專(zhuān)利名稱(chēng)：含乳鐵蛋白及其肽的全蠶蛹粉的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含乳鐵蛋白及其肽的全蠶蛹粉的制備方法。
背景技術(shù)：
乳鐵蛋白(Lactoferrin簡(jiǎn)稱(chēng)LF)，1960年從牛乳中分離獲得，它是一種鐵結(jié)合性糖蛋白，分子量80KDa左右，LF具有轉(zhuǎn)運(yùn)鐵離子和殺菌抗病毒的功效，它在乳腺中的表達(dá)量最高，而且以人乳中的含量最高，牛乳中的含量相對(duì)較少。其獨(dú)特的作用機(jī)理引起人們的高度重視，并將其從牛奶中分離純化后加入嬰兒奶粉。乳鐵蛋白肽(Lactoferricin，簡(jiǎn)稱(chēng)Lfcin)是乳鐵蛋白在動(dòng)物消化道內(nèi)經(jīng)蛋白酶降解后的產(chǎn)物，其某些生物學(xué)活性比乳鐵蛋白還要強(qiáng)。全蠶粉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，具有一些特殊的功效，是一種優(yōu)良的蛋白源，但是含有乳鐵蛋白或乳鐵蛋白肽的全蠶蛹粉目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能生產(chǎn)含乳鐵蛋白及其肽的全蠶蛹粉的方法。
本發(fā)明的生產(chǎn)含乳鐵蛋白及其肽的全蠶蛹粉的方法，包括以下步驟1)取泌乳母畜乳腺腺泡，液氮冷凍，研磨成粉末，提取總RNA并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄得到乳鐵蛋白或乳鐵蛋白肽的cDNA，根據(jù)乳鐵蛋白或乳鐵蛋白肽基因特征設(shè)計(jì)一對(duì)各帶一個(gè)酶切位點(diǎn)的引物，利用RT-PCR技術(shù)得到DNA，定向克隆入大腸桿菌克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株，篩選陽(yáng)性克隆；2)將以上篩選出的陽(yáng)性菌株抽提質(zhì)粒，用DNA內(nèi)切酶切出目的基因并純化之，將目的基因定向克隆進(jìn)桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體，得到含乳鐵蛋白重組轉(zhuǎn)移載體，同時(shí)線(xiàn)性化桿狀病毒表達(dá)載體，在透明的聚苯乙烯滅菌管中加入下列試劑濃度1.0μg/μL的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體15.0μl、濃度1.0μg/μL線(xiàn)性化的桿狀病毒表達(dá)載體1.0μL、滅菌水10.0μL、脂質(zhì)體14.0μL，輕輕混勻，常溫下放置15分鐘，在此期間待轉(zhuǎn)染的家蠶細(xì)胞吸去培養(yǎng)基，用無(wú)血清TC-100培養(yǎng)基洗三次，最后加入2mL無(wú)血清TC-100培養(yǎng)基，15分鐘以后，用移液器吸取上述40.0μL共轉(zhuǎn)染試劑，分三處滴入細(xì)胞中，輕輕搖勻，然后用封口膜密封，27℃培養(yǎng)5天；3)待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液，將母液按10-3、10-4、10-5的濃度梯度進(jìn)行稀釋?zhuān)?μL的病毒稀釋液接種到貼壁細(xì)胞中，搖動(dòng)使之均勻，27℃感染1小時(shí)后，移去接種液，在病毒接種時(shí)將3％低熔點(diǎn)瓊脂糖熔化，保溫在40℃水浴中，然后與等體積預(yù)熱到40℃的含20％胎牛血清2×TC-100快速混合均勻，將此混合液輕輕加到已移走接種液的貼壁細(xì)胞上，等膠凝固后封口，逐日觀察病毒斑生長(zhǎng)情況，當(dāng)病毒斑明顯后，在顯微鏡下挑取分隔良好的12個(gè)病毒斑，接種于5×104細(xì)胞密度且已貼壁生長(zhǎng)的24孔板中，至細(xì)胞呈感染態(tài)時(shí)，收集病毒液，向殘余的細(xì)胞中添加100μg X-gal的溶液，37℃溫育1小時(shí)后，選取白斑按上述步驟3進(jìn)一步篩選，重復(fù)篩選至獲得含乳鐵蛋白或乳鐵蛋白肽基因的重組桿狀病毒；4)將純化的重組病毒穿刺家蠶蠶蛹，26-30℃放置，待蠶蛹發(fā)病后收集病蠶蛹，勻漿，50℃烘干制成蠶蛹粉。
LF本身有殺菌抗病毒的作用，在胃中經(jīng)胃蛋白酶降解后的產(chǎn)物L(fēng)fcin的作用更強(qiáng)，它作用機(jī)理獨(dú)特，不同于傳統(tǒng)的抗生素，LF通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性?shī)Z取細(xì)菌繁殖和生長(zhǎng)所必需的鐵離子而達(dá)到抑菌的目的，Lfcin它可以在細(xì)菌細(xì)胞壁上打孔或溶解細(xì)胞壁，引起細(xì)胞跨膜電位喪失，細(xì)胞內(nèi)容物外泄而殺死細(xì)菌，它不干擾細(xì)菌DNA的復(fù)制，所以細(xì)菌對(duì)它不易產(chǎn)生抗藥性。眾所周知，腹瀉是引起仔豬死亡的主要原因，每年給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成巨大的損失。仔豬斷乳時(shí)期是腹瀉的高發(fā)期，原因之一就是斷乳后，仔豬缺少了乳汁中的抗菌成分LF保護(hù)而引起腸道pH和微生態(tài)平衡的變化導(dǎo)致腹瀉。本發(fā)明以桿狀病毒為載體，用家蠶為生物反應(yīng)器生產(chǎn)含乳鐵蛋白的全蠶粉。桿狀病毒只感染無(wú)脊椎動(dòng)物，不能在脊椎動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和增殖，病毒基因組也不可能整合到脊椎動(dòng)物細(xì)胞染色體上；病毒基因組內(nèi)多角體基因是病毒復(fù)制非必需的且具有強(qiáng)啟動(dòng)子，提供了外源基因插入的理想場(chǎng)所；切除野生型病毒復(fù)制所必需的一段基因，即使其自身環(huán)化也不能存活，同源重組后從轉(zhuǎn)移載體上獲得本段基因，從而將病毒救活，使其可以復(fù)制，重組救活提供了重組病毒篩選的方便快捷的方法；桿狀病毒約130kb的基因組DNA可容納約10kb的DNA插入物，不影響基因表達(dá)和病毒包裝；晚晚期高效表達(dá)啟動(dòng)子的使用，對(duì)高水平表達(dá)各種外源蛋白(包括毒性蛋白)都不會(huì)有影響；對(duì)轉(zhuǎn)譯后的產(chǎn)物能正確加工，包括糖基化作用，脂肪酸?；饔茫被┒艘阴；饔?，羧基末端α-酰胺化作用以及磷酸化作用。將含有乳鐵蛋白或乳鐵蛋白肽的全蠶蛹粉用作飼料添加劑，在補(bǔ)充飼料蛋白的同時(shí)起到殺菌抗病毒的作用，可有效地防治斷乳仔豬的腹瀉，以生產(chǎn)出無(wú)抗生素殘留的高品質(zhì)畜產(chǎn)品。本發(fā)明生產(chǎn)、使用過(guò)程安全，不存在對(duì)人畜和環(huán)境的潛在危險(xiǎn)。
具體實(shí)施例方式
下面以鼠乳鐵蛋白為例介紹具體操作方法將泌乳15天的小白鼠母鼠引頸致死，摘取乳腺組織50-100毫克，置于事先200℃烘烤并冷卻到室溫的研缽中，加入1/3研缽積液氮，研磨成粉末并將其轉(zhuǎn)入1.5ml微離心管，加入1ml Trizol液，充分混勻，冰上靜置5分鐘，再加入0.2ml氯仿，蓋緊管蓋，劇烈振蕩混勻后于4℃12000rpm離心30秒，取上層水相于一新的微離心管中，加入0.5ml異丙醇，混勻后-20℃靜置30分鐘，12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀用1ml75％乙醇洗滌后室溫干燥，干燥后將沉淀溶于20-100μL無(wú)酶水，得到總RNA提取液，將獲得的總RNA提取液用適當(dāng)?shù)囊?隨機(jī)引物、oligod(T)或特異性引物)在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT)，所得產(chǎn)物即為cDNA；設(shè)計(jì)合成上下游引物上游引物CCAGGATCCACAGACATGAAGCTGCTCA，下游引物TATGAATTCAGTGTTTTCACTGGGTAAGA，以上述cDNA為模板進(jìn)行PCR滅菌雙蒸水31.5μL94℃ 3分鐘10×PCR Buffer5μL 94℃ 50秒2.5mM MgCl23μL 50℃ 50秒2.5mM dNTP4μL 72℃ 2分30秒上下游引物各 1μL 72℃ 10分鐘cDNA 2μLTaq酶 1μLPCR產(chǎn)物全部上樣0.8％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下割回2.1kb片段，置于1.5mL離心管，加入600μL 6M NaI，37℃水浴使膠融化完全，加入9μL玻璃珠混勻，冰浴15分鐘，12000rpm離心5秒，棄上清，450μL 75％冰乙醇洗滌3次，棄上清，至37℃烘箱烘干殘余液體，沉淀溶于50μL 0.1×TE，12000rpm離心約1分鐘，轉(zhuǎn)上清于一新管，-20℃保存；割膠回收的產(chǎn)物和質(zhì)粒pGEM-3Z分別用BamH I和EcoR I酶切，兩酶切產(chǎn)物以4∶1比例加入200μL小離心管用T4 DNA連接酶1μL，5X連接緩沖液1.5μL，15℃連接過(guò)夜，以上連接產(chǎn)物5μL轉(zhuǎn)化200μL CaCl2法制備的TG-1感受態(tài)細(xì)胞，加入37℃預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基1mL后置37℃搖床，180rpm振蕩1小時(shí)，同時(shí)制備篩選培養(yǎng)基，Amp(+)LB固體培養(yǎng)基表面加40μL20mg/ml的X-gal和4μL 200mg/ml的IPTG用無(wú)菌玻棒涂布均勻，置37℃培養(yǎng)箱使之吸收，上述菌液4000rpm離心5分鐘，棄去1ml上清，用移液器輕輕吹打混勻后涂布篩選培養(yǎng)基置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時(shí)以上，直到出現(xiàn)明顯而又未相互重疊的單菌落，挑白色單菌落于3mL加入5μL Amp的液體LB培養(yǎng)基，抽提質(zhì)粒，用BamH I和EcoR I酶切鑒定重組質(zhì)粒，篩選陽(yáng)性出克隆接種于3ml LB液體培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，測(cè)序正確后堿法小量抽提質(zhì)粒，然后用Centricon-100管(Amicon公司)離心除去RNA，測(cè)OD260/OD280約為1.8，再用BamH I和EcoR I酶切后連入轉(zhuǎn)移載體pVL1393，得到重組轉(zhuǎn)移載體pVL1393-LF，pVL1393-LF與經(jīng)Bsu36 I酶切后的HyBacPAK6病毒DNA在脂質(zhì)體介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染Bm-N家蠶細(xì)胞，在35mm滅菌培養(yǎng)皿中加入0.5ml生長(zhǎng)旺盛期的細(xì)胞，加入0.5ml新鮮培養(yǎng)基TC-100，混勻，前后左右輕輕搖勻，室溫放置1小時(shí)，使細(xì)胞貼壁，在透明的聚苯乙烯滅菌管中加入下列試劑濃度為1.0μg/μL的pVL1393 15.0μl、濃度為1.0μg/μL的野生型桿狀病毒DNA1.0μL、滅菌水10.0μL、脂質(zhì)體14.0μL輕輕混勻，常溫下放置15分鐘，在此期間待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞吸取培養(yǎng)基，用無(wú)血清TC-100培養(yǎng)基洗三次，最后加入2mL無(wú)血清TC-100培養(yǎng)基。15分鐘以后，用移液器吸取上述40.0μL共轉(zhuǎn)染試劑，分三處滴入細(xì)胞中，然后用封口膜密封，27℃培養(yǎng)5天。待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液，將母液按10-3、10-4、10-5的濃度梯度進(jìn)行稀釋?zhuān)?μL的病毒稀釋液接種到貼壁細(xì)胞中，搖動(dòng)使之均勻。27℃感染1小時(shí)后，移去接種液，在病毒接種時(shí)將3％低熔點(diǎn)瓊脂糖熔化，保溫在40℃水浴中，然后與等體積預(yù)熱到40℃的2×TC-100(含20％胎牛血清)快速混合均勻，將此混合液輕輕加到已移走接種液的貼壁細(xì)胞上，等膠凝固后封口，逐日觀察病毒斑生長(zhǎng)情況，當(dāng)病毒斑明顯后，在顯微鏡下挑取分隔良好的12個(gè)病毒斑，感染接種于5×104細(xì)胞密度且已貼壁生長(zhǎng)的24孔板中，至細(xì)胞呈感染態(tài)時(shí)，收集病毒液，向殘余的細(xì)胞中添加100μg X-gal的溶液，37℃溫育1小時(shí)后，選取白斑重復(fù)篩選至獲得重組病毒HyBacPAK-LF，將純化的重組病毒HyBacPAK-LF穿刺家蠶蠶蛹，26-30℃放置，待其發(fā)病后收集病蠶蛹，勻漿，50℃烘干制成蠶蛹粉。
權(quán)利要求
1.含乳鐵蛋白及其肽的全蠶蛹粉的生產(chǎn)方法，包括以下步驟1)取泌乳母畜乳腺腺泡，液氮冷凍，研磨成粉末，提取總RNA并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄得到乳鐵蛋白或乳鐵蛋白肽的cDNA，根據(jù)乳鐵蛋白或乳鐵蛋白肽基因特征設(shè)計(jì)一對(duì)各帶一個(gè)酶切位點(diǎn)的引物，利用RT-PCR技術(shù)得到DNA，定向克隆入大腸桿菌克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株，篩選陽(yáng)性克??；2)將以上篩選出的陽(yáng)性菌株抽提質(zhì)粒，用DNA內(nèi)切酶切出目的基因并純化之，將目的基因定向克隆進(jìn)桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體，得到含乳鐵蛋白重組轉(zhuǎn)移載體，同時(shí)線(xiàn)性化桿狀病毒表達(dá)載體，在透明的聚苯乙烯滅菌管中加入下列試劑濃度1.0μg/μL的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體15.0μl、濃度1.0μg/μL線(xiàn)性化的桿狀病毒表達(dá)載體1.0μL、滅菌水10.0μL、脂質(zhì)體14.0μL，輕輕混勻，常溫下放置15分鐘，在此期間待轉(zhuǎn)染的家蠶細(xì)胞吸去培養(yǎng)基，用無(wú)血清TC-100培養(yǎng)基洗三次，最后加入2mL無(wú)血清TC-100培養(yǎng)基，15分鐘以后，用移液器吸取上述40.0μL共轉(zhuǎn)染試劑，分三處滴入細(xì)胞中，輕輕搖勻，然后用封口膜密封，27℃培養(yǎng)5天；3)待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液，將母液按10-3、10-4、10-5的濃度梯度進(jìn)行稀釋?zhuān)?μL的病毒稀釋液接種到貼壁細(xì)胞中，搖動(dòng)使之均勻，27℃感染1小時(shí)后，移去接種液，在病毒接種時(shí)將3％低熔點(diǎn)瓊脂糖熔化，保溫在40℃水浴中，然后與等體積預(yù)熱到40℃的含20％胎牛血清2×TC-100快速混合均勻，將此混合液輕輕加到已移走接種液的貼壁細(xì)胞上，等膠凝固后封口，逐日觀察病毒斑生長(zhǎng)情況，當(dāng)病毒斑明顯后，在顯微鏡下挑取分隔良好的12個(gè)病毒斑，接種于5×104細(xì)胞密度且已貼壁生長(zhǎng)的24孔板中，至細(xì)胞呈感染態(tài)時(shí)，收集病毒液，向殘余的細(xì)胞中添加100μg X-gal的溶液，37℃溫育1小時(shí)后，選取白斑按上述步驟3進(jìn)一步篩選，重復(fù)篩選至獲得含乳鐵蛋白或乳鐵蛋白肽基因的重組桿狀病毒；4)將純化的重組病毒穿刺家蠶蠶蛹，26-30℃放置，待蠶蛹發(fā)病后收集病蠶蛹，勻漿，50℃烘干制成蠶蛹粉。
全文摘要
本發(fā)明的含乳鐵蛋白及其肽的全蠶蛹粉的生產(chǎn)方法是采用桿狀病毒為載體，以家蠶蠶蛹為宿主生產(chǎn)與天然乳鐵蛋白及其肽生物學(xué)活性相似的基因工程產(chǎn)品的。其生產(chǎn)、使用過(guò)程安全，不存在對(duì)人畜和環(huán)境的潛在危險(xiǎn)。將本發(fā)明生產(chǎn)的全蠶蛹粉用作飼料添加劑，在補(bǔ)充飼料蛋白的同時(shí)起到殺菌抗病毒、提高動(dòng)物自身的免疫力的作用，可有效地防治斷乳仔豬的腹瀉，以生產(chǎn)出無(wú)抗生素殘留的高品質(zhì)畜產(chǎn)品。
文檔編號(hào)A61P1/12GK1560261SQ200410016758
公開(kāi)日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2004年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月2日
發(fā)明者汪以真, 許梓榮, 黃海青 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)