專利名稱：蛋白酪氨酸磷酸酯酶1b抑制劑桐花醇類化合物的制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種從紅樹林植物桐花樹中分離及衍生化得到的具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)活性的桐花醇(falcarindiol)類化合物的制備方法及其用途。該類化合物可作為蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)的抑制劑和胰島素增敏劑，可用于治療各種糖尿病、肥胖癥及其它由此引起的并發(fā)癥。
背景技術(shù)：
糖尿病(diabetes mellitus)是一組由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的臨床綜合癥，因胰島素分泌絕對或相對不足以及靶組織細(xì)胞對胰島素敏感性降低，引起糖、蛋白、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂。臨床以高血糖為主要共同標(biāo)志，久病可引起多個系統(tǒng)損害，病情嚴(yán)重和應(yīng)激時(shí)可發(fā)生急性代謝紊亂如酮癥酸中毒等。在糖尿病人中發(fā)生冠心病、缺鐵性或出血性腦血管病、失明、肢端壞疽等嚴(yán)重并發(fā)癥均明顯高于非糖尿病人群。因此，糖尿病及其并發(fā)癥已成為嚴(yán)重威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題。
目前一般將糖尿病分為兩類，I型糖尿病(胰島素依賴型糖尿病，IDDM)與II型糖尿病(非胰島素依賴型糖尿病，NIDDM)。糖尿病中90％以上是II型糖尿病。WHO預(yù)計(jì)，由于人口老齡化、肥胖、不健康的飲食以及缺乏運(yùn)動的生活方式，到2025年，糖尿病患者的數(shù)目將由1995年的1.35億上升為3億。
I型糖尿病人由于第6對染色體短臂上的HLA-D基因決定了遺傳易感性，對環(huán)境因素，特別是病毒感染或化學(xué)毒性物質(zhì)刺激的反應(yīng)異常，直接或間接通過自身免疫反應(yīng)，引起胰島B細(xì)胞破壞，以致胰島素不足。臨床特點(diǎn)是引起病急、多食、多尿、多飲、體重減輕等癥狀較明顯，有發(fā)生酮癥中毒的傾向，必須依賴胰島素治療維持生命。
II型糖尿病也有很強(qiáng)的遺傳性和環(huán)境因素，并呈顯著的異質(zhì)性，發(fā)病機(jī)制多樣而復(fù)雜，各病人間存在較大差異。總的來說可概括為胰島素分泌的相對不足和胰島素抵抗。對II型糖尿病人，尤其是肥胖性糖尿病患者的一系列研究證實(shí)，胰島素抵抗是II型糖尿病發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵因素。在研究脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞內(nèi)胰島素信號傳導(dǎo)途徑的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)開發(fā)胰島素增敏劑，以改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，是目前II型糖尿病新藥研究的重點(diǎn)，也是其主要方向之一。
II型糖尿病的特點(diǎn)是胰島素敏感組織如骨骼肌、肝、脂肪組織對胰島素作用的抵抗。雖然其具體機(jī)制尚不清楚，但胰島素信號在其傳導(dǎo)通路中的減弱甚至阻斷必定是直接因素。胰島素通過與其受體胞外α亞單位結(jié)合激活受體胞內(nèi)β亞單位內(nèi)在的酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域中關(guān)鍵的酪氨酸殘基自身磷酸化，從而完全激活胰島素受體酪氨酸激酶活性，胰島素受體酪氨酸激酶再通過磷酸化其底物將信號傳遞下去。隨著對細(xì)胞內(nèi)胰島素作用通路中可逆性酪氨酸磷酸化認(rèn)識的加深，蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTPases)在平衡該通路中相關(guān)蛋白酪氨酸磷酸化水平中的作用越來越受到重視。PTPases可能作用于該通路中多個環(huán)節(jié)，例如將自身磷酸化活化的胰島素受體(IR)去磷酸化，從而降低受體激酶活性；或?qū)⒅T如胰島素受體底物1(IRS-1)、胰島素受體底物2(IRS-2)、Shc等胰島素受體的底物中蛋白酪氨酸殘基致病磷酸化，從而負(fù)調(diào)控胰島素作用受體后通路。特定PTPases和胰島素通路中酪氨酸激酶間酶活性的不平衡可能是引起II型糖尿病胰島素抵抗的原因。因此，通過尋找選擇性作用于該通路中PTPases的抑制劑抑制其活性，加強(qiáng)和延長胰島素信號，成為越來越受重視的治療II型糖尿病的新途徑。
PTPases包括一大族跨膜(受體型)和胞內(nèi)(非受體型)酶，參與調(diào)控一系列重要生命過程。雖然多種PTPases在胰島素敏感的組織中有表達(dá)，如跨膜的CD45和LAR-PTPase等；胞內(nèi)的SHPTP-1、SHPTP-2、PTP1B、PTP1C等，但只有幾種PTPases可能在胰島素通路中受體或受體后環(huán)節(jié)影響正常胰島素作用。目前的研究主要集中在LAR-PTPase、SHPTP-2、PTP1B。
PTP1B是最早被純化和確定生物學(xué)特性的PTPase，全長大約50KD。早期研究證明能在體外有效地將胰島素受體去磷酸化；將來源于人胎盤的PTP1B顯微注射入非洲蟾蜍卵母細(xì)胞中，將減少胰島素誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟及S6肽磷酸化水平。隨后發(fā)現(xiàn)PTP1B在所有胰島素敏感組織中高表達(dá)；用滲透休克的方法給予PTP1B抗體后，小鼠KRC-7肝細(xì)胞經(jīng)胰島素刺激時(shí)DNA合成和PI3激酶活性水平顯著升高，IR自身磷酸化水平、IR激酶活性水平和IRS-1酪氨酸磷酸化水平也顯著升高。最近有研究表明，PTP1B直接與激活狀態(tài)的IR相互作用；在體外實(shí)驗(yàn)中也對IRS-1顯示最高的選擇性活性；大鼠成纖維細(xì)胞中PTP1B的高表達(dá)能明顯降低配體誘導(dǎo)的IR磷酸化水平；用腺病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的方法，在胰島素靶向組織骨骼肌和肝組織的模型細(xì)胞L6肌細(xì)胞和Fao細(xì)胞中高表達(dá)PTP1B，明顯抑制胰島素誘導(dǎo)的IR和IRS-1的酪氨酸磷酸化，并從而顯著抑制IRS-1和PI3激酶P85亞單位復(fù)合物的形成以及Akt、MAPK的磷酸化水平，而且胰島素誘導(dǎo)的糖原合成也被抑制[Egawa K.et al.J.Biol.Chem.276(13)10207-10211]。用同樣的方法在另一胰島素靶向組織脂肪組織的模型細(xì)胞3T3-L1細(xì)胞中高表達(dá)PTP1B，同樣明顯抑制胰島素誘導(dǎo)的IR、IRS-1和PI3激酶的酪氨酸磷酸化，P42和P44 MAPK磷酸化水平也明顯降低，而Akt磷酸化水平和活性不受影響[Venable C.L.et al.J.Biol.Chem.275(24)18318-18326]。PTP1B的高表達(dá)對基本的、中等的及最大量胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)無影響，對轉(zhuǎn)運(yùn)的EC50胰島素濃度無影響。這些研究證明PTP1B能夠負(fù)調(diào)控胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并主要作用于胰島素受體。更重要的實(shí)驗(yàn)證據(jù)來自PTP1B基因敲除小鼠。Elchebly等報(bào)道，運(yùn)用同源重組的方法產(chǎn)生的PTP1B基因敲除的小鼠生長正常，有生殖力，對胰島素敏感性顯著增強(qiáng)，而且這一增強(qiáng)作用與肝臟和骨骼肌中胰島素受體及胰島素受體底物1磷酸化水平的增強(qiáng)相關(guān)[Elchebly M.，et al.Science，283，1544-1548]。令人驚奇的是，PTP1B基因敲除的小鼠對食物誘導(dǎo)的體重增加和胰島素抵抗也有抵抗作用。Klaman等運(yùn)用大致相同的方法產(chǎn)生的PTP1B基因敲除的小鼠也得到同樣的結(jié)果，而且發(fā)現(xiàn)PTP1B基因敲除的小鼠之所以對食物誘導(dǎo)的體重增加有抵抗作用，是由于脂肪細(xì)胞體積的減少，而脂肪細(xì)胞的數(shù)量并不改變。PTP1B基因敲除的小鼠基本代謝水平和總體能量消耗升高[Klaman L.D.，et al.Molecular and Cellular Biology，20(15)5479-5489]。這些實(shí)驗(yàn)更加有力地證明了PTP1B在胰島素敏感性、能量消耗和脂肪儲存方面的重要作用，從而更加明確了它是治療二型糖尿病和肥胖癥的一個潛在藥物作用靶點(diǎn)。
PTP1B選擇性抑制劑的研究取得了一定的進(jìn)展，但大多局限于一些肽類或非肽類化合物，例如基于PTP1B去磷酸化的底物序列設(shè)計(jì)的抑制劑EEDE(F2PMP)M(Ki＝7.2nM)、Glu-F2PMP-F2PMP(IC50＝40nM)，雖然這些肽類抑制劑具有較強(qiáng)的抑制活性及較高的選擇性，但它們是肽類磷酸化合物的事實(shí)使其很難成為藥物候選化合物。最近，一系列非肽類非磷酸化合物類PTP1B抑制劑被報(bào)道，它們具有一定的選擇性，更重要的是，其中一些化合物對降低ob/ob小鼠血漿中葡萄糖和胰島素水平有顯著作用。這是第一例藥理學(xué)的直接證據(jù)，證明PTP1B抑制劑具有抗糖尿病活性[Malamas，M.S.，et al.J.Med.Chem.，2000，43，1293-1310]。這些無疑為我們尋找新的小分子非肽類有機(jī)化合物作為高效、高選擇性PTP1B抑制劑提供了機(jī)遇。
桐花樹(Aegiceras corniculatum)為紅樹林植物，專一生長于熱帶或亞熱帶海岸潮間帶，屬紫金?？?。桐花樹樹皮含鞣質(zhì)，可提制栲膠本發(fā)明是首次從紅樹林植物桐花樹中分離得到桐花醇(falcarindiol)，并衍生合成了其乙?；锖图谆?，經(jīng)多次藥理試驗(yàn)研究表明，該類化合物具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B的顯著活性，經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見該類化合物具有此方面活性的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的或提供一種從紅樹林植物桐花樹中提取分離桐花醇(falcarindiol)及制備其衍生物的方法；本發(fā)明的另一目的是提供一種上述桐花醇(falcarindiol)類化合物的用途。
本發(fā)明的桐花醇(falcarindiol)類化合物具有如下化學(xué)結(jié)構(gòu)式
其中R1、R2同時(shí)為H或CH3或Ac化合物1為R1、R2等于H本發(fā)明的從桐花樹中提取桐花醇(falcarindiol)的方法，其步驟如下晾干粉碎的桐花樹枝葉用甲醇冷浸，滲濾提取3次，每次一周，提取液減壓回收溶劑，合并后得浸膏。浸膏用水分散后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚部分，乙酸乙酯部分g，正丁醇部分和水溶性部分。乙酸乙酯部分經(jīng)100-200目硅膠柱層析，以石油醚/丙酮95∶5-50∶50梯度洗脫，薄層層析檢測，展開劑石油醚/丙酮80∶20，把具有相同點(diǎn)的洗脫液合并成A-G七個部分。F部分又經(jīng)硅膠(200-300目)柱層析，以石油醚/丙酮90∶10-70∶30洗脫，薄層層析檢測，展開劑石油醚/丙酮80∶20，把具有相同點(diǎn)的洗脫液合并得F1，F(xiàn)1又經(jīng)過Sephadex LH-20柱層析，用MeOH洗脫得化合物。
桐花醇與醋酐和吡啶反應(yīng)，得到其乙?；铮煌┗ù寂c甲基化試劑CH2N2反應(yīng)，得到其甲基化物。
本發(fā)明對所得桐花醇(falcarindiol)類化合物進(jìn)行了蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B抑制活性實(shí)驗(yàn)，表明其有明顯的抑制活性。
測試原理利用分子生物學(xué)手段在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)人源蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶1B(hPTP1B)催化結(jié)構(gòu)域，經(jīng)純化后的hPTP1B重組蛋白能水解底物pNPP的磷脂鍵，得到的產(chǎn)物在410nm處有很強(qiáng)的光吸收，因此可以通過直接檢測410nm處光吸收的變化以觀察酶的活性變化以及化合物對酶活性的抑制情況。標(biāo)準(zhǔn)的測活體系如下10mM Tris.Cl，pH 7.6，10mM pNPP，2％DMSO，100nM hPTP1B。
pNPP410nm觀察指標(biāo)動態(tài)測定波長為410nm處的光吸收，時(shí)間為3分鐘，其動力學(xué)曲線一級反應(yīng)的斜率作為酶的活性指標(biāo)。
抑制率(％)＝[1-Vmax(待測樣品)/Vmax(空白對照)]×100％實(shí)驗(yàn)結(jié)果的評判與解釋篩選結(jié)果是當(dāng)化合物的濃度為10μg/ml時(shí)對酶活性的百分抑制率，抑制活性高于50％時(shí)，按常規(guī)篩選得出IC50，陽性對照正釩酸鈉的IC50為2μM。

具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明。
NMR用Bruker-DRX400核磁共振儀測定。柱層析硅膠、薄層硅膠板均為青島海洋化工有限公司生產(chǎn)。所使用的Sephadex LH-20為E.Merk公司生產(chǎn)，試劑均為上海振興化工一廠產(chǎn)品。
pNPP為Sigma公司生產(chǎn)，Tris·Cl和DMSO為生工生產(chǎn)，96孔板為Abgene公司生產(chǎn)，PTP1B由國家新藥篩選中心表達(dá)、部分純化，酶標(biāo)儀為VERSAmax。
實(shí)施例一化合物桐花醇(falcarindiol)的制備(1)提取晾干粉碎的桐花樹枝葉3kg用甲醇冷浸，滲濾提取3次，每次一周，提取液減壓回收溶劑，合并后得浸膏649g。浸膏用水分散后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚部分9.0g，乙酸乙酯部分47.35g，正丁醇部分80.0g。
(2)分離乙酸乙酯部分經(jīng)100-200目硅膠柱層析，以石油醚/丙酮95∶5-50∶50梯度洗脫，500ml/份，共80份，薄層層析檢測，展開劑石油醚/丙酮80∶20，把具有相同點(diǎn)的洗脫液合并成A-G七個部分。F部分(6.0g)又經(jīng)硅膠(200-300目)柱層析，以石油醚/丙酮90∶10-70∶30洗脫，100ml/份，共30份，薄層層析檢測，展開劑石油醚/丙酮80∶20，合并得F1(22-25，200mg)，F(xiàn)1又經(jīng)過Sephadex LH-20柱層析，用MeOH洗脫得化合物1(25mg)。
其1HNMR(TMS/CDCl3)，δ0.87(3H，t，J＝6.59Hz，H-17)，1.27(8H，m，H-13-H-16)，1.37(2H，m，H-12)，2.11(2H，m，H-11)，4.94(1H，dd，J＝5.36Hz，0.69Hz，H-3)，5.19(1H，d，J＝8.24Hz，H-8)，5.25(1H，ddd，J＝10.16Hz，2.06Hz，0.96Hz，H-1a)，5.48(1H，ddd，J＝16.07Hz，1.65Hz，0.97Hz，H-1b)，5.52(1H，m，H-9)，5.59(1H，m，H-10)，5.93(1H，ddd，J＝15.52Hz，10.17Hz，5.36Hz，H-2)；13CNMR(TMS/CDCl3)，δ117.1(C-1)，135.5(C-2)，63.1(C-7)，78.0(C-4)，70.0<p>表3

權(quán)利要求
1.一類結(jié)構(gòu)如下的桐花醇(falcarindiol)類化合物的制備方法，其特征在于由紅樹林植物桐花樹中提取、分離及制備步驟如下 其中R1、R2同時(shí)為H或CH3或Aca.晾干粉碎的桐花樹枝葉用甲醇浸提，合并提取液除去甲醇得油狀物用H2O溶解，分別用石油醚、醋酸乙酯和正丁醇提取，減壓除去溶劑分別得石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水溶性部分；b.將醋酸乙酯提取物經(jīng)過硅膠(200-300目)柱層析，以石油醚∶丙酮為流動相進(jìn)行梯度冼脫，將簿層層析檢測具有相同點(diǎn)的冼脫液分為A-G七個部分；c.將F部分經(jīng)過200-300目硅膠柱析，以石油醚∶丙酮梯度冼脫，簿層層析檢測具有相同點(diǎn)(即F1)的合并；d.上述F1提取物再經(jīng)Sephadex LH-20柱層析，甲醇冼脫，檢測具有相同點(diǎn)的部分合并濃縮得化合物；e.所得化合物分別與醋酐吡啶和CH2N2反應(yīng)，得到其乙?；锖图谆?。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的桐花醇(falcarindiol)類化合物的制備方法，其特征在于步驟b中流動相石油醚∶丙酮＝95∶5-50∶50的梯度冼脫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的桐花醇(falcarindiol)類化合物的制備方法，其特征在于步驟c中流動相石油酮∶丙酮＝90∶10-70∶30的梯度冼脫。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的桐花醇(falcarindiol)類化合物的制備方法，其特征在于步驟d中流動相為甲醇溶液。
5.如權(quán)利要求1所述的桐花醇(falcarindiol)類化合物具有抑制PTP1B活性，在制備治療各種糖尿病、肥胖癥及其并發(fā)癥藥物中應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求1所述的桐花醇(falcarindiol)類化合物作為胰島素增敏劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體是一類從紅樹林植物桐花樹(Aegiceras corniculatum)枝葉中提取、分離及衍生化獲得的具有蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B抑制活性的桐花醇(falcarindiol)類化合物(結(jié)構(gòu)如上)的制備方法及其用途其中R
文檔編號A61K31/045GK1680235SQ200410017590
公開日2005年10月12日 申請日期2004年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月9日
發(fā)明者郭躍偉, 王繼棟, 李佳, 南發(fā)俊, 于嘉陵, 周秀紅 申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所