專利名稱：一種新的命名為barb的桿狀細(xì)菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型微生物及其用途和應(yīng)用，尤其涉及一種從人的腫瘤細(xì)胞系K562細(xì)胞中分離培養(yǎng)得到的新菌種，該菌種具有假單孢菌屬(Pseudomonas)的特征，并且與已知的假單孢菌種均有不同，暫將這一新菌種命名為BARB，即Bcr-Abl相關(guān)桿菌(BARB，Bcr-Abl associated rodbacteria)，BARB可誘導(dǎo)人的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞系產(chǎn)生Bcr-Abl融合基因。
背景技術(shù)：
1960年，Nowell和Hungerford在慢性髓系白血病(chronicmyelogenous leukemia)細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)費(fèi)城染色體(PhiladelphiaChromosome)1。1973年，Rowley發(fā)現(xiàn)費(fèi)城染色體是由人的9號(hào)染色體和22號(hào)染色體之間易位形成的2。這兩個(gè)染色體的重組導(dǎo)致了一個(gè)新的融合基因，在9號(hào)染色體上的Abl基因的部分基因與22號(hào)染色體上的Bcr部分基因組成了Bcr-Abl融合基因3-6。該融合基因在細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路中起非常重要的作用7。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已證明該融合基因可導(dǎo)致慢性髓系白血病樣的疾病8-10。95％以上的慢性髓系白血病患者都帶有Bcr-Abl融合基因11-13，針對(duì)Bcr-Abl融合基因的藥物如Imatinib(Gleevec，STI571)可迅速緩解慢性髓系白血病14。目前普遍認(rèn)為，Bcr-Abl融合基因與慢性髓系白血病的病因緊密相關(guān)。然而，Bcr-Abl的融合是怎樣產(chǎn)生的，目前只有非常零星的研究。如有人認(rèn)為輻射可造成Bcr-Abl融合15；也有人認(rèn)為染色體上的Alu序列和一些duplicon與Bcr-Abl融合有關(guān)16-17，但這些都是一些假設(shè)，并沒(méi)有嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)證明。
本發(fā)明從人的腫瘤細(xì)胞系K562細(xì)胞中，分離培養(yǎng)得到BARB，即Bcr-Abl相關(guān)桿菌(BARB，Bcr-Abl associated rod bacteria，Bcr-Abl相關(guān)桿菌)，該菌屬具有假單孢菌屬(Pseudomonas)的特征，研究提示BARB可導(dǎo)致人類細(xì)胞內(nèi)9號(hào)染色體和22號(hào)染色體的染色體易位(chromosomal translocation)，這種染色體易位的結(jié)果產(chǎn)生了Bcr-Abl(p210bcr-abl)融合基因，這個(gè)融合基因及其編碼蛋白質(zhì)就是慢性髓系白血病的Bcr-Abl融合基因及其編碼蛋白。
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(一)明內(nèi)容一種具有假單孢菌屬特征的新的細(xì)菌，命名為BARB(Bcr-Ablassociated rod bacteria，Bcr-Abl相關(guān)桿菌)，其在武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCC NO.M 204007，保藏日期為2004年1月19日，提議的分類命名為假單孢菌屬，Pseudomonas sp.BARB。
菌種來(lái)源所述的桿狀細(xì)菌BARB，生活在人的腫瘤細(xì)胞系K562細(xì)胞中(圖2e)，分離出BARB的方法是將人的腫瘤細(xì)胞系K562細(xì)胞(由浙江大學(xué)腫瘤研究所提供)培養(yǎng)在RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，培養(yǎng)溫度為37℃，不更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)30～60天，獲得生長(zhǎng)的細(xì)菌BARB?？稍賹@得細(xì)菌BARB用普通的LB培養(yǎng)液擴(kuò)增，再將所述細(xì)菌BARB接種于羊血平板上使其長(zhǎng)成集落。
BARB的生長(zhǎng)特性BARB為非明酵菌，生長(zhǎng)緩慢，初代培養(yǎng)35℃48小時(shí)以后長(zhǎng)出細(xì)小、點(diǎn)狀、圓形、凸起、灰白色的菌落，不溶血，72-96小時(shí)以后菌落長(zhǎng)到直徑2-3mm，表面干燥并聯(lián)成一片，呈皺折狀，整個(gè)菌落能推動(dòng)，在液體培養(yǎng)基內(nèi)，該細(xì)菌在液體表面生長(zhǎng)，形成一層擴(kuò)散的、灰白色的菌膜。能在麥康凱平板(Monc ConkeyAgar)生長(zhǎng)，但在SS平板上不能生長(zhǎng)。
BARB的形態(tài)為革蘭氏陰性、短小的桿菌。長(zhǎng)時(shí)間放置后再行涂片，細(xì)菌形態(tài)變得不規(guī)則，短小的和細(xì)長(zhǎng)的桿菌均存在。在腦心浸液液體培養(yǎng)基中，細(xì)菌革蘭染色呈鏈狀。直徑為0.5-1.0um，長(zhǎng)為3um。鞭毛染色為單鞭毛，鞭毛位于菌體的一端。在電子顯微鏡下細(xì)菌的形態(tài)如短桿狀，如圖2c、圖2d所示。
BARB的生化特性細(xì)菌氧化酶陽(yáng)性，觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性。
采用API生化鑒定板條、ATB、Vitek-AMS及Vitek-II生化鑒定系統(tǒng)(法國(guó)biomerium公司)及經(jīng)典的手工方法加以鑒定。用Vitek-AMS及Vitek-II均不能鑒定BARB，因?yàn)樵摼L(zhǎng)緩慢，而這兩型儀器適合鑒定生長(zhǎng)快速的細(xì)菌，用ATB和API生化板條鑒定BARB，結(jié)果顯示BARB與Pseudomonas diminuta相似，但符合率不到90％。將全自動(dòng)微生物生化分析儀和經(jīng)典微生物生化鑒定數(shù)據(jù)總結(jié)如表1。
表1.用經(jīng)典微生物生化檢驗(yàn)與全自動(dòng)微生物生化分析儀(API20NE，RapID，andVITEK-Ams60)分析BARB表1中-表示陰性；+表示陽(yáng)性；±表示在多次實(shí)驗(yàn)中有陽(yáng)性或陰性的結(jié)果。
綜上所敘，BARB的特征與假單孢菌屬中的diminuta菌種非常相似，但與diminuta有三點(diǎn)不同，首先，BARB在液體表面生長(zhǎng)，形成一層擴(kuò)散的、灰白色的菌膜，而diminuta沒(méi)有這一特征；其次，BARB可分解果糖，雖然比較緩慢，單diminuta不能分解果糖；最后，在BARB中檢測(cè)到尿素酶的活性，而diminuta無(wú)尿素酶的活性。因此，BARB可能為假單孢菌屬的一種新的細(xì)菌。
BARB的16S rRNA特性用細(xì)菌的16S rRNA的序列可比較精確地鑒定細(xì)菌的屬和種。將BARB的16S rRNA的PCR產(chǎn)物的序列與基因庫(kù)NCBI中的16S rRNA序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與假單孢菌屬中一些菌如Pseudomonasdiminuta有91％的同源性，但不完全相同，BARB可能屬于假單孢菌屬(Pseudomonas)并與diminuta不同的一種新的桿狀細(xì)菌。BARB的16SrRNA的部分核苷酸序列如下(BARB的16S rRNA片斷1)
CGACCCTGGCGGCAGGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGCCCTTGGGGGCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATGTGCCCTTTGGTACGGAACAACACAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATGTGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGCCATTGGAGCAGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTGCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGCAGCCATGCCGCGTGAATGATGAAGGTCTAGGATTGTAAAATTCTTTCACCGGGGAAGATAATGACGGTACCCGGAGAAGAAGTCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGCGCGTAGGCGGATGTTTAAGTCGGGGGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATTGCCTTCGATACTGGACATCTTGAGTACGGGAGAGGTGAGTGGAACTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCACTGGCCCGTTACTGACGCT；BARB的16S rRNA的又一部分核苷酸序列如下(BARB的16S rRNA片斷2)TTCGCTGACCCTACCGTGGTCGGCTGCCTCCATTGCTGGTTAGCGCACCGCCTTCGGGTAAAGCCAACTCCCATGGTGCGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGAACTGAGACGACTTTTAGGGATTAGCTCCGCTTCGCAGCATCGCAACCCTCTGTAGTCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCACCCCGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGCTTACCACCGGCGGTCCCATTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAATGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTCCCTGTCCCCGAAGGGAAAACTGGATCTCTCCAGCGATCAGGGCATGTCAAAAGGTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCCTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCGTCACCGACATGCATGCATGCCGACAACTAGCACTC。
BARB對(duì)抗菌素的敏感性BARB的特征還在于，對(duì)萬(wàn)古霉素(vancomycin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、復(fù)方新諾明較敏感，而對(duì)amikacin，amoxicillin，ampicillin，aztreonam，cefaime，ticarcillin，cefoxitin，cefpodoxime，ceftaziding，chroramphenicol，gentamicin，imipenem，nitrofurantoin，norfloxacin，peperacillin，and cefoperazone等抗菌素不敏感。
BARB的功能用BARB感染人的正常細(xì)胞如臍帶血單核細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞、和成纖維細(xì)胞和人的腫瘤細(xì)胞系如HL60和U937，一定時(shí)間后，上述細(xì)胞內(nèi)就發(fā)生Bcr與Abl的融合，產(chǎn)生Bcr-Abl(p210Bcr-Abl)融合基因及其基因產(chǎn)物p210Bcr-Abl蛋白質(zhì)。
所述的桿狀細(xì)菌BARB的用途，BARB的功能是能誘導(dǎo)人的正常細(xì)胞和人的細(xì)胞系產(chǎn)生Bcr-Abl(p210bcr-abl)融合基因，因此，BARB誘導(dǎo)人細(xì)胞內(nèi)發(fā)生Bcr和Abl兩個(gè)基因融合，可作為人的細(xì)胞內(nèi)染色體易位的研究模型。該模型可用于人染色體易位(chromosomal translocation)中涉及Bcr和Abl等基因融合的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞學(xué)、腫瘤學(xué)、病因?qū)W等等的研究，也可用此模型研制和開(kāi)發(fā)藥物、試劑盒和試劑。特別是可用此模型制備試劑盒和試劑以篩選藥物，如本發(fā)明試驗(yàn)可知BARB對(duì)萬(wàn)古霉素、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明較敏感，而對(duì)amikacin，amoxicillin，ampicillin，aztreonam，cefapime，ticarcillin，cefoxitin，cefpodoxime，ceftaziding，chroramphenicol，gentamicin，imipenem，nitrofurantoin，norfloxacin，peperacillin，and cefoperazone等抗菌素不敏感。
實(shí)施例2～實(shí)施例6實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明BARB能誘導(dǎo)人的細(xì)胞內(nèi)染色體易位而造成Bcr-Abl融合。在現(xiàn)有技術(shù)中，沒(méi)有任何一個(gè)報(bào)道有關(guān)細(xì)菌可誘導(dǎo)人類細(xì)胞內(nèi)Bcr-Abl融合；在此之前，沒(méi)有任何報(bào)道有關(guān)在人的K562細(xì)胞中提取和分離到細(xì)菌；BARB與人類細(xì)胞有非常良好的共生關(guān)系，這也是過(guò)去沒(méi)有任何報(bào)道的。這進(jìn)一步表明BARB是人類從自然中分離的新菌種。
BARB誘導(dǎo)人細(xì)胞內(nèi)發(fā)生Bcr和Abl兩個(gè)基因融合，這兩個(gè)基因的融合是正常細(xì)胞向白血病細(xì)胞轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟，因此，更具體的BARB可用于建立白血病的模型。用該模型研制和開(kāi)發(fā)用于白血病或與白血病相關(guān)的藥物、試劑盒(包括臨床檢驗(yàn)試劑盒)、試劑。
還可用桿狀細(xì)菌BARB與其它微生物或化合物組合制成相關(guān)的藥物、試劑、或試劑盒(包括臨床檢驗(yàn)試劑盒)；總之可制成含有所述桿狀細(xì)菌BARB的生物制品。
本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在(1)本發(fā)明不僅從人的腫瘤細(xì)胞系K562細(xì)胞中，分離培養(yǎng)得到新菌種BARB，而且揭示了BARB可導(dǎo)致人類細(xì)胞內(nèi)9號(hào)染色體和22號(hào)染色體的染色體易位(chromosomal translocation)，這種染色體易位的結(jié)果產(chǎn)生了Bcr-Abl(p210bcr-abl)融合基因，這個(gè)融合基因及其編碼蛋白質(zhì)就是慢性髓系白血病的Bcr-Abl融合基因及其編碼蛋白，為人類進(jìn)一步認(rèn)識(shí)腫瘤及相關(guān)疾病提供研究基礎(chǔ)和模型，該模型可用于研制藥物、試劑盒、試劑。(2)可利用BARB誘導(dǎo)制造研究模型。(3)BARB可用于建立白血病的模型。


圖1BARB的菌落外觀照片。
圖2BARB的光學(xué)和電子顯微鏡的形態(tài)鑒定a.K562細(xì)胞的Giemsa染色，箭頭所指為桿狀細(xì)菌樣顆粒；b.K562細(xì)胞內(nèi)分離提取到的細(xì)菌經(jīng)過(guò)擴(kuò)增后用革蘭氏染液染色，呈革蘭氏陰性；c.BARB的掃描電子顯微鏡照片；d.BARB的透射電子顯微鏡照片；e.BARB在K562細(xì)胞中的透射電鏡照片。
圖3用BARB處理人的成纖維細(xì)胞后，用PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bcr和Abl基因的融合。
圖4用BARB處理HL60、U937和人的臍帶血的單核細(xì)胞后，用PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bcr和Abl基因的融合。
圖5為PCR(a)和Western Blot(b)檢測(cè)BARB處理的正常人臍帶血和正常人外周血的單核細(xì)胞內(nèi)Bcr-Abl融合基因和融合蛋白質(zhì)-p210Bcr-Abl。
圖6為BARB處理正常人外周血后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的Bcr-Abl融合基因及其基因產(chǎn)物。
圖7為用100μm/ml萬(wàn)古霉素(Vancomycin)處理BARB后，將BARB與人的臍帶血單核細(xì)胞共溫肓，然后用PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bcr與Abl基因融合?？梢?jiàn)經(jīng)過(guò)100μm/ml萬(wàn)古霉素處理后，BARB失去介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Bcr-Abl融合的功能。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但不能將方案中所涉及的方法及技術(shù)參數(shù)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1BARB的分離將K562細(xì)胞(由浙江大學(xué)腫瘤研究所提供)培養(yǎng)在RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，不更換培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)30-60天，細(xì)菌生長(zhǎng)。獲得的細(xì)菌可用普通的LB培養(yǎng)液擴(kuò)增。將BARB接種于羊血平板上使其長(zhǎng)成集落。
BARB的鑒定(1)BARB的菌落外觀如圖1所示，長(zhǎng)出的菌落呈粗糙型。
(2)用革蘭氏染色將經(jīng)過(guò)擴(kuò)增后細(xì)菌BARB用革蘭氏染液染色，呈革蘭氏陰性(圖2b)。
(3)圖2c和圖2d為BARB在掃描和透射電子顯微鏡下照片。圖2e為BARB在K562細(xì)胞中的透射電鏡照片(4)用各種全自動(dòng)微生物生化分析儀和常規(guī)生化檢驗(yàn)對(duì)BARB做了詳細(xì)的分析，結(jié)果見(jiàn)表1，結(jié)果表明BARB具有假單孢菌屬(Pseudomonas)的特征，但與所知的假單孢屬中的菌種均有不同，這說(shuō)明BARB為一種新的菌種。
(5)BARB的16S rRNA的部分序列，見(jiàn)方案部分描述的BARB的16SrRNA的部分核苷酸序列BARB的16S rRNA片斷1，BARB的16S rRNA片斷2，與假單孢菌屬中的一些細(xì)菌有高度同源性，但不完全相同，也說(shuō)明BARB為一種新的菌種。
實(shí)施例2BARB的功能鑒定(一)用BARB感染人的細(xì)胞取人的臍帶血和外周血，用Ficoll-Hypaque分離其中的單個(gè)核細(xì)胞。將細(xì)胞與BARB混合共同培養(yǎng)在IMDM完全培養(yǎng)液中，35℃培養(yǎng)3-7天后，用RT-PCR，Western Blot和FISH法檢測(cè)，人的臍帶血和外周血的單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)就發(fā)生Bcr與Abl的融合(見(jiàn)圖5，圖6)。
圖5為PCR(a)和Western Blot(b)檢測(cè)BARB處理的正常人臍帶血和正常人外周血的單核細(xì)胞內(nèi)Bcr-Abl融合基因-p210Bcr-Abl。M，分子標(biāo)記；1-10，10個(gè)健康婦女的臍帶血單核細(xì)胞；11-12，2個(gè)健康人的外周血單核細(xì)胞；-，未經(jīng)BARB處理的細(xì)胞；+，BARB處理的細(xì)胞有一條292bp的PCR條帶(a)和p210Bcr-Abl蛋白條帶(b)。
圖6為BARB處理正常人外周血后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的Bcr-Abl融合基因及其基因產(chǎn)物。a，為Bcr-Abl的PCR檢測(cè)；b，為Bcr-Abl融合蛋白的Western blot檢測(cè)；c，為FISH技術(shù)檢測(cè)正常的Bcr和Abl信號(hào)；d，為FISH技術(shù)檢測(cè)Bcr-Abl融合基因。M，為分子量標(biāo)記；13 & 14，為2個(gè)正常人外周血單核細(xì)胞；-，為未經(jīng)BARB處理的細(xì)胞；+，為BARB處理的細(xì)胞。
檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明BARB可誘導(dǎo)人的細(xì)胞系產(chǎn)生Bcr-Abl融合基因。
實(shí)施例3BARB的功能鑒定(二)用BARB感染人的腫瘤細(xì)胞系HL60和U937和人的臍帶血單核細(xì)胞將細(xì)胞與BARB混合共同培養(yǎng)在RPMI1640完全培養(yǎng)液中，一定時(shí)間后，用RT-PCR法檢測(cè)，細(xì)胞內(nèi)就發(fā)生Bcr與Abl的融合(見(jiàn)圖4)。圖4中可見(jiàn)，用BARB處理過(guò)的細(xì)胞有一條分子量為292bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，而其對(duì)照沒(méi)有這一條帶。M，分子標(biāo)記；UCBMC，人的臍帶血的單核細(xì)胞；-，未經(jīng)BARB處理的細(xì)胞；+，用BARB處理過(guò)的細(xì)胞，292bp的PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)測(cè)序分析，確定為Bcr-Abl融合基因產(chǎn)物。這說(shuō)明BARB可誘導(dǎo)人的細(xì)胞系產(chǎn)生Bcr-Abl融合基因。
實(shí)施例4將人的正常成纖維細(xì)胞與BARB共同培養(yǎng)一定時(shí)間后，可檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)Bcr-Abl的融合基因產(chǎn)物，見(jiàn)圖3。
圖3為PCR(a)和Western Blot(b)檢測(cè)BARB處理的正常人臍帶血和正常人外周血的單核細(xì)胞內(nèi)Bcr-Abl融合基因-p210Bcr-Abl。圖3中M表示分子標(biāo)記；-表示未經(jīng)BARB處理的細(xì)胞；+表示BARB處理的細(xì)胞有一條292bp的PCR產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)測(cè)序分析，確定為Bcr-Abl融合基因產(chǎn)物。
實(shí)施例5用100μm/ml萬(wàn)古霉素(Vancomycin)處理BARB后，將BARB與人的臍帶血單核細(xì)胞共溫肓，然后用PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bcr與Abl基因融合?？梢?jiàn)100μm/ml萬(wàn)古霉素處理后不能引起B(yǎng)ARB介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Bcr-Abl融合。當(dāng)BARB用100μg/ml的萬(wàn)古霉素處理后就失去誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Bcr與Abl的融合的功能(見(jiàn)圖7)。
實(shí)施例6巢式PCR檢測(cè)BARB感染的細(xì)胞中的Bcr-Abl的融合實(shí)施例2，3，4，5中BARB感染過(guò)的細(xì)胞，1×106細(xì)胞融解于0.5mlTrizol，提取RNA。用于cDNA合成的引物為(5’-GGC AAG AGT TAC ACG TTCCTG ATC-3’)；用于巢式PCR的引物為(第一輪sense 5’-GGC AAG AGTTAC ACG TTC CTG ATC-3’，antisense 5’-GTG ATT ATA GCC TAA GACCCG GAG-3’)和(第二輪sense 5’-GGA GCT GCA GAT GCT GAC CAA C-3’，antisense 5’-GGC CAC AAA ATC ATA CAG TGC-3’).PCR的反應(yīng)條件為先將模板在94℃變性，然后進(jìn)行35輪PCR反應(yīng)(94℃30Sec秒，58℃30秒和72℃45秒)。然后用瓊脂糖凝膠電泳分析292bp的Bcr-Abl融合基因的PCR產(chǎn)物。
實(shí)施例7免疫印跡法(Western Blot)法檢測(cè)BARB感染的細(xì)胞中的Bcr-Abl的融合蛋白。
取實(shí)施例2中BARB感染過(guò)的細(xì)胞，1×107細(xì)胞用細(xì)胞裂解液裂解，測(cè)定其中的蛋白質(zhì)含量。210μg蛋白做SDS-PAGE電泳，然后用Santa Cruz公司的試劑做Western Blot.所用的試劑為c-Abl(鼠抗人Bcr-Abl的單克隆抗體)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG的第二抗體，化學(xué)發(fā)光試劑，以上試劑均來(lái)自美國(guó)Santa Cruz公司。
實(shí)施例8熒光原位雜交技術(shù)(FISH，fluorescent in-situhybridization)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bcr-Abl融合基因取實(shí)施例2中BARB感染過(guò)的細(xì)胞，Bcr-Abl的基因探針購(gòu)自美國(guó)Vysis公司，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的Bcr-Abl融合基因的技術(shù)流程按照美國(guó)Vysis公司的方法。Bcr，Abl，和Bcr-Abl的信號(hào)在裝有QFISH的DAPI-FITC-Texas Red三色熒光顯微鏡LEICA550QCW下俘獲。
實(shí)施例916S rRNA的PCR檢測(cè)與測(cè)序取實(shí)施例1中BARB，提取DNA，用PCR法檢測(cè)其中的16S rRNA.引物序列如下，(正向引物5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTA G-3’反向引物5’-ACG GNT ACC TTG TTA CGA CTT-3’)。PCR的反應(yīng)條件為先將模板在94℃變性，然后進(jìn)行35輪PCR反應(yīng)(94℃30Sec秒，52℃30秒和72℃45秒)，然后用瓊脂糖凝膠電泳分析1500bp左右的16S rRNA的PCR產(chǎn)物，并對(duì)此PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。
序列表.seq<120>Title一種新的命名為BARB的桿狀細(xì)菌及其應(yīng)用<130>AppFileReference<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate<210>Sequence1<211>Length668<212>TypeDNA<213>OrganismNameBARB的16S rRNA1<400>PreSequenceStringcgaccctggcggcaggcctaatacatgcaagtcgagcggcccttcggggcagcggcggacgggtgagtaacgcgtgggaatgtgccctttggtacggaacaacacagggaaacttgtgctaataccgtatgtgcccttcgggggaaagatttatcgccattggagcagcccgcgttggattaggtagttggtgaggtaaaggctcaccaagccgacgatccatagctggtctgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttgcgcaatgggcgaaagcctgacgcagccatgccgcgtgaatgatgaaggtcttaggattgtaaaattctttcaccggggaagataatgacggtacccggagaagaagtcccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggggctagcgttgctcggaattactgggcgtaaagggcgcgtaggcggatgtttaagtcgggggtgaaagcccggggctcaacctcggaattgccttcgatactggacatcttgagtacgggagaggtgagtggaactccgagtgtagaggtgaaattcgtagatattcggaagaacaccagtggcgaaggcgactcactggcccgttactgacgct<210>Sequence2<211>Length663<212>TypeDNA<213>OrganismNameBARB的16S rRNA2<400>PreSequenceStringttcgctgaccctaccgtggtcggctgcctccattgctggttagcgcaccgccttcgggtaaagccaactcccatggtgcgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccgacttcatgcactcgagttgcagagtgcaatccgaactgagacgacttttagggattagctccgcttcgcagcatcgcaaccctctgtagtcgccattgtagcacgtgtgtagcccaccccgtaagggccatgaggacttgacgtcatccccaccttcctccggcttaccaccggcggtcccattagagtgcccaacttaatgatggcaactaatggcgagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtgtccctgtccccgaagggaaaactggatctctccagcgatcagggcatgtcaaaaggtggtaaggttctgcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcccttgagttttaatcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcgtcaccgacatgcatgcatgccgacaactagcactc<210>Sequence3<211>Length24<212>TypeDNA<213>OrganismName引物1<400>PreSequenceStringggcaagagtt acacgttcct gatc24<210>Sequence4<211>Length24<212>TypeDNA<213>OrganismName引物2<400>PreSequenceStringgtgattatag cctaagaccc ggag24<210>Sequence5<211>Length22<212>TypeDNA<213>OrganismName引物3<400>PreSequenceStringggagctgcag atgctgacca ac 22<210>Sequence6<211>Length21
序列表.seq<212>TypeDNA<213>OrganismName引物4<400>PreSequenceStringggccacaaaa tcatacagtg c 11<210>Sequence7<211>Length19<212>TypeDNA<213>OrganismName引物5<400>PreSequenceStringagagtttgat cctggctag 19<210>Sequence8<211>Length21<212>TypeDNA<213>OrganismName引物6<400>PreSequenceStringacggntacct tgttacgact t 1權(quán)利要求
1.一種新的命名為BARB桿狀細(xì)菌，其在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCC NO.M 204007，保藏日期為2004年1月19日。
2.如權(quán)利要求1所述的名為BARB的桿狀細(xì)菌，其特征在于所述的BARB的16S rRNA的部分核苷酸序列如下CGACCCTGGCGGCAGGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGCCCTTCGGGGCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATGTGCCCTTTGGTACGGAACAACACAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATGTGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGCCATTGGAGCAGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTGCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGCAGCCATGCCGCGTGAATGATGAAGGTCTTAGGATTGTAAAATTCTTTCACCGGGGAAGATAATGACGGTACCCGGAGAAGAAGTCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGCGCGTAGGCGGATGTTTAAGTCGGGGGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATTGCCTTCGATACTGGACATCTTGAGTACGGGAGAGGTGAGTGGAACTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCACTGGCCCGTTACTGACGCT；BARB的16S rRNA的又一部分核苷酸序列如下TTCGCTGACCCTACCGTGGTCGGCTGCCTCCATTGCTGGTTAGCGCACCGCCTTCGGGTAAAGCCAACTCCCATGGTGCGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGAACTGAGACGACTTTTAGGGATTAGCTCCGCTTCGCAGCATCGCAACCCTCTGTAGTCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCACCCCGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGCTTACCACCGGCGGTCCCATTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAATGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTCCCTGTCCCCGAAGGGAAAACTGGATCTCTCCAGCGATCAGGGCATGTCAAAAGGTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCCTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCGTCACCGACATGCATGCATGCCGACAACTAGCACTC。
3.如權(quán)利要求1所述的名為BARB的桿狀細(xì)菌，其特征在于所述的BARB革蘭氏染色陰性，不溶血，菌體粗糙型，為短桿狀細(xì)菌；所述的BARB在腦心浸液液體培養(yǎng)基中，革蘭染色呈鏈狀，BARB的直徑為0.5～1.0μm，長(zhǎng)為3μm，鞭毛染色為單鞭毛，鞭毛位于菌體的一端；BARB的生化試驗(yàn)細(xì)菌氧化酶陽(yáng)性，觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，經(jīng)典的微生物生化檢驗(yàn)說(shuō)明其具有假單孢菌屬(Pseudomonas)的特征。
4.如權(quán)利要求1所述的名為BARB的桿狀細(xì)菌，其特征在于將BARB感染人的腫瘤細(xì)胞系如HL60和U937和人的正常細(xì)胞如人的臍帶血單核細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞等，一定時(shí)間后，細(xì)胞內(nèi)就發(fā)生Bcr與Abl的融合，產(chǎn)生Bcr-Abl(p210Bcr-Abl)融合基因及其基因產(chǎn)物p210Bcr-Abl蛋白質(zhì)。
5.一種如權(quán)利要求1所述的桿狀細(xì)菌BARB的用途，其特征在于所述的BARB用于誘導(dǎo)人體染色體易位，人的正常細(xì)胞和人的細(xì)胞系產(chǎn)生Bcr-Abl融合基因，可作為人的細(xì)胞內(nèi)染色體易位的研究模型。
6.如權(quán)利要求5所述的桿狀細(xì)菌BARB的用途，其特征在于所述研究模型為可用于白血病研究的模型。
7.如權(quán)利要求5所述的桿狀細(xì)菌BARB的用途，其特征在于所述研究模型在藥物研究和開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的桿狀細(xì)菌BARB的用途，其特征在于所述的研究模型在藥物篩選中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求5所述的桿狀細(xì)菌BARB的用途，其特征在于所述的研究模型在試劑及試劑盒中的應(yīng)用。
10.一種含有如權(quán)利要求1所述桿狀細(xì)菌BARB的生物制品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型微生物及其用途和應(yīng)用，尤其涉及一種從人的腫瘤細(xì)胞系K562細(xì)胞中分離培養(yǎng)得到的新菌種，在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCC NO.M 204007，保藏日期為2004年1月19日。該菌種具有假單孢菌屬(Pseudomonas)的特征，并且與已知的假單孢菌種均有不同，暫將這一新菌種命名為BARB，即Bcr－Abl相關(guān)桿菌(BARB，Bcr－Abl associated rod bacteria)，BARB可誘導(dǎo)人的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞系產(chǎn)生Bcr－Abl融合基因。這個(gè)融合基因及其編碼蛋白質(zhì)就是慢性髓系白血病的Bcr－Abl融合基因及其編碼蛋白，為人類進(jìn)一步認(rèn)識(shí)腫瘤及相關(guān)疾病提供研究基礎(chǔ)和模型，該模型可用于研制藥物、試劑盒、試劑，可利用BARB誘導(dǎo)制造研究模型。
文檔編號(hào)A61K35/66GK1737113SQ20041001606
公開(kāi)日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2004年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月21日
發(fā)明者胡汛 申請(qǐng)人:胡汛