專利名稱：一種垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽衍生物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程技術領域，涉及一種腺苷酸環(huán)化酶激活多肽衍生物，以及該衍生物的生產方法。
背景技術：
垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(英文名稱pituitary adenylate cyclase activatingpolypeptide，以下簡稱PACAP)及其受體廣泛分布于中樞神經系統(tǒng)、周圍神經系統(tǒng)以及非神經組織內，如腦、脊髓、腎上腺、睪丸、卵巢、肝臟、腎臟、胰腺、松果腺、心臟、脊椎、神經節(jié)、呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等。PACAP通過激活靶細胞細胞膜上特異的G蛋白偶聯(lián)受體，調節(jié)靶細胞內第二信史cAMP、IP3和Ca2+的濃度，從而發(fā)揮重要的生物學功能。目前已證實PACAP具有神經遞質、神經調質、神經營養(yǎng)和保護，調節(jié)胰島素及其它激素的分泌，保護血管上皮細胞，防止動脈硬化，調節(jié)生殖細胞的生成等作用。天然的PACAP由38個氨基酸組成，目前大多采用化學合成的方法，成本昂貴且收獲率低。因為PACAP的衍生物也具有相同的生物學活性。所以采用基因工程的方法獲得PACAP相應的衍生物可以降低生產成本，而且通過對生產方法的摸索，可以有效地提高收獲率及其活性、穩(wěn)定性等指標。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種重組腺苷酸環(huán)化酶激活多肽衍生物；本發(fā)明的另一目的在于提供重組腺苷酸環(huán)化酶激活多肽衍生物的生產方法；本發(fā)明再一目的在于提供重組腺苷酸環(huán)化酶激活多肽衍生物在制備治療相關疾病的藥物中的應用。
本發(fā)明利用基因工程的方法，通過蛋白內含肽(intein)的自剪切功能制備PACAP的衍生肽-PACAP衍生硫酯(PDT)，其是在天然PACAP的羧基端通過硫酯鍵連接了一個β-巰基乙醇分子(CH2SHCH2OH、β-mercaptoethanol，BME)，其與天然或化學合成產生的PACAP多肽的區(qū)別在于PDT為39個氨基酸，第一個氨基酸為甲硫氨酸，從第2個開始至第39個氨基酸的序列與天然的PACAP相同，但最后的一個氨基酸即賴氨酸(Lys)的羧基上與天然的PACAP不同，詳見見圖2、圖3和圖4，即其中本發(fā)明提供的PDT的羧基端最后一個氨基酸殘基的分子結構為圖2，其羧基端為一個β-巰基乙醇分子；而天然PACAP在相應位置處的氨基酸殘基分子結構見圖3，其羧基端為一個羥基；另化學合成的PACAP在相應位置處的氨基酸殘基分子結構見圖4，其羧基端為一個氨基。可從以上結果得知，本發(fā)明的PACAP的衍生肽--PDT)與天然的PACAP或化學合成的PACAP衍生物是不相同的。
本發(fā)明可用于制備治療相關疾病的藥物，該類藥物可用于腦損傷、腦缺血、防止神經細胞死亡、抗炎、男性陽痿、性冷淡、不孕不育、神經痛、神經病、神經混亂、焦慮癥、記憶損傷、癡呆、認知混亂、中樞神經系統(tǒng)疾病、偏頭痛、神經畏縮、心肌缺血、心肌梗死/纖維化、動脈硬化、糖尿病、肌畏縮癥、胃潰瘍、高血壓、內毒性休克、血栓癥、視網膜病變、心血管疾病、腎衰竭、心衰竭等疾病的治療。
以下詳細描述本發(fā)明的技術方案本發(fā)明所提供的PACAP的衍生肽--PACAP衍生硫酯(PDT)，其具體制備路線為首先，用本領域技術人員熟知的方法，設計引物，采用PCR的方法人工合成垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因；其次，將合成的垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因克隆到質粒載體中，構建成功重組表達載體，其中質粒載體較好的是pTYB1，構建而得的重組表達載體命名為pTY-PDT。
再在宿主菌表達由PACAP、intein和幾丁質結合域(chitin binding domain，CBD)構成的“三元”融合蛋白，其中所述的宿主菌，較好的是大腸桿菌，優(yōu)選的是大腸桿菌ER2566；再將表達產物與親和柱進行親和層析，該親和柱優(yōu)選的是幾丁質柱；“三元”融合蛋白通過CBD與親和柱特異結合，洗去雜蛋白后，用誘導劑誘導intein將目的蛋白PACAP從融合蛋白上切割下來，該誘導劑優(yōu)選的是β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol，BME)；最后，所制備的衍生肽蛋白羧基端通過硫酯鍵連接一個β巰基乙醇分子，成為蛋白硫酯，為一種PACAP衍生物，稱PACAP衍生硫酯(英文名稱PACAPderived thioester，以下簡稱PDT)。
以上所述的具體制備路線可參考圖5。另，目的蛋白PACAP從融合蛋白上切割下來，即PDT的產生機制的示意圖見圖6。
經檢測PDT的活性與天然蛋白相同，但體外活性半衰期比天然蛋白至少長10倍，說明PDT比天然蛋白的穩(wěn)定性更高。
值得說明的是，PDT在水中會發(fā)生水解反應，其通過硫酯鍵連接的β巰基乙醇分子基團會進一步水解形成-SH、-SOH、-OH、-H等基團，但活性試驗證明，這些水解混合物并沒有影響其活性。
獲得的垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽衍生物PDT由于具有神經遞質、神經調質、神經營養(yǎng)和保護，調節(jié)胰島素及其它激素的分泌，保護血管上皮細胞，防止動脈硬化，調節(jié)生殖細胞的生成等作用，因此它也可用于進一步制備治療相關疾病的藥物，該類藥物可用于治療包括腦損傷、腦缺血、防止神經細胞死亡、抗炎、男性陽痿、性冷淡、不孕不育、神經痛、神經病、神經混亂、焦慮癥、記憶損傷、癡呆、認知混亂、中樞神經系統(tǒng)疾病、偏頭痛、神經畏縮、心肌缺血、心肌梗死/纖維化、動脈硬化、糖尿病、肌畏縮癥、胃潰瘍、高血壓、內毒性休克、血栓癥、視網膜病變、心血管疾病、腎衰竭、心衰竭等疾病。
以下通過具體實施例和


對本發(fā)明作進一步的詳細說明，但實施例和附圖的內容不用于限定本發(fā)明。

圖1顯示的是一個β-巰基乙醇分子；圖2顯示的是PACAP的衍生肽(PDT)的羧基端最后的一個氨基酸即賴氨酸(Lys)的分子結構，其的羧基端連接了一個β-巰基乙醇分子；圖3顯示的是天然PACAP的羧基端最后的一個氨基酸即賴氨酸(Lys)的分子結構，其羧基端末端基團為羥基；圖4顯示的是化學合成PACAP的羧基端最后的一個氨基酸即賴氨酸(Lys)的分子結構，其羧基端末端基團為氨基；
圖5利用內含肽制備PDT的示意圖；圖6PDT的產生機制；圖7PACAP基因合成示意圖；圖8重組表達質粒pTY-PDT的構建示意圖；圖9PACAP基因擴增及重組質粒PTY-PDT的PCR鑒定。其中1.PACAP基因；2.3.陰性克隆的PCR結果；4.5.陽性產物PCR的結果；圖10PACAP基因的測序圖；圖11含重組PDT的融合蛋白和重組PDT的SDS-PAGE分析。其中M.蛋白質相對分子質量標準；1.未誘導的PTY-PDT/ER2566表達系統(tǒng)；2.已誘導的PTY-PDT/ER2566表達系統(tǒng)；3.重組PDT；圖12重組PDT的Westernblot。其中M.蛋白質相對分子質量標準；1.重組PDT；圖13重組PDT的質譜分析圖；圖14重組PDT和PACAP38促S19901細胞cAmp生成的活性比較；圖15重組PACAP38和重組PDT的體外穩(wěn)定性比較。
具體實施例實施例1PACAP基因的擴增和PTY-PDT質粒的構建根據PACAP成熟肽的氨基酸序列，按大腸桿菌的密碼偏好性設計其核苷酸序列。分段合成引物，按圖3所示，通過PCR，體外合成PACAP基因。合成PACAP的3條引物F1 5’ATG CAC TCT GAC GGC ATC TTC ACA GAC TCT TAT TCC CGCTAC CGA AAA CAA ATG3’；F2 5’TCC CGC TAC CGA AAA CAA ATG GCT GTC AAG AAA TAC TTGGCG GCC GTG CTA GGG AAA AGG3’；F3 5’TTA CTA TTT GTT TTT AAC CCT CTG TTT ATA CCT TTT CCC TAGCAC GGC CGC3’表達融合蛋白質粒的構建見圖8。設計引物，在PACAP基因的上游引入Ndel識別位點，在下游引入Sapl識別位點；將PACAP基因插入PTYB1中，得到表達載體PTY-PDT。表達質粒的PCR鑒定見圖9，測序結果見圖10。
實施例2重組融合蛋白的表達和目的蛋白的切割表達質粒轉化表達宿主菌E.coli Strain ER2566，挑取單克隆搖菌培養(yǎng)過夜，以1∶20接于1L含50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37℃搖菌至OD為0.5-0.8，加入IPTG至終濃度0.3-0.5mmol/L，30℃誘導3h。離心收集菌體，BufferA(20mMTris.HCl，500mM NaCl，1mM EDTA，pH7.5)重懸，于4℃下超聲破碎，離心取上清。
取6mL chitin beads slurry裝柱后用60mL Buffer A平衡；以＜＝0.5mL/min的流速將菌體破碎上清上樣；按1mL/min流速用不少于100mL的Buffer A洗柱，去除雜蛋白。用18mL的Buffer B(20mM Tris.HCl，500mM NaCl，1mM EDTA，50mM BME，pH7.5)快速洗柱后，4℃放置16h。18mL Buffer A將目的蛋白PDT洗下來。PDT經SDS-PAGE和westernblot鑒定，并用激光飛行質譜測定其分子量。SDS-PAGE蛋白電泳結果見圖11，westernblot鑒定結果見圖12，質譜結果見圖13。
實施例3PDT和PACAP38的活性和穩(wěn)定性比較取對數生長期的S1990細胞消化脫壁后，調整細胞懸液濃度為1×107個/mL，分別加入相同濃度的PDT和PACAP38，以培養(yǎng)液為對照組；培育5min后，分別自實驗組及對照組取出200μL懸液，加入三氯醋酸，充分震蕩混勻，離心，取上清0.5mL，用水飽和乙醚將上清洗滌后，蒸干。應用Cyclic AMP EnzymeImmunoassay Kit測定cAMP濃度。
按如上方法測定PDT和PACAP38促S1990胰腺細胞內cAmp生成的活性數據見表1，曲線圖見圖14，結果顯示PDT和PACAP38的活性相當。
表1 實施例4PDT和PACAP38的穩(wěn)定性測定用生理鹽水配置相同濃度的PDT和PACAP，4℃放置，每5天取樣測定其活性。以0時活性為100％，繪制活性隨時間變化的曲線圖，比較兩者的體外活性半衰期，數據見表2，曲線圖見圖15。
按如上方法比較PDT和PACAP38的體外穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)在室溫放置約5天，合成的PACAP38活性衰減50％，PDT室溫放置30天，活性仍保留75％，放置約50天，活性衰減為50％。因此PDT比PACAP有至少長約10倍的體外活性半衰期。
表2
序列表<110>暨南大學生物工程研究所<120>pituitary adenylate cyclase activating polypeptide derivedthioester(PDT)<130>no<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>117<212>DNA<213>Unknown<220>
<223>The codons of PDT gene were modified<400>1atgcactctg acggcatctt cacagactct tattcccgct accgaaaaca aatggctgtc 60aagaaatact tggcggccgt gctagggaaa aggtataaac agagggttaa aaacaaa 117<210>2<211>39<212>PRT<213>Unknown<220>
<223>The last amino acid is modified<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(39)..(39)<400>2Met His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys
1 5 10 15Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr20 25 30Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys3權利要求
1.一種垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽衍生物PDT，其氨基酸序列如序列表所示，其特征在于它的羧基端通過硫酯鍵連接一個β-巰基乙醇分子，該分子結構見附圖1。
2.一種生產權利要求1垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽衍生物PDT的方法，步驟如下(1)設計引物，采用PCR的方法人工合成垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因；(2)將合成的垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因克隆到質粒載體中，構建成功重組表達載體，在宿主菌中進行表達，其表達產物是由垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽、內含肽和幾丁質結合域構成的融合蛋白；(3)收集表達產物，過層析柱進行親和層析，再洗去雜蛋白，再用誘導劑過層析柱，誘導內含肽切割融合蛋白，得到垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽衍生物或水解產物的混合物。
3.如權利要求2所述垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽衍生物PDT的生產方法，其特征在于人工合成垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽基因，其基因序列如序列表所示。
4.如權利要求2所述垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽衍生物PDT的生產方法，其特征在于所述的質粒載體是pTYB1。
5.如權利要求2所述垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽衍生物PDT的生產方法，其特征在于所述的重組表達載體是pTY-PDT。
6.如權利要求2所述垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽衍生物PDT的生產方法，其特征在于所述的宿主菌是大腸桿菌ER2566。
7.如權利要求2所述垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽衍生物PDT的生產方法，其特征在于所述的層析柱是幾丁質柱。
8.如權利要求2所述垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽衍生物PDT的生產方法，其特征在于所述的誘導劑是β-巰基乙醇。
9.權利要求1所述的垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽衍生物PDT在制備治療腦損傷、腦缺血、防止神經細胞死亡、抗炎、男性陽痿、性冷淡、不孕不育、神經痛、神經病、神經混亂、焦慮癥、記憶損傷、癡呆、認知混亂、中樞神經系統(tǒng)疾病、偏頭痛、神經畏縮、心肌缺血、心肌梗死/纖維化、動脈硬化、糖尿病、肌畏縮癥、胃潰瘍、高血壓、內毒性休克、血栓癥、視網膜病變、心血管疾病、腎衰竭、心衰竭疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術領域，涉及一種腺苷酸環(huán)化酶激活多肽衍生物，該衍生物其氨基酸序列如序列表所示，其特征在于它的氨基端添加一個甲硫氨酸(Met)，羧基端通過硫酯鍵連接一個β－巰基乙醇分子；該腺苷酸環(huán)化酶激活多肽衍生物及其系列水解產物混合物與天然或化學合成的腺苷酸環(huán)化酶激活多肽相比，具有相同的活性但有更高的穩(wěn)定性。本發(fā)明還提供了該衍生物的生產方法。
文檔編號A61P9/00GK1557835SQ20041001513
公開日2004年12月29日 申請日期2004年1月15日 優(yōu)先權日2004年1月15日
發(fā)明者洪岸, 余榕捷, 洪 岸 申請人:暨南大學