)基的BHK21細(xì)胞，挑出藍(lán)斑，進(jìn)行有限稀釋，再接種細(xì)胞，進(jìn)一步空斑純化。用PCR擴(kuò)增icp34.5基因進(jìn)行重組病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ的鑒定，即以人工合成的DNA序列CTCTGCAGTCACGCCCCTTCCGCCTTCC和CCGGATCCGCTCCTGCCATCGTCTCTCC作引物，進(jìn)行PCR鑒別重組病毒含有被lacZ表達(dá)盒插入失活的icp34.5基因。
本發(fā)明的用途是作為抗腫瘤藥物，靶向性強(qiáng)，安全性好。
本重組1型單純皰疹病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ與其它重組1型單純皰疹病毒、野生型1型單純皰疹病毒及其它抗腫瘤藥物相比，具有如下特點(diǎn)1)HSV-1基因組較大(150kb)，一級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)清楚，大約70個(gè)基因可被代替而仍能在某些細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制，因而插入外源基因的容量可高達(dá)30kb，為提高治癌效率，可方便地插入細(xì)胞因子基因，突變型病毒容易包裝[Roizman，1996]，是產(chǎn)品更新?lián)Q代的基礎(chǔ)。
2)HSV-1宿主范圍較寬，包括分裂的和非分裂的細(xì)胞。可以說(shuō)它可感染迄今研究過(guò)的所有類型的脊椎動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明構(gòu)建的重組單純皰疹病毒可望用于多種腫瘤的治療[Fields，1990]。
3)本發(fā)明中，轉(zhuǎn)移載體pIL中的icp34.5基因被NotI酶切缺失和lacZ表達(dá)盒插入雙重滅活。所以含有這種雙重滅活icp34.5基因的重組1型單純皰疹病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ應(yīng)該是一種非常穩(wěn)定的突變型病毒，很難回復(fù)突變成野生型，保證了產(chǎn)品的安全性。
4)本發(fā)明的重組單純皰疹病毒的icp34.5基因被lacZ插入失活，lacZ在SV40啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下高效表達(dá)，在X-Gal存在下，空斑成為蘭色，因此，lacZ作為報(bào)道基因，可以監(jiān)測(cè) 鑒定重組病毒，作為產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)之一。
5)理論上和實(shí)驗(yàn)室研究已經(jīng)證明，本發(fā)明構(gòu)建的重組病毒能有效地靶向性殺死某些人癌細(xì)胞，不殺死人體正常細(xì)胞，具有安全性。
6)本發(fā)明構(gòu)建的重組單純皰疹病毒能像野生型HSV一樣對(duì)抗皰疹病毒的有效藥物阿昔洛韋敏感，為該重組病毒在人體內(nèi)的應(yīng)用提供保障。既是，倘若有個(gè)別病人因機(jī)體差異而出現(xiàn)病毒反應(yīng)，則可以及時(shí)用阿昔洛韋進(jìn)行治療，絕對(duì)保障病人的安全。
7)實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證明，該重組單純皰疹病毒用國(guó)家藥典允許的Vero細(xì)胞生產(chǎn)，滴度較高，便于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
8)HSV是嗜神經(jīng)性病毒，icp34.5基因是其關(guān)鍵性基因和神經(jīng)毒力基因[Thompson，1983]，缺失icp34.5基因的重組單純皰疹病毒無(wú)神經(jīng)毒性，對(duì)小鼠的半致死劑量下降10萬(wàn)倍，這是該重組單純皰疹病毒特別適于腦癌治療。


圖1 重組1型單純皰疹病毒的構(gòu)建過(guò)程，其中l(wèi)acZβ-半乳糖苷酶基因；Ampr氨芐抗性基因；T7 promoterT7啟動(dòng)子；T3 promoterT3啟動(dòng)子。
圖2 中間載體IpFL的結(jié)構(gòu)和酶切鑒定圖，其中AλDNA/HindIII分子量參照；BNotI酶切；CEcoRI酶切；D.BamhI/HindIII酶切3.1Kb和5.8Kb的片段；以BamhI/HindIII酶切產(chǎn)生4.1Kb和4.7Kb兩個(gè)片。NotI酶切使pFL線性化，產(chǎn)生8.9Kb片段；lacZ含有兩個(gè)EcoRI位點(diǎn)，以EcoRI酶切釋放段。說(shuō)明中間載體構(gòu)建成功。
圖3 中間載體IIpBL的結(jié)構(gòu)和酶切鑒定圖，其中AλDNA/HindIII分子量參照；BBamHI酶切；CNot1酶切；DBamHI/HindIII酶切。用BamHI酶切使pBL線性化，產(chǎn)生約7.1Kb片段；Not1酶切產(chǎn)生3Kb和4.1Kb片段；BamHI/HindIII酶切后得到3.3Kb和3.7Kb的片段。說(shuō)明中間載體構(gòu)建成功。
圖4 轉(zhuǎn)移載體pIL的結(jié)構(gòu)和酶切鑒定圖，其中AλDNA/HindIII分子量參照；BPstI酶切；CXbaI酶切；DNotI酶切。PstI酶切pIL得到9.4Kb；XbaI酶切得到3.8Kb和5.6Kb兩個(gè)片段；NotI酶切產(chǎn)生4.1Kb和5.3Kb兩個(gè)片段。說(shuō)明轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建成功。
圖5 Xga1篩選重組單純皰疹病毒，藍(lán)斑表示含有該重組病毒。
圖6 PCR鑒定重組1型單純皰疹病毒，ADNA分子量參照(1543、994、695、515、377bp)；B重組病毒；C野生病毒。PCR引物為icp34.5基因的缺失區(qū)，約1.7Kb，野生病毒檢測(cè)到了1.7Kb的片段，而重組病毒沒(méi)有。說(shuō)明重組1型單純皰疹病毒構(gòu)建成功。
圖7 rHSV-1Δ34.5/lacZ和wtHSV對(duì)阿昔洛韋(ACV)的敏感性， 代表wtHSV； 代表rHSV-1Δ34.5/lacZ。說(shuō)明阿昔洛韋(ACV)對(duì)rHSV-1Δ34.5/lacZ和wtHSV是一樣敏感。
圖8 rHSV-1Δ34.5/lacZ在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中的復(fù)制效率， 代表人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞； 代表正常羊膜wish細(xì)胞。說(shuō)明該病毒靶向性強(qiáng)，安全性好，可選擇性地感染腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒害作用。
圖9 rHSV-1Δ34.5/lacZ對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞、人膀胱癌EJ細(xì)胞、人肺腺癌A549細(xì)胞、正常羊膜Wish細(xì)胞的殺傷效率， 代表正常羊膜wish細(xì)胞； 代表人肺腺癌A549細(xì)胞； 代表人膀胱癌EJ細(xì)胞； 代表人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞。說(shuō)明該病毒對(duì)正常細(xì)胞羊膜Wish細(xì)胞無(wú)毒害作用，而對(duì)EJ細(xì)胞和U251細(xì)胞殺傷率強(qiáng)，特別是U251細(xì)胞，但對(duì)A549細(xì)胞無(wú)作用。
圖10 rHSV-1Δ34.5/lacZ對(duì)人肝癌Hep3B細(xì)胞、人喉癌Hep2細(xì)胞、人肺癌SPC-A1細(xì)胞、小鼠骨髓瘤S-180細(xì)胞的殺傷效率， 代表小鼠骨髓瘤S-180細(xì)胞； 代表人肺癌SPC-A1細(xì)胞； 代表人肝癌Hep3B細(xì)胞； 代表人喉癌Hep2細(xì)胞。說(shuō)明該病毒對(duì)Hep3B細(xì)胞殺傷率特強(qiáng)，Hep2細(xì)胞和S-180細(xì)胞較敏感，對(duì)SPC-A1細(xì)胞則無(wú)作用。
圖11 rHSV-1Δ34.5/lacZ在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤效率， 代表用PBS注射組； 代表早期治療組； 代表中期治療組； 代表晚期治療組。說(shuō)明rHSV-1Δ34.5/lacZ使S-180腫瘤增長(zhǎng)的速度顯著減緩。
圖12 治療小鼠的組織切片，其中A腦；B肝；C脾；D腎；E肺；F心。說(shuō)明小鼠各組織無(wú)病理變化，該重組病毒靶向性好。
圖13 免疫組化結(jié)果，其中A治療腫瘤陽(yáng)性；B未治療腫瘤陰性；C治療小鼠肝陰性；D治療小鼠大腦陰性。說(shuō)明該重組病毒只選擇性的在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，而對(duì)正常組織無(wú)害。
圖14 PCR鑒定rHSV-1Δ34.5/lacZ，PCR引物為DNA聚合酶基因(UL30)和DNA聚合酶輔助蛋白基因。說(shuō)明該重組病毒只選擇性的在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，而對(duì)正常組織無(wú)害。
圖15 電鏡觀察結(jié)果，其中A正常大腦切片(×40,000)；B治療腫瘤切片，可見(jiàn)核中待包裝的病毒顆粒及胞漿中少數(shù)包裝成功病毒粒子(×20,000)；C治療腫瘤切片，可見(jiàn)核中待包裝的病毒顆粒(×15,000)；D治療腫瘤切片，可見(jiàn)核中待包裝的病毒顆粒(×20,000)。
圖16 荷人肝癌細(xì)胞Hep-3B的裸鼠模型。
圖17 rHSV-1Δ34.5/lacZ治療組裸鼠腫瘤與對(duì)照組裸鼠腫瘤的對(duì)比，其中A空白對(duì)照組；B低劑量rHSV-1Δ34.5/lacZ治療組；C高劑量rHSV-1Δ34.5/lacZ治療組。說(shuō)明高劑量治療組和低劑量治療組對(duì)人肝癌細(xì)胞有顯著療效，特別是高劑量治療組有極顯著療效。
圖18 各組裸鼠的腫瘤大小隨時(shí)間變化的趨勢(shì)圖，其中 代表高劑量rHSV-1Δ34.5/lacZ治療組； 代表中劑量rHSV-1Δ34.5/lacZ治療組； 代表低劑量rHSV-1Δ34.5/lacZ治療組； 代表空白治療組； 代表臨床藥物治療組。說(shuō)明空白對(duì)照組裸鼠的腫瘤體積隨時(shí)間延長(zhǎng)而持續(xù)大幅增加；各治療組裸鼠的腫瘤體積在治療初期上升幅度較大，但在治療中，后期，治療裸鼠的腫瘤體積上升幅度明顯減小最終，各治療組裸鼠腫瘤體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于空白對(duì)照組；臨床藥物對(duì)照組裸鼠的腫瘤體積也是一直持續(xù)增加，但上升幅度小于空白對(duì)照組，最終治療效果不及高，中劑量rHSV-1Δ34.5/lacZ治療組。
圖19 聚合酶基因RT-PCR電泳檢測(cè)。說(shuō)明該重組病毒只選擇性的在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，而對(duì)正常組織無(wú)害。
圖20 tk基因RT-PCR電泳檢測(cè)。說(shuō)明該重組病毒只選擇性的在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，而對(duì)正常組織無(wú)害。
圖21 rHSV-1Δ34.5/lacZ治療組裸鼠各臟器病理切片(放大倍數(shù)20×3.3)。說(shuō)明該重組病毒只選擇性的在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，而對(duì)正常組織無(wú)害。
圖22 未治療組裸鼠各臟器病理切片(放大倍數(shù)20×3.3)。說(shuō)明重組病毒對(duì)正常組織無(wú)害。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件并參考下列資料進(jìn)行如J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，1992，“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南”(第二版)；D.L.斯佩克特等，科學(xué)出版社，2001，“細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南”；E.哈洛等，科學(xué)出版社，2002，“抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南”等所述的方法，或接照制造廠商操作指南所建議的方法。
實(shí)施例1 重組病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ的構(gòu)建和獲得質(zhì)粒載體pSV-β-Galactosidase購(gòu)自promega公司，轉(zhuǎn)座載體pFastBac1購(gòu)自Gibco公司。載體pSV-β-Galactosidase上含有l(wèi)acZ表達(dá)盒，SV40啟動(dòng)子控制其表達(dá)。質(zhì)粒載體pBluescript-M13購(gòu)自Stratagene公司。質(zhì)粒p4789由芝加哥大學(xué)Roizman B教授饋贈(zèng)，含有完整HSV icp34.5基因及其側(cè)翼序列。敘利亞倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系BHK21細(xì)胞由湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院龔鎮(zhèn)奎研究員饋贈(zèng)，野生病毒HSV-1 F株由芝加哥大學(xué)B.Roizman教授惠贈(zèng)的。
中間載體IpFL的構(gòu)建從含有l(wèi)acZ表達(dá)盒的載體pSV-β-Galactosidase上用BamHI完全消化，EcoRI不完全消化(因lacZ中還含有一個(gè)EcoRI位點(diǎn))并回收完整的帶SV40啟動(dòng)子的lacZ表達(dá)盒(4160bp)，插入到同樣用BamHI/EcoRI雙酶切的轉(zhuǎn)座載體pFastBac1中。取質(zhì)粒DNA 1-5μl加入到50μl的大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行熱休克轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化時(shí)提前1h將Xga1涂在含Amp的LB平皿上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，根據(jù)藍(lán)色菌落挑選出轉(zhuǎn)座載體pFL，以NotI、EcoRI、BamHI/HindIII酶切pFL來(lái)鑒定陽(yáng)性克隆(圖2)。NotI酶切使pFL線性化，產(chǎn)生8.9Kb片段；lacZ含有兩個(gè)EcoRI位點(diǎn)，以EcoRI酶切釋放3.1Kb和5.8Kb的片段；以BamhI/HindIII酶切產(chǎn)生4.1Kb和4.7Kb兩個(gè)片段。說(shuō)明中間載體I構(gòu)建成功。
中間載體IIpBL的構(gòu)建從含有l(wèi)acZ表達(dá)盒的中間載體IpFL上用BamHI/XhoI雙酶切，并回收完整的帶SV40啟動(dòng)子的lacZ表達(dá)盒，插入到同樣用BamHI/XhoI雙酶切的質(zhì)粒載體pBluescript-M13中，構(gòu)建中間載體IIpBL。取質(zhì)粒DNA 1-5μl加入到50μl的大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行熱休克轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化時(shí)提前1h將Xga1涂在含Amp的LB平皿上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，根據(jù)藍(lán)色菌落挑選出轉(zhuǎn)座載體，以BamHI、NotI、BamHI/HindIII酶切pBL來(lái)鑒定(圖3)。BamHI酶切使pBL線性化，產(chǎn)生約7.1Kb片段；Not1酶切產(chǎn)生3Kb和4.1Kb片段；BamHI/HindIII酶切后得到3.3Kb和3.7Kb的片段。說(shuō)明中間載體II構(gòu)建成功。
轉(zhuǎn)移載體pIL的構(gòu)建用Not1酶切p4789以除去icp34.5基因從第262個(gè)密碼子(262bp)到終止密碼(1084bp)的823bp片段，但保留其左右側(cè)翼序列650bp和1500bp；pBL也用NotI酶切，并回收完整的帶SV40啟動(dòng)子的lacZ表達(dá)盒，將lacZ表達(dá)盒連接到用Not1酶切的p4789中，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pIL。取質(zhì)粒DNA 1-5μl加入到50μl的大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行熱休克轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化時(shí)提前1h將Xga1涂在含Amp的LB平皿上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，根據(jù)藍(lán)色菌落挑選出轉(zhuǎn)座載體，用PstI、XbaI、NotI酶切鑒定(圖4)。PstI酶切pIL得到9.4Kb；XbaI酶切得到3.8Kb和5.6Kb兩個(gè)片段；NotI酶切產(chǎn)生4.1Kb和5.3Kb兩個(gè)片段。說(shuō)明轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建成功。
重組病毒的獲得提取野生HSV(wtHSV)的DNA，與轉(zhuǎn)移載體pIL共轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞。質(zhì)粒pIL與野生型HSV DNA的共轉(zhuǎn)染取兩個(gè)預(yù)先加入200μL 1640培養(yǎng)基(未加血清)的EP管，一個(gè)加20ug pIL和20ug HSV-1 DNA，混勻；另一個(gè)加8μL Lipofectin轉(zhuǎn)染試劑，混勻。將兩管合并混勻，靜置45min，使Lipofectin包裹DNA。臨用前補(bǔ)加無(wú)血清培養(yǎng)液1640，以使轉(zhuǎn)染混合液能均勻覆蓋細(xì)胞層。取70-80％豐度的單層BHK細(xì)胞1瓶，棄培養(yǎng)液。用未加血清的培養(yǎng)液清洗瓶壁數(shù)次，然后加轉(zhuǎn)染混合液。37℃溫育6h后棄轉(zhuǎn)染混合液，換常規(guī)1640培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)。
由于轉(zhuǎn)移載體pIL上插入了lacZ表達(dá)盒，icp34.5基因失活，但保留有icp34.5基因的左右側(cè)翼序列，它們與wtHSV的icp34.5基因左右側(cè)翼序列同源；經(jīng)過(guò)同源重組，獲得含有icp34.5基因失活的且?guī)в衛(wèi)acZ表達(dá)盒的重組病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ；用病毒上清0.2ml感染含Xga1軟瓊脂培養(yǎng)基的BHK21細(xì)胞，37℃培養(yǎng)36-42小時(shí)，挑出藍(lán)斑，進(jìn)行有限稀釋，再用0.2ml接種細(xì)胞，進(jìn)一步進(jìn)行空斑純化。
實(shí)施例2 重組病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ的鑒定供試病毒為實(shí)施例1構(gòu)建的重組病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ以及由芝加哥大學(xué)B.Roizman教授惠贈(zèng)的野生病毒HSV-1 F株。icp34.5基因引物由上海生工(SANGON)公司合成。
正向引物5’-CTCTGCAGTCACGCCCCTTCCGCCTTCC-3’反向引物5’-CCGGATCCGCTCCTGCCATCGTCTCTCC-3’用PCR技術(shù)擴(kuò)增icp34.5基因進(jìn)行鑒定。反應(yīng)體系10×buffer 5μL，dNTP(2.5mM)5μL，正向引物(10pmol/ul)2.5μL，反向引物(10pmol/ul)2.5μL，HSV DNA 5μL，MgCl2(25mM)5μL，ddH2O 25μL，Taq DNA聚合酶(5U/ul)0.5μL。擴(kuò)增條件94℃，90秒；56℃，90秒；72℃，120秒；循環(huán)35次。預(yù)變性5分鐘(94℃)，終延伸10分鐘(72℃)。結(jié)果證明重組病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ缺失了野生病毒wtHSV中的icp34.5基因(圖6)。
實(shí)施例3 重組病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ的擴(kuò)增供試病毒為實(shí)施例1構(gòu)建的重組病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ。非洲綠猴腎Vero細(xì)胞系由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院董長(zhǎng)垣教授惠贈(zèng)。
用DMEM培養(yǎng)液在35mm培養(yǎng)板上培養(yǎng)Vero細(xì)胞，待Vero細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，棄去DMEM培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞表面，接種病毒0.2ml，37℃吸附1-2小時(shí)，棄去上清，同時(shí)設(shè)一瓶不加病毒的細(xì)胞作對(duì)照；加入2％小牛血清的培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)；80％的細(xì)胞出現(xiàn)病變后，反復(fù)凍溶三次，收獲病毒；在4℃以8000rpm離心30分鐘，收集上清，置于4℃短期保存；若需要長(zhǎng)期保存，則加入10％甘油，置于-80℃。
實(shí)施例4 重組單純皰疹病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ的安全性供試病毒為實(shí)施例1構(gòu)建的重組病毒，由芝加哥大學(xué)B.Roizman教授惠贈(zèng)的野生病毒HSV-1 F株。
選擇對(duì)單純皰疹病毒敏感的昆明種小鼠作受試對(duì)象，比較了rHSV-1Δ34.5/lacZ和wtHSV的半數(shù)致死劑量(LD50)。實(shí)驗(yàn)第21天的死亡情況及兩種病毒的LD50見(jiàn)表1。結(jié)果表明icp34.5基因的缺失大大地降低了HSV的毒性，rHSV-1Δ34.5/lacZ的LD50為wt HSV的10萬(wàn)倍，即毒力降低10萬(wàn)倍，說(shuō)明rHSV-1Δ34.5/lacZ有較好的安全性。
抗皰疹藥物阿昔洛韋(ACV)是毒性極低的藥物前體，HSV tK基因表達(dá)產(chǎn)物TK(胸苷激酶)使ACV磷酸化激活成為細(xì)胞毒性藥物而殺死細(xì)胞。雖然缺失icp34.5基因，但HSV的tK基因完整，能有效表達(dá)TK酶蛋白，以活化抗皰疹藥物ACV，發(fā)揮殺細(xì)胞作用；由于rHSV-1Δ34.5/lacZ感染復(fù)制是靶向性的，所以正常細(xì)胞中沒(méi)有rHSV-1Δ34.5/lacZ增殖，即沒(méi)有tk基因的表達(dá)，ACV不會(huì)被激活，所以正常細(xì)胞既不會(huì)由于rHSV-1Δ34.5/lacZ殺死，也不會(huì)被活化的ACV毒殺；而對(duì)容許rHSV-1Δ34.5/lacZ增殖的惡性腫瘤細(xì)胞來(lái)說(shuō)，不僅會(huì)因rHSV-1Δ34.5/lacZ增殖而被有效裂解殺死，而且由于rHSV-1Δ34.5/lacZ有效增殖而使tk基因有效表達(dá)，產(chǎn)生TK酶蛋白，激活A(yù)CV前體成細(xì)胞毒性藥物，與rHSV-1Δ34.5/lacZ增殖裂解殺癌細(xì)胞協(xié)同，殺死癌細(xì)胞。所以，當(dāng)用ACV后，只要有rHSV-1Δ34.5/lacZ基因表達(dá)，ACV便被激活，rHSV-1Δ34.5/lacZ感染的細(xì)胞便被殺死，rHSV-1Δ34.5/lacZ也就失去了增殖的條件，rHSV-1Δ34.5/lacZ死亡，毒性消除；若沒(méi)有應(yīng)用ACV，rHSV-1Δ34.5/lacZ便會(huì)無(wú)限制地增殖并裂解腫瘤細(xì)胞，同時(shí)釋放子代rHSV-1Δ34.5/lacZ，子代rHSV-1Δ34.5/lacZ再感染、裂解新的腫瘤細(xì)胞，如此循環(huán)，以至所有腫瘤細(xì)胞徹底消滅；所有腫瘤細(xì)胞徹底消滅了，子代rHSV-1Δ34.5/lacZ也就失去了繁衍下一代rHSV-1Δ34.5/lacZ的場(chǎng)所，也就被機(jī)體作為異物排斥掉。
實(shí)驗(yàn)證明用對(duì)rHSV-1Δ34.5/lacZ敏感的神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞接種重組型和野生型病毒，換用含不同濃度(0、0.5、0.7、1.0、1.5ug/ml)ACV的培養(yǎng)基培養(yǎng)。計(jì)算兩種病毒對(duì)ACV的半耐受濃度EC50，比較其敏感性，結(jié)果表明rHSV-1Δ34.5/lacZ和wtHSV一樣，對(duì)抗皰疹藥物ACV敏感(見(jiàn)圖7)。所以在用rHSV-1Δ34.5/lacZ治療腫瘤的過(guò)程中，可用阿昔洛韋(ACV)對(duì)萬(wàn)一出現(xiàn)的重組病毒的副作用進(jìn)行有效控制。
表1.wtHSV和rHSV-1Δ34.5/lacZ半數(shù)致死劑量(LD50)

注ND為沒(méi)有進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施例5 重組單純皰疹病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ在細(xì)胞中的選擇性殺瘤測(cè)定供試病毒為實(shí)施例1構(gòu)建的重組病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ以及由芝加哥大學(xué)B.Roizman教授惠贈(zèng)的野生病毒HSV-1 F株。
以人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞的代表，以正常羊膜wish細(xì)胞為對(duì)照，比較重組單純皰疹病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中的復(fù)制效率，結(jié)果見(jiàn)圖8。可以看出rHSV-1Δ34.5/lacZ選擇性地在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中復(fù)制；而對(duì)正常細(xì)胞基本上不復(fù)制，表明病毒感染正常細(xì)胞后誘發(fā)其凋亡，病毒不能復(fù)制，隨后自然降解。
用MTT法定量測(cè)定重組單純皰疹病毒對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞、人膀胱癌EJ細(xì)胞、人肺腺癌A549細(xì)胞、正常羊膜Wish細(xì)胞、人肝癌Hep3B細(xì)胞、人喉癌Hep2細(xì)胞、人肺癌SPC-A1細(xì)胞、小鼠骨髓瘤S-180細(xì)胞的殺傷效率。結(jié)果見(jiàn)圖9、10。試驗(yàn)結(jié)果表明，U251、EJ、Hep3B、Hep2和S-180五種腫瘤細(xì)胞對(duì)rHSV-1Δ34.5/lacZ敏感，但對(duì)這些敏感細(xì)胞的增值動(dòng)力曲線各異。在這些敏感細(xì)胞中，Hep3B細(xì)胞對(duì)rHSV-1Δ34.5/lacZ感染反應(yīng)最為迅速，U251細(xì)胞次之，EJ和Hep2細(xì)胞也比較敏感，A549、SPC-A1和正常細(xì)胞對(duì)感染不敏感，感染后基本無(wú)細(xì)胞病變，亦無(wú)細(xì)胞死亡。
實(shí)施例6 荷S-180小鼠肉瘤動(dòng)物模型建立供試病毒為實(shí)施例1構(gòu)建的重組病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ以及由芝加哥大學(xué)B.Roizman教授惠贈(zèng)的野生病毒HSV-1 F株。供試BALB/c小鼠購(gòu)自武漢試驗(yàn)動(dòng)物中心，4-5周齡(20g左右)使用。小鼠肉瘤細(xì)胞系S-180由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院提供。
建立荷S-180小鼠肉瘤的動(dòng)物模型，用S-180細(xì)胞(濃度為1×105/mL)0.1mL接種健康BALB/c小鼠腹腔，7天后，鼠腹腔被腹水漲大，抽出腹水，以PBS將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/mL，接種0.1mL于健康小鼠前肢腋下，3天后即可見(jiàn)綠豆粒大小腫瘤塊長(zhǎng)出。
實(shí)施例7 重組病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ對(duì)荷S-180肉瘤小鼠的殺瘤效應(yīng)測(cè)定供試病毒為實(shí)施例1構(gòu)建的重組病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ。供試小鼠為實(shí)施例6建立的荷S-180肉瘤小鼠模型。抗HSV-1的抗體(DAKO，B0114)購(gòu)自DAKO公司。PCR引物在基康生物公司合成，第一對(duì)引物針對(duì)DNA聚合酶基因(UL30)，序列為(5’-atcaac ttc gac tgg ccc tt-3’)和(5’-ccg tac atg tcg atg ttc ac-3’)，產(chǎn)物為189bp(Lakemany et al.，1995)；第二對(duì)引物(5’-acg acg acg tcc gac ggc ga-3’)和(5’-gtg ctg gtg ctg gac gac ac-3’)，針對(duì)DNA聚合酶輔助蛋白基因，擴(kuò)增產(chǎn)物為279bp片段(Puchhammer et al.，1993)，PCR反應(yīng)體系為100ul，含200mMdNTP，2 U Taq酶。94℃1min，58℃1min，72℃2min，共35個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。
在荷瘤小鼠的生存期試驗(yàn)中，于每只BALB/c小鼠(4-5周齡；22-25g)左前肢腋窩處接種新鮮制備的1×105S-180細(xì)胞(0.1ml)。4天后，當(dāng)腫瘤平均直徑達(dá)到4mm，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為早期治療組、中期治療組、晚期治療組和對(duì)照組，30只/組。注射的劑量、時(shí)間和分組情況見(jiàn)表2。治療后每?jī)商煊脙赡_規(guī)量腫瘤直徑一次，腫瘤體積按公式0.53×長(zhǎng)×寬計(jì)算(Yamamura H et al，2001)。每天觀察小鼠，記錄死亡日期，解剖死亡小鼠，取其瘤塊，稱重并測(cè)量體積。結(jié)果見(jiàn)表3。從PBS組和治療組小鼠腫塊解剖看出，晚期治療組和對(duì)照組小鼠腫瘤體積較大，早期和中期治療組則腫瘤體積相對(duì)較小。
表2.rHSV-1Δ34.5/lacZ治療荷瘤小鼠分組情況

表3.rHSV-1Δ34.5/lacZ治療荷S-180肉瘤的小鼠的生存期試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)腫瘤體積及小鼠生存時(shí)間來(lái)評(píng)價(jià)rHSV-1Δ34.5/lacZ的抗腫瘤效率，結(jié)果表明與PBS對(duì)照組相比，rHSV-1Δ34.5/lacZ使S-180腫瘤增長(zhǎng)的速度顯著減緩(見(jiàn)圖11)。
t-檢驗(yàn)結(jié)果表明與PBS對(duì)照組相比，早期治療組和中期治療組平均生存期、治愈率、腫瘤體積各項(xiàng)指標(biāo)p＜0.01，有顯著性差異；晚期治療組各項(xiàng)指標(biāo)p＞0.05，無(wú)顯著性差異。
rHSV-1Δ34.5/lacZ注射入瘤內(nèi)后，每隔14天處死10只小鼠，分離其腫瘤、腦、心臟、肺、腎和肝，固定于10％甲醛溶液中，石蠟包埋，切片，HE(蘇木精-伊紅)染色，光鏡下病理分析。在處死日期前瀕死的小鼠，立即處死，如上處理其組織；已死亡的小鼠，丟棄不用，結(jié)果見(jiàn)圖12。上述切片中留一部分不染色，做免疫組化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖13。免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在治療小鼠的腫瘤細(xì)胞中有細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核著色(表明有rHSV-1Δ34.5/lacZ抗原表達(dá))，但在腦和其它組織中無(wú)。在所有檢測(cè)過(guò)的動(dòng)物中，僅在治療過(guò)的腫瘤細(xì)胞中有rHSV-1Δ34.5/lacZ抗原表達(dá)，在相鄰的正常組織中沒(méi)有。由于我們使用的抗體可以檢測(cè)出HSV-1主要表面糖蛋白和至少一種核心蛋白，陽(yáng)性反應(yīng)說(shuō)明病毒在被感染的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制增殖(Kerasi et al.，1998)。在治療14天的動(dòng)物中腫瘤壞死已很明顯，在壞死部位無(wú)抗原表達(dá)?？乖瓋H局限于治療過(guò)的腫瘤結(jié)節(jié)中，提示腫瘤壞死是由病毒復(fù)制引起的。病理學(xué)分析顯示除腫瘤外，包括腦、心、肝、脾、腎和肺器官在治療4周后，無(wú)病理學(xué)變化(圖12)。用Fisher精確法對(duì)各個(gè)治療組腫瘤壞死程度進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并在中期治療組設(shè)了劑量對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表4-12。表4結(jié)果表明，治療2周后，腫瘤壞死程度主要是輕度，治療時(shí)間延長(zhǎng)至第4周和第6周，腫瘤壞死發(fā)展成中度或重度，故認(rèn)為rHSV-1Δ34.5/lacZ殺傷腫瘤4周后效果明顯(ρ＜0.01)，到第6周全部腫瘤達(dá)到重度壞死。表5的結(jié)果表明在中期治療組中，給予不同劑量rHSV-1Δ34.5/lacZ，所致腫瘤壞死程度不一樣，差別有高顯著性(ρ＜0.01)，中劑量和高劑量使腫瘤壞死效率較低劑量高，表明增加重組病毒劑量，即使在治療的第2周，腫瘤也能顯示中度和重度壞死。表6表明在中期治療中，不同劑量組經(jīng)過(guò)4周的治療后，腫瘤壞死程度明顯增大，高劑量致使全部腫瘤達(dá)到重度壞死。表7統(tǒng)計(jì)分析表明，晚期治療的效果隨時(shí)間推移，沒(méi)有顯著性變化。表8、9、10是中期治療組不同劑量在2周、4周的觀察結(jié)果，中劑量與高劑量均是4周比2周腫瘤壞死嚴(yán)重，這表明隨著病毒的復(fù)制，腫瘤壞死程度越來(lái)越嚴(yán)重，但低劑量治療組沒(méi)有表現(xiàn)出這種明顯差異。表11、12的p值是各治療組的腫瘤壞死例數(shù)與對(duì)照組的相應(yīng)數(shù)據(jù)F-檢驗(yàn)分析的結(jié)果。結(jié)果表明，治療期間，各治療組和對(duì)照組均有不同程度的腫瘤壞死，與對(duì)照組相比，早期治療組和中期治療組的壞死程度有顯著性差異，這說(shuō)明rHSV-1Δ34.5/lacZ治療可以造成腫瘤壞死，在排除了腫瘤在生長(zhǎng)過(guò)程中自身會(huì)產(chǎn)生一定壞死的基礎(chǔ)上，腫瘤壞死程度可以反映治療效果。
表4.早期治療組不同時(shí)段(周)腫瘤壞死程度的比較

表5.中期治療各組治療2周后腫瘤壞死程度比較

表6.中期治療各組治療4周后腫瘤壞死程度比較

表7.晚期治療各組不同時(shí)段(周)腫瘤壞死程度的比較

表8.中期低劑量治療組不同時(shí)段(周)腫瘤壞死程度的比較

表9.中期中劑量治療組不同時(shí)段(周)腫瘤壞死程度較

表10.中期高劑量治療組不同時(shí)段(周)腫瘤壞死程度的比較

表11.治療2周后各實(shí)驗(yàn)組腫瘤壞死程度比較

表12.治療4周后各實(shí)驗(yàn)組腫瘤壞死程度比較

以上結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明構(gòu)建的重組病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ對(duì)小鼠的治療有顯著效果，并有如下規(guī)律1.rHSV-1Δ34.5/lacZ治療與腫瘤發(fā)生時(shí)間有關(guān)，早期治療優(yōu)于中期治療，晚期治療效果更差；
2.rHSV-1Δ34.5/lacZ治療與病毒劑量有關(guān)，隨著病毒劑量增加，治療效果顯著增加，高劑量的重組病毒在任何情況下的治療效果遠(yuǎn)優(yōu)于中、低劑量；3.rHSV-1Δ34.5/lacZ治療腫瘤與時(shí)間進(jìn)程有關(guān)，不管是早期治療還是中期治療，甚至劑量達(dá)到中等程度，注射后的2周無(wú)顯著效果(因?yàn)椴《緩?fù)制需要時(shí)間)，到第4周，病毒大量增殖，產(chǎn)生臨近效應(yīng)，不管是哪一個(gè)治療組，不管是哪一個(gè)劑量組均顯示顯著的治療效果。
4.rHSV-1Δ34.5/lacZ治療腫瘤的關(guān)鍵是重組病毒的劑量，為了病人的及早康復(fù)，最好的治療方案是用高劑量重組病毒(5×106pfu/mL)，一次注射，2周后療效顯著，甚至1周后也表現(xiàn)一定效果。
提取小鼠各組織DNA，用HSV-1特異的引物擴(kuò)增，PCR鑒定rHSV-1Δ34.5/lacZ的存在。結(jié)果顯示僅在治療的腫塊中，而未在其它組織中擴(kuò)增出相應(yīng)片段(見(jiàn)圖14)，說(shuō)明rHSV-1Δ34.5/lacZ僅能在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，并不能擴(kuò)散到其他組織中。
電鏡觀察腫瘤組織和腦組織切片，發(fā)現(xiàn)在治療的腫瘤組織中，有包裝好的和未包裝的病毒顆粒，直徑約140nm；相形之下，腦組織切片正常，未見(jiàn)病毒樣顆粒(圖15)。
實(shí)施例8 荷人肝癌Hep-3B裸鼠模型的建立人肝癌Hep-3B細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，武漢)，并經(jīng)體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明rHSV-1Δ34.5/lacZ能在Hep-3B細(xì)胞上復(fù)制增殖，產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)；用MTT技術(shù)證實(shí)了rHSV-1Δ34.5/lacZ對(duì)Hep-3B細(xì)胞的毒殺作用。
實(shí)驗(yàn)裸鼠由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供并負(fù)責(zé)全程管理和飼養(yǎng)。
大量培養(yǎng)Hep-3B細(xì)胞，待細(xì)胞形成致密單層時(shí)，消化收集細(xì)胞在無(wú)菌離心管中，1000rpm，離心5min；收集細(xì)胞沉淀，加入10ml新鮮MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀；取100ul細(xì)胞懸液稀釋，混勻后滴加在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)細(xì)胞；1000rpm，5min，離心沉淀細(xì)胞；加入新鮮MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，使終劑量為5×108cells/ml。
將1ml Hep-3B細(xì)胞濃縮液用無(wú)菌注射器注射到5只裸鼠的腋下(0.2ml/只)，一星期后，裸鼠注射部位長(zhǎng)出綠豆大小瘤狀突起；30天后，瘤狀突起物增大；處死荷瘤裸鼠，切下瘤狀物，并用解剖刀完全切碎，然后用套筒針管將切碎的瘤狀物全部等量移植到另外的5只健康裸鼠腋下。30天后，移植的裸鼠腋下均出現(xiàn)直徑約0.8cm的瘤狀物；處死其中1只移植裸鼠，取瘤狀物作病理檢查和作原代細(xì)胞培養(yǎng)，證實(shí)瘤狀物為Hep-3B腫瘤塊。另4只實(shí)驗(yàn)裸鼠20天后，移植腫瘤生長(zhǎng)至直徑3.5cm左右；處死之，切下腫瘤，并搗碎成米粒大小，用套筒針管第二次移植至180只裸鼠腋下；15天后，80％的移植裸鼠出現(xiàn)移植腫瘤，直徑在0.5cm-1.5cm之間(圖16)；選取125只作rHSV-1Δ34.5/lacZ治療實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例9 rHSV-1Δ34.5/lacZ對(duì)荷人肝癌Hep-3b裸鼠的殺瘤效應(yīng)測(cè)定供試病毒為實(shí)施例1構(gòu)建的重組病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ，供試裸鼠為實(shí)施例8建立的荷人肝癌Hep-3b裸鼠模型。TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司。PCR引物在基康生物公司合成，單純皰疹病毒DNA多聚酶基因Pol(215bp)，Pol正向引物GCT CGAGTG CGA AAA AAC GTT C，Pol反向引物CGG GGC GCT CGG CTA AC；單純皰疹病毒tk基因(335bp)，tk正向引物GAC CAG CGC CCA GAT AAC AA，tk反向引物CCA GCATAG CCA GGT CAA GC。PCR反應(yīng)體系95℃ 30sec，62℃ 30sec，72℃ 30sec共30個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。血液學(xué)指標(biāo)用日本東亞醫(yī)用電子公司生產(chǎn)的F-820型血球計(jì)數(shù)儀測(cè)定；血液生化指標(biāo)用德國(guó)產(chǎn)Eppendorf FG124型半自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，試劑盒由北京中生生物制品有限公司提供。
將選取的125只裸鼠按腫瘤大小分組，保證每組裸鼠的平均腫瘤大小基本一致，一共分為5個(gè)組rHSV-1Δ34.5/lacZ高劑量(5×106pfu/mL)治療組，rHSV-1Δ34.5/lacZ中劑量(5×105pfu/mL)治療組，rHSV-1Δ34.5/lacZ低劑量(5×104pfu/mL)治療組，空白對(duì)照組(注射不含rHSV-1Δ34.5/lacZ的Vero細(xì)胞懸液)，臨床藥物阿霉素ADM對(duì)照組(3.333mg ADM/ml)。分組后當(dāng)天，按上述分組施以不同的處理；瘤內(nèi)注射0.1ml/次/鼠處理用試劑，病毒組每周注射一次，共3次，ADM對(duì)照組每間隔三周作一次注射。
治療期間，觀察受試動(dòng)物生活狀態(tài)，記錄裸鼠死亡數(shù)，隔天測(cè)量裸鼠腫瘤大小及體重，繪制裸鼠腫瘤體積/時(shí)間變化曲線。在第三次瘤內(nèi)注射治療后一個(gè)星期開(kāi)始分三批(每周一批)處死裸鼠；眼球取血，做血常規(guī)以及血液生化檢查；取全部腫瘤組織、心、肝、脾、肺、腎和大腦，分別測(cè)量重量、用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)重組病毒的mRNA和組織病理學(xué)檢測(cè)等。
部分解剖后的rHSV-1Δ34.5/lacZ治療組裸鼠腫瘤與空白對(duì)照組裸鼠腫瘤照相，結(jié)果見(jiàn)圖17。結(jié)果表明，空白對(duì)照組裸鼠的瘤塊體積大、顏色鮮艷、血管豐富；高劑量rHSV-1Δ34.5/lacZ治療組裸鼠的瘤塊體積最小，血管不豐富；低劑量rHSV-1Δ34.5/lacZ治療組裸鼠瘤塊體積比空白對(duì)照組要小，且腫瘤塊血管沒(méi)有增生。
各組裸鼠的腫瘤大小隨時(shí)間變化的趨勢(shì)如圖18。結(jié)果表明，空白對(duì)照組裸鼠的腫瘤

體積隨時(shí)間延長(zhǎng)而持續(xù)大幅增加，且在治療期間呈加速上升趨勢(shì)，腫瘤體積由最初的30mm3增大接近20倍至最終的557mm3；rHSV-1Δ34.5/lacZ各治療組裸鼠的腫瘤體積在治療初期上升幅度較大，但仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于空白對(duì)照組的上升幅度，且在治療中、后期，治療裸鼠的腫瘤體積上升幅度明顯減小，最終各rHSV-1Δ34.5/lacZ治療組裸鼠腫瘤體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于空白對(duì)照組；臨床藥物阿霉素對(duì)照組裸鼠的腫瘤體積也是一直持續(xù)增加，但上升幅度小于空白對(duì)照組，最終治療效果不及高、中劑量rHSV-1Δ34.5/lacZ治療組，只是略優(yōu)于低劑量rHSV-1Δ34.5/lacZ治療組。各組腫瘤大小變化趨勢(shì)說(shuō)明，在治療初期，rHSV-1Δ34.5/lacZ增殖尚不占優(yōu)勢(shì)，癌細(xì)胞增加數(shù)目大于rHSV-1Δ34.5/lacZ殺死癌細(xì)胞數(shù)目，所以腫瘤體積仍在增大；隨著rHSV-1Δ34.5/lacZ在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制直至rHSV-1Δ34.5/lacZ趨于對(duì)數(shù)增殖，在治療的中、后期，rHSV-1Δ34.5/lacZ殺死癌細(xì)胞數(shù)大于癌細(xì)胞自身增殖數(shù)，以至腫瘤平均體積迅速減小、乃至消失。
rHSV-1Δ34.5/lacZ對(duì)荷人肝癌Hep-3B裸鼠的治療效果見(jiàn)表13。rHSV-1Δ34.5/lacZ對(duì)在體Hep-3B腫瘤有非常顯著的抑制作用；rHSV-1Δ34.5/lacZ治療組裸鼠生活狀態(tài)正常，高、中、低劑量治療組裸鼠均沒(méi)有因rHSV-1Δ34.5/lacZ副作用引起死亡?？瞻讓?duì)照組因沒(méi)有得到治療，有將近30％的裸鼠死于快速生長(zhǎng)的腫瘤；而其余的裸鼠腫瘤體積增長(zhǎng)得很大，并且生活狀態(tài)極差。臨床藥物對(duì)照組裸鼠經(jīng)ADM治療后腫瘤體積和重量有所減少，但是有明顯的副作用，裸鼠生活狀態(tài)不好，死亡率達(dá)15％。rHSV-1Δ34.5/lacZ顯示了極好的抗癌效果和安全性。
表13.rHSV-1Δ34.5/lacZ對(duì)荷Hep-3B裸鼠治療效果一覽表具體實(shí)施例方式

結(jié)果(表15)表明rHSV-1Δ34.5/lacZ各治療組與空白對(duì)照組比較，10項(xiàng)生化指標(biāo)均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。從而可以得出結(jié)論rHSV-1Δ34.5/lacZ對(duì)受試動(dòng)物的肝功能、腎功能、酶類、以及血脂等項(xiàng)目均無(wú)不良影響；而化療藥物阿霉素對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，總膽蛋白(TBI)指標(biāo)比空白對(duì)照組指標(biāo)顯著增高(P＜0.05)，表明對(duì)肝功能有毒副作用，而rHSV-1Δ34.5/lacZ治療不產(chǎn)生毒副作用。
表14.血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

表15.血液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

系統(tǒng)臨床病檢在實(shí)驗(yàn)裸鼠處死后立即進(jìn)行。先觀察各組實(shí)驗(yàn)裸鼠的胸腔、腹腔、顱腔及各臟器的位置、形狀、大小、質(zhì)地、色澤等情況，均未發(fā)現(xiàn)異常；再對(duì)心、肝、脾、肺、腎、腦等器官和腫瘤稱重并計(jì)算臟器和腫瘤系數(shù)，對(duì)各給藥組與空白對(duì)照組間進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(t檢驗(yàn))，結(jié)果見(jiàn)表16。研究結(jié)果表明，rHSV-1Δ34.5/lacZ各治療組與空白對(duì)照組比較，各臟器重量及臟器系數(shù)均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，定量的說(shuō)明了rHSV-1Δ34.5/lacZ對(duì)治療裸鼠各正常臟器無(wú)任何影響和副作用；而rHSV-1Δ34.5/lacZ各治療組與空白對(duì)照組比較，腫瘤顯著縮小，rHSV-1Δ34.5/lacZ各治療組與空白對(duì)照組之間腫瘤重量和腫瘤系數(shù)均有顯著性差異(P＜0.05)，其中高、中劑量rHSV-1Δ34.5/lacZ治療組之間有極顯著性差異(P＜0.01)，反映了rHSV-1Δ34.5/lacZ對(duì)荷Hep-3B裸鼠腫瘤存在極有效的抑制作用。
表16.系統(tǒng)臨床病檢結(jié)果

對(duì)實(shí)驗(yàn)各組裸鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦進(jìn)行病理切片檢查，結(jié)果見(jiàn)圖21、22。結(jié)果表明rHSV-1Δ34.5/lacZ治療組裸鼠與空白對(duì)照組裸鼠的各臟器均正常，說(shuō)明rHSV-1Δ34.5/lacZ不影響受試裸鼠的正常組織。
SEQ ID NO.11 tttaaagtcg cggcggcgca gcccgggccc cccgcggccg agacgagcga gttagacagg61 caagcactac tcgcctctgc acgcacatgc ttgcctgtca aactctacca ccccggcacg121 ctctctgtct ccatggcccg ccgccgccgc catcgcggcc cccgccgccc ccggccgccc181 gggcccacgg gcgccgtccc aaccgcacag tcccaggtaa cctccacgcc caactcggaa241 cccgcggtca ggagcgcgcc cgcggccgcc ccgccgccgc cccccgccag tgggcccccg301 ccttcttgtt cgctgctgct gcgccagtgg ctccacgttc ccgagtccgc gtccgacgac361 gacgatgacg acgactggcc ggacagcccc ccgcccgagc cggcgccaga ggcccggccc421 accgccgccg ccccccgccc ccggtcccca ccgcccggcg cgggcccggg gggcggggct481 aacccctccc accccccctc acgccccttc cgccttccgc cgcgcctcgc cctccgcctg541 cgcgtcaccg cagagcacct ggcgcgcctg cgcctgcgac gcgcgggcgg ggagggggcg601 ccggagcccc ccgcgacccc cgcgaccccc gcgacccccg cgacccccgc gacccccgcg661 acccccgcga cccccgcgac ccccgcgacc cccgcgaccc ccgcgcgggt gcgcttctcg721 ccccacgtcc gggtgcgcca cctggtggtc tgggcctcgg ccgcccgcct ggcgcgccgc781 ggctcgtggg cccgcgagcg ggccgaccgg gctcggttcc ggcgccgggt ggcggaggcc841 gaggcggtca tcgggccgtg cctggggccc gaggcccgtg cccgggccct ggcccgcgga901 gccggcccgg cgaactcggt ctaacgttac acccgaggcg gcctgggtct tccgcggagc961 tcccgggagc tccgcaccaa gccgctctcc ggagagacga tggcaggagc cgcgcatata1021 tacgctggga gccggcccgc ccccgaggcg ggcccgccct cggagggcgg gactggccaa1081 tcggcggccg ccagcgcggc ggggcccggc caaccagcgt ccgccgagtc ttcggggccc1141 ggcccactgg gcgggagtta ccgcccagtg ggccgggccg cccacttccc ggtatggtaa1201 ttaaaaactt acaagaggcc ttgttccgct tcccggtatg gtaattagaa actcattaat1261 gggcggcccc ggccgccctt cccgcttccg gcaattcccg cggcccttaa tgggcaaccc1321 cggtattccc cgcctcccgc gccgcgcgta accactccct tggggttccg ggttatgcta1381 attgcttttt tggcggaat
權(quán)利要求
1.一種重組1型單純皰疹病毒，單純病毒，1型單純皰疹病毒(Simplexvirus Herpssimplexvirus 1)rHSV-1Δ34.5/lacZ，CCTCC NO.V200402。
2.一種實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述的重組1型單純皰疹病毒的制備方法，包括下列步驟1)β-半乳糖苷酶表達(dá)盒的獲得與純化猴病毒40啟動(dòng)子，1bp-419bp，控制著載體pSV-β-Galactosidase上的lacZ基因710bp-3755bp的表達(dá)，pSV-β-Galactosidase上含有1個(gè)PolyA序列，4021bp-4156bp，SV40啟動(dòng)子上游6814bp和lacZ編碼序列的近3′末端3701bp各含有1個(gè)EcoRI位點(diǎn)，lacZ表達(dá)盒下游則含有1個(gè)BamHI位點(diǎn)4151bp；故用BamHI、EcoRI消化，DE81膜回收大片段，獲得LacZ表達(dá)盒4160bp，其中含有SV40啟動(dòng)子、lacZ、polyA；2)中間載體I pFL的構(gòu)建載體pFastBac1用EcoRI/BamHI雙酶切消化，與EcoRI/BamHI雙酶切消化的lacZ表達(dá)盒連接，構(gòu)建中間載體I pFL，該中間載體I pFL的lacZ表達(dá)盒上游具有載體自身的1個(gè)Not1位點(diǎn)；3)中間載體II pBL的構(gòu)建BamHI/XhoI酶切中間載體I pFL以切下lacZ表達(dá)盒，BamHI/XhoI酶切質(zhì)粒pBluescript-M13，將lacZ表達(dá)盒與線性pBluescript-M13連接，以構(gòu)建中間載體II pBL，使lacZ表達(dá)盒下游也獲得載體本身的1個(gè)NotI位點(diǎn)，于是，lacZ表達(dá)盒上下游均帶有NotI位點(diǎn)；4)轉(zhuǎn)移載體pIL的構(gòu)建質(zhì)粒p4789帶有完整的HSV-1的icp34.5基因及其側(cè)翼序列，NotI酶切質(zhì)粒p4789，以切去icp34.5基因第262位密碼子262bp到終止子1084bp長(zhǎng)823bp的序列，NotI酶切中間載體II pBL，獲得lacZ表達(dá)盒，并連接到經(jīng)NotI酶切的質(zhì)粒p4789上，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pIL，該轉(zhuǎn)移載體pIL中的icp34.5基因被NotI酶切缺失824bp并被lacZ表達(dá)盒插入雙重滅活；5)重組病毒的獲得轉(zhuǎn)移載體pIL與野生單純皰疹病毒F株共轉(zhuǎn)染敘利亞倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系，經(jīng)過(guò)同源重組，獲得被NotI酶切缺失的icp34.5基因和lacZ表達(dá)盒插入雙重滅活的重組1型單純皰疹病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ，用病毒上清感染含Xgal軟瓊脂培養(yǎng)基的BHK21細(xì)胞，挑出藍(lán)斑，進(jìn)行稀釋，再接種BHK21細(xì)胞，進(jìn)行空斑純化。
3.一種重組1型單純皰疹病毒在抗腫瘤中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種重組1型單純皰疹病毒(Simplexvirus Herps simplexvirus 1rHSV－1Δ34.5/lacZ)，制備該重組1型單純皰疹病毒的方法及重組1型單純皰疹病毒作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用。制備步驟是β－半乳糖苷酶表達(dá)盒的獲得與純化，中間載體IpFL的構(gòu)建，中間載體II pBL的構(gòu)建，轉(zhuǎn)移載體pIL的構(gòu)建，重組病毒的獲得。本發(fā)明凋亡抑制基因icp34.5也是神經(jīng)毒基因被報(bào)導(dǎo)基因lacZ插入失活，該重組1型單純皰疹病毒僅能在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，而在正常細(xì)胞中不復(fù)制，故重組1型單純皰疹病毒能有效殺死腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常細(xì)胞和組織安全，具有很好的靶向性和選擇性。
文檔編號(hào)A61K35/66GK1570091SQ20041001307
公開(kāi)日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2004年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月22日
發(fā)明者齊義鵬, 董長(zhǎng)垣, 肖庚富, 蘭萍, 祝華斌, 薛峰, 蘇越, 胡寶利, 肖巍 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)