專利名稱：一種米糠多糖類活性組分的制備方法
技術領域：
一種米糠多糖類活性組分的制備方法，屬于大米精深加工技術領域。
背景技術：
稻谷經(jīng)礱谷去掉稻殼后就得到糙米，米糠則是糙米碾白過程中被碾下的皮層及少量米胚和碎米的混合物。米糠的主要成分是糖類、脂肪及蛋白質，并含有較多的灰分和維生素。米糠的質量與各營養(yǎng)成分的數(shù)量取決于碾米的精度以及碾米過程中胚乳破碎的程度。
米糠一般占稻米總重的6～8％，但它卻包含有稻米64％的重要營養(yǎng)成分以及90％以上的人體必須元素。聯(lián)合國工業(yè)發(fā)展組織(UNIDO)把第三世界的米糠稱之為一種未充分利用的資源(an under-utilized raw material)。在國外米糠被譽為“天賜營養(yǎng)源”。隨著現(xiàn)代科技的進步，米糠全身皆是寶的奧秘已得以揭示。世界上許多大公司對于米糠中功能性成分的提取富集很感興趣。據(jù)不完全統(tǒng)計，截止目前已公開的有關米糠深加工的專利有50多件。
多糖作為來自高等植物、動物細胞膜和微生物細胞壁中的天然高分子化合物，是構成生命的四大基本物質之一。人們對于糖類的早期研究只注意到它作為能源物質的重要性和細胞的組成成分，只是近幾十年來人們對多糖的生物活性才有了進一步的認識。多糖具有多種生物活性，同維持生物機能密切相關。多糖與蛋白質、脂類形成的糖蛋白、脂多糖在細胞識別、細胞生長、分化、代謝、胚胎發(fā)育、細胞癌變、病毒感染、免疫應答等方面起著不容忽視的作用。自20世紀50年代末人們發(fā)現(xiàn)真菌多糖具有抗腫瘤活性以來，多糖的研究受到越來越廣泛的重視。近20年來，由于生物學、化學等學科的飛速發(fā)展，人們對多糖及其復合物的活性作用有了越來越深入的認識。多糖在抗腫瘤、免疫增強、降血糖、抗病毒、抗衰老、抗炎、抗凝血等方面發(fā)揮著生物活性作用。
米糠中存在多種類型的多糖，米糠多糖(RBP)是一類結構復雜的雜聚糖，由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等組成，主要的多糖有脂多糖、阿拉伯木聚糖和葡聚糖等。米糠活性多糖不僅具有一般多糖的生理功能，而且還具有較強的提高血清腫瘤壞死因子水平、增強機體免疫功能及降血糖、降血壓、降膽固醇等防治老年心血管疾病的功能，這已被科學界和醫(yī)學界所證實。米糠活性多糖被認為具有與人參、當歸等中草藥多糖相類似的功效，而米糠資源豐富和價格低廉，非常適合開發(fā)利用。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種米糠多糖類活性組分的制備方法，對脫脂米糠進行綜合利用，提高農(nóng)副產(chǎn)品附加值。
本發(fā)明的技術方案以米糠油生產(chǎn)中的副產(chǎn)品脫脂米糠為原料，用熱水提取其中的水溶性多糖，用淀粉酶和糖化酶酶解去除淀粉，用蛋白酶酶解反應去除蛋白質，用氫氧化鈣沉淀分離植酸鹽，再經(jīng)過超濾濃縮、乙醇沉淀制得粗制米糠多糖RBP產(chǎn)品；或對RBP繼續(xù)進行Sepharose CL-6B凝膠過濾柱層析，取RBP-a組分，再對RBP-a進行DEAE Sepharose Fast Flow離子交換柱層析，得到RBP-M主要免疫活性組分。
(1)擠壓膨化對米糠多糖提取的影響對米糠進行擠壓膨化處理可有效鈍化其中的脂肪酶，從而穩(wěn)定米糠的理化性質。特別是采用擠壓膨化工藝還可提高米糠中可溶性碳水化合物的含量，由此可以提高米糠多糖的得率。因此我們采用經(jīng)過擠壓膨化處理的脫脂米糠為原料。
(2)料水比對多糖得率的影響多糖得率隨著料水比的增加而增加，但其增加程度很??；但在料水比小于1∶6時，米糠與水的混合體系較稠難以攪動，所以采用料水質量比為1∶8。
(3)熱水提取工藝條件的優(yōu)化熱水提取溫度60～95℃，提取時間1～5小時，pH值5.0。采用響應面分析法(RAS)來尋求最佳工藝參數(shù)，設計組合使米糠多糖的得率為最佳。優(yōu)化工藝條件為溫度80℃，時間1.5小時，pH值5.0。在此工藝條件下放大5倍，重復試驗2次，進行米糠多糖的提取，平均得率為2.82％。
(4)蛋白酶酶解反應去除蛋白質RBP中除含有大量多糖(67.2％)外，還含有一定量的蛋白質(17.4％)及其它非糖雜質(主要是植酸鹽類)。目前用于多糖除蛋白的主要方法有Sevage法、三氟三氯乙烷法、苯酚法、等電點沉淀法、三氯乙酸法、正丁醇法和酶法。相對以上幾種方法，酶法去除蛋白工藝則相對較好，可以較好的完成蛋白質的去除和糖類物質的保留。選取酶用量、溫度、時間、pH值四個因素進行工藝條件優(yōu)化酶用量為底物濃度的0.5-1.5％，溫度為40-60℃，水浴1-2.5h為適宜的工藝條件，此時蛋白質百分含量為2.75％，蛋白質的去除百分率達到85％。
(5)Ca(OH)2沉淀分離植酸鹽以10％Ca(OH)2一次沉淀法去除提取液中的植酸。因為提取液體系的pH值為5左右，故用10％Ca(OH)2調節(jié)pH至中性。由于石灰乳的溶解有一個過程，其堿性釋放緩慢，常使剛調好的pH值片刻后又發(fā)生改變(升高)，造成工藝不穩(wěn)定，難控制，為此，我們以提取液中(植酸)磷含量的變化考察了攪拌時間對植酸沉淀的影響。攪拌時間從10min增加至50min，提取液中總磷含量降低顯著，即植酸沉淀為植酸鈣的作用顯著，50min以后，植酸沉淀充分，控制攪拌0.5-1小時，尤以選擇50min為最佳。經(jīng)過石灰乳的沉淀工藝，粗制米糠多糖(RBP)中灰分含量由14％降為1.3％，灰分去除率達到約92％，RBP純度得以提高。
(6)沉析液乙醇質量濃度對米糠多糖得率的影響多糖得率的總趨勢是隨著沉析液乙醇質量分數(shù)的增加而增加，到60％以上漸趨緩慢，這與多糖分子量大小有關，大分子量多糖溶解性較差，在低濃度的乙醇中即可沉淀，而小分子量多糖則要在較高的乙醇濃度下才能沉淀，部分單糖與寡糖不會沉淀，即使是乙醇濃度達到90％也還能溶解在其中。在提取工藝中，我們控制沉析終濃度為質量分數(shù)60-80％的乙醇進行多糖的沉淀。
(7)RBP凝膠過濾柱層析采用Sepharose CL-6B凝膠過濾柱對RBP濃縮液進行分級純化，用0.2mmol/L的NaCl溶液進行洗脫，自動部分收集，可以分級分離成三個主要組分RBP-a、RBP-b及RBP-c，其中RBP-a活性最顯著。
(8)RBP-a離子交換柱層析將RBP-a的濃縮液加至DEAE Sepharose Fast Flow離子交換色譜柱，離子強度線性梯度洗脫，自動部分收集，可以分級分離成四個主要組分RBP-L、RBP-M、RBP-N及RBP-O，體外活性檢測結果表明含量較高組分RBP-M活性最顯著。
本發(fā)明的有益效果國內外已有用全脂新鮮米糠作原料、用沸水浸泡提取米糠多糖的公開文獻報道，已有加硫酸銨或乙醇等有機溶劑沉淀提取米糠多糖的公開文獻報道，也已有研究米糠多糖的降血糖活性、降血脂活性和抑瘤活性的公開文獻報道；但本發(fā)明以脫脂米糠為原料，采用熱水提取(水溫低于沸點)、復合酶解、氫氧化鈣處理工藝，蛋白質去除率達到85％，灰分去除率達到約92％；采用凝膠過濾柱層析和離子交換柱層析分離純化，得到活性組分RBP-M。RBP-M的主要單糖組成為葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖等；構效關系研究表明，RBP-M的活性主要由多糖部分貢獻，與蛋白質、脂多糖、酚酸類物質無關；采用動物實驗研究RBP和RBP-M的免疫調節(jié)活性，證明其可增強免疫功能低下小鼠的細胞免疫、體液免疫和非特異性免疫活性。國內外未見與此相同的公開文獻、成果或專利報道。
附圖為米糠多糖類活性組分制備工藝流程圖。
具體實施例方式
實施例1取1000g脫脂米糠，加入10L蒸餾水，加熱至85℃，攪拌提取2小時，2500rpm離心20分鐘，85℃條件下加淀粉酶(0.5％)酶解反應半小時，降溫至65℃，調pH至4.0加糖化酶酶解去除淀粉，再降溫至45℃加蛋白酶(1.5％)酶解反應1小時去除蛋白質，加10％Ca(OH)2回調pH至中性，攪拌1小時，離心沉淀分離植酸鹽，上清液經(jīng)超濾濃縮，4倍酒精沉淀，靜置，離心，沉淀復溶后或經(jīng)旋轉蒸發(fā)濃縮，真空或噴霧干燥得到RBP；或沉淀復溶后進一步分離純化得到RBP-M。
實施例2取1000g脫脂米糠，加入20L蒸餾水，加熱至95℃，攪拌提取1.5小時，2500rpm離心20分鐘，85℃條件下加淀粉酶(0.5％)酶解反應1小時，降溫至65℃，調pH至4.0加糖化酶酶解去除淀粉，再降溫至40℃加蛋白酶(1.5％)酶解反應1.5小時去除蛋白質，加10％Ca(OH)2回調pH至中性，攪拌0.5小時，離心沉淀分離植酸鹽，上清液經(jīng)超濾濃縮，4倍酒精沉淀，靜置，離心，沉淀復溶后或經(jīng)旋轉蒸發(fā)濃縮，真空或噴霧干燥得到RBP；或沉淀復溶后進一步分離純化得到RBP-M。
實施例3取RBP濃縮液(8mg/ml)10ml，加入Sepharose CL-6B凝膠過濾柱，用0.2mmol/L的NaCl溶液進行洗脫，自動部分收集，得到三個組分RBP-a(38mg)、RBP-b(18mg)及RBP-c(20mg)，其中RBP-a活性最顯著。將RBP-a的濃縮液(20mg/ml)20ml加至DEAE Sepharose Fast Flow離子交換色譜柱，離子強度線性梯度洗脫，自動部分收集，可以分級分離成四個主要組分RBP-L(58mg)、RBP-M(219)、RBP-N(88mg)及RBP-O(16.5mg)，體外活性檢測結果表明含量較高組分RBP-M活性最顯著。
權利要求
1.一種米糠多糖類活性組分的制備方法，其特征是以米糠油生產(chǎn)中的副產(chǎn)品脫脂米糠為原料，用熱水提取其中的水溶性多糖，用淀粉酶和糖化酶酶解去除淀粉，用蛋白酶酶解反應去除蛋白質，用氫氧化鈣沉淀分離植酸鹽，再經(jīng)過超濾濃縮、乙醇沉淀制得粗制米糠多糖RBP產(chǎn)品；或對RBP繼續(xù)進行Sepharose CL-6B凝膠過濾柱層析，取RBP-a組分，再對RBP-a進行DEAE Sepharose Fast Flow離子交換柱層析，得到RBP-M主要免疫活性組分。
2.根據(jù)權利要求1所述的米糠多糖類活性組分的制備方法，其特征是所用原料脫脂米糠，是經(jīng)過擠壓膨化處理的脫脂米糠。
3.根據(jù)權利要求1所述的米糠多糖類活性組分的制備方法，其特征是熱水提取，料水質量比為1∶6～1∶20，提取溫度60～95℃，提取時間1～5小時，pH值5.0。
4.根據(jù)權利要求1所述的米糠多糖類活性組分的制備方法，其特征是蛋白酶酶解反應，酶用量為底物濃度的0.5～1.5％，酶解溫度40～60℃，酶解時間1～2.5小時。
5.根據(jù)權利要求1所述的米糠多糖類活性組分的制備方法，其特征是分離植酸鹽，用10％Ca(OH)2沉淀法去除提取液中的植酸，不斷攪拌，不斷加10％Ca(OH)2溶液調節(jié)提取液pH值至中性，攪拌0.5～1小時。
6.根據(jù)權利要求1所述的米糠多糖類活性組分的制備方法，其特征是乙醇沉淀米糠多糖，控制沉析終濃度為質量分數(shù)60～80％的乙醇。
7.根據(jù)權利要求1所述的米糠多糖類活性組分的制備方法，其特征是凝膠過濾柱層析，采用Sepharose CL-6B凝膠過濾柱對RBP濃縮液進行分級純化，用0.2mmol/L的NaCl溶液進行洗脫，自動部分收集，可以分級分離成三個主要組分RBP-a、RBP-b及RBP-c，其中RBP-a活性最顯著。
8.根據(jù)權利要求1所述的米糠多糖類活性組分的制備方法，其特征是離子交換柱層析，將RBP-a的濃縮液加至DEAE Sepharose Fast Flow離子交換色譜柱，離子強度線性梯度洗脫，自動部分收集，可以分級分離成四個主要組分RBP-L、RBP-M、RBP-N及RBP-O，體外活性檢測結果表明含量較高組分RBP-M活性最顯著。
全文摘要
一種米糠多糖類活性組分的制備方法，屬于大米精深加工技術領域。本發(fā)明以脫脂米糠為原料，采用熱水提取多糖、復合酶解去除淀粉和蛋白質、氫氧化鈣處理去除植酸鹽，制得粗制米糠多糖RBP，其總糖含量為85.4％，得率為2.82％；繼續(xù)采用凝膠過濾柱層析和離子交換柱層析，分離純化得到RBP－M活性組分。采用動物實驗研究米糠多糖RBP和RBP－M的免疫調節(jié)活性，發(fā)現(xiàn)它們對免疫功能低下小鼠在細胞免疫、體液免疫和非特異性免疫方面具有顯著增強作用。
文檔編號A61K31/715GK1560266SQ20041001426
公開日2005年1月5日 申請日期2004年3月8日 優(yōu)先權日2004年3月8日
發(fā)明者姜元榮, 姚惠源, 陳正行 申請人:江南大學