專利名稱：一種攜分子佐劑的融合蛋白避孕疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物制藥領(lǐng)域，涉及一種與分子佐劑交聯(lián)的避孕疫苗，具體涉及一種與分子佐劑C3d3交聯(lián)的hCGβ-C3d3融合蛋白避孕疫苗。
背景技術(shù)：
人絨毛膜促性腺激素(hCG)是由胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的一種糖蛋白激素，其主要的生理功能是延長黃體壽命，使之增大成為妊娠黃體，增加甾體激素的分泌以維持妊娠。hCG是妊娠期暫時出現(xiàn)的一種特異性激素，已有研究證實，中和hCG的生物學(xué)活性可以在不干擾其它生殖生物學(xué)功能的情況下中止妊娠，因此hCG成為避孕疫苗設(shè)計中理想的靶抗原?；趆CG結(jié)構(gòu)中β亞基的特異性，以hCGβ為基礎(chǔ)的合成肽疫苗已經(jīng)進(jìn)入了II期臨床實驗。實驗結(jié)果顯示，hCGβ避孕疫苗具有可喜的應(yīng)用前景，但免疫效果個體之間的差異性和目前僅有的80％的避孕效果距臨床應(yīng)用相距甚遠(yuǎn)。因此，如何顯著增強(qiáng)其具有抗生育作用的體液免疫效應(yīng)，減弱有可能導(dǎo)致生殖系自身免疫損傷的細(xì)胞免疫效應(yīng)已成為hCGβ避孕疫苗的研究目標(biāo)。以往研究中，為打破機(jī)體對hCGβ小分子自身抗原的免疫耐受，大多采用白喉類毒素(DT)或破傷風(fēng)類毒素(TT)作為載體增強(qiáng)其免疫原性，但DT和TT卻存在著載體介導(dǎo)的表位抑制效應(yīng)。
在哺乳動物免疫系統(tǒng)中，C3d是補(bǔ)體C3的最后裂解產(chǎn)物之一，它與B細(xì)胞和濾泡樹突狀細(xì)胞(FDC)上的受體(CR2，CD21)的相互作用于正常體液免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和維持至關(guān)重要。1996年Dempsy首次報道C3d是一個能顯著增強(qiáng)體液免疫效力的分子佐劑，將C3d與抗原融合形成的C3d-抗原復(fù)合物能使抗原的免疫原性增強(qiáng)1000～10000倍。Thomas D.Green等報道把膜結(jié)合形式的三個拷貝C3d(mC3d3)與流感病毒血凝素(HA)相聯(lián)形成的mHA-C3d3 DNA疫苗和MitchellJA等把分泌形式的三個拷貝C3d(sC3d3)與麻疹病毒血凝素(H)相聯(lián)形成的sH-C3d3 DNA疫苗在保護(hù)性免疫的出現(xiàn)、抗體親和力的成熟和中和滴度方面都明顯強(qiáng)于HA和H。最近他們采用了相似的方法將I型人類免疫缺陷病毒包膜表面蛋白(HIV-lgp120)融合到C3d3的羧基端，驗證了C3d3增強(qiáng)體液免疫效應(yīng)的能力。對于hCGβ避孕疫苗而言，決定其避孕效果的是體液免疫效力，而非細(xì)胞免疫。細(xì)胞免疫不僅沒有中和hCGβ生物學(xué)活性的能力，在一定程度上還存在著導(dǎo)致生殖系靶細(xì)胞自身免疫損傷的危險。因此，用基因工程技術(shù)研制hCGβ避孕疫苗，并顯著增強(qiáng)其具有抗生育作用的Th2型及體液免疫效應(yīng)，減弱Th1型及CTL效應(yīng)是hCGβ避孕疫苗的研究目標(biāo)。
以往的研究，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了hCGβ與3個拷貝C3d分子的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-hCGβ-C3d3，所得到的融合蛋白經(jīng)鑒定證實既具有CD21分子結(jié)合活性，也具有hCGβ抗原性。在以上研究基礎(chǔ)上，將hCGβ-C3d3cDNA構(gòu)建入表達(dá)效率更高的真核載體pCMV4，通過對BALB/c小鼠的基因免疫，顯示分子佐劑C3d3使hCGβ的免疫原性增強(qiáng)了200多倍，并實現(xiàn)了免疫效應(yīng)從Th1型細(xì)胞免疫向Th2型體液免疫偏倚。由于基因疫苗在宿主細(xì)胞中的表達(dá)限制和基因疫苗在與宿主細(xì)胞基因組整合過程中，有可能激活原癌基因或破壞抑癌基因，理論上存在著致癌的危險性。因此，體外表達(dá)、純化hCGβ-C3d3融合蛋白，制備基因工程疫苗，并針對此融合蛋白研究hCGβ-C3d3疫苗的免疫效應(yīng)、抗生育效果及其作用機(jī)理將更為合理、安全。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種攜分子佐劑的融合蛋白避孕疫苗，具體是一種高效、穩(wěn)定、廉價的與分子佐劑C3d3交聯(lián)的hCGβ-C3d3融合蛋白避孕疫苗。本發(fā)明的另一目的是提供制備hCGβ-C3d3融合蛋白避孕疫苗的方法。
本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)。
本發(fā)明選用真核表達(dá)載體phCMV1(Gene Therapy System，Inc.)，分別構(gòu)建帶有6個組氨酸(6His)純化標(biāo)簽的hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ。選用中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞作為表達(dá)宿主，在體外表達(dá)、鑒定、純化出hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白。分別用hCGβ-C3d3融合蛋白、hCGβ蛋白和hCGβ蛋白加用弗氏佐劑免疫不同品系小鼠。檢測抗體水平、抗血清中和hCG生物學(xué)活性的能力和受試小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的水平，證實分子佐劑C3d3增強(qiáng)hCGβ蛋白疫苗體液免疫效力和抗生育潛能的作用。
本發(fā)明方法包括下述步驟，1.構(gòu)建分泌型真核表達(dá)質(zhì)粒phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ。
(1)phCMV1-6His-hCGβ構(gòu)建策略(圖1)
采用PCR技術(shù)分別合成、擴(kuò)增Hind III-Signal-6His-EcoR I片段和EcoR I-hCGβ(無信號肽及終止密碼子)-BamH I片段。連接兩片段后用Hind III和BamH I雙酶切片段Hind III-signal-6His-EcoR I-hCGβ(無信號肽及終止密碼子)-BamH I和pBS-hCGβ，連接得pBS-signal-6His-hCGβ。Hind III和Not I雙酶切phCMV1和pBS-signal-6His-hCGβ，連接得phCMV1-signal-6His-hCGβ。
(2)phCMV1-6His-hCGβ-C3d3構(gòu)建策略(圖2)Bgl II和Xba I雙酶切pSG5-C3d3，BamH I和Xba I雙酶切pBS-signal-6His-hCGβ，連接得PBS-signal-6His-hCGβ-C3d3。Hind III和Not I雙酶切phCMV1和pBS-signal-6His-hCGβ-C3d3，連接得phCMV1-signal-6His-hCGβ-C3d3。
2.hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白的表達(dá)、鑒定與純化。
(1)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞、抗性克隆篩選及無血清培養(yǎng)六孔板內(nèi)CHO細(xì)胞95％匯合成片，用Lipofectamine2000分別介導(dǎo)phCMV1-6His-hCGβ-C3d3、phCMV1-6His-hCGβ、phCMV1、pcDNA3-hCGβ-C3d3和pcDNA3-hCGβ轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。用含G418(800-1000ug/ml)的完全培養(yǎng)基篩選抗藥性克隆，含G418(300-400μg/ml)的培養(yǎng)液擴(kuò)增陽性克隆。待陽性克隆95％匯合成片時換用CHO無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。
(2)陽性細(xì)胞克隆培養(yǎng)上清中hCGβ含量測定收集培養(yǎng)24、48和72小時的無血清培養(yǎng)上清，放免法測定hCGβ含量，選取高效表達(dá)hCGβ-C3d3融合蛋白的陽性克隆。反復(fù)3次凍存和復(fù)蘇hCGβ-C3d3融合蛋白的高效表達(dá)克隆，間隔時間為1個月，檢測95％匯片后無血清培養(yǎng)48h培養(yǎng)上清中hCGβ的含量。
(3)Western blotting鑒定表達(dá)產(chǎn)物收集高效表達(dá)重組蛋白的陽性克隆培養(yǎng)72h的無血清培養(yǎng)上清，凍干法濃縮20倍后行Western blot鑒定。一抗是小鼠抗人hCGβ單抗，二抗為偶聯(lián)HRP的兔抗小鼠IgG，用DAB底物顯色。
(4)Raji細(xì)胞免疫化學(xué)染色鑒定hCGβ-C3d融合蛋白Raji細(xì)胞膜上具有豐富的CD21分子(C3d受體)，把Raji細(xì)胞分別與不同的表達(dá)產(chǎn)物共孵育，涂片固定后以小鼠抗人hCGβ為一抗，ABC法檢測hCGβ，當(dāng)hCGβ與C3d為融合蛋白時，才能使Raji細(xì)胞呈現(xiàn)陽性著色。收集phCMV1-6His-hCGβ-C3d3、phCMV1-6His-hCGβ和phCMV1陽性克隆24小時的無血清培養(yǎng)上清，分別與Raji細(xì)胞37℃孵育1小時，然后涂布在包被有多聚賴氨酸的載玻片上。一抗為以小鼠抗人hCGβ單抗，用anti-mouse IgG ABC試劑盒檢測。
(5)分離、純化hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白hCGβ蛋白采用ProBond 6his resin在非變性條件下一步法純化獲得。根據(jù)Western blotting的結(jié)果，phCMV1-6His-hCGβ-C3d3的表達(dá)產(chǎn)物在用鎳柱純化的基礎(chǔ)上，加用Sephadex G150 column進(jìn)行了凝膠過濾層析以分離出高分子量的hCGβ-C3d3融合蛋白。
3.動物免疫和免疫效應(yīng)免疫對象分別選用6～8周齡以體液免疫效應(yīng)為主的BALB/c小鼠和以細(xì)胞免疫效應(yīng)為主的C57BL/6小鼠，分別用hCGβ-C3d3融合蛋白、單用hCGβ蛋白和hCGβ蛋白加用弗氏佐劑進(jìn)行免疫。共免疫兩次，間隔4周。通過檢測血清中的抗體水平以驗證分子佐劑C3d3在個體差異較大的不同品系小鼠是否都能增強(qiáng)hCGβ蛋白抗原的免疫原性，并將C3d3的佐劑能力與弗氏佐劑進(jìn)行比較。
4.hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗介導(dǎo)免疫動物Th2型優(yōu)勢效應(yīng)hCGβ-C3d3融合蛋白、單用hCGβ和hCGβ加用弗氏完全佐劑免疫的BALB/c小鼠于末次免疫后3周脫頸處死，制備脾淋巴細(xì)胞懸液。體外用hCG刺激培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后用ELISA法檢測培養(yǎng)上清中IFNγ、IL-2、IL-4和IL-10的分泌水平。
5.hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗的抗生育潛能實驗hCGβ-C3d3融合蛋白、單用hCGβ和hCGβ加用弗氏完全佐劑免疫的BALB/c小鼠于末次免疫后3周摘除眼球取血，分離出血清-20℃貯存?zhèn)溆?。檢測各免疫組小鼠血清抑制hCG刺激MLTC-1細(xì)胞分泌孕酮的作用和拮抗hCG誘導(dǎo)未成年小鼠子宮發(fā)育的作用。
本發(fā)明實驗結(jié)果表明，1.經(jīng)酶切及測序證實構(gòu)建分泌型真核表達(dá)質(zhì)粒phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ正確。
2.脂質(zhì)體法介導(dǎo)各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞成功。phCMV1-signal-6His-hCGβ和phCMV1-signal-6His-hCGβ-C3d3陽性克隆無血清培養(yǎng)24、48、72小時重組蛋白的表達(dá)量分別為1225、1129、1325mIU/ml/1×106cells和496、527、633mIU/ml/106cells(以hCGβ含量計算)。pcDNA3-hCGβ和pcDNA3-hCGβ-C3d3陽性克隆無血清培液中24、48、72h hCGβ含量分別為703、762、828mIU/ml/106cells和327、395、443mIU/ml/1×106cells。phCMV1表達(dá)hCGβ的效率比pcDNA3高1.6倍，表達(dá)hCGβ-C3d3融合蛋白的效率比pcDNA3高1.4倍。反復(fù)3次凍存和復(fù)蘇高效表達(dá)hCGβ-C3d3融合蛋白的陽性克隆，復(fù)蘇細(xì)胞95％匯片后無血清培養(yǎng)48h，培液中hCGβ的表達(dá)量分別為679、665和672mIU/ml/1×106cells。；Western blotting結(jié)果顯示phCMV1-6His-hCGβ-C3d3在CHO細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物有三條帶，分子量分別為128KD、96KD和62KD左右。phCMV1-6His-hCGβ在CHO細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物為24KD左右。
.Raji細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示，phCMV1-6His-hCGβ-C3d3陽性克隆的培養(yǎng)上清都能使細(xì)胞膜呈陽性著色，phCMV1-6His-hCGβ和phCMV1陽性克隆的上清皆為陰性著色。
hCGβ蛋白用鎳柱在非變性條件下一步法純化獲得，純化產(chǎn)物具有較高的純度(8a)。phCMV1-6His-hCGβ-C3d3陽性克隆培清的鎳柱純化產(chǎn)物有3種，大小分別為128KD、96KD和62KD(8b)。根據(jù)分子量的差異，加用Sephadex G150 column進(jìn)行凝膠過濾層析分離出128KD的hCGβ-C3d3融合蛋白，該融合蛋白具有較高的純度(8c)。
3.hCGβ-C3d3融合蛋白于初次免疫后2周開始產(chǎn)生抗體，4周時達(dá)峰值(1∶251)。加強(qiáng)免疫后一周抗體水平迅速升高，峰值可達(dá)1∶12589，高滴度的抗體水平(1∶6309)可持續(xù)至加強(qiáng)免疫后10周。hCGβ單獨免疫組在加強(qiáng)免疫后才見抗體生成，抗體滴度分別比hCGβ-C3d3融合蛋白免疫組低1995倍，在加強(qiáng)免疫后第8周已檢測不出抗體水平。hCGβ+CFA/IFA于初次免疫后第3周檢測到抗體生成，其初次和再次免疫后的抗體效價分別比hCGβ-C3d3融合蛋白組低10倍和32倍。
C57BL/6小鼠初次和再次免疫后抗-hCGβ抗體生成的總體水平分別比BALB/c小鼠低2.5倍和4倍。初次免疫后只有hCGβ-C3d3融合蛋白免疫組可檢測到抗體生成。加強(qiáng)免疫后hCGβ-C3d3融合蛋白免疫組的抗體滴度高達(dá)1∶3162，比hCGβ單獨免疫組高1259倍。hCGβ+CFA/IFA初次和再次免疫后的抗體效價分別比hCGβ-C3d3融合蛋白免疫組低10倍和20倍。
4.hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ+CFA/IFA免疫組小鼠IL-4和IL-10分泌水平均顯著高于hCGβ免疫組(P＜0.05)，以hCGβ-C3d3融合蛋白最為明顯。以IL-4/IFNγ比值分析，hCGβ-C3d3融合蛋白免疫組為8.0，hCGβ+CFA/IFA免疫組為2.28，hCGβ免疫組為1.77。hCGβ-C3d3融合蛋白免疫動物顯示出明顯的Th2型優(yōu)勢效應(yīng)。
5.10IU的hCG刺激7h，1×105MLTC-1細(xì)胞可分泌孕酮560.33ng/ml。hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ+CFA/IFA免疫組小鼠產(chǎn)生的抗血清均能明顯抑制hCG刺激MLTC-1細(xì)胞分泌孕酮的作用(P＜0.05)，分別使孕酮分泌量下降到44.06ng/ml和102ng/ml，但兩組間的中和能力無顯著性差異(P＞0.05)。而單用hCGβ免疫產(chǎn)生的抗血清對hCG的生物學(xué)活性則幾乎沒有影響(P＞0.05)。
從原液至1∶400稀釋的hCGβ-C3d3抗血清和1∶200稀釋的hCGβ+CFA/IFA抗血清均可顯著抑制hCG誘導(dǎo)的小鼠子宮增重(P＜0.05)，hCGβ抗血清只能在1∶50稀釋時具有抑制作用(P＜0.05)。正常鼠血清對hCG誘導(dǎo)的小鼠子宮增重沒有拮抗作用。


圖1.phCMV1-6his-hCGβ構(gòu)建示意2.phCMV1-6his-hCGβ-C3d3構(gòu)建示意圖.
圖3酶切鑒定phCMV1-6His-hCGβ-C3d和phCMV1-6His-hCGβ圖4.陽性CHO克隆無血清培液中24、48和72h重組蛋白的表達(dá)量。(以hCGβ含量計算，mIU/ml/106cells)圖5.Western blotting分析phCMV1-6His-hCGβ-C3d3在CHO細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物圖6.Western blotting分析phCMV1-6His-hCGβ在CHO細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物圖7.Raji細(xì)胞免疫化學(xué)染色結(jié)果圖8.SDS-PAGE分析純化后的表達(dá)產(chǎn)物圖9.BALB/c小鼠初次和再次免疫后的hCGβ抗血清效價，↑所指為第二次免疫的時間。
圖10.C57BL/6小鼠初次和再次免疫后的hCGβ抗血清效價，↑所指為第二次免疫的時間圖11.各組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1型(IFNγ、IL-2)和Th2型(IL-4、IL-10)細(xì)胞因子表達(dá)水平(X±SD)，*表示與其它各組相比，P＜0.05。
圖12.各組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th2型/Th1型(IL-4/IFNγ)細(xì)胞因子表達(dá)水平。
圖13.正常鼠血清和hCGβ免疫鼠血清比較圖14.不同稀釋度免疫鼠血清對未成年小鼠子宮增重的拮抗作用具體實施方式
實施例1.構(gòu)建分泌型真核表達(dá)質(zhì)粒phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ。
phCMV1-signal-6His-hCGβ構(gòu)建策略(圖2)以帶有信號肽的hCGβ為模板，設(shè)計下列2對引物5’-CCAAGCTT ATG GAGATG TTC CAG GGG-3’，5’-CGGAATTC CCA ATG ATG ATG ATG ATG ATG TGC CCATGT CCC GCC CAT-3’和5’-CGGAATTC TCC AAG GAG CCGCTT CGG-3’，5‘-CGGGATCC TTG TGG GAG GAT CGG-3’。以pBS-hCGβ為模板，用第一對引物擴(kuò)增Hind III-Signal-6His-EcoR I片段。用第二對引物擴(kuò)增EcoR I-hCGβ(無信號肽及終止密碼子)-BamH I片段。用Hind III和EcoR I雙酶切Hind III-Signal-6His-EcoR I片段，用EcoR I和BamH I雙酶切EcoR I-hCGβ(無信號肽及終止密碼子)-BamH I片段。連接得到Hind III-Signal-6His-EcoR I-hCGβ(無信號肽及終止密碼子)-BamH I。用第一對引物的上游引物和第二對引物的下游引物擴(kuò)增片段Hind III-Signal-6His-EcoR I-hCGβ(無信號肽及終止密碼子)-BamH I。
Hind III和BamH I雙酶切片段Hind III-signal-6His-EcoR I-hCGβ(無信號肽及終止密碼子)-BamH I和pBS-hCGβ，連接得pBS-signal-6His-hCGβ。HindIII和Not I雙酶切phCMV1和pBS-signal-6His-hCGβ，連接得phCMV1-signal-6His-hCGβ。
phCMV1-signal-6His-hCGβ-C3d3構(gòu)建策略(圖2)Bgl II和Xba I雙酶切pSG5-C3d3，BamH I和Xba I雙酶切pBS-signal-6His-hCGβ，連接得PBS-signal-6His-hCGβ-C3d3。Hind III和Not I雙酶切phCMV1和pBS-signal-6His-hCGβ-C3d3，連接得phCMV1-signal-6His-hCGβ-C3d3。
實施例2 hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白的表達(dá)、鑒定與純化。
重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞、抗性克隆篩選及無血清培養(yǎng)待六孔板內(nèi)CHO細(xì)胞95％匯合成片時，用Lipofectamine2000分別介導(dǎo)phCMV1-6His-hCGβ-C3d3、phCMV1-6His-hCGβ、phCMV1、pcDNA3-hCGβ-C3d3和pcDNA3-hCGβ轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，質(zhì)粒和脂質(zhì)體用量為1μg∶7μg。轉(zhuǎn)染后24小時用含G418(800ug/ml)的完全培養(yǎng)基篩選陽性克隆。每3天換一次液，維持篩選8天，直至抗藥性細(xì)胞克隆形成。分別挑選10個phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ的陽性克隆，用含G418(300μg/ml)的培養(yǎng)液維持培養(yǎng)、擴(kuò)增，待陽性克隆95％匯合成片時換用CHO無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。
陽性細(xì)胞克隆培養(yǎng)上清中hCGβ含量測定收集培養(yǎng)24、48和72小時的無血清培養(yǎng)上清，5000g，4℃離心5min，取上清-20℃保存，放免法測定hCGβ含量，選取高效表達(dá)hCGβ-C3d3融合蛋白的陽性克隆。反復(fù)3次凍存和復(fù)蘇hCGβ-C3d3融合蛋白的高效表達(dá)克隆，間隔時間為1個月，檢測95％匯片后無血清培養(yǎng)48h培養(yǎng)上清中hCGβ的含量。
Western blotting鑒定表達(dá)產(chǎn)物收集高效表達(dá)重組蛋白的陽性克隆培養(yǎng)72h的無血清培養(yǎng)上清，5000g，4℃離心5min，取上清-20℃保存。凍干法濃縮20倍，PBS 4℃透析24小時，其間換PBS三次，棄沉淀，取透析后的上清液做Western blotting。一抗是小鼠抗人hCGβ單抗，二抗為偶聯(lián)HRP的兔抗小鼠IgG，用DAB底物顯色。
Raji細(xì)胞免疫化學(xué)染色鑒定hCGβ-C3d融合蛋白Raji細(xì)胞膜上具有豐富的CD21分子(C3d受體)，把Raji細(xì)胞分別與不同的表達(dá)產(chǎn)物共孵育，涂片固定后以小鼠抗人hCGβ為一抗，ABC法檢測hCGβ，當(dāng)hCGβ與C3d為融合蛋白時，才能使Raji細(xì)胞呈現(xiàn)陽性著色。收集phCMV1-6His-hCGβ-C3d3、phCMV1-6His-hCGβ和phCMV1陽性克隆24小時的無血清培養(yǎng)上清，5000g，4℃離心5min。各取150ul分別與Raji細(xì)胞37℃孵育1小時，然后涂布在包被有多聚賴氨酸的載玻片上，4％多聚甲醛固定20分鐘。一抗為以小鼠抗人hCGβ單抗，用anti-mouse IgG ABC試劑盒檢測。
分離、純化hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白hCGβ蛋白采用ProBond 6hisresin在非變性條件下一步法純化獲得。步驟如下收集含hCGβ的無血清培液，5000g，4℃離心5min。凍干法濃縮10倍后PBS 4℃透析24小時，取透析后的上清上柱。按照ProBond 6his resin說明書采用非變性條件進(jìn)行純化，最后用含250mM咪唑的洗脫液洗脫目的蛋白，洗脫液用含2mMTris，20mM NaCl，0.1％glycine，and 10nM EDTA的溶液透析去除咪唑和鎳離子。根據(jù)Western blotting的結(jié)果，phCMV1-6His-hCGβ-C3d3的表達(dá)產(chǎn)物在用鎳柱純化的基礎(chǔ)上，加用Sephadex G150 column進(jìn)行了凝膠過濾層析以分離出高分子量的hCGβ-C3d3融合蛋白。凝膠過濾層析按照Pharmacia公司提供的操作在4℃進(jìn)行。用TM緩沖液+0.1mol/L KCl洗滌、膨脹G150膠后均勻、無氣泡裝柱、壓柱，用相同的緩沖液平衡凝膠層析柱后上樣，用含0.05M磷酸鈉和0.15M氯化鈉的溶液(PH7.0)洗脫，流速為19cm/h(0.25ml/min)。分部收集洗脫液，每管500ul，分光光度計A280跟蹤洗脫蛋白峰。合并含有128KD的主峰蛋白溶液并用PBS 4℃透析過夜，取透析上清-20℃貯存。
實施例3.動物免疫和免疫效應(yīng)免疫方法6～8周齡BALB/c小鼠(19～24g)和C57BL/6小鼠(20～25g)，各分為3組，每組5只。分別用hCGβ-C3d3融合蛋白、單用hCGβ和hCGβ加用弗氏佐劑免疫。于右側(cè)背部皮下注射免疫，共免疫兩次，間隔4周。免疫劑量分別為50pmol hCGβ-C3d3融合蛋白/100μl PBS，50pmol hCGβ/100μl PBS和50pmolhCGβ/50μl PBS+50μl CFA形成的完全乳劑。其中hCGβ+CFA免疫組再次免疫時換用hCGβ+IFA免疫。
第一次注射后7天開始采血，每周一次，共4次。第二次注射后7天開始采血，每周一次，共3次。于小鼠眼眶后靜脈叢采血，每次采血100～150μl，分離出血清20～25μl，-20℃貯存?zhèn)溆谩?br> 用間接ELISA法測定。以純化hCG抗原包被96孔酶標(biāo)板，每孔0.5μg。封閉后加入系列稀釋(指數(shù)級稀釋)的抗血清37℃孵育1h。PBS洗3次后加入偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP)的羊抗小鼠IgG(H+L)，37℃孵育30min，用H2O2-TMB系統(tǒng)顯色。于450nm測定樣品OD值?？寡遄罡呦♂尪瘸赎栃哉?樣品OD值/PBS陰性對照OD值＞2.0)，其稀釋度的倒數(shù)即為抗血清效價。
于加強(qiáng)免疫后第3周，分別隨機(jī)選取3只hCGβ-C3d3融合蛋白、單用hCGβ和hCGβ加用弗氏佐劑免疫的BALB/c小鼠。摘除眼球取血，分離出血清-20℃貯存?zhèn)溆?用于下一步抗血清特性的研究)。其余小鼠繼續(xù)監(jiān)測抗體水平至加強(qiáng)免疫后第10周。
實施例4.hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗介導(dǎo)免疫動物Th2型優(yōu)勢效應(yīng)制備脾淋巴細(xì)胞懸液hCGβ-C3d3融合蛋白、單用hCGβ和hCGβ加用弗氏完全佐劑免疫的BALB/c小鼠于末次免疫后3周脫頸處死，無菌摘取脾臟，用10ml注射器針芯研磨，過400目尼龍網(wǎng)富集單個細(xì)胞。1500rpm離心3分鐘，去上清，每個脾臟加入5ml紅細(xì)胞裂解液(ACK)裂解紅細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞兩次。用RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度為1×107/ml。在24孔板中按2×106/50ul/孔加入脾細(xì)胞，然后在每孔中加入hCG抗原至終濃度100IU/ml，培養(yǎng)48h后用ELISA法檢測培養(yǎng)上清中IFNγ、IL-2、IL-4和IL-10的分泌水平。
培養(yǎng)上清中IFNγ、IL-2、IL-4和IL-10的測定將50μl培養(yǎng)上清加入到96孔酶標(biāo)板，室溫孵育2h，洗板5次。加入100μlHRP標(biāo)記的抗小鼠細(xì)胞因子抗體，室溫孵育2h，洗板5次。每孔加入100μl底物溶液，室溫避光孵育30min后加入100μl終止液終止反應(yīng)，于450nm波長測OD值。
實施例5.hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗的抗生育潛能分析抗血清制備hCGβ-C3d3融合蛋白、單用hCGβ和hCGβ加用弗氏完全佐劑免疫的BALB/c小鼠于末次免疫后3周摘除眼球取血，分離出血清-20℃貯存?zhèn)溆谩？寡迨褂们跋冉?jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。
hCGβ-C3d3免疫鼠血清拮抗hCG刺激MLTC-1細(xì)胞分泌孕酮的作用MLTC-1是一個小鼠睪丸間質(zhì)Leydig腫瘤細(xì)胞系，其表面有hCG的受體，此受體結(jié)構(gòu)與正常小鼠的Leydig細(xì)胞一致。在hCG作用下，MLTC-1細(xì)胞能分泌孕酮。為了檢測hCGβ-C3d3融合蛋白免疫BALB/c小鼠產(chǎn)生的抗血清是否具有中和hCG生物學(xué)活性的能力，在12孔板內(nèi)每孔傳入1×105MLTC-1細(xì)胞，用1ml含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)。同時加入10IU hCG和100μl的正常鼠血清、hCGβ-C3d3抗血清、hCGβ抗血清和hCGβ+CFA/IFA抗血清共培養(yǎng)，7小時后取培養(yǎng)上清檢測孕酮含量。
hCGβ-C3d3免疫鼠血清對hCG誘導(dǎo)小鼠子宮增重的抑制效應(yīng)3周齡雌性BALB/c小鼠，隨機(jī)分為3個大組，每大組內(nèi)小鼠再隨機(jī)分為7個小組，每小組5只。均給予皮下注射hCG 4IU，同時腹腔內(nèi)分別注射系列稀釋的正常鼠血清、hCGβ-C3d3免疫鼠血清、hCGβ免疫鼠血清和hCGβ+CFA/IFA免疫鼠血清，注射劑量為100μl。每天注射兩次，間隔8h，連續(xù)注射3d，第4d上午脫頸法處死小鼠，取子宮稱濕重，計算每克體重的子宮濕重(mg/g)。
本發(fā)明結(jié)果顯示無論是BALB/c小鼠還是C57BL/6小鼠，hCGβ-C3d3融合蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生抗hCGβ抗體的出現(xiàn)時間都明顯早于hCGβ+CFA/IFA免疫和hCGβ單獨免疫組。在BALB/c小鼠，初次和再次免疫結(jié)果顯示，C3d3使hCGβ的免疫原性增強(qiáng)了1995倍。與hCGβ-C3d3基因疫苗相比，hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗的免疫原性有了明顯的提高。C3d3使hCGβ的免疫原性增強(qiáng)了1259倍。表明在個體差異很大的不同品系小鼠，C3d3均能增強(qiáng)機(jī)體對hCGβ的體液免疫應(yīng)答能力。為解決hCGβ避孕疫苗免疫效果在個體之間的差異提供了理論依據(jù)。
檢測受試鼠脾細(xì)胞在體外hCG抗原再次刺激下分泌Th1型(IFNγ、IL-2)和Th2型(IL-4、IL-10)細(xì)胞因子結(jié)果表明，hCGβ-C3d3融合蛋白免疫鼠脾細(xì)胞IL-4和IL-10分泌水平明顯高于hCGβ免疫鼠，以IL-4最明顯。從IL-4與IFNγ的比值分析，hCGβ-C3d3融合蛋白免疫動物顯示出明顯的Th2型優(yōu)勢效應(yīng)。表明分子佐劑C3d3是通過誘導(dǎo)Th2型細(xì)胞因子優(yōu)勢表達(dá)來實現(xiàn)其增強(qiáng)hCGβ蛋白抗原體液免疫效力。
本發(fā)明結(jié)果還顯示，hCGβ-C3d3融合蛋白免疫鼠血清具有很強(qiáng)的中和hCG生物學(xué)活性的作用，能明顯抑制hCG刺激MLTC-1細(xì)胞分泌孕酮的作用，也能有效拮抗hCG誘導(dǎo)的小鼠子宮增重作用。表明hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗具有較強(qiáng)的抗生育潛能。
本發(fā)明結(jié)果顯示，對于hCGβ抗原而言，C3d3的佐劑能力強(qiáng)于弗氏佐劑。加之C3d是體內(nèi)補(bǔ)體C3自身的一個裂解產(chǎn)物，克服了弗氏佐劑中的石蠟油對機(jī)體有毒性，和引起注射部位局部組織的潰爛和壞死的危險，是完全適合人類應(yīng)用的新型分子佐劑。
權(quán)利要求
1.一種攜分子佐劑的融合蛋白避孕疫苗，其特征在于將分子佐劑C3d3與hCGβ通過基因克隆構(gòu)建入真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV1制成，包括下述步驟1)構(gòu)建分泌型真核表達(dá)質(zhì)粒phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ，2)表達(dá)、鑒定與純化hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白，3)檢測hCGβ-C3d3融合蛋白免疫小鼠的體液免疫效應(yīng)及抗血清特性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的攜分子佐劑的融合蛋白避孕疫苗，其特征在于所述的融合蛋白在氨基端加上6個組氨酸純化標(biāo)簽。
全文摘要
本發(fā)明屬生物制藥領(lǐng)域，涉及一種與分子佐劑交聯(lián)的避孕疫苗，具體涉及一種與分子佐劑C3d3交聯(lián)的hCGβ－C3d3融合蛋白避孕疫苗。本發(fā)明選用真核表達(dá)載體phCMV1，分別構(gòu)建帶有6個組氨酸純化標(biāo)簽的hCGβ－C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒phCMV1－6His－h(huán)CGβ－C3d3和phCMV1－6His－h(huán)CGβ。在體外表達(dá)、鑒定、純化出hCGβ－C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白。分別加用弗氏佐劑免疫不同品系小鼠。經(jīng)檢測抗體水平、抗血清中和hCG生物學(xué)活性的能力和脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的水平，證實hCGβ－C3d3融合蛋白疫苗具有較強(qiáng)的抗生育潛能作用。
文檔編號A61K39/39GK1569227SQ20041001803
公開日2005年1月26日 申請日期2004年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月29日
發(fā)明者李大金, 王秀麗 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院