專利名稱：蛋白酪氨酸磷酸酯酶1b抑制劑1，3－二羥基－5－烷基苯類化合物的制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種從紅樹林植物欖李中分離及衍生化得到的具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)活性的1，3-二羥基-5-烷基苯類化合物的制備方法及其用途。該類化合物可作為蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B的抑制劑和胰島素增敏劑，可用于治療各種糖尿病、肥胖癥及其它由此引起的并發(fā)癥。
背景技術(shù)：
糖尿病(diabetes mellitus)是一組由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的臨床綜合癥，因胰島素分泌絕對或相對不足以及靶組織細胞對胰島素敏感性降低，引起糖、蛋白、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂。臨床以高血糖為主要共同標(biāo)志，久病可引起多個系統(tǒng)損害，病情嚴重和應(yīng)激時可發(fā)生急性代謝紊亂如酮癥酸中毒等。在糖尿病人中發(fā)生冠心病、缺鐵性或出血性腦血管病、失明、肢端壞疽等嚴重并發(fā)癥均明顯高于非糖尿病人群。因此，糖尿病及其并發(fā)癥已成為嚴重威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題。
目前一般將糖尿病分為兩類，I型糖尿病(胰島素依賴型糖尿病，IDDM)與II型糖尿病(非胰島素依賴型糖尿病，NIDDM)。糖尿病中90％以上是II型糖尿病。WHO預(yù)計，由于人口老齡化、肥胖、不健康的飲食以及缺乏運動的生活方式，到2025年，糖尿病患者的數(shù)目將由1995年的1.35億上升為3億。
I型糖尿病人由于第6對染色體短臂上的HLA-D基因決定了遺傳易感性，對環(huán)境因素，特別是病毒感染或化學(xué)毒性物質(zhì)刺激的反應(yīng)異常，直接或間接通過自身免疫反應(yīng)，引起胰島B細胞破壞，以致胰島素不足。臨床特點是引起病急、多食、多尿、多飲、體重減輕等癥狀較明顯，有發(fā)生酮癥中毒的傾向，必須依賴胰島素治療維持生命。
II型糖尿病也有很強的遺傳性和環(huán)境因素，并呈顯著的異質(zhì)性，發(fā)病機制多樣而復(fù)雜，各病人間存在較大差異。總的來說可概括為胰島素分泌的相對不足和胰島素抵抗。對II型糖尿病人，尤其是肥胖性糖尿病患者的一系列研究證實，胰島素抵抗是II型糖尿病發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵因素。在研究脂肪細胞和肌肉細胞內(nèi)胰島素信號傳導(dǎo)途徑的基礎(chǔ)上，設(shè)計開發(fā)胰島素增敏劑，以改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，是目前II型糖尿病新藥研究的重點，也是其主要方向之一。
II型糖尿病的特點是胰島素敏感組織如骨骼肌、肝、脂肪組織對胰島素作用的抵抗。雖然其具體機制尚不清楚，但胰島素信號在其傳導(dǎo)通路中的減弱甚至阻斷必定是直接因素。胰島素通過與其受體胞外α亞單位結(jié)合激活受體胞內(nèi)β亞單位內(nèi)在的酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域中關(guān)鍵的酪氨酸殘基自身磷酸化，從而完全激活胰島素受體酪氨酸激酶活性，胰島素受體酪氨酸激酶再通過磷酸化其底物將信號傳遞下去。隨著對細胞內(nèi)胰島素作用通路中可逆性酪氨酸磷酸化認識的加深，蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTPases)在平衡該通路中相關(guān)蛋白酪氨酸磷酸化水平中的作用越來越受到重視。PTPases可能作用于該通路中多個環(huán)節(jié)，例如將自身磷酸化活化的胰島素受體(IR)去磷酸化，從而降低受體激酶活性；或?qū)⒅T如胰島素受體底物1(IRS-1)、胰島素受體底物2(IRS-2)、Shc等胰島素受體的底物中蛋白酪氨酸殘基致病磷酸化，從而負調(diào)控胰島素作用受體后通路。特定PTPases和胰島素通路中酪氨酸激酶間酶活性的不平衡可能是引起II型糖尿病胰島素抵抗的原因。因此，通過尋找選擇性作用于該通路中PTPases的抑制劑抑制其活性，加強和延長胰島素信號，成為越來越受重視的治療II型糖尿病的新途徑。
PTPases包括一大族跨膜(受體型)和胞內(nèi)(非受體型)酶，參與調(diào)控一系列重要生命過程。雖然多種PTPases在胰島素敏感的組織中有表達，如跨膜的CD45和LAR-PTPase等；胞內(nèi)的SHPTP-1、SHPTP-2、PTP1B、PTP1C等，但只有幾種PTPases可能在胰島素通路中受體或受體后環(huán)節(jié)影響正常胰島素作用。目前的研究主要集中在LAR-PTPase、SHPTP-2、PTP1B。
PTP1B是最早被純化和確定生物學(xué)特性的PTPase，全長大約50KD。早期研究證明能在體外有效地將胰島素受體去磷酸化；將來源于人胎盤的PTP1B顯微注射入非洲蟾蜍卵母細胞中，將減少胰島素誘導(dǎo)的卵母細胞成熟及S6肽磷酸化水平。隨后發(fā)現(xiàn)PTP1B在所有胰島素敏感組織中高表達；用滲透休克的方法給予PTP1B抗體后，小鼠KRC-7肝細胞經(jīng)胰島素刺激時DNA合成和PI3激酶活性水平顯著升高，IR自身磷酸化水平、IR激酶活性水平和IRS-1酪氨酸磷酸化水平也顯著升高。最近有研究表明，PTP1B直接與激活狀態(tài)的IR相互作用；在體外實驗中也對IRS-1顯示最高的選擇性活性；大鼠成纖維細胞中PTP1B的高表達能明顯降低配體誘導(dǎo)的IR磷酸化水平；用腺病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的方法，在胰島素靶向組織骨骼肌和肝組織的模型細胞L6肌細胞和Fao細胞中高表達PTP1B，明顯抑制胰島素誘導(dǎo)的IR和IRS-1的酪氨酸磷酸化，并從而顯著抑制IRS-1和PI3激酶P85亞單位復(fù)合物的形成以及Akt、MAPK的磷酸化水平，而且胰島素誘導(dǎo)的糖原合成也被抑制[Egawa K.et al.J.Biol.Chem.276(13)10207-10211]。用同樣的方法在另一胰島素靶向組織脂肪組織的模型細胞3T3-L1細胞中高表達PTP1B，同樣明顯抑制胰島素誘導(dǎo)的IR、IRS-1和PI3激酶的酪氨酸磷酸化，P42和P44 MAPK磷酸化水平也明顯降低，而Akt磷酸化水平和活性不受影響[Venable C.L.et al.J.Biol.Chem.275(24)18318-18326]。PTP1B的高表達對基本的、中等的及最大量胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運無影響，對轉(zhuǎn)運的EC50胰島素濃度無影響。這些研究證明PTP1B能夠負調(diào)控胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并主要作用于胰島素受體。更重要的實驗證據(jù)來自PTP1B基因敲除小鼠。Elchebly等報道，運用同源重組的方法產(chǎn)生的PTP1B基因敲除的小鼠生長正常，有生殖力，對胰島素敏感性顯著增強，而且這一增強作用與肝臟和骨骼肌中胰島素受體及胰島素受體底物1磷酸化水平的增強相關(guān)[Elchebly M.，et al.Science，283，1544-1548]。令人驚奇的是，PTP1B基因敲除的小鼠對食物誘導(dǎo)的體重增加和胰島素抵抗也有抵抗作用。Klaman等運用大致相同的方法產(chǎn)生的PTP1B基因敲除的小鼠也得到同樣的結(jié)果，而且發(fā)現(xiàn)PTP1B基因敲除的小鼠之所以對食物誘導(dǎo)的體重增加有抵抗作用，是由于脂肪細胞體積的減少，而脂肪細胞的數(shù)量并不改變。PTP1B基因敲除的小鼠基本代謝水平和總體能量消耗升高[Klaman L.D.，et al.Molecular and Cellular Biology，20(15)5479-5489]。這些實驗更加有力地證明了PTP1B在胰島素敏感性、能量消耗和脂肪儲存方面的重要作用，從而更加明確了它是治療二型糖尿病和肥胖癥的一個潛在藥物作用靶點。
PTP1B選擇性抑制劑的研究取得了一定的進展，但大多局限于一些肽類或非肽類化合物，例如基于PTP1B去磷酸化的底物序列設(shè)計的抑制劑EEDE(F2PMP)M(Ki＝7.2nM)、Glu-F2PMP-F2PMP(IC50＝40nM)，雖然這些肽類抑制劑具有較強的抑制活性及較高的選擇性，但它們是肽類磷酸化合物的事實使其很難成為藥物候選化合物。最近，一系列非肽類非磷酸化合物類PTP1B抑制劑被報道，它們具有一定的選擇性，更重要的是，其中一些化合物對降低ob/ob小鼠血漿中葡萄糖和胰島素水平有顯著作用。這是第一例藥理學(xué)的直接證據(jù)，證明PTP1B抑制劑具有抗糖尿病活性[Malamas，M.S.，et al.J.Med.Chem.，2000，43，1293-1310]。這些無疑為我們尋找新的小分子非肽類有機化合物作為高效、高選擇性PTP1B抑制劑提供了機遇。
欖李(Lumnitzera racemosa Willd)為紅樹林植物，專一生長于熱帶或亞熱帶海岸潮間帶，屬于使君子科。《中華本草》記載，欖李主治鵝口瘡、濕疹、皮膚瘙癢等癥[國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草，上海上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999，5，615]。
本發(fā)明是首次從紅樹林植物欖李中分離得到1，3-二羥基-5-烷基苯類化合物，并經(jīng)過衍生化反應(yīng)得到了它們的甲基化物和乙?；?，經(jīng)多次藥理試驗研究表明，該類化合物具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B的顯著活性，經(jīng)文獻檢索，未見該類化合物具有此方面活性的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從紅樹林植物欖李中提取分離1，3-二羥基-5-烷基苯類化合物及制備其衍生物的方法；本發(fā)明的另一目的是提供一種上述1，3-二羥基-5-烷基苯類化合物的用途。
本發(fā)明的1，3-二羥基-5-烷基苯類化合物具有如下化學(xué)結(jié)構(gòu)式 其中當(dāng)n＝10，R3＝CH3時，R1、R2同時為H、CH3或Ac；當(dāng)n＝8，R3＝H時，R1、R2同時為H、CH3或Ac。
本發(fā)明從紅樹林植物欖李中提取分離1，3-二羥基-5-烷基苯類化合物的方法，其步驟如下將干燥粉碎的欖李枝葉用甲醇浸提三次，每次一周，合并甲醇提取液，減壓蒸去甲醇，得甲醇提取物，甲醇提取物用H2O溶解，再分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取三次，分別蒸干溶劑得石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水溶性部分。乙酸乙酯部分經(jīng)過硅膠(100-200目)柱層析，用石油醚/乙酸乙酯95∶5-50∶50洗脫，再經(jīng)過Sephadex LH-20凝膠柱層析，用CHCl3/MeOH(1∶1)洗脫，得到1，3-二羥基-5-烷基苯類化合物。
1，3-二羥基-5-烷基苯類化合物與醋酐和吡啶反應(yīng)，得到其乙?；?；1，3-二羥基-5-烷基苯類化合物與甲基化試劑CH2N2反應(yīng)，得到其甲基化物。
本發(fā)明對所得1，3-二羥基-5-烷基苯類化合物進行了蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B抑制活性實驗，表明其有明顯的抑制活性。
測試原理利用分子生物學(xué)手段在大腸桿菌系統(tǒng)表達人源蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶1B(hPTP1B)催化結(jié)構(gòu)域，經(jīng)純化后的hPTP1B重組蛋白能水解底物pNPP的磷脂鍵，得到的產(chǎn)物在410nm處有很強的光吸收，因此可以通過直接檢測410nm處光吸收的變化以觀察酶的活性變化以及化合物對酶活性的抑制情況。標(biāo)準的測活體系如下10mM Tris.Cl，pH 7.6，10mM pNPP，2％DMSO，100nM hPTP1B。

pNPP 410nm觀察指標(biāo)動態(tài)測定波長為410nm處的光吸收，時間為3分鐘，其動力學(xué)曲線一級反應(yīng)的斜率作為酶的活性指標(biāo)。
抑制率(％)＝[1-Vmax(待測樣品)/Vmax(空白對照)]×100％實驗結(jié)果的評判與解釋篩選結(jié)果是當(dāng)化合物的濃度為10μg/ml時對酶活性的百分抑制率，抑制活性高于50％時，按常規(guī)篩選得出IC50，陽性對照正釩酸鈉的IC50為2μM。

具體實施方式
下面結(jié)合實施實例對本發(fā)明作進一步闡述，但不限制本發(fā)明。
NMR用Bruker-DRX400核磁共振儀測定。EI-MS用Finnigan-MAT-95質(zhì)譜儀測定。柱層析硅膠、薄層硅膠板均為青島海洋化工有限公司生產(chǎn)。所使用的Sephadex LH-20為E.Merk公司生產(chǎn)，試劑均為上海振興化工一廠產(chǎn)品。
pNPP為Sigma公司生產(chǎn)，Tris·Cl和DMSO為生工生產(chǎn)，96孔板為Abgene公司生產(chǎn)，PTP1B由國家新藥篩選中心表達、部分純化，酶標(biāo)儀為VERSAmax。
實施例一化合物2-甲基-5-十三烷基-1，3-苯二醇(2-methyl-5-tridecyl-1，3-benzendiol)的制備欖李3.0kg用甲醇浸提三次，每次一周，合并甲醇提取液，減壓除去甲醇、再用H2O溶解，然后分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取三次，合并蒸干乙酸乙酯部分得浸膏28g。
乙酸乙酯部分28g浸膏上硅膠(100-200目)柱，用石油醚/乙酸乙酯95∶5-50∶50洗脫，500ml/份，共100份，經(jīng)薄層層析檢測后合并為15個部分，第四個部分又經(jīng)硅膠(200-300目)柱層析，用石油醚/乙醚90∶10-50∶50洗脫，分為F41(500mg)、F42(850mg)、F43(350mg)三個部分，F(xiàn)41又經(jīng)過Sephadex LH-20凝膠柱層析，用CHCl3/MeOH(1∶1)洗脫，5ml/份，共30份，薄層層析檢測，展開劑石油醚/乙醚(1∶1)，合并13-18份，得化合物1(25mg)。
其1HNMR(TMS/CD3OD)δ6.14(2H，s，H-4，6)，2.39(2H，t，J＝7.24Hz，H-1’)，1.99(3H，s，2-Me)，1.53(2H，m，H-2’)，1.26(20H，m，H-3’-H-12’)，0.88(3H，t，J＝7.15 Hz，H-13’)；EIMSm/z 306[M]+；參照文獻[Manju，M.R.Parthasarathy.Indian J.of Chemistry，1977，15(sect B)，1090-1093]，鑒定化合物1為2-甲基-5-十三烷基-1，3-苯二醇。(2-methyl-5-tridecyl-1，3-benzendiol)。
實施例二化合物1，3-二羥基-5-十一烷基苯(1，3-dihydroxy-5-undecylbenzene)的制備乙酸乙酯部分28g浸膏上硅膠(100-200目)柱，用石油醚/乙酸乙酯95∶5-50∶50洗脫，500ml/份，共100份，經(jīng)薄層層析檢測后合并為15個部分，第五部分又經(jīng)過硅膠(200-300目)柱層析，用石油醚/乙酸乙酯90∶10-50∶50洗脫，100ml/份，共90份。薄層層析檢測，展開劑石油醚/乙醚(1∶1)，合并為三個部分，F(xiàn)51(29-36，2.0g)，F(xiàn)52(40-55，500mg)，F(xiàn)53(65-85，200mg)；F52又經(jīng)過Sephadex LH-20凝膠柱層析，用CHCl3/MeOH(1∶1)洗脫，5ml/份，共30份，薄層層析檢測，展開劑石油醚/乙醚(1∶1)，合并為F521(10-19，300mg)和F522(25-29，90mg)兩個部分；F522又經(jīng)過Sephadex LH-20凝膠柱層析，用MeOH洗脫，5ml/份，共30份，薄層層析檢測，展開劑石油醚/乙醚(1∶1)，合并18-20份得化合物2(20mg)。
其1HNMR(TMS/CDCl3)δ6.25(2H，d，J＝2.01Hz，H-1，3)，6.18(1H，d，J＝1.83Hz，H-2)，2.44(2H，t，J＝7.33Hz，H-1’)，1.54(2H，m，H-2’)，1.25(16H，m，H-3’-H-10’)，0.88(3H，t，J＝6.60Hz，H-11’)；13CNMR(TMS/CDCl3)δ156.6(C-1，3)，146.6(C-5)，108.4(C-4，6)，100.5(C-2)，36.2(C-1’)，23.0-32.2(C-2’-10’)，14.4(C-11’).參照文獻[Marmor R.S.J.O.C，1972，37(18)2901-2904]，鑒定化合物2為1，3-二羥基-5-十一烷基苯(1，3-dihydroxy-5-undecylbenzene)。
實施例三化合物1和化合物2衍生物的制備(1)化合物1和化合物2甲基化物的制備分別稱取化合物1和化合物2樣品5.0mg于10mL圓底燒瓶中，加入溶有CH2N2的乙醚溶液2mL，揮去乙醚和CH2N2后，得化合物1的甲基化物(n＝10，R3＝CH3，R1、R2＝CH3)和化合物2的甲基化物(n＝8，R3＝H，R1、R2＝CH3)(2)化合物1和化合物2乙?；锏闹苽浞謩e稱取化合物1和化合物2樣品5.0mg于25mL圓底燒瓶中，加入無水吡啶和醋酐各1.5mL，在磁力攪拌器上攪拌24h，減壓除去吡啶和醋酐，得化合物1的乙?；?n＝10，R3＝CH3，R1、R2＝Ac)和化合物2的乙?；?n＝8，R3＝H，R1、R2＝Ac)。
實施例四1，3-二羥基-5-烷基苯類化合物的PTP1B抑制活性實驗實驗方法用于篩選的蛋白酪氨酸磷酸酯酶PTP1B是從大腸桿菌中表達并純化的GST融合蛋白。采用紫外底物pNPP，觀察不同化合物對重組酶的活性的抑制，以初步評價化合物的藥用效果。PTP1B水解底物pNPP的磷脂得到的產(chǎn)物在410nm處有很強的光吸收。因此可以直接監(jiān)測410nm處光吸收的變化以觀察酶的活性變化以及化合物對其的抑制情況。樣品臨用前溶于DMSO配成適當(dāng)濃度，3倍稀釋，7個稀釋度，三復(fù)孔，取2μl樣品溶液加入96孔板，加入88μl assay mix(Assay buffer，pNPP，H2O)，再加入10μlPTP1B，在VERSAmax上410nm處檢測Vmax值。陽性對照正釩酸鈉IC50為2μM。實驗結(jié)果如下

權(quán)利要求
1.一類結(jié)構(gòu)如下的1，3-二羥基-5-烷基苯類化合物的制備方法 其中當(dāng)n＝10，R3＝CH3時，R1、R2同時為H、CH3或Ac；當(dāng)n＝8，R3＝H時，R1、R2同時為H、CH3或Ac。其特征在于由紅樹林植物欖李中提取、分離及制備步驟如下a.欖李植物枝葉用甲醇浸提、合并提取液，分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取，分別減壓濃縮，分成石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物；b.將乙酸乙酯提取物經(jīng)過硅膠(100-200目)柱層析，用石油醚∶乙酸乙酯或石油醚∶乙醚梯度冼脫；c.合并后的b中組分再經(jīng)過硅膠(200-300目)柱層析，用石油醚∶乙酸乙酯或石油醚∶乙醚梯度冼脫；d.將上述所得之提取物再在Sephadex LH-20凝膠柱層析，流動相為氯仿∶甲醇(1∶1)或甲醇冼脫；e.收集各部冼脫液減壓濃縮分別得所需化合物。所得化合物分別與醋酐吡啶和CH2N2反應(yīng)，得到其乙酰化物和甲基化物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的1，3-二羥基-5-烷基苯類化合物的制備方法，其特征在于步驟a中提取1，3-二羥基-5-烷基苯類化合物時用的是甲醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的1，3-二羥基-5-烷基苯類化合物的制備方法，其特征在于步驟b中流動相是石油醚∶乙酸乙酯＝95∶5-50∶50的梯度冼脫。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的1，3-二羥基-5-烷基苯類化合物的制備方法，其特征在于步驟c中流動相是石油醚∶乙醚＝90∶10-50∶50的梯度冼脫。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的1，3-二羥基-5-烷基苯類化合物的制備方法，其特征在于步驟d中流動相為氯仿∶甲醇＝1∶1或甲醇冼脫。
6.如權(quán)利要求1所述的1，3-二羥基-5-烷基苯類化合物具有抑制PTP1B活性，在制備治療各種糖尿病、肥胖癥及其并發(fā)癥藥物中應(yīng)用；
7.如權(quán)利要求1所述的1，3-二羥基-5-烷基苯類化合物作為胰島素增敏劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體是一類從紅樹林植物欖李(Lumnitzera racemosa Willd)枝葉中提取、分離獲得的具有蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B抑制活性的1，3－二羥基－5－烷基苯類化合物(結(jié)構(gòu)如右式)的制備方法及其用途其中R
文檔編號A61P5/50GK1680238SQ200410017589
公開日2005年10月12日 申請日期2004年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月9日
發(fā)明者郭躍偉, 王繼棟, 李佳, 南發(fā)俊, 于嘉陵, 周秀紅 申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所