專利名稱：人溶菌酶在制備治療傷口感染不愈潰爛的藥物中的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組人溶菌酶的用途，特別是重組人溶菌酶在制藥領(lǐng)域中在制備治療傷口感染不愈潰爛的藥物中的新用途。
背景技術(shù)：
抗生素創(chuàng)造了許多醫(yī)學(xué)奇跡，使許多疾病消失無蹤，如肺炎、腦膜炎、產(chǎn)褥熱、敗血癥、結(jié)核等。21世紀(jì)的今天，耐藥菌的發(fā)展令人觸目驚心。如耐青霉素的肺炎鏈球菌，過去對青霉素、紅霉素、磺胺等藥品都很敏感，現(xiàn)在幾乎“刀槍不入”。肺炎克雷伯氏菌對西力欣、復(fù)達(dá)欣等16種高檔抗生素的耐藥性高達(dá)51.85％-100％。由燒、燙傷和糖尿病晚期末梢微循環(huán)不暢傷口不愈合，艾滋病導(dǎo)致的人類免疫缺陷傷口不愈引起的金黃色葡萄球菌(MRSA)感染傷口潰爛除萬古霉素外已經(jīng)無藥可治，而銅綠假單孢菌在臨床上也基本無藥可治。從細(xì)菌的耐藥發(fā)展史可以看出，在某種新的抗生素出現(xiàn)以后，就有一批耐藥菌株出現(xiàn)。開發(fā)一種新的抗生素一般需要10年左右的時(shí)間，而一代耐藥菌的產(chǎn)生只要2年的時(shí)間，抗生素的研制速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)趕不上耐藥菌的發(fā)展速度。目前急需開發(fā)一種針對不同耐藥菌株均有效的不產(chǎn)生耐藥性的新型“超級抗生素”用于臨床治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基因重組人溶菌酶在燒、燙傷和糖尿病及艾滋病導(dǎo)致傷口不愈合引起的感染傷口潰爛的藥物中的新用途，能有效針對耐藥菌株、不產(chǎn)生耐藥性。
實(shí)際上，本發(fā)明涉及人溶菌酶在制備治療由燒、燙傷導(dǎo)致傷口不愈合引起的傷口感染潰爛的藥物中的應(yīng)用。
涉及人溶菌酶在制備治療由糖尿病晚期末梢微循環(huán)不暢傷口不愈合引起的傷口感染潰爛的藥物中的應(yīng)用。
涉及人溶菌酶在制備治療由艾滋病導(dǎo)致的人類免疫缺陷傷口不愈合引起的傷口感染潰爛的藥物中的應(yīng)用。
所述人溶菌酶為基因工程表達(dá)的重組人溶菌酶、基因工程表達(dá)人溶菌酶的氨基端帶有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修飾的人溶菌酶、基因工程表達(dá)或化學(xué)合成突變體重組人溶菌酶。
所述藥物中含有活性300U～300萬U/mL人溶菌酶。藥物制劑為噴霧劑、滴劑、奶液、乳劑或霜劑。
重組人溶菌酶它是一種有效的抗菌劑，全稱為1，4-β-N-溶菌酶或者稱粘肽N-乙?；邗Ｋ饷?。它能切斷細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4糖苷鍵的聯(lián)結(jié)，破壞肽聚糖支架，細(xì)菌在內(nèi)部滲透壓的作用下細(xì)胞脹裂開，引起細(xì)菌裂解。人和動物細(xì)胞無細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)亦無肽聚糖，故溶菌酶對人體細(xì)胞無毒性作用。溶菌酶除可以直接裂解細(xì)菌，還可以作為免疫調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的作用，保護(hù)炎癥部位的正常組織，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中起負(fù)反饋?zhàn)饔?Leo IG，et al.J.Clin.Invist.1979；64222)。它可能通過與多形核粒細(xì)胞膜表面的多糖部分結(jié)合，抑制多形核粒細(xì)胞向炎癥部位移動，并可衰減炎癥部位由多形核粒細(xì)胞所產(chǎn)生的超氧化物的作用，保護(hù)機(jī)體在炎癥反應(yīng)時(shí)由于免疫應(yīng)答過度而發(fā)生的組織損傷。
本發(fā)明對基因重組人溶菌酶發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。安全無毒副作用，有很好的藥用前景。并且基因重組人溶菌酶來源豐富，制備工藝簡單，使用方便。
為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面將用基因重組人溶菌酶的藥理試驗(yàn)及結(jié)果來說明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。
基因重組人溶菌酶以配制200毫升培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，用H3PO44-8毫升、MgSO41-5克，K2SO42-6克，KOH1-3克，CaSO42H2O1-3.5克，加蒸餾水至200毫升，高壓滅菌后接種甘油管種子，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為每分鐘250轉(zhuǎn)，培養(yǎng)溫度為20-35℃，在恒溫床上培養(yǎng)36-48小時(shí)。進(jìn)行種子罐培養(yǎng)后進(jìn)行生產(chǎn)罐培養(yǎng)。將發(fā)酵表達(dá)完成的培養(yǎng)液進(jìn)行提取純化，對提取純化的蛋白濃縮液冰凍干燥，測定蛋白量、純度和溶菌酶活性保存。將合格的基因重組人溶菌酶凍干粉溶于水中制得噴霧劑、滴劑30000U/ml備用；制得膏(霜)劑30000U/g備用。
一、對鼠的模型試驗(yàn)A、人溶菌酶對大鼠的熱照射所致鎮(zhèn)痛模型的制備選用SD健康大鼠50只，120-150克，雌雄各半，在熱照射下10秒鐘內(nèi)反應(yīng)的大鼠，隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半。設(shè)空白對照組、30000U/ml人溶菌酶三個(gè)劑量組(120、60、30IU/只)、雞溶菌酶(陽性對照)30IU/，均尾部涂藥。涂藥前和涂藥后0.5-4小時(shí)測每只大鼠的疼痛反應(yīng)(甩尾)時(shí)間，若痛閾升高到照射30秒鐘不甩尾時(shí)即中斷照射，以免損傷皮膚與起泡，并以30秒計(jì)算。試驗(yàn)重復(fù)一次。試驗(yàn)結(jié)果見表17-21。大鼠尾巴涂抹人溶菌酶30、60、120IU/只，使動物在涂藥后0.5-3小時(shí)內(nèi)熱刺激照射下痛閾值明顯提高，結(jié)果表明人溶菌酶具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。
表17-21(A)人溶菌酶外涂對大鼠的鎮(zhèn)痛作用(甩尾法)(第一次試驗(yàn)結(jié)果)疼痛反應(yīng)時(shí)間(秒，X±SD)組別 劑量 動物數(shù)(IU/只)(只) 0 0.5 1 2 3 4(h)空白 - 10 5.25.7 6.4 6.4 6.8 10.3對照 ±1.69±2.16 ±2.46 ±3.34 ±3.91±5.33雞溶 30 10 5.5 11.4**14.0**14.7**15.2**12.7**菌酶 ±1.72±4.5±6.93 ±7.67 ±7.45±6.99人溶 120 10 5.3 13.6**15.2**13.4**15.4**14.9菌酶 ±1.77±6.98 ±7.42 ±6.38 ±6.62±6.54人溶 60 10 5.39.8*12.9**12.7*13.5*12.4菌酶 ±1.89±4.05 ±6.69 ±6.9±6.72±6.65人溶 30 10 5.28.6*12.4*10.9 11.7 10.1菌酶 ±1.93±2.67 ±7.49 ±7.09 ±6.89±7.5注經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表17-21(B)人溶菌酶外涂對大鼠的鎮(zhèn)痛作用(甩尾法)(第二次試驗(yàn)結(jié)果)疼痛反應(yīng)時(shí)間(秒，X±SD)組別 劑量 動物數(shù)(IU/只)(只) 0 0.5 1234(h)空白 - 10 5.5 5.96.5 6.6 6.9 9.8對照±1.58±1.66 ±1.78 ±4.95 ±6.35±6.73雞溶 30 10 5.7 12.3** 15.0** 13.8* 13.6* 11.7菌酶±1.64±4.6 ±7.99 ±7.99 ±7.6 ±6.9人溶 120 10 5.8 14.2** 15.7** 14.5** 14.3* 13.5菌酶±1.23±6.54 ±6.78 ±7.11 ±7.44±7.69人溶 60 10 5.6 12.6** 14.3** 14.0*13.8* 12.5菌酶±1.89±4.05 ±6.69 ±6.9±6.72±6.65人溶 30 10 5.7 10.0* 12.0* 10.7 10.1 11.2菌酶±1.34±4.47 ±7.85 ±4.27 ±3.84±4.5注經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
B、人溶菌酶對巴豆油誘發(fā)小鼠耳廓腫脹模型的制備選用體重27-30克的健康雄性昆明小鼠50只，隨機(jī)分成5組，每組10只。第一組為空白對照組；第二、三、四組為人溶菌酶，劑量分別為120、60、30IU/只；第五組為雞溶菌酶(陽性對照)，30IU/只。首先，各組小鼠全部右耳內(nèi)側(cè)涂1％巴豆油30μL致炎，半小時(shí)后分別用雙蒸水20μl、人溶菌酶(6000IU/ML)20μl、人溶菌酶(3000IU/ML)20μl、人溶菌酶(1500IU/ML)20μl、雞溶菌酶(1500IU/ML)20μl涂抹各組小鼠右耳內(nèi)側(cè)。致炎后4小時(shí)將小鼠脫頸椎致死，沿耳廓基線剪下左右兩耳片，用8mm打孔器沖下兩耳片，精確稱重，左右耳片重量之差為腫脹度。經(jīng)T檢驗(yàn)，比較藥物組與空白對照組的差異，并求出抑制率。試驗(yàn)重復(fù)一次。試驗(yàn)結(jié)果見表17-22。小鼠外用人溶菌酶120、60、30IU/只，使小鼠由巴豆油誘發(fā)耳廓腫脹度明顯減輕。結(jié)果表明人溶菌酶具有抗炎作用。
表17-22人溶菌酶對巴豆油誘發(fā)小鼠耳廓腫脹的影響第1次試驗(yàn) 第2次試驗(yàn)組別劑量(Iu/只) 腫脹度 抑制率 腫脹度 抑制率(mg，X±SD)(％) (mg，X±SD) (％)空白對照 - 20.3±3.40 20.1±4.01人溶菌酶 120 12.5±5.56** 38.42 13.6±3.78** 32.34人溶菌酶 60 13.5±4.67** 33.50 15.1±2.42** 24.88人溶菌酶 30 14.2±3.77** 30.05 15.4±4.22* 23.38雞溶菌酶 30 14.6±2.12** 28.08 15.1±2.51** 24.88注與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
二、基因重組人溶菌酶(HLZ)體內(nèi)外抗菌作用評價(jià)1體外抗菌作用藥品及試劑1、人溶菌酶(Human Lysozyme HLZ)活性單位30000單位/mL，由大連奇龍生物技術(shù)研究所提供。
2、對照溶菌酶(contral Lysozyme，CLZ)白色粉未，活性單位50000單位/mg，美國SIGMA公司產(chǎn)品，批號L6876。
3、克拉霉素效價(jià)948μ/mg，中國藥品生物制品檢定所標(biāo)準(zhǔn)品，批號4、羅紅霉素效價(jià)878μ/mg，中國藥品生物制品檢定所標(biāo)準(zhǔn)品，批號
5、注射用阿莫西林哈爾濱制藥廠產(chǎn)品，批號010504。
6、瓊脂糖(B10WEST AGAROSE)7、三羥甲基氨基甲烷(Tris)成都化學(xué)試驗(yàn)廠，批號010211試驗(yàn)菌株所用菌株均為2001.4-2002.4月于四川、北京地區(qū)收集的臨床分離致病菌。經(jīng)本室用API方法重新鑒定后用于試驗(yàn)。
質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923大腸埃希菌ATCC25922銅綠假單孢菌ATCC27853培養(yǎng)基1、Tris-HCl緩沖液0.1M Tris 100ml，0.1M HCl 70ml，HighWater 800ml，測PH值，用HCl溶液調(diào)至PH7.2，加High Water至1000ml。
2、Tris-HCl脂瓊養(yǎng)基在Tris-Cl緩沖液中加入脂瓊糖116℃天菌后使用。
3、M-H培養(yǎng)基中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品，M-H肉湯培養(yǎng)基稱取25g加1000ml蒸餾水，加熱溶解，分裝，高壓滅菌，116℃ 20分鐘。M-H固體培養(yǎng)基稱取36g，加1000ml蒸餾水，高壓滅菌，116℃20分鐘，用于革蘭陽性、陰性需氧菌的藥敏試驗(yàn)。
4、血培養(yǎng)基，即在M-H培養(yǎng)基中加5-10％脫纖維兔血配制而成，用于腸球菌、鏈球菌的藥敏試驗(yàn)。
試驗(yàn)方法
體外抗菌活性(MIC)測定采用瓊脂二倍稀釋法測定受試藥物對試驗(yàn)菌株的最低抑菌濃度(MIC)。將受試藥物用滅菌蒸餾水溶解，適當(dāng)稀釋。分別取1ml藥液加9ml融化的Tris-HCl瓊脂糖固體培養(yǎng)基混勻，以二倍稀釋，制備系列含藥平皿。每皿所含藥物終濃度分別為4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03……0.001mg/ml；用多點(diǎn)接種儀(Denley A400，England)將稀釋至105CFU/ml的試驗(yàn)菌液接種于各含藥平皿表面，置于37℃培養(yǎng)8-10小時(shí)，取出分別吸取6ml融化的M-H培養(yǎng)基(50℃)覆蓋上述系列平皿表面，再置于37℃培養(yǎng)10小時(shí)取出，觀察結(jié)果，以無細(xì)菌生長平皿內(nèi)所含最低藥物濃度為該菌的最低抑菌濃度(MIC)。
2、體內(nèi)抗菌作用評價(jià)藥品人溶性酶 來源同前。
克拉霉素 來源同前。
羅紅霉素 來源同前。
阿莫西林 來源同前。
細(xì)菌金黃色葡球菌01193，金黃色葡球菌MRSA021923均為臨床分離致病菌。
動物昆明種小鼠，體重18-22克，由本所動物室提供。
試驗(yàn)方法1、體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)挑取一定量的菌苔接種于2ml M-H液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)6小時(shí)后，取出用滅菌干酵母液進(jìn)行適當(dāng)稀釋(10-1，10-2，10-3，10-4)，再取昆明種小鼠，隨機(jī)分組，每組5只鼠，分別腹腔感染不同菌量的受試菌液，測定引起小鼠100％死亡的最小致死菌量(MLD)。再按1∶0.5劑間距設(shè)置5個(gè)劑量組，每組10只鼠，每只小鼠腹腔感染1MLD菌量的菌液0.5ml，感染后即刻靜脈注射受試藥0.5ml，設(shè)感染對照組(不給藥)，觀察1周，記錄小鼠死亡數(shù)。按Bliss法計(jì)算半數(shù)有效劑量ED50及95％可信限。
2、小鼠皮膚燒傷感染模型的療效評價(jià)昆明種小鼠26-30g，隨機(jī)分組，每組5只鼠，分別皮膚燒傷感染模型噴涂金黃色葡萄球菌菌液100ml，菌量為108CFU/ml，連續(xù)噴5次(間隔10分鐘噴一次)，末次噴菌后6小時(shí)，分別用無菌棉簽挑取皮膚燒傷感染模型涂于無藥瓊脂平板表面，37℃培養(yǎng)18小時(shí)，皮膚燒傷感染模型感染細(xì)菌數(shù)在＞103CFU/ml，且經(jīng)革蘭氏染色、光鏡檢測為金黃色葡萄球菌的小鼠為感染模型成功。選取皮膚燒傷感染模型感染成功小鼠隨機(jī)分組，每組10只鼠，分別用噴霧器噴涂受試藥物100μl/次，4次/日，連續(xù)5日，每日采用咽試子涂片法，于瓊脂平板表面進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，與感染對照組和克拉霉素組、羅紅霉素給藥組作比較。
試驗(yàn)結(jié)果(1)人溶菌酶對臨床分離菌株的體外抗菌活性見表1。(2)克拉霉素、羅紅霉素、阿莫西林與人溶菌酶以1∶1聯(lián)合用藥的體外抗菌作用結(jié)果見表2。(3)人溶菌酶對379株臨床分離致病菌的MIC50、MIC90見表3。
以上試驗(yàn)結(jié)果表明人溶菌酶體外具有一定抗菌作用，體內(nèi)對傷口感染潰爛的療效較確切。對多數(shù)菌株的抗菌活性比不上克拉霉素、羅紅霉素和阿莫西林。人溶菌酶與克拉霉素、羅紅霉素聯(lián)用(1∶1)，可使克拉霉素、羅紅霉素對其耐藥菌株的抗菌活性增效2-16倍以上，個(gè)別菌株增效倍數(shù)在1000倍。溶菌酶是一種小分子蛋白質(zhì)，存在于機(jī)體的淚液、唾液、白細(xì)胞和血清中，對多種革蘭氏陽性菌和少數(shù)革蘭氏陰性菌有殺菌作用，由大連奇龍生物技術(shù)研究所研制的基因重組人溶菌酶(Human Lysozyme)也具有溶菌酶相同作用機(jī)制，主要切斷肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β-1、4糖苷鍵之間的聯(lián)結(jié)，破壞肽聚糖支架，引起細(xì)菌裂解。
三、用法與用量1、噴霧劑直接噴霧作用于病灶局部給藥，每日1～6次，每次1500u～30000u成人與小兒相同。
2、奶液、乳劑、滴劑直接作用于病灶局部給藥每日1～6次，每次1500u～30000u。
3、霜劑直接作用于病灶局部給藥1500u～30000u/g外用，每日2～3次，每次按病灶部位大小給藥。
表1人溶菌酶、雞溶菌酶、克拉霉素和羅紅霉素體內(nèi)外抗菌活性MIC細(xì)菌 HLZ CLZ CLAROXmg/ml(萬μ/ml) mg/ml(萬μ/ml)mg/ml mg/ml金葡MRSA02-22 0.25(0.8) 0.008(0.04) ＞1＞1金葡MRSA02-23 0.25(0.8) 0.008(0.04) ＞1＞1金葡MRSA02-26 0.25(0.8) 0.004(0.02) ＞1＞1金葡MRSA02-28 0.5(1.5) 0.016(0.08) ＞1＞1金葡02-19-5 0.03(0.1) ＜0.002(0.001) ＞1＞1表葡MssE25 0.016(0.05)0.004(0.02) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-29 0.063(0.2) 0.5(2.5) 0.03 0.5表葡MRSE 02-5 ＜0.001(0.003) ＜0.001(0.003) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-6 ＜0.001(0.005) ＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-20-2＜0.001(0.003) ＜0.001(0.005) ＞11表葡MRSE 02-20-3＜0.001(0.003) 0.004(0.02) ＞11表葡MRSE 02-20-4＜0.001(0.003) ＜0.001(0.005) ＞1＞1表葡MRSE 02-20-50.004(0.012) ＜0.001(0.005) ＞1＞1表葡MRSE 02-20-60.004(0.012) ＜0.001(0.005) ＞1＞1表葡MRSE 02-20-7＜0.001(0.003) ＜0.001(0.005) 1 1表葡MRSE 02-20-8＜0.001(0.003) ＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-20-9＜0.001(0.003) ＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-20-1＜0.001(0.003) ＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-31(3) 0.015(0.08) ＞1＞1表葡MRSE 02-4 0.004(0.012)0.008(0.04) 0.5＞1
續(xù)表2MIC細(xì)菌 HLZ CLZCLAROXmg/ml(萬/ml) mg/ml(萬μ/ml) mg/ml mg/ml表葡MRSE 02-10 0.004(0.012) 0.25(1.25) 1 1表葡MRSE 02-12 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) 0.008 0.125表葡MRSE 02-11 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-15 0.008(0.024) 0.002(0.01)1 ＞1表葡MRSE 02-17 0.004(0.012) ＜0.001(0.005) 0.25 ＞1表葡MRSE 02-18 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-20 0.008(0.024) ＜0.001(0.005) ＞1＞1表葡MRSE 02-21 0.016(0.05) 0.25(1.25) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-22 0.004(0.012) ＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡菌02-7-4 0.008(0.02) 4(20) 0.002 0.002表葡菌02-7-5 0.008(0.02) 0.25(0.63) ＜0.001＜0.001金葡菌02-7-6 0.008(0.02) 0.063(0.31)0.008 0.25金葡菌02-7-9 0.063(0.2)0.125(0.63)0.008 0.016金葡菌02-7-7 0.125(0.4)0.016(0.08)0.032 0.25金葡菌01-2-22 0.032(0.1)0.5(2.5) 1 1金葡菌01-2-30 0.063(0.2)4(10) ＞1＞1金葡菌01-2-32 0.016(0.05) 0.25(1.25) 0.008 0.5金葡菌01-2-33 0.032(0.1)2(10) ＞1＞1金葡菌01-2-36 0.063(0.2)4(20) 0.25 0.5金葡菌01-2-37 0.032(0.1)＞4(20)＞11
金葡菌01-2-39 0.032(0.1) 0.5(2.5) 0.5 1續(xù)表3MIC細(xì)菌HLZ CLZ CLAROXmg/ml(萬μ/ml)mg/ml(萬μ/ml)mg/ml mg/ml銅綠假單孢菌01-2-41 0.032(0.1) 0.5(2.5) ＞1＞1銅綠假單孢菌01-2-42 0.016(0.05)0.5(2.5) 0.063 ＞1銅綠假單孢菌01-2-43 ＜0.001(0.003) ＞4(20) 0.016 0.25銅綠假單孢菌01-2-45 0.032(0.1) 2(10)0.25 0.5銅綠假單孢菌01-2-51 0.032(0.1) ＞4(20) ＞1＞1銅綠假單孢菌01-2-52 0.032(0.1) ＞4(20) ＞10.25銅綠假單孢菌01-2-53 0.008(0.024) 4(20)0.03 0.25銅綠假單孢菌01-2-54 0.032(0.1) 1(5) ＞11金葡菌01-2-56 0.032(0.1) ＞4(20) 0.016 0.25金葡菌01-2-57 ＜0.001(0.003) 2(10)0.032 0.25大腸埃希菌01-2-58 ＜0.001(0.003) 4(20)＞10.5大腸埃希菌01-2-59 0.032(0.1) 4(20)0.125 0.25沙雷氏菌2-31-8 0.008(0.02)0.5(0.25)0.008 0.016沙雷氏菌2-31-8 0.008(0.02)1(5) 0.008 0.016金葡菌2-31-8 0.008(0.02)0.125(0.63) 0.016 0.016金葡菌02-6-14 0.25(0.8) 1(5) 0.063 ＞1金葡菌02-6-18 0.5(1.5) ＞4(20) 0.51注HLZ指人溶菌酶，CLZ指對照溶菌酶(雞溶菌酶)，CLA指克拉霉素，ROX指羅紅素具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
基因重組人溶菌酶以配制200毫升培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，用H3PO44-8毫升、MgSO41-5克，K2SO42-6克，KOH1-3克，CaSO42H2O1-3.5克，加蒸餾水至200毫升，高壓滅菌后接種甘油管種子，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為每分鐘250轉(zhuǎn)，培養(yǎng)溫度為20-35℃，在恒溫床上培養(yǎng)36-48小時(shí)。進(jìn)行種子罐培養(yǎng)后進(jìn)行生產(chǎn)罐培養(yǎng)。將發(fā)酵表達(dá)完成的培養(yǎng)液進(jìn)行提取純化，對提取純化的蛋白濃縮液冰凍干燥，測定蛋白量、純度和溶菌酶活性保存。將純度95％的基因重組人溶菌酶制得300U～300萬U/mL，磷酸鹽緩沖液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、5～25％丙二醇、萬分之五吐溫80，在常溫下混合均質(zhì)，(在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成)制成噴霧劑。
實(shí)施例2制成含重組人溶菌酶純度為85％-99％、300U～300U萬/ml、磷酸鹽緩沖液10(pH6.0)80％、20％丙二醇、6％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、0.9％水溶性氮酮、3/萬吐溫80的(在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成)滴劑、奶液、乳劑。
實(shí)施例3制成含重組人溶菌酶純度為85％-99％、300U～300U萬/ml/g、磷酸鹽緩沖液20mM(pH7.0)85％、20％丙二醇、卡波樹脂1％、香精0.3％(在符合GMP要求的制藥工廠，按制藥規(guī)程完成)霜劑。
權(quán)利要求
1.人溶菌酶在制備治療由燒、燙傷導(dǎo)致傷口不愈合引起的傷口感染潰爛的藥物中的應(yīng)用。
2.人溶菌酶在制備治療由糖尿病晚期末梢微循環(huán)不暢傷口不愈合引起的傷口感染潰爛的藥物中的應(yīng)用。
3.人溶菌酶在制備治療由愛滋病導(dǎo)致的人類免疫缺陷傷口不愈合引起的傷口感染潰爛的藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的人溶菌酶在制備治療傷口不愈感染傷口潰爛的藥物中的新用途，其特征是人溶菌酶為基因工程表達(dá)的重組人溶菌酶或基因工程表達(dá)人溶菌酶的氨基端帶有(谷氨酸—丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修飾的人溶菌酶、基因工程表達(dá)或化學(xué)合成突變體重組人溶菌酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的人溶菌酶在制備治療傷口不愈感染傷口潰爛的藥物中的新用途，其特征是藥物中含有活性300U～300萬U/mL人溶菌酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的人溶菌酶在制備治療傷口不愈感染傷口潰爛的藥物中的新用途，其特征是藥物制劑為噴霧劑、滴劑、奶液、乳劑或霜劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及人溶菌酶的用途，特別是人溶菌酶在制藥領(lǐng)域中的新用途?；蛑亟M人溶菌酶在燒、燙傷和糖尿病及艾滋病導(dǎo)致傷口不愈合引起的感染傷口潰爛的藥物中的新用途，藥物可以制成噴霧劑、滴劑、膏劑等。本發(fā)明對基因重組人溶菌酶發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。安全無毒副作用，有很好的藥用前景。并且基因重組人溶菌酶來源豐富，制備工藝簡單，使用方便。
文檔編號A61K9/107GK1583168SQ20041002073
公開日2005年2月23日 申請日期2004年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月10日
發(fā)明者張華 申請人:張華