專利名稱：一種抑制冠狀病毒的多肽及其衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抑制病毒的多肽及其衍生物。
背景技術(shù)：
SARS冠狀病毒是傳染性非典型肺炎的主要致病病毒，有很強(qiáng)的傳染性，造成嚴(yán)重的社會(huì)危害。目前國家食品和藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的抗SARS藥物僅有干擾素“重組人干擾素α-2b噴霧劑”和“重組人干擾素ω噴鼻劑”，化學(xué)藥品“注射用西維來司鈉”和“注射用烏司他丁”等少數(shù)幾個(gè)藥物，“蓮花清瘟膠囊”和“復(fù)方鱉甲軟肝片”等中藥品種正處在臨床研究中。這些藥有的是用于高危人群的預(yù)防，有的是廣譜抗病毒和提高免疫力的輔助藥物，目前尚沒有直接抑制SARS冠狀病毒的特效藥，由SARS冠狀病毒引起的非典型肺炎仍然處于無藥可醫(yī)的狀態(tài)。由于傳染性非典型性肺炎對(duì)人類健康和社會(huì)的巨大危害，應(yīng)用基因組學(xué)、蛋白組學(xué)和藥物設(shè)計(jì)的原理，發(fā)展直接針對(duì)SARS冠狀病毒的特效藥物，有重大的現(xiàn)實(shí)意義、經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抑制冠狀病毒的多肽；本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種抑制冠狀病毒的多肽在制備抗冠狀病毒藥物中的應(yīng)用；本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種抑制冠狀病毒的多肽衍生物；本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種抑制冠狀病毒的多肽衍生物在制備抗冠狀病毒藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種抑制冠狀病毒的多肽，它的氨基酸組成為X-纈氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-絲氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-Z。該多肽的單字母表達(dá)式為X-VLQSGFR-Z，三字母表達(dá)式為X-Val-Leu-Gln-Ser-Gly-Phe-Arg-Z。
所述X為1至10之任意個(gè)氨基酸，或者是氨基，或者是羧基。
所述Z為1至10之任意個(gè)氨基酸，或者是氨基，或者是羧基。
將該多肽命名為Wogu(Wei-Chou-Gan-Du)多肽。
一種抑制冠狀病毒的多肽，在制備抗冠狀病毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的一種抑制冠狀病毒的多肽可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法，與一種或多種載體混合，制成所需的制劑，根據(jù)患者的年齡、體重等因素進(jìn)行一次或多次施用。
一種抑制冠狀病毒的多肽衍生物，它由下述化學(xué)表達(dá)式所示 所述X為1至10之任意個(gè)氨基酸，或者是氨基，或者是羧基。
所述Z為1至10之任意個(gè)氨基酸，或者是氨基，或者是羧基。
一種抑制冠狀病毒的多肽衍生物，在制備抗冠狀病毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的一種抑制冠狀病毒的多肽衍生物，可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法，與一種或多種載體混合，制成所需的制劑，根據(jù)患者的年齡、體重等因素進(jìn)行一次或多次施用。
本發(fā)明的效果①本發(fā)明的一種抑制冠狀病毒的多肽即Wogu多肽，對(duì)病毒有一定的抑制作用，其半數(shù)有效濃度為2.7×10-5mg/ml，可以制備抗病毒藥物。
②本發(fā)明的一種抑制冠狀病毒的多肽即Wogu多肽經(jīng)化學(xué)修飾后成為衍生物，可成為SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制劑和抗非典型肺炎的藥物。
③本發(fā)明的一種抑制冠狀病毒的多肽即Wogu多肽經(jīng)化學(xué)修飾后成為衍生物，可成為其它冠狀病毒的抑制劑。


圖1為SARS冠狀病毒主蛋白酶與一種抑制冠狀病毒多肽對(duì)接圖示；圖2A、B為SARS冠狀病毒主蛋白酶與一種抑制冠狀病毒多肽氫鍵相互作用的不同角度的透視圖；圖3 Wogu多肽的7個(gè)aa的氨基酸序列(SEQ ID No.1)
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地說明實(shí)施例1一種抑制冠狀病毒的多肽，它的氨基酸組成為X-纈氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-絲氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-Z，其中X為氨基，Z為羧基。用多肽合成儀按常規(guī)方法合成，合成從羧基端開始向氨基端延伸。
實(shí)施例2一種抑制冠狀病毒的多肽，它的氨基酸組成為X-纈氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-絲氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-Z，其中X為羧基，Z為氨基。用多肽合成儀按常規(guī)方法合成，合成從羧基端開始向氨基端延伸。
實(shí)施例3一種抑制冠狀病毒的多肽，它的氨基酸組成為X-纈氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-絲氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-Z，其中X為丙氨酸，Z為氨基。用多肽合成儀按常規(guī)方法合成，合成從羧基端開始向氨基端延伸。
實(shí)施例4一種抑制冠狀病毒的多肽，它的氨基酸組成為X-纈氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-絲氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-Z，其中X為甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-酪氨酸-甘氨酸-丙氨酸-絲氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-丙氨酸，Z為甘氨酸。用多肽合成儀按常規(guī)方法合成，合成從羧基端開始向氨基端延伸。
實(shí)施例5一種抑制冠狀病毒的多肽，它的氨基酸組成為X-纈氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-絲氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-Z，其中X為甘氨酸-丙氨酸，Z為甘氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸-甘氨酸-丙氨酸-絲氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-甘氨酸。用多肽合成儀按常規(guī)方法合成，合成從羧基端開始向氨基端延伸。
實(shí)施例6一種抑制冠狀病毒的多肽，它的氨基酸組成為X-纈氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-絲氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-Z，其中X為甘氨酸，Z為甘氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸-甘氨酸。用多肽合成儀按常規(guī)方法合成，合成從羧基端開始向氨基端延伸。
實(shí)施例7一種抑制冠狀病毒的多肽，它的氨基酸組成為X-纈氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-絲氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-Z，其中X丙氨酸-絲氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-丙氨酸，Z為甘氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸-甘氨酸。用多肽合成儀按常規(guī)方法合成，合成從羧基端開始向氨基端延伸。
實(shí)施例8一種抑制冠狀病毒的多肽衍生物，其中X為氨基，Z為羧基。用多肽合成儀按常規(guī)方法合成，合成從羧基端開始向氨基端延伸。
由Wogu多肽至多肽衍生物的修飾方案如下 一種抑制冠狀病毒的多肽及其衍生物在制備抗冠狀病毒藥物中的應(yīng)用，可以按常規(guī)方法制成針劑、片劑及膠囊劑等。
根據(jù)SARS冠狀病毒主蛋白酶(SARS CoV Mpro)分子的三維結(jié)構(gòu)和多肽類藥物設(shè)計(jì)的“變形的鑰匙”理論，設(shè)計(jì)和合成了一種對(duì)SARS冠狀病毒主蛋白酶有抑制作用，能阻斷SARS冠狀病毒復(fù)制的多肽X-VLQSGFR-Z(X-纈氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-絲氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-Z)；該多肽經(jīng)化學(xué)修飾后形成衍生物，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明對(duì)SARS冠狀病毒有抑制作用，并能成為SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制劑和抗非典型肺炎的藥物，而且對(duì)其它冠狀病毒的有一定抑制作用。
1.SARS冠狀病毒主蛋白酶活性區(qū)域的確定本發(fā)明的第一步是確定SARS冠狀病毒主蛋白酶的催化活性區(qū)域。Anand等首先建立了SARS冠狀病毒主蛋白酶的同源模型(K.Anand，J.Ziebuhr，P.Wadhwani，J.R.Mesters，R.Hilgenfeld.Coronavirus main proteinase[3CLpro]structurebasis for design of anti-SARS drugs.Science 2003，300，1763-1767)。清華大學(xué)的饒子和研究小組從中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院發(fā)現(xiàn)的編號(hào)為BJ01的毒株中克隆了SARS冠狀病毒的主蛋白酶基因，并通過遺傳工程手段在大腸桿菌中獲得了蛋白酶的高效、穩(wěn)定表達(dá)，經(jīng)過進(jìn)一步的分離、純化和結(jié)晶，收集了高分辨率的衍射數(shù)據(jù)，測定了該酶在四種不同條件下的三維空間結(jié)構(gòu)，并詳細(xì)闡述了該酶在底物結(jié)合區(qū)域的精確構(gòu)象，進(jìn)而通過解析該酶與抑制劑形成的復(fù)合物的三維空間結(jié)構(gòu)，揭示了該酶與底物結(jié)合的精確模式(H.Yang，M.Yang，Y.Ding，Y.Liu，Z.Lou，Z.Zhou，L.Sun，L.Mo，S.Ye，H.Pang，G.F.Gao，K.Anand，M.Bartlam，R.Hilgenfeld，Z.Rao.The crystal structures ofsevere acute respiratory syndrome virus main protease and its complex with an inhibitor.Proc.Natl.Acad Sci.USA.2003，100，13190-13195)。由于SARS冠狀病毒主蛋白酶的功能是切割病毒編碼的多聚蛋白質(zhì)，在病毒的復(fù)制周期中起著關(guān)鍵的作用，對(duì)病毒的生物特性有重要意義，因此SARS冠狀病毒主蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)成為以分子結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的直接藥物設(shè)計(jì)的首選靶標(biāo)。
SARS冠狀病毒主蛋白酶包括304個(gè)氨基酸，折疊成三個(gè)結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域1為氨基酸殘基8-99，結(jié)構(gòu)域2為氨基酸殘基100-193，結(jié)構(gòu)域3為氨基酸殘基184-199，蛋白酶與多肽結(jié)合的活性區(qū)域位于結(jié)構(gòu)域1和結(jié)構(gòu)域2之間的口袋狀部位，我們的分子動(dòng)力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)，催化活性區(qū)由23個(gè)氨基酸殘基組成，它們是Cys-22、Gly-23、Thr-24、Thr-25、Leu-27、His-41、Val-42、Cys-44、Thr-45、Ala-46、Glu-47、Asp-48、Met-49、Leu-50、Asn-51、Pro-52、Tyr-54、Cys-145、His-164、Met-165、Asp-187、Arg-188、Gln-189。
2.分子動(dòng)力學(xué)對(duì)接的計(jì)算機(jī)模擬SARS冠狀病毒主蛋白酶與Wogu多肽VLQSGFR對(duì)接的計(jì)算機(jī)模擬是用藥物設(shè)計(jì)軟件包MOE(Molecular Operate Environment，Chemical Comuting Ltd.)完成的。水解酶切割多肽或蛋白質(zhì)的催化敏感部位通常由可容納8個(gè)氨基酸的8個(gè)位點(diǎn)組成，按慣例，8個(gè)氨基酸殘基記作P4、P3、P2、P1、P1′、P2′、P3′、P4′，并且切割點(diǎn)在位點(diǎn)P1和P1′之間，標(biāo)記為P1↓P1′(K.-C.Chou.Review prediction of human immunodeficiency virus protease cleavagesites in proteins，Analy.Biochem.1996，233，1-14；G.E.Schulz，R.H.Schirmer.Principles ofProtein Structure，Chap.2，pp.17-18，Springer-Verlag，New York，1985)。盡管偶爾有的水解酶的活性部位可容納7-9個(gè)氨基酸，但8個(gè)氨基酸是最普遍的情況。我們的研究僅限于七肽的可分割性。
3.SARS冠狀病毒主蛋白酶與Wogu多肽的結(jié)合機(jī)制Wogu多肽緊密地結(jié)合在蛋白酶的結(jié)構(gòu)域1和2之間的口袋狀部位，通過6個(gè)氫鍵緊密地結(jié)合在SARS冠狀病毒主蛋白酶的催化活性區(qū)域，如果把多肽P1位的氨基酸殘基Q(谷氨酰胺)用E(谷氨酸)取代，主蛋白酶與多肽之間的氫鍵減少到3個(gè)，使結(jié)合力大大降低。SARS冠狀病毒主蛋白酶和其它冠狀病毒的主蛋白酶的剪切點(diǎn)有明顯的專一性，P1位點(diǎn)只能為Gln占據(jù)，P1′位點(diǎn)可以是Ser或其它氨基酸殘基，表達(dá)為Gln↓(Ser，Ala和Gly)。計(jì)算機(jī)模擬證實(shí)了SARS冠狀病毒主蛋白酶與多肽的結(jié)合機(jī)制和剪切點(diǎn)的專一性。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步支持了Anand(K.Anand，J.Ziebuhr，P.Wadhwani，J.R.Mesters，R.Hilgenfeld.Coronavirus main proteinase[3CLpro]structurebasis for design of anti-SARS drugs.Science 2003，300，1763-1767)關(guān)于八肽中P1位置的Gln對(duì)SARS冠狀病毒主蛋白酶的特異性起關(guān)鍵作用的說法，也為多肽的化學(xué)修飾指出了方向。
4.“扭曲的鑰匙”模型與Wogu多肽的化學(xué)修飾的分析根據(jù)酶學(xué)中“鑰匙和鎖”的關(guān)系，從SARS冠狀病毒主蛋白酶變異出來的多肽必須和活性位點(diǎn)有著很好的結(jié)合。然而，如果一個(gè)多肽用一些常規(guī)的方法把易斷裂的鍵修飾后，會(huì)完全失去它的可劈開性，但它仍然能夠和活性位點(diǎn)相結(jié)合。實(shí)際上，這種方法修飾的分子類似與“扭曲的鑰匙”，它能夠插入鎖的孔中，但既不能打開鎖也不能把鑰匙拔出來，這自然就是一個(gè)理想的有競爭力的抗SARS蛋白酶的抑制劑。因此研究從酶本身分離出來的多肽和SARS蛋白酶的結(jié)合機(jī)理會(huì)給我們的藥物設(shè)計(jì)提供有用的信息。圖1所示的是Wogu多肽(實(shí)施例3)的化學(xué)修飾方案之一。
5.Wogu多肽AVLQSGFR的化學(xué)合成，用多肽合成儀按常規(guī)方法合成，合成從羧基端開始向氨基端延伸。
實(shí)驗(yàn)例1 Wogu多肽AVLQSGFR對(duì)非洲綠猴腎傳代細(xì)胞(VERO)的毒性實(shí)驗(yàn)按一定比例稀釋W(xué)ogu多肽，共9個(gè)稀釋度，加到含有VERO細(xì)胞的96孔板中，每孔的培養(yǎng)液為100μl，多肽的終濃度為0.1mg/ml～7mg/ml，37℃下5％CO2培養(yǎng)48小時(shí)，每孔加20μl MTS/PMS，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)，加50μl 10％SDS，檢測OD490，以不加七肽的VERO細(xì)胞為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)樣品的OD490值大于對(duì)照細(xì)胞值的90％作為無毒性指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果是實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的OD490值為1.87～2.06，對(duì)照細(xì)胞的OD490值為2.01，其比值均大于0.9，表明Wogu多肽對(duì)VERO細(xì)胞沒有毒性。
實(shí)驗(yàn)例2 Wogu多肽AVLQSGFR對(duì)SARS病毒的抑制作用在96孔板中每孔接種10000個(gè)VERO細(xì)胞，培養(yǎng)液體積為100μl，37℃下5％CO2培養(yǎng)24小時(shí)，加入不同濃度的多肽(同實(shí)施例1)，每孔加入2μl SARS-BJ-01病毒，繼續(xù)培養(yǎng)24～96小時(shí)，設(shè)置無細(xì)胞對(duì)照、細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照，當(dāng)病毒對(duì)照組中細(xì)胞大量死亡時(shí)，測定OD490值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果是實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的OD490值為1.01～1.72，對(duì)照細(xì)胞的OD490值為2.11，其比值均小于0.9，表明該肽對(duì)SARS-BJ-01病毒的感染有一定的抑制作用。
實(shí)驗(yàn)例3 Wogu多肽AVLQSGFR和其它藥物對(duì)SARS病毒抑制作用的比較按上述方法，對(duì)Wogu多肽AVLQSGFR和其它5種病毒抑制劑對(duì)SARS-BJ-01病毒的抑制效果進(jìn)行了測定，結(jié)果見下表。表中結(jié)果表明Wogu多肽的半數(shù)有效濃度最低(2.7×10-5mg/ml)，選擇性最好。
5種藥物對(duì)SARS-BJ-01病毒的抑制作用藥物 半數(shù)有效濃度(mg/ml)選擇系數(shù)Wogu多肽 2.7×10-5＞37046-氮尿嘧啶核苷 16.86吡唑呋喃菌素 4.2 12霉酚酸 ＞50不可計(jì)算三氮唑核苷 ＞1000 不可計(jì)算甘草皂苷 300 ＞6權(quán)利要求
1.一種抑制冠狀病毒的多肽，其特征在于它的氨基酸組成為X-纈氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-絲氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-Z，所述纈氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-絲氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸用序列表SEQ ID No1表示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抑制冠狀病毒的多肽，所述X為1至10之任意個(gè)氨基酸，或者是氨基，或者是羧基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抑制冠狀病毒的多肽，所述Z為1至10之任意個(gè)氨基酸，或者是氨基，或者是羧基。
4.權(quán)利要求1至3之一的一種抑制冠狀病毒的多肽，在制備抗冠狀病毒藥物中的應(yīng)用。
5.一種抑制冠狀病毒的多肽衍生物，其特征在于它由下述化學(xué)表達(dá)式所示
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種抑制冠狀病毒的多肽衍生物，所述X為1至10之任意個(gè)氨基酸，或者是氨基，或者是羧基。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種抑制冠狀病毒的多肽衍生物，所述Z為1至10之任意個(gè)氨基酸，或者是氨基，或者是羧基。
8.權(quán)利要求5至7之一的一種抑制冠狀病毒的多肽衍生物，在制備抗冠狀病毒藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制冠狀病毒的多肽及其衍生物，多肽的氨基酸組成為X－纈氨酸－亮氨酸－谷氨酰胺－絲氨酸－甘氨酸－苯丙氨酸－精氨酸－Z，實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的一種抑制冠狀病毒的多肽及其衍生物，對(duì)非洲綠猴腎傳代細(xì)胞沒有毒性，對(duì)冠狀病毒有一定的抑制作用，其半數(shù)有效濃度較低，為2.7×10
文檔編號(hào)A61P11/00GK1560074SQ200410018679
公開日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2004年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月23日
發(fā)明者魏冬青, 周國城, 甘一如, 杜奇石 申請(qǐng)人:天津師范大學(xué), 天津大學(xué)